JP6812368B2 - Ｐｒｐｆ３１遺伝子における変異により引き起こされる遺伝性網膜変性に対する遺伝子増強療法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年３月６日出願の米国特許出願第６２／１２９，６３８号、および２０１５年４月１４日出願の同第６２／１４７，３０７号の利益を主張する。前述の特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩのコピーは、２０１６年３月７日に作成され、００６３３−０１９２ＷＯ１．ｔｘｔと命名され、サイズは１５４ＫＢである。

連邦支援の研究または開発
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（National Institutes of Health）により授与される助成金番号ＥＹ０２０９０２の下に、政府により支援されて行われた。政府は本発明における一定の権利を有する。

本発明は、ｍＲＮＡ前駆体プロセシング因子３１（ＰＲＰＦ３１）における変異に関係する網膜色素変性の遺伝子療法のための方法および組成物に関する。

ｍＲＮＡ前駆体プロセシング因子３１（ＰＲＰＦ３１）における変異はヒトにおいて、遺伝性網膜ジストロフィー（ＩＲＤ）の１つである非症候性網膜色素変性（ＲＰ）を引き起こす。変異が、遍在して発現されるこれらのタンパク質に存在する場合に、どのような機構またはどの組織が影響されているのか、現在のところ不明である。

本明細書には、ｍＲＮＡ前駆体プロセシング因子３１（ＰＲＰＦ３１）における変異に関係する網膜色素変性の遺伝子療法のための方法および組成物が記載される。

したがって、本明細書では、ヒト対象におけるＰＲＰＦ３１の変異により引き起こされる網膜色素変性を処置するか、またはヒト対象の眼においてＰＲＰＦ３１の発現を増大させる方法が提供される。方法は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞における発現を駆動させるプロモーターと作動可能に連結した、ヒトＰＲＰＦ３１をコードする配列を含む治療的有効量のアデノ随伴ウイルスのベクター、例えば、アデノ随伴ウイルスタイプ２（ＡＡＶ２）ベクターを対象の眼に送達することを含む。

プロモーターは、ＲＰＥに特異的であってもよく、または他の細胞型においても同様に、例えば、ＣＡＳＩもしくはＣＡＧでも発現を駆動する一般的プロモーターであってもよい。いくつかの実施形態において、プロモーターはＲＰＥ６５またはＶＭＤ２プロモーターである。

いくつかの実施形態において、ＰＲＰＦ３１配列は、例えば、対象がヒトである場合に、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、ＰＲＰＦ３１配列は、配列番号３４のｎｔｓ１３１９〜２８１８と同じタンパク質であるかまたはそれを含むかまたはコードする。

いくつかの実施形態において、ベクターは、網膜下注射により送達される。

いくつかの実施形態において、ベクターは、国際公開第２０１５０５４６５３号パンフレットに記載されたＡＡＶカプシドポリペプチドを含むか、またはＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする配列を含む。

網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞における発現を駆動するプロモーターと作動可能に連結した、ヒトＰＲＰＦ３１をコードする配列を含むアデノ随伴ウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルスタイプ２（ＡＡＶ２）ベクターも、本明細書で提供される。プロモーターはＲＰＥ特異的であってもよく、または他の細胞型においても同様に、例えば、ＣＡＳＩまたはＣＡＧでも発現を駆動する一般的プロモーターであってもよい。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＲＰＥ６５またはＶＭＤ２プロモーターである。いくつかの実施形態において、ＰＲＰＦ３１配列は、例えば、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている。ベクターを、好ましくは、網膜下注射による送達のために製剤化されたベクターを含む医薬組成物も提供される。

本明細書に記載された核酸、ベクター、および医薬組成物の使用も、本明細書で提供される。

特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者により共通して理解される同じ意味を有する。方法および材料は、本発明で使用するために本明細書に記載されるが、当技術分野において知られた他の適当な方法および材料も使用することができる。材料、方法および例は、単なる例示であり、限定することは意図されない。全ての公報、特許出願、特許、配列、データベース登録、および本明細書で言及される他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書に従うものとする。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図から、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。

図１Ａ〜Ｆ：Ｐｒｐｆ変異マウスにおける食作用の阻害を示す図である。網膜色素上皮の（ＲＰＥ）初代培養を、日齢９〜１０日のＰｒｐｆ変異マウスおよびそれらの同腹子対照から確立し、次にＦＩＴＣ標識されたブタ光受容体の外側セグメントでチャレンジし、核はＤＡＰＩ（青色）で標識した。（Ａ）野生型（ＷＴ）またはＰｒｐｆ３Ｔ４９４Ｍ／Ｔ４９４Ｍ、Ｐｒｐｆ８Ｈ２３０９Ｐ／Ｈ２３０９Ｐ、Ｐｒｐｆ３１＋／−変異（ＭＵＴ）マウスからの初代ＲＰＥ細胞の定性的描写（核の青色ＤＡＰＩ染色）。ＰＯＳ取り込みにおける差が、変異体と対照との間で観察された。 図１Ａ〜Ｆ：Ｐｒｐｆ変異マウスにおける食作用の阻害を示す図である。網膜色素上皮の（ＲＰＥ）初代培養を、日齢９〜１０日のＰｒｐｆ変異マウスおよびそれらの同腹子対照から確立し、次にＦＩＴＣ標識されたブタ光受容体の外側セグメントでチャレンジし、核はＤＡＰＩ（青色）で標識した。（Ｂ）食作用の比の定量分析により、示した３種の変異体マウス系統について野生型同腹子（ＷＴ）と比較した変異（ＭＵＴ）マウスにおける食作用の有意の減少が示される（^＊Ｐ＜０．０５、Ｎ＝３〜５）。（Ｃ）ＰＯＳの結合および内部移行比を、野生型対照（ＷＴ）と比較してＰｒｐｆ３１＋／−（ＭＵＴ）マウス間で比較すると、変異マウスでは、結合（Ｂｉｎｄ．）では有意の減少を示すが、ＰＯＳ内部移行（Ｉｎｔｅｒｎ．）では有意の変化を示さない（^＊Ｐ＜０．０５、Ｎ＝２〜５）。 図１Ａ〜Ｆ：Ｐｒｐｆ変異マウスにおける食作用の阻害を示す図である。網膜色素上皮の（ＲＰＥ）初代培養を、日齢９〜１０日のＰｒｐｆ変異マウスおよびそれらの同腹子対照から確立し、次にＦＩＴＣ標識されたブタ光受容体の外側セグメントでチャレンジし、核はＤＡＰＩ（青色）で標識した。（Ｄ）ＡＲＰＥ−１９細胞におけるＰＲＰＦ３１のｓｈＲＮＡにより媒介されるノックダウンの安定な系列。ＰＯＳ取り込みにおける差が、対照のｓｈＲＮＡをトランスフェクトされたＡＲＰＥ−１９細胞と抗ＰＲＰＦ３１ ｓｈＲＮＡをトランスフェクトされたＡＲＰＥ−１９細胞との間でも観察された。（Ｅ）ＡＲＰＥ−１９細胞におけるＰＲＰＦ３１−ノックダウンの効果を決定するための細胞生存能力アッセイは、ＰＲＰＦ３１のｓｈＲＮＡ−ノックダウン後の細胞増殖または生存能力は、非標的対照と比較して有意の差がないことを示す（Ｐ＞０．０５、Ｎ＝６）。（Ｆ）ヒトＡＲＰＥ−１９細胞系列におけるＰＲＰＦ３１のｓｈＲＮＡにより媒介されるノックダウンは、非標的構造物（ＮＴＣ）と比較して１細胞当たりのＰＯＳの減少数により示されるように、食作用も有意に阻害する（^＊Ｐ＜０．０５、Ｎ＝３）。誤差バーは、平均値からの標準偏差を表す。 図２Ａ〜Ｃ：Ｐｒｐｆ変異マウスにおける食作用の日周的な周期性が乱されることを示す図である。食作用を、光照射開始前２時間（−２）、光照射開始時（０）、および光照射開始後２、４、および６（＋２、＋４、＋６）時間にインビボでアッセイした。（Ａ、Ｂ）代表的な写真を光照射開始後＋２（食作用のピーク）および＋８（食作用のピークの外側）時間で示す。ＲＰＥ：網膜色素上皮、ＯＳ：光受容体外側セグメント、Ｃｈ：脈絡膜。（Ａ）Ｐｒｐｆ３およびＰｒｐｆ８変異マウスにおける初期のファゴソームの検出は、電子顕微鏡を使用して、１）ＲＰＥの細胞原形質中にある、および２）視認できる層状の構造（黒色矢じり）に含有されるファゴソームを計数して実施した。スケールのバーは２μｍ。（Ｂ）Ｐｒｐｆ３１＋／−マウスの日周的なリズムを、ロドプシンに対する免疫蛍光染色（Ｉｇ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８）および１００μｍの完全な網膜全体にわたってＲＰＥ細胞層（ＤＡＰＩで染色された核）に所在するファゴソーム（白色矢じり）の検出を使用して決定した。スケールのバーは２０μｍ。 図２Ａ〜Ｃ：Ｐｒｐｆ変異マウスにおける食作用の日周的な周期性が乱されることを示す図である。食作用を、光照射開始前２時間（−２）、光照射開始時（０）、および光照射開始後２、４、および６（＋２、＋４、＋６）時間にインビボでアッセイした。（Ｃ）全ての時点にわたるファゴソームの定量は、全てのＰｒｐｆ変異マウスにおける食作用のバーストの一貫した有意の乱れを示す（^＊Ｐ＜０．０５、Ｐｒｐｆ３およびＰｒｐｆ８変異体についてはＮ＝２、ならびにＰｒｐｆ３１変異マウスについてはＮ＝３〜５）。誤差バーは、平均値からの標準偏差を表す。 図３Ａ〜Ｂ：ピーク時点におけるＰｒｐｆ変異マウスにおける網膜接着の変化を示すグラフである。ＲＰＥ頂点の微絨毛とＰＯＳとの間の接着強度は、神経網膜に接着するＲＰＥ色素またはタンパク質の量を、ＷＴ対照と比較して定量化することにより決定した。（Ａ）メラニン定量化により、接着が３種全ての変異マウスで、光照射開始後３．５時間のピーク時点に減少し、Ｐｒｐｆ８Ｈ２３０９Ｐ／Ｈ２３０９Ｐマウスではオフピーク時点で減少することが示される（^＊Ｐ＜０．０５、Ｎ＝３〜７）。 図３Ａ〜Ｂ：ピーク時点におけるＰｒｐｆ変異マウスにおける網膜接着の変化を示すグラフである。ＲＰＥ頂点の微絨毛とＰＯＳとの間の接着強度は、神経網膜に接着するＲＰＥ色素またはタンパク質の量を、ＷＴ対照と比較して定量化することにより決定した。（Ｂ）イムノブロット上におけるＲＰＥ６５タンパク質の定量的測定により、３種全ての変異マウスにおいてピーク時点でメラニンが見出されることか確認されるが、Ｐｒｐｆ８変異マウスでのみオフピーク時点で接着における減少傾向が観察される（^＊Ｐ＜０．０５、Ｎ＝４〜７）。誤差バーは平均値からの標準偏差を表す。 図４Ａ〜Ｃ：若干の接着および食作用マーカーの局在および発現が、Ｐｒｐｆ３およびＰｒｐｆ８変異マウスで妨げられることを示す図である。示される通りの、野生型対照（ＷＴ）ならびにＰｒｐｆ３−およびＰｒｐｆ８変異体網膜の凍結切片上における（Ａ）αｖおよびβ５インテグリン受容体サブユニットおよび関連するＭｆｇ−Ｅ８リガンド、（Ｂ）ＦＡＫ細胞内シグナル伝達タンパク質、ならびに（Ｃ）ＭｅｒＴＫ受容体ならびに関連するＧａｓ６およびタンパク質Ｓリガンドの発現および局在の代表的影像。非免疫ＩｇＧ（ＩｇＧ）で探査された切片からの画像が、各抗原について含まれる。ＲＰＥ：網膜色素上皮、ＯＳ：光受容体外側セグメント、ＯＮＬ：外側の核層。ＲＰＥの基底側へのβ５インテグリンの局在が、Ｐｒｐｆ３およびＰｒｐｆ８変異マウスの両方で観察された。それに加えて、ＦＡＫは、Ｐｒｐｆ８変異マウスでＲＰＥの基底側に誤って局在した。目的の各タンパク質をＩｇ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で染色して、核はＤＡＰＩで染色される。スケールバーは４０μｍ。 図４Ａ〜Ｃ：若干の接着および食作用マーカーの局在および発現が、Ｐｒｐｆ３およびＰｒｐｆ８変異マウスで妨げられることを示す図である。示される通りの、野生型対照（ＷＴ）ならびにＰｒｐｆ３−およびＰｒｐｆ８変異体網膜の凍結切片上における（Ａ）αｖおよびβ５インテグリン受容体サブユニットおよび関連するＭｆｇ−Ｅ８リガンド、（Ｂ）ＦＡＫ細胞内シグナル伝達タンパク質、ならびに（Ｃ）ＭｅｒＴＫ受容体ならびに関連するＧａｓ６およびタンパク質Ｓリガンドの発現および局在の代表的影像。非免疫ＩｇＧ（ＩｇＧ）で探査された切片からの画像が、各抗原について含まれる。ＲＰＥ：網膜色素上皮、ＯＳ：光受容体外側セグメント、ＯＮＬ：外側の核層。ＲＰＥの基底側へのβ５インテグリンの局在が、Ｐｒｐｆ３およびＰｒｐｆ８変異マウスの両方で観察された。それに加えて、ＦＡＫは、Ｐｒｐｆ８変異マウスでＲＰＥの基底側に誤って局在した。目的の各タンパク質をＩｇ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で染色して、核はＤＡＰＩで染色される。スケールバーは４０μｍ。 図４Ａ〜Ｃ：若干の接着および食作用マーカーの局在および発現が、Ｐｒｐｆ３およびＰｒｐｆ８変異マウスで妨げられることを示す図である。示される通りの、野生型対照（ＷＴ）ならびにＰｒｐｆ３−およびＰｒｐｆ８変異体網膜の凍結切片上における（Ａ）αｖおよびβ５インテグリン受容体サブユニットおよび関連するＭｆｇ−Ｅ８リガンド、（Ｂ）ＦＡＫ細胞内シグナル伝達タンパク質、ならびに（Ｃ）ＭｅｒＴＫ受容体ならびに関連するＧａｓ６およびタンパク質Ｓリガンドの発現および局在の代表的影像。非免疫ＩｇＧ（ＩｇＧ）で探査された切片からの画像が、各抗原について含まれる。ＲＰＥ：網膜色素上皮、ＯＳ：光受容体外側セグメント、ＯＮＬ：外側の核層。ＲＰＥの基底側へのβ５インテグリンの局在が、Ｐｒｐｆ３およびＰｒｐｆ８変異マウスの両方で観察された。それに加えて、ＦＡＫは、Ｐｒｐｆ８変異マウスでＲＰＥの基底側に誤って局在した。目的の各タンパク質をＩｇ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で染色して、核はＤＡＰＩで染色される。スケールバーは４０μｍ。 図５Ａ〜Ｃ：若干の接着および食作用マーカーの局在および発現が、Ｐｒｐｆ３１変異マウスで妨げられることを示す図である。示される通りの、野生型対照（ＷＴ）ならびにＰｒｐｆ３１変異体の網膜のパラフィン切片上における（Ａ）αｖおよびβ５インテグリン受容体サブユニットおよび関連するＭｆｇ−Ｅ８リガンド、（Ｂ）ＦＡＫ細胞内シグナル伝達タンパク質、ならびに（Ｃ）ＭｅｒＴＫ受容体ならびに関連するＧａｓ６およびタンパク質Ｓリガンドの発現および局在、または非免疫ＩｇＧ（ＩｇＧ）の代表的画像。ＲＰＥ：網膜色素上皮、ＯＳ：光受容体外側セグメント、ＯＮＬ：外側核層。Ｐｒｐｆ３１変異マウスにおける最も顕著な変化は、ＲＰＥの基底側へのβ５インテグリンの誤った局在であるが、ＭｅｒＴＫの局在も摂動する。目的の各タンパク質をＩｇＧ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で染色し、核はＤＡＰＩで染色される。スケールバーは２０μｍ。 図５Ａ〜Ｃ：若干の接着および食作用マーカーの局在および発現が、Ｐｒｐｆ３１変異マウスで妨げられることを示す図である。示される通りの、野生型対照（ＷＴ）ならびにＰｒｐｆ３１変異体の網膜のパラフィン切片上における（Ａ）αｖおよびβ５インテグリン受容体サブユニットおよび関連するＭｆｇ−Ｅ８リガンド、（Ｂ）ＦＡＫ細胞内シグナル伝達タンパク質、ならびに（Ｃ）ＭｅｒＴＫ受容体ならびに関連するＧａｓ６およびタンパク質Ｓリガンドの発現および局在、または非免疫ＩｇＧ（ＩｇＧ）の代表的画像。ＲＰＥ：網膜色素上皮、ＯＳ：光受容体外側セグメント、ＯＮＬ：外側核層。Ｐｒｐｆ３１変異マウスにおける最も顕著な変化は、ＲＰＥの基底側へのβ５インテグリンの誤った局在であるが、ＭｅｒＴＫの局在も摂動する。目的の各タンパク質をＩｇＧ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で染色し、核はＤＡＰＩで染色される。スケールバーは２０μｍ。 図５Ａ〜Ｃ：若干の接着および食作用マーカーの局在および発現が、Ｐｒｐｆ３１変異マウスで妨げられることを示す図である。示される通りの、野生型対照（ＷＴ）ならびにＰｒｐｆ３１変異体の網膜のパラフィン切片上における（Ａ）αｖおよびβ５インテグリン受容体サブユニットおよび関連するＭｆｇ−Ｅ８リガンド、（Ｂ）ＦＡＫ細胞内シグナル伝達タンパク質、ならびに（Ｃ）ＭｅｒＴＫ受容体ならびに関連するＧａｓ６およびタンパク質Ｓリガンドの発現および局在、または非免疫ＩｇＧ（ＩｇＧ）の代表的画像。ＲＰＥ：網膜色素上皮、ＯＳ：光受容体外側セグメント、ＯＮＬ：外側核層。Ｐｒｐｆ３１変異マウスにおける最も顕著な変化は、ＲＰＥの基底側へのβ５インテグリンの誤った局在であるが、ＭｅｒＴＫの局在も摂動する。目的の各タンパク質をＩｇＧ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で染色し、核はＤＡＰＩで染色される。スケールバーは２０μｍ。 ゲノム編集により生じたＰＲＰＦ３１＋／−ｈｉＰＳＣおよびＡＲＰＥ−１９細胞系列の配列を示す図である。ＰＲＰＦ３１についての遺伝子モデルを上に示し、例となる３種の細胞系列についてエクソン６〜７中の配列の詳細を下に示す。ノックアウトｈｉＰＳＣ細胞系列は、ヘテロ接合の４ｂｐの欠失を有し（欠失した塩基は正常配列中で上に罫線を引いて示した）、その結果、フレームシフト（下線を引いたアミノ酸）および未成熟停止が生じる。描かれたノックアウトＡＲＰＥ−１９細胞系列は４ｂｐの欠失または単一の塩基の挿入を有し、そのこともフレームのシフトおよびヌル対立遺伝子を生じさせる。 ＡＡＶ．ＣＡＳＩ．ＰＲＰＦ３１で処理した後の相対的ＰＯＳ取り込みを示すグラフである。ゲノム編集されたＰＲＰＦ３１（ＧＥ３１）ＡＲＰＥ−１９細胞に、ＡＡＶ．ＣＡＳＩ．ＰＲＰＦ３１を０、１０，０００、および１５，０００のＭＯＩで３日間形質導入した。その後、細胞をＦＩＴＣ−ＰＯＳと１時間インキュベートして、ＦＩＴＣ陽性の細胞をフローサイトメトリーにより計数した。^＊Ｐ＜０．０５。

ＲＮＡスプライシング因子をコードする遺伝子における変異は、盲目にする障害である網膜色素変性（ＲＰ）の主要な形態の２番目に多い一般的な原因であり、したがって失明の重要な原因である（Hartong et al., Lancet. 2006; 368: 1795-809；Daiger et al., Archives Ophthalmology. 2007; 125: 151-8；Sullivan et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2013; 54: 6255-61. PMCID: 3778873）。変異を受けるスプライシング因子であるｍＲＮＡ前駆体プロセシング因子（ＰＲＰＦ）３、ＰＲＰＦ４、ＰＲＰＦ６、ＰＲＰＦ８、ＰＲＰＦ３１、およびＳＮＲＮＰ２００は、スプライセオソームの高度に保存された成分であり、スプライセオソームは、新生ＲＮＡ転写物からイントロンを切って成熟ｍＲＮＡを生成する複合体である（McKie et al., Human Molecular Genetics. 2001; 10: 1555-62；Vithana et al., Molecular Cell. 2001; 8:375-81；Chakarova et al., Human Molecular Genetics. 2002; 11: 87-92；Keen et al., European Journal Human Genetics. 2002; 10:245-9；Nilsen, Bioessays. 2003; 25: 1147-9；Sullivan et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2006; 47: 4579-88；Zhao et al., American Journal Human Genetics. 2009; 85: 617-27；Tanackovic et al., American Journal Human Genetics. 2011; 88: 643-9；Chen et al., Human Molecular Genetics. 2014; 23: 2926-39.）。ＰＲＰＦ３１遺伝子における変異は、ＲＮＡスプライシング因子ＲＰの最も一般的な原因であり、米国で２４００から８５００人の影響された人々および世界中で５５，０００から１９３，０００人を占めると見積もられている（Daiger et al., Archives Ophthalmology. 2007; 125:151-8；Sullivan et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2013;54: 6255-61. PMCID: 3778873）。ＲＮＡスプライシングは、全ての細胞で必要とされるので、これらの遍在するタンパク質における変異が、どのようにして網膜特異的疾患をもたらすのかは明らかではない。

ＲＮＡスプライシング因子における変異が網膜変性を引き起こす機構（単数または複数）を理解するために、Ｐｒｐｆ３、Ｐｒｐｆ８およびＰｒｐｆ３１変異マウスの表現型を検討した。細胞自律性における欠陥を、遺伝子を標的とされるマウスにおける網膜色素上皮の（ＲＰＥ）細胞の機能で同定した。しかしながら、マウスモデルとヒトの状態との間の疾患における遺伝的および表現型の差が、マウスで引き出された結論をヒトに置き換えることを困難にする可能性がある。

ＰＲＰＦ３１における変異がハプロ不全による疾患を引き起こすこと、したがって、優性ＲＰのこの形態は、遺伝子増強療法による処置に対応できるといういくつかの証拠がある。ＰＲＰＦ３１で同定された変異の多くは、大きい染色体の欠失であるか、またはナンセンスおよびフレームシフト変異のいずれかであり、それが未成熟停止コドンをもたらし、それはナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊を経て、ヌル対立遺伝子を生じる（Vithana et al., Molecular Cell. 2001;8:375-81；Sullivan et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2006;47:4579-88.；Wang et al., American Journal Medical Genetics A. 2003;121A:235-9；Xia et al., Molecular Vision. 2004;10:361-5；Sato et al., American Journal Ophthalmology. 2005;140:537-40；Abu-Safieh et al., MolVis. 2006;12:384-8；Rivolta et al., Human Mutation. 2006;27:644-53；Waseem et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2007;48:1330-4；Rio Frio et al., Human Mutation. 2009;30:1340-7. PMCID: 2753193；Rose et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2011;52:6597-603；Saini et al., Experimental Eye Research. 2012;104:82-8）。したがって、ＰＲＰＦ３１が関連する網膜の変性はハプロ不全により引き起こされると考えられる。この仮説と矛盾せずに、野生型対立遺伝子からのＰＲＰＦ３１発現のレベルは、ＰＲＰＦ３１における変異を有する患者における疾患の重症度と相関する（Rio et al., Journal Clinical Investigation. 2008;118:1519-31；Vithana et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2003;44:4204-9；McGee et al., American Journal Human Genetics. 1997;61:1059-66）。２通りの機構が、野生型ＰＲＰＦ３１の対立遺伝子の発現の調節に寄与すると報告されている。第１に、ＣＮＯＴ３は、ＰＲＰＦ３１発現を転写の抑制により調節する。ＰＲＰＦ３１変異の無症候性の保因者では、ＣＮＯＴ３が低レベルで発現され、これが、より高い量の野生型ＰＲＰＦ３１転写物が産生されることを可能にし、網膜変性の顕性化を防止する（Venturini et al., PLoS genetics. 2012;8:e1003040. PMCID: 3493449；Rose et al., Annals Human Genetics. 2013）。第２に、ＭＳＲ１が、ＰＲＰＦ３１の上流のシス調節エレメントとして同定されている。したがって、ヒトの遺伝的変動は、ＰＲＰＦ３１遺伝子発現の増強がこの障害における失明を減少させるかまたは排除することができることの証拠を提供している。

本明細書で説明するように、本発明者らは、ＲＰＥ細胞を、ＲＮＡスプライシング因子ＲＰにおいて影響された原発性細胞と同定した。このことが、ＰＲＰＦ３１における変異により引き起こされる疾患のための遺伝子増強療法を開発して前進する機会を創り出す（実施例１を参照されたい）。この目標に達するために、ヒトＰＲＰＦ３１を発現するためのＡＡＶベクターが本明細書に記載され、それは、ヒト対象における表現型を向上させるために使用することができる。

Ｕ４／Ｕ６小核リボ核タンパク質Ｐｒｐ３１としても知られるヒトＰＲＰＦ３１の配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて受託番号ＮＭ＿０１５６２９．３（核酸）およびＮＰ＿０５６４４４．３（タンパク質）で入手できる。ＰＲＰＦ３１における変異と関連するＲＰを有する対象は、当技術分野において知られた方法により、例えば、ＰＲＰＦ３１遺伝子の配列を決定することにより（ＮＧ＿００９７５９．１、範囲：５００１から２１３６１）またはＮＣ＿００００１９．１０参照ＧＲＣｈ３８．ｐ２ Ｐｒｉｍａｒｙ Ａｓｓｅｍｂｌｙ、範囲：５４１１５３７６から５４１３１７１９）、同定することができる。罹患した固体において多数の変異が同定された；例えば、Villanueva et al. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2014；Dong et al. Mol Vis, 2013；Lu F, et al. PLoS One, 2013；Utz et al. Ophthalmic Genet, 2013；およびXu F, et al. Mol Vis, 2012；Saini et al., Exp Eye Res. 2012 Nov;104:82-8；Rose et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011 Aug 22;52(9):6597-603；Audo et al., BMC Med Genet. 2010 Oct 12;11:145；およびTanackovic and Rivolta, Ophthalmic Genet. 2009 Jun;30(2):76-83を参照されたい。

したがって、本明細書に記載されたＰＲＰＦ３１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの、ＲＰＥ細胞中、例えば、主としてまたは専らＲＰＥ細胞中におけるインビボのトランスフェクションおよび発現のための標的とされる発現ベクターが本明細書に記載される。そのような成分の発現構築物は、任意の効果的な担体で、例えば、成分の遺伝子を、インビボで細胞に効果的に送達することができる任意の製剤または組成物中で投与することができる。種々の手法は、組み替えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、および単純ヘルペスウイルス−１、アルファウイルス、ワクシニアウイルスを含むウイルスベクター、または組み替え細菌のまたは真核細胞のプラスミドに遺伝子を挿入することを含む。好ましいウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスのタイプ２（ＡＡＶ２）である。ウイルスベクターは、細胞に直接形質移入する。プラスミドＤＮＡは、裸で、または例えば、カチオン性リポソーム（リポフェクタミン）の助けで、または誘導体化されて（例えば、抗体とコンジュゲートして）、カチオン性デンドリマー、無機ベクター（例えば、酸化鉄マグネトフェクション）、リピドイド、細胞浸透性ペプチド、シクロデキストリンポリマー（ＣＤＰ）、ポリリシンコンジュゲート、グラマシジンＳ、人工ウイルスのエンベロープまたは他のそのような細胞内担体、および遺伝子構築物の直接注射またはインビボで実施されるＣａＰＯ４沈殿の助けで送達することができる。

核酸を細胞中にインビボで導入する典型的手法は、核酸、例えば、ｃＤＮＡを含有するウイルスベクターの使用による。ウイルスベクターによる細胞の感染は、標的とされる細胞の大きい比率が、核酸を受け入れることができるという利点を有する。それに加えて、ウイルスのベクター内で、例えば、ウイルスベクターに含有されるｃＤＮＡによりコードされた分子が、ウイルスベクターの核酸を取り上げた細胞中で効率的に発現される。

ウイルスベクターは、組み替え遺伝子の送達系として、外因性遺伝子をインビボで、特にヒト中に導入するために使用することができる。これらのベクターは、遺伝子を細胞中に効率的に送達し、いくつかの場合には、導入された核酸は、宿主の染色体ＤＮＡ中に安定に組み込まれる。組み替えウイルスを産生するための、および細胞にインビトロまたはインビボでそのようなウイルスを感染させるためのプロトコルは、Ausubel, et al., eds., Gene Therapy Protocols Volume 1: Production and In Vivo Applications of Gene Transfer Vectors, Humana Press, (2008), pp. 1-32および他の標準的実験室マニュアルに見出すことができる。

核酸の送達のために有用な好ましいウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製および産生のライフサイクルのためのヘルパーウイルスとして、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの別のウイルスを必要とする天然に存在する欠損ウイルスである。（総説については、Muzyczka et al., Curr. Topics in Micro and Immunol.158:97-129 (1992)を参照されたい）。ＡＡＶベクターは、種々の細胞型に効率的に形質導入して、インビボにおける導入遺伝子の長期発現を生じさせることができる。ＡＡＶベクターのゲノムは、細胞内でエピソームとして存続することができるが、ベクターの組み込みが観察されている（例えば、Deyle and Russell, Curr Opin Mol Ther. 2009 Aug; 11(4): 442-447；Asokan et al., Mol Ther. 2012 April; 20(4): 699-708；Flotte et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356 (1992)；Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828 (1989)；およびMcLaughlin et al., J. Virol. 62:1963-1973 (1989)を参照されたい）。ＡＡＶベクター、特にＡＡＶ２は、遺伝子増強または置き換えのために広く使用されてきて、広範囲の動物モデルおよびクリニックで治療効果を示してきた。例えば、Mingozzi and High, Nature Reviews Genetics 12, 341-355 (2011)；Deyle and Russell, Curr Opin Mol Ther. 2009 Aug; 11(4): 442-447；Asokan et al., Mol Ther. 2012 April; 20(4): 699-708を参照されたい。ＡＡＶのわずか３００塩基対を含有するＡＡＶベクターがパッケージされ得て、組み替えタンパク質発現を生じさせることができる。外因性ＤＮＡのための余地は約４．５ｋｂに限定される。例えば、ＡＡＶ１、２、４、５、または８ベクターは、ＤＮＡをＲＰＥ細胞中に導入するために使用することができる（例えば、Maguire et al. (2008). Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med 358: 2240-2248. Maguire et al. (2009). Age-dependent effects of RPE65 gene therapy for Leber's congenital amaurosis: a phase 1 dose-escalation trial. Lancet 374: 1597-1605；Bainbridge et al. (2008). Effect of gene therapy on visual function in Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med 358: 2231-2239；Hauswirth et al. (2008). Treatment of leber congenital amaurosis due to RPE65 mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: short-term results of a phase I trial. Hum Gene Ther 19: 979-990；Cideciyan et al. (2008). Human gene therapy for RPE65 isomerase deficiency activates the retinoid cycle of vision but with slow rod kinetics. Proc Natl Acad Sci USA 105: 15112-15117. Cideciyan et al. (2009). Vision 1 year after gene therapy for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med 361: 725-727；Simonelli et al. (2010). Gene therapy for Leber's congenital amaurosis is safe and effective through 1.5 years after vector administration. Mol Ther 18: 643-650；Acland, et al. (2005). Long-term restoration of rod and cone vision by single dose rAAV-mediated gene transfer to the retina in a canine model of childhood blindness. Mol Ther 12: 1072-1082；Le Meur et al. (2007). Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotyp 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Gene Ther 14: 292-303；Stieger et al. (2008). Subretinal delivery of recombinant AAV serotype 8 vector in dogs results in gene transfer to neurons in the brain. Mol Ther 16: 916-923；およびVandenberghe et al. (2011). Dosage thresholds for AAV2 and AAV8 photoreceptor gene therapy in monkey. Sci Transl Med 3: 88ra54に記載されたものなど）。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、国際公開第２０１５０５４６５３号パンフレットに記載されたＡＡＶカプシドポリペプチド；例えば、国際公開第２０１５０５４６５３号パンフレットの配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、および１７、および本明細書に記載されたＰＲＰＦ３１をコードする配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＡＡＶカプシドポリペプチドを含むウイルス粒子を含む（またはそれをコードする配列を含む）ことができる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドポリペプチドは、ここで再掲する国際公開第２０１５０５４６５３号パンフレットの表１に示されている通りである。

いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドポリペプチドは、Ａｎｃ８０ポリペプチドであり、例えば、典型的ポリペプチドは、配列番号１９（Ａｎｃ８０Ｌ２７）；配列番号２０（Ａｎｃ８０Ｌ５９）；配列番号２１（Ａｎｃ８０Ｌ６０）；配列番号２２（Ａｎｃ８０Ｌ６２）；配列番号２３（Ａｎｃ８０Ｌ６５）；配列番号２４（Ａｎｃ８０Ｌ３３）；配列番号２５（Ａｎｃ８０Ｌ３６）；および配列番号２６（Ａｎｃ８０Ｌ４４）で示される。

種々の核酸が、異なった細胞型中に、ＡＡＶベクターを使用して導入されてきた（例えば、上で挙げた引用文献およびAsokan et al., Molecular Therapy (2012); 20 4, 699-708：およびHermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470 (1984)；Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1985)；Wondisford et al., Mol. Endocrinol. 2:32-39 (1988)；Tratschin et al., J. Virol. 51:611-619 (1984)；およびFlotte et al., J. Biol. Chem. 268:3781-3790 (1993)を参照されたい）。

レトロウイルスも使用することができる。複製欠損レトロウイルスのみを産生する特化された細胞系列（「パケージング細胞」と称される）の開発により、遺伝子療法のためのレトロウイルスの効用が高まったので、欠損レトロウイルスが、遺伝子療法目的のための遺伝子移入で使用するために特徴づけられる（総説については、Katz et al., Human Gene Therapy 24:914 (2013)を参照されたい）。複製欠損レトロウイルスは、ビリオンにパッケージ化することができ、それは、ヘルパーウイルスの使用を通じて標準的技法により標的細胞への感染のために使用することができる。適当なレトロウイルスの例には、当業者に知られたｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭが含まれる。同種エクトロピックレトロウイルスおよびアンホトロピックレトロウイルス系の両者を調製するために適当なパッケージングウイルス系列の例には、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２およびΨＡｍが含まれる。レトロウイルスは、種々の遺伝子を、インビトロおよび／またはインビボで上皮細胞を含む多くの異なった細胞型中に導入するために使用されてきた（例えば、Eglitis, et al. (1985) Science 230:1395-1398；Danos and Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464；Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018；Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145；Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043；Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381；Chowdhury et al. (1991) Science 254:1802-1805；van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644；Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647；Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895；Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150:4104-4115；米国特許第４，８６８，１１６号明細書；米国特許第４，９８０，２８６号明細書；ＰＣＴ出願国際公開第８９／０７１３６号パンフレット；ＰＣＴ出願国際公開第８９／０２４６８号パンフレット；ＰＣＴ出願国際公開第８９／０５３４５号パンフレット；およびＰＣＴ出願国際公開第９２／０７５７３号パンフレットを参照されたい）。

本発明の方法で有用な別のウイルスの遺伝子送達系は、アデノウイルス誘導ベクターを利用する。アデノウイルスのゲノムは、それが目的の遺伝子産物をコードおよび発現するように操作することができるが、正常な細胞を溶解するウイルスのライフサイクルで複製するその能力に関して不活性化されている。例えば、Berkner et al., BioTechniques 6:616 (1988)；Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991)；およびRosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992)を参照されたい。アデノウイルス系統のＡｄタイプ５ｄｌ３２４または他の系統のアデノウイルス（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、またはＡｄ７その他）から誘導された適当なアデノウイルスベクターが当業者に知られている。組み替えアデノウイルスは、それらは、非***細胞に感染することができず、上皮細胞を含む広範囲の細胞型への感染のために使用することができることで、ある状況では有利であり得る（Rosenfeld et al.,(1992)前出）。さらに、ウイルス粒子は比較的安定であり、精製および濃縮に対応できて、上記のように、感染力のスペクトルに影響するように改変することができる。それに加えて、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびその中に含有される外来ＤＮＡ）は宿主細胞のゲノムに組み込まれず、エピソームにとどまり、それによりその場で挿入変異の結果として、導入されたＤＮＡが宿主ゲノムに組み込まれる場合に（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）起こり得る可能性のある問題を回避する。その上、外来ＤＮＡのためのアデノウイルスゲノムの運搬能は、他の遺伝子送達ベクターと比較して大きい（８キロ塩基まで）（Berkner et al., 前出; Haj-Ahmand and Graham, J. Virol. 57:267 (1986)）。

いくつかの実施形態において、ＰＲＰＦ３１をコードする遺伝子は、それらの表面に正電荷を有するリポソーム（例えば、リポフェクチン）に捕捉されており、それは標的組織の細胞表面抗原に対する抗体でタグを付けられる得る（Mizuno et al., No Shinkei Geka 20:547-551 (1992)；国際公開第９１／０６３０９号パンフレット；日本特許出願第１０４７３８１号明細書；および欧州特許出願公開第４３０７５号明細書）。

臨床環境で、治療遺伝子のための遺伝子送達系は、各々当技術分野でよく知られている多くの方法のいずれかにより対象に導入することができる。他の方法も使用することができるが、いくつかの実施形態において、遺伝子療法ベクターを網膜に送達するために選択される経路は、網膜下注射によるものである。これは、網膜のＲＰＥおよび光受容体細胞への接近を提供する。種々のＡＡＶの血清型が、動物の検討において、網膜下に注射後にこれらの細胞集団に効果的に形質導入することが示された（Vandenberghe et al., PLoS One. 2013;8:e53463. PMCID: 3559681; Vandenberghe and Auricchio, Gene Therapy. 2012;19:162-8；Vandenberghe et al., Science translational medicine. 2011;3:88ra54；Dinculescu et al., HumGene Ther. 2005;16:649-63；Boye et al., Mol Ther. 2013;21:509-19；Alexander and Hauswirth, Adv Exp Med Biol. 2008;613:121-8）。網膜下注射の手法は、ＲＰＥ６５における変異およびＣＨＭ遺伝子の遺伝的疾患により引き起こされる網膜変性のための遺伝子増強療法の現在進行中の臨床試験で使用されている（Maguire et al., New England Journal of Medicine. 2008;358:2240-8；Bainbridge et al., New England Journal of Medicine. 2008;358:2231-9；Cideciyan et al., Proceedings National Academy Sciences USA. 2008;105:15112-7；Maguire et al., Lancet. 2009;374:1597-605；Jacobson et al., Archives Ophthalmology. 2012;130:9-24；Bennett et al., Science translational medicine. 2012;4:120ra15；MacLaren et al., Lancet. 2014;383:1129-37）。網膜下注射は、標準的外科手法を使用して実施することができる（例えば、Maguire et al., 2008 前出；Bainbridge et al., 2008 前出；Cideciyan et al., 2008 前出；MacLaren et al., 2014 前出に記載されたように）。

遺伝子療法構築物の医薬製剤は、許容される希釈剤中の遺伝子送達系（ウイルスベクターおよびヘルパーウイルス、タンパク質、および脂質などの任意の関連する作用物質）から本質的になるか、または遺伝子送達ビヒクルが、包埋された徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは、完全な遺伝子送達系が、組み替え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから完全に生成され得る場合には、医薬製剤は、遺伝子送達系を生成する１種または複数種の細胞を含むことができる。
実施例

本発明を、以下の実施例でさらに説明するが、これらの実施例は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定しない。

ｍＲＮＡ前駆体プロセシング因子３、８および３１における変異は、網膜色素上皮の機能不全を引き起こす。
序
スプライセオソームは、新生ＲＮＡからイントロンを除去するために必要な、遍在する動的リボ核タンパク質高分子である^１。常染色体の優性の網膜色素変性（ＲＰ）の原因となる変異は、Ｕ４／Ｕ６．Ｕ５トリ−ｓｎＲＮＰ^２に見出されるタンパク質（ＰＲＰＦ３、ＰＲＰＦ４、ＰＲＰＦ６、ＰＲＰＦ８、ＰＲＰＦ３１、およびＳＮＲＮＰ２００）をコードする６種の遺伝子中で同定された。全体として、これらの遺伝子における変異は、優性のＲＰの２番目に多い一般的な原因である^３〜５。ＲＰは進行性の後期発症性の失明により定義され、遺伝性の網膜変性の最も一般的な形態であり、世界中で約１：３５００の個体が罹患する^６。それは遺伝的に不均一であり、メンデル遺伝の３通り全ての様式を示す^７。罹患組織は、神経網膜、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、および脈絡膜を含む^４。スプライセオソームの成分は、あらゆる細胞型で普遍的に発現するので、これらのスプライシング因子における変異が、非症候性ＲＰのみを引き起こす理由は明らかでない。さらに、これらの変異によって罹患した網膜に特異的な細胞型（単数または複数）は未だ同定されていない。

本発明者らは、Ｐｒｐｆ３、Ｐｒｐｆ８およびＰｒｐｆ３１ノックアウトマウス、ならびにＰｒｐｆ３−Ｔ４９４ＭおよびＰｒｐｆ８−Ｈ２３０９Ｐノックインマウスを含むマウスモデルのＰＲＰＦ３、ＰＲＰＦ８およびＰＲＰＦ３１遺伝子における変異に基づくＲＮＡスプライシング因子ＲＰのキャラクタリゼーションを以前に報告した^８、９。これらのマウスモデルの検討結果、およびヒトの検討によるデータに基づいて、ＰＲＰＦ３およびＰＲＰＦ８における変異は、機能獲得または優性ネガティブ機構により優性の疾患を引き起こすが、一方、ＰＲＰＦ３１における変異は、ハプロ不全により疾患を引き起こすと考えられる^９〜１１。Ｐｒｐｆ３−Ｔ４９４ＭおよびＰｒｐｆ８−Ｈ２３０９ＰノックインマウスおよびＰｒｐｆ３１^＋／−マウスの老化するＲＰＥ（神経網膜ではなく）における形態学的変化については、本発明者らは、基底陥入の消失、ＲＰＥ下における基底沈着物の形成および細胞原形質中の空胞形成を観察し、特に興味深かった。これらのＲＰＥの変性性の変化は、ヘテロ接合のＰｒｐｆ３^{Ｔ４９４Ｍ／＋}、Ｐｒｐｆ８^{Ｈ２３０９Ｐ／＋}およびＰｒｐｆ３１^＋／−マウスで観察され、ホモ接合体のＰｒｐｆ３^{Ｔ４９４Ｍ／Ｔ４９４Ｍ}およびＰｒｐｆ８^{Ｈ２３０９Ｐ／Ｈ２３０９Ｐ}ノックインマウスにおいてはさらに顕著であった^８。

ＲＰＥは、網膜の全体的健康状態にとって極めて重要である^１２。消費された光受容体外側セグメント末端（ＰＯＳ）の日々の脱離は、高度に互いに整合的に作用するプロセスであり、脱落するＰＯＳに対する食作用は、周期的基調で起こる^１３。ＰＯＳ食作用に関係する一部の受容体は、全体的な網膜接着およびその生理学的リズムにも関与する^１４。最高の食作用および網膜接着は、光照射開始後それぞれ約２および３．５時間に起こり、およそその１０時間後にそれらの最少レベルになる^{１３、１５、１４}。ＲＰＥは専門のマクロファージであり、そこで、基質の結合および内部移行は、ＲＰＥ細胞上の受容体と光受容体間マトリックス中のリガンドとがそれぞれＲＰＥ細胞とＰＯＳ表面にあるホスファチジルセリンとを架橋することにより調整されている^１６。一部の受容体は、食作用および接着の間で共通であるが、それらは異なったリガンドを使用する^{１３、１４、１５、１７}。食作用のこれらの重要な成分のいずれかの調節の喪失は、ヒト疾患における失明に結びつき、齧歯目モデルにおいても同様である^{１３、１８〜２０}。

ここで、本発明者らは、Ｐｒｐｆ^{３Ｔ４９４Ｍ／Ｔ４９４Ｍ}、Ｐｒｐｆ８^{Ｈ２３０９Ｐ／Ｈ２３０９Ｐ}およびＰｒｐｆ３１^＋／−マウスモデルについて、ＲＰＥ食作用および接着の検討を報告する。具体的には、本発明者らは、２週齢マウスからの初代ＲＰＥ培養における食作用を測定した。結果は食作用の欠損を示し、本発明者らは、食作用の欠損を、ヒトＲＰＥ細胞系列ＡＲＰＥ−１９においてもＰＲＰＦ３１のｓｈＲＮＡにより媒介されるノックダウン後に示す。それに加えて、食作用および接着の日周的な周期性の消失が、インビボで検出された。興味深いことに、ＲＰＥ細胞による食作用に関与することが知られている重要な因子の局在が変更されている。本発明者らは、ＲＰＥが、ＲＮＡスプライシング因子ＲＰ中の病原性の主要な部位であるらしいと結論する。

材料および方法
動物
動物による研究は、ｔｈｅ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｅｙｅ ａｎｄ Ｅａｒ Ｉｎｆｉｒｍａｒｙのｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓおよびｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｐｉｅｒｒｅ ｅｔ Ｍａｒｉｅ Ｃｕｒｉｅ−Ｐａｒｉｓからのｔｈｅ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｄａｒｗｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｅｔｈｉｃｓ ＣＯｍｍｉｔｔｅｅにより承認されたプロトコルの下で実施された。同数の雄および雌マウスを以下の実験の各々で使用した。

初代ＲＰＥ細胞培養
日齢９〜１０日の動物からのＲＰＥ細胞を記載したようにして単離した^１３。簡単に説明すると、眼杯を２ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）で消化して、神経網膜を眼杯から丁寧に剥離した。１ｍｇ／ｍｌのトリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で消化した後、ＲＰＥをＢｒｕｃｈ膜から剥離して５ｍｍのカバーガラス上に播種した。細胞を、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中において３７℃、５％ＣＯ_２でコンフルエントになるまで５〜１０日間増殖させた。

腹腔マクロファージ細胞の初代培養
腹腔の常在マクロファージを以前に記載したようにして単離した^２１。安楽死させたマウスを解剖台にピンで留めて、水平なフローフード中で毛皮を７０％エタノールを使用して湿らせた。ピンセットおよび鋏を使用して、皮膚を腹腔壁から注意深く分離した。５ｍＬの滅菌ＰＢＳを腹部の空洞に注入して、２０〜３０秒間臍を揉むかまたは全身を揺すった。ＰＢＳを腹部空洞からゆっくりと集めて、２から３匹の異なる動物からの試料をプールした。細胞を１０分間３００ｇでスピンにかけて、１０％ＦＢＳを添加した１ｍＬのＲＰＭＩ中に再懸濁させた。細胞を９６ウェルのプレートに１ウェル当たり１００，０００〜２００，０００細胞で播種して、２時間接着するに任せた。プレートを振盪して、滅菌ＰＢＳを使用してウェルを１回すすいだ。細胞を培地中で２〜３日の間３７℃、５％ＣＯ_２に保った。

安定なｓｈＲＮＡ−ＰＲＰＦ３１ノックダウンＡＲＰＥ−１９およびＪ７７４．１細胞系列の生成および細胞の生存能力アッセイ
３種のｓｈＲＮＡをヒトＰＲＰＦ３１またはマウスＰｒｐｆ３１に設計して、ピューロマイシン耐性遺伝子を含有するｐＣＡＧ−ｍｉｒ３０ベクター中にクローニングした。これらのｓｈＲＮＡの配列は以下の通りである。ヒトｓｈＲＮＡ１−５’−ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＡＧＡＴＧＡＧＣＴＣＴＴＡＧＣＴＧＡＴＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＡＴＣＡＧＣＴＡＡＧＡＧＣＴＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ−３’（配列番号２７）、ヒトｓｈＲＮＡ２−５’−ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＡＣＣＣＡＡＣＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡＴＴＡＴＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＡＴＡＡＴＧＡＴＧＧＡＣＡＧＧＴＴＧＧＧＴＧＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ−３’（配列番号２８）、およびヒトｓｈＲＮＡ３−５’−ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＣＡＡＧＧＴＣＡＡＧＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＣＴＴＧＡＣＣＴＴＧＡＧＧＡＡＣＴＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ−３’（配列番号２９）；マウスｓｈＲＮＡ１−５’−ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＧＴＣＡＡＧＡＧＣＡＴＴＧＣＣＡＡＧＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＣＴＴＧＧＣＡＡＴＧＣＴＣＴＴＧＡＣＴＧＡＡＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ−３’（配列番号３０）、マウスｓｈＲＮＡ２−５’−ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＣＴＴＣＴＣＴＴＣＴＡＣＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＧＴＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＣＣＡＧＡＣＡＧＧＧＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ−３’（配列番号３１）、およびマウスｓｈＲＮＡ３−５’−ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＣＧＡＧＴＴＣＣＴＣＡＡＧＧＴＣＡＡＧＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＣＴＴＧＡＣＣＴＴＧＡＧＧＡＡＣＴＣＧＧＣＣＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ−３’（配列番号３２）。本発明者らは、緑色蛍光タンパク質に対するｓｈＲＮＡをこのベクター中に非標的対照としてクローニングした（５’−ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＴＣＣＧＡＡＣＧＴＧＴＡＴＣＡＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＡＡＣＧＴＧＡＴＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＡＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ−３’（配列番号３３））。ｓｈＲＮＡを含有するベクターをＰｓｔＩで線状化して、Ａｍａｘａ電気穿孔法キットＶ（Ａｍａｘａ）を使用して、別々のＡＲＰＥ−１９（ヒトＲＰＥ細胞系列、ＡＴＣＣ）またはＪ７７４Ａ．１（マウスマクロファージ細胞系列、ＡＴＣＣ）培養物にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を６ウェルプレートおよび２ｍＬの培養培地（１：１ＤＭＥＭ：１０％ＦＢＳ添加Ｆ−１２）に移した。トランスフェクトされた細胞を、終夜３７℃、５％ＣＯ_２で増殖させた。トランスフェクション後２４時間に、１μｇ／ｍｌ（ＡＲＰＥ−１９）から１．２５（Ｊ７７４Ａ．１）μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）を添加して、安定な細胞系列を選択した。培地およびピューロマイシンを２日毎に１０日間更新した。選択後、４種のＡＲＰＥ−１９および４種のＪ７７４Ａ．１ノックダウン系列をコンフルエントになるまで増殖させた。ノックダウンの有効度を決定するために、安定な系列に、ＡＲＰＥ−１９細胞中のＶ５でタグを付けたＰＲＰＦ３１、またはＧａｔｅｗａｙ Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングされたＶ５でタグを付けたＰｒｐｆ３１のいずれかを一過性にトランスフェクトした。ウェスタンブロットを実施して、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外撮像装置（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を使用してＶ５でタグを付けたＰＲＰＦ３１を定量した。細胞生存能力アッセイは、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の推奨に従って使用して実施した。簡単に説明すると、ＡＲＰＥ−１９細胞を、９６ウェルの細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３９０４）に１，０００細胞／ウェルの密度で播種した。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で３日間増殖させた。この期間の後、細胞の生存能力をルミネッセンスにより測定し、スチューデントｔ−検定を使用して統計的有意性を決定した。

インビトロにおける食作用アッセイ
光受容体外側セグメントを屠殺場から得られた新鮮なブタの眼から単離し、以前に記載したインビトロ食作用アッセイ^１３のために、ＦＩＴＣ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて共有結合で標識した。コンフルエントに培養されたＲＰＥ細胞を、１細胞当たり約１０ＦＩＴＣ−ＰＯＳでチャレンジし１．５時間置いた。１ｍＭ ＭｇＣｌ_２および０．２ｍＭ ＣａＣｌ_２を添加したＰＢＳで３回洗浄して、非特異的に結合したＰＯＳを徹底的に除去した。内在化したＰＯＳを測定するために、一部のウェルをトリパンブルーと１０分間インキュベートして、表面に結合したＦＩＴＣ標識されたＰＯＳの蛍光を以前に記載したように^２６消光した。細胞を氷冷メタノールで固定して、核をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＤＡＰＩ（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）で対比染色した。細胞を、Ｎｉｋｏｎ Ｔｉ２またはＬｅｉｃａ ＤＭ６０００蛍光顕微鏡を２０×で使用して撮像した。ＲＰＥ初代培養について、ＦＩＴＣ／ＤＡＰＩ比を、全ての視野で、１細胞当たりのＰＯＳの数に対応して計算した。ＦＩＴＣ−ＰＯＳを１細胞基準で１００細胞について計算して、ＡＲＰＥ−１９について３個のウェルで平均を決定した。腹腔マクロファージについて、ＦＩＴＣ−ＰＯＳおよびＤＡＰＩ標識された核を蛍光プレートの読みにより定量した（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００、Ｍａｇｅｌｌａｎ６ソフトウェア、Ｔｅｃａｎ）。結合比は、内部移行ウェル（トリパンブルー処理した）で得られた結果を全食作用（未処理）ウェルから差し引くことにより計算した。これを、３から６回の独立のアッセイについて実施して、有意性をスチューデントｔ−検定（Ｐ＜０．０５）を使用して決定した。

食作用に先立って、安定なノックダウンＪ７７４Ａ．１系列のコンフルエント培養物を、Ｚｙｍｏｓａｎ Ａ Ｂｉｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｏｐｓｏｎｉｚｉｎｇ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者のプロトコルに従って使用してオプソニン化した。オプソニン化の後、培養培地中で再構成された１μｇのＺｙｍｏｓａｎ Ａ Ｂｉｏｐａｒｔｉｃｌｅを９６ウェルプレートの各培養ウェルに適用した。培養物を３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした。固定および食作用レベルの決定は、上で記載したようにして実施した。

インビボにおける日周的な周期性のアッセイ
マウスは、光照射開始の２時間前（−２）、光照射開始時（０）、ならびに光照射開始後２、４、および８時間に（＋２、＋４、＋８）安楽死させて、電子顕微鏡またはパラフィン包埋のいずれかのために、前に記載したように^{１３、１５}処理した。電子顕微鏡のためには、全ての試薬を、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。マウスを、２％グルタルアルデヒド＋２％パラホルムアルデヒドで灌流して、眼杯を、０．２Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液を添加した灌流緩衝液に移した。６０から８０ナノメートルの超薄切片を、クエン酸鉛／酢酸ウラニルで染色して、視神経から２００ｎＭ離れた初期ファゴソームを計数した。初期ファゴソームは、以下の基準：１）それがＲＰＥの細胞原形質内に含有されていること、および２）視認できる層状構造を有すること、に合致する場合に計数する。光顕微鏡のためには、眼杯をホルムアルデヒド／エタノール／酢酸中で固定して、Ｏｔｔｉｘ Ｐｌｕｓ溶媒代用品（ＤｉａＰａｔｈ）を使用してパラフィン包埋した。５マイクロメートルの切片に切り、ＳａｆｅＳｏｌｖ溶媒代用品を使用してパラフィンを除去した。切片を再水和して、色素を漂白するために、照明下で１０分間１×ＳＳＣ中５％Ｈ_２Ｏ_２でインキュベートした。１×ＴＢＳ中の１０％ＢＳＡ使用して非特異的シグナル伝達を遮断した後、抗ロドプシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および抗マウスＩｇＧ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて切片を染色した。核はＤＡＰＩで染色して、（標準的手順に従って調製した）Ｍｏｗｉｏｌを用いてスライドにマウントした。像のスタックは、６０×油浸対物レンズを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００倒立共焦点顕微鏡で、４倍ズームおよび０．４１μｍステップサイズ走査で得て、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ６ソフトウェアを使用して処理した。少なくとも１００μｍの連続した網膜／ＲＰＥの領域が１０回走査のスタックで計数された。各実験シリーズにおいて、ファゴソームの数は、網膜の長さに対して正規化して平均した。有意性は、スチューデントのｔ−検定を使用して（Ｐ＜０．０５）、全ての実験についてＮ＝２〜５で決定した。

インビボにおける網膜の接着アッセイ
本発明者らは、記載したようにして^１４インビボにおける網膜の接着アッセイを実施した。簡単に説明すると、水晶体および角膜を眼杯から取り外して、直ちにカルシウムおよびマグネシウムを添加したＨａｎｋｓ生理食塩水緩衝液中で検死解剖する。視神経に放射状の切断を行い、神経網膜を平板化された眼杯から丁寧に剥離した。神経網膜試料を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、０．１％ＳＤＳ、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）および１ｍＭ ＰＭＳＦを添加した１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０中で溶解した。清澄化した上清からのタンパク質を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して定量し、等濃度をＲＰＥ６５（ＡｂｃａｍまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびベータ−アクチン（ＡｂｃａｍまたはＳｉｇｍａ）に対してイムノブロットした。メラニン色素を、不溶性の神経網膜のペレットから２０％ＤＭＳＯ、２Ｎ ＮａＯＨを用いて抽出した。試料および市販のメラニン標準（Ｓｉｇｍａ）を、吸光度を４９０ｎＭで測定することにより定量した。異なった組織収率を説明するために、各試料で色素の存在量をタンパク質濃度に対して正規化した。イムノブロットのバンドを、ＩｍａｇｅＪソフトウェアｖ１．４６ｒを使用して、全てのブロットに対して参照として共通の試料を使用して定量し、次にシグナルを平均した。有意性は、スチューデントのｔ−検定を使用して（Ｐ＜０．０５）、全ての実験についてＮ＝３〜６で決定した。

免疫蛍光顕微鏡
凍結切片のために、眼杯を２％パラホルムアルデヒド中で固定して、３０％スクロース中で終夜４℃でインキュベートした。眼杯をＯ．Ｃ．Ｔ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｓａｋｕｒａ）中に包埋して、１０μｍの切片を切った。切片を個々に、αｖインテグリン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、β５インテグリン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＭｅｒＴＫ（ＦａｂＧｅｎｎｉｘ）、Ｍｆｇ−Ｅ８およびＧａｓ６（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＦＡＫクローン２Ａ７（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、およびタンパク質Ｓ（Ｓｉｇｍａ）に対する一次抗体とインキュベートし、続いてＩｇＧ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートした。核は、ＤＡＰＩで染色して、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてマウントした。画像は、油浸６０×対物レンズを使用するＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ倒立蛍光顕微鏡を用いて撮った。画像をＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）で処理した。

パラフィン切片のためには、動物を食作用のピーク時に屠殺して、眼をＤａｖｉｄｓｏｎ固定剤中で３時間４℃で固定し、次に水晶体および角膜を取り出した。眼杯をパラフィン中に包埋して５μｍ切片を切った。切片を「インビボにおける日周的な周期性のアッセイ」の節で記載したように処理して、αｖインテグリン（Ｃｏｖａｎｃｅ）、β５インテグリン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｍｆｇ−Ｅ８、ＭｅｒＴＫおよびＧａｓ６（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＦＡＫクローン２Ａ７（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、およびタンパク質Ｓ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）に対する一次抗体と個々にインキュベートして、続いてＩｇＧ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、二次抗体とのインキュベーションを行った。核をＤＡＰＩで染色して、Ｍｏｗｉｏｌを用いてスライドにマウントした。画像を、４０×油浸対物プリズムを使用するＬｅｉｃａ ＤＭ６０００Ｂ落射蛍光顕微鏡を用いて撮った。画像を、ＩｍａｇｅＪ ｖ１．４６ｒおよびＰｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ６ソフトウェアで処理した。

結果
ＲＰＥの食作用はＰｒｐｆ変異マウスで低下する
Ｐｒｐｆ変異マウスの本発明者らの独自のキャラクタリゼーションで、電子顕微鏡により、１から２歳の変異体における形態学的変化が確認された^８。ここで、本発明者らは、機能的変化が観察された形態学的変化に先行するかどうかを決定することを企てた。ＲＰＥは培養中に食作用活性を維持するので、本発明者らは、日齢９〜１０日のＰｒｐｆ３^{Ｔ４９４Ｍ／Ｔ４９４Ｍ}、Ｐｒｐｆ８^{Ｈ２３０９Ｐ／Ｈ２３０９Ｐ}、Ｐｒｐｆ３１^＋／−マウスおよびそれらの対応する同腹子対照から独立の初代ＲＰＥ培養を確立した。培養物がコンフルエントになったら、本発明者らは、１．５時間のインキュベーション後にＦＩＴＣ標識されたブタＰＯＳを使用して食作用を測定した。図１Ａ（パネル１〜３）は、Ｐｒｐｆ変異マウスおよびそれらの同腹子対照からのＲＰＥ細胞のＰＯＳ結合／取り込みを例示して、変異マウスによる食作用における定性的欠損を示す初代培養の代表的画像を示す。３種全ての変異体モデルにおいて、食作用における３７〜４８％の減少が観察された（Ｎ＝３〜５、Ｐ＜０．０５）（図１Ｂ）。ＰＯＳのカバーガラスへの非特異的結合を数えるために、本発明者らは、細胞を含有しないカバーガラス上で食作用のアッセイが実施される陰性対照を実験した。本発明者らは、ＰＯＳのカバーガラスへのいかなる非特異的接着も観察しなかった（データ掲載せず）。

本発明者らは、結合と内部移行との間の食作用の特異的ステップが、Ｐｒｐｆ３１^＋／−ＲＰＥの初代培養で優先的に妨げられるかどうかを調べた。１．５時間食作用チャレンジを実施した後、本発明者らは、内在化したＰＯＳのみを定量するために、細胞を処理して表面（結合したＰＯＳ）の蛍光を消光した。ＰＯＳの結合は、変異体細胞で５３±１１％有意に減少した（Ｎ＝２〜５、Ｐ＜０．０５）が、野生型と変異体のＲＰＥ培養との間におけるＰＯＳ内部移行率に有意な差はなかった（図１Ｃ）。

現在、ＰＲＰＦ３１には６４通りの知られた病原性変異があり、その多くはフレームのシフトが生じて、ナンセンス媒介崩壊経路を通って分解される^{２、１０、１１、２２}。ＡＲＰＥ−１９は、自発的に不死化したヒトＲＰＥ細胞系列であり、トランスフェクションを受けやすく食作用能力を保持する^２３。スプライシング因子における変異がヒトＲＰＥモデルでも食作用に影響するかどうかを試験するために、本発明者らは、転写物の５’、３’および中部領域に対する３種の別個のｓｈＲＮＡを使用して、ＰＲＰＦ３１のｓｈＲＮＡにより媒介されるノックダウンを有する３種の安定なＡＲＰＥ−１９細胞系列を創り出した（図１Ｄ）。本発明者らは、対照として使用するために緑色蛍光性タンパク質に対するｓｈＲＮＡを有する第４の安定な細胞系列も生成した。３種のＰＲＰＦ３１ ｓｈＲＮＡ安定な細胞系列の各々で、本発明者らは、約６０〜９５％のＰＲＰＦ３１のノックダウンを達成した（データ掲載せず）。ｓｈＲＮＡ−ノックダウンおよび非標的とされる対照ＡＲＰＥ−１９細胞の細胞生存能力アッセイは、有意の低下が、ＰＲＰＦ３１のノックダウンと関連して起こることはないことを示した（図１Ｅ）。食作用は試験された各系列で、標的とされない対照ｓｈＲＮＡ系列と比較して約４０％減少した（図１Ｆ）。初代ＲＰＥに対して実施された食作用のアッセイと同様に、本発明者らは、陰性対照のアッセイも実施し、ＰＯＳのカバーガラスへのいかなる非特異的接着も観察しなかった（データ掲載せず）。

食作用のはたらきの混乱がＲＰＥに特異的な機構であるか、または他の食作用細胞でも観察され得るかを決定するために、本発明者らは、マウスマクロファージ細胞系列、Ｊ７７４Ａ．１において、Ｐｒｐｆ３１をノックダウンした。ＡＲＰＥ−１９細胞系列におけるノックダウンの検討と同様に、３種の別個のｓｈＲＮＡを、転写物の５’−、３’−末端および中部に対するものとした。本発明者らは前の検討と同じ対照ｓｈＲＮＡを使用した。安定なＰｒｐｆ３１細胞系列の各々で、本発明者らは、Ｐｒｐｆ３１の約４５〜７０％ノックダウンを達成した（補足の図１Ａ）。本発明者らは、試験された系列のいずれにおいてもいかなる食作用欠損も観察しなかった（補足の図１Ｂ）。本発明者らが非特異的ＰＯＳ接着を観察しなかったことを確かめるために、本発明者らは、以前の実験シリーズに対するように陰性対照のアッセイを実施した（データ掲載せず）。同一の実験を、Ｐｒｐｆ３１^＋／−マウスから単離されたマウスの初代腹腔マクロファージで繰り返した。興味深いことに、野生型マクロファージと比較して、Ｐｒｐｆ３１変異体では、食作用のステップ、すなわち結合または内部移行も、全食作用も、影響されなかった（補足の図１Ｃ）。

食作用の日周的な周期性が乱される
光照射開始後２時間でピークになり、その日の残りには比較的不活性にとどまる^１３強い日周的な、同期されたリズムに従って、脱落したＰＯＳのＲＰＥによる食作用が生じる。本発明者らは、光サイクルを通して５つの時点で、インビボにおける食作用を、電子顕微鏡（図２Ａ、Ｐｒｐｆ３およびＰｒｐｆ８変異体）または免疫蛍光（図２Ｂ、Ｐｒｐｆ３１変異体）のいずれか（両方共、ＲＰＥの食作用のリズムを推定する認められた技法^{１３、１５}）を使用して、測定した。Ｐｒｐｆ３およびＰｒｐｆ８の対照および変異マウスについて、本発明者らは、電子顕微鏡写真で層状の構造（図２Ａ、挿入された矢じりは層状の構造を示す）を含有する初期のファゴソームを計数した。食作用の周期性は、パラフィン包埋およびロドプシンに対する染色を使用して、Ｐｒｐｆ３１^＋／−マウスで決定して、本発明者らは、ＲＰＥ細胞層に存在するファゴソーム（図２Ｂ、矢じり）を計数した。本発明者らは、光照射開始後２時間に全ての対照マウスで食作用のバーストを観察して、網膜の切片の１００μｍ当たり２２〜２６個のファゴソームを確認した（図２Ｃ、＋２時点）。対照的に、変異マウスは、同じピーク時点で１０〜１４個のファゴソームを示しただけであった。光照射の他の間：暗サイクルでは、食作用レベルは対照マウスでは比較的低いままであり（「ピークオフ時間」、２〜１２個のファゴソーム／１００μｍ網膜）、これらのレベルは、変異マウスでは一般的に上昇した（６〜１４個のファゴソーム／１００μｍ網膜）。これらの結果は、変異マウスの３種全てのタイプにおいて食作用のピーク強度における低下を示し、ピーク時が広がってそれがＰｒｐｆ３およびＰｒｐｆ８変異体ではより長く持続して、Ｐｒｐｆ３１変異体ではより早く始まる。さらに、Ｐｒｐｆ８変異体は、ピークオフ時点で（＋８時間）、ＷＴ対照と比較して有意により多くのファゴソームを有する。

減少した網膜の接着がピーク時点で観察される
ＲＰＥ頂点の微絨毛とＰＯＳの末端の先端との間の接着は、同期されたリズムに従って、最大強度は光照射開始後３．５時間に、食作用のピークのわずかに後に起こることが知られている^４，１５。接着は、安楽死の直後に平坦化された眼杯から網膜を剥離し、次に網膜に移されたＲＰＥ６５などのＲＰＥメラニン含有率および頂点のＲＰＥタンパク質マーカーの両者を定量することにより、決定することができる。この方法を使用して、本発明者らは、Ｐｒｐｆ変異マウスおよび同腹子対照で、光照射開始後３．５および８．５時間に（それぞれ、ピーク時およびピークオフの接着）接着を推定した。ＲＰＥ接着は、先ず標準的メラニン定量の手順^１４、次にメラニン生成を確認するためにＲＰＥ６５の存在についてウェスタンブロットを使用して定量した。本発明者らは、ピーク時におけるＰｒｐｆ３^{Ｔ４９４Ｍ／Ｔ４９４Ｍ}のメラニン含有率が５６±１６％減少すること（Ｎ＝６、ｐ＜０．０５、変動は標準偏差に等しい）およびピークオフ時点における（図３Ａ）接着に有意の変化はないことを認めた。ウェスタンブロット分析により、ピーク接着における３０±２％減少でこの観察を確認した（図３Ｂ）。Ｐｒｐｆ８^{Ｈ２３０９Ｐ／Ｈ２３０９Ｐ}マウスにおけるメラニン定量は、接着が、ピーク時点で６１±２８％、およびピークオフ時点で５１±１６％と有意に減少することを示した（両時点共、Ｎ＝６、Ｐ＜０．０５）（図３Ａ）。しかしながら、ウェスタンブロット分析では、ピーク時点においてのみ有意の３６±１１％減少が確認された（図３Ｂ）。Ｐｒｐｆ３１^＋／−マウスでは、１５±１％の減少がピーク時点で観察されて（図３Ａ）、イムノブロット分析によって確認された（両方のパネルについて、Ｎ＝３〜７、Ｐ＜０．０５）（図３Ｂ、１４±１％）。

食作用および接着マーカーの局在
ＲＰＥ細胞は高度に分極しており、それらの機能はこの極性に依存する^２４。ＲＰＥで発現された多くのタンパク質の特異的局在は重要であり、局在における不規則性は、ＲＰまたはベスト病などの網膜ジストロフィーの原因となり得る^{２５、２６}。３種全てのＰｒｐｆ変異体マウスモデルにおける食作用および接着の両方の日周的なリズムの乱れがあると仮定し、本発明者らは、これらのプロセスにとって重要であることが知られているタンパク質の局在を特徴づけることを企てた。タンパク質の局在は、Ｐｒｐｆ３およびＰｒｐｆ８変異マウスについては凍結切片（図４）、およびＰｒｐｆ３１変異マウスについてはパラフィン切片でアッセイした（図５）。

前に示したように、主要な食作用の受容体（αｖβ５インテグリンおよびＭｅｒＴＫ）は、ＲＰＥ頂点の表面に局在しているが^２７、それらのリガンドは、ＰＯＳおよびＲＰＥの全体にわたって発現し得る^２８。興味深いことに、光受容体間マトリックスで発現された細胞外リガンドは、ＲＰＥおよび光受容体細胞の両方で合成され得る。

αｖβ５−インテグリンは、その関連するリガンドＭｆｇ−Ｅ８（乳脂肪小球体−ＥＧＦ８）と共に、食作用にとって重要であり、この機能の日周的な周期性の原因であることが示されている^{１３、１５}。それに加えて、αｖβ５−インテグリンは、網膜の接着およびそのリズムに関与するが、Ｍｆｇ−Ｅ８と異なるリガンドによる^{１４、１５、１７}。αｖインテグリンサブユニットは、ＲＰＥ細胞における数種のβインテグリンサブユニットと複合体で結びつき^１４、それ故それは、β５インテグリンサブユニットの発現の分析にさらに関連する。したがって、本発明者らは、αｖβ５インテグリン受容体のαｖおよびβ５サブユニットを別々に探索した。野生型組織では、各インテグリンはＲＰＥの頂点側に主として局在しており、一部の発現はＲＰＥ細胞全体にわたる。全ての３種のＰｒｐｆ変異体の組織において、αｖ−インテグリンの局在に変化は観察されなかった（図４Ａ、５Ａ）。対照的に、β５インテグリンは、Ｐｒｐｆ３およびＰｒｐｆ３１変異体の組織ではＲＰＥの基底側に主として局在しているが、それは、Ｐｒｐｆ８変異体のＲＰＥ細胞ではＲＰＥ全体にわたる均等な発現を示した。本発明者らは、ＲＰＥまたはＰＯＳのいずれにおいてもＭｆｇ−Ｅ８の局在における変化を観察しなかったが、Ｐｒｐｆ８および３１変異体の両方でより多く発現されているように思われる。

下流のシグナル伝達タンパク質ＦＡＫ（限局性接着キナーゼ）は、インビトロおよびインビボの両方で、αｖβ５インテグリンとＭｅｒＴＫ受容体間の逐次活性化のリンクを提供する^{２９、３０、１３}。ＦＡＫは、ＲＰＥ全体にわたって見出され、このパターンに対する変化は、Ｐｒｐｆ３またはＰｒｐｆ３１変異マウスでは観察されなかった（図４Ｂ、５Ｂ）。しかしながら、Ｐｒｐｆ８変異マウスは、ＲＰＥの基底側にＦＡＫの局在を示した。

食作用は、活性のピーク時にリン酸化によるＭｅｒＴＫの適時の活性化により推進される^{１３、３１、３２}。Ｇａｓ６およびタンパク質Ｓは、インビトロで脱落した外側セグメントの取り込みを刺激し得るＭｅｒＴＫのリガンドである^３３。二重ノックアウト動物は、ＭｅｒＴＫに受容体がないラットで起こる急速な網膜の変性を再現するので^３４、両リガンドは、ＰＯＳの内部移行に必要である。野生型組織におけるＭｅｒＴＫ発現は、ＲＰＥの頂点および基底膜の両方に局在するが、それに対してＭｅｒＴＫは、Ｐｒｐｆ３１変異体のＲＰＥ細胞の頂点側にだけ局在している（図４Ｃ、５Ｃ）。野生型組織では、第１のＭｅｒＴＫリガンドのＧａｓ６は、ＰＯＳに、およびＲＰＥの頂点の層に局在する。発現の減少はＰｒｐｆ３変異マウスのＰＯＳで観察され、散在性の発現がＲＰＥ全体にわたって見られる。Ｐｒｐｆ８変異マウスは、ＰＯＳ中におけるＧａｓ６発現を維持するが、ＲＰＥにおける頂点の局在を失うように見えて、やはりＲＰＥ全体にわたって散在性の発現を示す。局在の変化は、Ｐｒｐｆ３１変異マウスでは観察することができない。第２のＭｅｒＴＫリガンドタンパク質Ｓの発現は、野生型および全てのＰｒｐｆ変異マウス中のＰＯＳに特異的に局在している（図４Ｃ、５Ｃ）。

考察
ここで、本発明者らは、ＲＮＡスプライシング因子Ｐｒｐｆ３、８、および３１における変異を有するマウス中のＲＰＥの機能の最初のキャラクタリゼーションを報告する。本発明者らが以前報告したように、変異マウスでは、光受容体の変性はないが、むしろＲＰＥにおける形態学的変化がある^８。ＲＮＡスプライシング因子ＲＰは後期発症疾患であるから、これらの結果は、驚くことではなく、これらのモデルにより、本発明者らは、疾患の発症に導く機構を検討することができる。本発明者らの結果は、マウスにおいて、およびヒトにおいても、同様な食作用の欠損が、ＰＲＰＦ３１がノックダウンされたヒトＡＲＰＥ−１９細胞で観察されることを考慮に入れれば、ＲＰＥが、これらの３種のＲＮＡスプライシング因子の変異により罹患する主要な細胞型である可能性が高いことを示す。疾患の病原性の厳密な機構は未だ確認されていないが、これらのデータは、研究がＲＰＥに集中されることを許容する。例えば、これらの障害に罹患する主要な細胞型としてのＲＰＥの同定により、これらの検討をヒト細胞に拡大することが可能になるであろう。遺伝性の網膜疾患を有する患者のヒト由来の多分化能幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からＲＰＥ細胞を発生させることが現在では可能であるからである^{４２〜４５}。

実施例１のための参考文献
[1] Will CL, Luhrmann R: Spliceosome Structure and Function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 2011, 3.
[2] Liu MM, Zack DJ: Alternative splicing and retinal degeneration. Clinical Genetics 2013, 84: 142-149.
[3] Daiger SP, Bowne SJ, Sullivan LS: Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology 2007, 125:151-158.
[4] Hartong DT, Berson EL, Dryja TP: Retinitis pigmentosa. The Lancet 2006, 368:1795-809.
[5] Sullivan LS, Bowne SJ, Reeves MJ, Blain D, Goetz K, NDifor V, Vitez S, Wang X, Tumminia SJ, Daiger SP: Prevalence of Mutations in eyeGENE Probands With a Diagnosis of Autosomal Dominant Retinitis Pigmentosa. Investigative Ophthalmology & Visual Science 2013, 54:6255-61.
[6] Nishiguchi KM, Rivolta C: Genes Associated with Retinitis Pigmentosa and Allied Diseases Are Frequently Mutated in the General Population. PLoS ONE 2012, 7.
[7] Neveling K, Collin RWJ, Gilissen C, van Huet RAC, Visser L, Kwint MP, Gijsen SJ, Zonneveld MN, Wieskamp N, de Ligt J, Siemiatkowska AM, Hoefsloot LH, Buckley MF, Kellner U, Branham KE, den Hollander AI, Hoischen A, Hoyng C, Klevering BJ, van den Born LI, Veltman JA, Cremers FPM, Scheffer H: Next-generation genetic testing for retinitis pigmentosa. Human Mutation 2012, 33:963-72.
[8] Graziotto JJ, Farkas MH, Bujakowska K, Deramaudt BM, Zhang Q, Nandrot EF, Inglehearn CF, Bhattacharya SS, Pierce EA: Three gene-targeted mouse models of RNA splicing factor RP show late-onset RPE and retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science 2011, 52:190-8.
[9] Graziotto JJ, Inglehearn CF, Pack MA, Pierce EA: Decreased Levels of the RNA Splicing Factor Prpf3 in Mice and Zebrafish Do Not Cause Photoreceptor Degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science 2008, 49:3830-8.
[10] Rio Frio T, Wade NM, Ransijn A, Berson EL, Beckmann JS, Rivolta C: Premature termination codons in PRPF31 cause retinitis pigmentosa via haploinsufficiency due to nonsense-mediated mRNA decay. The Journal of Clinical Investigation 2008, 118:1519-31.
[11] Venturini G, Rose AM, Shah AZ, Bhattacharya SS, Rivolta C: CNOT3 is a modifier of PRPF31 mutations in retinitis pigmentosa with incomplete penetrance. PLoS Genetics 2012, 8.
[12] Kevany BM, Palczewski K: Phagocytosis of Retinal Rod and Cone Photoreceptors. Physiology 2010, 25:8-15.
[13] Nandrot EF, Kim Y, Brodie SE, Huang X, Sheppard D, Finnemann SC: Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. The Journal of Experimental Medicine 2004, 200:1539-45.
[14] Nandrot EF, Anand M, Sircar M, Finnemann SC: Novel role for alphavbeta5-integrin in retinal adhesion and its diurnal peak. American Journal of Physiology Cell Physiology 2006, 290(4):C1256-62.
[15] Nandrot EF, Anand M, Almeida D, Atabai K, Sheppard D, Finnemann SC: Essential role for MFG-E8 as ligand for alphavbeta5 integrin in diurnal retinal phagocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2007, 104:12005-10.
[16] Ruggiero L, Connor MP, Chen J, Langen R, Finnemann SC: Diurnal, localized exposure of phosphatidylserine by rod outer segment tips in wild-type but not Itgb5-/- or Mfge8-/- mouse retina. Proceedings of the National Academy of Sciences 2012, 109:8145-8.
[17] Nandrot EF, Finnemann SC: Lack of alphavbeta5 integrin receptor or its ligand MFG-E8: distinct effects on retinal function. Ophthalmic Research 2008, 40:120-3.
[18] Nandrot E, Dufour EM, Provost AC, Pequignot MO, Bonnel S, Gogat K, Marchant D, Rouillac C, Sepulchre de Conde B, Bihoreau M-T: Homozygous Deletion in the Coding Sequence of the c-mer Gene in RCS Rats Unravels General Mechanisms of Physiological Cell Adhesion and Apoptosis. Neurobiology of Disease 2000, 7:586-99.
[19] Issa PC, Bolz HJ, Ebermann I, Domeier E, Holz FG, Scholl HP: Characterisation of severe rod-cone dystrophy in a consanguineous family with a splice site mutation in the MERTK gene. British Journal of Ophthalmology 2009, 93:920-5.
[20] Ostergaard E, Duno M, Batbayli M, Vilhelmsen K, Rosenberg T: A novel MERTK deletion is a common founder mutation in the Faroe Islands and is responsible for a high proportion of retinitis pigmentosa cases. Molecular Vision 2011, 17:1485.
[21] Davies JQ and Gordon S: Isolation and culture of murine macrophages. Basic cell culture protocols 2005: 91-103.
[22] Stenson PD, Mort M, Ball EV, Shaw K, Phillips AD, Cooper DN: The Human Gene Mutation Database: building a comprehensive mutation repository for clinical and molecular genetics, diagnostic testing and personalized genomic medicine. Human Genetics 2013:1-9.
[23] Mao Y, Finnemann S: Analysis of Photoreceptor Outer Segment Phagocytosis by RPE Cells in Culture. Retinal Degeneration. Edited by Weber BHF, Langmann T. Humana Press, 2013. pp. 285-95.
[24] Marmorstein AD: The Polarity of the Retinal Pigment Epithelium. Traffic 2001, 2:867-72.
[25] Davidson AE, Millar ID, Urquhart JE, Burgess-Mullan R, Shweikh Y, Parry N, O'Sullivan J, Maher GJ, McKibbin M, Downes SM, Lotery AJ, Jacobson SG, Brown PD, Black GC, Manson FD: Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. American journal of Human Genetics 2009, 85:581-92.
[26] Lopes VS, Gibbs D, Libby RT, Aleman TS, Welch DL, Lillo C, Jacobson SG, Radu RA, Steel KP, Williams DS: The Usher 1B protein, MYO7A, is required for normal localization and function of the visual retinoid cycle enzyme, RPE65. Human Molecular Genetics 2011, 20:2560-70.
[27] Finnemann SC, Bonilha VL, Marmorstein AD, Rodriguez-Boulan E: Phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelial cells requires αvβ5 integrin for binding but not for internalization. Proceedings of the National Academy of Sciences 1997, 94:12932-7.
[28] Prasad D, Rothlin CV, Burrola P, Burstyn-Cohen T, Lu Q, Garcia de Frutos P, Lemke G: TAM receptor function in the retinal pigment epithelium. Molecular and Cellular Neuroscience 2006, 33:96-108.
[29] Finnemann SC: Focal adhesion kinase signaling promotes phagocytosis of integrin-bound photoreceptors. The EMBO Journal 2003, 22:4143-54.
[30] Qin S, Rodrigues GA: Roles of alphavbeta5, FAK and MerTK in oxidative stress inhibition of RPE cell phagocytosis. Experimental Eye Research 2012, 94:63-70.
[31] Nandrot EF, Silva KE, Scelfo C, Finnemann SC: Retinal pigment epithelial cells use a MerTK-dependent mechanism to limit the phagocytic particle binding activity of alphavbeta5 integrin. Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization 2012, 104:326-41.
[32] Hall MO, Obin MS, Heeb MJ, Burgess BL, Abrams TA: Both protein S and Gas6 stimulate outer segment phagocytosis by cultured rat retinal pigment epithelial cells. Experimental Eye Research 2005, 81:581-91.
[33] Burstyn-Cohen T, Lew ED, Traves PG, Burrola PG, Hash JC, Lemke G: Genetic Dissection of TAM Receptor-Ligand Interaction in Retinal Pigment Epithelial Cell Phagocytosis. Neuron 2012, 76:1123-32.
[34] Yin J, Brocher J, Fischer U, Winkler C: Mutant Prpf31 causes pre-mRNA splicing defects and rod photoreceptor cell degeneration in a zebrafish model for Retinitis pigmentosa. Molecular Neurodegeneration 2011, 6:1-18.
[35] Masland RH: Cell populations of the retina: the Proctor lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science 2011, 52:4581-91.
[36] Finnemann SC, Nandrot EF: MerTK activation during RPE phagocytosis in vivo requires alphaVbeta5 integrin. Advances in Experimental Medicine and Biology 2006, 572:499-503.
[37] Gal A, Li Y, Thompson DA, Weir J, Orth U, Jacobson SG, Apfelstedt-Sylla E, Vollrath D: Mutations in MERTK, the human orthologue of the RCS rat retinal dystrophy gene, cause retinitis pigmentosa. Nature Genetics 2000, 26:270-1.
[38] Mackay DS, Henderson RH, Sergouniotis PI, Li Z, Moradi P, Holder GE, Waseem N, Bhattacharya SS, Aldahmesh MA, Alkuraya FS: Novel mutations in MERTK associated with childhood onset rod-cone dystrophy. Molecular Vision 2010, 16:369-377.
[39] Tschernutter M, Jenkins S, Waseem N, Saihan Z, Holder G, Bird A, Bhattacharya S, Ali R, Webster A: Clinical characterisation of a family with retinal dystrophy caused by mutation in the Mertk gene. British Journal of Ophthalmology 2006, 90:718-23.
[40] Taniguchi-Ikeda M, Kobayashi K, Kanagawa M, Yu C-c, Mori K, Oda T, Kuga A, Kurahashi H, Akman HO, DiMauro S: Pathogenic exon-trapping by SVA retrotransposon and rescue in Fukuyama muscular dystrophy. Nature 2011, 478:127-31.
[41] Dell’Angelica EC: AP-3-dependent trafficking and disease: the first decade. Current Opinion in Cell Biology 2009, 21:552-9.
[42] Farkas MH, Grant GR, White JA, Sousa ME, Consugar MB, Pierce EA: Transcriptome analyses of the human retina identify unprecedented transcript diversity and 3.5 Mb of novel transcribed sequence via significant alternative splicing and novel genes. BMC Genomics 2013, 14: 486.
[43] Buchholz DE, Pennington BO, Croze RH, Hinman CR, Coffey PJ, Clegg DO: Rapid and Efficient Directed Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Retinal Pigmented Epithelium. Stem Cells Translational Medicine 2013, 2:384-93.
[44] Meyer JS, Howden SE, Wallace KA, Verhoeven AD, Wright LS, Capowski EE, Pinilla I, Martin JM, Tian S, Stewart R: Optic Vesicle-like Structures Derived from Human Pluripotent Stem Cells Facilitate a Customized Approach to Retinal Disease Treatment. Stem Cells 2011, 29:1206-18.
[45] Singh R, Phillips MJ, Kuai D, Meyer J, Martin JM, Smith MA, Perez ET, Shen W, Wallace KA, Capowski EE: Functional analysis of serially expanded human iPS cell-derived RPE cultures. Investigative Ophthalmology & Visual Science 2013, 54:6767-78.

ゲノム編集技法を使用するＰＲＰＦ３１ノックアウトＡＲＰＥ−１９細胞の開発および機能のキャラクタリゼーション
実施例１に記載したように、網膜色素上皮（ＲＰＥ）を、ＲＮＡスプライシング網膜色素変性（ＲＰ）の３種の変異体マウスモデルにおける病原性の部位と同定した。しかしながら、これらの結果は、ヒトＲＰＥにおいて確認される必要があった。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集技法の出現で、疾患のこれらの形態のためのヒト細胞系列モデルが開発された。本実施例は、ヒト細胞系列で初めてＰＲＰＦ３１をノックアウトするためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集の使用を提供し、およびＲＰＥ機能に対する効果をキャラクタライズする。

ＰＲＰＦ３１のエクソン７への２０ｂｐのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計して、ｇＲＮＡ足場配列を含有するｐＣＡＧベクター中にクローニングした。ｇＲＮＡベクターを、ｐＣＡＧ−Ｃａｓ９−ＧＦＰベクターと共にＡＲＰＥ−１９細胞中にコトランスフェクトした。

ＧＦＰ陽性細胞は、９６ウェルプレートの個々のウェル中に選別された単一細胞であり、コンフルエントになるまで増殖させた。ＤＮＡを各クローンから単離して、予測される切断部位付近の領域をＳａｎｇｅｒ法で配列決定して、正確な切断および非相同末端連結（ＮＨＥＪ）を示すところを同定した。ｑＲＴ−ＰＣＲおよび食作用アッセイの両方を使用して、５通りのＮＨＥＪ系列をさらなるキャラクタリゼーションのために選択して、ＦＩＴＣ標識された光受容体外側セグメント取り込みを、フローサイトメトリーを用いて定量した。これらの系列を、ＲＰＥに特異的な遺伝子の分極および最高の発現を確実にするために、３週間コンフルエントな培養として維持した。

トランスフェクション後に検証された個々のクローンの約２５％が、２個と１１個との間の塩基が欠失したＮＨＥＪを示し、１つのクローンが１塩基挿入を有した（図６）。ヘテロ接合のインデル（indel）だけが同定され、これは、ＰＲＰＦ３１における変異がハプロ不全による疾患の原因であるという以前の報告と矛盾しない。５種のゲノム編集されたクローン中４種におけるＰＲＰＦ３１の発現が、野生型対照と比較して５０〜８０％有意に（Ｐ＜０．０５）減少した。これらの変化がゲノム編集の結果であることを確認するために、ＰＲＰＦ３１変更因子ＣＮＯＴ３の発現レベルを決定した。１つの系列で発現が２倍に増大して、それは、その系列におけるＰＲＰＦ３１の低下したレベルを説明することができる。ＰＯＳ取り込みのフローサイトメトリー分析は、食作用がゲノム編集された系列で１０〜６０倍減少したことを示した。

現在のところ、ヒトモデルでＲＮＡスプライシング因子ＲＰの疾患機構を検討することは難しい。本発明者らは、マウスモデルにおける発見を模倣するＰＲＰＦ３１関連疾患のためのヒト細胞系列モデルを創出した。これらの系列は、本発明者らが、より関連するモデルで疾患を検討することを可能にして、本発明者らがスプライシングをより深く調べることができるようにするであろう。さらに、本発明者らは、ＰＲＰＦ３１のＡＡＶにより媒介される遺伝子増強の、疾患の病原性に対する効果および機能欠如のレスキューを検討することができる。

例えば、実施例１で言及したように、光受容体外側セグメント（ＰＯＳ）は、それらの末端の先端における視神経円板の脱落により調節されるそれらの基底における連続した増殖により、１０日毎に完全に更新される（Young RW. The renewal of photoreceptor cell outer segments. Journal of Cell Biology. 1967;33:61-72；Young RW. Shedding of discs from rod outer segments in the rhesus monkey. JUltrastructRes. 1971;34:190-203）。ＲＰＥによる弱ったＰＯＳ材料に対する食作用は、それがないかまたは遅延すると視力の喪失をもたらすので、適当な網膜の機能にとって必須である（Dowling JE, Sidman RL. Inherited retinal dystrophy in the rat. Journal Cell Biology. 1962;14:73-109；Nandrot EF, Kim Y, Brodie SE, Huang X, Sheppard D, Finnemann SC. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. Journal Experimental Medicine. 2004;200:1539-45）。ＰＯＳに対する食作用は、日齢１０日の変異マウスからの初代ＲＰＥ細胞培養で減少し、これは、ヒトＡＲＰＥ−１９細胞中のＰＲＰＦ３１のｓｈＲＮＡ媒介ノックダウンにより再現される（実施例１、図１）。インビボにおける食作用の日周的な周期性も失われ、ＲＰＥ頂点の微絨毛とＰＯＳとの間の接着の強度は、３種全ての変異体モデルでピーク接着時において、低下していた（Nandrot EF, Kim Y, Brodie SE, Huang X, Sheppard D, Finnemann SC. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. Journal Experimental Medicine. 2004;200:1539-45；Nandrot EF, Finnemann SC. Lack of alphavbeta5 integrin receptor or its ligand MFG-E8: distinct effects on retinal function. Ophthalmic Research. 2008;40:120-3）。

ゲノム編集技法を使用するＰＲＰＦ３１がノックアウトされたヒト由来多分化能幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の開発および機能のキャラクタリゼーション
上の実施例２で記載したように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集を、正常ｈｉＰＳＣにおいてＰＲＰＦ３１をノックアウトするために使用した（Hou Z, Zhang Y, Propson NE, Howden SE, Chu LF, Sontheimer EJ, Thomson JA. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2013;110:15644-9；Xue H, Wu J, Li S, Rao MS, Liu Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods Molecular Biology. 2014Peters DT, Cowan CA, Musunuru K. Genome editing in human pluripotent stem cells. StemBook. Cambridge (MA) 2013; Ding Q, Regan SN, Xia Y, Oostrom LA, Cowan CA, Musunuru K. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 2013; 12: 393-4. PMCID: 3925309）。

ｈｉＰＳＣ技法の開発により、ｈｉＰＳＣはＲＰＥ細胞に容易に分化することができるので、現在では、ヒトＲＰＥ細胞が、ＲＮＡスプライシング因子遺伝子における変異により同様に罹患するかどうかを決定することが可能になっている（実施例１、Singh R, Phillips MJ, Kuai D, Meyer JT, Martin J, Smith M, Shen W, Perez ET, Wallace KA, Capowski EE, Wright L, Gamm DM. Functional analysis of serially expanded human iPS cell-derived RPE cultures. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2013;54:6767-78；Buchholz DE, Hikita ST, Rowland TJ, Friedrich AM, Hinman CR, Johnson LV, Clegg DO. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 2009;27:2427-34；Okamoto S, Takahashi M. Induction of retinal pigment epithelial cells from monkey iPS cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2011;52:8785-90；Ukrohne TU, Westenskow PD, Kurihara T, Friedlander DF, Lehmann M, Dorsey AL, Li W, Zhu S, Schultz A, Wang J, Siuzdak G, Ding S, Friedlander M. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem cells translational medicine. 2012;1:96-109；Westenskow PD, Moreno SK, Krohne TU, Kurihara T, Zhu S, Zhang ZN, Zhao T, Xu Y, Ding S, Friedlander M. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2012;53:6282-90；Buchholz DE, Pennington BO, Croze RH, Hinman CR, Coffey PJ, Clegg DO. Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium. Stem cells translational medicine. 2013;2:384-93を参照されたい）。ｈｉＰＳＣから誘導されたＲＰＥ細胞は、機能的なタイトジャンクション、ＰＯＳの食作用、および分極を含め、天然のＲＰＥ細胞と多くの特徴を共有しする。（同上）。

ｈｉＰＳＣ−ＲＰＥを得るために、胚様体（ＥＢ）発生させて、ラミニンでコートされたプレートに接着させ、網膜の分化培地（ＲＤＭ）中で６０〜９０日間培養した。次に、色素沈着細胞の領域は、顕微解剖されて分離され、確立されたプロトコルに従ってｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート上に送られるであろう（Singh R, Phillips MJ, Kuai D, Meyer JT, Martin J, Smith M, Shen W, Perez ET, Wallace KA, Capowski EE, Wright L, Gamm DM. Functional analysis of serially expanded human iPS cell-derived RPE cultures. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2013;54:6767-78；Phillips MJ, Wallace KA, Dickerson SJ, Miller MJ, Verhoeven AD, Martin JM, Wright LS, Shen W, Capowski EE, Percin EF, Perez ET, Zhong X, Canto-Soler MV, Gamm DM. Blood-derived human iPS cells generate optic vesicle-like structures with the capacity to form retinal laminae and develop synapses. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2012;53:2007-19）。次に、色素の沈着した単層が再形成される場合、細胞をさらに３０〜６０日の間培養する。実験で使用する前に、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート上で増殖したｈｉＰＳＣ−ＲＰＥ単層の経上皮耐性（ＴＥＲ）を測定する。ＴＥＲ＞１５０Ωｃｍ^２で培養されたものだけが、さらなる検討のために選択される。全ての実験のために、本発明者らは、目的の各変異および野生型対照細胞について２連を含め、それらを培養し、平行して分析する。ｈｉＰＳＣから誘導されたＲＰＥ細胞の構造および機能を、数通りの方法を使用してキャラクタライズする。

構造：光顕微鏡および電子顕微鏡を使用して、頂点の***および基底外側の陥入の形成を含む分極を推定する（実施例１、Garland DL, Fernandez-Godino R, Kaur I, Speicher KD, Harnly JM, Lambris JD, Speicher DW, Pierce EA. Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 2013;Sep 4. [Epub ahead of print]; Liu Q, Lyubarsky A, Skalet JH, Pugh EN, Jr., Pierce EA. RP1 is required for the correct stacking of outer segment discs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2003;44:4171-83）。

食作用：
上で記載したように、Ｐｒｐｆ３^{Ｔ４９４Ｍ／Ｔ４９４Ｍ}、Ｐｒｐｆ８^{Ｈ２３０９Ｐ／Ｈ２３０９Ｐ}、およびＰｒｐｆ３１^＋／−マウスからのＲＰＥ細胞の初代培養物は、ＰＯＳに食作用を行う能力が有意に低下している（図１）。本発明者らは、ｈｉＰＳＣから誘導されたＲＰＥ細胞の食作用機能を、確立された技法を使用して推定するであろう（実施例１；Finnemann SC, Bonilha VL, Marmorstein AD, Rodriguez-Boulan E. Phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelial cells requires alpha(v)beta5 integrin for binding but not for internalization. ProcNatlAcadSciUSA. 1997;94:12932-7；Singh R, Shen W, Kuai D, Martin JM, Guo X, Smith MA, Perez ET, Phillips MJ, Simonett JM, Wallace KA, Verhoeven AD, Capowski EE, Zhang X, Yin Y, Halbach PJ, Fishman GA, Wright LS, Pattnaik BR, Gamm DM. iPS cell modeling of Best disease: insights into the pathophysiology of an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 2013;22:593-60を参照されたい）。

ｈｉＰＳＣから誘導されたＲＰＥ細胞の極性を推定するために、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上で増殖させた安定にトランスフェクトされた細胞のビブラトーム切片を、確立された技法を使用して確立されたＲＰＥ細胞マーカーに対する抗体で免疫染色する（Nandrot EF, Kim Y, Brodie SE, Huang X, Sheppard D, Finnemann SC. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. Journal Experimental Medicine. 2004;200:1539-45；Nandrot EF, Finnemann SC. Lack of alphavbeta5 integrin receptor or its ligand MFG-E8: distinct effects on retinal function. Ophthalmic Research. 2008;40:120-3; Finnemann SC, Nandrot EF. MerTK activation during RPE phagocytosis in vivo requires alphaVbeta5 integrin. Advances Experimental Medicine Biology. 2006;572:499-503）。この染色された細胞を共焦点顕微鏡によって評価して、マーカータンパク質の分布および相対量を変異体および対照ｈｉＰＳＣから誘導されたＲＰＥ細胞で比較する。これらのＲＰＥ細胞マーカーのレベルも、分化した細胞でウェスタンブロットにより評価する（Nandrot EF, Kim Y, Brodie SE, Huang X, Sheppard D, Finnemann SC. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. Journal Experimental Medicine. 2004;200:1539-45）。

ゲノム編集されたｈｉＰＳＣにおいて観察されたＲＰＥ表現型における変化は、ＲＮＡスプライシング因子ＲＰを有する患者からのｈｉＰＳＣを使用して確認される。ＰＲＰＦ３１の遺伝子における変異に基づくＲＰを有する患者および家族は同定されており、ｈｉＰＳＣは、３組の家族の各々から１名の罹患したおよび１名の罹患していないファミリーメンバーからの線維芽細胞を使用して発生させる。簡単に説明すると、記載されたように、線維芽細胞を、７種のリプログラミング因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ｃ−Ｍｙｃ、ＫＬＦ４、およびＳＶ４０の大きいＴ−抗原）をコードする非組み込み性ｏｒｉＰ含有プラスミドベクターを使用して、プログラムし直す（Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 2009;324:797-801）。正常核型を有し且つ多分化能性のマーカーＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、ＮＡＮＯＧおよびＴＲＡ−１−８１の奇形腫の検討および発現により多分化能であることが確認されているｈｉＰＳＣ系列を、さらなる検討のために選択する（Singh R, Shen W, Kuai D, Martin JM, Guo X, Smith MA, Perez ET, Phillips MJ, Simonett JM, Wallace KA, Verhoeven AD, Capowski EE, Zhang X, Yin Y, Halbach PJ, Fishman GA, Wright LS, Pattnaik BR, Gamm DM. iPS cell modeling of Best disease: insights into the pathophysiology of an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 2013;22:593-607；Singh R, Phillips MJ, Kuai D, Meyer JT, Martin J, Smith M, Shen W, Perez ET, Wallace KA, Capowski EE, Wright L, Gamm DM. Functional analysis of serially expanded human iPS cell-derived RPE cultures. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2013;54:6767-78；Meyer JS, Howden SE, Wallace KA, Verhoeven AD, Wright LS, Capowski EE, Pinilla I, Martin JM, Tian S, Stewart R, Pattnaik B, Thomson JA, Gamm DM. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 2011;29:1206-18）。各ｈｉＰＳＣ系列が予想される変異を有することを確認した後、ｈｉＰＳＣから誘導されたＲＰＥ機能を患者からの細胞でキャラクタライズして、罹患していないファミリーメンバーと上記の技法を使用して比較する。

遺伝子増強療法のためのＡＡＶベクター
ＲＮＡスプライシング因子ＲＰに罹患した初代細胞と思われるＲＰＥ細胞の同定（実施例１を参照されたい）により、ＰＲＰＦ３１における変異により引き起こされた疾患のために遺伝子増強療法を使用する機会が得られる。この目標を達成するために、本発明者らは、ＲＰＥ細胞中でヒトＰＲＰＦ３１を発現するＡＡＶベクターを開発して、培養されたＲＰＥ細胞において、および次にインビボにおけるＰｒｐｆ３１^＋／−マウスにおいて、ＡＡＶ送達されたＰＲＰＦ３１の表現型を改良する能力を試験した。ＡＡＶは、ＲＰＥ６５ＬＣＡおよびコロイデレミアのための遺伝子療法の臨床試験、ならびに他の臨床試験および前臨床試験の成功に基づく、網膜の障害のための好ましい遺伝子送達ベクターである（Maguire AM, Simonelli F, Pierce EA, Pugh EN, Jr., Mingozzi F, Bennicelli J, Banfi S, Marshall KA, Testa F, Surace EM, Rossi S, Lyubarsky A, Arruda VR, Konkle B, Stone E, Sun J, Jacobs J, Dell’Osso L, Hertle R, Ma JX, Redmond TM, Zhu X, Hauck B, Zelenaia O, Shindler KS, Maguire MG, Wright JF, Volpe NJ, McDonnell JW, Auricchio A, High KA, Bennett J. Safety and efficacy of gene transfer for Leber’s congenital amaurosis. New England Journal of Medicine. 2008;358:2240-8. PMCID: 2829748；Bainbridge JW, Smith AJ, Barker SS, Robbie S, Henderson R, Balaggan K, Viswanathan A, Holder GE, Stockman A, Tyler N, Petersen-Jones S, Bhattacharya SS, Thrasher AJ, Fitzke FW, Carter BJ, Rubin GS, Moore AT, Ali RR. Effect of gene therapy on visual function in Leber’s congenital amaurosis. New England Journal of Medicine. 2008;358:2231-9；Cideciyan AV, Aleman TS, Boye SL, Schwartz SB, Kaushal S, Roman AJ, Pang JJ, Sumaroka A, Windsor EA, Wilson JM, Flotte TR, Fishman GA, Heon E, Stone EM, Byrne BJ, Jacobson SG, Hauswirth WW. Human gene therapy for RPE65 isomerase deficiency activates the retinoid cycle of vision but with slow rod kinetics. Proceedings National Academy Sciences USA. 2008;105:15112-7. PMCID: 2567501；Maguire AM, High KA, Auricchio A, Wright JF, Pierce EA, Testa F, Mingozzi F, Bennicelli JL, Ying GS, Rossi S, Fulton A, Marshall KA, Banfi S, Chung DC, Morgan JI, Hauck B, Zelenaia O, Zhu X, Raffini L, Coppieters F, De Baere E, Shindler KS, Volpe NJ, Surace EM, Acerra C, Lyubarsky A, Redmond TM, Stone E, Sun J, McDonnell JW, Leroy BP, Simonelli F, Bennett J. Age-dependent effects of RPE65 gene therapy for Leber’s congenital amaurosis: a phase 1 dose-escalation trial. Lancet. 2009;374:1597-605；Jacobson SG, Cideciyan AV, Ratnakaram R, Heon E, Schwartz SB, Roman AJ, Peden MC, Aleman TS, Boye SL, Sumaroka A, Conlon TJ, Calcedo R, Pang JJ, Erger KE, Olivares MB, Mullins CL, Swider M, Kaushal S, Feuer WJ, Iannaccone A, Fishman GA, Stone EM, Byrne BJ, Hauswirth WW. Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Archives Ophthalmology. 2012;130:9-24；Bennett J, Ashtari M, Wellman J, Marshall KA, Cyckowski LL, Chung DC, McCague S, Pierce EA, Chen Y, Bennicelli JL, Zhu X, Ying GS, Sun J, Wright JF, Auricchio A, Simonelli F, Shindler KS, Mingozzi F, High KA, Maguire AM. AAV2 gene therapy readministration in three adults with congenital blindness. Science translational medicine. 2012;4:120ra15；Bowles DE, McPhee SW, Li C, Gray SJ, Samulski JJ, Camp AS, Li J, Wang B, Monahan PE, Rabinowitz JE, Grieger JC, Govindasamy L, Agbandje-McKenna M, Xiao X, Samulski RJ. Phase 1 gene therapy for Duchenne muscular dystrophy using a translational optimized AAV vector. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 2012;20:443-55. PMCID: 3277234；Maclachlan TK, Lukason M, Collins M, Munger R, Isenberger E, Rogers C, Malatos S, Dufresne E, Morris J, Calcedo R, Veres G, Scaria A, Andrews L, Wadsworth S. Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration. Molecular Therapy. 2011;19:326-34. PMCID: 3034852；Nathwani AC, Tuddenham EG, Rangarajan S, Rosales C, McIntosh J, Linch DC, Chowdary P, Riddell A, Pie AJ, Harrington C, O’Beirne J, Smith K, Pasi J, Glader B, Rustagi P, Ng CY, Kay MA, Zhou J, Spence Y, Morton CL, Allay J, Coleman J, Sleep S, Cunningham JM, Srivastava D, Basner-Tschakarjan E, Mingozzi F, High KA, Gray JT, Reiss UM, Nienhuis AW, Davidoff AM. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. New England Journal of Medicine. 2011;365:2357-65. PMCID: 3265081）。

ＡＡＶは、初期相の臨床試験で例外的安全性の記録を有し、ＡＡＶゲノムは光受容体およびＲＰＥ細胞などの最終的に分化した細胞中においてエピソーム形態で安定であるので、他のベクター系と比較して遺伝毒性のリスクをもたらすことも少ない（Yang GS, Schmidt M, Yan Z, Lindbloom JD, Harding TC, Donahue BA, Engelhardt JF, Kotin R, Davidson BL. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. JVirol. 2002;76:7651-60；Acland GM, Aguirre GD, Bennett J, Aleman TS, Cideciyan AV, Bennicelli J, Dejneka NS, Pearce-Kelling SE, Maguire AM, Palczewski K, Hauswirth WW, Jacobson SG. Long-term restoration of rod and cone vision by single dose rAAV-mediated gene transfer to the retina in a canine model of childhood blindness. Molecular Therapy. 2005;12:1072-82）。

ＰＦＰＦ３１のための数種のＡＡＶベクター系が、異なったプロモーターの選択およびカプシドの血清型で開発されている。プロモーターに関して、ベクターは、多くの細胞型（例えば、ＣＡＧまたはＣＡＳＩ）、ＲＰＥ細胞（例えば、ＲＰＥ特異的タンパク質、例えば、ＶＭＤ２、ＲＰＥ６５、ＲＬＢＰ１、ＲＧＲ、またはＴＩＭＰ３などのためのプロモーター）および光受容体細胞（ＲＨＯ）において発現を駆動するプロモーターを含むことができる（Esumi N, Oshima Y, Li Y, Campochiaro PA, Zack DJ. Analysis of the VMD2 promoter and implication of E-box binding factors in its regulation. Journal Biological Chemistry. 2004;279:19064-73；Guziewicz KE, Zangerl B, Komaromy AM, Iwabe S, Chiodo VA, Boye SL, Hauswirth WW, Beltran WA, Aguirre GD. Recombinant AAV-Mediated BEST1 Transfer to the Retinal Pigment Epithelium: Analysis of Serotype-Dependent Retinal Effects. PLoS One. 2013;8:e75666; Allocca M, Mussolino C, Garcia-Hoyos M, Sanges D, Iodice C, Petrillo M, Vandenberghe LH, Wilson JM, Marigo V, Surace EM, Auricchio A. Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors. J Virol. 2007;81:11372-80）。ＡＡＶベクターの成分は、遺伝子発現のレベルおよび持続時間を改善するようにコドン最適化されたＰＲＰＦ３１配列を使用して合成される（Ill CR, Chiou HC. Gene therapy progress and prospects: recent progress in transgene and RNAi expression cassettes. Gene Therapy. 2005;12:795-802；Foster H, Sharp PS, Athanasopoulos T, Trollet C, Graham IR, Foster K, Wells DJ, Dickson G. Codon and mRNA sequence optimization of microdystrophin transgenes improves expression and physiological outcome in dystrophic mdx mice following AAV2/8 gene transfer. Molecular Therapy. 2008;16:1825-32；Sack BK, Merchant S, Markusic DM, Nathwani AC, Davidoff AM, Byrne BJ, Herzog RW. Transient B cell depletion or improved transgene expression by codon optimization promote tolerance to factor VIII in gene therapy. PLoS One. 2012;7:e37671）。予備的検討で、コドン最適化されたＰＲＰＦ３１は、全長ＰＲＰＦ３１タンパク質をＡＲＰＥ−１９細胞中で産生した。調製されたベクターは、最適の発現を達成するために必要な最小のベクターゲノムをコードする。本発明者らは、ＲＰＥ細胞に形質導入することに主として関心があるので、本発明者らは、対照血清型としてＡＡＶ２を使用するが、これは、このベクターが培養された単層細胞に形質導入することが知られており、インビボで首尾良くＲＰＥに形質導入を起こしたからである（Pang JJ, Lauramore A, Deng WT, Li Q, Doyle TJ, Chiodo V, Li J, Hauswirth WW. Comparative analysis of in vivo and in vitro AAV vector transduction in the neonatal mouse retina: effects of serotype and site of administration. Vision Research. 2008;48:377-85；Vandenberghe LH, Bell P, Maguire AM, Cearley CN, Xiao R, Calcedo R, Wang L, Castle MJ, Maguire AC, Grant R, Wolfe JH, Wilson JM, Bennett J. Dosage thresholds for AAV2 and AAV8 photoreceptor gene therapy in monkey. Science translational medicine. 2011;3:88ra54；Tolmachova T, Tolmachov OE, Barnard AR, de Silva SR, Lipinski DM, Walker NJ, Maclaren RE, Seabra MC. Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo. Journal of Molecular Medicine. 2013;91:825-37. PMCID: 3695676）。ベクター製剤を生成し、確立された技法を使用して精製した（Vandenberghe LH, Bell P, Maguire AM, Cearley CN, Xiao R, Calcedo R, Wang L, Castle MJ, Maguire AC, Grant R, Wolfe JH, Wilson JM, Bennett J. Dosage thresholds for AAV2 and AAV8 photoreceptor gene therapy in monkey. Science translational medicine. 2011;3:88ra54, Lock M, Alvira M, Vandenberghe LH, Samanta A, Toelen J, Debyser Z, Wilson JM. Rapid, simple, and versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 2010;21:1259-71. PMCID: 2957274）。タイターの決定は、ベクターゲノム中のポリアデニル化シグナルに対するプライマープローブセットを用いてＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲにより実施した。

培養された細胞中におけるＰＲＰＦ３１の発現を検討するために、ＰＲＰＦ３１変異体および対照ＡＲＰＥ−１９細胞を、実施例１で記載したように、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌフィルター上で培養した。細胞を所望量のＡＡＶ−ＰＲＰＦ３１ベクターで処理して、さらに１１〜１４日間培養した。ＡＡＶ−ＰＲＰＦ３１で処理された野生型ＲＰＥ細胞、およびＡＡＶ−ＥＧＦＰで処理されたＰＲＦＰ３１^＋／−細胞を対照として使用した。ＡＡＶ−ＰＲＰＦ３１処理の効果を、数通りの手法を使用して評価する。全長ＰＲＰＦ３１タンパク質の産生は、形質導入後２〜４日に免疫蛍光顕微鏡およびウェスタンブロット実験により評価する（Liu Q, Zhou J, Daiger SP, Farber DB, Heckenlively JR, Smith JE, Sullivan LS, Zuo J, Milam AH, Pierce EA. Identification and subcellular localization of the RP1 protein in human and mouse photoreceptors. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2002;43:22-32；Liu Q, Zuo J, Pierce EA. The retinitis pigmentosa 1 protein is a photoreceptor microtubule-associated protein. Journal Neuroscience. 2004;24:6427-36；Falk MJ, Zhang Q, Nakamaru-Ogiso E, Kannabiran C, Fonseca-Kelly Z, Chakarova C, Audo I, Mackay DS, Zeitz C, Borman AD, Staniszewska M, Shukla R, Palavalli L, Mohand-Said S, Waseem NH, Jalali S, Perin JC, Place E, Ostrovsky J, Xiao R, Bhattacharya SS, Consugar M, Webster AR, Sahel JA, Moore AT, Berson EL, Liu Q, Gai X, Pierce EA. NMNAT1 mutations cause Leber congenital amaurosis. Nature Genetics. 2012;44:1040-5）。遺伝子移入をｑＰＣＲによってベクターゲノムについてアッセイした。変異体細胞の正常な食作用活性の回復を、ＦＩＴＣ標識ＰＯＳを用いる処理により、確立された技法を使用して測定する（実施例１、Finnemann SC, Bonilha VL, Marmorstein AD, Rodriguez-Boulan E. Phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelial cells requires alpha(v)beta5 integrin for binding but not for internalization. ProcNatlAcadSciUSA. 1997;94:12932-7；Singh R, Shen W, Kuai D, Martin JM, Guo X, Smith MA, Perez ET, Phillips MJ, Simonett JM, Wallace KA, Verhoeven AD, Capowski EE, Zhang X, Yin Y, Halbach PJ, Fishman GA, Wright LS, Pattnaik BR, Gamm DM. iPS cell modeling of Best disease: insights into the pathophysiology of an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 2013;22:593-607）。

Ｐｒｐｆ３１^＋／−変異マウスにおけるＰＲＰＦ３１発現および機能を検討するために、ＰＲＰＦ３１のＡＡＶにより媒介される送達を使用して、インビボでＰｒｐｆ３１^＋／−マウスにおける欠損食作用を処理する。これらの検討のために、細胞培養の検討で確認されたＡＡＶ−ＰＲＰＦ３１ベクターの最適の用量を、Ｐｒｐｆ３１^＋／−マウスの１眼中の網膜下に注射する。注射後１カ月に眼を取り出して免疫蛍光およびウェスタンブロットアッセイを使用して、全長ＰＲＰＦ３１タンパク質の発現および局在を評価する（Liu Q, Lyubarsky A, Skalet JH, Pugh EN, Jr., Pierce EA. RP1 is required for the correct stacking of outer segment discs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2003;44:4171-83；Liu Q, Saveliev A, Pierce EA. The severity of retinal degeneration in Rp1h gene-targeted mice is dependent on genetic background. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2009;50:1566-74；Liu Q, Collin RW, Cremers FP, den Hollander AI, van den Born LI, Pierce EA. Expression of Wild-Type Rp1 Protein in Rp1 Knock-in Mice Rescues the Retinal Degeneration Phenotype. PLoS One. 2012;7:e43251）。

ＡＡＶを送達されたＰＲＰＦ３１の、ＲＰＥ食作用の周期性の喪失を防止またはレスキューする能力を、光照射開始の２時間前（−２）、光照射開始時（０）、および光照射開始の２、４、および６（＋２、＋４、＋６）時間後に、ロドプシンの免疫蛍光染色およびＲＰＥ細胞層に所在するファゴソームの検出について、確立された技法を使用して推定する（Nandrot EF, Kim Y, Brodie SE, Huang X, Sheppard D, Finnemann SC. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. Journal Experimental Medicine. 2004;200:1539-45；Nandrot EF, Finnemann SC. Lack of alphavbeta5 integrin receptor or its ligand MFG-E8: distinct effects on retinal function. Ophthalmic Research. 2008;40:120-3）。本発明者らは、これらの動物で、ＡＡＶ−ＰＲＰＦ３１の注射後１カ月および２カ月に初めて、表現型のレスキューの証拠について、処理された網膜を評価する。ＲＰＥ変性の防止の証拠を評価するために、マウスを月齢１カ月で処置して、ＲＰＥの超微細構造を、表現型のレスキューについて、ＡＡＶ−ＰＲＰＦ３１注射後５、８および１１カ月に評価する（Graziotto JJ, Farkas MH, Bujakowska K, Deramaudt BM, Zhang Q, Nandrot EF, Inglehearn CF, Bhattacharya SS, Pierce EA. Three gene-targeted mouse models of RNA splicing factor RP show late-onset RPE and retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2011;52:190-8）。ＰＲＰＦ３１変異の無症候性の保因者からのデータに基づいて、本発明者らは、処理されたＲＰＥ細胞におけるＰＲＰＦ３１レベルの控えめの増大でさえ治療効果があるであろうと予想する（Rio FT, Wade NM, Ransijn A, Berson EL, Beckmann JS, Rivolta C. Premature termination codons in PRPF31 cause retinitis pigmentosa via haploinsufficiency due to nonsense-mediated mRNA decay. Journal Clinical Investigation. 2008;118:1519-31；Vithana EN, Abu-Safieh L, Pelosini L, Winchester E, Hornan D, Bird AC, Hunt DM, Bustin SA, Bhattacharya SS. Expression of PRPF31 mRNA in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa: a molecular clue for incomplete penetrance? Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2003;44:4204-9）。

培養されたＲＰＥ細胞における欠損食作用表現型を改良するためのＡＡＶにより媒介される遺伝子増強療法
上で記載したように、ＰＲＰＦ３１における変異は、ハプロ不全により疾患を引き起こし、したがって優性のＲＰのこの形態は、遺伝子増強療法を用いる処置を受けやすいという十分な証拠がある（Wang et al., American Journal Medical Genetics A. 2003;121A:235-9；Xia et al., Molecular Vision. 2004;10:361-5；Abu-Safieh et al., MolVis. 2006;12:384-8；Rivolta et al., Human Mutation. 2006;27:644-53；Sullivan et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2006;47:4579-88；Rio et al., Human Mutation. 2009;30:1340-7）。この仮説と矛盾することなく、野生型対立遺伝子由来のＰＲＰＦ３１の発現のレベルは、ＰＲＰＦ３１における変異を有する患者における疾患の重症度と相関する（Rio et al., Journal Clinical Investigation. 2008;118:1519-31；Venturini et al., PLoS genetics. 2012;8:e1003040；Rose et al., Scientific reports. 2016;6:19450）。この仮説を試験するために、本発明者らは、ＡＡＶにより媒介される遺伝子増強療法を使用して、培養されたＲＰＥ細胞における表現型を改良した。

これらの検討のために、本発明者らは、ＡＡＶ．ＣＡＳＩ．ＰＲＰＦ３１ウイルスのベクターを生成し、これが、培養された細胞中で全長ＰＲＰＦ３１タンパク質を産生できることを示した。このベクターの配列は以下の通りである。

ＩＴＲ−ｐＺａｃ２．１逆位末端反復− ｎｔｓ１〜１３０および３２９１〜３４２０
プロモーター−ＣＡＳＩ ｎｔｓ１９７〜１２５２
タグ−Ｖ５ ｎｔｓ１２５９〜１３０９
挿入−ＰＲＰＦ３１ ｎｔｓ１３１９〜２８１８
ポリＡ配列−ウサギβ−グロビン ｎｔｓ２８２５〜３２１１

本発明者らは、次に、ゲノム編集されたＰＲＦＰ３１−欠損ＡＲＰＥ−１９細胞における欠損食作用表現型を修正するＡＡＶ．ＣＡＳＩ．ＰＲＰＦ３１の能力を試験した。これらの実験のために、ゲノム編集されたＰＲＰＦ３１変異体（ＧＥ３１）ＡＲＰＥ−１９細胞に、ＡＡＶ．ＣＡＳＩ．ＰＲＰＦ３１を０、１０，０００、および１５，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。形質導入に続いて、各複製を、１×１０^６個のＦＩＴＣ標識された光受容体外側セグメント（ＦＩＴＣ−ＰＯＳ）と１時間３７℃でインキュベートした。ＦＩＴＣ−ＰＯＳ取り込みは、フローサイトメトリーを使用してＦＩＴＣ陽性細胞を計数することにより決定した。ＧＥ３１変異体細胞系列の処置の結果、用量依存性の様式でＦＩＴＣ−ＰＯＳ取り込みが増大した（図７）。この結果により、遺伝子増強療法がＰＲＰＦ３１−関連する網膜の変性を処置するために使用される可能性が確認される。

他の実施形態
本発明をそれらの詳細な説明と関連して説明したが、前述の説明は、例示することが意図され、本発明の範囲を限定することは意図されず、本発明は、添付の請求項の範囲によって定義されることが理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
また、本発明は、以下の態様を含み得る。
［１］
ヒト対象において、ＰＲＰＦ３１における変異により引き起こされる網膜色素変性を処置する方法であって、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞における発現を駆動するプロモーターと作動可能に連結した、ヒトＰＲＰＦ３１をコードする配列を含む治療的有効量のアデノ随伴ウイルスタイプ２（ＡＡＶ２）ベクターを前記対象の眼に送達することを含む方法。
［２］
前記プロモーターが、ＣＡＧ、ＣＡＳＩ、ＲＰＥ６５またはＶＭＤ２プロモーターである、［１］に記載の方法。
［３］
前記ＰＲＰＦ３１配列がコドン最適化されている、［２］に記載の方法。
［４］
前記ベクターが網膜下注射により送達される、［１］〜［３］に記載の方法。
［５］
ヒト対象の眼においてＰＲＰＦ３１の発現を増大させる方法であって、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞における発現を駆動するプロモーターと作動可能に連結した、ヒトＰＲＰＦ３１をコードする配列を含む治療的有効量のアデノ随伴ウイルスタイプ２（ＡＡＶ２）ベクターを前記対象の眼に送達することを含む方法。
［６］
前記プロモーターがＣＡＧ、ＣＡＳＩ、ＲＰＥ６５またはＶＭＤ２プロモーターである、［５］に記載の方法。
［７］
前記ＰＲＰＦ３１配列がコドン最適化されている、［５］に記載の方法。
［８］
前記ベクターが網膜下注射により送達される、［５］〜［７］に記載の方法。
［９］
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞における発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結した、ヒトＰＲＰＦ３１をコードする配列を含むアデノ随伴ウイルスタイプ２（ＡＡＶ２）ベクター。
［１０］
前記プロモーターがＣＡＧ、ＣＡＳＩ、ＲＰＥ６５またはＶＭＤ２プロモーターである、［９］に記載のベクター。
［１１］
前記ＰＲＰＦ３１配列がコドン最適化されている、［９］に記載のベクター。
［１２］
網膜下注射による送達のために製剤化された、［９］〜［１１］に記載のベクターを含む医薬組成物。
［１３］
ヒト対象の眼において、ＰＲＰＦ３１における変異により引き起こされる網膜色素変性の処置に使用するための、［９］〜［１１］に記載のベクター。
［１４］
ヒト対象の眼において、ＰＲＰＦ３１の発現を増大させることに使用するための、［９］〜［１１］に記載のベクター。
［１５］
ヒト対象の眼において、ＰＲＰＦ３１における変異により引き起こされる網膜色素変性の処置に使用するための、［１２］に記載の医薬組成物。
［１６］
ヒト対象の眼において、ＰＲＰＦ３１の発現を増大させることに使用するための、［１２］に記載の医薬組成物。

Claims (13)

1. ヒト対象において、ＰＲＰＦ３１における変異により引き起こされる網膜色素変性を処置するための医薬組成物であって、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞における発現を駆動するプロモーターと作動可能に連結した、ヒトＰＲＰＦ３１をコードする配列を含む治療的有効量のアデノ随伴ウイルスタイプ２（ＡＡＶ２）ベクターを含む医薬組成物。
2. 前記プロモーターが、ＣＡＧ、ＣＡＳＩ、ＲＰＥ６５またはＶＭＤ２プロモーターである、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記ＰＲＰＦ３１配列がコドン最適化されている、請求項２に記載の医薬組成物。
4. 網膜下注射による送達のために製剤化された、請求項１〜３に記載の医薬組成物。
5. ヒト対象の眼においてＰＲＰＦ３１の発現を増大させるための医薬組成物であって、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞における発現を駆動するプロモーターと作動可能に連結した、ヒトＰＲＰＦ３１をコードする配列を含む治療的有効量のアデノ随伴ウイルスタイプ２（ＡＡＶ２）ベクターを含む医薬組成物。
6. 前記プロモーターがＣＡＧ、ＣＡＳＩ、ＲＰＥ６５またはＶＭＤ２プロモーターである、請求項５に記載の医薬組成物。
7. 前記ＰＲＰＦ３１配列がコドン最適化されている、請求項５に記載の医薬組成物。
8. 網膜下注射による送達のために製剤化された、請求項５〜７に記載の医薬組成物。
9. 網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞における発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結した、ヒトＰＲＰＦ３１をコードする配列を含むアデノ随伴ウイルスタイプ２（ＡＡＶ２）ベクター。
10. 前記プロモーターがＣＡＧ、ＣＡＳＩ、ＲＰＥ６５またはＶＭＤ２プロモーターである、請求項９に記載のベクター。
11. 前記ＰＲＰＦ３１配列がコドン最適化されている、請求項９に記載のベクター。
12. ヒト対象の眼において、ＰＲＰＦ３１における変異により引き起こされる網膜色素変性の処置に使用するための、請求項９〜１１に記載のベクター。
13. ヒト対象の眼において、ＰＲＰＦ３１の発現を増大させることに使用するための、請求項９〜１１に記載のベクター。