JP6801237B2 - ウイルスからの核酸抽出および増幅試薬 - Google Patents
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Description
本発明は、簡便、迅速かつ高効率にウイルスから核酸を抽出して増幅するための試薬、および前記試薬を用いた核酸抽出および増幅方法に関する。
感染症の臨床検査分野においては、外来での診療中に正確な検査結果を得て適切な治療を施す等の目的から、簡便、迅速かつ高感度に病原体を検出することが重要である。例えば、毎年冬季に流行を繰り返すインフルエンザウイルス感染症の検査では、感染初期での投与で高い効果を発揮する治療薬が存在することもあり、迅速検査キットが広く普及している。
このような迅速検査法の原理としては、イムノクロマト法による検出法が最も用いられている。しかしながら、イムノクロマト法による検出法は検出感度が低いため、感染初期など検体中の病原体数が少ない場合には検出できないことが課題となっている。
イムノクロマト法よりも高感度に病原体を検出する方法として、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＴＭＡ法（特許文献１）、ＴＲＣ法（特許文献２、非特許文献１）、ＮＡＳＢＡ法（特許文献３および４）等の核酸増幅法を利用した検出法が知られている。核酸増幅法を利用した検出法は、病原体の有する核酸を特異的に増幅して検出するため、当該病原体を迅速かつ高感度に検出できる可能性を有している。
核酸増幅法を利用した検出法で病原体の検出を行なう際は、一般に病原体を含む試料から核酸を抽出する操作を事前に行なう。病原体、特にウイルスから核酸を抽出する方法としては、界面活性剤やグアニジンといったタンパク質変性剤や、フェノールやクロロホルムといった有機溶媒を使用する方法が知られている（特許文献５および６）。しかしながら、これらタンパク質変性剤や有機溶媒は核酸増幅反応を阻害するため、抽出工程の後にこれらを除去するための精製工程が必要となり、煩雑で時間のかかる操作を要する。
このような核酸抽出および精製操作を簡略化するため、種々のキットや装置が市販されている。一例として、ＥＸＴＲＡＧＥＮ ＩＩ（東ソー製）といった核酸を不溶化させる試薬と遠心分離を利用したキットや、ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン製）といったスピンカラムを利用したキット、Ｃｈｅｍａｇｉｃ Ｐｒｅｐｉｔｏ（パーキンエルマー製）といった磁性ビーズを利用した自動抽出装置等が挙げられる。しかしながら、前述のキットや装置を用いても１０分から１時間程度の時間を要し、また作業工数も多く、遠心分離機や自動抽出装置といった特殊な装置も必要となるため、より迅速かつ簡便な方法が求められていた。
一方、非特許文献２に記載の方法のように、核酸を抽出し精製する操作をせずに核酸増幅を行ない、標的核酸を検出する方法も知られているが、感度面で不十分であった。
核酸の抽出操作のみを行い、精製せずに核酸増幅反応へ供する方法として、界面活性剤を用いて核酸を抽出した後、シクロデキストリンを用いて界面活性剤を中和して核酸増幅工程に供する方法が知られている。特許文献７においては、酵母および大腸菌から０．５％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて核酸を抽出し、α−シクロデキストリンを含む核酸増幅試薬を用いてＰＣＲ法またはＲＣＡ法により核酸増幅する方法が示されている。しかしながら、当該特許文献に記載の方法は、核酸抽出に際して９５℃で５〜１５分間の加熱を要しており、簡便性・迅速性・安全性等の点で好ましくない。また当該特許文献では、前記ＳＤＳ以外の界面活性剤が添加された条件においても、シクロデキストリンを含むＰＣＲ反応液により、酵母由来ゲノムＤＮＡを核酸増幅可能なことも示されている。しかしながら前記ＳＤＳを用いた場合を除いて、界面活性剤によって細胞やウイルスから核酸を抽出した例は示されていない。
また特許文献８においては、インフルエンザウイルス感染患者由来の鼻腔スワブを０．２％のＳＤＳを含む溶液に懸濁し、シクロデキストリンを含む酵素試薬と混合させてＲＴ−ＬＡＭＰ法により検出した例が示されている。しかしながら当該特許文献においては検出感度や抽出効率に関しての記述は認められず、高効率にウイルスから核酸を抽出して増幅するための試薬については知られていなかった。
また、特許文献７および８の核酸増幅方法は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、比較的高温でＤＮＡを増幅する方法であり、比較的低温でＲＮＡポリメラーゼと逆転写酵素の協奏反応によって核酸増幅を行う方法（ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法など）におけるウイルスからの核酸抽出および増幅条件は、知られていなかった。
Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，７７−８６（２００３）
松村武史、東京大学学位論文、報告番号１２２５９０（２００７）
本発明の目的は、簡便、迅速および高効率にウイルスから核酸を抽出し、かつ核酸増幅反応の阻害を最小限とすることを特徴とする、核酸抽出および増幅試薬を提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含む抽出試薬とウイルスとを接触させ、その後さらにシクロデキストリンと接触させることで、複雑な抽出および／または精製操作を行なうことなく、高効率に核酸を抽出および増幅できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下の態様を包含する：
［１］ 以下の（ｉ）（ｉｉ）（ｉｉｉ）を含む、ウイルスを含む試料から当該ウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
（ｉ）ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含むウイルス核酸抽出試薬
（ｉｉ）シクロデキストリン
（ｉｉｉ）核酸増幅試薬
［２］当該シクロデキストリンが核酸増幅試薬に含まれている、［１］に記載のウイルス核酸を抽出及び増幅するためのキット。
［３］ 当該ウイルスがエンベロープを有するウイルスである、［１］または［２］に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［４］ 当該ウイルスがインフルエンザウイルスである、［１］から［３］のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［５］ シクロデキストリンがγ−シクロデキストリンである、［１］から［４］のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［６］ 界面活性剤が胆汁酸である、［１］から［５］のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［７］ 界面活性剤が、コール酸、タウロコール酸、グリココール酸、タウロウルソデオキシコール酸又はそれらの塩のいずれかである、［６］に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［８］ シクロデキストリンの濃度が、ステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度の３倍以上である、［１］から［７］のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［９］ 抽出試薬におけるステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度が０．４（ｗ／ｗ）％以上である、［１］から［８］のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［１０］ さらに非イオン界面活性剤を含む、［１］から［９］のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［１１］ 核酸増幅試薬が乾燥形態である［１］から［１０］のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［１２］ 以下の（ｉ）（ｉｉ）（ｉｉｉ）の工程を含む、ウイルスを含む試料から当該ウイルス核酸を抽出および増幅する方法。
（ｉ）当該ウイルスを、ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含むウイルス核酸抽出試薬と接触させる核酸抽出工程
（ｉｉ）（ｉ）によって抽出されたウイルス核酸抽出液にシクロデキストリンを接触させる工程
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の工程で得られた溶液の一部又は全部を核酸増幅試薬と接触させる核酸増幅工程
［１３］以下の（ｉ）（ｉｉ）の工程を含む、ウイルスを含む試料から当該ウイルス核酸を抽出および増幅する方法。
（ｉ）当該ウイルスを、ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含むウイルス核酸抽出試薬と接触させる核酸抽出工程
（ｉｉ）（ｉ）によって抽出されたウイルス核酸抽出液を、シクロデキストリンを含む核酸増幅試薬と接触させる核酸増幅工程。
［１］ 以下の（ｉ）（ｉｉ）（ｉｉｉ）を含む、ウイルスを含む試料から当該ウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
（ｉ）ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含むウイルス核酸抽出試薬
（ｉｉ）シクロデキストリン
（ｉｉｉ）核酸増幅試薬
［２］当該シクロデキストリンが核酸増幅試薬に含まれている、［１］に記載のウイルス核酸を抽出及び増幅するためのキット。
［３］ 当該ウイルスがエンベロープを有するウイルスである、［１］または［２］に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［４］ 当該ウイルスがインフルエンザウイルスである、［１］から［３］のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［５］ シクロデキストリンがγ−シクロデキストリンである、［１］から［４］のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［６］ 界面活性剤が胆汁酸である、［１］から［５］のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［７］ 界面活性剤が、コール酸、タウロコール酸、グリココール酸、タウロウルソデオキシコール酸又はそれらの塩のいずれかである、［６］に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［８］ シクロデキストリンの濃度が、ステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度の３倍以上である、［１］から［７］のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［９］ 抽出試薬におけるステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度が０．４（ｗ／ｗ）％以上である、［１］から［８］のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［１０］ さらに非イオン界面活性剤を含む、［１］から［９］のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［１１］ 核酸増幅試薬が乾燥形態である［１］から［１０］のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［１２］ 以下の（ｉ）（ｉｉ）（ｉｉｉ）の工程を含む、ウイルスを含む試料から当該ウイルス核酸を抽出および増幅する方法。
（ｉ）当該ウイルスを、ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含むウイルス核酸抽出試薬と接触させる核酸抽出工程
（ｉｉ）（ｉ）によって抽出されたウイルス核酸抽出液にシクロデキストリンを接触させる工程
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の工程で得られた溶液の一部又は全部を核酸増幅試薬と接触させる核酸増幅工程
［１３］以下の（ｉ）（ｉｉ）の工程を含む、ウイルスを含む試料から当該ウイルス核酸を抽出および増幅する方法。
（ｉ）当該ウイルスを、ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含むウイルス核酸抽出試薬と接触させる核酸抽出工程
（ｉｉ）（ｉ）によって抽出されたウイルス核酸抽出液を、シクロデキストリンを含む核酸増幅試薬と接触させる核酸増幅工程。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明においてステロイド骨格を有する界面活性剤とは、シクロペンタノペルヒドロフェナントレン構造を有する化合物であり、界面活性作用を有するものである。天然に存在するステロイド骨格を有する界面活性剤としては、胆汁酸が例示される。胆汁酸はコラン酸骨格を持つステロイド誘導体であり、しばしばグリシンやタウリンと結合して抱合胆汁酸を形成する。天然に存在する胆汁酸および胆汁酸誘導体の一例として、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロウルソデオキシコール酸、タウロコール酸、グリココール酸及びそれらの塩などが例示できる。塩としては特に限定されるものではないが、例えばナトリウム塩等をあげることができる。また、本発明における界面活性剤は天然に存在するステロイド誘導体や胆汁酸誘導体に限らず、人工的に合成したステロイド骨格やコラン酸骨格を有する界面活性剤でもよい。中でも、本発明における好適な界面活性剤としてコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、タウロウルソデオキシコール酸及びそれらの塩が、より好ましくはコール酸及びその塩、特にコール酸ナトリウムが例示される。なお、コール酸骨格を有する界面活性剤の濃度については特に限定しないが、好ましくは０．４（ｗ／ｗ）％以上、より好ましくは０．８（ｗ／ｗ）％以上である。
本発明の抽出対象は、いずれの種類のウイルスであってもよい。ウイルスは、カプシドと呼ばれるタンパク質の殻により核酸が包接された構造を有し、構造や大きさの点で細菌や微生物、細胞などと明確に区別される。本発明における好ましい抽出対象の一例として、エンベロープを有するウイルスや一本鎖ＲＮＡを有するウイルスが例示される。エンベロープを有するウイルスとは、ウイルスカプシドが主に脂質から構成されるエンベロープにより覆われたウイルスのことをいい、一例として、単純ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、エイズウイルス（ＨＩＶ）があげられる。一本鎖ＲＮＡを有するウイルスとは、ボルティモア分類における第４群（１本鎖ＲＮＡ ＋鎖）、第５群（１本鎖ＲＮＡ −鎖）、第６群（１本鎖ＲＮＡ 逆転写）に属するウイルスであり、一例として、コロナウイルス、ＲＳウイルス、ヒト・メタニューモウイルス、インフルエンザウイルス、エイズウイルス（ＨＩＶ）があげられる。一本鎖ＲＮＡを有するウイルスは、ＴＲＣ法等のＲＮＡを出発物質とする核酸増幅法に適する点で好ましい。中でもインフルエンザウイルスは、本発明の抽出試薬における抽出対象ウイルスとして特に好ましい。
本発明においてウイルスを含む試料とは、単にウイルスを水、生理食塩水や緩衝液に溶解したものや、ウイルスを含んだ生体試料そのものや、前記生体試料を含んだ濾紙、スワブ等があげられる。前記生体試料の一例として、血液、糞便、尿、痰、リンパ液、血漿、***液、肺吸引物、脳脊髄液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、うがい液、唾液、涙液があげられる。
本発明のウイルス核酸抽出試薬は、ステロイド骨格を有する界面活性剤の他に、種々の成分をさらに含んでいてもよい。後の核酸増幅反応に必要な成分、例えば酵素や、マグネシウム塩、カリウム塩等の塩類や、トレハロース等の糖類や、グリセロール等の糖アルコールや、核酸成分や、有機溶媒等を含むことは、核酸抽出工程から核酸増幅工程に至る操作を簡略化できる意味で好ましい。中でも有機溶媒は、ウイルス核酸の抽出を促進させる効果を有している点で特に好ましい。本発明の抽出試薬にさらに含ませる有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を例示できる。また、ステロイド骨格を有する界面活性剤の他に、さらに１種類以上の界面活性剤やタンパク質変性剤を、核酸増幅反応を妨害しない範囲で添加することもできる。添加する界面活性剤の一例として、ＳＤＳ等の陰イオン界面活性剤や、ＣＨＡＰＳ等の両イオン界面活性剤や、Ｓｐａｎ ２０（商品名）、ＭＥＧＡ−８（商品名）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ ４０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ ６０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ ８０（商品名）など）等の非イオン性界面活性剤があげられる。中でも非イオン性界面活性剤は、ウイルス核酸の抽出を促進する効果を有する点や、核酸増幅反応への影響が少ない点で好ましい。添加する界面活性剤の一例として、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系界面活性剤であるＴｗｅｅｎ ２０（商品名）を例示できる。
本発明のウイルス核酸抽出試薬を用いて、ウイルスを含む試料から当該ウイルス核酸を抽出するには、単に本発明のウイルス核酸抽出試薬とウイルスを含む試料とを接触させればよい。接触時間はウイルスを含む試料の性状、試料中のウイルス濃度、ウイルス核酸抽出試薬に含まれる成分等を考慮し、適宜決定すればよいが、多くの場合接触後４分以内で十分にウイルス核酸を抽出でき、接触後すぐにシクロデキストリンと接触させる工程等の後工程へ供することもできる。
本発明のウイルス核酸抽出液とは、ウイルスを含む試料とウイルス核酸抽出試薬を用いることによって得られる。また、ウイルス核酸抽出液は、シクロデキストリンと接触することで、ウイルス核酸抽出液中のステロイド骨格を有する界面活性剤がシクロデキストリンに包接され、核酸増幅反応への阻害作用が緩和される。シクロデキストリンには、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンなど環の大きさが異なるものや、種々の誘導体が知られている。本発明に用いるシクロデキストリンは、ステロイド骨格を有する界面活性剤を包接可能なものであればいずれの種類でもよいが、環の大きさの点からγ−シクロデキストリンおよびその誘導体の使用が好ましい。また、ウイルス核酸抽出液と接触させるシクロデキストリンは、溶液状や固体状など、いずれの性状であってもよい。さらに、シクロデキストリンと同時に、他の種々の成分をも添加してもよい。
シクロデキストリンは、ウイルス核酸抽出試薬とウイルスを含む試料とを接触させた後、核酸増幅工程開始までの間に接触させればよく、必要な抽出効率に応じて上述の範囲内で適宜選択することができる。特に本発明の好適な実施形態の一例としてシクロデキストリンとの接触を、核酸増幅工程の開始と同時に行う方法が例示できる。さらに、シクロデキストリンは核酸増幅試薬に必要な成分と同時に加えられることは操作を簡便にする観点からさらに好ましいため、シクロデキストリンを含む核酸増幅試薬を用いることも出来る。
特に核酸増幅反応に必要な成分、例えば酵素や、マグネシウム塩、カリウム塩等の塩類や、トレハロース等の糖類や、グリセロール等の糖アルコールや、核酸成分や、有機溶媒や、プライマーやプローブ等の核酸類や、緩衝液成分等を含むことは、操作を簡略化できる点で好ましい。すなわち、本発明の好適な実施形態の一例として、ステロイド骨格を有する界面活性剤を含むウイルス核酸抽出試薬によりウイルス核酸を抽出し、当該ウイルス核酸抽出液をシクロデキストリンを含む核酸増幅試薬へ添加することで核酸増幅反応を行う試薬があげられる。なお、シクロデキストリンの濃度については特に限定しないが、好ましくはコール酸骨格を有する界面活性剤の濃度の３倍以上、より好ましくは６倍以上である。
本発明における核酸増幅法は、いずれの核酸増幅法（例えば、ＰＣＲ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法）であってもよい。等温で核酸増幅を行う方法は、温度の昇降を行う比較的複雑な装置が不要である点で好ましい。このような核酸増幅法として、ウイルス核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、ウイルス核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素と、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素とを用いて、標的核酸を増幅する方法であって、前記第一のプライマーまたは前記第二のプライマーのいずれかには、その５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素に対応したプロモーター配列を付加している方法（例えば、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法）が例示される。当該方法は一本鎖ＲＮＡを標的として核酸増幅する方法であるが、特開２０１５−１１６３６号公報等に開示される方法を用いることで、二本鎖ＤＮＡ等を増幅することもできる。
本発明における核酸増幅試薬は、乾燥形態であってもよい。核酸増幅試薬には酵素が含まれるため、乾燥状態にすることで液状の場合よりも保存期間を延ばし、保存に適する温度もより室温に近い状態にすることが出来る。さらに乾燥状態にすることで輸送や使う際の操作がし易いという利点がある。
乾燥形態とする方法としては酵素の活性を失わない方法であればいずれの方法であってもよく、凍結乾燥法、蒸発乾燥法などを例示できる。
本発明は、ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含むウイルス核酸抽出試薬により、ウイルスを含む試料から当該ウイルス核酸を抽出し、さらにシクロデキストリンと接触させることを特徴とする、ウイルス核酸を抽出および増幅するための試薬に係る発明である。本発明により、当該ウイルス核酸の抽出および増幅を、精製操作を行なうことなく、簡便、迅速かつ高効率に行なうことができる。
具体的には、本願の構成を採用するウイルスを含む試料から当該ウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット及び方法によって、煩雑な抽出ステップが不要であり、かつＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉと同等の検出感度を達成することができた。
以下、ウイルスとしてインフルエンザウイルスを用いたときの実施例および参考例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら例により限定されるものではない。
実施例１ 標準ＲＮＡの調製
後述の実施例で使用したインフルエンザウイルスＲＮＡ（以下、標準ＲＮＡと表記）は下記に示す方法で調製した。
（１）配列番号１（Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルス、セグメント５、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の４１０番目から９３０番目まで）、配列番号２（Ａ型（Ｈ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルス、セグメント５、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＣ＿００７３６９の４５５番目から９７５番目まで（ただし６６３番目のＣはＴ））および配列番号３（Ｂ型インフルエンザウイルス、セグメント７、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の２０６番目から７３５番目まで）に記載の塩基配列からなる２本鎖ＤＮＡを調製し、それぞれＴ−Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０（タカラバイオ製）へ挿入した（なお、当該ｃＤＮＡ配列の相補鎖の５’末端側にはＳＰ６プロモーターを付加している）。
（２）（１）で調製したプラスミドＤＮＡを、挿入したインフルエンザウイルスｃＤＮＡの５’末端側で制限酵素消化し、直鎖状のＤＮＡを調製した。
（３）（２）で調製したＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写を行なった。その後、ＤＮａｓｅ Ｉ処理により前記鋳型ＤＮＡを完全消化し、精製することで標準ＲＮＡを調製した。調製したＲＮＡは、２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。
後述の実施例で使用したインフルエンザウイルスＲＮＡ（以下、標準ＲＮＡと表記）は下記に示す方法で調製した。
（１）配列番号１（Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルス、セグメント５、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の４１０番目から９３０番目まで）、配列番号２（Ａ型（Ｈ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルス、セグメント５、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＣ＿００７３６９の４５５番目から９７５番目まで（ただし６６３番目のＣはＴ））および配列番号３（Ｂ型インフルエンザウイルス、セグメント７、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の２０６番目から７３５番目まで）に記載の塩基配列からなる２本鎖ＤＮＡを調製し、それぞれＴ−Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０（タカラバイオ製）へ挿入した（なお、当該ｃＤＮＡ配列の相補鎖の５’末端側にはＳＰ６プロモーターを付加している）。
（２）（１）で調製したプラスミドＤＮＡを、挿入したインフルエンザウイルスｃＤＮＡの５’末端側で制限酵素消化し、直鎖状のＤＮＡを調製した。
（３）（２）で調製したＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写を行なった。その後、ＤＮａｓｅ Ｉ処理により前記鋳型ＤＮＡを完全消化し、精製することで標準ＲＮＡを調製した。調製したＲＮＡは、２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。
なお、本例で調製した標準ＲＮＡの全長は約５００塩基と、インフルエンザウイルスＲＮＡの全長（セグメント５：約１５００塩基、セグメント７：約１１００塩基）の一部であるが、インフルエンザウイルスＲＮＡの測定には十分適用可能である。
実施例２ インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの作製
Ｉｓｈｉｇｕｒｏらの方法（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７（１９９６））により、配列番号４に記載の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７２４番目から７４６番目までの塩基配列の相補配列）の５’末端から１７番目のＴと１８番目のＴの間、および配列番号５に記載の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の４６３番目から４８３番目までの塩基配列の相補配列）の５’末端から８番目のＡと９番目のＴの間のリン酸ジエステル部分にリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させ、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（以下、ＩＮＡＦプローブと表記）を調製した。その構造式を以下に示す。
Ｉｓｈｉｇｕｒｏらの方法（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７（１９９６））により、配列番号４に記載の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７２４番目から７４６番目までの塩基配列の相補配列）の５’末端から１７番目のＴと１８番目のＴの間、および配列番号５に記載の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の４６３番目から４８３番目までの塩基配列の相補配列）の５’末端から８番目のＡと９番目のＴの間のリン酸ジエステル部分にリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させ、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（以下、ＩＮＡＦプローブと表記）を調製した。その構造式を以下に示す。
参考例１ スピンカラムを用いた核酸抽出によるインフルエンザウイルスの検出
以下の方法により、スピンカラムを用いた核酸抽出によるインフルエンザウイルスの検出を試みた。
（１）表１に示すインフルエンザウイルスの溶液（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ製）を注射用
水を用いて表３に記載の濃度に希釈し、ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて当該キットのマニュアルに従い抽出することで、インフルエンザウイルスＲＮＡを得た。
以下の方法により、スピンカラムを用いた核酸抽出によるインフルエンザウイルスの検出を試みた。
（１）表１に示すインフルエンザウイルスの溶液（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ製）を注射用
水を用いて表３に記載の濃度に希釈し、ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて当該キットのマニュアルに従い抽出することで、インフルエンザウイルスＲＮＡを得た。
ウイルス抽出液の組成：濃度はウイルス試料添加後（１５μＬ中）の最終濃度
４２．４ｍＭ 塩化マグネシウム
２０５．４ｍＭ 塩化カリウム
２．３％ グリセロール
２３．０％ ＤＭＳＯ
４２．４ｍＭ 塩化マグネシウム
２０５．４ｍＭ 塩化カリウム
２．３％ グリセロール
２３．０％ ＤＭＳＯ
反応液の組成：濃度はウイルスＲＮＡ抽出物添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー。
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。開始液添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。
結果を表３に示す。スピンカラムを用いた核酸抽出法では、概ね４．７×１０−２ＴＣＩＤ５０／ｍＬのインフルエンザウイルスを検出できることを確認した。
以下の方法により、本発明の核酸抽出／増幅試薬に添加するシクロデキストリンの種類を検討した。
（１）実施例１で調製したＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡ（配列番号１）を、注射用水を用いて１０３コピー／５μＬとなるように希釈し、ＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成からなる反応液１５μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注した後、前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
反応液の組成：濃度は開始剤添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー
表４に記載の濃度のシクロデキストリン。
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー
表４に記載の濃度のシクロデキストリン。
（３）上記の反応液を４６℃で４分間保温後、以下の組成からなる開始剤１０μＬを添加した。
開始剤の組成：濃度は開始剤添加後（３０μＬ中）の最終濃度
２１．２ｍＭ 塩化マグネシウム
１０２．７ｍＭ 塩化カリウム
１．２％ グリセロール
１１．５％ ＤＭＳＯ。
２１．２ｍＭ 塩化マグネシウム
１０２．７ｍＭ 塩化カリウム
１．２％ グリセロール
１１．５％ ＤＭＳＯ。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。開始液添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。
結果を表４に示す。α−シクロデキストリン（α−ＣＤ）またはγ−シクロデキストリン（γ−ＣＤ）を核酸増幅試薬に添加しても、反応が進行することが確認できた。特にγ−シクロデキストリンは高濃度に添加しても核酸増幅反応への影響が少ないことから、以下の実験においてはγ−ＣＤを用いた。
以下の方法により、本発明の核酸抽出／増幅試薬に添加する界面活性剤の種類を検討した。
（１）実施例１で調製したＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡを、注射用水を用いて１０３コピー／２．５μＬとなるように希釈し、ＲＮＡ試料として用いた。
（２）表１に示すＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルスの溶液（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ製）を注射用水で４．７×１００ＴＣＩＤ５０／ｍＬに希釈することでウイルス試料を調製した。
（３）（１）で調製したＲＮＡ試料または（２）で調製したウイルス試料２．５μＬを、予め４６℃に加熱した以下の組成からなる界面活性剤を含む溶液（以下、ウイルス抽出液と表記）１２．５μＬに添加、撹拌し、４６℃で４分間保温することで、ウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを調製した。
ウイルス抽出液の組成：濃度はウイルス試料添加後（１５μＬ中）の最終濃度
４２．４ｍＭ 塩化マグネシウム
２０５．４ｍＭ 塩化カリウム
２．３％ グリセロール
２３．０％ ＤＭＳＯ
表５に記載の濃度の界面活性剤。
４２．４ｍＭ 塩化マグネシウム
２０５．４ｍＭ 塩化カリウム
２．３％ グリセロール
２３．０％ ＤＭＳＯ
表５に記載の濃度の界面活性剤。
（４）以下の組成からなるγ−ＣＤを含む反応液１５μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、４６℃で４分間保温後、（３）で得られたウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを直ちに添加した。なお、第一のプライマーおよび第二のプライマーには、表２に示す配列および濃度からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた。また第一のプライマーには、表２に示した各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側に、Ｔ７プロモーター配列（配列番号６）が付加されている。
反応液の組成：濃度はウイルスＲＮＡ抽出物添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー
１（ｗ／ｗ）％ γ−ＣＤ。
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー
１（ｗ／ｗ）％ γ−ＣＤ。
（５）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。開始液添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。
ＲＮＡ試料を用いた場合およびウイルス試料を用いた場合の結果を、表５に示す。ＲＮＡ試料を用いた場合の結果から、種々の界面活性剤に対して、γ−シクロデキストリンにより核酸増幅反応の阻害を緩和できることが認められた。またウイルス試料を用いた場合の結果から、陰イオン性界面活性剤、特にデオキシコール酸ナトリウムやコール酸ナトリウムといったステロイド骨格を有する界面活性剤を用いることで、ウイルスから核酸を高効率に抽出して増幅可能であることが示された。
実施例４で調製したウイルス抽出液を、室温で１２時間静置し、保存安定性を評価した。結果を表６に示す。ＳＤＳ、ＬＤＳ、デオキシコール酸ナトリウムを用いた場合には、結晶状の沈殿が形成された。一方、コール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウムを用いた場合は、沈殿の形成は認められず、本発明における好ましい界面活性剤であることが分かった。
以下の方法により、本発明の核酸抽出／増幅試薬に添加するシクロデキストリンの濃度を検討した。
（１）実施例１で調製したＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡを、注射用水を用いて１０３コピー／２．５μＬとなるように希釈し、ＲＮＡ試料として用いた。
（２）（１）で調製したＲＮＡ試料２．５μＬを、予め４６℃に加熱した以下の組成からなる界面活性剤を含む溶液（以下、ウイルス抽出液と表記）１２．５μＬに添加、撹拌し、４６℃で４分間保温することで、ウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを調製した。
ウイルス抽出液の組成：濃度はウイルス試料添加後（１５μＬ中）の最終濃度
４２．４ｍＭ 塩化マグネシウム
２０５．４ｍＭ 塩化カリウム
２．３％ グリセロール
２３．０％ ＤＭＳＯ
表７から表８に記載の濃度の界面活性剤。
４２．４ｍＭ 塩化マグネシウム
２０５．４ｍＭ 塩化カリウム
２．３％ グリセロール
２３．０％ ＤＭＳＯ
表７から表８に記載の濃度の界面活性剤。
（３）以下の組成からなるγ−ＣＤを含む反応液１５μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、４６℃で４分間保温後、（２）で得られたウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを直ちに添加した。なお、第一のプライマーおよび第二のプライマーには、表２に示す配列および濃度からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた。また第一のプライマーには、表２に示した各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側に、Ｔ７プロモーター配列（配列番号６）が付加されている。
反応液の組成：濃度はウイルスＲＮＡ抽出物添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー
表７から表８に記載の濃度のγ−ＣＤ。
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー
表７から表８に記載の濃度のγ−ＣＤ。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。開始液添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。
界面活性剤としてタウロウルソデオキシコール酸ナトリウムを添加した場合の結果を表７に、コール酸ナトリウムを添加した場合の結果を表８に示す。表７および表８の結果から、シクロデキストリンがステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度の３倍以上、好ましくは６倍以上の濃度で含まれる場合に、核酸増幅反応の阻害を十分に緩和できることがわかる。
以下の方法により、本発明の核酸抽出／増幅試薬に添加する界面活性剤の濃度を検討した。
（１）表１に示すＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルスの溶液（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ製）を注射用水で４．７×１０−１ＴＣＩＤ５０／ｍＬに希釈することでウイル
ス試料を調製した。
（２）（１）で調製したウイルス試料２．５μＬを、予め４６℃に加熱した以下の組成からなる界面活性剤を含む溶液（以下、ウイルス抽出液と表記）１２．５μＬに添加、撹拌し、４６℃で４分間保温することで、ウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを調製した。
ウイルス抽出液の組成：濃度はウイルス試料添加後（１５μＬ中）の最終濃度
４２．４ｍＭ 塩化マグネシウム
２０５．４ｍＭ 塩化カリウム
２．３％ グリセロール
２３．０％ ＤＭＳＯ
表９に記載の濃度のコール酸ナトリウム。
４２．４ｍＭ 塩化マグネシウム
２０５．４ｍＭ 塩化カリウム
２．３％ グリセロール
２３．０％ ＤＭＳＯ
表９に記載の濃度のコール酸ナトリウム。
（３）以下の組成からなるγ−ＣＤを含む反応液１５μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、４６℃で４分間保温後、（２）で得られたウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを直ちに添加した。なお、第一のプライマーおよび第二のプライマーには、表２に示す配列および濃度からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた。また第一のプライマーには、表２に示した各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側に、Ｔ７プロモーター配列（配列番号６）が付加されている。
反応液の組成：濃度はウイルスＲＮＡ抽出物添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
６（ｗ／ｗ）％ γ−ＣＤ
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー。
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
６（ｗ／ｗ）％ γ−ＣＤ
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。開始液添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。
結果を表９に示す。コール酸ナトリウムを添加した抽出液、好ましくはコール酸ナトリウムを０．８（ｗ／ｗ）％以上添加した抽出液を用いることで、ウイルス核酸を良好に抽出および増幅可能なことがわかる。
以下の方法により、ステロイド骨格を有する界面活性剤に加え、さらに非イオン性界面活性剤を添加した抽出試薬について検討を行った。
（１）表１に示すＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルスの溶液（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ製）を注射用水で４．７×１０−１ＴＣＩＤ５０／ｍＬに希釈することでウイル
ス試料を調製した。
（２）（１）で調製したウイルス試料２．５μＬを、予め４６℃に加熱した以下の組成からなるコール酸ナトリウムおよびＴｗｅｅｎ ２０を含む溶液（以下、ウイルス抽出液と表記）１２．５μＬに添加、撹拌し、４６℃で４分間保温することで、ウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを調製した。
ウイルス抽出液の組成：濃度はウイルス試料添加後（１５μＬ中）の最終濃度
４２．４ｍＭ 塩化マグネシウム
２０５．４ｍＭ 塩化カリウム
２．３％ グリセロール
２３．０％ ＤＭＳＯ
０．１（ｖ／ｖ）％ Ｔｗｅｅｎ ２０
表１０に記載の濃度の界面活性剤。
４２．４ｍＭ 塩化マグネシウム
２０５．４ｍＭ 塩化カリウム
２．３％ グリセロール
２３．０％ ＤＭＳＯ
０．１（ｖ／ｖ）％ Ｔｗｅｅｎ ２０
表１０に記載の濃度の界面活性剤。
（３）以下の組成からなるγ−ＣＤを含む反応液１５μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、４６℃で４分間保温後、（２）で得られたウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを直ちに添加した。なお、第一のプライマーおよび第二のプライマーには、表２に示す配列および濃度からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた。また第一のプライマーには、表２に示した各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側に、Ｔ７プロモーター配列（配列番号６）が付加されている。
反応液の組成：濃度はウイルスＲＮＡ抽出物添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー
表１０に記載の濃度のγ−ＣＤ。
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー
表１０に記載の濃度のγ−ＣＤ。
（５）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。開始液添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。結果を表１０に示す。
抽出液中のコール酸ナトリウムの濃度が０．４から１．６（ｗ／ｗ）％の範囲において
、良好にウイルス核酸を抽出および増幅できていることがわかる。また、Ｔｗｅｅｎ ２０を添加していない抽出試薬（表９）に比べ、核酸抽出／増幅効率が向上していることがわかる。
、良好にウイルス核酸を抽出および増幅できていることがわかる。また、Ｔｗｅｅｎ ２０を添加していない抽出試薬（表９）に比べ、核酸抽出／増幅効率が向上していることがわかる。
以下の方法により、本発明の核酸抽出／増幅試薬を用いた場合の抽出時間について、検討を行った。
（１）表１に示すＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルスの溶液（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ製）を、注射用水で４．７×１００ＴＣＩＤ５０／ｍＬに希釈することでウイルス試料を調製した。
（２）（１）で調製したウイルス試料２．５μＬを、予め４６℃に加熱した以下の組成からなる界面活性剤を含む溶液（以下、ウイルス抽出液と表記）１２．５μＬに添加、撹拌し、４６℃で０分から４分間保温することで、ウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを調製した。
（２）（１）で調製したウイルス試料２．５μＬを、予め４６℃に加熱した以下の組成からなる界面活性剤を含む溶液（以下、ウイルス抽出液と表記）１２．５μＬに添加、撹拌し、４６℃で０分から４分間保温することで、ウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを調製した。
ウイルス抽出液の組成：濃度はウイルス試料添加後（１５μＬ中）の最終濃度
４２．４ｍＭ 塩化マグネシウム
２０５．４ｍＭ 塩化カリウム
２．３％ グリセロール
２３．０％ ＤＭＳＯ
０．１（ｖ／ｖ）％ Ｔｗｅｅｎ ２０
１．０（ｗ／ｗ）％ コール酸ナトリウム。
４２．４ｍＭ 塩化マグネシウム
２０５．４ｍＭ 塩化カリウム
２．３％ グリセロール
２３．０％ ＤＭＳＯ
０．１（ｖ／ｖ）％ Ｔｗｅｅｎ ２０
１．０（ｗ／ｗ）％ コール酸ナトリウム。
（３）以下の組成からなるγ−ＣＤを含む反応液１５μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、４６℃で４分間保温後、（２）で得られたウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを直ちに添加した。なお、第一のプライマーおよび第二のプライマーには、表２に示す配列および濃度からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた。また第一のプライマーには、表２に示した各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側に、Ｔ７プロモーター配列（配列番号６）が付加されている。
反応液の組成：濃度はウイルスＲＮＡ抽出物添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー
６（ｗ／ｗ）％ γ−ＣＤ。
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー
６（ｗ／ｗ）％ γ−ＣＤ。
（５）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。開始液添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。
結果を表１１に示す。抽出時の加熱時間を０分（ウイルスを抽出試薬と混合後、直ちに反応液と混合する方法）とした場合も、良好にウイルス核酸を抽出／増幅可能であった。
以下の方法により、本発明の核酸抽出／増幅試薬を用いて、各種インフルエンザウイルスの検出を行った。
（１）表１に示すＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルス、Ａ型（Ｈ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルスの溶液（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ製）を、注射用水で表１２に記載の濃度に希釈することでウイルス試料を調製した。
（２）（１）で調製したウイルス試料２．５μＬを、予め４６℃に加熱した以下の組成からなる界面活性剤を含む溶液（以下、ウイルス抽出液と表記）１２．５μＬに添加、撹拌し、４６℃で４分間保温することで、ウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを調製した。
ウイルス抽出液の組成：濃度はウイルス試料添加後（１５μＬ中）の最終濃度
４２．４ｍＭ 塩化マグネシウム
２０５．４ｍＭ 塩化カリウム
２．３％ グリセロール
２３．０％ ＤＭＳＯ
０．１（ｖ／ｖ）％ Ｔｗｅｅｎ ２０
１．０（ｗ／ｗ）％ コール酸ナトリウム。
４２．４ｍＭ 塩化マグネシウム
２０５．４ｍＭ 塩化カリウム
２．３％ グリセロール
２３．０％ ＤＭＳＯ
０．１（ｖ／ｖ）％ Ｔｗｅｅｎ ２０
１．０（ｗ／ｗ）％ コール酸ナトリウム。
（３）以下の組成からなるγ−ＣＤを含む反応液１５μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、４６℃で４分間保温後、（２）で得られたウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを直ちに添加した。なお、第一のプライマーおよび第二のプライマーには、表２に示す配列および濃度からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた。また第一のプライマーには、表２に示した各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側に、Ｔ７プロモーター配列（配列番号６）が付加されている。
反応液の組成：濃度はウイルスＲＮＡ抽出物添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー
６（ｗ／ｗ）％ γ−ＣＤ。
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー
６（ｗ／ｗ）％ γ−ＣＤ。
（５）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。開始液添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。
結果を表１２に示す。概ね４．７×１０−２ＴＣＩＤ５０／ｍＬのインフルエンザウイルスを検出できており、簡便かつ迅速な方法でありながら、スピンカラムを用いた核酸抽出／精製方法（参考例１）と同等の高い効率を有していることが認められた。
以下の組成からなるγ−ＣＤを含む試薬液１８．５μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、Ｖｉｒｔｉｓ ＧＥＮＥＳＩＳ １２ＳＬにて、−４０℃ ２時間、−２０℃ １４時間、２５℃ ２時間で真空下において凍結乾燥した。なお、第一のプライマーおよび第二のプライマーには、表２に示す配列および濃度からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた。また第一のプライマーには、表２に示した各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側に、Ｔ７プロモーター配列（配列番号６）が付加されている。
試薬液の組成：濃度はウイルスＲＮＡ抽出物添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．７ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
１９８．９ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー
６．８（ｗ／ｗ）％ γ−ＣＤ。
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．７ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
１９８．９ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー
６．８（ｗ／ｗ）％ γ−ＣＤ。
実施例１２ 凍結乾燥増幅試薬によるインフルエンザウイルスの検出感度
以下の方法により、本発明の核酸抽出／増幅試薬を用いて、各種インフルエンザウイルスの検出を行った。
（１）表１に示すＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルスを、注射用水で表１３に記載の濃度に希釈することでウイルス試料を調製した。
（２）（１）で調製したウイルス試料３μＬを、予め４６℃に加熱した以下の組成からなる界面活性剤を含む溶液（以下、ウイルス抽出液と表記）２７μＬに添加、撹拌し、４６℃で４分間保温し、３０μＬを実施例１１で作製した凍結乾燥試薬に添加した。
以下の方法により、本発明の核酸抽出／増幅試薬を用いて、各種インフルエンザウイルスの検出を行った。
（１）表１に示すＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルスを、注射用水で表１３に記載の濃度に希釈することでウイルス試料を調製した。
（２）（１）で調製したウイルス試料３μＬを、予め４６℃に加熱した以下の組成からなる界面活性剤を含む溶液（以下、ウイルス抽出液と表記）２７μＬに添加、撹拌し、４６℃で４分間保温し、３０μＬを実施例１１で作製した凍結乾燥試薬に添加した。
ウイルス抽出液の組成：濃度はウイルス試料添加後の最終濃度
２２．２ｍＭ 塩化マグネシウム
４７．５ｍＭ 塩化カリウム
１．２％ グリセロール
１０．３％ ＤＭＳＯ
０．０５（ｖ／ｖ）％ Ｔｗｅｅｎ ２０
１．５（ｗ／ｗ）％ コール酸ナトリウム。
２２．２ｍＭ 塩化マグネシウム
４７．５ｍＭ 塩化カリウム
１．２％ グリセロール
１０．３％ ＤＭＳＯ
０．０５（ｖ／ｖ）％ Ｔｗｅｅｎ ２０
１．５（ｗ／ｗ）％ コール酸ナトリウム。
同時に実施例１０で示した液状試薬（反応液）を用いて、温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。開始液添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。
結果を表１３に示す。乾燥状態の増幅試薬においても、液状の試薬と同程度の検出性能を有していることが示された。
Claims (10)
- 以下の（ｉ）（ｉｉ）（ｉｉｉ）を含む、ウイルスを含む試料から前記ウイルス核酸を抽出および増幅するためのキットであって、
前記シクロデキストリンがγ−シクロデキストリンであり、
前記界面活性剤が、コール酸、タウロコール酸、グリココール酸、タウロウルソデオキシコール酸又はそれらの塩のいずれかであり、
シクロデキストリンの濃度（ｗ／ｗ）％が、ステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度（ｗ／ｗ）％の３倍以上である、キット。
（ｉ）ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含むウイルス核酸抽出試薬
（ｉｉ）シクロデキストリン
（ｉｉｉ）核酸増幅試薬 - 前記シクロデキストリンが核酸増幅試薬に含まれている、請求項１に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
- 前記ウイルスがエンベロープを有するウイルスである、請求項１または２に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
- 前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１から３のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
- 抽出試薬におけるステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度が０．４（ｗ／ｗ）％以上である、請求項１から４のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
- さらに非イオン界面活性剤を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
- 核酸増幅試薬が乾燥形態である請求項１から６のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
- 以下の（ｉ）（ｉｉ）（ｉｉｉ）の工程を含む、ウイルスを含む試料から前記ウイルス核酸を抽出および増幅する方法であって、
前記シクロデキストリンがγ−シクロデキストリンであり、
前記界面活性剤が、コール酸、タウロコール酸、グリココール酸、タウロウルソデオキシコール酸又はそれらの塩のいずれかであり、
シクロデキストリンの濃度（ｗ／ｗ）％が、ステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度（ｗ／ｗ）％の３倍以上である、方法。
（ｉ）前記ウイルスを、ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含むウイルス核酸抽出試薬と接触させる核酸抽出工程
（ｉｉ）（ｉ）によって抽出されたウイルス核酸抽出液にシクロデキストリンを接触させる工程
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の工程で得られた溶液の一部または全部を核酸増幅試薬と接触させる核酸増幅工程 - 以下の（ｉ）（ｉｉ）の工程を含む、ウイルスを含む試料から前記ウイルス核酸を抽出および増幅する方法であって、
前記シクロデキストリンがγ−シクロデキストリンであり、
前記界面活性剤が、コール酸、タウロコール酸、グリココール酸、タウロウルソデオキシコール酸又はそれらの塩のいずれかであり、
シクロデキストリンの濃度（ｗ／ｗ）％が、ステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度（ｗ／ｗ）％の３倍以上である、方法。
（ｉ）前記ウイルスを、ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含むウイルス核酸抽出試薬と接触させる核酸抽出工程
（ｉｉ）（ｉ）によって抽出されたウイルス核酸抽出液を、シクロデキストリンを含む核酸増幅試薬と接触させる核酸増幅工程 - 前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項８または９に記載の方法。
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