JP6801237B2 - ウイルスからの核酸抽出および増幅試薬 - Google Patents
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Description
[1] 以下の(i)(ii)(iii)を含む、ウイルスを含む試料から当該ウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
(i)ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含むウイルス核酸抽出試薬
(ii)シクロデキストリン
(iii)核酸増幅試薬
[2]当該シクロデキストリンが核酸増幅試薬に含まれている、[1]に記載のウイルス核酸を抽出及び増幅するためのキット。
[3] 当該ウイルスがエンベロープを有するウイルスである、[1]または[2]に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
[4] 当該ウイルスがインフルエンザウイルスである、[1]から[3]のいずれか1項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
[5] シクロデキストリンがγ−シクロデキストリンである、[1]から[4]のいずれか1項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
[6] 界面活性剤が胆汁酸である、[1]から[5]のいずれか1項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
[7] 界面活性剤が、コール酸、タウロコール酸、グリココール酸、タウロウルソデオキシコール酸又はそれらの塩のいずれかである、[6]に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
[8] シクロデキストリンの濃度が、ステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度の3倍以上である、[1]から[7]のいずれか1項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
[9] 抽出試薬におけるステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度が0.4(w/w)%以上である、[1]から[8]のいずれか1項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
[10] さらに非イオン界面活性剤を含む、[1]から[9]のいずれか1項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
[11] 核酸増幅試薬が乾燥形態である[1]から[10]のいずれか1項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
[12] 以下の(i)(ii)(iii)の工程を含む、ウイルスを含む試料から当該ウイルス核酸を抽出および増幅する方法。
(i)当該ウイルスを、ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含むウイルス核酸抽出試薬と接触させる核酸抽出工程
(ii)(i)によって抽出されたウイルス核酸抽出液にシクロデキストリンを接触させる工程
(iii)(ii)の工程で得られた溶液の一部又は全部を核酸増幅試薬と接触させる核酸増幅工程
[13]以下の(i)(ii)の工程を含む、ウイルスを含む試料から当該ウイルス核酸を抽出および増幅する方法。
(i)当該ウイルスを、ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含むウイルス核酸抽出試薬と接触させる核酸抽出工程
(ii)(i)によって抽出されたウイルス核酸抽出液を、シクロデキストリンを含む核酸増幅試薬と接触させる核酸増幅工程。
後述の実施例で使用したインフルエンザウイルスRNA(以下、標準RNAと表記)は下記に示す方法で調製した。
(1)配列番号1(A型(H1N1亜型)インフルエンザウイルス、セグメント5、cDNA部分配列、GenBank No.FJ969536の410番目から930番目まで)、配列番号2(A型(H3N2亜型)インフルエンザウイルス、セグメント5、cDNA部分配列、GenBank No.NC_007369の455番目から975番目まで(ただし663番目のCはT))および配列番号3(B型インフルエンザウイルス、セグメント7、cDNA部分配列、GenBank No.CY115184の206番目から735番目まで)に記載の塩基配列からなる2本鎖DNAを調製し、それぞれT−Vector pMD20(タカラバイオ製)へ挿入した(なお、当該cDNA配列の相補鎖の5’末端側にはSP6プロモーターを付加している)。
(2)(1)で調製したプラスミドDNAを、挿入したインフルエンザウイルスcDNAの5’末端側で制限酵素消化し、直鎖状のDNAを調製した。
(3)(2)で調製したDNAを鋳型として、SP6 RNAポリメラーゼによるインビトロ転写を行なった。その後、DNase I処理により前記鋳型DNAを完全消化し、精製することで標準RNAを調製した。調製したRNAは、260nmにおける吸光度を測定して定量した。
Ishiguroらの方法(Ishiguro,T.et al,Nucleic Acids Res.,24,4992−4997(1996))により、配列番号4に記載の配列(GenBank No.KJ741989の724番目から746番目までの塩基配列の相補配列)の5’末端から17番目のTと18番目のTの間、および配列番号5に記載の配列(GenBank No.CY115184の463番目から483番目までの塩基配列の相補配列)の5’末端から8番目のAと9番目のTの間のリン酸ジエステル部分にリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させ、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ(以下、INAFプローブと表記)を調製した。その構造式を以下に示す。
以下の方法により、スピンカラムを用いた核酸抽出によるインフルエンザウイルスの検出を試みた。
(1)表1に示すインフルエンザウイルスの溶液(ZeptoMetrix製)を注射用
水を用いて表3に記載の濃度に希釈し、QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN社製)を用いて当該キットのマニュアルに従い抽出することで、インフルエンザウイルスRNAを得た。
42.4mM 塩化マグネシウム
205.4mM 塩化カリウム
2.3% グリセロール
23.0% DMSO
60mM Tris−HCl(pH8.6)
各0.25mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP
各2.6mM ATP、CTP、UTP、GTP
3.06mM ITP
70mM トレハロース
9.1U AMV逆転写酵素
142U T7 RNAポリメラーゼ
各20nM INAFプローブ(実施例2で調製)(配列番号4および5)
表2に記載の濃度の第一のプライマー
表2に記載の濃度の第二のプライマー。
以下の方法により、本発明の核酸抽出/増幅試薬に添加するシクロデキストリンの種類を検討した。
(1)実施例1で調製したA型(H1N1亜型)インフルエンザウイルス標準RNA(配列番号1)を、注射用水を用いて103コピー/5μLとなるように希釈し、RNA試料として用いた。
(2)以下の組成からなる反応液15μLを0.5mL容量PCRチューブ(Individual Dome Cap PCR Tube、SSI製)に分注した後、前記RNA試料5μLを添加した。
60mM Tris−HCl(pH8.6)
各0.25mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP
各2.6mM ATP、CTP、UTP、GTP
3.06mM ITP
70mM トレハロース
9.1U AMV逆転写酵素
142U T7 RNAポリメラーゼ
各20nM INAFプローブ(実施例2で調製)(配列番号4および5)
表2に記載の濃度の第一のプライマー
表2に記載の濃度の第二のプライマー
表4に記載の濃度のシクロデキストリン。
21.2mM 塩化マグネシウム
102.7mM 塩化カリウム
1.2% グリセロール
11.5% DMSO。
以下の方法により、本発明の核酸抽出/増幅試薬に添加する界面活性剤の種類を検討した。
(1)実施例1で調製したA型(H1N1亜型)インフルエンザウイルス標準RNAを、注射用水を用いて103コピー/2.5μLとなるように希釈し、RNA試料として用いた。
(2)表1に示すA型(H1N1亜型)インフルエンザウイルスの溶液(ZeptoMetrix製)を注射用水で4.7×100TCID50/mLに希釈することでウイルス試料を調製した。
(3)(1)で調製したRNA試料または(2)で調製したウイルス試料2.5μLを、予め46℃に加熱した以下の組成からなる界面活性剤を含む溶液(以下、ウイルス抽出液と表記)12.5μLに添加、撹拌し、46℃で4分間保温することで、ウイルスRNA抽出物15μLを調製した。
42.4mM 塩化マグネシウム
205.4mM 塩化カリウム
2.3% グリセロール
23.0% DMSO
表5に記載の濃度の界面活性剤。
60mM Tris−HCl(pH8.6)
各0.25mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP
各2.6mM ATP、CTP、UTP、GTP
3.06mM ITP
70mM トレハロース
9.1U AMV逆転写酵素
142U T7 RNAポリメラーゼ
各20nM INAFプローブ(実施例2で調製)(配列番号4および5)
表2に記載の濃度の第一のプライマー
表2に記載の濃度の第二のプライマー
1(w/w)% γ−CD。
実施例4で調製したウイルス抽出液を、室温で12時間静置し、保存安定性を評価した。結果を表6に示す。SDS、LDS、デオキシコール酸ナトリウムを用いた場合には、結晶状の沈殿が形成された。一方、コール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウムを用いた場合は、沈殿の形成は認められず、本発明における好ましい界面活性剤であることが分かった。
以下の方法により、本発明の核酸抽出/増幅試薬に添加するシクロデキストリンの濃度を検討した。
(1)実施例1で調製したA型(H1N1亜型)インフルエンザウイルス標準RNAを、注射用水を用いて103コピー/2.5μLとなるように希釈し、RNA試料として用いた。
(2)(1)で調製したRNA試料2.5μLを、予め46℃に加熱した以下の組成からなる界面活性剤を含む溶液(以下、ウイルス抽出液と表記)12.5μLに添加、撹拌し、46℃で4分間保温することで、ウイルスRNA抽出物15μLを調製した。
42.4mM 塩化マグネシウム
205.4mM 塩化カリウム
2.3% グリセロール
23.0% DMSO
表7から表8に記載の濃度の界面活性剤。
60mM Tris−HCl(pH8.6)
各0.25mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP
各2.6mM ATP、CTP、UTP、GTP
3.06mM ITP
70mM トレハロース
9.1U AMV逆転写酵素
142U T7 RNAポリメラーゼ
各20nM INAFプローブ(実施例2で調製)(配列番号4および5)
表2に記載の濃度の第一のプライマー
表2に記載の濃度の第二のプライマー
表7から表8に記載の濃度のγ−CD。
以下の方法により、本発明の核酸抽出/増幅試薬に添加する界面活性剤の濃度を検討した。
(1)表1に示すA型(H1N1亜型)インフルエンザウイルスの溶液(ZeptoMetrix製)を注射用水で4.7×10−1TCID50/mLに希釈することでウイル
ス試料を調製した。
(2)(1)で調製したウイルス試料2.5μLを、予め46℃に加熱した以下の組成からなる界面活性剤を含む溶液(以下、ウイルス抽出液と表記)12.5μLに添加、撹拌し、46℃で4分間保温することで、ウイルスRNA抽出物15μLを調製した。
42.4mM 塩化マグネシウム
205.4mM 塩化カリウム
2.3% グリセロール
23.0% DMSO
表9に記載の濃度のコール酸ナトリウム。
60mM Tris−HCl(pH8.6)
各0.25mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP
各2.6mM ATP、CTP、UTP、GTP
3.06mM ITP
70mM トレハロース
6(w/w)% γ−CD
9.1U AMV逆転写酵素
142U T7 RNAポリメラーゼ
各20nM INAFプローブ(実施例2で調製)(配列番号4および5)
表2に記載の濃度の第一のプライマー
表2に記載の濃度の第二のプライマー。
以下の方法により、ステロイド骨格を有する界面活性剤に加え、さらに非イオン性界面活性剤を添加した抽出試薬について検討を行った。
(1)表1に示すA型(H1N1亜型)インフルエンザウイルスの溶液(ZeptoMetrix製)を注射用水で4.7×10−1TCID50/mLに希釈することでウイル
ス試料を調製した。
(2)(1)で調製したウイルス試料2.5μLを、予め46℃に加熱した以下の組成からなるコール酸ナトリウムおよびTween 20を含む溶液(以下、ウイルス抽出液と表記)12.5μLに添加、撹拌し、46℃で4分間保温することで、ウイルスRNA抽出物15μLを調製した。
42.4mM 塩化マグネシウム
205.4mM 塩化カリウム
2.3% グリセロール
23.0% DMSO
0.1(v/v)% Tween 20
表10に記載の濃度の界面活性剤。
60mM Tris−HCl(pH8.6)
各0.25mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP
各2.6mM ATP、CTP、UTP、GTP
3.06mM ITP
70mM トレハロース
9.1U AMV逆転写酵素
142U T7 RNAポリメラーゼ
各20nM INAFプローブ(実施例2で調製)(配列番号4および5)
表2に記載の濃度の第一のプライマー
表2に記載の濃度の第二のプライマー
表10に記載の濃度のγ−CD。
、良好にウイルス核酸を抽出および増幅できていることがわかる。また、Tween 20を添加していない抽出試薬(表9)に比べ、核酸抽出/増幅効率が向上していることがわかる。
(2)(1)で調製したウイルス試料2.5μLを、予め46℃に加熱した以下の組成からなる界面活性剤を含む溶液(以下、ウイルス抽出液と表記)12.5μLに添加、撹拌し、46℃で0分から4分間保温することで、ウイルスRNA抽出物15μLを調製した。
42.4mM 塩化マグネシウム
205.4mM 塩化カリウム
2.3% グリセロール
23.0% DMSO
0.1(v/v)% Tween 20
1.0(w/w)% コール酸ナトリウム。
60mM Tris−HCl(pH8.6)
各0.25mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP
各2.6mM ATP、CTP、UTP、GTP
3.06mM ITP
70mM トレハロース
9.1U AMV逆転写酵素
142U T7 RNAポリメラーゼ
各20nM INAFプローブ(実施例2で調製)(配列番号4および5)
表2に記載の濃度の第一のプライマー
表2に記載の濃度の第二のプライマー
6(w/w)% γ−CD。
以下の方法により、本発明の核酸抽出/増幅試薬を用いて、各種インフルエンザウイルスの検出を行った。
(1)表1に示すA型(H1N1亜型)インフルエンザウイルス、A型(H3N2亜型)インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルスの溶液(ZeptoMetrix製)を、注射用水で表12に記載の濃度に希釈することでウイルス試料を調製した。
(2)(1)で調製したウイルス試料2.5μLを、予め46℃に加熱した以下の組成からなる界面活性剤を含む溶液(以下、ウイルス抽出液と表記)12.5μLに添加、撹拌し、46℃で4分間保温することで、ウイルスRNA抽出物15μLを調製した。
42.4mM 塩化マグネシウム
205.4mM 塩化カリウム
2.3% グリセロール
23.0% DMSO
0.1(v/v)% Tween 20
1.0(w/w)% コール酸ナトリウム。
60mM Tris−HCl(pH8.6)
各0.25mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP
各2.6mM ATP、CTP、UTP、GTP
3.06mM ITP
70mM トレハロース
9.1U AMV逆転写酵素
142U T7 RNAポリメラーゼ
各20nM INAFプローブ(実施例2で調製)(配列番号4および5)
表2に記載の濃度の第一のプライマー
表2に記載の濃度の第二のプライマー
6(w/w)% γ−CD。
以下の組成からなるγ−CDを含む試薬液18.5μLを0.5mL容量PCRチューブ(Individual Dome Cap PCR Tube、SSI製)に分注し、Virtis GENESIS 12SLにて、−40℃ 2時間、−20℃ 14時間、25℃ 2時間で真空下において凍結乾燥した。なお、第一のプライマーおよび第二のプライマーには、表2に示す配列および濃度からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた。また第一のプライマーには、表2に示した各配列番号に記載の塩基配列の5’末端側に、T7プロモーター配列(配列番号6)が付加されている。
60mM Tris−HCl(pH8.6)
各0.25mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP
各2.7mM ATP、CTP、UTP、GTP
3.06mM ITP
198.9mM トレハロース
9.1U AMV逆転写酵素
142U T7 RNAポリメラーゼ
各20nM INAFプローブ(実施例2で調製)(配列番号4および5)
表2に記載の濃度の第一のプライマー
表2に記載の濃度の第二のプライマー
6.8(w/w)% γ−CD。
以下の方法により、本発明の核酸抽出/増幅試薬を用いて、各種インフルエンザウイルスの検出を行った。
(1)表1に示すA型(H1N1亜型)インフルエンザウイルスを、注射用水で表13に記載の濃度に希釈することでウイルス試料を調製した。
(2)(1)で調製したウイルス試料3μLを、予め46℃に加熱した以下の組成からなる界面活性剤を含む溶液(以下、ウイルス抽出液と表記)27μLに添加、撹拌し、46℃で4分間保温し、30μLを実施例11で作製した凍結乾燥試薬に添加した。
22.2mM 塩化マグネシウム
47.5mM 塩化カリウム
1.2% グリセロール
10.3% DMSO
0.05(v/v)% Tween 20
1.5(w/w)% コール酸ナトリウム。
Claims (10)
- 以下の(i)(ii)(iii)を含む、ウイルスを含む試料から前記ウイルス核酸を抽出および増幅するためのキットであって、
前記シクロデキストリンがγ−シクロデキストリンであり、
前記界面活性剤が、コール酸、タウロコール酸、グリココール酸、タウロウルソデオキシコール酸又はそれらの塩のいずれかであり、
シクロデキストリンの濃度(w/w)%が、ステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度(w/w)%の3倍以上である、キット。
(i)ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含むウイルス核酸抽出試薬
(ii)シクロデキストリン
(iii)核酸増幅試薬 - 前記シクロデキストリンが核酸増幅試薬に含まれている、請求項1に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
- 前記ウイルスがエンベロープを有するウイルスである、請求項1または2に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
- 前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項1から3のいずれか1項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
- 抽出試薬におけるステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度が0.4(w/w)%以上である、請求項1から4のいずれか1項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
- さらに非イオン界面活性剤を含む、請求項1から5のいずれか1項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
- 核酸増幅試薬が乾燥形態である請求項1から6のいずれか1項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
- 以下の(i)(ii)(iii)の工程を含む、ウイルスを含む試料から前記ウイルス核酸を抽出および増幅する方法であって、
前記シクロデキストリンがγ−シクロデキストリンであり、
前記界面活性剤が、コール酸、タウロコール酸、グリココール酸、タウロウルソデオキシコール酸又はそれらの塩のいずれかであり、
シクロデキストリンの濃度(w/w)%が、ステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度(w/w)%の3倍以上である、方法。
(i)前記ウイルスを、ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含むウイルス核酸抽出試薬と接触させる核酸抽出工程
(ii)(i)によって抽出されたウイルス核酸抽出液にシクロデキストリンを接触させる工程
(iii)(ii)の工程で得られた溶液の一部または全部を核酸増幅試薬と接触させる核酸増幅工程 - 以下の(i)(ii)の工程を含む、ウイルスを含む試料から前記ウイルス核酸を抽出および増幅する方法であって、
前記シクロデキストリンがγ−シクロデキストリンであり、
前記界面活性剤が、コール酸、タウロコール酸、グリココール酸、タウロウルソデオキシコール酸又はそれらの塩のいずれかであり、
シクロデキストリンの濃度(w/w)%が、ステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度(w/w)%の3倍以上である、方法。
(i)前記ウイルスを、ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含むウイルス核酸抽出試薬と接触させる核酸抽出工程
(ii)(i)によって抽出されたウイルス核酸抽出液を、シクロデキストリンを含む核酸増幅試薬と接触させる核酸増幅工程 - 前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項8または9に記載の方法。
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