JP6794555B2 - アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体、これを含む微生物、またはこれを用いるl−分岐鎖アミノ酸の生産方法 - Google Patents
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Description
以下、本出願の実施例により詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願の範囲がこれらの実施例により限定されるものではない。
本実施例では、アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体を取得するために、下記の方法で染色体内の1次交差挿入用のベクターライブラリを製作した。コリネバクテリウム・グルタミカムATCC14067由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼ(配列番号1)をコードするilvB遺伝子(配列番号2)を対象に、Error−prone PCR法を行い、塩基置換変異がランダムに導入されたilvB遺伝子変異体(2395bp)を獲得した。Error−prone PCRはGenemorphII Random Mutagenesis Kit(Stratagene)を用いて行い、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC14067のゲノムDNAを鋳型とし、プライマー1(配列番号3)及びプライマー2(配列番号4)を用いた。
プライマー2(配列番号4):5’− GGGTC TCTCC TTATG CCTC -3’
増幅された遺伝子断片内に変異が1kb当り0〜3.5個が導入されるようにし、PCR条件は、変性96℃、30秒;アニーリング53℃、30秒;及び重合反応72℃、2分を30回繰り返した。
KCCM11201P(特許文献5)菌株を親菌株にしてpCR2.1−ilvB(mt)ライブラリを導入するためのilvB欠損菌株を製作した。
プライマー4(配列番号6):5’− CAGCC AAGTC CCTCA GAATT GATGT AGCAA TTATC C−3’
プライマー5(配列番号7):5’− GGATA ATTGC TACAT CAATT CTGAG GGACT TGGCT G−3’
プライマー6(配列番号8):5’− GCGTC TAGAA CCACA GAGTC TGGAG CC−3’
PCR条件は、95℃で5分間変性した後、95℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、72℃で30秒の重合を30回繰り返した後、72℃で7分間重合反応を行った。
前記製作したKCCM11201PilvB菌株を親菌株にして前記製作されたpCR2.1−ilvB(mt)ライブラリを相同染色体組換えによって形質転換した。これをカナマイシン(25mg/L)が含まれた複合平板培地に塗抹して約10,000個のコロニーを確保し、各コロニーをKCCM11201PilvB/pCR2.1−ilvB(mt)−1から KCCM11201PilvB/pCR2.1−ilvB(mt)−10000までと命名した。
ブドウ糖10g、ペプトン10g、牛肉抽出物5g、酵母抽出物5g、脳心臓浸出液(Brain Heart Infusion)18.5g、NaCl 2.5g、尿素2g、ソルビトール(sorbitol)91g、寒天20g(蒸留水1L基準)
確保された約10,000個のコロニーをそれぞれ300μlの選別培地に接種して、96ディープウェルプレートで32℃、1000rpmで約24時間培養した。培養液の中に生産されたL−アミノ酸の生産量を分析するためにニンヒドリン方法を用いた(非特許文献10)。培養が完了した後、培養上澄み液10μlとニンヒドリン反応溶液190μlとを65℃で30分間反応させた後、波長570nmで分光光度計(spectrophotometer)で吸光度を測定した。対照群KCCM11201PilvB/pCR2.1−ilvB(WT)菌株の吸光度と比較して10%以上増加した吸光度を示す変異菌株のコロニー約213個を選別した。その他のコロニーは対照区に比べて類似または減少した吸光度を示した。
ブドウ糖10g、硫酸アンモニウム5.5g、硫酸マグネシウム7水塩1.2g、第1リン酸カリウム 0.8 g、第2リン酸カリウム 16.4g、ビオチン100μg、チアミン塩酸塩1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド2000μg( 蒸留水1L基準 )
選別された213個の菌株は、前記と同様の方法でニンヒドリン反応を繰り返して行い、KCCM11201PilvB/pCR2.1−ilvB(WT)菌株に比べてL−アミノ酸生産能が向上された菌株の上位60種を選別した。
前記実施例3で選別した60種の菌株のL−バリン生産能を比較するために、以下のような方法で培養し、培養液の成分を分析した。
ブドウ糖100g、硫酸アンモニウム40g、大豆タンパク質2.5g、トウモロコシ浸漬固形分(Corn Steep Solids)5g、尿素3g、第2リン酸カリウム1g、硫酸マグネシウム7水塩0.5g、ビオチン100μg、チアミン塩酸塩1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド3000μg、炭酸カルシウム30(蒸留水1リットルあたり)
60種の菌株のうち、L−バリン濃度が向上された菌株2種を選別して、前記培養及び分析を繰り返して行い、分析されたL−バリンの濃度は下記表1の通りである。残り58種の菌株は、L−バリン濃度がむしろ下がる結果を示した。
前記実施例4で選別した2種菌株のアセトヒドロキシ酸シンターゼに導入されたランダム変異を確認するために、ilvB遺伝子の塩基配列を分析した。塩基配列を決定するためにプライマー7(配列番号12)及びプライマー8(配列番号13)を用いてPCRを行った。
プライマー7(配列番号12):5’− CGCTT GATAA TACGC ATG −3’
プライマー8(配列番号13):5’− GAACA TACCT GATAC GCG −3’
前記実施例5で確認した変異されたアセトヒドロキシ酸シンターゼタンパク質の効果を確認するために、これを染色体上に導入しうるベクターを製作した。
プライマー9(配列番号14):5’− CGCTC TAGAC AAGCA GGTTG AGGTT CC −3’
プライマー10(配列番号15):5’− CGCTC TAGAC ACGAG GTTGA ATGCG CG −3’
プライマー11(配列番号16):5’− CGCTC TAGAC CCTCG ACAAC ACTCA CC −3’
プライマー12(配列番号17):5’− CGCTC TAGAT GCCAT CAAGG TGGTG AC −3’
前記実施例6で製造した新規変異の導入ベクター2種をそれぞれ2段階相同染色体組換えによりL−バリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムKCCM11201Pに形質転換させた。その後、染色体上のilvB変異が導入された菌株を塩基配列分析によって選別し、前記ilvB変異が導入された菌株をそれぞれKCCM11201P::ilvB(W503Q)及びKCCM11201P::ilvB(T96S)と命名した。そして、前記変異導入ベクターの中で、pDZ−ilvB(T96S)を前記製作した菌株KCCM11201P::ilvB(W503Q)に形質転換させた。その後、染色体上のilvB変異2種の両方が導入された菌株をKCCM11201P::ilvB(W503Q/ T96S)と命名した。
対照群として、L−バリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムKCCM11201PからL−バリン生合成過発現ベクターを製作した。また、前記実施例7で製造したそれぞれのKCCM11201P::ilvB(W503Q)、KCCM11201P::ilvB(T96S)から変異されたアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードするDNAが含まれたL−バリン生合成過発現ベクターを製作した。
プライマー14(配列番号19):5’− CTGTC TAGAA ATCGT GGGAG TTAAA CTCGC −3’
実施例5で確認した変異されたアセトヒドロキシ酸シンターゼタンパク質において、変異位置の効果を確認するために、96番目のアミノ酸がトレオニンまたはセリン以外のアミノ酸に、503番目のアミノ酸がトリプトファンまたはグルタミン以外のアミノ酸に置換された変異を含むベクターを製作した。
プライマー16(配列番号21):5’− CTGGG CATGG TTCGC CAAAA CCAGA CCCTA TTCTA TGAAG −3’
その後、増幅された2つのDNA断片を鋳型として、プライマー13(配列番号18)及びプライマー14(配列番号19)でPCRを行った。PCR条件は、94℃で5分間変性した後、94℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、72℃で4分の重合を30回繰り返した後、72℃で7分間重合反応を行った。
プライマー18(配列番号23):5’− CTGGG CATGG TTCGC CAACT GCAGA CCCTA TTCTA TGAAG −3’
その後、増幅された2つのDNA断片を鋳型とし、プライマー13(配列番号18)及びプライマー14(配列番号19)でPCRを行った。
プライマー20(配列番号25):5’− GTTGG CGTCT GCATT GCAGC ATCTG GCCCA GGCGC AACC −3’
その後、増幅された2つのDNA断片を鋳型とし、プライマー13(配列番号18)及びプライマー14(配列番号19)でPCRを行った。
プライマー22(配列番号27):5’− GTTGG CGTCT GCATT GCATG CTCTG GCCCA GGCGC AACC −3’
その後、増幅された2つのDNA断片を鋳型とし、プライマー13(配列番号18)及びプライマー14(配列番号19)でPCRを行った。
実施例8と同様の方法で、PCRで増幅された前記4種の変異型遺伝子断片を制限酵素BamHIとXbaIで処理して、それぞれのDNA切片を獲得した後、これを制限酵素BamHIとXbaI末端を有する過発現ベクターpECCG117に連結した後、大腸菌DH5αに形質転換して、カナマイシン(25mg/l)が含まれたLB固体培地に塗抹した。
前記実施例8及び実施例9で製造したL−バリン生合成過発現ベクターpECCG117−ilvBN、pECCG117−ilvB(W503Q)N、pECCG117−ilvB(T96S)N及びpECCG117−ilvB(W503N)N、pECCG117−ilvB(W503L)N、pECCG117−ilvB(T96A)N、pECCG117−ilvB(T96C)Nをコリネバクテリウム・グルタミカム野生型菌株ATCC13032に電気穿孔法でそれぞれ挿入した。製作された菌株は、それぞれコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032::pECCG117−ilvBN、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032::pECCG117−ilvB(W503Q)N、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032::pECCG117−ilvB (T96S)N、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032::pECCG117−ilvB(W503N)N、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032::pECCG117−ilvB(W503L)N、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032::pECCG117−ilvB(T96A)N及びコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032::pECCG117−ilvB(T96C)Nと命名した。ベクターが形質転換された場合、カナマイシン耐性を有するようになるため、カナマイシンが25mg/lの濃度で含まれた培地での生長有無を介して形質転換を確認した。
本出願のアセトヒドロキシ酸シンターゼの大サブユニットの変異体は、他のL−分岐鎖アミノ酸の生産能の増加にも影響を与えるかを確認するために、L−分岐鎖アミノ酸の別の例として、L−ロイシンの生産能を確認した。
肉汁1%、ポリペプトン1%、塩化ナトリウム0.5%、酵母エキス1%、寒天2%、pH7.2
ぶどう糖5%、バクトペプトン1%、塩化ナトリウム0.25%、酵母エキス1%、尿素0.4%、 pH7.2
ぶどう糖1.0%、硫酸アンモニウム0.4%、硫酸マグネシウム0.04%、リン酸第1カリウム0.1%、尿素0.1%、チアミン0.001%、ビオチン200μg/L、寒天2%、pH7.0
前記の方法で得られた変異株は、コリネバクテリウム・グルタミカムKCJ−24(Corynebacterium glutamicum KCJ−24)と命名し、2015年1月22日付でブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センターに寄託し、受託番号KCCM11661Pを与えられた。
前記実施例6で製造した新規変異の導入ベクター2種をそれぞれ2段階相同染色体組換えにより他のL−ロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムKCCM11662P(特許文献7及び8)に形質転換させた。その後、染色体上のilvB変異が導入された菌株を塩基配列分析によって選別し、前記ilvB変異が導入された菌株をそれぞれKCCM11662P::ilvB(W503Q)及びKCCM11662P::ilvB(T96S)と命名した。
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869を親菌株にして、実施例11のKCCM11662Pを収得する方法と同様の方法で培養し、最終的にNL耐性変異株を獲得した。
以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者は、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本出願の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
Claims (14)
- 配列番号1のアミノ酸配列からなるアセトヒドロキシ酸シンターゼの大サブユニット(acetolactate synthase large subunit; IlvBタンパク質)において、96番目の位置のアミノ酸(トレオニン)がセリン(serine)、システイン(cysteine)またはアラニン(alanine)に置換されている、アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体。
- 配列番号1のアミノ酸配列の503番目のアミノ酸(トリプトファン)が、グルタミン(glutamine)にさらに置換された、請求項1に記載のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体。
- 配列番号28〜30のいずれか一つのアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体。
- 配列番号1のアミノ酸配列のアセトヒドロキシ酸シンターゼの大サブユニットにおいて、N端から503番目のアミノ酸(トリプトファン)が、グルタミン(glutamine)、アスパラギン(asparagine)、またはロイシン(leucine)に置換されている、アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体。
- 配列番号31〜33のいずれか一つのアミノ酸配列からなる、請求項4に記載のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体をコードする、ポリヌクレオチド。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項7に記載のベクターが導入された、形質転換体。
- 請求項1に記載のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体、又は前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む、L−分岐鎖アミノ酸を生産する、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)の微生物。
- 請求項4又は5に記載のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体;前記変異体をコードするポリヌクレオチド;及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも1つを含む、L−分岐鎖アミノ酸を生産する、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)の微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)である、請求項9又は10に記載のL−分岐鎖アミノ酸を生産する微生物。
- 前記L−分岐鎖アミノ酸が、L−バリン、またはL−ロイシンである、請求項9又は10に記載のL−分岐鎖アミノ酸を生産する微生物。
- (a)請求項9又は10に記載のL−分岐鎖アミノ酸を生産する微生物を培地で培養する段階;及び
(b)前記(a)段階の微生物または培養した培地からL−分岐鎖アミノ酸を回収する段階を含む、L−分岐鎖アミノ酸の生産方法。 - 前記L−分岐鎖アミノ酸が、L−バリン、またはL−ロイシンである、請求項13に記載のL−分岐鎖アミノ酸の生産方法。
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