JP6789512B2 - How to test the effectiveness of antineoplastic drugs for the treatment of lung cancer - Google Patents

Description

本発明は、抗癌剤の効果の検査法に関し、具体的には癌細胞における、Gli1、PRMT5およびMEP50の発現率を指標にした検査法に関する。 The present invention relates to a test method for the effect of an anticancer drug, and specifically to a test method using the expression rates of Gli1, PRMT5 and MEP50 in cancer cells as an index.

癌は、日本人の死因の中で最も多く、国立がん研究センターがん対策情報センターの統計によると、2013年に癌で死亡した人は364,872例（男性216,975例、女性147,897例）であり、なかでも肺癌による死亡数が多い。 Cancer is the most common cause of death among Japanese people, and according to statistics from the National Cancer Research Center Cancer Control Information Center, 364,872 cases (216,975 men and 147,897 women) died of cancer in 2013. Among them, the number of deaths from lung cancer is high.

肺癌には様々な種類があるが、最も一般的なものは、次の2つである。
非小細胞癌(Non-small cell lung cancer: NSCLC): (肺癌の約75%)
小細胞癌(Small cell lung cancer: SCLC) There are many types of lung cancer, but the two most common are:
Non-small cell lung cancer (NSCLC): (Approximately 75% of lung cancers)
Small cell lung cancer (SCLC)

肺癌に対する治療法には、腫瘍の大きさや種類、進行度、患者の健康状態によって変わるが、一般的に、外科手術(surgery)、放射線療法（radiotherapy: X線療法）、化学療法（chemotherapy: 薬物を使った治療）の3種類の治療法が使用される。 Treatment for lung cancer depends on the size and type of the tumor, its degree of progression, and the patient's health, but is generally surgery, radiation therapy, or chemotherapy. Three types of treatments are used.

肺癌のうち、最も多い非小細胞癌では、病期に応じて手術や放射線治療と組み合わせて、あるいは単独で抗癌剤治療が行われる。 Among lung cancers, non-small cell lung cancer, which is the most common, is treated with anticancer drugs in combination with surgery or radiation therapy, or alone, depending on the stage.

最近では、癌細胞のDNA異常を把握し、これを利用した治療法「分子標的治療」が行われ、肺癌では、EGFR遺伝子変異やALK遺伝子融合が検出された場合には、それらの阻害剤（EGFRチロシンキナーゼ阻害剤、ALKチロシンキナーゼ阻害剤）による治療が行われている（非特許文献１）。 Recently, a treatment method called "molecular-targeted therapy" has been performed by grasping DNA abnormalities in cancer cells and using them. In lung cancer, if EGFR gene mutation or ALK gene fusion is detected, those inhibitors ( Treatment with EGFR tyrosine kinase inhibitor, ALK tyrosine kinase inhibitor) is performed (Non-Patent Document 1).

現在、イレッサ（一般名：ゲフィチニブ）のほか、タルセバ（一般名：エルロチニブ）、ジオトリフ（一般名：アファチニブ）が承認を受けた分子標的治療薬である。 Currently, in addition to Iressa (generic name: gefitinib), Tarceva (generic name: erlotinib) and Geotrif (generic name: afatinib) are approved molecular-targeted therapies.

肺癌の治療は、日本肺癌学会による「肺癌診療ガイドライン」に沿って実施され、そこで分子標的治療薬の使用が示されているが、分子標的治療薬によっても治療効果がない患者もいるため、より個別的に適切な治療が行えることが期待されている。 Treatment of lung cancer is carried out in accordance with the "Lung Cancer Clinical Practice Guidelines" by the Japan Lung Cancer Society, which indicates the use of molecular-targeted therapies, but it is more difficult because some patients have no therapeutic effect even with molecular-targeted therapies. It is expected that appropriate treatment can be performed individually.

Dobbelstein M et al., Nature review drug discovery 13. 179-196 (2014)Dobbelstein M et al., Nature review drug discovery 13. 179-196 (2014)

本発明は、特定の遺伝子の発現率を指標として、抗癌剤の効果を検査する方法の提供を目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for examining the effect of an anticancer drug using the expression rate of a specific gene as an index.

本発明者らは、細胞の癌化と深く関わるhedgehog (Hh) シグナル経路下流で機能する、転写因子Gli1と、様々な癌で発現亢進が報告されているアルギニンメチル基転移酵素（PRMT5）とその活性制御因子（MEP50）の発現と抗癌剤の効果との関連について鋭意検討を行った。その結果、前記のGli1、PRMT5およびMEP50の発現が高まることで、特定の抗癌剤の治療薬としての効果が低減することを見出した。 The present inventors have a transcription factor Gli1 that functions downstream of the hedgehog (Hh) signal pathway, which is closely related to cell carcinogenesis, and arginine methyltransferase (PRMT5), which has been reported to be upregulated in various cancers, and its expression. We diligently investigated the relationship between the expression of the activity regulator (MEP50) and the effect of anticancer drugs. As a result, it was found that the effect of a specific anticancer drug as a therapeutic agent is reduced by increasing the expression of Gli1, PRMT5 and MEP50.

その結果、本発明者らは上記の３種類の遺伝子の発現の程度により抗癌剤の効果を判定し評価する新たな診断方法に関する発明を完成させるに至った。 As a result, the present inventors have completed an invention relating to a new diagnostic method for determining and evaluating the effect of an anticancer drug based on the degree of expression of the above three types of genes.

すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１] チロシンキナーゼ阻害剤に対する癌の感受性を判定し、チロシンキナーゼ阻害剤が癌に対して治療効果を有するかを判定するための補助的データを取得する方法であって、ヒト被験体由来の生物学的試料における、
（１）Gli1発現率を検出する工程、
（２）PRMT5発現率を検出する工程、および
（３）MEP50発現率を検出する工程
によりGli1発現率、PRMT5発現率およびMEP50発現率を求め、Gli1発現率、PRMT5発現率およびMEP50発現率に基づいて、チロシンキナーゼ阻害剤に対する癌の感受性を判定し、チロシンキナーゼ阻害剤が癌に対して治療効果を有するかを判定するための補助的データを取得する方法。
[２] ヒト被験体由来の生物学的試料の（１）Gli1発現率がコントロールレベルに比較して亢進していること、
（２）PRMT5発現率がコントロールレベルに比較して亢進していること、および
（３）MEP50発現率がコントロールレベルに比較して亢進していること、
に基づいて、前記ヒト被験体の癌は、チロシンキナーゼ阻害剤による治療に効果がないと判定する、[１]の方法。
[３] Gli1発現率、PRMT5発現率、およびMEP50発現率を免疫組織化学染色または免疫細胞化学染色を行いHスコア法で判定する、[１]または[２]の方法。
[４] 癌が非小細胞肺癌である、[１]〜[３]のいずれかの方法。
[５] 抗Gli1タンパク質抗体、抗PRMT5タンパク質抗体および抗MEP50抗体を含む、[１]〜[４]のいずれかの方法を行うためのキット。 That is, the present invention is as follows.
[1] A method for determining the susceptibility of a cancer to a tyrosine kinase inhibitor and obtaining auxiliary data for determining whether the tyrosine kinase inhibitor has a therapeutic effect on cancer, which is derived from a human subject. In biological samples,
(1) Step of detecting Gli1 expression rate,
Gli1 expression rate, PRMT5 expression rate and MEP50 expression rate are obtained by (2) step of detecting PRMT5 expression rate and (3) step of detecting MEP50 expression rate, and based on Gli1 expression rate, PRMT5 expression rate and MEP50 expression rate. A method for determining the susceptibility of a cancer to a tyrosine kinase inhibitor and obtaining supplementary data for determining whether the tyrosine kinase inhibitor has a therapeutic effect on the cancer.
[2] Gli1 expression rate of biological samples derived from human subjects is increased compared to the control level.
(2) PRMT5 expression rate is increased compared to the control level, and (3) MEP50 expression rate is increased compared to the control level.
The method of [1], wherein the cancer of the human subject is determined to be ineffective for treatment with a tyrosine kinase inhibitor.
[3] The method of [1] or [2], wherein the Gli1 expression rate, PRMT5 expression rate, and MEP50 expression rate are determined by immunohistochemical staining or immunocytochemical staining by the H-score method.
[4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the cancer is non-small cell lung cancer.
[5] A kit for performing any of the methods [1] to [4], which comprises an anti-Gli1 protein antibody, an anti-PRMT5 protein antibody and an anti-MEP50 antibody.

本発明の方法により、肺癌患者の癌組織または癌細胞におけるGli1遺伝子もしくは遺伝子産物、PRMT5遺伝子もしくは遺伝子産物、ならびにMEP50遺伝子もしくは遺伝子産物の発現率が大きく発現量が陽性であると判定、評価された場合、該癌患者に対して、EGFR（上皮成長因子受容体）チロシンキナーゼ阻害剤、ALKチロシンキナーゼ阻害剤等のチロシンキナーゼ阻害剤が効果がないと判定することができる。
本発明の方法により、癌患者の適切な治療法を決定することができる。 According to the method of the present invention, it was determined and evaluated that the expression rate of the Gli1 gene or gene product, PRMT5 gene or gene product, and MEP50 gene or gene product in the cancer tissue or cancer cell of a lung cancer patient was high and the expression level was positive. In this case, it can be determined that a tyrosine kinase inhibitor such as an EGFR (epidermal growth factor receptor) tyrosine kinase inhibitor or an ALK tyrosine kinase inhibitor is ineffective against the cancer patient.
According to the method of the present invention, an appropriate treatment method for a cancer patient can be determined.

非小細胞癌におけるGli1とPRMT5とMEP50の３つのタンパク質の相互作用を示す図である。It is a figure which shows the interaction of three proteins of Gli1, PRMT5 and MEP50 in non-small cell lung cancer. 研究対象となった肺癌患者の原発腫瘍の標識抗Gli1抗体、標識抗PRMT5抗体、および標識抗MEP50抗体による染色像を示す図である。It is a figure which shows the stained image by the labeled anti-Gli1 antibody, the labeled anti-PRMT5 antibody, and the labeled anti-MEP50 antibody of the primary tumor of the lung cancer patient which became the study subject. 研究対象となった各患者の年齢、性別、症状、EGFR遺伝子変異型、T790M耐性の有無、癌のステージ（yc(r)stage)、M1b、EGFR-TK1、PFS（無増悪生存期間）、MEP50の発現率、PRMT5の発現率、Gli1の発現率およびトータルの発現率（IHC:total）を示す図である。Age, gender, symptoms, EGFR gene variant, T790M resistance, cancer stage (yc (r) stage), M1b, EGFR-TK1, PFS (progression-free survival), MEP50 of each patient studied It is a figure which shows the expression rate of, PRMT5 expression rate, Gli1 expression rate and total expression rate (IHC: total). Gli1、PRMT5およびMEP50の発現率が高い患者（Hi)と低い患者（Lo)の無増悪生存期間（PFS：Progression Free Survival)を示す図である。It is a figure which shows the progression-free survival (PFS: Progression Free Survival) of a patient (Hi) with a high expression rate (Hi) and a patient (Lo) with a low expression rate of Gli1, PRMT5 and MEP50.

以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.

本発明は、抗癌剤に対する腫瘍の感受性を判定し、評価するための方法である。腫瘍の抗癌剤に対する感受性はその抗癌剤の腫瘍に対する効果に関与する。従って、本発明は、抗癌剤による癌治療効果を判定し、評価するための方法でもある。 The present invention is a method for determining and evaluating the susceptibility of a tumor to an anticancer agent. The susceptibility of a tumor to an anticancer drug is related to the effect of the anticancer drug on the tumor. Therefore, the present invention is also a method for determining and evaluating the cancer therapeutic effect of an anticancer agent.

さらに、本発明の方法は、抗癌剤に対する腫瘍の感受性を判定し、評価するための補助的データを取得するための方法であり、さらに抗癌剤による癌治療効果を判定し、評価するための補助的データを取得するための方法でもある。 Furthermore, the method of the present invention is a method for obtaining auxiliary data for determining and evaluating the susceptibility of a tumor to an anticancer agent, and further, auxiliary data for determining and evaluating a cancer therapeutic effect of an anticancer agent. It is also a way to get.

また、ゲフィチニブ等を投与した肺癌患者の一部で、肺線維症、間質性肺炎などの薬剤耐性肺障害がみられる。本発明は、このような薬剤耐性肺障害発症の可能性を評価・判定する方法も包含する。 In addition, drug-resistant lung disorders such as pulmonary fibrosis and interstitial pneumonia are observed in some lung cancer patients who received gefitinib or the like. The present invention also includes a method for evaluating and determining the possibility of developing such drug-resistant lung injury.

本発明の方法においては、転写因子であるGli1、アルギニンメチル基転移酵素（PRMT5）およびアルギニンメチル基転移酵素の活性制御因子であるMEP50の被験体の生体試料における発現率を指標に判定する。ここで、発現率とは発現量や発現の程度とも呼ぶ。生体試料としては、被験体の組織や細胞が挙げられる。生体試料は、癌組織または癌細胞であってもよい。Gli1、PRMT5およびMEP50は、細胞の癌化に関係があるhedgehog (Hh)シグナル経路下流で機能する。図１に非小細胞癌におけるGli1とPRMT5とMEP50の３つのタンパク質の相互作用を示す。図１に示すように、PRMT5とMEP50が転写因子であるGli1に結合し複合体を形成し、Gli1が活性化される。Gli1が活性化されるとGli1は、FoxM1遺伝子、Bmi1遺伝子等の標的遺伝子に作用し、癌細胞を作り出す。MEP50はWDR77とも呼ぶ。 In the method of the present invention, the expression rate of Gli1, which is a transcription factor, arginine methyltransferase (PRMT5), and MEP50, which is an activity regulator of arginine methyltransferase, in a biological sample of a subject is used as an index for determination. Here, the expression rate is also referred to as the expression level or the degree of expression. Examples of biological samples include tissue and cells of a subject. The biological sample may be cancer tissue or cancer cells. Gli1, PRMT5 and MEP50 function downstream of the hedgehog (Hh) signaling pathway involved in cell carcinogenesis. FIG. 1 shows the interaction of three proteins, Gli1, PRMT5, and MEP50, in non-small cell lung cancer. As shown in FIG. 1, PRMT5 and MEP50 bind to the transcription factor Gli1 to form a complex, and Gli1 is activated. When Gli1 is activated, Gli1 acts on target genes such as FoxM1 gene and Bmi1 gene to produce cancer cells. MEP50 is also called WDR77.

本発明において、検査対象とする癌細胞は、好ましくは肺癌の原発腫瘍細胞である。肺癌は非小細胞癌(Non-small cell lung cancer: NSCLC)も小細胞癌(Small cell lung cancer: SCLC)も含む。好ましくは非小細胞癌である。 In the present invention, the cancer cell to be examined is preferably a primary tumor cell of lung cancer. Lung cancer includes both non-small cell lung cancer (NSCLC) and small cell lung cancer (SCLC). It is preferably non-small cell lung cancer.

本発明により効果を判定、評価する抗癌剤は、分子標的治療薬であるチロシンキナーゼ阻害剤である。チロシンキナーゼ阻害剤として、EGFR（上皮成長因子受容体）チロシンキナーゼ阻害剤およびALK（未分化リンパ腫キナーゼ）チロシンキナーゼ阻害剤（ALK阻害剤）が挙げられる。好ましくは、EGFR（上皮成長因子受容体）チロシンキナーゼ阻害剤の効果を判定、評価することができる。 The anticancer agent whose effect is determined and evaluated by the present invention is a tyrosine kinase inhibitor which is a molecular targeted therapeutic agent. Examples of tyrosine kinase inhibitors include EGFR (epidermal growth factor receptor) tyrosine kinase inhibitor and ALK (anaplastic lymphoma kinase) tyrosine kinase inhibitor (ALK inhibitor). Preferably, the effect of the EGFR (epidermal growth factor receptor) tyrosine kinase inhibitor can be determined and evaluated.

非小細胞肺癌や大腸癌をはじめとして様々な癌細胞で上皮成長因子受容体（EGFR）が過剰発現しており、癌細胞の増殖が活発となっている。さらに、過剰発現している細胞はそうでない細胞と比べ、高い転移性を示すことが分かっている。ここで、EGFR（上皮成長因子受容体）チロシンキナーゼ阻害剤上皮成長因子受容体（EGFR）チロシンキナーゼのリン酸化を阻害すると、癌細胞の増殖に必要なシグナル伝達を遮断することができ、癌細胞の増殖を抑制することができる。また、ALK遺伝子に変異があると、EML4等のタンパク質と融合しEML4-ALK融合タンパク質が産生され、この融合タンパク質が癌細胞の増殖や正常細胞の癌化に関与する。この薬は、ALKチロシンキナーゼのリン酸化を阻害すると、癌細胞の増殖に必要なシグナル伝達を遮断することができ、癌細胞の増殖を抑制することができる。 Epidermal growth factor receptor (EGFR) is overexpressed in various cancer cells including non-small cell lung cancer and colon cancer, and the growth of cancer cells is active. In addition, overexpressing cells have been shown to be more metastatic than non-overexpressing cells. Here, by inhibiting the phosphorylation of the EGFR (epidermal growth factor receptor) tyrosine kinase inhibitor epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase, the signal transduction necessary for the growth of cancer cells can be blocked, and the cancer cells can be blocked. Can suppress the growth of. In addition, if there is a mutation in the ALK gene, it fuses with a protein such as EML4 to produce an EML4-ALK fusion protein, and this fusion protein is involved in the growth of cancer cells and the canceration of normal cells. By inhibiting the phosphorylation of ALK tyrosine kinase, this drug can block the signal transduction required for cancer cell growth and suppress cancer cell growth.

EGFR（上皮成長因子受容体）チロシンキナーゼ阻害剤として、ゲフィチニブ（商品名：イレッサ(登録商標））、エルロチニブ（商品名：タルセバ（登録商標））、セツキシマブ（商品名：アービタックス（登録商標））、パニツムマブ（商品名：ベクティビックス（登録商標））等が挙げられる。また、ALKチロシンキナーゼ阻害剤として、グリゾチニブ（商品名：ザーコリ（登録商標））、セリチニブ(商品名：ジカディア（登録商標））、アレクチニブ（標品名：アレセンサ（登録商標））等が挙げられる。 Gefitinib (trade name: Iressa (registered trademark)), erlotinib (trade name: Tarceva (registered trademark)), cetuximab (trade name: Erbitux (registered trademark)), as EGFR (epidermal growth factor receptor) tyrosine kinase inhibitors, Panitumumab (trade name: Vectibix (registered trademark)) and the like can be mentioned. Examples of ALK tyrosine kinase inhibitors include crizotinib (trade name: Zakori (registered trademark)), ceritinib (trade name: Zicadia (registered trademark)), and alectinib (brand name: Alecensa (registered trademark)).

本発明の方法においては、生体試料におけるGli1遺伝子、PRMT5遺伝子およびMEP50遺伝子の発現率を測定する。生体試料におけるGli1遺伝子、PRMT5遺伝子およびMEP50遺伝子の発現率はGli1遺伝子、PRMT5遺伝子およびMEP50遺伝子がコードするmRNAの発現量、すなわち転写量を指標としてもよいし、Gli1タンパク質、PRMT5タンパク質およびMEP50タンパク質の発現量を指標としてもよい。 In the method of the present invention, the expression rates of the Gli1 gene, PRMT5 gene and MEP50 gene in a biological sample are measured. The expression rate of the Gli1 gene, PRMT5 gene and MEP50 gene in the biological sample may be based on the expression level of the mRNA encoded by the Gli1 gene, PRMT5 gene and MEP50 gene, that is, the transcription level, or of Gli1 protein, PRMT5 protein and MEP50 protein. The expression level may be used as an index.

Gli1遺伝子、PRMT5遺伝子およびMEP50遺伝子がコードするmRNAの発現率を測定する場合、癌組織または癌細胞を生体試料として癌患者であるヒト被験体から採取し、該試料中に含まれるGli1遺伝子、PRMT5遺伝子およびMEP50遺伝子がコードするmRNAを測定すればよい。mRNAの測定のためには、例えば、バイオプシーにより癌組織の一部を採取し材料として用いて測定すればよい。癌組織の採取は、例えば外来診察中に、内視鏡手術等により、癌組織を採取すればよい。mRNAの測定は採取した癌組織または癌細胞からmRNAを抽出して行うことができる。また、組織切片標本を作製するか、あるいは採取した癌細胞をスライドガラス上に固定し、in situ ハイブリダイゼーション法により染色して行うこともできる。さらに、mRNAを抽出し、ノーザンブロット法やRT-PCR等の公知のRNA測定法により測定してもよい。mRNAの抽出および測定は公知の方法で行うことができる。この際、Gli1遺伝子、PRMT5遺伝子およびMEP50遺伝子がコードするmRNAを特異的に測定するためには、Gli1遺伝子、PRMT5遺伝子およびMEP50遺伝子がコードするmRNAの部分配列に相補的な部分配列からなるプローブまたはプライマーを用いる。Gli1遺伝子、PRMT5遺伝子およびMEP50遺伝子の塩基配列は公知であり、公知の塩基配列情報に基づいて、プローブまたはプライマーを設計すればよい。該プライマーまたはプローブは、上記のGli1遺伝子、PRMT5遺伝子およびMEP50遺伝子の断片であり、塩基の数は５〜50、好ましくは10〜30、さらに好ましくは15〜25である。 When measuring the expression rate of mRNA encoded by the Gli1 gene, PRMT5 gene and MEP50 gene, cancer tissue or cancer cells are collected from a human subject who is a cancer patient as a biological sample, and the Gli1 gene and PRMT5 contained in the sample are collected. The mRNA encoded by the gene and the MEP50 gene may be measured. For the measurement of mRNA, for example, a part of the cancer tissue may be collected by biopsy and used as a material for measurement. The cancer tissue may be collected, for example, during an outpatient examination by endoscopic surgery or the like. The mRNA can be measured by extracting mRNA from the collected cancer tissue or cancer cells. Alternatively, a tissue section sample can be prepared, or the collected cancer cells can be fixed on a slide glass and stained by an in situ hybridization method. Further, mRNA may be extracted and measured by a known RNA measuring method such as Northern blotting or RT-PCR. Extraction and measurement of mRNA can be performed by a known method. At this time, in order to specifically measure the mRNA encoded by the Gli1 gene, PRMT5 gene and MEP50 gene, a probe consisting of a partial sequence complementary to the partial sequence of the mRNA encoded by the Gli1 gene, PRMT5 gene and MEP50 gene or Use a primer. The nucleotide sequences of the Gli1 gene, PRMT5 gene, and MEP50 gene are known, and a probe or primer may be designed based on the known nucleotide sequence information. The primer or probe is a fragment of the Gli1 gene, PRMT5 gene and MEP50 gene described above, and the number of bases is 5 to 50, preferably 10 to 30, and more preferably 15 to 25.

Gli1遺伝子、PRMT5遺伝子およびMEP50遺伝子の発現率は、例えば、測定したmRNAの定量値で表すことができる。 The expression rates of the Gli1 gene, PRMT5 gene and MEP50 gene can be expressed, for example, by the quantitative value of the measured mRNA.

Gli1タンパク質、PRMT5タンパク質およびMEP50タンパク質の発現率を測定する場合、癌組織または癌細胞を生体試料として採取し、該試料中に含まれるGli1タンパク質、PRMT5タンパク質およびMEP50タンパク質を測定すればよい。Gli1タンパク質、PRMT5タンパク質およびMEP50タンパク質の測定は、癌組織または癌細胞からタンパク質を抽出し、該抽出物中のGli1タンパク質、PRMT5タンパク質およびMEP50タンパク質を測定してもよいし、免疫組織化学または免疫細胞化学の手法により行ってもよい。 When measuring the expression rates of Gli1 protein, PRMT5 protein and MEP50 protein, cancer tissue or cancer cells may be collected as a biological sample, and the Gli1 protein, PRMT5 protein and MEP50 protein contained in the sample may be measured. Measurement of Gli1 protein, PRMT5 protein and MEP50 protein may be performed by extracting a protein from cancer tissue or cancer cells and measuring Gli1 protein, PRMT5 protein and MEP50 protein in the extract, immunohistochemistry or immunocells. It may be carried out by a chemical method.

抽出したタンパク質の測定は、ELISA、ラジオイムノアッセイ等の公知の免疫測定法（イムノアッセイ）を用いればよい。この際、Gli1タンパク質、PRMT5タンパク質およびMEP50タンパク質に対する抗体を用いて行うことができる。Gli1タンパク質、PRMT5タンパク質およびMEP50タンパク質に対する抗体は公知の手法によりモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体として作製してもよく、市販の抗体を用いてもよい。抗体は必要に応じて、酵素、蛍光物質、放射性同位元素により標識して用いればよい。抗体の標識は公知の方法により行うことができる。 For the measurement of the extracted protein, a known immunoassay method (immunoassay) such as ELISA or radioimmunoassay may be used. At this time, antibodies against Gli1 protein, PRMT5 protein and MEP50 protein can be used. Antibodies to Gli1 protein, PRMT5 protein and MEP50 protein may be prepared as monoclonal antibodies or polyclonal antibodies by known methods, or commercially available antibodies may be used. If necessary, the antibody may be labeled with an enzyme, a fluorescent substance, or a radioisotope. Labeling of the antibody can be performed by a known method.

免疫組織化学または免疫細胞化学の手法による測定は、採取した癌組織の切片標本を作製するか、あるいは、採取した癌細胞をスライドガラス上に固定して行えばよい。免疫組織化学の手法による測定のためには、例えば、癌組織をパラフィン中に包埋し、ミクロトーム等の薄切装置で３〜５μm程度の厚さの切片標本を作製し、測定時にキシレンやエタノール処理等によりパラフィンを除去し、生理食塩水または緩衝液に浸して親水化すればよい。染色は、酵素、蛍光物質、放射性同位元素等で標識したGli1タンパク質、PRMT5タンパク質およびMEP50タンパク質に対するそれぞれの抗体を用いて行えばよい。また、Gli1タンパク質、PRMT5タンパク質およびMEP50タンパク質に対するそれぞれの抗体を切片標本中のGli1タンパク質、PRMT5タンパク質およびMEP50タンパク質に結合させ、その後、該抗体に結合する２次抗体であって酵素、蛍光物質等で標識した２次抗体を用いてもよい。標識に用いる酵素として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等が挙げられる。また、蛍光物質として、フルオレセイン、ローダミン等が挙げられる。さらに、公知のビオチン-アビジン系を利用して染色してもよい。免疫細胞化学は採取した細胞をホルマリン等を用いてスライドガラス上に固定し、免疫組織化学の手法と同様の方法で細胞中のGli1タンパク質、PRMT5タンパク質およびMEP50タンパク質を染色し可視化すればよい。免疫組織化学または免疫細胞化学において、染色は顕微鏡や肉眼で判断することもできるし、適当な光学的測定装置を用いてもよい。免疫組織化学による染色は、公知の方法で行うことができる。 Measurement by immunohistochemistry or immunohistochemistry may be performed by preparing a section sample of the collected cancer tissue or fixing the collected cancer cells on a slide glass. For measurement by immunohistochemistry, for example, cancer tissue is embedded in paraffin, a slice sample with a thickness of about 3 to 5 μm is prepared with a slicer such as a microtome, and xylene or ethanol is used for measurement. Paraffin may be removed by treatment or the like and immersed in physiological saline or a buffer solution to make it hydrophilic. Staining may be performed using antibodies against Gli1 protein, PRMT5 protein and MEP50 protein labeled with an enzyme, a fluorescent substance, a radioactive isotope or the like. In addition, each antibody against Gli1 protein, PRMT5 protein and MEP50 protein is bound to Gli1 protein, PRMT5 protein and MEP50 protein in a section sample, and then a secondary antibody that binds to the antibody, such as an enzyme or a fluorescent substance, is used. A labeled secondary antibody may be used. Examples of the enzyme used for labeling include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase and the like. Moreover, as a fluorescent substance, fluorescein, rhodamine and the like can be mentioned. Further, a known biotin-avidin system may be used for staining. In immunohistochemistry, the collected cells may be fixed on a slide glass using formalin or the like, and the Gli1 protein, PRMT5 protein and MEP50 protein in the cells may be stained and visualized by the same method as in immunohistochemistry. In immunohistochemistry or immunocytochemistry, staining can be determined microscopically or with the naked eye, or a suitable optical measuring device may be used. Staining by immunohistochemistry can be performed by a known method.

免疫組織化学または免疫細胞化学の手法による測定する場合、染色の程度をソフトウェアで数値化し、上記のようにカットオフ値を定め、陽性か陰性かModerateかを判断することができる。また、発現が亢進しているか否かをHスコア法によって判定してもよい。Hスコア法はSARA BACUS et al., Am J Clin Pathol., 90. 233-239に記載されている方法であり、染色の強度を目視で判断し、以下のように、染色強度を0、1、2または3で判定する。
染色強度0：染色なし、1：弱い染色、2：中程度の染色、3：強い染色 When measuring by immunohistochemistry or immunohistochemistry, the degree of staining can be quantified by software, the cutoff value can be determined as described above, and positive, negative, or moderate can be determined. In addition, whether or not the expression is enhanced may be determined by the H-score method. The H-score method is a method described in SARA BACUS et al., Am J Clin Pathol., 90. 233-239. The staining intensity is visually judged, and the staining intensity is set to 0, 1 as shown below. , 2 or 3 to judge.
Staining intensity 0: No staining, 1: Weak staining, 2: Medium staining, 3: Strong staining

なお、「Moderate」は「境界域」と呼ぶこともでき、例えば、免疫組織化学または免疫細胞化学の手法により染色したときに、弱〜中程度の完全な側方あるいは側方・基底膜側の細胞膜の陽性染色がある癌細胞が一切片に10％以上認められる場合をいう。 In addition, "Moderate" can also be called "boundary region", for example, when stained by immunohistochemistry or immunohistochemistry, weak to moderate complete lateral or lateral / basement membrane side. This refers to the case where 10% or more of cancer cells with positive staining of the cell membrane are found in one section.

染色強度に基づいて、Hスコア＝Σ（染色強度×陽性細胞占有率（％））の式によりHスコアを求める。染色強度は目視により判定してもよいし、染色の強さを判定ソフトウェアを用いて数値化してもよい。 Based on the staining intensity, the H score is calculated by the formula of H score = Σ (staining intensity x positive cell occupancy rate (%)). The dyeing intensity may be visually determined, or the dyeing intensity may be quantified using determination software.

Hスコア法を採用する場合、事前にパラフィン包埋切片の一部についてヘマトキシン・エオジン（HE)染色を行い、検査する組織における癌細胞の有無を判断し、癌細胞の部分をHスコアの判定に用いる。Hスコア法を採用する場合、Hスコアが3以上を「強い発現 (Positive)」、Hスコアが2以上3未満を「Moderate」、0以上2未満を「Negative」として判定すればよい。Hスコアの他、Allred法（Allred DC et al. Mod Pathol 1998;11:155-68）等によりスコアリングしてもよい。 When the H-score method is adopted, a part of the paraffin-embedded section is stained with hematoxin / eosin (HE) in advance, the presence or absence of cancer cells in the tissue to be examined is determined, and the part of the cancer cells is used to determine the H score. Use. When the H-score method is adopted, an H-score of 3 or more is judged as "Positive", an H-score of 2 or more and less than 3 is judged as "Moderate", and a H-score of 0 or more and less than 2 is judged as "Negative". In addition to the H score, scoring may be performed by the Allred method (Allred DC et al. Mod Pathol 1998; 11: 155-68) or the like.

あらかじめ、肺癌等の癌患者の肺癌組織等の癌組織または肺癌細胞と魚癌細胞におけるGli1遺伝子もしくは遺伝子産物、PRMT5遺伝子もしくは遺伝子産物、ならびにMEP50遺伝子もしくは遺伝子産物の発現率と正常被験体（コントロール）の肺組織等の組織におけるM Gli1遺伝子もしくは遺伝子産物、PRMT5遺伝子もしくは遺伝子産物、ならびにEP50遺伝子もしくは遺伝子産物の発現率を、mRNAレベルまたはタンパク質レベルで測定しておき、癌患者と正常被験体の発現率を区別するためのカットオフ値を定めておき、該カットオフ値以上になった場合に、Gli1遺伝子もしくは遺伝子産物、PRMT5遺伝子もしくは遺伝子産物、ならびにMEP50遺伝子もしくは遺伝子産物の発現率がコントロールレベルに比較して亢進していると判定する。 Expression rate and normal subject (control) of Gli1 gene or gene product, PRMT5 gene or gene product, and MEP50 gene or gene product in cancer tissue such as lung cancer tissue of cancer patient such as lung cancer or lung cancer cell and fish cancer cell in advance. The expression rate of the MGli1 gene or gene product, PRMT5 gene or gene product, and EP50 gene or gene product in tissues such as lung tissue was measured at the mRNA level or protein level, and the expression in cancer patients and normal subjects was measured. A cut-off value for distinguishing the rate is set, and when the cut-off value is exceeded, the expression rate of the Gli1 gene or gene product, PRMT5 gene or gene product, and MEP50 gene or gene product reaches the control level. It is judged that it is enhanced in comparison.

Gli1遺伝子、PRMT5遺伝子およびMEP50遺伝子の３つの遺伝子またはそれらの遺伝子産物の発現は連動して起こる。従って、３種類の遺伝子のうちの１種類の遺伝子または遺伝子産物の発現が亢進している場合、他の２種類も亢進している場合が多く、３種類の遺伝子のうちの２種類の遺伝子または遺伝子産物の発現が亢進している場合、他の１種類の遺伝子または遺伝子産物の発現も亢進している場合が多い。Gli1遺伝子、PRMT5遺伝子およびMEP50遺伝子の３種類の遺伝子またはそれらの遺伝子産物のうち、少なくとも１種類、２種類の発現が亢進している場合、残りの１種類または２種類の発現がコントロールレベルと比較して顕著に高くなく同程度の場合でも、トータルでGli1遺伝子、PRMT5遺伝子およびMEP50遺伝子またはそれらの遺伝子産物の発現が亢進しているという。本発明においては、Gli1遺伝子もしくは遺伝子産物、PRMT5遺伝子もしくは遺伝子産物、ならびにMRP50遺伝子もしくは遺伝子産物の発現の程度を、Gli1遺伝子もしくは遺伝子産物、PRMT5遺伝子もしくは遺伝子産物、ならびにMRP50遺伝子もしくは遺伝子産物の発現率と呼び、これらの遺伝子または遺伝子産物の発現が亢進していることをGli1、PRMT5およびMRP50の発現率が亢進しているという。 The expression of three genes, the Gli1 gene, the PRMT5 gene and the MEP50 gene, or their gene products occurs in tandem. Therefore, when the expression of one of the three types of genes or the gene product is enhanced, the other two types are often also enhanced, and two of the three types of genes or two types of genes or When the expression of a gene product is upregulated, the expression of one other gene or gene product is often upregulated. If at least one or two of the three genes, Gli1 gene, PRMT5 gene and MEP50 gene, or their gene products, are upregulated, the expression of the remaining one or two is compared to the control level. It is said that the expression of Gli1 gene, PRMT5 gene and MEP50 gene or their gene products is increased in total even if they are not significantly high and are similar. In the present invention, the degree of expression of the Gli1 gene or gene product, PRMT5 gene or gene product, and MRP50 gene or gene product is determined by the expression rate of Gli1 gene or gene product, PRMT5 gene or gene product, and MRP50 gene or gene product. It is said that the expression rate of Gli1, PRMT5 and MRP50 is increased when the expression of these genes or gene products is increased.

上記のように、免疫組織化学または免疫細胞化学の手法によりGli1遺伝子もしくは遺伝子産物、PRMT5遺伝子もしくは遺伝子産物、ならびにMEP50遺伝子もしくは遺伝子産物の発現率を測定し、発現が亢進しているか否かをHスコア法によって判定する場合、以下のように判定してもよい。 As described above, the expression rates of the Gli1 gene or gene product, PRMT5 gene or gene product, and MEP50 gene or gene product are measured by immunohistochemistry or immunocytochemistry, and whether or not the expression is enhanced is determined. When judging by the scoring method, the judgment may be made as follows.

Gli1遺伝子もしくは遺伝子産物、PRMT5遺伝子もしくは遺伝子産物、ならびにMEP50遺伝子もしくは遺伝子産物のそれぞれの発現率について、Hスコアが3以上を「強い発現率 (Positive)」、Hスコアが2以上3未満を「Moderate」、0以上2未満を「Negative」として判定する。 For the expression rates of the Gli1 gene or gene product, PRMT5 gene or gene product, and MEP50 gene or gene product, an H score of 3 or more is "Positive" and an H score of 2 or more and less than 3 is "Moderate". , 0 or more and less than 2 is judged as "Negative".

Gli1遺伝子もしくは遺伝子産物、PRMT5遺伝子もしくは遺伝子産物、ならびにMEP50遺伝子もしくは遺伝子産物のうちの１種類の発現率が「強い発現率 (Positive)」の場合、他の２種類の発現率も「強い発現率 (Positive)」か、あるいはModerateであると判定される。３種類の発現率のすべてが「強い発現率 (Positive)」と判定されるか、２種類の発現率が「強い発現率 (Positive)」と判定され１種類の発現率がModerateと判定されるか、あるいは１種類の発現率が「強い発現率 (Positive)」と判定され２種類の発現率がModerateと判定された場合、３種類の発現率はトータルで「強い発現率 (Positive)」と判定することができる。すなわち、３種類の発現率を測定したときに３種類のうち「Negative（陰性）」と判定されるものがなく、かつ、少なくとも１種類が「強い発現率 (Positive)」と判定される場合に、３種類の発現率はトータルで「強い発現率 (Positive)」と判定することができる。一方、Gli1遺伝子もしくは遺伝子産物、PRMT5遺伝子もしくは遺伝子産物、ならびにMEP50遺伝子もしくは遺伝子産物のいずれの発現率も「強い発現率 (Positive)」と判定されない場合、３種類の発現率はトータルで「Negative（陰性）」と判定することができる。Gli1遺伝子もしくは遺伝子産物、PRMT5遺伝子もしくは遺伝子産物、ならびにMEP50遺伝子もしくは遺伝子産物の発現率がトータルで「強い発現率 (Positive)」と判定される場合、トータルでGli1遺伝子もしくは遺伝子産物、PRMT5遺伝子もしくは遺伝子産物、ならびにMEP50遺伝子もしくは遺伝子産物の発現が亢進しているとする。 When the expression rate of one of the Gli1 gene or gene product, PRMT5 gene or gene product, and MEP50 gene or gene product is "Positive", the expression rates of the other two types are also "strong expression rate". (Positive) ”or determined to be Moderate. All three types of expression rates are judged to be "strong expression rate (Positive)", or two types of expression rates are judged to be "strong expression rate (Positive)" and one type of expression rate is judged to be Moderate. Or, if one type of expression rate is determined to be "strong expression rate (Positive)" and two types of expression rate are determined to be Moderate, the three types of expression rate are collectively referred to as "strong expression rate (Positive)". Can be determined. That is, when none of the three types is determined to be "Negative" when the three types of expression rates are measured, and at least one type is determined to be "strong expression rate (Positive)". The three types of expression rates can be judged as "Positive" in total. On the other hand, if the expression rates of the Gli1 gene or gene product, PRMT5 gene or gene product, and MEP50 gene or gene product are not judged to be "Positive", the three types of expression rates are "Negative" in total. Negative) ”can be determined. If the expression rate of the Gli1 gene or gene product, PRMT5 gene or gene product, and MEP50 gene or gene product is judged to be "Positive" in total, the total expression rate of Gli1 gene or gene product, PRMT5 gene or gene It is assumed that the expression of the product and the MEP50 gene or gene product is enhanced.

上記のように、癌患者から採取した癌組織または癌細胞におけるGli1遺伝子もしくは遺伝子産物、PRMT5遺伝子もしくは遺伝子産物、ならびにMEP50遺伝子もしくは遺伝子産物の発現率を、Gli1発現率、PRMT5発現率およびMEP50発現率を検出する工程で測定し求め、Gli1遺伝子もしくは遺伝子産物、PRMT5遺伝子もしくは遺伝子産物、ならびにMEP50遺伝子もしくは遺伝子産物の発現が亢進していると判定される場合、すなわちGli1発現率、PRMT5発現率およびMEP50発現率がコントロールレベルに比較して亢進している場合、その癌患者に対して、チロシンキナーゼ阻害剤である抗癌剤が効果がないと判定、評価することができる。一方、癌患者から採取した癌組織または癌細胞におけるGli1遺伝子もしくは遺伝子産物、PRMT5遺伝子もしくは遺伝子産物、ならびにMEP50遺伝子もしくは遺伝子産物の発現率を測定し、Gli1遺伝子もしくは遺伝子産物、PRMT5遺伝子もしくは遺伝子産物、ならびにMEP50遺伝子もしくは遺伝子産物の発現が亢進していない場合にチロシンキナーゼ阻害剤である抗癌剤が効果があると判定、評価することができる。 As described above, the expression rates of the Gli1 gene or gene product, PRMT5 gene or gene product, and MEP50 gene or gene product in cancer tissue or cancer cells collected from cancer patients are referred to as Gli1 expression rate, PRMT5 expression rate, and MEP50 expression rate. When it is determined that the expression of Gli1 gene or gene product, PRMT5 gene or gene product, and MEP50 gene or gene product is enhanced, that is, Gli1 expression rate, PRMT5 expression rate and MEP50 When the expression rate is increased as compared with the control level, it can be determined and evaluated that the anticancer agent, which is a tyrosine kinase inhibitor, is ineffective for the cancer patient. On the other hand, the expression rates of the Gli1 gene or gene product, PRMT5 gene or gene product, and MEP50 gene or gene product in cancer tissues or cells collected from cancer patients are measured, and the Gli1 gene or gene product, PRMT5 gene or gene product, In addition, it can be determined and evaluated that an anticancer agent, which is a tyrosine kinase inhibitor, is effective when the expression of the MEP50 gene or gene product is not enhanced.

該被験体の癌の治療に抗癌剤としてチロシンキナーゼ阻害剤が効果があると評価、判定することができた場合、該被験体に、チロシンキナーゼ阻害剤を投与すればよい。 When it can be evaluated and determined that a tyrosine kinase inhibitor is effective as an anticancer agent for the treatment of cancer of the subject, the tyrosine kinase inhibitor may be administered to the subject.

投与量は、年齢、体重、症状等により異なるが、数日、数週間あるいは数ヶ月おきに１回あたり、0.001mg〜100mgを静脈注射、腹腔内注射、皮下注射、筋肉注射等によって投与すればよい。投与する阻害剤は、薬理学的に許容され得る担体、希釈剤若しくは賦形剤を含んでいてもよい。また、阻害剤の形態は限定されず、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、あるいは注射剤、点滴剤、座薬、スプレー剤などによる非経口投与等が挙げられる。 The dose varies depending on age, weight, symptoms, etc., but if 0.001 mg to 100 mg is administered by intravenous injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, etc. once every few days, weeks or months. Good. The inhibitor to be administered may include a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. The form of the inhibitor is not limited, and examples thereof include oral administration with tablets, capsules, granules, powders, syrups and the like, or parenteral administration with injections, infusions, suppositories, sprays and the like.

一方、被験体から採取した癌組織または癌細胞においてGli1遺伝子もしくは遺伝子産物、PRMT5遺伝子もしくは遺伝子産物、ならびにMEP50遺伝子もしくは遺伝子産物の発現率が上昇しておらず、該被験体の癌の治療に抗癌剤としてチロシンキナーゼ阻害剤が有効でない可能性が高いと評価、判定された場合、手術療法による癌の切除、上記の抗癌剤以外のプラチナ製剤等の抗癌剤による化学療法、あるいは放射線療法等により治療することになる。プラチナ製剤として、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラテン等が挙げられる。 On the other hand, the expression rates of Gli1 gene or gene product, PRMT5 gene or gene product, and MEP50 gene or gene product are not increased in cancer tissues or cancer cells collected from a subject, and an anticancer agent is used for treating cancer of the subject. If it is evaluated and judged that there is a high possibility that the tyrosine kinase inhibitor is not effective, the cancer will be resected by surgical treatment, chemotherapy with anticancer agents such as platinum preparations other than the above anticancer agents, or radiation therapy. Become. Examples of the platinum preparation include cisplatin, carboplatin, oxaliplatin and the like.

本発明は、Gli1、MEP50およびPRMT5の発現率に基づいて、抗癌剤であるチロシンキナーゼ阻害剤が被験体の癌の治療に効果があるか否かを判定するためのキットも包含する。該キットは、例えば、抗Gli1タンパク質抗体、抗PRMT5タンパク質抗体および抗MEP50抗体を含むHスコア法で発現率を判定するためのキットである。該キットは、Gli1遺伝子、MEP50遺伝子およびPRMT5遺伝子にハイブリダイズするGli1遺伝子、PRMT5遺伝子およびMEP50遺伝子をコードするmRNAの部分配列に相補的な部分配列からなるプローブまたはプライマーを含んでいてもよい。 The present invention also includes a kit for determining whether an anticancer agent, a tyrosine kinase inhibitor, is effective in treating a subject's cancer based on the expression rates of Gli1, MEP50, and PRMT5. The kit is a kit for determining the expression rate by the H-score method containing, for example, an anti-Gli1 protein antibody, an anti-PRMT5 protein antibody, and an anti-MEP50 antibody. The kit may include a probe or primer consisting of a partial sequence complementary to the partial sequence of the mRNA encoding the Gli1 gene, the Gli1 gene that hybridizes to the Gli1 gene, the MEP50 gene and the PRMT5 gene, the PRMT5 gene and the MEP50 gene.

本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 The present invention will be specifically described with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.

日本医科大学付属病院倫理委員会の承認を受けた「包括的肺癌研究」に該当する患者のうち、日本医科大学付属病院（東京都文京区）で治療を受けた術後再発（ステージＩＶ期相当）肺癌患者を対象とし、腫瘍組織切片と、当該患者の臨床データを用いて研究を行った。 Among the patients who fall under the "Comprehensive Lung Cancer Research" approved by the Nippon Medical School Hospital Ethics Committee, postoperative recurrence (equivalent to stage IV) treated at the Nippon Medical School Hospital (Bunkyo-ku, Tokyo) ) A study was conducted on lung cancer patients using tumor tissue sections and clinical data of the patients.

EGFRチロシンキナーゼ阻害薬で治療中の肺がん患者について、１．EGFR遺伝子変異の検出、およびT790M耐性の有無の検出、２．腫瘍細胞中のGli1、PRMT5、MEP50の発現率並びに３．無増悪生存期間（PFS：がんが進行することなく生存している期間）を以下の方法で確認した。 For lung cancer patients being treated with EGFR tyrosine kinase inhibitors 1. 2. Detection of EGFR gene mutation and presence or absence of T790M resistance. Expression rate of Gli1, PRMT5, MEP50 in tumor cells and 3. Progression-free survival (PFS: the period of survival without cancer progression) was confirmed by the following method.

１．EGFR遺伝子変異検出
株式会社 LSIメディエンス（旧: 三菱化学メディエンス）が提供する、EGFR遺伝子変異解析受託サービスを利用した。本解析は新鮮組織、凍結病理標本、パラフィン包埋切片病理標本、胸水のいずれかのサンプルを用い、ゲフィチニブ（イレッサ(登録商標））に対する感受性ならびに耐性変異に関与するexon18、19、20、21の遺伝子変異を解析する。本検査には正常型遺伝子の増幅を抑制するプライマー（PNAプライマー）と変異型遺伝子特異的プローブ（LNAプローブ）を使用したPNA‐LNA PCR Clamp法により遺伝子変異を高感度（約1%）に検出可能である（受託解析説明書類より引用）。 1. 1. EGFR gene mutation detection We used the EGFR gene mutation analysis contract service provided by LSI Medience Corporation (formerly Mitsubishi Chemical Medience). This analysis uses fresh tissue, frozen pathological specimens, paraffin-embedded section pathological specimens, or breast water samples of exon 18, 19, 20, and 21 involved in gefitinib (Iressa®) susceptibility and resistance mutations. Analyze gene mutations. In this test, gene mutations are detected with high sensitivity (about 1%) by the PNA-LNA PCR Clamp method using a primer that suppresses the amplification of normal genes (PNA primer) and a mutant gene-specific probe (LNA probe). It is possible (quoted from the contract analysis explanatory document).

T790M耐性は、EGFR遺伝子のエキソン20の790番目にあるトレオニンがメチオニンになる変異であり、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬に対する獲得耐性症例の約50％にT790Mが検出されることが知られている。 T790M resistance is a mutation in which threonine at position 790 of exon 20 of the EGFR gene becomes methionine, and it is known that T790M is detected in about 50% of cases of acquired resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors.

２．腫瘍細胞中のGli1、PRMT5、MEP50の発現率の検出
（１）パラフィン包埋組織切片作製方法
手術によって切除された肺癌患者の原発腫瘍を包埋カセットに入れ、包埋装置を使ってパラフィン包埋病理組織サンプルを作製した。包枚装置は腫瘍組織中の水分を溶解パラフィンと置換するための装置であった。手順としては腫瘍組織をエタノールに浸して、組織中の水分をエタノールと置換した。その後、組織をキシレンに漬け、エタノールをキシレンに置換した。最後に溶解パラフィンに漬け、キシレンを溶解パラフィンと置換した。この工程を全自動で行ってパラフィン包埋病理組織サンプルを作製した。 2. 2. Detection of expression rates of Gli1, PRMT5, and MEP50 in tumor cells (1) Paraffin-embedded tissue section preparation method The primary tumor of a lung cancer patient resected by surgery is placed in an embedding cassette and paraffin-embedded using an embedding device. A histopathological sample was prepared. The encapsulation device was a device for replacing water in tumor tissue with dissolved paraffin. The procedure was to immerse the tumor tissue in ethanol to replace the water in the tissue with ethanol. The tissue was then immersed in xylene and ethanol was replaced with xylene. Finally, it was immersed in dissolved paraffin to replace xylene with dissolved paraffin. This step was performed fully automatically to prepare a paraffin-embedded pathological tissue sample.

パラフィン包埋組織をミクロトームにて3〜5μmに薄切してカバーガラスにのせ、熱を加えて切片とカバーガラスを接着させた。 The paraffin-embedded structure was sliced into 3 to 5 μm with a microtome, placed on a cover glass, and heat was applied to bond the section and the cover glass.

（２）免疫組織染色法
(2-1) 脱パラフィン処理
すべての操作は室温で行った。
(a) サンプルをキシレンで3分ごとに交換しながら5回インキュベーションした。
(b) 100％エタノールで2分間ごとに交換しながら3回インキュベーションした。
(c) 約80％エタノールで2分間インキュベーションした。
(d) 70％エタノールで2分間インキュベーションした。
(e) 水道水で5分間洗浄した。
(f) 超純水でスライドをリンスした。 (2) Immunohistochemical staining method
(2-1) Deparaffinization All operations were performed at room temperature.
(a) The sample was incubated with xylene 5 times, changing every 3 minutes.
(b) Incubated 3 times with 100% ethanol, changing every 2 minutes.
(c) Incubated for 2 minutes in about 80% ethanol.
(d) Incubated in 70% ethanol for 2 minutes.
(e) Washed with tap water for 5 minutes.
(f) The slides were rinsed with ultrapure water.

(2-2) 抗原賦活化処理から目的タンパク質の検出
(a) 0.3%過酸化水素水入りのメタノールでサンプルを室温で30分間インキュベーションした。
(b) イムノセイバー (日新EM株式会社製)入り10 mMクエン酸ナトリウムバッファー (pH6.0)にサンプルを浸し、95℃で45分間インキュベーションした。
サンプルを室温で30分ほど冷却した。
(c) リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でサンプルを室温で5分間、3回洗浄した。
(d) スライドおよびスライド周辺の水気をキムワイプでできるだけ拭き取り湿潤チャンバーに静置して、免疫組織用ブロッキング剤(Blocking One Histo: ナカライテスク製)を組織切片上に注ぎ、室温で10分間インキュベーションした。
(e) サンプルをPBSで5分ごとに交換しながら、3回洗浄した。
(f) スライドおよびスライド周辺の水気をキムワイプでできるだけ拭き取り、0.1% ウシ胎児血清アルブミン(BSA)入りのPBSで希釈した一次抗体を組織切片上に注ぎ、湿潤チャンバーに静置して、4℃で一晩インキュベーションした。
(g) 使用した抗体は次の通り。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗PRMT5抗体: ATLAS ANTIBODIES社製の抗体（カタログ番号: HPA005525）を150倍希釈して使用。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗MEP50抗体: Brthyl Laboratories社製の抗体（カタログ番号: A301-561A）を1000倍希釈して使用。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗Gli1抗体: AbCam社製の抗体（カタログ番号: ab134906）を100倍希釈して使用した。
(h) サンプルをPBSで5分ごとに交換しながら、3回洗浄した。
(i) スライドガラスおよびその周辺の水気をキムワイプでできるだけ拭き取り、ヒストファイン（二次抗体: ニチレイバイオサイエンス製）をスライド上の切片に滴下し、湿潤チャンバーに静置して室温で30分間インキュベーションする。サンプルをPBSで5分ごとに交換しながら、3回洗浄した。
(j) DAB溶液（DAB Peroxidase Substrate Kit, ImmPACT: Vector Laboratories社製）を調製（A液1 mlに対し、B液1滴）し、スライドおよびスライド周辺の水気をキムワイプでできるだけ拭き取り、DAB溶液をスライド上の切片に注ぎ、すぐに光学顕微鏡にセットして染色具合を確認する。PRMT5はDAB溶液を注ぎ、2分30秒で染色を終了させた。MEP50は30秒で染色を終了させた。Gli1は7分で染色を終了させた。
(k) 染色が終わったら水道水の入ったバットにスライドガラスを即座に浸した。
(l) 細胞の核を染色するため、ヘマトキシリン溶液に5回程度サンプルを浸けた。1回ごとの時間は3秒であった。
(m) 水道水の入ったバットにスライドガラスを浸して洗浄した。 (2-2) Detection of target protein from antigen activation treatment
(a) The sample was incubated with methanol containing 0.3% hydrogen peroxide solution at room temperature for 30 minutes.
(b) The sample was immersed in 10 mM sodium citrate buffer (pH 6.0) containing Immunosaver (manufactured by Nissin EM Co., Ltd.) and incubated at 95 ° C. for 45 minutes.
The sample was cooled at room temperature for about 30 minutes.
(c) Samples were washed 3 times with phosphate buffered saline (PBS) at room temperature for 5 minutes.
(d) The slides and the water around the slides were wiped off as much as possible with a Kimwipe, and the cells were allowed to stand in a moist chamber, and a blocking agent for immune tissue (Blocking One Histo: manufactured by Nacalai Tesque) was poured onto the tissue sections and incubated at room temperature for 10 minutes.
(e) The sample was washed 3 times with PBS every 5 minutes.
(f) Wipe the slides and the water around the slides as much as possible with a Kimwipe, pour the primary antibody diluted with PBS containing 0.1% bovine serum albumin (BSA) onto the tissue sections, allow to stand in a wet chamber, and at 4 ° C. Incubated overnight.
(g) The antibodies used are as follows. Horseradish peroxidase-labeled anti-PRMT5 antibody: ATLAS ANTIBODIES antibody (catalog number: HPA005525) diluted 150-fold and used. Horseradish peroxidase-labeled anti-MEP50 antibody: Brthyl Laboratories antibody (catalog number: A301-561A) diluted 1000-fold and used. Horseradish peroxidase-labeled anti-Gli1 antibody: An antibody manufactured by AbCam (catalog number: ab134906) was diluted 100-fold and used.
(h) The sample was washed 3 times with PBS every 5 minutes.
(i) Wipe off the water on the slide glass and its surroundings with a Kimwipe as much as possible, drop Histfine (secondary antibody: manufactured by Nichirei Bioscience) onto the section on the slide, leave it in a wet chamber and incubate for 30 minutes at room temperature. .. The sample was washed 3 times with PBS every 5 minutes.
(j) Prepare a DAB solution (DAB Peroxidase Substrate Kit, ImmPACT: Vector Laboratories) (1 ml of A solution, 1 drop of B solution), wipe off the slide and the water around the slide as much as possible with a Kimwipe, and remove the DAB solution. Pour into a section on a slide and immediately set in an optical microscope to check the staining. PRMT5 was poured with DAB solution and staining was completed in 2 minutes and 30 seconds. MEP50 completed staining in 30 seconds. Gli1 completed staining in 7 minutes.
(k) After dyeing, the slide glass was immediately immersed in a vat containing tap water.
(l) In order to stain the cell nucleus, the sample was immersed in hematoxylin solution about 5 times. The time for each session was 3 seconds.
(m) The slide glass was dipped in a vat containing tap water for cleaning.

(2-3) 脱水処理から封入
(a) 80％エタノールで切片を2分間インキュベーションした。
(b) 90％エタノールで切片を2分間インキュベーションした。
(c) 100％エタノールで2分間ごとに交換しながら3回インキュベーションした。
(d) キシレンで2分ごとに交換しながら3回インキュベーションした。
(e) カバーガラスに封入剤を少量つけ、切片を覆った。
(f) 封入剤が乾燥したら、サンプルはケースに入れて室温で保存した。 (2-3) Enclosed from dehydration treatment
(a) Sections were incubated with 80% ethanol for 2 minutes.
(b) The sections were incubated with 90% ethanol for 2 minutes.
(c) Incubated 3 times with 100% ethanol, changing every 2 minutes.
(d) Incubated 3 times with xylene, changing every 2 minutes.
(e) A small amount of mounting medium was applied to the cover glass to cover the sections.
(f) Once the encapsulant had dried, the sample was placed in a case and stored at room temperature.

図２に、研究対象となった肺がん患者の原発腫瘍の標識抗PRMT5抗体、標識抗MEP50抗体、および標識抗Gli1抗体による染色像を示す。上段は強く染色された高発現率の染色像を示し、下段は弱く染色された弱発現率の染色像を示す。 FIG. 2 shows a stained image of the primary tumor of the lung cancer patient studied with the labeled anti-PRMT5 antibody, the labeled anti-MEP50 antibody, and the labeled anti-Gli1 antibody. The upper row shows a strongly stained image with a high expression rate, and the lower row shows a stained image with a weakly stained weak expression rate.

Gli1、MEP50、PRMT5の発現率亢進の判断は、Hスコア法によって行った。Hスコア＝Σ（染色強度×陽性細胞占有率（％））で表される（Am J Clin Pathol., 90. 233-239）。ここで染色強度は以下の基準で判定する。
染色強度0：染色なし、1：弱い染色、2：中程度の染色、3：強い染色 The H-score method was used to determine the increased expression of Gli1, MEP50, and PRMT5. H score = Σ (staining intensity x positive cell occupancy (%)) (Am J Clin Pathol., 90. 233-239). Here, the dyeing intensity is determined according to the following criteria.
Staining intensity 0: No staining, 1: Weak staining, 2: Medium staining, 3: Strong staining

図３に、研究対象となった各患者の年齢、性別、症状、EGFR遺伝子変異型、T790M耐性の有無、がんのステージ（yc(r)stage)、M1b、EGFR-TK1、PFS（無増悪生存期間）、MEP50の発現率、PRMT5の発現率、Gli1の発現率およびトータルの発現率（IHC: total）を示す。トータルの発現率（IHC: total）は、MEP50の発現率、PRMT5の発現率、Gli1の発現率の少なくとも１つの発現率が「強い発現率 (Positive)」と判定され、他が「Moderate」と判定された場合に、「強い発現率 (Positive)」と判断される。 Figure 3 shows the age, sex, symptoms, EGFR gene mutation, T790M resistance, cancer stage (yc (r) stage), M1b, EGFR-TK1, and PFS (progression-free) of each patient studied. (Survival time), MEP50 expression rate, PRMT5 expression rate, Gli1 expression rate and total expression rate (IHC: total) are shown. Regarding the total expression rate (IHC: total), at least one of the MEP50 expression rate, PRMT5 expression rate, and Gli1 expression rate is judged to be "Positive", and the others are "Moderate". If it is determined, it is determined to be "Positive".

図３中、Hスコアが3以上を「強い発現率 (Positive)」、Hスコアが2以上3未満を「Moderate」、0以上2未満を「Negative」としている。
図３より、Gli1、PRMT5、MEP50の発現率はほぼ連動しているという結果が得られた。 In FIG. 3, an H score of 3 or more is defined as “Positive”, an H score of 2 or more and less than 3 is defined as “Moderate”, and a score of 0 or more and less than 2 is defined as “Negative”.
From FIG. 3, it was obtained that the expression rates of Gli1, PRMT5, and MEP50 were almost linked.

図４に、Gli1、MEP50およびPRMT5の発現率が高い患者（Hi)と低い患者（Lo)の無増悪生存期間（PFS：Progression Free Survival)を示す。 FIG. 4 shows the progression-free survival (PFS) of patients with high (Hi) and low expression rates of Gli1, MEP50 and PRMT5 (Lo).

図４に示すように、EGFR遺伝子変異の種類、T790M耐性の有無に係らず、Gli1、PRMT5、MEP50の発現率の高い患者では無増悪生存期間が短くなっているという結果になった。 As shown in FIG. 4, the progression-free survival was shortened in patients with high expression rates of Gli1, PRMT5, and MEP50 regardless of the type of EGFR gene mutation and the presence or absence of T790M resistance.

図３および図４の結果は、Gli1、PRMT5、およびMEP50の発現率がModerate以上であることが無増悪生存期間の短縮と相関関係があることを示している。それ未満の発現率ではPFSの短縮との相関関係はないか、または低いと考えられる。 The results in FIGS. 3 and 4 show that higher expression rates of Gli1, PRMT5, and MEP50 correlate with shortened progression-free survival. Less than that is considered to have no or low correlation with PFS shortening.

以上より、肺がん患者から採取した腫瘍細胞におけるGli1、PRMT5、MEP50の発現率を確認することで、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤に対する腫瘍の感受性を判定することができる。 Based on the above, the susceptibility of tumors to EGFR tyrosine kinase inhibitors can be determined by confirming the expression rates of Gli1, PRMT5, and MEP50 in tumor cells collected from lung cancer patients.

さらにPRMT5、MEP50を介したGli1の活性化経路は、がん細胞を作り出す大元のともいうべき、肺がん幹細胞の維持に関わることが示唆されるため、ALK融合遺伝子産物を標的とした薬剤ザーコリ（一般名：クリゾチニブ）の治療効果の判断にも使える可能性がある。 Furthermore, since it is suggested that the activation pathway of Gli1 via PRMT5 and MEP50 is involved in the maintenance of lung cancer stem cells, which can be said to be the origin of cancer cells, the drug Zakori (ALK fusion gene product) is targeted. It may also be used to determine the therapeutic effect of (generic name: crizotinib).

なお、本発明によって治療効果を判定した後は、現在定められている治療プロトコルに従って他の薬剤（プラチナ製剤など）投与や放射線治療を行うことになる。 After determining the therapeutic effect according to the present invention, administration of another drug (platinum preparation, etc.) or radiotherapy is performed according to the currently established treatment protocol.

本発明により、癌患者に抗癌剤が有効か否かを判断することができ、抗癌剤の有効な使用が可能になる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to determine whether or not an anticancer drug is effective for a cancer patient, and it becomes possible to effectively use the anticancer drug.

Claims (3)

EGFRチロシンキナーゼ阻害剤に対するEGFR遺伝子に変異を持つ肺癌の感受性を判定し、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤がEGFR遺伝子に変異を持つ肺癌に対して治療効果を有するかを判定するための補助的データを取得する方法であって、ヒト被験体由来の生物学的試料における、
（１）Gli1発現率を検出する工程、
（２）PRMT5発現率を検出する工程、および
（３）MEP50発現率を検出する工程
によりGli1発現率、PRMT5発現率およびMEP50発現率を免疫組織化学染色または免疫細胞化学染色を行いHスコア法で判定し、Gli1発現率、PRMT5発現率およびMEP50発現率に基づいて、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤に対するEGFR遺伝子に変異を持つ肺癌の感受性を判定し、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤がEGFR遺伝子に変異を持つ肺癌に対して治療効果を有するかを判定するための補助的データを取得する方法であって、
ヒト被験体由来の生物学的試料の（１）Gli1発現率が、Hスコア法により判定した場合のHスコアとして３以上であること、
（２）PRMT5発現率が、Hスコア法により判定した場合のHスコアとして３以上であること、および
（３）MEP50発現率が、Hスコア法により判定した場合のHスコアとして３以上であること、
に基づいて、前記ヒト被験体のEGFR遺伝子に変異を持つ肺癌は、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤による治療に効果がないと判定する、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤がEGFR遺伝子に変異を持つ肺癌に対して治療効果を有するかを判定するための補助的データを取得する方法。 Obtaining supplementary data to determine the susceptibility of lung cancers with EGFR gene mutations to EGFR tyrosine kinase inhibitors and to determine whether EGFR tyrosine kinase inhibitors have therapeutic effects on lung cancers with EGFR gene mutations In a biological sample derived from a human subject,
(1) Step of detecting Gli1 expression rate,
Gli1 expression rate, PRMT5 expression rate and MEP50 expression rate were subjected to immunohistochemical staining or immunocytochemical staining by the H-score method by (2) the step of detecting the PRMT5 expression rate and (3) the step of detecting the MEP50 expression rate. Based on the Gli1 expression rate, PRMT5 expression rate, and MEP50 expression rate, the susceptibility of lung cancer with a mutation in the EGFR gene to an EGFR tyrosine kinase inhibitor was determined, and lung cancer in which the EGFR tyrosine kinase inhibitor had a mutation in the EGFR gene. It is a method of acquiring auxiliary data for determining whether or not it has a therapeutic effect on
Biological sample from a human subject (1) Gli1 expression rate is 3 or more der Rukoto as H score if it is determined by H scoring,
(2) PRMT5 incidence is 3 or more der Rukoto as H score if it is determined by H scoring, and (3) MEP 50 expression rate, der 3 or more as H score if it is determined by H scoring That,
Based on the above, lung cancer having a mutation in the EGFR gene of the human subject is determined to be ineffective in treatment with an EGFR tyrosine kinase inhibitor, and the EGFR tyrosine kinase inhibitor is treated for lung cancer having a mutation in the EGFR gene. A method of obtaining ancillary data to determine if it has an effect. 癌が非小細胞肺癌である、請求項１記載の方法。 Cancer is non-small cell lung cancer, according to claim 1 Symbol placement methods. 抗Gli1タンパク質抗体、抗PRMT5タンパク質抗体または抗MEP50抗体を含む、請求項１又は２に記載の方法を行うためのキット。 A kit for performing the method according to claim 1 or 2 , comprising an anti-Gli1 protein antibody, an anti-PRMT5 protein antibody or an anti-MEP50 antibody.

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