JP6783969B2 - コラゲナーゲを用いないで脂肪組織から脂肪由来幹細胞を分離抽出培養するための方法、及び脂肪由来幹細胞分離抽出用キット - Google Patents
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Description
脂肪組織中の脂肪由来幹細胞をコラゲナーゼを用いないで抽出して増殖させる方法であって、前記方法は、
患者の生体から採取した脂肪由来幹細胞を含む脂肪組織塊を培養容器に入れて、外径が10μm以上100μm以下の生分解性繊維からなり繊維と繊維の間の間隙が10μmから500μmである不織布シートを前記脂肪組織塊に被せ、
前記培養容器に脂肪由来幹細胞培養用培地を満たすことによって、前記不織布シートを被せた前記脂肪組織塊を前記脂肪由来幹細胞培養用培地に浸し、
前記不織布シートを前記脂肪組織塊に対して押圧することによって、前記脂肪組織塊と前記不織布シートとの密着性を増加させ、それによって前記脂肪細胞組織塊に含まれている前記脂肪由来幹細胞が前記生分解性繊維の表面に這い出すことを促して、前記這い出した前記脂肪由来幹細胞を前記不織布シートの繊維と繊維の間の隙間スペースにおいて大量に増殖させる、
脂肪組織中の脂肪由来幹細胞をコラゲナーゼを用いないで分離抽出して増殖させる方法、という発明に想到した。
細胞培養用容器と、セルストレーナーと、不織布シートと、前記不織布シートを押圧するために用いる目皿又はリングを含み、
前記セルストレーナーの側面と底面はメッシュ状に形成されており、メッシュの孔を通して細胞培養液がセルストレーナー内に通過浸入可能であり、
前記不織布シートは外径が10μmから100μmの生分解性繊維からなり、繊維と繊維の間の間隙が10μmから500μmであり、
脂肪由来幹細胞を含む脂肪組織塊を前記セルストレーナーに入れて、前記不織布シートを前記セルストレーナー中の前記脂肪組織塊に被せた状態で、前記セルストレーナーを収容した培養容器に脂肪由来幹細胞培養用培地を満たすことによって前記脂肪由来幹細胞培養用培地に浸し、
前記脂肪組織塊に被せた不織布シートを前記目皿又はリングを用いて前記脂肪組織塊に対して押圧することによって、前記脂肪組織塊と前記不織布シートとの密着性を増加させることによって、前記脂肪細胞組織塊に含まれている前記脂肪由来幹細胞が前記生分解性繊維の表面に這い出すことを促し、前記這い出してきた前記脂肪由来幹細胞を前記不織布シートの繊維と繊維の間の隙間スペースにおいて増殖させる、
脂肪組織中の脂肪由来幹細胞をコラゲナーゼを用いないで抽出し、増殖するためのキット、という発明に想到した。
本発明では、脂肪組織中に含まれる幹細胞が増殖するための足場材料となる基材として、生分解性繊維からなる不織布シートを用いる。本発明の不織布シートを構成する繊維は外径が10〜100μmあるので繊維と繊維の間に十分なスペースが形成されており、脂肪組織塊を本発明の不織布シートを播種すると、脂肪組織塊が繊維と繊維の間のスペースに入り込んで、その状態で脂肪組織が繊維の表面と接触する。本発明の好ましい実施態様において、不織布を構成する繊維と繊維の間の距離は10μmから500μmある。
本発明の不織布シートを構成する繊維は、ポリ乳酸、PLGA等の生分解性樹脂を用いることができる。本発明の不織布シートを構成する樹脂を生分解性樹脂とすることによって、不織布シート基材上で増殖した細胞を基材ごと人体に移植することが可能になる。
本発明の好ましい一つの実施態様では、患者から採取した脂肪組織塊に不織布シートを被せることによって脂肪由来幹細胞を不織布シートに播種する。患者から採取した脂肪組織は柔らかく不定形な塊であり、不織布シートを被せると不織布シートの繊維による押圧を受けて、脂肪組織塊が柔軟に形状を変えて不織布シートの繊維と繊維の間の間隙に入り込む。脂肪組織塊が繊維と繊維の間に挟まれて不織布シート中にトラップされた状態で培地に浸されて、幹細胞の培養が行われる。
本発明の不織布シートの繊維に対する細胞接着性を高めるためには、ハイドロキシアパタイト(HAp)の粒子を生分解性繊維に含有させるか、又はHApを繊維の表面にコーティングすることが好ましい。HApは殆ど全ての接着細胞と良好な親和性を有するので、本発明の不織布シートの繊維に好適に用いることができる。
容器(又はウェル)に脂肪由来幹細胞増殖用培地(ADSC培地)を満たし、脂肪由来幹細胞を含む脂肪組織片の上から不織布シートを被せた状態で、容器に満たしたADSC培地に完全に浸す。
本発明の生分解性繊維からなる不織布シートを足場材として用いて、In Vitroで基材上に脂肪由来幹細胞を増殖させると、繊維と繊維の間に増殖した脂肪幹細胞が満たされた状態(コンフルエントな状態)になる(図11参照)。この状態に到達した時点で、増殖した脂肪由来幹細胞を不織布シートごと、患者の体内に移植することが可能である。この場合にはトリプシンを用いる必要がないので、細胞にダメージを与えずに移植することが可能である。
<本発明の脂肪由来幹細胞の抽出・培養キットの構成>
・幹細胞抽出培養シート
・ヒト脂肪由来幹細胞専用培地(血清入りのものが望ましい)
・セルストレーナー
(例)サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社 型番22-363-549
・ガラス目皿やガラスリング(脱気時およびセルストレーナーなしの培養時に使用を推奨)
(例)ガラス目皿20(厚さ3 mm、穴径2 mm)株式会社東新理興
(例)クローニングリング AGCテクノグラス株式会社 型番RING-12
・培養容器(6ウェルプレート、10 cmディッシュ、15 cmディッシュなど)
(例)6ウェルマルチウェルプレート コーニング 型番3516
(例)細胞培養ディッシ100 mm ビーエム機器株式会社 型番93100
(例)接着細胞培養用シャーレ150 住友ベークライト株式会社 型番MS-10150
セルストレーナーの中に脂肪を播種したシートを入れて培養を行う。シート1枚で培養する方法(脂肪の上にシートをのせる)とシート2枚で培養する方法(脂肪を上下からシートで挟む)が可能である(図1参照)。更に多くのシートを積層して培養することも可能である。
6ウェルプレート、10 cmディッシュ、15 cmディッシュから培養容器を選択する。
(図2,3,4参照)。培養容器ごとの最大サンプル数と推奨培地量を以下の表1に示す。
シートを培地に沈めようとすると、不織布シートの空隙内に気泡を生じてしまうのでそのままでは浮いてしまう恐れがある。培地にシートが浮いてしまうのを避けるためには、以下の手順でシートの脱気をすることが望ましい。
1) 10 cmディッシュに培地を8〜10 mL加える。
2) 幹細胞抽出培養シートを滅菌済みのピンセットで必要枚数取り出し、培地が入っているディッシュへ入れる。
3) シートの上から重しとして滅菌済みのガラス目皿またはガラスリングをのせてシートを完全に沈める。(図5参照)
4) -0.09 MPaで1 min程度脱気する。気圧計がない場合は、水流アスピレーターで10 min程度脱気する。
A.セルストレーナーを用いて培養する場合(6ウェルプレートを用いる)
図6〜8に示す手順で脂肪組織塊を播種する。播種後はインキュベーター(37℃, 5%CO2)に入れて培養を開始する。なお、培地交換は2〜4日おきに全量または半量程度を交換する。
1) ウェルに培地を約5 mL加えてセルストレーナーをセットする。
2) セルストレーナーの底の中央部分(メッシュ部分)に脂肪を約0.05 gのせる。その際には、播種しやすいようにピンセット等でセルストレーナーの底をかるく押して面を平らにすることが重要である。セルストレーナーの底に脂肪をのせたときに脂肪が浮いて分散してしまう場合は、培地量を減らして液面を低くし、分散を防ぐことが望ましい
3) 脂肪の上から脱気済みのシートを1枚のせる。
4) ウェルに培地を3 mL加えてウェルの培地量が8 mLになるようにする。
5) 6ウェルプレートの蓋が浮かないように蓋の上からテープを貼って押さえる。(図7参照)
6) インキュベーター(37℃, 5%CO2)に入れて培養を開始する。
1) ウェルに培地を約6 mL加えてセルストレーナーをセットする。
2) セルストレーナーに脱気済みのシートを1枚入れる。
3) シートの中央部分に脂肪を約0.05 gのせる。
4) 脂肪の上から脱気済みのシートを1枚のせる。
5) ウェルに培地を2 mL加えてウェルの培地量が8 mLになるようにする。
6) 6ウェルプレートの蓋が浮かないように蓋の上からテープを貼って押さえる。
7) インキュベーター(37℃, 5%CO2)に入れて培養を開始する。
セルストレーナーを使用せず、脂肪播種済みのシートを培養することが可能である。セルストレーナーを使わない場合、シートがずれる危険がある。そのため、ガラス目皿またはガラスリングなどで押さえつけて培養することが望ましい。また、この場合、ウェルプレートの底に接着し増殖する脂肪幹細胞の割合が大きくなることも考慮する必要がある。
1) ウェルに培地を約1 mL加える。
2) 脱気済みのシートを1枚入れる。
3) シートの中央部分に脂肪を約0.05 gのせる。
4) 脂肪とウェル底が接地するように、シートをひっくり返す。
5) シートの上から重しとして滅菌済みのガラス目皿またはガラスリングをのせる。
6) ウェルに培地を2〜2.5 mL加えてウェルの培地量が3〜3.5 mLになるようにする。
7) インキュベーター(37℃, 5%CO2)に入れて培養を開始する。
1) ウェルに培地を約1 mL加える。
2) 脱気済みのシートを1枚入れる。
3) シートの中央部分に脂肪を約0.05 gのせる。
4) 脂肪の上から脱気済みのシートを1枚のせる。
5) シートの上から重しとして滅菌済みのガラス目皿またはガラスリングをのせる。
6) ウェルに培地を2〜2.5 mL加えてウェルの培地量が3〜3.5 mLになるようにする。
7) インキュベーター(37℃, 5%CO2)に入れて培養を開始する。
図12(a)(b)は、バイオ未来工房株式会社の脂肪幹細胞分離キットを用いた脂肪細胞の培養結果を示す。図11と図12の比較から、本発明の方法・キットを用いた細胞培養が従来技術と比べて大量の細胞増殖を実現できていることがわかる。
実験条件
使用した不織布シート:エレクトロスピニング法でPLGA50重量%/HAp50重量%の組成の複合繊維(外径10〜60μm)を紡糸して不織布シートとして回収し、直径23mm円形にカットしてサンプル1とした。
播種したもの:ヒトの脂肪組織(大腿部浅層から吸引)
使用した培地:ADSCADSC -GM
培養容器:6ウェルプレート
培地量( 1ウェル当たり):10 mL
培養温度・ CO2濃度37 ℃,5%CO2
培養日数:4日間、 12 日間、 22 日間、 32 日間、 42 日間
播種した脂肪量:0.05 g
吸光度(波長440 nm)をWST-1測定 全5回測定
2)図14(b)に示す通り、脂肪組織塊から幹細胞が不織布シートに這い出して接着培養された結果は、培養日数32日で吸光度0.346であった。
3)図14(c)に示す通り、脂肪組織塊から不織布シートに這い出した幹細胞が不織布シートを経由して不織布シートの上に置いた目皿に這い出してそこで接着培養された結果は、培養日数32日で吸光度0.293であった。
4)セルストレーナーに不織布シートを敷いて脂肪組織塊を載せてその上から別の不織布シートで覆うことによって、脂肪組織塊の上下から不織布シートで挟んだ状態で培地に浸して培養すると、セルストレーナーに接着する幹細胞は目皿に接着した培養とほぼ同様に減少し、その分不織布シートに接着培養される幹細胞の数が増加すると考えられる。
5)図14(a)〜(c)から、脂肪組織を二枚の不織布シートで上下からサンドイッチして挟んだ状態で培地に浸して培養することによって、かなりの量の幹細胞がセルストレーナーに逃げるのを防いで、不織布シートに接着させることができると考えられる。
脂肪組織播種前日にセルストレーナー上に不織布シート2枚とガラス目皿1個を乗せ、6 well plateに3セット静置し、 PBS 1% PSで脱気・浸漬を行った。翌日、 脂肪組織を受け取った後0.02 g の脂肪組織を中心付近に置き、不織布シートで挟むようにして中心付近に置き、 ADSCGM 培地で3日毎に培地交換を行い24日間培養した。不織布シート上に脂肪由来幹細胞( ADSCs )が過密状態になったタイミングで軟骨分化培地に交換し、3日ごとに培地交換し3週間培養を行った。
脂肪組織播種前日にセルストレーナー上に不織布シート2枚とガラス目皿1個を乗せ、6 well plateに3セット静置し、 PBS 1% PSで脱気・浸漬を行った。翌日、 脂肪組織を受け取った後0.02 g の脂肪組織を不織布シートで挟むようにして中心付近に置き、 ADSCGM 培地で培養を行った。三日後にEBM-2培地(LONZA)に培地交換し、32日間3日ごとに培地交換して培養を行った。
脂肪組織播種前日にセルストレーナー上に不織布シート2枚とガラス目皿1個を乗せ、6 well plateに3セット静置し、 PBS 1% PSで脱気・浸漬を行った。翌日、 脂肪組織を受け取った後0.02 g の脂肪組織を中心付近に置き、不織布シートで挟むようにして中心付近に置き、 ADSCGM 培地で3日毎に培地交換を行い40日間培養した。不織布シート上に脂肪由来幹細胞( ADSCs )が過密状態になったタイミングで脂肪細胞分化培地(DSファーマ)に交換し1週間培養を行った後、脂肪細胞培養用培地(DSファーマ)に培地交換し、3日ごとに培地交換し1週間培養を行った。
また、本発明の方法及びキットは、脂肪組織だけでなく臍帯組織や皮膚組織、滑膜組織、歯髄組織、骨髄組織などからも各体性幹細胞を分離抽出するのにも同様に用いることが可能である。さらに、本発明に用いる不織布シートは、脂肪組織から脂肪幹細胞を抽出するだけでなく、脂肪幹細胞やその他の体性幹細胞、iPS細胞、ES細胞などを直接的に播種して培養する足場としても使用可能である。
Claims (15)
- 脂肪由来幹細胞が接着培養された生分解性繊維を含む不織布シートであって、
前記不織布シートは、エレクトロスピニング法で紡糸した外径10μm〜100μmの生分解性繊維を含み、繊維と繊維の間のスペースが10μm〜500μmであり、
前記不織布シートの繊維と繊維の間は脂肪由来幹細胞が密に増殖して満たされた状態であり、
前記脂肪由来幹細胞は、前記不織布を構成する繊維と繊維の間に挟まれた複数の脂肪組織塊に含まれた脂肪由来幹細胞が前記脂肪組織塊の中から這い出して、前記生分解性繊維の表面に接着し増殖したものである、
前記脂肪由来幹細胞が接着培養された生分解性繊維を含む不織布シート。
- 前記生分解性繊維は、PLGA樹脂を含む、請求項1に記載の前記脂肪由来幹細胞が接着培養された生分解性繊維を含む不織布シート。
- 前記生分解性繊維は、HApを40〜80重量%含んでいる、請求項1又は2に記載の前記脂肪由来幹細胞が接着培養された生分解性繊維を含む不織布シート。
- 前記不織布は。0.1mm〜1.0mmの厚さを有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の前記脂肪由来幹細胞が接着培養された生分解性繊維を含む不織布シート。
- 前記不織布は、複数のシートが重畳的に重ねられてなる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の前記脂肪由来幹細胞が接着培養された生分解性繊維を含む不織布シート。
- 前記脂肪組織は、患者の生体から採取した脂肪組織である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の前記脂肪由来幹細胞が接着培養された生分解性繊維を含む不織布シート。
- 脂肪組織中の脂肪由来幹細胞をコラゲナーゼを用いないで抽出し、増殖させる方法であって、前記方法は、
患者の生体から採取した脂肪由来幹細胞を含む脂肪組織塊を培養容器に入れて、外径が10μmから100μmの生分解性繊維からなり、繊維と繊維の間の間隙が10μmから500μmである不織布シートを前記脂肪組織塊に被せ、
前記培養容器に脂肪由来幹細胞培養用培地を満たすことによって、前記不織布シートを被せた前記脂肪組織塊を前記脂肪由来幹細胞培養用培地に浸し、
前記不織布シートで前記脂肪組織塊を押圧することによって、前記脂肪組織塊と前記不織布シートとの密着性を増加し、密着性の増加によって前記脂肪組織塊に含まれている前記脂肪由来幹細胞が前記生分解性繊維の表面に這い出すことを促して、前記這い出した前記脂肪由来幹細胞によって前記不織布シートの繊維と繊維の間のスペースが満たされた状態になるように密に増殖させる、
前記脂肪組織中の脂肪由来幹細胞をコラゲナーゼを用いないで分離抽出し、増殖させる方法。
- 前記生分解性繊維は、エレクトロスピニング法を用いて紡糸されており、HApを40〜80重量%含有する、請求項7に記載の方法。
- 前記細胞組織塊を覆う不織布シートに上から重しを載せることによって、前記不織布シートと前記脂肪組織塊との間の密着性を高める、請求項7又は8に記載の方法。
- 前記培養容器中において、前記脂肪組織塊を二枚の不織布シートの間に挟んでサンドイッチ状態で培地に浸して培養する、請求項7から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脂肪組織塊をメッシュ構造を有するセルストレーナーに入れて、前記脂肪組織塊を収容した前記セルストレーナーを培養容器に収容し、培養容器を脂肪由来幹細胞培養用培地に浸すことによって、脂肪組織塊を脂肪由来幹細胞培養用培地に浸す、請求項7から10のいずれか一項に記載の方法。
- 脂肪組織塊を細胞非接着性のシャーレに入れて、そのシャーレに培地を満たして培養する、請求項7から11のいずれか一項に記載の方法。
- 脂肪組織中の脂肪由来幹細胞をコラゲナーゼを用いないで抽出して増殖するために用いる脂肪由来幹細胞分離抽出用キットであって、前記キットは、
細胞培養用容器と、セルストレーナーと、不織布シートと、前記不織布シートを押圧するために用いる目皿又はリングを含み、
前記セルストレーナーの側面と底面はメッシュ状に形成されており、メッシュの孔を通して細胞培養液がセルストレーナー内に通過浸入可能であり、
前記不織布シートは外径が10μm以上100μm以下の生分解性繊維からなり、繊維と繊維の間の間隙が10μmから500μmであり、
前記脂肪由来幹細胞を含む脂肪組織塊を前記セルストレーナーに入れて、前記不織布シートを前記セルストレーナー中の前記脂肪組織塊に被せた状態で、前記セルストレーナーを収容した培養容器に脂肪由来幹細胞培養用培地を満たすことによって前記脂肪由来幹細胞培養用培地に浸し、前記脂肪組織塊に被せた不織布シートをその状態で前記目皿又はリングを用いて上から押圧して前記脂肪組織塊と前記不織布シートとの密着性を増加させることによって、前記脂肪組織塊に含まれている前記脂肪由来幹細胞が前記生分解性繊維の表面に這い出すことを促し、前記這い出してきた前記脂肪由来幹細胞によって前記不織布シートの繊維と繊維の間のスペースが満たされた状態になるように密に増殖させる、
脂肪組織中の脂肪由来幹細胞をコラゲナーゼを用いないで抽出し、増殖するためのキット。
- 前記生分解性繊維は、エレクトロスピニング法を用いて紡糸されており、HApを40から80重量%含有する、請求項13に記載の脂肪由来幹細胞分離抽出用キット。
- 前記培養容器は、非細胞接着性のシャーレである、請求項13又は14に記載の脂肪由来幹細胞分離抽出用キット。
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