JP6781854B1 - Method for producing and screening monoclonal antibody with yeast - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
【課題】より迅速かつ効率的にモノクローナル抗体を動物個体を用いずに製造する方法を提供すること。【解決手段】分泌シグナルをコードする遺伝子、ナノボディをコードする遺伝子およびペプチドバーコードをコードする遺伝子を含むDNA断片または該DNA断片を含むベクターが導入された酵母であって、該ペプチドバーコードが、5〜30個のアミノ酸からなるアミノ酸配列により表され、かつ該アミノ酸が独立してA、F、G、K、L、P、R、VおよびWからなる群から選択される、酵母を開示する。ナノボディおよび上記ペプチドバーコードを含むポリペプチドからなるモノクローナル抗体、ならびに上記バーコードペプチドもまた開示する。【選択図】図1PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for producing a monoclonal antibody more quickly and efficiently without using an individual animal. A DNA fragment containing a gene encoding a secretory signal, a gene encoding a nanobody, and a gene encoding a peptide bar code, or a yeast into which a vector containing the DNA fragment has been introduced, wherein the peptide bar code is used. Discloses a yeast represented by an amino acid sequence consisting of 5 to 30 amino acids, wherein the amino acids are independently selected from the group consisting of A, F, G, K, L, P, R, V and W. .. Monoclonal antibodies consisting of Nanobodies and polypeptides containing the peptide barcodes, as well as the barcode peptides, are also disclosed. [Selection diagram] Fig. 1
Description
本発明は、モノクローナル抗体の酵母による製造方法およびスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a monoclonal antibody with yeast and a method for screening.
抗体は、重鎖(H鎖)と軽鎖(L鎖)とからなる150kDaの大きなタンパク質分子である。これまで、抗体は、例えば脊椎動物個体に抗原を投与して、時間をかけて作製されてきた。抗体の抗原決定部位は、ゲノム上に多様な部位の遺伝子としてコードされており、外部からの多様な異物の侵入に対抗してその多様性を組み合わせ、いわゆるポリクローナル抗体タンパク質分子を作り出している。さらに、特異性を向上させたモノクローナル抗体は、ミエローマ細胞(骨髄腫細胞)とのハイブリドーマ細胞(融合細胞)を試験管内で調製し、培養することによって製造されている。 An antibody is a large protein molecule of 150 kDa consisting of a heavy chain (H chain) and a light chain (L chain). So far, antibodies have been produced over time, for example, by administering an antigen to an individual vertebrate. The antigenic determination site of an antibody is encoded as a gene of various sites on the genome, and the diversity is combined against the invasion of various foreign substances from the outside to create a so-called polyclonal antibody protein molecule. Furthermore, monoclonal antibodies with improved specificity are produced by preparing hybridoma cells (fusion cells) with myeloma cells (myeloma cells) in vitro and culturing them.
このように、ポリクローナル抗体については脊椎動物への投与、そしてモノクローナル抗体については試験管内での細胞培養によって製造されてきた。しかし、重鎖(H鎖)と軽鎖(L鎖)とからなるフルボディの抗体は大きなタンパク質分子であるため、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれの製造方法とも、費用および時間のかかる方法であった。 Thus, polyclonal antibodies have been produced by administration to vertebrates, and monoclonal antibodies by cell culture in vitro. However, since a full-bodied antibody consisting of a heavy chain (H chain) and a light chain (L chain) is a large protein molecule, both methods for producing polyclonal antibodies and monoclonal antibodies are costly and time-consuming methods. It was.
他方、抗体の製造には、動物体内または培養細胞によって生産された抗体をスクリーニングするために、ディスプレイ技術(例えば、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイ)が用いられてきた。ディスプレイ技術では、抗体が細胞やファージの表層に固定化される。このように固定化された抗体は、構造の安定性が高まることが知られている。そのため、スクリーニングで取得された抗体を、実際の利用状況である遊離型抗体として用いる場合、構造の安定性が失われて使用できないことがある。また、1つの担体(例えば、ファージまたは酵母細胞)に対して複数の抗体が提示されるため、近接阻害効果が生じ、低い結合能力しか持たない抗体が得られることがある。 On the other hand, for the production of antibodies, display techniques (eg, phage display or yeast display) have been used to screen for antibodies produced in animals or by cultured cells. In display technology, antibodies are immobilized on the surface of cells and phages. Antibodies immobilized in this way are known to have enhanced structural stability. Therefore, when the antibody obtained by screening is used as a free antibody, which is the actual usage situation, the structural stability may be lost and the antibody may not be used. In addition, since a plurality of antibodies are presented to one carrier (for example, phage or yeast cells), a proximity inhibitory effect may occur and an antibody having a low binding ability may be obtained.
抗体医薬品として、モノクローナル抗体が注目されている。モノクローナル抗体は、単一の抗原に対して結合し、特異性が高いため、癌細胞、自己免疫疾患、感染症等への応用が期待されている。例えば、モノクローナル抗体は標的となる抗原に特異的に結合し、その抗原を含む細胞(例えば、癌細胞、感染因子が感染した細胞)を免疫機構によって攻撃し、破壊することができる。したがって、より簡便にモノクローナル抗体を製造する方法が求められている。さらに、標的の抗原に対して特異的に結合するモノクローナル抗体をより容易に同定する方法もまた求められている。 Monoclonal antibodies are attracting attention as antibody drugs. Monoclonal antibodies bind to a single antigen and have high specificity, so they are expected to be applied to cancer cells, autoimmune diseases, infectious diseases, and the like. For example, a monoclonal antibody can specifically bind to a target antigen and attack and destroy cells containing that antigen (eg, cancer cells, cells infected with an infectious agent) by an immune system. Therefore, there is a need for a simpler method for producing a monoclonal antibody. In addition, there is also a need for a method for more easily identifying monoclonal antibodies that specifically bind to the target antigen.
非特許文献1および2には、抗体を固定化せずに結合能力を調べる方法として、NestLinkという一度に数千のライブラリメンバーを特徴付けることができる結合物質の選択および同定方法を開発したことが記載されている。このNestLinkは、遺伝子でコードされたペプチドバーコード「フライコード」に基づくものであり、このフライコードを、質量分析の検出力を高めかつ配列解析の際のユニークな識別子として機能するように設計したことが記載されている。 Non-Patent Documents 1 and 2 describe that NestLink, a method for selecting and identifying a binding substance capable of characterizing thousands of library members at a time, has been developed as a method for examining the binding ability without immobilizing an antibody. Has been done. This NestLink is based on the gene-encoded peptide barcode "flycode", which was designed to enhance the detection power of mass spectrometry and to function as a unique identifier during sequence analysis. It is stated that.
しかし、結合能力を有する抗体の同定をより容易とするには、質量分析によるペプチドの検出に関して、感度および特異性を高めた識別バイアスの少ない方法がなお求められる。 However, in order to facilitate the identification of antibodies capable of binding, a method with increased sensitivity and specificity and less discrimination bias is still required for the detection of peptides by mass spectrometry.
本発明は、より迅速かつ効率的に、モノクローナル抗体を製造する方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for producing a monoclonal antibody more quickly and efficiently.
本発明は、モノクローナル抗体を製造する方法を提供し、この方法は、
分泌シグナルをコードする遺伝子、ナノボディをコードする遺伝子およびペプチドバーコードをコードする遺伝子を含むDNA断片または該DNA断片を含むベクターを、酵母の細胞に導入する工程、および
該細胞で発現されかつ該細胞の外に分泌された、該ナノボディおよび該ペプチドバーコードを含むポリペプチドを回収する工程
を含む。
The present invention provides a method of producing a monoclonal antibody, which method is:
A step of introducing a DNA fragment containing a gene encoding a secretory signal, a gene encoding a nanobody and a gene encoding a peptide bar code, or a vector containing the DNA fragment into a yeast cell, and expressing in the cell and the cell. Including the step of recovering a polypeptide containing the nanobody and the peptide bar code secreted outside the cell.
1つの実施形態では、上記酵母は、サッカロマイセス属、ピチア属、シゾサッカロマイセス属、ジゴサッカロマイセス属、カンジダ属、トルロプシス属、ヤロウイア属またはハンセヌラ属に属する酵母である。 In one embodiment, the yeast is a yeast belonging to the genus Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Candida, Trulopsis, Yarrowia or Hansenula.
1つの実施形態では、上記分泌シグナルは、α因子分泌シグナル、グルコアミラーゼ分泌シグナルまたはPHO1分泌シグナルである。 In one embodiment, the secretory signal is an α-factor secretory signal, a glucoamylase secretory signal or a PHO1 secretory signal.
1つの実施形態では、上記DNA断片は、AOX1プロモーター、GAPプロモーター、FLD1プロモーター、PEX8プロモーターまたはYPT1プロモーターであるプロモーターをさらに含む。 In one embodiment, the DNA fragment further comprises a promoter that is the AOX1 promoter, GAP promoter, FLD1 promoter, PEX8 promoter or YPT1 promoter.
1つの実施形態では、上記DNA断片は、FLAGタグ、Hisタグ、カルモジュリンプロテイン(CBP)タグ、Strepタグ、StrepIIタグ、GSTタグ、Mycタグ、マルトース結合プロテイン(MBP)タグからなる群から選択される少なくとも1つのタグをコードする遺伝子をさらに含む。 In one embodiment, the DNA fragment is selected from the group consisting of FLAG tag, His tag, calmodulin protein (CBP) tag, Strep tag, StrepII tag, GST tag, Myc tag, Maltose binding protein (MBP) tag. It further comprises a gene encoding at least one tag.
1つの実施形態では、上記ペプチドバーコードは、6〜16個のアミノ酸からなるアミノ酸配列により表され、かつ該アミノ酸が独立してA、F、G、K、L、P、R、VおよびWからなる群から選択される。 In one embodiment, the peptide barcode is represented by an amino acid sequence consisting of 6 to 16 amino acids, the amino acids independently A, F, G, K, L, P, R, V and W. Selected from the group consisting of.
1つの実施形態では、上記製造方法は、上記回収されたポリペプチドを抗原と合わせ、該抗原と特異的に結合するナノボディを含むポリペプチドを取得する工程、
該取得されたポリペプチドから前記ペプチドバーコードを切り出し、該切り出されたペプチドバーコードを質量分析にて同定する工程、および
該同定されたペプチドバーコードをコードする核酸の塩基配列に基づいて、該同定されたペプチドバーコードが切り出されたポリペプチドに含まれていたナノボディを同定する工程
をさらに含む。
In one embodiment, the production method comprises combining the recovered polypeptide with an antigen to obtain a polypeptide containing Nanobodies that specifically bind to the antigen.
The peptide barcode is cut out from the obtained polypeptide, and the cut out peptide barcode is identified by mass spectrometry, and the peptide barcode is identified based on the base sequence of the nucleic acid encoding the identified peptide barcode. The identified peptide barcode further comprises the step of identifying the nanobody contained in the excised polypeptide.
1つの実施形態では、上記DNA断片は、特異的プロテアーゼにより切断される部位をさらに含む。 In one embodiment, the DNA fragment further comprises a site that is cleaved by a specific protease.
1つの実施形態では、上記ペプチドバーコードを同定する工程は、高速液体クロマトグラフ(LC)に接続したタンデム質量分析計(MS/MS)を用いたピークの検出により行われる。 In one embodiment, the step of identifying the peptide barcode is performed by detecting peaks using a tandem mass spectrometer (MS / MS) connected to a high performance liquid chromatograph (LC).
1つの実施形態では、上記高速液体クロマトグラフは、モノリスロング型カラムを備える。 In one embodiment, the high performance liquid chromatograph comprises a monolith long column.
1つの実施形態では、上記製造方法は、上記DNA断片の塩基配列を決定する工程をさらに含む。 In one embodiment, the production method further comprises the step of determining the base sequence of the DNA fragment.
1つの実施形態では、上記酵母の細胞に導入する工程は、少なくとも2個の前記DNA断片またはベクターを酵母細胞に導入する工程であり、各DNA断片中のペプチドバーコードをコードする遺伝子が、それぞれ異なるアミノ酸配列で表されるペプチドバーコードをコードする。 In one embodiment, the step of introducing into the yeast cell is the step of introducing at least two of the DNA fragments or vectors into the yeast cell, and the gene encoding the peptide bar code in each DNA fragment is each. It encodes a peptide bar code represented by a different amino acid sequence.
1つの実施形態では、上記DNA断片は、2個以上のペプチドバーコードをコードする遺伝子を含み、該2個以上のペプチドバーコードの間に切断部位が配置されている。 In one embodiment, the DNA fragment comprises a gene encoding two or more peptide barcodes, with cleavage sites located between the two or more peptide barcodes.
本発明はさらに、モノクローナル抗体を酵母で製造するためのベクターを提供し、このベクターは、分泌シグナルをコードする遺伝子、ナノボディをコードする遺伝子およびペプチドバーコードをコードする遺伝子を含むDNA断片を含有し、かつ該酵母の細胞に導入されて該ナノボディおよび該ペプチドバーコードを含むポリペプチドを該酵母の細胞の外に分泌させるように発現させる。 The present invention further provides a vector for producing a monoclonal antibody in yeast, which contains a DNA fragment containing a gene encoding a secretory signal, a gene encoding a nanobody and a gene encoding a peptide bar code. And, it is introduced into the cells of the yeast and expressed so as to secrete the polypeptide containing the nanobody and the peptide bar code to the outside of the cells of the yeast.
1つの実施形態では、上記分泌シグナルは、α因子分泌シグナル、グルコアミラーゼ分泌シグナルまたはPHO1分泌シグナルである。 In one embodiment, the secretory signal is an α-factor secretory signal, a glucoamylase secretory signal or a PHO1 secretory signal.
1つの実施形態では、上記DNA断片は、AOX1プロモーター、GAPプロモーター、FLD1プロモーター、PEX8プロモーターまたはYPT1プロモーターであるプロモーターをさらに含む。 In one embodiment, the DNA fragment further comprises a promoter that is the AOX1 promoter, GAP promoter, FLD1 promoter, PEX8 promoter or YPT1 promoter.
1つの実施形態では、上記DNA断片は、FLAGタグ、Hisタグ、カルモジュリンプロテイン(CBP)タグ、Strepタグ、StrepIIタグ、GSTタグ、Mycタグ、マルトース結合プロテイン(MBP)タグからなる群から選択される少なくとも1つのタグをコードする遺伝子をさらに含む。 In one embodiment, the DNA fragment is selected from the group consisting of FLAG tag, His tag, calmodulin protein (CBP) tag, Strep tag, StrepII tag, GST tag, Myc tag, Maltose binding protein (MBP) tag. It further comprises a gene encoding at least one tag.
1つの実施形態では、上記ペプチドバーコードは、6〜16個のアミノ酸からなるアミノ酸配列により表され、かつ該アミノ酸が独立してA、F、G、K、L、P、R、VおよびWからなる群から選択される。 In one embodiment, the peptide barcode is represented by an amino acid sequence consisting of 6 to 16 amino acids, the amino acids independently A, F, G, K, L, P, R, V and W. Selected from the group consisting of.
1つの実施形態では、上記DNA断片は、特異的プロテアーゼにより切断される部位をさらに含む。 In one embodiment, the DNA fragment further comprises a site that is cleaved by a specific protease.
本発明はさらに、モノクローナル抗体をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、
(i)遺伝子ライブラリから抗体ライブラリを発現する工程であって、
該遺伝子ライブラリが少なくとも2個の遺伝子メンバーを含み、各遺伝子メンバーが、ナノボディをコードする遺伝子および少なくとも1つのペプチドバーコードをコードする遺伝子を含むDNA断片を含み、
該遺伝子ライブラリの各遺伝子メンバーの該DNA断片が、該抗体ライブラリの各抗体メンバーのポリペプチドをコードし、
該抗体ライブラリの各抗体メンバーの該ポリペプチドが、ナノボディおよび少なくとも1個のペプチドバーコードを含み、該ナノボディおよび該少なくとも1個のペプチドバーコードが、該遺伝子ライブラリの各遺伝子メンバーに含まれるDNA断片によりコードされ、
該抗体メンバーの各ペプチドバーコードが、それぞれ異なるアミノ酸配列で表される、
工程;
(ii)該抗体ライブラリを抗原と合わせ、該抗体ライブラリから、該抗原に結合したナノボディを含む該抗体ライブラリの抗体メンバーを選択する工程;
(iii)選択した該抗体ライブラリの抗体メンバーに含まれるペプチドバーコードを切り出し、該切り出されたペプチドバーコードを質量分析にて同定する工程;および
(iv)該同定されたペプチドバーコードをコードする遺伝子の塩基配列を該遺伝子ライブラリの塩基配列に基づいて決定し、該同定されたペプチドバーコードが切り出された抗体メンバーのナノボディを同定する工程
を含み、
該発現工程は、上記ベクターを酵母の細胞に導入することにより行われる。
The present invention further provides a method of screening for monoclonal antibodies, which methods are:
(I) A step of expressing an antibody library from a gene library.
The gene library contains at least two gene members, each gene member containing a DNA fragment containing a gene encoding a Nanobody and a gene encoding at least one peptide barcode.
The DNA fragment of each gene member of the gene library encodes the polypeptide of each antibody member of the antibody library.
A DNA fragment in which the polypeptide of each antibody member of the antibody library comprises a Nanobody and at least one peptide barcode, and the Nanobody and the at least one peptide barcode are contained in each gene member of the gene library. Coded by
Each peptide barcode of the antibody member is represented by a different amino acid sequence.
Process;
(Ii) A step of combining the antibody library with an antigen and selecting an antibody member of the antibody library containing a Nanobody bound to the antigen from the antibody library;
(Iii) A step of cutting out a peptide bar code contained in an antibody member of the selected antibody library and identifying the cut out peptide bar code by mass analysis; and (iv) encoding the identified peptide bar code. A step of determining the base sequence of a gene based on the base sequence of the gene library and identifying the nanobody of the antibody member from which the identified peptide barcode was excised is included.
The expression step is carried out by introducing the above vector into yeast cells.
1つの実施形態では、上記スクリーニング方法は、上記DNA断片の塩基配列を決定する工程をさらに含む。 In one embodiment, the screening method further comprises the step of determining the base sequence of the DNA fragment.
本発明によれば、任意の抗原に対して特異的に結合するモノクローナル抗体を迅速に取得することができる。また、本発明では遊離型抗体を用いて結合能力を測定するため、実際の利用状況に応じた抗体の結合能力に基づいて、抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を取得することができる。 According to the present invention, a monoclonal antibody that specifically binds to an arbitrary antigen can be rapidly obtained. Further, in the present invention, since the binding ability is measured using a free antibody, a monoclonal antibody that specifically binds to an antigen can be obtained based on the binding ability of the antibody according to the actual usage situation.
(定義)
本明細書中の用語は、本質的には、生物学および免疫学で通常用いる用語において用いるが、以下の用語について説明する。
(Definition)
The terms herein are used essentially in terms commonly used in biology and immunology, but the following terms will be described.
用語「核酸」は、任意の長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかまたはその類似体の重合体形態を指す。この用語は、例えば、DNA、RNAおよびそれらの修飾された形態を包含する。核酸は、線形である場合も、環状である場合もある。用語「遺伝子」は、その塩基配列によってコードされる遺伝情報を含む核酸の領域をいう。遺伝子は、「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」をコードし、その配列情報に基づき「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」を発現し得る。 The term "nucleic acid" refers to a polymeric form of any length of nucleotide, deoxyribonucleotide or ribonucleotide or an analog thereof. The term includes, for example, DNA, RNA and their modified forms. Nucleic acids may be linear or cyclic. The term "gene" refers to a region of nucleic acid that contains the genetic information encoded by its base sequence. A gene encodes a "peptide," "polypeptide," or "protein," and can express a "peptide," "polypeptide," or "protein" based on its sequence information.
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸の重合体形態を指す。「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、例えば、核酸によりコードされるアミノ酸を構成分子として含み、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸もまた構成分子として含んでもよい。本明細書において、「ポリペプチド」または「タンパク質」は互換的に用いられる。 The term "peptide", "polypeptide" or "protein" refers to a polymeric form of an amino acid. A "peptide", "polypeptide" or "protein" may include, for example, an amino acid encoded by a nucleic acid as a constituent molecule, and a chemically or biochemically modified or derivatized amino acid may also be included as a constituent molecule. .. As used herein, "polypeptide" or "protein" is used interchangeably.
本明細書中で用語「抗体」は、生物学および免疫学において通常用いられる意味において用い、「免疫グロブリン」とも呼ばれるポリペプチドまたはタンパク質である。抗体は、フルボディでは、2個の重鎖(H鎖)と2個の軽鎖(L鎖)とからなり、鎖間はジスルフィド結合で結合されている。本明細書中で「抗体」とは、抗原に対する特異的結合を保持する任意のアイソタイプの抗体または抗体の断片を含み、例えば、Fab、Fv、scFv、Fd、VHH(「ナノボディ」)、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体ならびに抗体の抗原結合部分および非抗体タンパク質を含む融合タンパク質も含まれる。抗体は、例えば、放射性同位元素、検出可能な生成物を生成する酵素、蛍光タンパク質、ペプチドバーコードなどを用いて検出可能に標識できる。 As used herein, the term "antibody" is a polypeptide or protein commonly used in biology and immunology and is also referred to as "immunoglobulin". In full body, the antibody consists of two heavy chains (H chain) and two light chains (L chain), and the chains are linked by a disulfide bond. The term "antibody" herein includes an antibody or fragment of an antibody of any isotype that retain specific binding to an antigen, for example, Fab, Fv, scFv, Fd , V H H ( "nanobodies"), Also included are chimeric antibodies, humanized antibodies, single chain antibodies and fusion proteins containing the antigen binding portion of the antibody and non-antibody proteins. Antibodies can be detectably labeled using, for example, radioactive isotopes, enzymes that produce detectable products, fluorescent proteins, peptide barcodes, and the like.
「ナノボディ」とは、シングルドメイン抗体とも呼ばれ、単一のモノマー可変抗体ドメインからなり、軽鎖および従来のFab領域の重鎖のCHドメインを欠く、一種の抗体フラグメントである。ナノボディは、その分子量は12〜15kDaであり、通常のフルボディ抗体の分子量150kDaと比べて約10分の1である。ナノボディは、このように低分子であるにもかかわらず、フルボディの抗体と同様の特性を有する。例えば、ラクダ科動物が有する単一ドメイン抗体の可変領域であるVHHドメインからなる抗体が挙げられる。ナノボディは、通常、約120アミノ酸残基のポリペプチドである。ナノボディは、基本的には、典型的な免疫グロブリンの可変領域の配列の構成と類似しており、FR1、FR2、FR3およびFR4という4個のフレームワーク領域を挟んで超可変領域である相補性決定領域(CDR)と呼ばれる3個のCDR1、CDR2およびCDR3が見られる。 A "Nanobody", also referred to as a single domain antibody, is a type of antibody fragment that consists of a single monomeric variable antibody domain and lacks the CH domain of the light chain and the heavy chain of the conventional Fab region. Nanobodies have a molecular weight of 12 to 15 kDa, which is about one-tenth that of a normal fullbody antibody with a molecular weight of 150 kDa. Despite these small molecules, Nanobodies have properties similar to fullbody antibodies. For example, an antibody consisting of V H H domain is the variable region of a single domain antibody with the camelid. Nanobodies are usually polypeptides with approximately 120 amino acid residues. Nanobodies are basically similar in composition to the sequence of the variable regions of a typical immunoglobulin and are hypervariable regions of complementarity with four framework regions of FR1, FR2, FR3 and FR4 in between. Three CDR1, CDR2 and CDR3 are seen, called determining regions (CDRs).
「遺伝子ライブラリ」とは、少なくとも2個の遺伝子を含む集団であり、集団を構成する各々の遺伝子を「遺伝子メンバー」ともいう。本発明においては、遺伝子ライブラリの集団において、遺伝子メンバーの遺伝子は各々、別個のベクター(例えばプラスミド)に組み込まれてそれぞれが独立して存在し得る。さらにこれらの遺伝子またはベクターの各々が個々の宿主細胞(例えば、酵母)に導入されて別々に存在するものであってもよい。「抗体ライブラリ」とは、少なくとも2個の抗体を含む集団であり、集団を構成する各々の抗体を「抗体メンバー」ともいう。本発明においては、抗体ライブラリの各抗体メンバーは、遺伝子ライブラリの各遺伝子メンバーの宿主細胞における発現によって得られる。抗体ライブラリの集団において、各抗体メンバーは、例えば、遺伝子ライブラリの遺伝子メンバーからの発現に用いた宿主細胞培養の上清中に遊離型抗体としてそれぞれ存在し得る。 A "gene library" is a group containing at least two genes, and each gene constituting the group is also referred to as a "gene member". In the present invention, in a population of gene libraries, each gene of a gene member can be integrated into a separate vector (eg, a plasmid) and each can exist independently. Furthermore, each of these genes or vectors may be introduced into an individual host cell (eg, yeast) and exist separately. An "antibody library" is a group containing at least two antibodies, and each antibody constituting the group is also referred to as an "antibody member". In the present invention, each antibody member of the antibody library is obtained by expression of each gene member of the gene library in a host cell. In a population of antibody libraries, each antibody member may be present as a free antibody, for example, in the supernatant of the host cell culture used for expression from a gene member of the gene library.
用語「塩基配列」とは、遺伝子における連続したヌクレオチド塩基の並びの順序であり、遺伝情報を担う。用語「アミノ酸配列」とは、ペプチドまたはタンパク質における連続したアミノ酸の並びの順序である。 The term "base sequence" is the sequence of consecutive nucleotide bases in a gene and is responsible for genetic information. The term "amino acid sequence" is the sequence of consecutive amino acids in a peptide or protein.
ペプチドまたはタンパク質を「コードする」遺伝子は、例えば、当該遺伝子が、例えば適当な調節または制御エレメントの制御下に置かれた場合に転写され(DNAの場合)、ペプチドまたはタンパク質に翻訳される(mRNAの場合)。 A gene that "encodes" a peptide or protein is, for example, transcribed (in the case of DNA) and translated into a peptide or protein (mRNA) when the gene is placed, for example, under the control of an appropriate regulatory or regulatory element. in the case of).
「ペプチドバーコード」は、ペプチドバーコードが融合された分子(例えば抗体)を同定する、かつ/または1種もしくは複数の異なる分子から区別することができる配列を有するペプチドをいう。ペプチドバーコードは、当該ペプチドバーコードが融合された抗体の抗原への結合に影響を及ぼさないように抗体に融合されており、かつそのような影響を及ぼさない大きさでありかつアミノ酸配列を有することが好ましい。本明細書において、ペプチド(例えば、ペプチドバーコード)が分子(例えば、抗体またはタグ)と「融合する」とは、当該ペプチドのC末端またはN末端に当該分子が連結されてより大きな分子を形成することをいうが、当該ペプチドと当該分子との間に、別の分子または領域(例えば切断部位)が配置されていてもよく、かつ/または1または複数個(例えば、2〜10数個)のアミノ酸が存在していてもよい。「ペプチドバーコード」は遺伝子によりコードされており、コードする遺伝子の塩基配列は、遺伝子バーコードとして機能し得る。 "Peptide barcode" refers to a peptide having a sequence that can identify the molecule (eg, antibody) to which the peptide barcode is fused and / or distinguish it from one or more different molecules. The peptide barcode is fused to the antibody so as not to affect the binding of the antibody to which the peptide barcode is fused to the antigen, and has a size and an amino acid sequence that does not affect such influence. Is preferable. As used herein, when a peptide (eg, peptide bar code) "fuse" with a molecule (eg, antibody or tag), the molecule is linked to the C-terminus or N-terminus of the peptide to form a larger molecule. However, another molecule or region (for example, a cleavage site) may be arranged between the peptide and the molecule, and / or one or more (for example, 2 to 10 or more). Amino acids may be present. The "peptide barcode" is encoded by a gene, and the base sequence of the encoding gene can function as a gene barcode.
本明細書において、「特異的結合」は、結合のパートナー同士(例えば、抗原と抗体)は互いに結合するが、所与の条件(例えば、生理学的条件)下でその環境(例えば、生体サンプル、組織)中に存在し得る他の分子とは十分または実質的に結合しないような、結合パートナー間の相互作用に基づく結合をいう。 As used herein, "specific binding" means that binding partners (eg, antigens and antibodies) bind to each other, but under given conditions (eg, physiological conditions), the environment (eg, biological sample, eg). A bond based on an interaction between binding partners that does not adequately or substantially bind to other molecules that may be present in the tissue.
(1.モノクローナル抗体の製造方法)
本発明は、モノクローナル抗体の製造方法を提供する。この製造方法は、分泌シグナルをコードする遺伝子、ナノボディをコードする遺伝子およびペプチドバーコードをコードする遺伝子を含むDNA断片または該DNA断片を含むベクターを、酵母の細胞に導入する工程(工程(A));および該細胞で発現されかつ該細胞の外に分泌された、該ナノボディおよび該ペプチドバーコードを含むポリペプチドを回収する工程(工程(B))を含む。
(1. Manufacturing method of monoclonal antibody)
The present invention provides a method for producing a monoclonal antibody. This production method is a step of introducing a DNA fragment containing a gene encoding a secretory signal, a gene encoding a nanobody and a gene encoding a peptide bar code, or a vector containing the DNA fragment into yeast cells (step (A)). ); And a step (step (B)) of recovering a polypeptide containing the nanobody and the peptide bar code expressed in the cell and secreted outside the cell.
(1−1.工程(A):酵母による分泌発現)
本発明では、酵母による分泌発現によってモノクローナル抗体を製造する。酵母は、エンドトキシンを含まず、発現により得られる抗体の精製プロセスを簡便にすることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属(Saccharomyces)、ピチア属(Pichia)、シゾサッカロマイセス属(Schizosaccharomyces)、ジゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyces)、カンジダ属(Candida)、トルロプシス属(Torulopsis)、ヤロウイア属(Yarrowia)またはハンセヌラ属(Hansenula)に属する酵母が挙げられる。例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロマイセス・ポムベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)などが挙げられる。ピチア・パストリス(Pichia pastoris)が好ましい。
(1-1. Step (A): Expression of secretion by yeast)
In the present invention, a monoclonal antibody is produced by secretory expression by yeast. Yeast is endotoxin-free and can simplify the process of purifying the antibody obtained by expression. Examples of yeast include Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Candida, Torulopsis, and Yarrowia. Alternatively, yeast belonging to the genus Hansenula can be mentioned. For example, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris and the like. Pichia pastoris is preferred.
分泌シグナルは、モノクローナル抗体を発現する宿主酵母が、当該モノクローナル酵母を細胞外に分泌させることができる限り、いかなる分泌シグナルも用いることができる。酵母による分泌発現が効率的である点で、例えば、α因子分泌シグナル(例えば、サッカロマイセス・セレビシエ由来のα因子プレプロ配列)、グルコアミラーゼ分泌シグナル(例えば、リゾプス・オリゼ(Rhizopus oryzae)由来のグルコアミラーゼの分泌シグナル)またはPHO1分泌シグナル(例えば、ピチア・パストリス由来のフォスファターゼ(PHO1)の分泌シグナル)である。 As the secretory signal, any secretory signal can be used as long as the host yeast expressing the monoclonal antibody can secrete the monoclonal yeast extracellularly. In terms of efficient yeast secretion expression, for example, α-factor secretory signal (eg, α-factor prepro sequence derived from Saccharomyces cerevisiae), glucoamylase secretory signal (eg, Rhizopus oryzae-derived glucoamylase) Secretory signal) or PHO1 secretory signal (eg, secretory signal of phosphatase (PHO1) derived from Pitia pastris).
本発明では、モノクローナル抗体は、ナノボディをコードする遺伝子を発現させることによって製造され得る。ナノボディは、抗体重鎖の単一の可変ドメイン(VHH)からなり、この可変ドメインが単一種の抗原と結合することができる。ナノボディをコードする遺伝子は、既知の塩基配列および未知の塩基配列のいずれであってもよい。ナノボディは、キメラとしたものを用いてもよい。 In the present invention, monoclonal antibodies can be produced by expressing genes encoding Nanobodies. Nanobodies consist of a single variable domain (VHH) of the antibody heavy chain, which can bind to a single antigen. The gene encoding the Nanobody may be either a known base sequence or an unknown base sequence. As the Nanobody, a chimeric one may be used.
塩基配列情報が既知である場合、当該配列情報に基づいて設計したプライマー対を用いた、入手可能なゲノムDNA、cDNAなどをテンプレートとするPCRによって、ナノボディをコードする遺伝子を取得することができる。その塩基配列を有するDNAを化学合成して人工遺伝子を作出してもよい。ナノボディをコードする遺伝子は、例えば、ラクダ科動物を含む脊椎動物の胸腺、骨髄、末梢血等の白血球から抽出したDNAから可変領域をPCRなどにより増幅させることによって得ることもできる。 When the base sequence information is known, a gene encoding a Nanobody can be obtained by PCR using available genomic DNA, cDNA, etc. as a template using a primer pair designed based on the sequence information. An artificial gene may be produced by chemically synthesizing a DNA having the base sequence. Genes encoding Nanobodies can also be obtained, for example, by amplifying variable regions from DNA extracted from leukocytes such as thymus, bone marrow, and peripheral blood of vertebrates including camelids by PCR or the like.
ナノボディをコードする遺伝子は、例えば、NNKコドンによる網羅的変異法によって種々の変異を導入してもよく、エラープローンPCRを併用することもできる。これらの方法によると、動物個体を用いることなく多様な抗体をコードする遺伝子を設計し得る。 For the gene encoding Nanobodies, for example, various mutations may be introduced by a comprehensive mutation method using NNK codons, or error prone PCR may be used in combination. According to these methods, genes encoding various antibodies can be designed without using individual animals.
上記DNA断片は、プロモーターをさらに含むことができる。分泌シグナルの上流にプロモーターが配置され得る。酵母において遺伝子発現を導くことができる任意のプロモーターを用いることができる。上記DNA断片は、プロモーターをさらに含むことができる。プロモーターは、誘導性プロモーターおよび構成的発現プロモーターのいずれでもよい。誘導性プロモーターとしては、AOX1プロモーター(アルコールオキシダーゼ(AOX)をコードする遺伝子のプロモーター)、FLD1プロモーター(ホルムアルデヒド脱水素酵素(FLD)をコードする遺伝子のプロモーター)およびPEX8プロモーター(ペルオキシン(PEX)の1つをコードする遺伝子のプロモーター)が挙げられ、そして構成的発現プロモーターとしては、例えば、GAPプロモーター(グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のプロモーター)およびYPT1プロモーターが挙げられる(これらのプロモーターはいずれもピチア・パストリス由来であり得る)。酵母がピチア・パストリスの場合、メタノール誘導性プロモーター(例えば、AOX1プロモーター、FLD1プロモーターおよびPEX8プロモーター(上記))を用いることができ、構成的発現プロモーターでもよい。メタノール誘導性プロモーターは、メタノール資化性酵母で好ましく用いられる。 The DNA fragment can further include a promoter. A promoter can be placed upstream of the secretory signal. Any promoter capable of inducing gene expression in yeast can be used. The DNA fragment can further include a promoter. The promoter may be either an inducible promoter or a constitutive expression promoter. One of the inducible promoters is the AOX1 promoter (promoter of the gene encoding alcohol oxidase (AOX)), the FLD1 promoter (promoter of the gene encoding formaldehyde dehydrogenase (FLD)), and the PEX8 promoter (peroxin (PEX)). (Promoters of genes encoding), and constitutive expression promoters include, for example, the GAP promoter (promoter of the gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) and the YPT1 promoter (these promoters). Can all be derived from Pichia pastris). When the yeast is Pichia pastris, methanol-induced promoters (eg, AOX1 promoter, FLD1 promoter and PEX8 promoter (above)) can be used and may be constitutive expression promoters. The methanol-inducible promoter is preferably used in methanol-utilizing yeast.
上記DNA断片は、タンパク質タグをコードする遺伝子をさらに含んでもよい。タンパク質タグとしては、例えば、FLAGタグ、Hisタグ、CBP(カルモジュリンプロテイン)タグ、Strepタグ、StrepIIタグ、GSTタグ、MycタグおよびMBP(マルトース結合プロテイン)タグ、ならびにそれらの組合せが挙げられる。このようなタグの付加により、酵母の細胞外に分泌されるモノクローナル抗体の回収および精製をより容易にすることができ、さらに、より高精度のペプチドバーコードの質量分析(MS)が可能となる。 The DNA fragment may further contain a gene encoding a protein tag. Examples of protein tags include FLAG tags, His tags, CBP (calmodulin protein) tags, Strep tags, StrepII tags, GST tags, Myc tags and MBP (maltose-binding protein) tags, and combinations thereof. The addition of such a tag makes it easier to recover and purify the extracellularly secreted monoclonal antibody of yeast, and further enables more accurate mass spectrometry (MS) of peptide barcodes. ..
ペプチドバーコードをコードする遺伝子の塩基配列は、以下に記載するペプチドバーコードのアミノ酸配列に基づいて作成され得る。ペプチドバーコードのアミノ酸配列は、例えば、5〜30個、好ましくは、6〜20個、より好ましくは、6〜16個、なお好ましくは、6個、7個、8個、9個または10個のアミノ酸からなる。ペプチドバーコードのアミノ酸配列がこのような長さの範囲内であることにより、イオン化効率が高くなり、質量分析によってより良好に検出および定量することができ、当該ペプチドバーコードの同定が容易となる。また、上記の長さの範囲内であれば、設計したペプチドバーコードのイオン化効率が高いことをあらかじめ検証することができ、質量分析(MS)による同定にバイアスが生じにくい。そのため、候補となるすべてのナノボディの結合能を漏れなく測定することができる。例えば、6個、7個、8個、9個または10個のアミノ酸からなるペプチドバーコードは、質量分析による高い検出感度に加え、かつバーコードが付加しているナノボディの抗原への結合能を実質的に低下させることなく、しかも多様なバーコードを作成することができ、あるいは、このようなペプチドバーコードは、ナノボディの結合能および質量分析の検出感度に実質的に影響を与えることなく、ペプチドバーコードにタンパク質タグをさらに付加することもできる。 The base sequence of the gene encoding the peptide barcode can be prepared based on the amino acid sequence of the peptide barcode described below. The amino acid sequence of the peptide barcode is, for example, 5 to 30, preferably 6 to 20, more preferably 6 to 16, still more preferably 6, 7, 8, 9 or 10. Consists of amino acids. When the amino acid sequence of the peptide barcode is within such a length range, the ionization efficiency is high, the detection and quantification can be performed better by mass spectrometry, and the peptide barcode can be easily identified. .. Further, if the length is within the above range, it can be verified in advance that the ionization efficiency of the designed peptide barcode is high, and the identification by mass spectrometry (MS) is unlikely to cause a bias. Therefore, the binding ability of all Candidate Nanobodies can be measured without omission. For example, a peptide barcode consisting of 6, 7, 8, 9 or 10 amino acids provides high detection sensitivity by mass spectrometry and the ability of the barcode-added nanobody to bind to an antigen. A wide variety of barcodes can be produced without substantial degradation, or such peptide barcodes do not substantially affect the binding capacity of the nanobody and the detection sensitivity of mass spectrometry. Further protein tags can be added to the peptide barcode.
1つの実施形態では、ペプチドバーコードを構成するアミノ酸は、独立して、アラニン(A)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、リジン(K)、ロイシン(L)、プロリン(P)、アルギニン(R)、バリン(V)およびトリプトファン(W)からなる群から選択される。これらのアミノ酸は、イオン化効率に関してイオン抑制のないアミノ酸である。例えば、リジン(K)、アルギニン(R)などのアミノ基を有する残基は正に帯電しやすく、それらはイオン化効率を高める。グリシン(G)およびプロリン(P)残基もまた、イオン化効率を高める。他方で、ヒスチジン(H)はイオン化効率を低下させ、システイン(C)およびメチオニン(M)は酸化されやすく、アスパラギン(N)、セリン(S)、およびトレオニン(T)は糖鎖付加され得るため、これらのアミノ酸は、ペプチドバーコードを構成するアミノ酸から除かれ得る。さらに、液体クロマトグラフ(LC)による溶出時間(リテンションタイム)を適度に分散させるために、疎水性のアミノ酸も含められる。1つの実施形態では、ペプチドバーコードは、A、F、G、K、L、P、R、VおよびWをランダムに配置したものが用いられる。このような種類のアミノ酸でペプチドバーコードを構成することにより、上記のアミノ酸個数(特に6個、7個、8個、9個または10個のアミノ酸)にて、イオン化効率の高いペプチドバーコードを作製することができる。このため、質量分析(MS)による同定にバイアスが生じにくく、候補となるすべてのナノボディの結合能を漏れなく測定することができる。また、ペプチドバーコードの同定に用いられる質量分析(MS)の事前の液体クロマトグラフ(LC)による分離のリテンションタイムを適度に分散させて質量分析による検出の特異度を向上させることもできる、多様なバーコードを作成することができる。 In one embodiment, the amino acids that make up the peptide barcode are independently alanine (A), phenylalanine (F), glycine (G), lysine (K), leucine (L), proline (P), arginine. It is selected from the group consisting of (R), valine (V) and tryptophan (W). These amino acids are amino acids without ion suppression in terms of ionization efficiency. For example, residues having an amino group such as lysine (K) and arginine (R) are likely to be positively charged, which enhances ionization efficiency. Glycine (G) and proline (P) residues also enhance ionization efficiency. On the other hand, histidine (H) reduces ionization efficiency, cysteine (C) and methionine (M) are easily oxidized, and asparagine (N), serine (S), and threonine (T) can be glycosylated. , These amino acids can be excluded from the amino acids that make up the peptide bar code. Further, hydrophobic amino acids are also included in order to appropriately disperse the elution time (retention time) by the liquid chromatograph (LC). In one embodiment, the peptide barcodes used are those in which A, F, G, K, L, P, R, V and W are randomly arranged. By constructing a peptide barcode with these types of amino acids, a peptide barcode having high ionization efficiency can be obtained with the above number of amino acids (particularly 6, 7, 8, 9 or 10 amino acids). Can be made. Therefore, the identification by mass spectrometry (MS) is less likely to be biased, and the binding ability of all candidate Nanobodies can be measured without omission. In addition, the retention time of separation by mass spectrometry (MS) prior liquid chromatography (LC) used for identification of peptide barcodes can be appropriately dispersed to improve the specificity of detection by mass spectrometry. Bar code can be created.
例えば、上記の種類のアミノ酸によって6個のアミノ酸からなるペプチドバーコードを作製する場合、96=531441種類のユニークバーコードを設計することができる。 For example, the case of producing a peptide bar code consisting of six amino acids by the above types of amino acids can be designed 9 6 = 531,441 different unique bar code.
DNA断片は、切断部位をコードする遺伝子を含むことができ、切断部位は、酵素または化学的手段で分解可能な部位である。以下に説明するようにペプチドバーコードの切り出しをより容易にするために、切断部位は、好ましくは、切断特異性を有するプロテアーゼによって切断が可能な部位である。切断特異性を有するプロテアーゼ(本明細書中で「特異的プロテアーゼ」ともいう)が認識するアミノ酸配列を有することが好ましい。特異的プロテアーゼとして、例えば、エンテロキナーゼが挙げられるがこれに限定されない。例えば、特異的プロテアーゼがエンテロキナーゼである場合、アミノ酸配列DDDDK(4個のアスパラギン酸−リジン)のリジンの後ろで(すなわち、上記5アミノ酸のペプチドに対してC末端側を)切断する。 The DNA fragment can contain a gene encoding a cleavage site, which is a site that can be degraded by enzymatic or chemical means. In order to facilitate excision of the peptide barcode as described below, the cleavage site is preferably a site that can be cleaved by a protease having cleavage specificity. It is preferable to have an amino acid sequence recognized by a protease having cleavage specificity (also referred to as "specific protease" in the present specification). Specific proteases include, but are not limited to, enterokinase, for example. For example, if the specific protease is enterokinase, it cleaves behind the lysine of the amino acid sequence DDDDK (4 aspartic acid-lysines) (ie, the C-terminal side of the 5 amino acid peptide above).
遺伝子の塩基配列は、宿主に応じて最適化したコドンを採用し得る。 The base sequence of the gene may adopt codons optimized according to the host.
DNA断片は、ターミネーターをさらに含み得る。ターミネーターは、酵母において機能する限り任意のターミネーターを用いることができる。一例として、AOX1ターミネーターが挙げられる。 The DNA fragment may further contain a terminator. As the terminator, any terminator can be used as long as it functions in yeast. One example is the AOX1 terminator.
各種構成要素(すなわち、各種遺伝子、プロモーターおよびターミネーター)を含むDNAの合成および結合は、当業者が通常用い得る技術で行われ得る。例えば、分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子とナノボディをコードする遺伝子との結合は、部位特異的突然変異法を用いて行うことができる。この方法を用いることにより、より正確な分泌シグナルペプチドの切断およびナノボディの発現が可能である。 The synthesis and binding of DNA containing various components (ie, various genes, promoters and terminators) can be performed by techniques commonly used by those skilled in the art. For example, binding of a gene encoding a secretory signal peptide to a gene encoding a Nanobody can be performed using a site-specific mutation method. By using this method, more accurate cleavage of the secretory signal peptide and expression of Nanobodies are possible.
上記のように構築されたDNA断片を酵母細胞に導入する。DNA断片は、ベクターに組み込まれて導入されてもよい。DNA断片の上記構成要素、例えば、プロモーターおよびターミネーター、ならびに/または分泌シグナルをコードする遺伝子は、市販の酵母発現用ベクターに予め備えられているものを用いてもよい。「導入」とは、DNA断片中の遺伝子を細胞の中に導入するだけでなく、発現させることも意味する。このような導入の方法としては、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクション、エレクトロポレーションなどの方法がある。酵母細胞への導入の場合、具体的には、例えば、酢酸リチウムを用いる方法、プロトプラスト法などがある。DNA断片の導入は、宿主の遺伝子に挿入して、または宿主の遺伝子と相同組換えを起こして染色体に取り込まれてもよい。導入のために市販のキットもまた用いることができ、宿主細胞が酵母である場合には、例えば、Frozen EZ Yeast Transformation II Kit(Zymo Research社製)が用いられる。 The DNA fragment constructed as described above is introduced into yeast cells. The DNA fragment may be incorporated into the vector and introduced. As the above-mentioned components of the DNA fragment, for example, promoters and terminators, and / or genes encoding secretory signals, those previously provided in a commercially available yeast expression vector may be used. "Introduction" means not only introducing a gene in a DNA fragment into a cell, but also expressing it. Examples of such introduction methods include transformation, transduction, transfection, cotransfection, electroporation and the like. In the case of introduction into yeast cells, specific examples include a method using lithium acetate and a protoplast method. The introduction of the DNA fragment may be inserted into the host gene or homologous recombination with the host gene to be incorporated into the chromosome. Commercially available kits can also be used for introduction, for example Frozen EZ Yeast Transformation II Kit (manufactured by Zymo Research) when the host cell is yeast.
(1−2.工程(B):分泌発現されたポリペプチドの回収)
上記の導入によって、該ナノボディおよび該ペプチドバーコードを含むポリペプチドが酵母の細胞で発現され、そして該細胞の外に分泌される。例えば、メタノール資化性であるピチア・パストリスを宿主細胞として用いる場合、例えばメタノール誘導性プロモーター(例えば、AOX1プロモーター)の下流に、分泌シグナルペプチド(例えば、α因子分泌シグナルペプチド)とペプチドバーコードを付加したナノボディとの融合タンパク質をコードする遺伝子を配置したDNA断片を含むプラスミドベクターを設計する。このようなプラスミドベクターを宿主細胞に導入して融合タンパク質を発現させると、分泌過程でα因子分泌シグナルが切断され、最終的には、ペプチドバーコードを付加したナノボディが培地上清に分泌される。培養上清の回収により、ナノボディおよび該ペプチドバーコードを含むポリペプチドを回収することができる。発現された抗体を得るために細胞を破砕する必要なく、ナノボディおよび該ペプチドバーコードを含むポリペプチドを回収することができる。当該ポリペプチド(ペプチドバーコードを付加したモノクローナル抗体)を必要に応じて培養上清から精製してもよい。
(1-2. Step (B): Recovery of secreted and expressed polypeptide)
With the above introduction, the polypeptide containing the Nanobody and the peptide barcode is expressed in yeast cells and secreted out of the cells. For example, when Pichia pastris, which is methanol-utilizing, is used as a host cell, for example, a secretory signal peptide (eg, α-factor secretory signal peptide) and a peptide bar code are placed downstream of a methanol-inducible promoter (eg, AOX1 promoter). Design a plasmid vector containing a DNA fragment containing a gene encoding a fusion protein with the added nanobody. When such a plasmid vector is introduced into a host cell to express the fusion protein, the α factor secretory signal is cleaved during the secretion process, and finally, the nanobody to which the peptide bar code is added is secreted into the medium supernatant. .. By recovering the culture supernatant, the polypeptide containing the Nanobody and the peptide barcode can be recovered. Polypeptides containing Nanobodies and the peptide barcodes can be recovered without the need to disrupt cells to obtain the expressed antibody. The polypeptide (monoclonal antibody to which a peptide barcode is added) may be purified from the culture supernatant, if necessary.
本発明の製造方法は、以下の工程をさらに含むことができる:回収されたポリペプチドを抗原と合わせ、該抗原と特異的に結合するナノボディを含むポリペプチドを取得する工程(工程(C));該取得されたポリペプチドから前記ペプチドバーコードを切り出し、該切り出されたペプチドバーコードを質量分析にて同定する工程(工程(D));および該同定されたペプチドバーコードをコードする核酸の塩基配列に基づいて、該同定されたペプチドバーコードが切り出されたポリペプチドに含まれていたナノボディを同定する工程(工程(E))。 The production method of the present invention can further include the following steps: combining the recovered polypeptide with an antigen to obtain a polypeptide containing a nanobody that specifically binds to the antigen (step (C)). The step (step (D)) of cutting out the peptide bar code from the obtained polypeptide and identifying the cut out peptide bar code by mass analysis; and the nucleic acid encoding the identified peptide bar code. A step of identifying the nanobody contained in the polypeptide from which the identified peptide bar code was cut out based on the base sequence (step (E)).
(1−3.工程(C):抗体−抗原相互作用に基づく結合)
目的の抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体をより確実に得るために、工程(B)で回収されたポリペプチドを当該抗原と合わせ、その抗原と特異的に結合するナノボディを含むポリペプチドを取得してもよい(工程(C))。上記工程(B)によって例えば培地上清を回収すると、ペプチドバーコードを付加したナノボディがこの培地上清に含まれているので、培地上清をそのまま、抗原への結合能を調べる結合アッセイに用いることができる。発現された抗体を得るために細胞を破砕する必要なく、抗体の結合能力について培地上清をそのまま測定に用いることができ、プレ精製が必要なく迅速かつ低コストで抗原への結合能力の測定が可能である。
(1-3. Step (C): Binding based on antibody-antigen interaction)
In order to more reliably obtain a monoclonal antibody that specifically binds to the target antigen, the polypeptide recovered in step (B) is combined with the antigen to obtain a polypeptide containing a nanobody that specifically binds to the antigen. May be done (step (C)). For example, when the culture medium supernatant is collected by the above step (B), Nanobodies to which the peptide barcode is added are contained in the culture medium supernatant. be able to. The medium supernatant can be used as it is for measuring the antibody binding ability without the need to disrupt cells to obtain the expressed antibody, and the antigen binding ability can be measured quickly and at low cost without the need for pre-purification. It is possible.
抗原は、免疫反応で抗体を作製できるものであればよく、特に限定されないが、例えばタンパク質、ペプチド、多糖類、脂質、低分子化合物など、生体から採取された細胞などが挙げられ、好ましくは、タンパク質である。 The antigen is not particularly limited as long as it can produce an antibody by an immune reaction, and examples thereof include cells collected from a living body such as proteins, peptides, polysaccharides, lipids, and low molecular weight compounds, and preferably. It is a protein.
抗原は、担体に固定され得る。そのような担体として、磁気ビーズ(例えば、NHS活性化磁気ビーズ(Thermo Scientific社製))を用いることができる)。例えば、抗原を表層提示する細胞(例えば酵母)を用いることもできる。また、セルソーター(FCS)の利用も可能である。このような抗原−抗体間の結合のための結合アッセイの方法および条件は、当業者が通常用いる方法によって行うことができる。例えば、抗原を固定した磁気ビーズを用いる場合、抗原と抗体との結合反応を行った後に適当な溶剤でこのビーズを洗浄することにより、抗原に結合していない抗体を含むポリペプチドを洗い流し、ビーズ上で抗原に結合している抗体を含むポリペプチドを残すことができる。 The antigen can be immobilized on a carrier. As such a carrier, magnetic beads (for example, NHS activated magnetic beads (manufactured by Thermo Scientific)) can be used). For example, cells that present the antigen on the surface (for example, yeast) can also be used. It is also possible to use a cell sorter (FCS). The methods and conditions of the binding assay for such antigen-antibody binding can be performed by methods commonly used by those skilled in the art. For example, when magnetic beads on which an antigen is immobilized are used, the polypeptide containing the antibody that is not bound to the antigen is washed away by washing the beads with an appropriate solvent after the binding reaction between the antigen and the antibody. Polypeptides containing antibodies bound to the antigen above can be left behind.
抗原への結合能力を調べるために、例えば、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイもまた用いることができる。このようなアッセイは、例えば、Biacore T-200(GE Healthcare社製)を用いた速度論パラメータの測定によって行うことができる。 Assays based on surface plasmon resonance can also be used, for example, to determine the ability to bind antigen. Such an assay can be performed, for example, by measuring kinetic parameters using a Biacore T-200 (manufactured by GE Healthcare).
(1−4.工程(D):ペプチドバーコードの同定)
抗原への結合が確認された抗体を同定および/または取得するために、工程(C)においてナノボディが抗原に結合したポリペプチドからペプチドバーコードを切り出し、該切り出されたペプチドバーコードを質量分析にて同定することができる(工程(D))。
(1-4. Step (D): Identification of peptide barcode)
In order to identify and / or obtain an antibody whose binding to an antigen has been confirmed, a peptide barcode is excised from a polypeptide in which Nanobodies are bound to the antigen in step (C), and the excised peptide barcode is subjected to mass spectrometry. Can be identified (step (D)).
ナノボディが抗原に結合したポリペプチドから、該ポリペプチドにナノボディと共に含まれるペプチドバーコードを切り出す。このようなペプチドバーコードの切り出しは、例えば、切断部位を認識する酵素を添加して、ポリペプチドの切断部位で切断することによって行われる。好ましくは、特異的プロテアーゼ(例えば、エンテロキナーゼ)が用いられる。これにより、抗原に結合した抗体が残り、ペプチドバーコードが切り離される。この切り離されたペプチドバーコードを回収し得る。 From a polypeptide in which Nanobodies are bound to an antigen, a peptide barcode contained in the polypeptide together with Nanobodies is cut out. Cutting out such a peptide barcode is performed, for example, by adding an enzyme that recognizes the cleavage site and cleaving at the cleavage site of the polypeptide. Preferably, a specific protease (eg, enterokinase) is used. This leaves the antibody bound to the antigen and cleaves the peptide barcode. This detached peptide barcode can be recovered.
次いで、切り出されたペプチドバーコードを質量分析にて同定する。例えば、質量分析で検出されたピークに基づいて決定された分子量と、ペプチドバーコードの構成(アミノ酸配列)によって推定される分子量とを対比して、ペプチドバーコードを同定することができる。 The excised peptide barcode is then identified by mass spectrometry. For example, a peptide barcode can be identified by comparing the molecular weight determined based on the peak detected by mass spectrometry with the molecular weight estimated by the composition of the peptide barcode (amino acid sequence).
このような質量分析のために、例えば、高速液体クロマトグラフ(LC)に接続した質量分析計(MS)またはタンデム質量分析計(MS/MS)を用いることができる(すなわち、LC−MS法またはLC−MS/MS法)。検出の特異度が上がる点で、LC−MS/MS法が好ましい。タンデム質量分析計としては、トリプル四重極型質量分析計(例えば、LCMS−8060:株式会社島津製作所製)が、感度が高く、特異的でありかつ定量的である点で好ましい。MS/MSの測定法としては、好ましくは、選択反応モニタリング(SRM:特定のm/zの前駆イオンを解離させて生じる特定のm/zのプロダクトイオンを検出する方法)が用いられる。 For such mass spectrometry, for example, a mass spectrometer (MS) or tandem mass spectrometer (MS / MS) connected to a high speed liquid chromatograph (LC) can be used (ie, LC-MS method or LC-MS / MS method). The LC-MS / MS method is preferable in that the specificity of detection is increased. As the tandem mass spectrometer, a triple quadrupole mass spectrometer (for example, LCMS-8060: manufactured by Shimadzu Corporation) is preferable in that it has high sensitivity, is specific, and is quantitative. As the method for measuring MS / MS, selective reaction monitoring (SRM: a method for detecting a specific m / z product ion generated by dissociating a specific m / z precursor ion) is preferably used.
液体クロマトグラフ(LC)のカラムとして、例えば、モノリスカラム、好ましくは、ロング型モノリスカラムが用いられる。モノリスカラムは、2種類の大きさの細孔(メソ孔・マクロ孔)を有した棒形状(ロッド)の液体クロマトグラフィー用一体型カラムであり、分離剤としてモノリスシリカゲルが用いられる。ロング型とは、カラムの長さが、例えば、100mm〜10000mmであるモノリスカラムをいう。モノリスカラムの内径は、例えば、1μm〜200μmであり、好ましくは、30μm〜75μmである。ロング型であること、さらに好ましくは上記のような範囲内の内径であることにより、カラムの分離能力が高くなり、ペプチドバーコードの検出をより効率的に行うことができ同定が容易となる。またロング型モノリスカラムを用いることにより、SRMによってペプチドの絶対定量を行うこともできる。 As the column of the liquid chromatograph (LC), for example, a monolith column, preferably a long type monolith column is used. The monolith column is a rod-shaped integrated column for liquid chromatography having pores (mesopores and macropores) of two sizes, and monolith silica gel is used as a separating agent. The long type refers to a monolith column having a column length of, for example, 100 mm to 10000 mm. The inner diameter of the monolith column is, for example, 1 μm to 200 μm, preferably 30 μm to 75 μm. The long type, more preferably the inner diameter within the above range, enhances the column separation ability, enables more efficient detection of peptide barcodes, and facilitates identification. Further, by using a long monolith column, absolute quantification of peptides can be performed by SRM.
(1−5.工程(E):モノクローナル抗体の同定)
上記のように同定されたペプチドバーコードをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて、該同定されたペプチドバーコードを含むポリペプチドに含まれる抗体を同定することができる(工程(E))。
(1-5. Step (E): Identification of monoclonal antibody)
Based on the base sequence of the gene encoding the peptide barcode identified as described above, the antibody contained in the polypeptide containing the identified peptide barcode can be identified (step (E)).
質量分析によりペプチドバーコードが同定されると、そのペプチドバーコードをコードする遺伝子の塩基配列から、そのペプチドバーコードを付加したナノボディを推定し得る。そのように推定したナノボディの塩基配列情報を取得し、ナノボディを同定することができる。例えば、ナノボディをコードする遺伝子として未知の塩基配列を用いた場合では、ナノボディをコードする遺伝子の塩基配列取得のために、上記DNA断片の塩基配列を決定する工程を本発明の製造方法にさらに含めてもよい。このような塩基配列の決定には、当業者が通常用いる方法を用いることができる。 When the peptide barcode is identified by mass spectrometry, the nanobody to which the peptide barcode is added can be estimated from the base sequence of the gene encoding the peptide barcode. The base sequence information of the Nanobody estimated in this way can be acquired, and the Nanobody can be identified. For example, when an unknown base sequence is used as a gene encoding a Nanobody, the production method of the present invention further includes a step of determining the base sequence of the DNA fragment in order to obtain the base sequence of the gene encoding the Nanobody. You may. A method usually used by those skilled in the art can be used for determining such a base sequence.
このようにして、目的の抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を同定することができる。 In this way, a monoclonal antibody that specifically binds to the antigen of interest can be identified.
さらに、同定されたモノクローナル抗体をコードする遺伝子の発現により当該抗体を取得することもできる。例えば、同定された抗体をコードする核酸の塩基配列情報からプライマー対を設計し、これを用いるPCRによって抗体をコードする核酸を取得する。このような核酸を用いて上記のように発現ベクターを構築し、この発現ベクターを宿主細胞に導入し、発現された抗体を取得することができる。このようなモノクローナル抗体の発現のために、好ましくは、上述したような酵母による分泌発現が用いられる。 Furthermore, the antibody can also be obtained by expressing a gene encoding the identified monoclonal antibody. For example, a primer pair is designed from the base sequence information of the nucleic acid encoding the identified antibody, and the nucleic acid encoding the antibody is obtained by PCR using the primer pair. An expression vector can be constructed using such a nucleic acid as described above, and the expression vector can be introduced into a host cell to obtain an expressed antibody. For the expression of such a monoclonal antibody, preferably secretory expression by yeast as described above is used.
本発明の製造方法においては、2個以上のDNA断片を用いることもできる。この場合、上記酵母の細胞に導入する工程(工程(A))が、少なくとも2つの前記DNA断片またはベクターを酵母細胞に導入する工程であり、各DNA断片中のペプチドバーコードをコードする遺伝子は、それぞれ異なるアミノ酸配列で表されるペプチドバーコードをコードする。2個以上のDNA断片を用いる場合は、各DNA断片中のペプチドバーコードのアミノ酸配列を異なるものとすることにより、工程(D)の質量分析によって検出されるペプチドバーコードを識別することができる。 In the production method of the present invention, two or more DNA fragments can also be used. In this case, the step of introducing into the yeast cell (step (A)) is the step of introducing at least two of the DNA fragments or vectors into yeast cells, and the gene encoding the peptide barcode in each DNA fragment is , Each encode a peptide bar code represented by a different amino acid sequence. When two or more DNA fragments are used, the peptide barcode detected by mass spectrometry in step (D) can be identified by differentiating the amino acid sequences of the peptide barcodes in each DNA fragment. ..
また、1つのDNA断片が、2個以上のペプチドバーコードをコードする遺伝子を含んでいてもよい。この場合、1つのDNA断片によってコードされるナノボディに対し、該2個以上のペプチドバーコードがタンデムに配置され得る。その2つ以上のペプチドバーコードの間に切断部位が配置され得る。例えば、2個以上のペプチドバーコードをタンデムに並べ、それぞれの間に特異的プロテアーゼ切断配列を配置することで、ペプチドバーコードの多様性を増加させることができる。例えば、NH2−[ナノボディ]−切断部位−[ペプチドバーコードA]−切断部位−[ペプチドバーコードB]−COOHというポリペプチドの配列でライブラリを構築するとした場合、COOH末端に近いものをペプチドバーコードB、NH2末端に近いものをペプチドバーコードAと名付けるとき、ペプチドバーコードの位置を識別できるように、ペプチドバーコードの末端(C末端またはN末端のいずれであってもよい)に識別子となるアミノ酸を各ペプチドバーコードで異なるように1つ追加する。識別子のアミノ酸として、A、F、G、K、L、P、R、VおよびWのいずれも用いることができる。例えば、ペプチドバーコードAのC末端にK(リジン)、ペプチドバーコードBのC末端にR(アルギニン)を付加するようにすれば、それぞれのペプチドバーコードがペプチドバーコードA由来かペプチドバーコードB由来かを質量分析で区別できるようになる。この場合、2種類のペプチドバーコードをタンデムに並べると、(96)2=5314412種類の多様性を評価できるようになる。3種類のペプチドバーコードをタンデムに並べれば、(96)3=5314413種類の多様性を評価可能である。4種類以上のペプチドバーコードのタンデム化も可能であるため、定量可能なナノボディライブラリのサイズは高くなる。 Also, one DNA fragment may contain genes encoding two or more peptide barcodes. In this case, the two or more peptide barcodes can be arranged in tandem for Nanobodies encoded by one DNA fragment. A cleavage site can be placed between the two or more peptide barcodes. For example, the diversity of peptide barcodes can be increased by arranging two or more peptide barcodes in tandem and placing a specific protease cleavage sequence between them. For example, when a library is constructed with a polypeptide sequence of NH 2- [nanobody] -cleaved site- [peptide bar code A] -cleaved site- [peptide bar code B] -COOH, the peptide near the COOH terminal is used. When naming a peptide bar code A that is close to the bar code B or NH 2 terminal, the end of the peptide bar code (which may be either the C-terminal or the N-terminal) is used so that the position of the peptide bar code can be identified. One amino acid as an identifier is added so as to be different for each peptide bar code. Any of A, F, G, K, L, P, R, V and W can be used as the amino acid of the identifier. For example, if K (lysine) is added to the C-terminal of peptide barcode A and R (arginine) is added to the C-terminal of peptide barcode B, each peptide barcode is derived from peptide barcode A or peptide barcode. It becomes possible to distinguish whether it is derived from B by mass analysis. In this case, when arranging two peptides bar code in tandem, it becomes possible to evaluate (9 6) 2 = 531 441 2 types of diversity. If we lined three peptides bar code in tandem, it is possible to assess (9 6) 3 = 531441 three diversity. Since it is possible to tandemize four or more types of peptide barcodes, the size of the quantifiable nanobody library is increased.
(2.モノクローナル抗体を酵母で製造するためのベクター)
本発明は、モノクローナル抗体を酵母で製造するためのベクターをさらに提供する。本発明のベクターは、上記DNA断片を含む。DNA断片の構成要素(上述したような、分泌シグナルをコードする遺伝子、ナノボディをコードする遺伝子およびペプチドバーコードをコードする遺伝子、ならびにプロモーター、タンパク質タグをコードする遺伝子、切断部位をコードする遺伝子、およびターミネーター)は、上述したとおりである。
(2. Vector for producing monoclonal antibody in yeast)
The present invention further provides a vector for producing a monoclonal antibody in yeast. The vector of the present invention contains the above DNA fragment. Components of the DNA fragment (as described above, genes encoding secretory signals, genes encoding nanobodies and peptides barcodes, and promoters, genes encoding protein tags, genes encoding cleavage sites, and genes. The terminator) is as described above.
ベクターは、選択マーカー、複製起点、エンハンサー等の因子を適宜含み得る。ベクターは、例えば、プラスミドの形態である。例えば、酵母のColE1の複製起点を有するプラスミドが好適に用いられる。プラスミドは、プラスミドの調製および形質転換体の検出を容易にする点で、選択マーカーを有することが好ましい。選択マーカーとしては、例えば、薬剤耐性遺伝子および栄養要求性遺伝子が挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子(Ampr)、およびカナマイシン耐性遺伝子(Kanr)が挙げられるが、特に限定されない。栄養要求性遺伝子としては、例えば、N−(5'−ホスホリボシル)アントラニル酸イソメラーゼ(TRP1)遺伝子、トリプトファンシンターゼ(TRP5)遺伝子、リンゴ酸β−イソプロピル脱水素酵素(LEU2)遺伝子、イミダゾールグリセロールリン酸脱水素酵素(HIS3)遺伝子、ヒスチジノール脱水素酵素(HIS4)遺伝子、ジヒドロオロト酸脱水素酵素(URA1)遺伝子、およびオロチジン−5−リン酸デカルボキシラーゼ(URA3)遺伝子が挙げられるが、特に限定されない。酵母用の複製遺伝子は必要に応じて選択され得る。 The vector may optionally include factors such as selectable markers, origins of replication, enhancers and the like. The vector is, for example, in the form of a plasmid. For example, a plasmid having an origin of replication of yeast ColE1 is preferably used. The plasmid preferably has a selectable marker in that it facilitates plasmid preparation and detection of transformants. Selectable markers include, for example, drug resistance genes and auxotrophic genes. Examples of the drug resistance gene include, but are not limited to, an ampicillin resistance gene (Ampr) and a kanamycin resistance gene (Kanr). Examples of the nutritionally demanding gene include N- (5'-phosphoribosyl) anthranilate isomerase (TRP1) gene, tryptophan synthase (TRP5) gene, malate β-isopropyl dehydrogenase (LEU2) gene, and imidazole glycerol phosphate dehydration. Examples thereof include, but are not limited to, the elementary enzyme (HIS3) gene, histidineol dehydrogenase (HIS4) gene, dihydroorotoic acid dehydrogenase (URA1) gene, and orotidine-5-phosphate decarboxylase (URA3) gene. The replication gene for yeast can be selected as needed.
(3.モノクローナル抗体をスクリーニングする方法)
本発明は、モノクローナル抗体をスクリーニングする方法もまた提供する。この方法は、(i)遺伝子ライブラリから抗体ライブラリを発現する工程であって、
該遺伝子ライブラリが少なくとも2つの遺伝子メンバーを含み、各遺伝子メンバーが、ナノボディをコードする遺伝子および少なくとも1つのペプチドバーコードをコードする遺伝子を含むDNA断片を含み、
該遺伝子ライブラリの各遺伝子メンバーの該DNA断片が、該抗体ライブラリの各抗体メンバーのポリペプチドをコードし、
該抗体ライブラリの各抗体メンバーの該ポリペプチドが、ナノボディおよび少なくとも1つのペプチドバーコードを含み、該ナノボディおよび該少なくとも1つのペプチドバーコードが、該遺伝子ライブラリの各遺伝子メンバーに含まれるDNA断片によりコードされ、
該抗体メンバーの各ペプチドバーコードが、それぞれ異なるアミノ酸配列で表される、
工程;
(ii)該抗体ライブラリを抗原と合わせ、該抗体ライブラリから、該抗原に結合したナノボディを含む該抗体ライブラリの抗体メンバーを選択する工程;
(iii)選択した該抗体ライブラリの抗体メンバーに含まれるペプチドバーコードを切り出し、該切り出されたペプチドバーコードを質量分析にて同定する工程;および
(iv)該同定されたペプチドバーコードをコードする遺伝子の塩基配列を該遺伝子ライブラリの塩基配列に基づいて決定し、該同定されたペプチドバーコードが切り出された抗体メンバーのナノボディを同定する工程
を含む。上記発現工程(工程(i))は、上記「2.モノクローナル抗体を酵母で製造するためのベクター」に説明したようなベクターを、酵母の細胞に導入することにより行われる。
(3. Method for screening monoclonal antibodies)
The present invention also provides a method of screening for monoclonal antibodies. This method is (i) a step of expressing an antibody library from a gene library.
The gene library contains at least two gene members, each gene member containing a DNA fragment containing a gene encoding a Nanobody and a gene encoding at least one peptide barcode.
The DNA fragment of each gene member of the gene library encodes the polypeptide of each antibody member of the antibody library.
The polypeptide of each antibody member of the antibody library comprises a Nanobody and at least one peptide barcode, and the Nanobody and the at least one peptide barcode are encoded by a DNA fragment contained in each gene member of the gene library. Being done
Each peptide barcode of the antibody member is represented by a different amino acid sequence.
Process;
(Ii) A step of combining the antibody library with an antigen and selecting an antibody member of the antibody library containing a Nanobody bound to the antigen from the antibody library;
(Iii) A step of cutting out a peptide bar code contained in an antibody member of the selected antibody library and identifying the cut out peptide bar code by mass analysis; and (iv) encoding the identified peptide bar code. The base sequence of the gene is determined based on the base sequence of the gene library, and the step of identifying the nanobody of the antibody member from which the identified peptide barcode has been cut out is included. The expression step (step (i)) is carried out by introducing a vector as described in "2. Vector for producing a monoclonal antibody in yeast" into yeast cells.
(3−1.工程(i):遺伝子ライブラリの発現)
本発明によれば、複数種のナノボディを一度に発現させることにより、目的の抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を選択して、同定することもできる。このために、遺伝子ライブラリを作成し得る。遺伝子ライブラリは少なくとも2つの遺伝子メンバーを含み、各遺伝子メンバーが、ナノボディをコードする遺伝子および少なくとも1個のペプチドバーコードをコードする遺伝子を含むDNA断片を含む。このDNA断片は上述したように構築し、必要に応じてベクターに組み込み得る。
(3-1. Step (i): Expression of gene library)
According to the present invention, a monoclonal antibody that specifically binds to a target antigen can be selected and identified by expressing a plurality of types of Nanobodies at one time. For this, a gene library can be created. The gene library contains at least two gene members, each gene member containing a DNA fragment containing a gene encoding a Nanobody and a gene encoding at least one peptide barcode. This DNA fragment can be constructed as described above and incorporated into the vector if desired.
上記遺伝子ライブラリの各遺伝子メンバーのDNA断片は、抗体ライブラリの各抗体メンバーのポリペプチドをコードする。したがって、抗体ライブラリの各抗体メンバーのポリペプチドは、ナノボディおよび少なくとも1つのペプチドバーコードを含む。各抗体メンバーのナノボディおよび少なくとも1個のペプチドバーコードは、遺伝子ライブラリの各遺伝子メンバーに含まれるDNA断片によりコードされる。 The DNA fragment of each gene member of the above gene library encodes the polypeptide of each antibody member of the antibody library. Thus, the polypeptide of each antibody member of the antibody library contains Nanobodies and at least one peptide barcode. The Nanobodies of each antibody member and at least one peptide barcode are encoded by the DNA fragments contained in each gene member of the gene library.
抗体ライブラリの各抗体メンバーのペプチドバーコードは、それぞれ異なるアミノ酸配列により表される。抗体ライブラリの抗体メンバーは、ランダム化された抗体にユニークな(唯一の)ペプチドバーコードが付加しており、遺伝子ライブラリの遺伝子メンバーは、ランダム化された抗体の遺伝子(抗体をコードする核酸)に対し、ユニークなペプチドバーコードをコードする遺伝子(核酸(例えばDNA))(よって、ユニークなDNAバーコードとなる)が付加されている。これにより、遺伝子ライブラリ中のランダム化された抗体の遺伝子とDNAバーコード、ならびにランダム化された抗体とペプチドバーコードとが1:1の対応関係にある。抗体ライブラリの各抗体メンバーのペプチドバーコードは、質量分析によって効率的に検出することができる。抗体メンバー毎にペプチドバーコードのアミノ酸配列が異なることにより、ペプチドバーコードをコードする核酸(DNAバーコード)の塩基配列が異なる。各抗体メンバーのペプチドバーコードのアミノ酸配列は、質量分析による同定で用いられ得る液体クロマトグラフ(LC)−タンデム質量分析(MS/MS)において、LCによる分離で異なるリテンションタイムを得ることができるように設計され得、さらにその設計されたアミノ酸配列をコードするように遺伝子の塩基配列が設計され得る。 The peptide barcode of each antibody member of the antibody library is represented by a different amino acid sequence. The antibody members of the antibody library have a unique (unique) peptide bar code added to the randomized antibody, and the gene members of the gene library are the genes of the randomized antibody (nucleic acid encoding the antibody). On the other hand, a gene encoding a unique peptide bar code (nucleic acid (for example, DNA)) (hence, a unique DNA bar code) is added. As a result, there is a 1: 1 correspondence between the randomized antibody gene and the DNA barcode in the gene library, and the randomized antibody and the peptide barcode. The peptide barcodes of each antibody member of the antibody library can be efficiently detected by mass spectrometry. Since the amino acid sequence of the peptide barcode is different for each antibody member, the base sequence of the nucleic acid (DNA barcode) encoding the peptide barcode is different. The amino acid sequence of the peptide barcode of each antibody member can be used for identification by mass spectrometry so that different retention times can be obtained by separation by LC in liquid chromatography (LC) -tandem mass spectrometry (MS / MS). The base sequence of the gene can be designed to encode the designed amino acid sequence.
よって、DNAバーコードの塩基配列情報を得ることができると、当該DNAバーコードが付加された抗体遺伝子(抗体をコードする核酸)の塩基配列を決定することができる。核酸ライブラリにおいては、各核酸メンバーのペプチドバーコードをコードする核酸はいずれも異なるが、抗体については重複していてもよい(言い換えれば、1種の抗体に対し、1種または複数種類(例えば、2〜10種類)のペプチドバーコードが付加されてもよい)。これにより、ある核酸メンバーの発現がうまくいかない場合や、ペプチドバーコードが付加された抗体が何らかの原因で質量分析前に喪失されてしまう場合に備えることができる。 Therefore, if the base sequence information of the DNA barcode can be obtained, the base sequence of the antibody gene (nucleic acid encoding the antibody) to which the DNA barcode is added can be determined. In the nucleic acid library, the nucleic acids encoding the peptide barcodes of each nucleic acid member are all different, but the antibodies may be duplicated (in other words, one or more kinds (for example, one kind) for one kind of antibody. 2 to 10 types of peptide barcodes) may be added). This makes it possible to prepare for cases where the expression of a certain nucleic acid member is not successful, or where the antibody to which the peptide barcode is added is lost before mass spectrometry for some reason.
1つの実施形態では、抗体ライブラリの抗体メンバーは、2個以上のペプチドバーコードを含み、かつ2個以上のペプチドバーコードの間に切断部位が配置されている。ペプチドバーコードおよび切断部位は、上述したとおりである。2個以上のペプチドバーコードをタンデムに並べることにより、バーコードの組合せをより増大することができ、例えば、哺乳動物に見られる程度の多様性またはより多くの多様性を現出することができる。 In one embodiment, the antibody member of the antibody library comprises two or more peptide barcodes and the cleavage site is located between the two or more peptide barcodes. The peptide barcode and cleavage site are as described above. By arranging two or more peptide barcodes in tandem, the combination of barcodes can be increased, for example, the degree of diversity found in mammals or more diversity can be manifested. ..
遺伝子ライブラリに含まれる遺伝子メンバーの数としては、少なくとも2個以上であればよいが、例えば、2〜108個、好ましくは102〜107個、または103〜106個である。このような範囲内の遺伝子メンバー数であれば、遺伝子ライブラリの塩基配列の取得および/または抗原特異的結合に基づく一斉結合アッセイの実施をより効率的に行うことができる。 The number of gene members contained in the gene library may be at least 2 or more, and is, for example, 2 to 8 pieces, preferably 10 2 to 10 7 pieces, or 10 3 to 6 pieces. With the number of gene members within such a range, acquisition of the base sequence of the gene library and / or simultaneous binding assay based on antigen-specific binding can be performed more efficiently.
遺伝子ライブラリは、抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体のスクリーニングに際し、新たに配列を設計して構築してもよく、あるいは既存の配列情報を利用して予め調製したものを用いてもよい。 As the gene library, a new sequence may be designed and constructed when screening a monoclonal antibody that specifically binds to an antigen, or a gene library prepared in advance using existing sequence information may be used.
遺伝子ライブラリからの抗体ライブラリの発現は、上記のモノクローナル抗体の製造方法およびベクターに関して説明したとおりである。すなわち、遺伝子ライブラリの各遺伝子メンバーのDNA断片を酵母の細胞に導入し、ナノボディおよびペプチドバーコードを酵母から分泌発現させる。この酵母による分泌発現のために、上述したベクターが用いられる。 The expression of the antibody library from the gene library is as described above for the method for producing the monoclonal antibody and the vector. That is, DNA fragments of each gene member of the gene library are introduced into yeast cells, and nanobody and peptide barcodes are secreted and expressed from yeast. The above-mentioned vector is used for the expression of secretion by this yeast.
(3−2.工程(ii):抗原結合抗体メンバーの選択)
本発明のスクリーニング方法においては、抗体ライブラリを抗原と合わせ、該抗体ライブラリから、該抗原に結合した抗体を含む該抗体ライブラリの抗体メンバーを選択する(工程(ii))。この工程では、目的の抗原への結合に関して、抗体ライブラリをスクリーニングに供する。上記工程(i)の酵母細胞への導入後、酵母による分泌発現のため培地上清に抗体ライブラリの各抗体メンバー(ペプチドバーコードを付加したナノボディ)が含まれている。よって、抗体ライブラリを抗原と合わせるために、培地上清をそのまま当該抗原に対して添加してもよい。必要に応じて、培地上清からポリペプチドを精製した後、抗原に対して添加してもよい。この工程(ii)は、基本的に、上記の「工程(C):抗体−抗原相互作用に基づく結合」(工程(C))と同様にして行うことができる。好ましくは、抗原に対して、抗体ライブラリの抗体メンバーを一斉に添加する一斉結合アッセイが用いられる。
(3-2. Step (ii): Selection of antigen-binding antibody members)
In the screening method of the present invention, an antibody library is combined with an antigen, and an antibody member of the antibody library containing an antibody bound to the antigen is selected from the antibody library (step (ii)). In this step, the antibody library is screened for binding to the antigen of interest. After introduction into yeast cells in step (i) above, each antibody member of the antibody library (Nanobody to which a peptide barcode is added) is contained in the culture medium supernatant for the expression of secretion by yeast. Therefore, in order to combine the antibody library with the antigen, the culture medium supernatant may be added to the antigen as it is. If necessary, the polypeptide may be purified from the culture medium supernatant and then added to the antigen. This step (ii) can be basically performed in the same manner as the above-mentioned "step (C): binding based on antibody-antigen interaction" (step (C)). Preferably, a simultaneous binding assay is used in which antibody members of the antibody library are added all at once to the antigen.
(3−3.工程(iii):ペプチドバーコードの同定)
本発明のスクリーニング方法においては、選択した該抗体ライブラリの抗体メンバーに含まれるペプチドバーコードを切り出し、該切り出されたペプチドバーコードを質量分析にて同定する(工程(iii))。この工程(iii)は、基本的に、上記の「工程(D):ペプチドバーコードの同定」と同様にして行うことができる。
(3-3. Step (iii): Identification of peptide barcode)
In the screening method of the present invention, a peptide barcode contained in an antibody member of the selected antibody library is cut out, and the cut out peptide barcode is identified by mass spectrometry (step (iii)). This step (iii) can be basically performed in the same manner as the above-mentioned "Step (D): Identification of peptide barcode".
(3−4.工程(iv):モノクローナル抗体の同定)
本発明のスクリーニング方法においては、該同定されたペプチドバーコードをコードする遺伝子の塩基配列を該遺伝子ライブラリの塩基配列に基づいて決定し、該同定されたペプチドバーコードが切り出された抗体メンバーのナノボディを同定する(工程(iv))。この工程(iv)は、基本的に、上記の「工程(E):モノクローナル抗体の同定」と同様にして行うことができる。
(3-4. Step (iv): Identification of monoclonal antibody)
In the screening method of the present invention, the nucleotide sequence of the gene encoding the identified peptide barcode is determined based on the nucleotide sequence of the gene library, and the identified peptide barcode is excised from the antibody member Nanobody. (Step (iv)). This step (iv) can be basically performed in the same manner as the above-mentioned "Step (E): Identification of monoclonal antibody".
遺伝子ライブラリが、塩基配列が未知の核酸を含む場合やペプチドバーコードと抗体との組合せが不明の場合、当該遺伝子ライブラリの塩基配列を取得する工程をさらに含み得る。 When the gene library contains a nucleic acid whose base sequence is unknown or the combination of the peptide barcode and the antibody is unknown, the step of obtaining the base sequence of the gene library may be further included.
遺伝子ライブラリの塩基配列の取得は、遺伝子ライブラリを大規模配列解析によって行うことができる。大規模配列解析は、当業者が通常用いる方法に従ってすることができ、例えば、大量の塩基配列情報を処理できるDNAシーケンサーを用いて行うことができる。大規模配列解析のために、例えば、例えば、MiSeq(illumina社製)のような次世代シーケンサー(NGS)を用いることができる。 The base sequence of the gene library can be obtained by large-scale sequence analysis of the gene library. Large-scale sequence analysis can be performed according to a method usually used by those skilled in the art, for example, using a DNA sequencer capable of processing a large amount of base sequence information. For large-scale sequence analysis, for example, a next-generation sequencer (NGS) such as MiSeq (manufactured by Illumina) can be used.
塩基配列の情報を用いてデータベースを作成してもよい。このようなデータベースは、質量分析によるペプチドバーコードの同定後に、同定されたペプチドバーコードを含む抗体ライブラリのメンバーをコードする核酸の塩基配列情報(ペプチドバーコードをコードする遺伝子および抗体をコードする遺伝子を含む)、必要に応じて当該塩基配列情報から推定されるアミノ酸配列(ペプチドバーコードおよび抗体を含む)の配列情報から抗体を同定するために用いることができる。 A database may be created using the information of the base sequence. After identification of the peptide bar code by mass analysis, such a database contains the nucleotide sequence information of the nucleic acid encoding the member of the antibody library containing the identified peptide bar code (gene encoding the peptide bar code and the gene encoding the antibody). Can be used to identify the antibody from the sequence information of the amino acid sequence (including the peptide barcode and the antibody) deduced from the base sequence information, if necessary.
さらに、本発明について、図1を用いて説明する。 Further, the present invention will be described with reference to FIG.
図1は、本発明における酵母による分泌発現で製造したペプチドバーコード付加ナノボディの抗原−抗体相互作用に基づく結合の解析の一例を示す模式図である。図1に関して、(a)ランダム化されたナノボディ遺伝子(ナノボディをコードする遺伝子)のそれぞれに対してユニークなDNAバーコード(ペプチドバーコードをコードする遺伝子)が付加された、少なくとも2個の遺伝子メンバーを含む遺伝子ライブラリを提供し、この各遺伝子メンバーを酵母細胞に導入する;(b)酵母細胞での発現によりそれぞれのペプチドバーコードが付加された抗体(ナノボディ)を含む抗体メンバーが生成され、抗体ライブラリを構成し、この抗体ライブラリの各抗体メンバーは酵母細胞から培地上清に分泌される;(c)この抗体ライブラリの各抗体メンバーを一斉に抗原と合わせて、抗原に対して結合させる;(d)洗浄し、非結合抗体を含む抗体メンバーを除去し、抗原に結合した抗体を含む抗体メンバーを残し、選択する;(e)エンテロキナーゼによって、選択された抗体メンバーからペプチドバーコードを切り出す;そして(f)切り出されたペプチドバーコードを質量分析で同定する。 FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of analysis of binding based on an antigen-antibody interaction of a peptide barcode-added Nanobody produced by secretory expression by yeast in the present invention. With respect to FIG. 1, (a) at least two gene members to which a unique DNA bar code (gene encoding peptide bar code) is added to each of the randomized nanobody genes (genes encoding nanobodies). A gene library containing the above is provided, and each of these gene members is introduced into yeast cells; (b) Expression in yeast cells produces antibody members containing antibodies (nanobodies) to which the respective peptide barcodes have been added, and antibodies are produced. Constituting the library, each antibody member of this antibody library is secreted from yeast cells into the supernatant of the medium; (c) each antibody member of this antibody library is combined with the antigen and bound to the antigen; ( d) Wash, remove antibody members containing unbound antibody, leave and select antibody members containing antibody bound to the antigen; (e) Cut out peptide barcodes from the selected antibody members by enterokinase; Then, (f) the excised peptide bar code is identified by mass analysis.
図1(a)の遺伝子ライブラリからの配列情報に基づき、ランダム化された抗体遺伝子の塩基配列と、DNAバーコード(ペプチドバーコードをコードする遺伝子)の塩基配列の1:1の対応関係を決定することができ、ランダム化された抗体のアミノ酸配列(当該抗体遺伝子の塩基配列によりコードされる)と、ペプチドバーコードのアミノ酸配列の対応関係を演繹的に調べることができる。上記(b)〜(f)によって、抗体ライブラリから抗原に対して結合した抗体を含む抗体メンバーを選択し、選択した抗体メンバーからペプチドバーコードを切り出し、切り出したペプチドバーコードが質量分析で同定されると、核酸ライブラリの既知の配列情報または配列解析で得られた配列情報と併せて、この同定したペプチドバーコードを含む抗体メンバーをコードする遺伝子の塩基配列を求め、どの抗体が抗原に特異的に結合したかを決定することができ、よって抗原に対してモノクローナルなナノボディを得ることができる。さらに、このようにして同定された抗体を、核酸ライブラリの配列情報に基づいて当該抗体をコードする遺伝子を取得し、当該遺伝子から抗体を発現させて製造することもできる。 Based on the sequence information from the gene library of FIG. 1 (a), the 1: 1 correspondence between the base sequence of the randomized antibody gene and the base sequence of the DNA bar code (gene encoding the peptide bar code) is determined. The correspondence between the randomized amino acid sequence of the antibody (encoded by the base sequence of the antibody gene) and the amino acid sequence of the peptide bar code can be abbreviated. According to the above (b) to (f), an antibody member containing an antibody bound to an antigen is selected from the antibody library, a peptide bar code is cut out from the selected antibody member, and the cut out peptide bar code is identified by mass analysis. Then, together with the known sequence information of the nucleic acid library or the sequence information obtained by the sequence analysis, the base sequence of the gene encoding the antibody member containing the identified peptide bar code was obtained, and which antibody was specific to the antigen. It can be determined whether it binds to the antigen, and thus a nanobody that is monoclonal to the antigen can be obtained. Further, the antibody thus identified can be produced by obtaining a gene encoding the antibody based on the sequence information of the nucleic acid library and expressing the antibody from the gene.
以上のように、本発明によれば、モノクローナル抗体を、動物を用いずに試験管内で作製することができ、遊離型抗体に付加されたユニークなペプチドバーコードの質量分析を通じてその遊離型抗体の結合能力を同定することができる。また、本発明によれば、脊椎動物や培養細胞を使った費用と時間のかかる抗体生産に代わり、試験管内、実験室内で多様な性質の抗体を作り出すことができる。さらに、本発明によれば、モノクローナル抗体の候補となる多数のナノボディを用いる場合、各候補ナノボディに付加されたユニークなペプチドバーコードの質量分析での定量を通じて、目的の抗原に対するこれらのナノボディの結合能力を一回の実験で網羅的に同定することができる。したがって、より安価で迅速に、かつ効率的に目的の抗原に特異的に結合するモノクローナルなナノボディを製造することができる。本発明は、基礎的なイメージング研究やセンシング研究のための実験用試薬、分子標的抗体を用いた診断薬および医薬品の製造に有用である。 As described above, according to the present invention, a monoclonal antibody can be produced in vitro without using an animal, and the free antibody can be obtained through mass spectrometry of a unique peptide barcode added to the free antibody. The binding ability can be identified. Further, according to the present invention, instead of costly and time-consuming antibody production using vertebrates and cultured cells, antibodies having various properties can be produced in vitro and in a laboratory. Furthermore, according to the present invention, when a large number of candidate Nanobodies for monoclonal antibodies are used, binding of these Nanobodies to the antigen of interest through mass spectrometric quantification of the unique peptide barcodes added to each candidate Nanobody. Capabilities can be comprehensively identified in a single experiment. Therefore, it is possible to produce a monoclonal Nanobody that specifically binds to the target antigen at a lower cost, faster, and more efficiently. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is useful for the production of experimental reagents for basic imaging research and sensing research, diagnostic agents using molecular target antibodies, and pharmaceuticals.
(実施例1:ペプチドバーコードと融合したナノボディの作製)
抗CD4ナノボディ(米国特許出願公開2011/0318347)および抗GFP(緑色蛍光タンパク質)ナノボディ(Mol. Cell. Proteomics. 2008:7:282-289)に基づいて、4つのナノボディを設計した。図2は、本実施例で設計した4種のナノボディの模式図である。ナノボディのうち、2つは、6個のアミノ酸残基からなるユニークなペプチドバーコードを付加し、残りの2つはペプチドバーコードなしとした。抗CD4ナノボディにペプチドバーコードとしてバーコード1を付加し、および抗GFPナノボディにペプチドバーコードとしてバーコード2を付加した(図2)。
(Example 1: Preparation of Nanobody fused with peptide barcode)
Four Nanobodies were designed based on anti-CD4 Nanobodies (US Patent Application Publication 2011/0318347) and anti-GFP (Green Fluorescent Protein) Nanobodies (Mol. Cell. Proteomics. 2008: 7: 282-289). FIG. 2 is a schematic diagram of four types of Nanobodies designed in this embodiment. Two of the Nanobodies were added with a unique peptide barcode consisting of 6 amino acid residues, and the other two were without peptide barcodes. Barcode 1 was added as a peptide barcode to the anti-CD4 Nanobody, and barcode 2 was added as a peptide barcode to the anti-GFP Nanobody (Fig. 2).
ペプチドバーコードを以下のように設計した。ペプチドのイオン化効率は、ペプチドの長さや構成アミノ酸残基によって大きく異なる。6〜16残基を有するペプチドは高いイオン化効率を示す。イオン化効率はまた、ペプチドを構成するアミノ酸残基の種類に左右される。例えば、リジン(K)やアルギニン(R)などのアミノ基を有する残基は正に帯電しやすいので、それらはイオン化効率を上げる。グリシン(G)およびプロリン(P)残基はイオン化効率を高め、ヒスチジン(H)はイオン化効率を減らす。システイン(C)およびメチオニン(M)は酸化されやすく、アスパラギン(N)、セリン(S)、およびトレオニン(T)は糖鎖付加され得るため、これらの残基は所定のターゲットを分析するSRM分析に適していない。また、液体クロマトグラフの溶出時間(リテンションタイム)を適度に分散させるために疎水性のアミノ酸を含めた。 The peptide barcode was designed as follows. The ionization efficiency of a peptide varies greatly depending on the length of the peptide and the constituent amino acid residues. Peptides with 6 to 16 residues show high ionization efficiency. Ionization efficiency also depends on the types of amino acid residues that make up the peptide. For example, residues having an amino group, such as lysine (K) and arginine (R), are positively charged and thus increase the ionization efficiency. Glycine (G) and proline (P) residues increase the ionization efficiency, and histidine (H) decreases the ionization efficiency. Since cysteine (C) and methionine (M) are easily oxidized and asparagine (N), serine (S), and threonine (T) can be glycosylated, these residues are SRM analyzes that analyze a given target. Not suitable for. In addition, hydrophobic amino acids were included in order to appropriately disperse the elution time (retention time) of the liquid chromatograph.
これらの要因を考慮して、9つのアミノ酸(A、F、G、K、L、P、R、V、およびW)を構成アミノ酸残基として選択し、それぞれ分子量が異なる2つのペプチドバーコードを設計した:
バーコード1:WLFPVG(配列番号1)
バーコード2:FVGARL(配列番号2)
Considering these factors, nine amino acids (A, F, G, K, L, P, R, V, and W) were selected as constituent amino acid residues, and two peptide barcodes having different molecular weights were selected. Designed:
Barcode 1: WLFPVG (SEQ ID NO: 1)
Barcode 2: FVGARL (SEQ ID NO: 2)
バーコード1および2ともに、そのN末端にFLAGタグペプチド(DYKDDDDK:配列番号3)を融合させた。また、バーコード1および2ともに、そのC末端にもFLAGタグペプチドを融合させた(図2)。 For both barcodes 1 and 2, a FLAG tag peptide (DYKDDDDK: SEQ ID NO: 3) was fused to the N-terminal thereof. In addition, both barcodes 1 and 2 were fused with a FLAG tag peptide at the C-terminal thereof (Fig. 2).
「FLAGタグペプチド−バーコード1−FLAGタグペプチド」(アミノ酸配列を配列番号4に示す)を抗CD4ナノボディのC末端に融合させ、そして「FLAGタグペプチド−バーコード2−FLAGタグペプチド」(アミノ酸配列を配列番号5に示す)を抗GFPナノボディのC末端に融合させた(これらを「抗CD4−FLAG−バーコード1」および「抗GFP−FLAG−バーコード2」と称した:図2)。 "FLAG Tag Peptide-Barcode 1-FLAG Tag Peptide" (the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4) is fused to the C-terminus of the anti-CD4 nanobody, and "FLAG Tag Peptide-Barcode 2-FLAG Tag Peptide" (Amino Acid). The sequence shown in SEQ ID NO: 5) was fused to the C-terminus of the anti-GFP nanobody (these were referred to as "anti-CD4-FLAG-barcode 1" and "anti-GFP-FLAG-barcode 2": FIG. 2). ..
また、バーコードなしの抗CD4ナノボディおよび抗GFPナノボディの場合は、これらのナノボディのC末端にFLAGタグペプチド(DYKDDDDK:配列番号3)を融合させた(これらを「抗CD4−FLAG」および「抗GFP−FLAG」と称した:図2)。 In the case of anti-CD4 Nanobodies and anti-GFP Nanobodies without barcodes, FLAG tag peptides (DYKDDDDK: SEQ ID NO: 3) were fused to the C-terminus of these Nanobodies (these were "anti-CD4-FLAG" and "anti-CD4-FLAG". It was called "GFP-FLAG": FIG. 2).
これらのナノボディをコードするプラスミドを構築した。プラスミドは、AOX1プロモーターの下流に、α因子分泌シグナルおよびナノボディをそれぞれコードする遺伝子を配置するように設計した。本実施例で設計したナノボディ(抗CD4−FLAG、抗CD4−FLAG−バーコード1、抗GFP−FLAGまたは抗GFP−FLAG−バーコード2)をコードする遺伝子を合成してDNA断片を得、このDNA断片を、EcoRIおよびNotI(いずれも東洋紡株式会社製)で予め切断したpPIC9Kベクター(Invitrogrn製:このベクターは、AOX1プロモーターおよびα因子分泌シグナルを含有する)に、In Fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ株式会社製)を用いて組み込んだ。 A plasmid encoding these Nanobodies was constructed. The plasmid was designed to place genes encoding α-factor secretory signals and Nanobodies downstream of the AOX1 promoter, respectively. A gene encoding the nanobody designed in this example (anti-CD4-FLAG, anti-CD4-FLAG-barcode 1, anti-GFP-FLAG or anti-GFP-FLAG-barcode 2) was synthesized to obtain a DNA fragment, which was obtained. The DNA fragment was pre-cut with EcoRI and NotI (both manufactured by Toyo Boseki Co., Ltd.) into a pPIC9K vector (manufactured by Invitrogrn: this vector contains the AOX1 promoter and α-factor secretion signal) and the In Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio). Incorporated using (manufactured by Co., Ltd.).
各プラスミドの全配列を配列番号6〜17に示す(抗CD4−FLAGプラスミド:全配列(配列番号6)および発現ペプチド配列(配列番号7〜8);抗CD4−FLAG−バーコード1プラスミド:全配列(配列番号9)および発現ペプチド配列(配列番号10〜11);抗GFP−FLAGプラスミド:全配列(配列番号12)および発現ペプチド配列(配列番号13〜14);ならびに抗GFP−FLAG−バーコード2プラスミド:全配列(配列番号15)および発現ペプチド配列(配列番号16〜17))。 The entire sequence of each plasmid is shown in SEQ ID NOs: 6-17 (anti-CD4-FLAG plasmid: total sequence (SEQ ID NO: 6) and expressed peptide sequence (SEQ ID NOs: 7-8); anti-CD4-FLAG-barcode 1 plasmid: total). Sequence (SEQ ID NO: 9) and expressed peptide sequence (SEQ ID NOs: 10-11); anti-GFP-FLAG plasmid: full sequence (SEQ ID NO: 12) and expressed peptide sequence (SEQ ID NOs: 13-14); and anti-GFP-FLAG-bar Code 2 plasmid: full sequence (SEQ ID NO: 15) and expressed peptide sequence (SEQ ID NOs: 16-17).
構築したプラスミドをSacI(東洋紡株式会社製)で消化し、MinElute PCR精製キット(QIAGEN社製)により精製した。このプラスミドをFrozen EZ Yeast Transformation II Kit(Zymo Research社製)を用いて、ピチア・パストリスGS115株に形質転換した。形質転換した細胞をMD固形培地(1.34%w/v酵母窒素ベース(アミノ酸なし)、2%w/vのD−グルコース、および2%w/vの寒天)に播き、コロニーを得た。得られたコロニー(形質転換体)を20mLのBMGY培地(1%w/v酵母エキス、2%w/vペプトン、1%w/vグリセロール、0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)、2.68%w/v酵母窒素ベース(アミノ酸なし)、400μg/mLビオチン)に植菌し、30℃にて250rpm、48時間培養した。生育させた菌を遠心で回収し、10mLのBMMY培地(1%w/v酵母エキス、2%w/vペプトン、0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)、2.68%w/v酵母窒素ベース(アミノ酸なし)400μg/mLビオチン、および0.5%v/vメタノール)に懸濁し、30℃、250rpmで24時間培養した。培養後、BMMY培地を遠心分離し、上清を0.22μmフィルターで濾過した。この濾過上清をSDS−PAGEによって分析してナノボディの産生を確認した。 The constructed plasmid was digested with SacI (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) and purified with the MinElute PCR purification kit (manufactured by QIAGEN). This plasmid was transformed into Pichia pastris GS115 strain using Frozen EZ Yeast Transformation II Kit (manufactured by Zymo Research). Transformed cells were seeded on MD solid medium (1.34% w / v yeast nitrogen base (without amino acids), 2% w / v D-glucose, and 2% w / v agar) to obtain colonies. .. The obtained colonies (transformants) were cultivated in 20 mL of BMGY medium (1% w / v yeast extract, 2% w / v peptone, 1% w / v glycerol, 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 6.0)). 2.68% w / v yeast nitrogen base (without amino acids), 400 μg / mL biotin) was inoculated and cultured at 30 ° C. at 250 rpm for 48 hours. The grown bacteria are collected by centrifugation and collected in 10 mL of BMMY medium (1% w / v yeast extract, 2% w / v peptone, 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 6.0), 2.68% w /. It was suspended in v yeast nitrogen base (without amino acids) 400 μg / mL biotin and 0.5% v / v methanol) and cultured at 30 ° C. and 250 rpm for 24 hours. After culturing, the BMMY medium was centrifuged and the supernatant was filtered through a 0.22 μm filter. This filtered supernatant was analyzed by SDS-PAGE to confirm Nanobody production.
10mLの濾過上清をAmicon Ultra-15 Centrifugal Filters Ultracel-3K(Merck Millipore、Burlington、MA、USA)に8000g、60分間遠心分離し、そして10mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)をAmicon Ultra-3kユニットに添加し、60分間8000gで遠心分離した。この緩衝液交換手順を2回繰り返した。このようにバッファー置換を行いつつ濃縮し、この濃縮溶液をモノクローナル抗体溶液として用いた。 Centrifuge 10 mL of the filtered supernatant into Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters Ultracel-3K (Merck Millipore, Burlington, MA, USA) for 60 minutes at 8000 g, and add 10 mL of Phosphate Buffered Saline (PBS) to Amicon Ultra- It was added to a 3k unit and centrifuged at 8000g for 60 minutes. This buffer exchange procedure was repeated twice. Concentration was performed while performing buffer substitution in this manner, and this concentrated solution was used as a monoclonal antibody solution.
図3は、ピチア・パストリス形質転換体から生産された抗CD4−FLAG、抗CD4−FLAG−バーコード1、抗GFP−FLAGおよび抗GFP−FLAG−バーコード2のSDS−PAGEによる結果を示す電気泳動写真である。図3において、抗CD4−FLAG、抗CD4−FLAG−バーコード1、抗GFP−FLAGおよび抗GFP−FLAG−バーコード2のいずれも対応する分子量の位置にバンドが観察された。図3の結果から分かるように、形質転換体をメタノール含有培地で培養した結果、設計したすべてのナノボディの生産が成功したことを確認した。図4は、ピチア・パストリス形質転換体から生産された抗CD4−FLAG、抗CD4−FLAG−バーコード1、抗GFP−FLAGおよび抗GFP−FLAG−バーコード2の生産量を示すグラフである(各値は、少なくとも5つの試料からの平均±標準偏差を表す。t検定による統計学的解析を行った。星印は、有意差あり(p<0.05)を表す)。抗CD4−FLAGと抗CD4−FLAG−バーコード1との間で生産性にわずかな違いがあったが(図4)、これは、ピチア・パストリス形質転換体のコピー数変動に由来したと考えられる。 FIG. 3 shows the results of SDS-PAGE of anti-CD4-FLAG, anti-CD4-FLAG-barcode 1, anti-GFP-FLAG and anti-GFP-FLAG-barcode 2 produced from Pichia pastris transformants. It is an electrophoretic photograph. In FIG. 3, bands were observed at positions of corresponding molecular weights in all of anti-CD4-FLAG, anti-CD4-FLAG-barcode 1, anti-GFP-FLAG and anti-GFP-FLAG-barcode 2. As can be seen from the results of FIG. 3, as a result of culturing the transformants in a methanol-containing medium, it was confirmed that the production of all the designed Nanobodies was successful. FIG. 4 is a graph showing the production of anti-CD4-FLAG, anti-CD4-FLAG-barcode 1, anti-GFP-FLAG and anti-GFP-FLAG-barcode 2 produced from the Pitia-pastris transformant ( Each value represents the mean ± standard deviation from at least 5 samples. Statistical analysis by t-test was performed. Stars represent significant differences (p <0.05)). There was a slight difference in productivity between anti-CD4-FLAG and anti-CD4-FLAG-barcode 1 (Fig. 4), which is believed to be due to copy number variation of the Pichia-Pastris transformant. Be done.
(実施例2:バーコード付加ナノボディの結合特性の評価)
ペプチドバーコードの付加がナノボディの特性に影響を及ぼすかどうかを調べた。
(Example 2: Evaluation of binding characteristics of Barcode-added Nanobody)
We investigated whether the addition of peptide barcodes affected the properties of Nanobodies.
まず、CD4またはGFPを固定したセンサーチップを用いて、以下の手順にて表面プラズモン共鳴を行い、ナノボディの速度論パラメータを測定した。 First, using a sensor chip with CD4 or GFP fixed, surface plasmon resonance was performed according to the following procedure, and the kinetic parameters of Nanobodies were measured.
速度論パラメータは、Biacore T-200(GE Healthcare社製)を用いて測定した。組換えヒトsCD4 CF(R&D Systems社製)および組換えGFP(ProSpec、Rehovot、イスラエル)をSeries S Sensor Chip M5(GE Healthcare社製)に固定化したところ、それぞれ2486.9RUおよび1189.8RUであった。抗CD4ナノボディ(抗CD4−FLAG、抗CD4−FLAG−バーコード1)をHBS−EP緩衝液(0.01M HEPE(pH7.4)、0.15M NaCl、3mM EDTA、および0.005%v/v界面活性剤)で希釈し、0.2、0.4、0.6、0.8、および1.0μMとし、抗GFPナノボディ(抗GFP−FLAG、抗GFP−FLAG−バーコード2)を0.5、1、5、10、および50nMとした。流速、接触時間、および解離時間は、それぞれ30μL/分、120秒、および120秒であった。CD4固定チップを10mM NaOH(流速30μL/分および接触時間30秒)により再生し、そしてGFP固定チップを50mM NaOH(流速30μL/分および接触時間30秒)により再生した。 Kinetic parameters were measured using a Biacore T-200 (manufactured by GE Healthcare). Recombinant human sCD4 CF (manufactured by R & D Systems) and recombinant GFP (ProSpec, Rehovot, Israel) were immobilized on Series S Sensor Chip M5 (manufactured by GE Healthcare) and found to be 2486.9 RU and 1189.8 RU, respectively. It was. Anti-CD4 Nanobodies (anti-CD4-FLAG, anti-CD4-FLAG-barcode 1) in HBS-EP buffer (0.01M HEPE (pH 7.4), 0.15M NaCl, 3 mM EDTA, and 0.005% v / v Surfactant) to 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, and 1.0 μM to anti-GFP Nanobodies (anti-GFP-FLAG, anti-GFP-FLAG-barcode 2) It was set to 0.5, 1, 5, 10, and 50 nM. The flow rate, contact time, and dissociation time were 30 μL / min, 120 seconds, and 120 seconds, respectively. The CD4 fixation chip was regenerated with 10 mM NaOH (flow rate 30 μL / min and contact time 30 seconds), and the GFP-fixed chip was regenerated with 50 mM NaOH (flow rate 30 μL / min and contact time 30 seconds).
この結果を以下の表1に示す。 The results are shown in Table 1 below.
全てのナノボディが各抗原に対して特異的結合を示し、ペプチドバーコードの有無によって速度論パラメータに有意差はみられなかった(表1)。 All Nanobodies showed specific binding to each antigen, and there was no significant difference in kinetic parameters depending on the presence or absence of peptide barcodes (Table 1).
次に、ナノボディを用いたCD4の免疫蛍光染色を行った。pCAGGS−CD4−mycはJacob Yountから贈与された(Addgeneプラスミド#58537; http://n2t.net/addgene:58537;RRID:Addgene_58537)。HEK293細胞を、Xfect Transfection Reagent(タカラバイオ株式会社製)を用いることによりpCAGGS−CD4−mycプラスミドでトランスフェクトし、そしてDMEM低グルコース培地(ナカライテスク株式会社製)で1日間培養した。トランスフェクトした細胞を、ポリ−L−リジン臭化水素酸塩(Sigma-Aldrich社製)でコーティングしたカバーガラス上に移し、DMEM低グルコース培地で1〜2時間培養した。培地を除去した後、細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温にて30分間固定した。固定した細胞をPBSで3回すすぎ、そして室温で30分間、10%FBS(GE Healthcare社製)を含有するPBSでブロックした。抗CD4ナノボディ(抗CD4−FLAG−バーコード1)(2.7μg/ml)または抗GFPナノボディ(抗GFP−FLAG−バーコード2)(3.3μg/ml)を、固定した細胞と共に90分間インキュベートした後、細胞をPBSで3回すすぎ、そしてPBSで5分間3回洗浄した。二次抗体として抗DDDDKタグmAb Alexa Fluor 488(抗FLAG−AF488:蛍光顕微鏡下で緑色を示す)(株式会社医学生物学研究所製)を、10%FBSを含むPBSで1μg/mLになるように希釈し、そして室温にて1時間、細胞と共にインキュベートした後、細胞をPBSで3回すすぎ、5分間PBSで3回洗浄した。核を1μg/mLの4’,6’-ジアミジノ−2−フェニルインドールジヒドロクロライド(DAPI:ナカライテスク株式会社製)で1分間染色した(青色に染色される)。染色した細胞を共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡LSM700(Carl Zeiss社製)を用いて可視化した。なお、コントロールとして、野生型HEK293細胞を用いた。 Next, immunofluorescence staining of CD4 using Nanobodies was performed. pCAGGS-CD4-myc was donated by Jacob Yount (Addgene plasmid # 58537; http://n2t.net/addgene: 58537; RRID: Addgene_58537). HEK293 cells were transfected with the pCAGGS-CD4-myc plasmid by using Xfect Transfection Reagent (manufactured by Takara Bio Inc.) and cultured in DMEM low glucose medium (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) for 1 day. Transfected cells were transferred onto a cover glass coated with poly-L-lysine hydrobromide (manufactured by Sigma-Aldrich) and cultured in DMEM low glucose medium for 1 to 2 hours. After removing the medium, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde at room temperature for 30 minutes. Fixed cells were rinsed 3 times with PBS and blocked with PBS containing 10% FBS (GE Healthcare) for 30 minutes at room temperature. Incubate anti-CD4 Nanobodies (anti-CD4-FLAG-barcode 1) (2.7 μg / ml) or anti-GFP Nanobodies (anti-GFP-FLAG-barcode 2) (3.3 μg / ml) with fixed cells for 90 minutes. After that, the cells were rinsed 3 times with PBS and washed 3 times with PBS for 5 minutes. Anti-DDDDDK tag mAb Alexa Fluor 488 (anti-FLAG-AF488: showing green under fluorescence microscopy) (manufactured by Medical Biology Laboratory Co., Ltd.) as a secondary antibody to 1 μg / mL in PBS containing 10% FBS. After diluting to and incubating with the cells for 1 hour at room temperature, the cells were rinsed 3 times with PBS and washed 3 times with PBS for 5 minutes. The nuclei were stained with 1 μg / mL of 4', 6'-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI: manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) for 1 minute (stained in blue). Stained cells were visualized using a confocal laser scanning fluorescence microscope LSM700 (manufactured by Carl Zeiss). As a control, wild-type HEK293 cells were used.
図5は、ペプチドバーコードを付加したナノボディを用いたCD4の免疫蛍光染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。pCAGGS−CD4−mycfrトランスフェクトしたHEK293細胞(CD4表面発現細胞)およびコントロールの野生型HEK293細胞において、抗CD4ナノボディ(抗CD4−FLAG−バーコード1)、抗GFPナノボディ(抗GFP−FLAG−バーコード2)およびナノボディ処理なしのいずれでも核の染色が観察されたのに対し、二次抗体の緑色は、抗CD4ナノボディ(抗CD4−FLAG−バーコード1)をCD4表面発現細胞とインキュベートした場合にのみ観察された。したがって、図5に示す結果は、抗CD4−FLAG−バーコード1がHEK293細胞の表面上のCD4を認識したが、抗GFP−FLAG−バーコード2は認識しなかったことを示した。このような結果は、ペプチドバーコードの付加がナノボディの特性に影響しなかったことを示している。 FIG. 5 is a fluorescence micrograph showing the results of immunofluorescence staining of CD4 using Nanobodies to which peptide barcodes have been added. In pCAGGS-CD4-mycfr-transfected HEK293 cells (CD4 surface-expressing cells) and control wild-type HEK293 cells, anti-CD4 Nanobodies (anti-CD4-FLAG-barcode 1), anti-GFP nanobodies (anti-GFP-FLAG-barcodes) Nuclear staining was observed in both 2) and without Nanobody treatment, whereas the green color of the secondary antibody was when anti-CD4 Nanobodies (anti-CD4-FLAG-barcode 1) were incubated with CD4 surface-expressing cells. Only observed. Therefore, the results shown in FIG. 5 showed that anti-CD4-FLAG-barcode 1 recognized CD4 on the surface of HEK293 cells, but anti-GFP-FLAG-barcode 2 did not. These results indicate that the addition of peptide barcodes did not affect the properties of Nanobodies.
(実施例3:質量分析によるナノボディの結合能力の特徴付け)
ペプチドバーコード付加技術が、一回の実験で複数の結合物質の結合能力を測定するのに有用な技術となり得ることを示すための原理証明実験を設計した(図6)。図6は、LC−MSによるナノボディの結合能力を定量するためのスキームを示す模式図である。設計した実験は、まず、等モルに調製した抗CD4−FLAG−バーコード1と抗GFP−FLAG−バーコードとの混合物をCD4固定磁気ビーズと反応させ(一斉結合アッセイ)、この反応で結合しなかった抗体を洗い流し、次いでエンテロキナーゼを添加してビーズからペプチドバーコードを切り出し、切り出されたペプチドバーコードをLC−MSまたはLC−MS/MSの選択反応モニタリング(SRM)法で定量するというものである。具体的には、以下のように行った。
(Example 3: Characterizing the binding ability of Nanobodies by mass spectrometry)
A principle proof experiment was designed to show that the peptide barcode addition technique can be a useful technique for measuring the binding ability of multiple binding substances in a single experiment (Fig. 6). FIG. 6 is a schematic diagram showing a scheme for quantifying the binding ability of Nanobodies by LC-MS. In the designed experiment, first, a mixture of anti-CD4-FLAG-barcode 1 and anti-GFP-FLAG-barcode prepared in equimolarity was reacted with CD4 fixed magnetic beads (simultaneous binding assay), and the mixture was bound in this reaction. The missing antibody is washed away, then enterokinase is added to cut out peptide barcodes from the beads, and the cut out peptide barcodes are quantified by LC-MS or LC-MS / MS selective reaction monitoring (SRM) method. Is. Specifically, it was carried out as follows.
(一斉結合アッセイ:抗原−抗体相互作用によるCD4ナノボディの濃縮)
組換えCD4(0.1mg/mL)を、1mM氷冷HClで予備洗浄した30μLのNHS活性化磁気ビーズ(Thermo Scientific社製)と混合した。反応後、ビーズを0.1Mグリシン−HCl(pH2.0)で2回、そして蒸留水で1回洗浄し、3Mエタノールアミン(pH9.0)で室温にて2時間ブロックした。ブロッキングの後、磁気ビーズを、0.05%アジ化ナトリウムを含有する30μLの50mMホウ酸緩衝液で懸濁し、CD4固定磁気ビーズを得た。
(Simultaneous binding assay: enrichment of CD4 Nanobodies by antigen-antibody interaction)
Recombinant CD4 (0.1 mg / mL) was mixed with 30 μL of NHS activated magnetic beads (manufactured by Thermo Scientific) prewashed with 1 mM ice-cold HCl. After the reaction, the beads were washed twice with 0.1 M glycine-HCl (pH 2.0) and once with distilled water and blocked with 3 M ethanolamine (pH 9.0) at room temperature for 2 hours. After blocking, the magnetic beads were suspended in 30 μL of 50 mM borate buffer containing 0.05% sodium azide to give CD4 fixed magnetic beads.
CD4固定磁気ビーズを500μLのナノボディ混合物(0.1μM 抗CD4−FLAG−バーコード1および0.1μM 抗GFP−FLAG−バーコード2を含む)と混合し、そして室温にて2時間インキュベートした。上清を除去した後、1mLの0.05%Tween 20含有TBSで2回、そして1mLの蒸留水で1回ビーズを洗浄した。 CD4 fixed magnetic beads were mixed with 500 μL of Nanobody mixture (including 0.1 μM anti-CD4-FLAG-barcode 1 and 0.1 μM anti-GFP-FLAG-barcode 2) and incubated at room temperature for 2 hours. After removing the supernatant, the beads were washed twice with 1 mL of TBS containing 0.05% Tween 20 and once with 1 mL of distilled water.
ペプチドバーコードの切断のため、ビーズを20μLの50ng/mLエンテロキナーゼ(New England Bio-Labs社製)と共に25℃にて16時間インキュベートした。上清をMonoSpin C18(ジーエルサイエンス株式会社製)を用いて脱塩し、そして凍結乾燥した。乾燥したペレットを20μLの50mM TEABを用いて溶解し、Ultrafree-MC-HV Centrifugal Filters Durapore PVDF 0.45μm(Merck Millipore社製)により濾過し、そしてLC−MS/MS分析に供するまで−20℃で保存した。 Beads were incubated with 20 μL of 50 ng / mL enterokinase (manufactured by New England Bio-Labs) at 25 ° C. for 16 hours to cleave the peptide barcode. The supernatant was desalted using MonoSpin C18 (manufactured by GL Sciences, Inc.) and lyophilized. Dried pellets are lysed with 20 μL of 50 mM TEAB, filtered through Ultrafree-MC-HV Centrifugal Filters Durapore PVDF 0.45 μm (Merck Millipore) and at −20 ° C. until subjected to LC-MS / MS analysis. saved.
(LC−MS/MSによるペプチドバーコードの定量)
エンテロキナーゼにより切り出されたペプチドバーコードを、高速液体クロマトグラフィー(LC)(Nexera UHPLC/HPLCシステム:株式会社島津製作所製)−トリプル四重極質量分析(MS/MS)(LCMS−8060:株式会社島津製作所製)により分析した。
(Quantification of peptide barcode by LC-MS / MS)
High Performance Liquid Chromatography (LC) (Nexera UHPLC / HPLC System: Shimadzu Corporation) -Triple Tandem Mass Spectrometry (MS / MS) (LCMS-8060: Co., Ltd.) from peptide barcodes cut out by enteroxinase. Analyzed by Shimadzu Corporation).
ペプチドバーコードを含有する5μLの溶液を、50mmのInert SustainSwiftTM C18カラム(P.N.5020〜88228、内径2.1mm、粒径1.9μm;ジーエルサイエンス株式会社製)に注入してバーコードを分離する。カラムは40℃に保たれており、そしてこの溶液は引き続き6口の注入/切替弁(Valco Instruments社製)を通してMSに注入される。ペプチドバーコードの分析を、600μL/分の流速で3.5分間行った。2つの溶離液の混合比を変えることによってグラジエントを生成した:A、0.1%(v/v)ギ酸およびB、アセトニトリル含有0.1%(v/v)ギ酸。グラジエントは、5%B0.5分保持から開始し、次にこれを2分間で50%Bに上げ、次に0.5分間保持し95%Bに上げて、最後にB濃度を直ちに5%に調整し、0.5分間保持してカラムを再平衡化した。オートサンプラーを4℃に保ち、黒のドアを装備させた。インターフェース温度、ヒートブロック温度および脱溶媒部(DL)温度をそれぞれ300℃、400℃および250℃に設定した。液滴を作製するためのネブライザーガス(N2)、乾燥用ガス(N2)、および加熱用ガス(乾燥空気)の流速をそれぞれ2L/分、10L/分および10L/分に設定した。 A 5 μL solution containing a peptide barcode is injected into a 50 mm Inert SustainSwift TM C18 column (PN 5020 to 88228, inner diameter 2.1 mm, particle size 1.9 μm; manufactured by GL Sciences Co., Ltd.) and the barcode. To separate. The column is kept at 40 ° C., and the solution is subsequently injected into the MS through a 6-port injection / switching valve (Valco Instruments). Peptide barcode analysis was performed at a flow rate of 600 μL / min for 3.5 minutes. Gradients were produced by varying the mixing ratio of the two eluents: A, 0.1% (v / v) formic acid and B, 0.1% (v / v) formic acid containing acetonitrile. The gradient starts with a 5% B 0.5 minute hold, then raises this to 50% B in 2 minutes, then holds for 0.5 minutes and raises to 95% B, and finally raises the B concentration to 5% immediately. And held for 0.5 minutes to rebalance the column. The autosampler was kept at 4 ° C and equipped with a black door. The interface temperature, heat block temperature and desolvation part (DL) temperature were set to 300 ° C, 400 ° C and 250 ° C, respectively. The flow rates of the nebulizer gas (N 2 ), the drying gas (N 2 ), and the heating gas (dry air) for producing the droplets were set to 2 L / min, 10 L / min, and 10 L / min, respectively.
SRM法の最適化のために、Skylineソフトウェア(Proteomics 2012:12:1134-1141)で作製した各合成ペプチド(バーコード1のC末端にFLAGタグペプチドを融合したペプチドと、バーコード2のC末端にFLAGタグペプチドを融合したペプチド)の全ての遷移を分析した。ペプチド毎に2つの感度の高い遷移を選択し、最も高いピーク強度を持つ衝突エネルギーを採用した(表2)。 For the optimization of the SRM method, each synthetic peptide prepared by Skyline software (Proteomics 2012: 12: 1134-1141) (a peptide in which a FLAG tag peptide is fused to the C-terminal of bar code 1 and a C-terminal of bar code 2) All transitions of the peptide (peptide fused with FLAG tag peptide) were analyzed. Two sensitive transitions were selected for each peptide and the collision energy with the highest peak intensity was adopted (Table 2).
さらに、これらの遷移について、得られた保持時間に基づいて時間を決定した。イオン化ペプチドバーコードをこの方法によって5分の滞留時間で分析した。 In addition, the time was determined for these transitions based on the retention time obtained. Ionized peptide barcodes were analyzed by this method with a residence time of 5 minutes.
(結果)
SRMの感度および定量性を検証するために、合成ペプチド(バーコード1のC末端にFLAGタグペプチドを融合したペプチド(配列番号18)と、バーコード2のC末端にFLAGタグペプチドを融合したペプチド(配列番号19))をそれぞれ連続希釈して定量した。
(result)
In order to verify the sensitivity and quantification of SRM, a synthetic peptide (a peptide in which a FLAG tag peptide is fused to the C-terminal of bar code 1 (SEQ ID NO: 18) and a peptide in which a FLAG tag peptide is fused to the C-terminal of bar code 2) (SEQ ID NO: 19)) were continuously diluted and quantified.
図7は、バーコード1(A)およびバーコード2(B)について種々の量のLC−MS/MSの分析結果を示すグラフである。図7の各値は、3つの試料の平均±標準偏差を表す。図7AおよびBの結果から、バーコード1およびバーコード2ともに、本実施例で使用したLC−MS/MS分析で高感度に検出され、かつ定量されることが分かった。 FIG. 7 is a graph showing the analysis results of various amounts of LC-MS / MS for barcode 1 (A) and barcode 2 (B). Each value in FIG. 7 represents the mean ± standard deviation of the three samples. From the results of FIGS. 7A and 7B, it was found that both the barcode 1 and the barcode 2 were detected and quantified with high sensitivity by the LC-MS / MS analysis used in this example.
ポジティブコントロール実験として、250fmolの抗CD4−FLAG−バーコード1または250fmolの抗GFP−FLAG−バーコード2からそれぞれペプチドバーコード(すなわち、バーコード1−FLAG(配列番号18)およびバーコード2−FLAG(配列番号19))を切り出し、それらをLC−MS/MSで定量した。 As a positive control experiment, from 250 fmol anti-CD4-FLAG-bar code 1 or 250 fmol anti-GFP-FLAG-bar code 2 to peptide bar code (ie, bar code 1-FLAG (SEQ ID NO: 18) and bar code 2-FLAG, respectively). (SEQ ID NO: 19)) were cut out and quantified by LC-MS / MS.
図8は、250fmolの抗CD4−FLAG−バーコード1および250fmolの抗GFP−FLAG−バーコード2からそれぞれ切り出されたペプチドバーコードをLC−MS/MSで定量した結果を示すグラフである。図8の各値は、3つの試料の平均±標準偏差を表す。図8の結果から、バーコード1およびバーコード2ともに、本実施例で使用したLC−MS/MSで高感度に検出され、かつサンプル調製手順中の損失を最小限に抑えて首尾よく定量されることがわかった。 FIG. 8 is a graph showing the results of quantifying peptide barcodes cut out from 250 fmol anti-CD4-FLAG-bar code 1 and 250 fmol anti-GFP-FLAG-bar code 2 by LC-MS / MS, respectively. Each value in FIG. 8 represents the mean ± standard deviation of the three samples. From the results of FIG. 8, both barcode 1 and barcode 2 were detected with high sensitivity by the LC-MS / MS used in this example, and were successfully quantified with minimal loss during the sample preparation procedure. It turned out that.
次に、500μLのナノボディ混合物(0.1μM 抗CD4−FLAG−バーコード1および0.1μM 抗GFP−FLAG−バーコード2を含む)をCD4固定磁気ビーズに加えて一斉結合アッセイを行った後、ビーズから切り出されたペプチドバーコードを定量した。 Next, a 500 μL Nanobody mixture (containing 0.1 μM anti-CD4-FLAG-barcode 1 and 0.1 μM anti-GFP-FLAG-barcode 2) was added to the CD4 immobilized magnetic beads for a simultaneous binding assay. Peptide barcodes cut out from the beads were quantified.
図9は、一斉結合アッセイ後、ビーズから切り出されたペプチドバーコードをLC−MS/MSで定量した結果を示すグラフである。図9の各値は、3つの試料の平均±標準偏差を表す。図9に見られるように、抗CD4−FLAG−バーコード1に由来するバーコード1のペプチドが検出されたが、抗GFP−FLAG−バーコード2に由来するバーコード2のペプチドは検出されなかった。したがって、一斉結合アッセイに供した後にビーズ上に担持されたCD4抗原に結合した抗CD4−FLAG−バーコード1由来のペプチドバーコードが、LC−MS/MSによって特異的に検出されることを見出した。 FIG. 9 is a graph showing the results of quantifying peptide barcodes cut out from beads by LC-MS / MS after the simultaneous binding assay. Each value in FIG. 9 represents the mean ± standard deviation of the three samples. As seen in FIG. 9, the peptide of barcode 1 derived from anti-CD4-FLAG-barcode 1 was detected, but the peptide of barcode 2 derived from anti-GFP-FLAG-barcode 2 was not detected. It was. Therefore, it was found that the peptide barcode derived from anti-CD4-FLAG-barcode 1 bound to the CD4 antigen carried on the beads after being subjected to the simultaneous binding assay was specifically detected by LC-MS / MS. It was.
(実施例4:種々のペプチドバーコードの結合アッセイに対する影響の検討)
以下の8つのペプチドバーコードを設計した。これらのペプチドバーコードは、疎水性の程度がばらつくように設計した。これにより、液体クロマトグラフの溶出時間を適度にずらすことができる:
バーコード4−1:DIVVLGVEK(配列番号20)
バーコード4−2:LIHVLDAGR(配列番号21)
バーコード4−3:LHAILFGLPR(配列番号22)
バーコード4−4:LEDLLLDR(配列番号23)
バーコード4−5:LAEIHGVPR(配列番号24)
バーコード4−6:FQFLWGPR(配列番号25)
バーコード4−7:VELQQEVEK(配列番号26)
バーコード4−8:NIFEQLHR(配列番号27)
(Example 4: Examination of the effect of various peptide barcodes on the binding assay)
The following eight peptide barcodes were designed. These peptide barcodes were designed with varying degrees of hydrophobicity. Thereby, the elution time of the liquid chromatograph can be appropriately shifted:
Barcode 4-1: DIVVLGVEK (SEQ ID NO: 20)
Barcode 4-2: LIHVLDAGR (SEQ ID NO: 21)
Barcode 4-3: LHAILFGLPR (SEQ ID NO: 22)
Barcode 4-4: LEDLLLDR (SEQ ID NO: 23)
Barcode 4-5: LAEIHGVPR (SEQ ID NO: 24)
Barcode 4-6: FQFLWGPR (SEQ ID NO: 25)
Barcode 4-7: VELQQEVERK (SEQ ID NO: 26)
Barcode 4-8: NIFEQLHR (SEQ ID NO: 27)
上記の各種ペプチドバーコードを付与した抗CD4ナノボディまたは抗GFPナノボディを酵母で分泌発現するためのプラスミドを構築した。プラスミドの構築は、抗CD4−FLAG−バーコード1、抗GFP−FLAG−バーコード1のバーコード部分を上記の各種ペプチドバーコードを発現する遺伝子に変更した以外は、実施例1のプラスミドの構築と同様に行った。本実施例では、ペプチドバーコードはそのN末端にFLAGタグペプチド(DYKDDDDK:配列番号3)を融合させたが、C末端には融合させていない。各バーコード付きナノボディの融合タンパク質をコードするDNA断片の塩基配列および発現ペプチド配列を配列番号28〜75に示す:バーコード4−1付加抗CD4:DNA断片の塩基配列(配列番号28)および発現ペプチド配列(配列番号28〜30);バーコード4−2付加抗CD4:DNA断片の塩基配列(配列番号31)および発現ペプチド配列(配列番号31〜33);バーコード4−3付加抗CD4:DNA断片の塩基配列(配列番号34)および発現ペプチド配列(配列番号34〜36);バーコード4−4付加抗CD4:DNA断片の塩基配列(配列番号37)および発現ペプチド配列(配列番号37〜39);バーコード4−5付加抗CD4:DNA断片の塩基配列(配列番号40)および発現ペプチド配列(配列番号40〜42);バーコード4−6付加抗CD4:DNA断片の塩基配列(配列番号43)および発現ペプチド配列(配列番号43〜45);バーコード4−7付加抗CD4:DNA断片の塩基配列(配列番号46)および発現ペプチド配列(配列番号46〜48);バーコード4−8付加抗CD4:DNA断片の塩基配列(配列番号49)および発現ペプチド配列(配列番号49〜51);バーコード4−1付加抗GFP:DNA断片の塩基配列(配列番号52)および発現ペプチド配列(配列番号52〜54);バーコード4−2付加抗GFP:DNA断片の塩基配列(配列番号55)および発現ペプチド配列(配列番号55〜57);バーコード4−3付加抗GFP:DNA断片の塩基配列(配列番号58)および発現ペプチド配列(配列番号58〜60);バーコード4−4付加抗GFP:DNA断片の塩基配列(配列番号61)および発現ペプチド配列(配列番号61〜63);バーコード4−5付加抗GFP:DNA断片の塩基配列(配列番号64)および発現ペプチド配列(配列番号64〜66);バーコード4−6付加抗GFP:DNA断片の塩基配列(配列番号67)および発現ペプチド配列(配列番号67〜69);バーコード4−7付加抗GFP:DNA断片の塩基配列(配列番号70)および発現ペプチド配列(配列番号70〜72);ならびにバーコード4−8付加抗GFP:DNA断片の塩基配列(配列番号73)および発現ペプチド配列(配列番号73〜75)。 A plasmid for secreting and expressing anti-CD4 Nanobodies or anti-GFP Nanobodies to which the above various peptide barcodes were added was constructed in yeast. The plasmid was constructed according to Example 1 except that the barcode portions of anti-CD4-FLAG-barcode 1 and anti-GFP-FLAG-barcode 1 were changed to genes expressing the above-mentioned various peptide barcodes. I went in the same way. In this example, the peptide barcode has a FLAG-tag peptide (DYKDDDDK: SEQ ID NO: 3) fused to its N-terminus, but not to its C-terminus. Nucleotide sequence and expression of DNA fragment encoding each barcoded nanobody fusion protein are shown in SEQ ID NOs: 28 to 75: Nucleotide sequence of barcode 4-1 addition anti-CD4: Nucleotide sequence of DNA fragment (SEQ ID NO: 28) and expression. Peptide sequence (SEQ ID NOs: 28-30); Barcode 4-2 addition anti-CD4: Nucleotide sequence of DNA fragment (SEQ ID NO: 31) and expression peptide sequence (SEQ ID NOs: 31-33); Barcode 4-3 addition anti-CD4: Nucleotide sequence of DNA fragment (SEQ ID NO: 34) and expressed peptide sequence (SEQ ID NOs: 34-36); Barcode 4-4 Additive Anti-CD4: Nucleotide sequence of DNA fragment (SEQ ID NO: 37) and expressed peptide sequence (SEQ ID NOs: 37-36) 39); Barcode 4-5 Additive Anti-CD4: Nucleotide Sequence of DNA Fragment (SEQ ID NO: 40) and Expressed Peptide Sequence (SEQ ID NOs: 40-42); Barcode 4-6 Additive Anti-CD4: Nucleotide Sequence of DNA Fragment (Sequence) No. 43) and expressed peptide sequence (SEQ ID NOs: 43-45); Barcode 4-7 Addition Anti-CD4: Nucleotide sequence of DNA fragment (SEQ ID NO: 46) and expressed peptide sequence (SEQ ID NOs: 46-48); Barcode 4- 8 Additive anti-CD4: DNA fragment base sequence (SEQ ID NO: 49) and expressed peptide sequence (SEQ ID NO: 49-51); Barcode 4-1 Additive anti-GFP: DNA fragment base sequence (SEQ ID NO: 52) and expressed peptide sequence (SEQ ID NOs: 52 to 54); Nucleotide sequence of DNA fragment (SEQ ID NO: 55) and expression peptide sequence (SEQ ID NO: 55-57); Barcode 4-3 added anti-GFP: DNA fragment Nucleotide sequence (SEQ ID NO: 58) and expressed peptide sequence (SEQ ID NO: 58-60); Barcode 4-4 addition anti-GFP: Nucleotide sequence of DNA fragment (SEQ ID NO: 61) and expressed peptide sequence (SEQ ID NOs: 61-63) Barcode 4-5 Additive Anti-GFP: Nucleotide Sequence of DNA Fragment (SEQ ID NO: 64) and Expressed Peptide Sequence (SEQ ID NOs: 64-66); Barcode 4-6 Additive Anti-GFP: Nucleotide Sequence of DNA Fragment (SEQ ID NO: 67) ) And the expressed peptide sequence (SEQ ID NOs: 67-69); barcode 4-7 added anti-GFP: base sequence of DNA fragment (SEQ ID NO: 70) and expressed peptide sequence (SEQ ID NOs: 70-72); and barcode 4-8. Nucleotide sequence of DNA fragment (SEQ ID NO: 73) and expression peptide sequence (SEQ ID NOs: 73-75).
実施例1と同様にして、各種プラスミドから、ペプチドバーコードが付与されたモノクローナル抗体を得た。得られたモノクローナル抗体を、実施例2と同様にして速度論パラメータにて各抗原に対する結合能を調べた。なお対照として、ペプチドバーコードを付与していないナノボディ(実施例1の「抗CD4−FLAG」および「抗GFP−FLAG」)を用いた。結果を以下の表3(CD4)および表4(GFP)に示す。いずれの場合も、ペプチドバーコードの付与は、ナノボディの抗原に対する結合能に影響しないことがわかった。 Monoclonal antibodies to which peptide barcodes were added were obtained from various plasmids in the same manner as in Example 1. The obtained monoclonal antibody was examined for its binding ability to each antigen using kinetic parameters in the same manner as in Example 2. As a control, Nanobodies to which no peptide barcode was added (“Anti-CD4-FLAG” and “Anti-GFP-FLAG” of Example 1) were used. The results are shown in Table 3 (CD4) and Table 4 (GFP) below. In each case, it was found that the addition of peptide barcodes did not affect the ability of Nanobodies to bind to antigens.
(実施例5:ロングモノリスカラムを用いた質量分析器検出力の向上)
LC−MS/MSによるペプチドの検出力の向上のため、ロングモノリスカラムをさらに改良した。検出力の評価のため、実施例3と同様のLC−MS/MS装置を用いて、そのピークキャパシティ(peak capacity)を測定した。ピークキャパシティが高くなるほど分離性能が高いことを示す。
(Example 5: Improvement of mass spectrometer detection power using a long monolith column)
The long monolith column was further improved in order to improve the detection ability of peptides by LC-MS / MS. In order to evaluate the detection power, the peak capacity was measured using the same LC-MS / MS apparatus as in Example 3. The higher the peak capacity, the higher the separation performance.
例えば、図10は、ペプチドバーコード1(配列番号18)のLC−MS/MS測定において100μm内径および75μm内径のそれぞれのモノリスカラムを用いた場合のピークキャパシティを示すグラフである(いずれも500mm長)。内径を100μm内径から75μm内径へと変化させることにより、ピークキャパシティが高くなった(図10)。 For example, FIG. 10 is a graph showing the peak capacity when each monolith column having an inner diameter of 100 μm and an inner diameter of 75 μm is used in LC-MS / MS measurement of peptide barcode 1 (SEQ ID NO: 18) (both are 500 mm). Long). By changing the inner diameter from 100 μm inner diameter to 75 μm inner diameter, the peak capacity was increased (FIG. 10).
さらに、カラムを長くすることでも、ピークキャパシティが高くなった。例えば、図11は、ペプチドバーコード1(配列番号18)のLC−MS/MS測定において500mm長および1000mm長のそれぞれのモノリスカラムを用いた場合のピークキャパシティを示すグラフである(いずれも内径75μm)。500mmの長さのカラムを1000mmに長くすることで、ピークキャパシティの向上が確認された(図11)。モノリスカラムをさらに長くすることで、さらなる性能の向上が見込まれる。 In addition, the longer columns also increased the peak capacity. For example, FIG. 11 is a graph showing the peak capacity when each monolith column having a length of 500 mm and a length of 1000 mm is used in the LC-MS / MS measurement of peptide barcode 1 (SEQ ID NO: 18) (both inner diameters). 75 μm). It was confirmed that the peak capacity was improved by lengthening the column having a length of 500 mm to 1000 mm (FIG. 11). Further improvement in performance is expected by making the monolith column longer.
75μm内径の1000mmモノリスカラムを使うことで、液体クロマトグラフィーによるペプチドの分離性能が高くなり、質量分析によるペプチドの検出感度を大きく向上させることができた。 By using a 1000 mm monolith column having an inner diameter of 75 μm, the peptide separation performance by liquid chromatography was improved, and the detection sensitivity of peptides by mass spectrometry could be greatly improved.
75μm内径の1000mmモノリスカラムを用いて、例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)のトリプシン消化物をLC−MS/MS測定で分析したところ、2倍以上の感度向上を確認した。 Using a 1000 mm monolith column with a 75 μm inner diameter, for example, a tryptic digest of bovine serum albumin (BSA) was analyzed by LC-MS / MS measurement, and it was confirmed that the sensitivity was improved more than twice.
本発明は、例えば、実験用試薬、診断薬、および医薬品の製造に有用である。 The present invention is useful, for example, in the manufacture of experimental reagents, diagnostic agents, and pharmaceuticals.
Claims (6)
該ペプチドバーコードが、5〜30個のアミノ酸からなるアミノ酸配列により表され、かつ該アミノ酸が独立してA、F、G、K、L、P、R、VおよびWからなる群から選択され、
該ナノボディおよび該ペプチドバーコードを含むポリぺプチドを該酵母の細胞内で発現させて該細胞外に分泌させ、該ポリぺプチドから切り出された該ペプチドバーコードの同定を通じて、抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体のナノボディを同定するために使用される、組成物。 A composition comprising a DNA fragment containing a gene encoding a secretory signal, a gene encoding a Nanobody and a gene encoding a peptide barcode, or a yeast into which a vector containing the DNA fragment has been introduced.
The peptide barcode is represented by an amino acid sequence consisting of 5 to 30 amino acids, and the amino acids are independently selected from the group consisting of A, F, G, K, L, P, R, V and W. ,
A polypeptide containing the Nanobody and the peptide barcode is expressed intracellularly in the yeast and secreted extracellularly, and through identification of the peptide barcode excised from the polypeptide, specifically with the antigen. A composition used to identify the Nanobodies of a monoclonal antibody that binds .
該ペプチドバーコードが、5〜30個のアミノ酸からなるアミノ酸配列により表され、かつ該アミノ酸が独立してA、F、G、K、L、P、R、VおよびWからなる群から選択され、
該ポリぺプチドから切り出された該ペプチドバーコードの同定を通じて、抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体のナノボディを同定するために使用される、組成物。 A composition comprising a polypeptide containing Nanobodies and peptide barcodes.
The peptide barcode is represented by an amino acid sequence consisting of 5 to 30 amino acids, and the amino acids are independently selected from the group consisting of A, F, G, K, L, P, R, V and W. ,
A composition used to identify Nanobodies of monoclonal antibodies that specifically bind to an antigen through the identification of the peptide barcode excised from the polypeptide .
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