JP6779896B2 - ヒトインターフェロン−β変異体が接合された免疫サイトカインとその製造方法 - Google Patents

ヒトインターフェロン−β変異体が接合された免疫サイトカインとその製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、ヒトインターフェロン−β変異体が接合された免疫サイトカイン及びその製造方法に関する発明で、より具体的には、天然型インターフェロン−βよりも活性と機能に優れたインターフェロン−β変異体と抗体（antibody）が結合された免疫サイトカイン及びその製造方法に関する発明である。
本出願は、2015年3月3日に出願された韓国特許出願第10-2015-0030037号に基づく優先権を主張し、前記明細書全体は、参照により本出願に援用する。
薬剤における免疫療法は、免疫系を調整して、予防及び／又は治療の目標を達成するための概念に基づく多数の治療戦略を示す。
過去数年間、免疫療法は、いくつかの病理状態の治療又は予防のために使用されてきた。モノクローナル抗体を生産するための細胞融合技法が開発されて以来、多数のモノクローナル抗体が研究者によって製造された。その後、ヒトモノクローナル抗体を生産するためのB細胞ハイブリドーマ技法とEBVハイブリドーマ技法を含む、他の手法がモノクローナル抗体の製造のために開発された。
モノクローナル抗体（Mab）は、ほぼすべてのエピトープを標的とするために開発されることができる。特定の細胞／分子の特異的な認識及び結合の性質は、様々な疾患状態に対する診断と治療試薬としてMabの開発を促した。組換えDNA技術は、人間に投与するキメラ又はヒト化抗体を製造するために使用された。現在、いくつかのモノクローナル抗体が癌、感染性疾患、免疫疾患などの治療のために、例えばRITUXAN（登録商標）、HERCEPTIN（登録商標）、AVASTIN（登録商標）などとして市販されて利用される。
モノクローナル抗体は、標的化された分子であり、病理組織のような特異的領域（細胞、組織など）内に偏在化することができる。このような性質もまた、病理組織部位で特異的分子を標的するための努力で、様々な物質（ペイロード（payload））が接合されたMabの開発に繋がった。これらの物質（ペイロード）は毒物、薬物、放射性核種、プロドラッグ化合物などであることができる。これらの結合の多くは抗体の特異的製造、面倒で変形し易いプロセス、反応性部分（ペイロード）の化学接合を含む（US4,671,958）。
新しいこれらの分子の中で、免疫サイトカインは、特に関心の対象である。前記免疫サイトカインは、抗体とサイトカインを含む融合タンパク質を意味する。これらのタンパク質は、抗原結合能力とサイトカイン活性をすべて保有する。
サイトカインは、ホルモンや神経伝達物質のような細胞間の情報伝達に広く使用されるシグナリングタンパク質及び糖タンパク質のカテゴリーである。ホルモンは特異的器官によって血液に分泌され、神経伝達物質は神経活性に関連するものであるのに対し、サイトカインは、起源と目的の面でより多様な化合物群である。これは大規模な造血及び非造血細胞のタイプによって生成され、近くの細胞に影響を与えたり、生物全体に影響を与えたりする可能性があり、時には他の化学物質の存在に強く依存する。サイトカインファミリーは、質量が8〜30kDaであり、より小さな水溶性タンパク質及び糖タンパク質で主に構成される。サイトカインは、先天性免疫応答及び適応免疫応答の両方の機能について重要である。多くの場合、サイトカインは、病原体と会った免疫細胞によって分泌され、より多くの免疫細胞を活性化させて動員して病原体に対するシステムの反応を増加させる役割をする。
サイトカインの中で、インターフェロン（IFN）は、サイトカインの一種として抗ウイルス活性を示し、細胞増殖を抑制し、自然免疫反応を調節する機能を有するが、このうちインターフェロン−β（interferon-beta；IFN-β）は5つのαヘリックスを持っている球形タンパク質であって、大きさは22kDであり、糖鎖を削除すると、18kDになる（Arduini et al.、Protein Science 8：pp1867-1877、1999）。
インターフェロン−βの臨床適用に関する研究は活発に行われており、特に多発性硬化症（Multiple Sclerosis）の症状の緩和、軽減又は治療剤として脚光を浴びている（Goodkin et al.、Multiple sclerosis：Treatment options for patients with relapsing-remitting and secondary progressive multiple sclerosis、1999）。
多発性硬化症に加えて、インターフェロン−βは、抗ウイルス活性、細胞成長抑制又は抗成長活性、リンパ球細胞毒性の増大活性、免疫調節活性、標的細胞の分化誘導や阻害活性、マクロファージの活性化活性、サイトカイン生成の増加活性、細胞傷害性T細胞の効果の増加活性、ナチュラルキラー細胞（natural killing cell）の増加活性などの様々な免疫学的活性に癌、自己免疫疾患及びウイルス感染、HIVと関連する病気、C型肝炎、リウマチなどの治療などの効果があるという報告がある（Pilling et al.、などEuropean Journal of Immunology 29：pp 1041-1050、1999、Young等Neurology 51：pp 682-689、1998年、Cirelliなど1995 Major therapeutic uses of interferons。Clin Immunother 3：pp 27-87）。
ヒトインターフェロン−βも糖タンパク質の一種であるが、これらのタンパク質に接続された糖鎖部分が、そのタンパク質の活性に重要な役割を果たす。したがって、糖タンパク質の場合、糖鎖を付加させると、その活性が増加する場合がある。
前述した観点から、糖タンパク質である天然型のヒトインターフェロンーβの糖鎖を導入させ、その活性や機能が増えた又は改良されたヒトインターフェロン−β変異体が韓国登録特許10-0781666号に開示されている。
そこで、天然型インターフェロン−βの薬理効果よりも優れた効能を示すヒトインターフェロン−β変異体を標的治療に利用するために抗体接合した免疫サイトカインの開発が必要であり、これを高い収率で得ることができる製造方法が要求される。
［発明の詳細な説明］
［課題］
本発明の発明者らは、天然型ヒトインターフェロン−βの糖鎖を導入させ、その活性や機能が増えた又は改良されたヒトインターフェロン−β変異体が抗体と結合された免疫サイトカインを発明し、このような免疫サイトカインの宿主細胞での発現量が天然型インターフェロン−βと抗体が結合された免疫サイトカインに比べて大幅に向上していることを発見し、本発明を完成した。
したがって、本発明の目的は、（a）ヒトインターフェロン−β変異体；と（b）前記ヒトインターフェロン−β変異体に直接又は間接的に共有結合された抗体又はその断片；を含む免疫サイトカインであって、前記ヒトインターフェロン−β変異体は、（i）配列番号1に開示されたアミノ酸配列の全体を含むポリペプチド、（ii）配列番号1に開示されたアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド、（iii）前記（a）又は（b）のポリペプチドと実質的に類似のポリペプチドで構成された群から選択され、ヒトインターフェロン−β活性を持つポリペプチドであって、N-結合型糖鎖を含むポリペプチドである、免疫サイトカインを提供するものである。
本発明の他の目的は、前記免疫サイトカインをエンコードするポリヌクレオチドを提供するものである。
本発明の他の目的は、（a）ヒトインターフェロン−β変異体；と（b）ペプチドリンカー；と（c）抗体又はその断片を含む融合ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングする段階；と
（b）前記発現ベクターを宿主細胞にクローニングする段階；と
（c）前記宿主細胞を培養する段階；と
（d）前記細胞又は培養培地から前記融合ポリペプチドを回収する段階を含み、
前記ヒトインターフェロン−β変異体は、配列番号2〜配列番号4からなる群から選択されたペプチド配列からなることを特徴とするターゲット特異的ヒトインターフェロン−βの生産量の増加方法を提供するものである。
本発明の他の目的は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供するものである。
本発明の他の目的は、前記ベクターで形質転換された宿主細胞を提供するものである。
本発明の他の目的は、（a）宿主細胞を提供する段階；と、（b）指定された細胞を培養する段階；と（c）前記細胞又は培養培地から免疫サイトカインを回収することにより、免疫サイトカインを製造する段階；を含む免疫サイトカインの製造方法を提供するものである。
［技術解決方法］
前記の目的を達成するために、本発明は、（a）ヒトインターフェロン−β変異体； と（b）前記ヒトインターフェロン−β変異体に直接又は間接的に共有結合された抗体又はその断片；を含む免疫サイトカインであって、前記ヒトインターフェロン−β変異体は、（i）配列番号1に開示されたアミノ酸配列の全体を含むポリペプチド、（ii）配列番号1に開示されたアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド、（iii）前記（a）又は（b）のポリペプチドと実質的に類似のポリペプチドで構成された群から選択され、ヒトインターフェロン−β活性を持つポリペプチドであって、N-結合型糖鎖を含むポリペプチドである、免疫サイトカインを提供するものである。
本発明の他の目的を達成するために、（a）ヒトインターフェロン−β変異体；と（b）ペプチドリンカー；と（c）抗体又はその断片；を含む融合ポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングする段階；と
（b）前記発現ベクターを宿主細胞にクローニングする段階；と
（c）前記宿主細胞を培養する段階；と
（d）前記細胞又は培養培地から前記融合ポリペプチドを回収する段階を含み、
前記ヒトインターフェロン−β変異体は、配列番号2〜配列番号4からなる群から選択されたペプチド配列からなることを特徴とするターゲット特異的ヒトインターフェロン−βの生産量の増加方法を提供するものである。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記免疫サイトカインをエンコードするポリヌクレオチドを提供するものである。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供するものである。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記ベクターで形質転換された宿主細胞を提供するものである。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、（a）宿主細胞を提供する段階；と、（b）提供された細胞を培養する段階；と（c）前記細胞又は培養培地から免疫サイトカインを回収することにより、免疫サイトカインを製造する段階；を含む、免疫サイトカインの製造方法を提供するものである。
以下、本発明を詳細に説明する。
サイトカインの治療の潜在能力は、低濃度でも起こる重症の副作用によって、しばしば制限を受け、これにより標的組織に十分なサイトカイン濃度が存在しないようにする。そこで、サイトカインの治療の潜在能力を増加させ、正常組織を毒性効果から保護するために抗体を使用してサイトカインを標的化し、これを病所に伝達することが免疫サイトカインによって可能である。
本発明に係る免疫サイトカインは、ヒトインターフェロン−βの変異体であり、天然型インターフェロン−βの糖鎖を導入させ、その活性や機能が増えた又は改良されたサイトカインである。本発明の発明者らは、前記のヒトインターフェロン−β変異体を抗体と結合して、免疫サイトカインの形で多発性硬化症、ウイルス性疾患などの標的治療に利用することができれば、天然型インターフェロン−βが接合された免疫サイトカインと比較して治療効果が優れていることがあることに着目し、本発明を完成した。
したがって、本発明は、（a）ヒトインターフェロン−β変異体；と（b）前記ヒトインターフェロン−β変異体に直接又は間接的に共有結合された抗体又はその断片；を含む免疫サイトカインであって、前記ヒトインターフェロン−β変異体は、（i）配列番号1に開示されたアミノ酸配列の全体を含むポリペプチド、（ii）配列番号1に開示されたアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド、（iii）前記（a）又は（b）のポリペプチドと実質的に類似のポリペプチドで構成された群から選択され、ヒトインターフェロン−β活性を持つポリペプチドであって、N-結合型糖鎖を含むポリペプチドである、免疫サイトカインを提供する。
天然型のヒトインターフェロン−βに比べてその活性又は機能の増加又は改善された前記ヒトインターフェロン−β変異体は、天然型のヒトインターフェロン−β又は天然型のヒトインターフェロン−β変異体で、そのアミノ酸配列のC末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリン配列を含み、前記付加配列のアスパラギン残基にN-結合型糖鎖を含むことを特徴とする。
請求の範囲を含む本明細書において、前記「天然型のヒトインターフェロン−β変異体」は、天然型のヒトインターフェロン−βに由来するアミノ酸配列の全部又は一部を有しながら、ヒトインターフェロン−βの活性を有するすべてのポリペプチドを含む意味である。
前記の「ヒトインターフェロン−βの活性」とは、ヒトインターフェロン−βが持つと知られている活性のうちの１つ以上として定義され、ポリペプチドはヒトインターフェロン−βとして同定されるように層別化される。そのような活性としては、既に前述した多発性硬化症の軽減、緩和又は治療活性、抗ウイルス活性、細胞の成長抑制活性、抗成長活性、抗増殖活性、リンパ球細胞毒性の増大活性、免疫調節活性、標的細胞の分化誘導又は抑制活性、サイトカイン生成の増加活性、細胞傷害性T細胞の効果の増加活性、マクロファージの効果増加活性、ナチュラルキラー細胞（natural killing cell）の増加活性、癌の予防又は治療活性、自己免疫疾患の予防又は治療活性、ウイルス感染の予防又は治療活性、HIVと関連する疾患の予防又は治療活性、C型肝炎の予防又は治療活性、関節リウマチの予防又は治療活性などを例示することができる。
また、前記の「天然型のヒトインターフェロン−βに由来するアミノ酸配列の全部又は一部を有するポリペプチド」とは、天然型のヒトインターフェロン−βのアミノ酸配列である配列番号1のアミノ酸配列の全部又はその実質的な部分を含むポリペプチドであるか、これらのポリペプチドと実質的に類似のポリペプチドを含む意味である。
ここで、前記「配列番号1のアミノ酸配列全体の実質的な部分を含むポリペプチド」とは、配列番号1のアミノ酸配列を有する天然型のヒトインターフェロン−βに比べ同等又はそれ以上の活性を持ったり、活性は低くても、まだヒトインターフェロン−βの活性を保持している配列番号1のアミノ酸配列の一部を含むポリペプチドとして定義され、前記「配列番号1に開示されたアミノ酸配列の全体又はその実質的な部分と実質的に類似のポリペプチド」とは、配列番号1の天然型のヒトインターフェロン−βに比べ同等又はそれ以上の活性を持ったり、活性は低くても、ヒトインターフェロン−βの活性を依然として保有しながら、複数の置換されたアミノ酸を含む配列番号1のアミノ酸配列の全部又はその実質的な部分を含むポリペプチドと定義される。
配列番号1に開示されたアミノ酸配列全体の実質的な部分を含むポリペプチドとして、配列番号1に開示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドでN末端部分及び／又はC末端部分が外れた場合を挙げることができ、配列番号1に開示されたアミノ酸配列の全体又はその実質的な部分と実質的に類似のポリペプチドとして、複数のアミノ酸が置換されても置換前のアミノ酸が置換されたアミノ酸と化学的に等価である場合には、例えば、疎水性アミノ酸であるアラニンが、他の疎水性アミノ酸に置換された場合には、特にもっと疎水性であるアミノ酸、例えばバリン、ロイシン又はイソロイシンで置換された場合を挙げることができる。
もちろん、場合によっては、N末端部分、C末端部分、又は置換されたアミノ酸がヒトインターフェロン−βの活性に不可欠なモチーフに関与することにより、N末端部分及び／又はC末端部分が外れたポリペプチド、又は置換されたアミノ酸を含むポリペプチドがヒトインターフェロン−βの活性を示さない場合があるが、それにも、配列番号1に由来する、前記ポリペプチドが、前記例示された活性のいずれかを有するかを確認することを通じて、及び／又は本発明の出願時を基準に、当業界に公知されたヒトインターフェロン−βの同定に関連した方法を介して、そのような不活性のポリペプチドを活性のポリペプチドと区別して検出することは、当業者の通常の能力の範囲内に属する。
したがって、本発明のヒトインターフェロン−β変異体は、C末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリン配列を含み、その位置にN-結合型糖鎖を含みつつ、ヒトインターフェロン−β活性を持つポリペプチド、又は野生型のインターフェロン−βの27番アルギニン（R27）の部位がスレオニンに変異（R27T）したり、セリンで変異（R27S）されたりしたものの一つとして定義することができ、より好ましくは配列番号2〜配列番号4のいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。
（a）配列番号1に開示されたアミノ酸配列全体を含むポリペプチド；と
（b）配列番号1に開示されたアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド；と
（c）前記（a）又は（b）のポリペプチドと実質的に類似のポリペプチド。
したがって、本発明のヒトインターフェロン−β変異体は、C末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリン配列を含みながら、その位置にN-結合型糖鎖を含む、ヒトインターフェロン−β活性を有するすべてのポリペプチドとして理解されるべきである。
このように、本発明のヒトインターフェロン−β変異体は、C末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリン配列を含みながら、その位置にN-結合型糖鎖を含むヒトインターフェロン−β活性を有するすべてのポリペプチドとして定義さされる。
より好ましくは、本発明の「ヒトインターフェロン−β変異体」は、配列番号2〜4のいずれかのアミノ酸配列を有するインターフェロン−βの突然変異タンパク質（mutein）であることができ、本発明者らによってカビペロン（Carbiferon）と命名された。本発明のカビペロンは、天然型のインターフェロン−β糖鎖が1〜2つ追加された形態をとる。より好ましくは、配列番号1のアミノ酸配列を有する天然型のヒトインターフェロン−βで27番のアミノ酸であるアルギニン（R）をスレオニン（T）又はセリン（S）で置換させたり、その天然型のヒトインターフェロン−βのC末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−トレオニン−バリン（GNITV）配列を含みながら、その位置にN-結合型糖鎖を含むポリペプチドを意味する。
ヒトインターフェロン−β変異体は、天然型インターフェロン−βに比べて向上又は増加された抗ウイルス活性、細胞成長抑制活性、免疫調節機能、生体内での半減期を示す。
前記配列番号2は、インターフェロン−β変異体であるR27Tのアミノ酸配列であり、配列番号3は、配列番号1の27番アミノ酸がSで置換されたインターフェロン−β変異体R27Sある。また、前記配列番号4は、終止コドンの後ろにGNITVアミノ酸を含むインターフェロン−β変異体GNITVのアミノ酸配列である。前記配列番号1〜4は、N末端に開始コドンを含むが、配列番号1〜4のタンパク質は、他のリンカーと接続するとき（リンカーのC末端とカビペロンのN末端が接続）省略することができる。つまり、配列番号1〜4のタンパク質の開始コドンの塩基配列ATG又はアミノ酸配列のメチオニンは省略することができる。
一方、前記「ヒトインターフェロン−β変異体」は韓国登録特許10-0781666号に詳細に記録されている。
本発明の抗体は、広義に使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片（目的とする抗原結合活性を示す限り）を含むが、これに限定されない多様な抗体構造を含む。天然の抗体は、様々な構造を有する分子である。例えば、天然IgG抗体は、ジスルフィド結合された2つの同一の軽鎖及び2つの同一の重鎖からなる、約150,000ダルトンの4量体の糖タンパク質である。N末端からC末端まで、それぞれの重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変ドメイン（VH）に続いて、3つ又は4つの定常ドメイン（CH1、CH2、CH3、及び必要に応じてCH4）を有している。同様に、N末端からC末端まで、それぞれの軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変ドメイン（VL）に続いて、定常軽鎖（CL）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる2つのタイプうちの一つを指定することができる。
本発明の抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体、及び／又はヒト化抗体であることができるが、これに限定されない。
前記キメラ抗体は、鼠類の免疫グロブリンの可変領域とヒト免疫グロブリンの保存領域で構成されている抗体を意味する。このような変形は、単にヒトの抗体の保存領域を鼠類の保存領域に置換させることで構成され、これにより、薬学的用途に許容可能なように十分に低い免疫原性を持つことができる人間／鼠類のキメラを生成する。
前記ヒト化抗体とは、非ヒト相補性決定領域（CDR）を有する抗体の配列を変形させることで、ヒトの抗体生殖細胞（germline）に由来するアミノ酸配列に（部分的又は全体的に）構成された抗体を意味する。抗体の可変領域及びCDRのヒト化は、当業界でよく知られている技法によって行われる。これらの抗体は、Fc依存エフェクター機能のために必要な、抗体に対する免疫反応の誘発をはるかに少なくさせるようなヒト保存領域を保有する。一例として、可変領域のフレームワーク領域は、非ヒトCDRを実質的に完全に残したり、あるいはCDRをヒトゲノムから由来した配列に置き換えたりと、対応するヒトのフレームワーク領域によって置換されている（例えば、特許出願US2006／25885を参照）。完全（fully）ヒト抗体は、ヒトの免疫系に対応するように、免疫系が改変された遺伝改変マウスで生産される。ヒト化抗体はまた、ヒトフレームワーク、非ヒト抗体の一つ又は複数のCDRを含み、存在する任意の保存領域が人間の免疫グロブリン保存領域と実質的に同一な、すなわち約85％又は90％以上が同じ、好ましくは95％以上が同じ、抗体を示す。したがって、ヒト化抗体のすべての部分（おそらくCDRは除いて）は、一つ又は複数の天然のヒト免疫グロブリン配列の相当する部分と実質的に同一である。
本発明での抗体断片は、抗体対応物（counterpart）と同じ抗原と反応することができる抗体断片を示す。これらの断片は、通常の技術者により簡単に同定することができ、これには一例として、Fab断片（例えば、パパイン消化による断片）、Fab'断片（例えば、ペプシン消化及び部分的還元による断片）、F（ab'）2断片（例えば、ペプシン消化による断片）、Facb（例えば、プラスミン消化による断片）、Fd（例えば、ペプシン消化、部分還元及び再凝集による断片）、及びscFv断片（短鎖Fv；例えば、分子生物学技法による断片）が含まれる。前記断片は、当業界で知られているか、及び／又は本明細書に開示されているように、酵素による分割、合成又は組換え技術によって生産されることができる。
本発明に係るヒトインターフェロン−β変異体が接合された免疫サイトカインは、抗体自体には見られない、細胞毒性とpSTAT-1のリン酸化を誘導してインターフェロン−β活性を示すことが確認された（実施例3及び4を参照）。
本発明は、また、前記の抗体又はその断片が、腫瘍抗原と多発性硬化症特異的抗原を含む群から選択された抗原に対する抗体又はその断片であることを特徴とする免疫サイトカインを提供する。
一定の大きさ以上に成長した腫瘍は、より成長したり、他の部位に転移するために新しい血管を形成する必要があることになる。したがって、新しい血管の形成に関連する分子及びシグナル伝達システムは、抗癌治療において重要な治療ターゲットになることがある。一方、インターフェロン−βは、腫瘍細胞の血管新生作用の阻害作用をすることにより、腫瘍細胞の増殖を阻害することが報告されている。また、インターフェロン−βは、腫瘍が存在する部位の周囲の環境から先天性又は後天性免疫反応を誘導することにより、腫瘍細胞の死滅を誘導して抗癌効果を示すことができる。
そこで、本願発明に係るヒトインターフェロン−β変異体は、天然型インターフェロン−βと比較して、その活性や機能が向上しているので、腫瘍抗原を特異的に認識する抗体と結合された免疫サイトカインの形態として、癌患者の標的治療に使用される場合、天然型インターフェロン−βが接合された免疫サイトカインに比べて、より優れた治療効果を示すことができる。
前記腫瘍抗原は、免疫応答、特にT細胞で媒介された免疫反応を引き出す腫瘍細胞によって生産されるタンパク質である。腫瘍抗原は、当該技術分野でよく知られており、例えば、糖鎖関連抗原、癌胎児性抗原（CEA）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、α-フェトプロテイン（AFP）、レクチン拮抗AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2（AS）、カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、プロスターゼ、前立腺特異抗原（PSA）、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、プロスタシン、PSMA、Her2／neu、サバイビン（survivin）とテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1（PCTA-1）、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、CD22、インスリン成長因子（IGF）-I、IGF-II、IGF-I受容体とメソテルリンを含む。
本発明の腫瘍抗原のタイプはまた、腫瘍特異的抗原（TSA）又は腫瘍関連抗原（TAA）である。TSAは、腫瘍細胞に固有し、身体の他の細胞上で発生しない。TAAに関する抗原は、腫瘍細胞に固有せず、代わりにまた抗原に対する免疫原性耐性の状態を誘発していない条件の下で、正常細胞上で発現される。腫瘍に対する抗原の発現は、免疫系が抗原に対して反応するようにする条件の下で発生することができる。TAAは、免疫系が成熟しておらず、反応することができない場合は、胎児の発達中に、正常細胞上で発現される抗原であることができるか、正常細胞上で非常に低いレベルで正常に存在するが、腫瘍細胞上ではるかに高いレベルで発現される抗原であることができる。
TSA又はTAA抗原の非限定的な例としては、以下が含まれる：MART-1／MelanA（MART-I）、gp100（Pmel 17）、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2のような分化抗原とMAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15のような腫瘍特異的多重抗原システム；CEAのような過発現された胚抗原；過発現された腫瘍の遺伝子とp53、Ras、HER-2／neuのような突然変異された腫瘍抑制遺伝子；染色体転座からもたらされた固有の腫瘍抗原；例えばBCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；及びウイルス抗原、例えばエプスタイン・バール・ウイルス抗原EBVAとヒトパピローマウイルス（HPV）抗原E6及びE7。他の大規模な、タンパク質系抗原は、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-フェトプロテイン、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68＼P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733＼EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB／70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90＼Mac-2結合性タンパク質＼サイクロフィルリンC関連タンパク質、TAAL6、TAG72、TLP、及びTPSが含まれる。
前記腫瘍抗原を特異的に認識する抗体では、例えば、HuM195（例えば、Kossman et al．、（1999）Clin．Cancer Res．5：2748-2755を参照）、CMA-676（例えば、Sievers et al．、（1999）Blood 93：3678-3684を参照）、AT13／5（例えば、Ellis et al．、（1995）J．Immunol．155：925-937を参照）、HB7、トラスツズマブ（例えば、HERCEPTIN； Fornier et al．、（1999）Oncology（Huntingt）13：647-58）、TAB-250（Rosenblum et al．、（1999）Clin．Cancer Res．5：865-874）、BACH-250（Id．）、TA1（Maier et al．、（1991）Cancer Res．51：5361-5369）、及び米国特許第5,772,997号；第5,770,195号に記載されたmAb（mAb 4D5； ATCC CRL10463）；及び米国特許第5,677,171号に記載されたmAb、Mc5（例えば、Peterson et al．、（1997）Cancer Res．57：1103-1108； Ozzello et al．、（1993）Breast Cancer Res．Treat．25：265-276を参照）、hCTMO1（例えば、Van YM et al．、（1996）Cancer Res．56：5179-5185参照）、CC49（例えば、Pavlinkova et al．、（1999）Clin．Cancer Res．5：2613-2619を参照）、B72.3（例えば、Divgi et al．、（1994）Nucl．Med．Biol．21：9-15参照）、マウスモノクローナル抗-HM1.24 IgG2a／κ、ヒト化抗-HM1.24 IgG1／κ抗体（例えば、Ono et al．、（1999）Mol．Immuno．36：387-395を参照）、トラスツズマブ（例えば、HERCEPTIN、Fornier et al．、（1999）Oncology（Huntingt）13：647-658参照）、TAB-250（Rosenblum et al．、（l999）Clin．Cancer Res．5：865-874）、BACH-250（Id．）、TA1（例えば、Maier et al．、（1991）Cancer Res．51：5361-5369参照）、リツキシマブ（rituximab）、イブリツモマブ チウキセタン（Ibritumomab tiuxetan）、及びトシツモマブ（tositumomab）、AME-133v（Applied Molecular Evolution）、オクレリズマブ（Ocrelizumab）（Roche）、オファツムマブ（Ofatumumab）（Genmab）、TRU-015（Trubion）とIMMU-106（Immunomedics）などが含まれるが、これらに限定されない。
本発明は、前記記載された抗体の使用を制限する必要がなく、当業者に知られているような他の抗体は、本明細書に記述された組成物及び方法で使用することができる。
一方、IFN-βは、最初に多発性硬化症の治療薬として導入されたのは、抗ウイルス効果を得るためにあったが、以来、多くの研究を通して、その作用機序が明らかになっている。まずIFN-βはIFN-αによって誘導されるHLA class II分子の活性化を抑制することにより、抗原発現を阻害し、T細胞の活性化を妨げる。また、IFN-βは共刺激分子を無効にさせてT細胞の活性化を抑制し、自己反応性T細胞がアポトーシス（apoptosis）するように誘導することもある。脳血管バリアー（brain-blood barrier）のIFN-βの効果は、T細胞が血管内皮細胞に付着するのを抑制し、脳に入る能力を減少させると考えられ、実際にMRI研究をみると、IFN-β治療を受けた約90％の多発性硬化症の患者で造影増強病変が減少したとの報告がある。
そこで、本願発明に係るヒトインターフェロン−β変異体は、天然型インターフェロン−βと比較して、その活性や機能が向上しているので、多発性硬化症特異的抗原を認識する抗体と結合された免疫サイトカインの形態として標的治療に使用される場合、インターフェロン−β単独製剤の治療効果よりも優れた効果を示すことができる。
多発性硬化症特異的抗原と抗体は、例えば、CD20とこれを認識する抗体であるリツキシマブ、CD52とこれを認識するモノクローナル抗体であるアレムツズマブ、とインターロイキン-2のアルファ受容体と、これを認識しているダクルリジュマプ（daclizumab）が挙げられるが、これらに限定されているわけではない。
本発明は、また、前記ヒトインターフェロン−β変異体は、ペプチドリンカーによって前記抗体又はその断片に結合している免疫サイトカインを提供する。ペプチドリンカーは、アミノ酸又はアミノ酸の類似物質が互いにペプチド結合によって二つ以上が接続された短い断片のアミノ酸又はアミノ酸類似体で、複数の別個の物質を相互に接続させる役割をする分子をいう。グリシン、セリン、アラニンなどが主な構成アミノ酸として利用されてグリシン−セリンリンカー、グリシン−セリン−アラニンリンカーなどを使用することができ、本発明の好ましい実施例によれば、前記リンカーは、配列番号5〜配列番号11のいずれかのアミノ酸配列で構成されたり、これを含んだりすることができる。
本発明の免疫サイトカインは、好ましくは、ヒトインターフェロン−β変異体と抗体又はその断片のポリペプチドの間に挿入された可撓性リンカー配列を含むことができる。前記リンカー配列は、前記の抗体又はその断片の前記ヒトインターフェロン−β変異体の有効な位置決めを可能にして、前記両方のドメインの作用活性を可能にする。
前記リンカーは、天然由来のペプチドリンカー又は合成由来のペプチドリンカーを意味する。前記ペプチドリンカーは、直鎖アミノ酸鎖で構成され、この時、20種の自然発生アミノ酸は、モノマーブロックである。リンカーは、反復アミノ酸配列を持つことができたり、自然発生ポリペプチド、例えば、ヒンジ機能を有するポリペプチドの配列を持ったりすることができる。すべてのペプチドリンカーが核酸分子によってコードされることができるので、組換え的に発現されることができる。リンカーは、それ自体がペプチドであるため、ヒトインターフェロン−β変異体と抗体又はその断片は、ペプチド結合を介してリンカーに接続される。
リンカーは、ペプチド結合によって一緒に接続されたアミノ酸、好ましくはペプチド結合によって接続された1〜20個のアミノ酸で構成され、この時、アミノ酸は、20個の天然のアミノ酸から選択される。これらのアミノ酸のいずれかは、当該分野の熟練者によって理解されるように、グリコシル化される。これらに限定されるものではないが、好ましくは、1〜20個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリジンから選択される。
適切なリンカーには、例えば、切断可能なリンカーと切断不可能なリンカーを含む。切断可能なリンカーは、典型的には、細胞内の条件下で容易に切断される。適切な切断可能なリンカーには、例えば、細胞内プロテアーゼ、例えば、リソソームプロテアーゼ又はエンドソームのプロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーを含む。
前記リンカーは、例えば、前記抗体の重鎖C末端にリンカーのN末端が接続される。抗体の重鎖C末端への接続は、好ましくは、本発明の抗体を発現する発現ベクターに、リンカー配列をコードする塩基配列がタンパク質の発現のフレームが一致するように接続されて、発現ベクターによって発現される抗体に直接接続されることができる。また、前記リンカーは、抗体の軽鎖C末端に接続されたり、抗体の軽鎖C末端と重鎖C末端の両方に接続されたりできる。また、前記リンカーのC末端に、本発明のインターフェロン−β変異体のN末端が接続される。
本発明のペプチドリンカーは、当業界に公知されたペプチドリンカーであることができるが、好ましくはグリシン−セリンリンカー又は配列番号5〜配列番号11のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーであることができる。
好ましくは、グリシン−セリンリンカー、例えば、（GlyxSery）z型（xは1〜5の整数、yは1〜2の整数であり、zは1〜6の整数）、例えば（gly4ser1）3又は（gly3ser2）3を挙げることができ、より好ましくは、GGGGS又はGGGGSGGGGSGGGSGのアミノ酸配列で表示されるリンカーであることができるが、これに限定されるものではない。
本発明は、また、前記ヒトインターフェロン−β変異体ポリペプチドのアミノ酸配列は、前記の抗体又はその断片のアミノ酸配列に対して重鎖C末端、軽鎖C末端又は重鎖及び軽鎖C末端位置にあることを特徴とする免疫サイトカインを提供する。
前記ヒトインターフェロン−β変異体のアミノ酸配列は、抗体又はその断片のアミノ酸配列に対して重鎖C末端、軽鎖C末端又は重鎖及び軽鎖C末端位置にあることができ、好ましくは、抗体又はその断片のアミノ酸配列についてC末端位置にある。
本発明は、また、前記免疫サイトカインは、配列番号12、13、15、又は17からなる群のいずれかのアミノ酸配列を含むことを特徴とする免疫サイトカインを提供する。
本発明は、（a）配列番号2〜配列番号4のいずれかで表示されているヒトインターフェロン−β変異体；と（b）配列番号5〜配列番号11のいずれかで表示されているペプチドリンカー；と（c）抗体又はその断片；を含む免疫サイトカインを提供する。
本発明は、また、前記免疫サイトカインをエンコードするポリヌクレオチドを提供する。
前記ポリヌクレオチドは、本発明のヒトインターフェロン−β変異体と抗体又はその断片が結合された免疫サイトカインのペプチドをエンコードするものであれば制限なく使用することができ、DNA、cDNA、及びRNA配列をすべて含む。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、配列番号3で示されるアミノ酸配列を持つか、又は前記アミノ酸配列と少なくとも70％以上の相同性（homology）があるアミノ酸配列を有するペプチドをエンコードする物質をいい、これは天然分離されたり、当業界の公知の遺伝子工学的方法により製造したりすることができる。
本発明は、また、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
前記ベクターは、当業者が、当業界で知られている任意の方法により、本発明のポリヌクレオチドをベクター内に挿入して、適切な転写／翻訳調節配列を用いて、本発明の免疫サイトカインを発現するように製造された発現ベクターをいう。
本発明に基づいてクローニングされた前記ポリヌクレオチド配列は、適切な発現調節配列に作動可能に接続することができ、前記作動可能に接続された遺伝子配列と発現調節配列は、選択マーカー、複製開始点（replication origin）を共に含む一つの発現ベクター内に含まれることができる。「作動可能に連結（operably linked）」というのは、前記ポリヌクレオチド配列が発現調節配列に遺伝子発現を可能にする方法で接続されたことを意味する。前記「発現調節配列（expression control sequence）」とは、特定の宿主細胞で作動可能に接続されたポリヌクレオチド配列の発現を調節するDNA配列を意味する。そのような調節配列は、転写を実施するためのプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なmRNAリポソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の終結を調節する配列などからなる群から選択された一つ以上を含むことができる。
前記発現ベクターの発現ベクターとして使用されるベクターは、特別な制限がなく、この発明が属する技術分野で宿主細胞として使用される微生物での発現のために通常使用されるすべてのプラスミド、ウイルス、又はその他の媒体などが使用可能である。例えば、前記プラスミドは、大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pBR325、pUC118とpUC119、pET-22b（+））、バチルスサブチリス由来プラスミド（pUB110とpTP5）と酵母由来プラスミド（YEp13、YEp24、及びYCp50）などがあり、前記ウイルスはレトロウイルス、アデノウイルス、又はワクチニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスなどが使用されることがあるが、これらに限定されるものではない。
本発明は、また、前記ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
宿主細胞は、挿入された配列の発現を調節するか、又は望ましい特定の方法で遺伝子産物を進めることを選択することができる。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳及び翻訳後のプロセシングと変形の、特徴的で特異的な機序を持っている。適切な細胞株又は宿主システムには、発現された異種タンパク質の望ましい変形とプロセシングを提供するように選ぶことができる。酵母での発現は、生理活性の生成物を生産することができる。真核細胞での発現は、「天然」フォールディングの可能性を増加させることができる。
本発明のベクターを安定的で連続的にクローニング及び発現させることができる宿主細胞は、当業界に公知されている任意の宿主細胞も利用することができ、例えば、E.coli JM109、E.coli BL21DE、E.coli DH5、E、coli RR1、E.coli LE392、E.coli B、E.coli X1776、E.coli W3110などが使用されることができ、また、アグロバクテリウムA4のようなアグロバクテリウム属菌株、バチルスサブチリス（Bacillus subtilis）のような桿菌（bacilli）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）又はセラチアマルセッセンス（Serratia marcescens）のような他の腸内細菌、様々なシュードモナス（Pseudomonas）属菌株が宿主細胞として使用することができる。
また、本発明のベクターを真核細胞に形質転換させる場合には、宿主細胞としては、酵母（Saccharomyces cerevisiae）、昆虫細胞、及びヒト細胞（例えば、CHO細胞株（Chinese hamster ovary）、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RINとMDCK細胞株）などが利用できる。
本発明では、宿主細胞は、好ましくは、CHO細胞とすることができる。
ベクターを宿主細胞内に伝達して宿主細胞を形質転換させる方法は、公知の方法であればどのようなものであれ可能で、特に制限されない。例えば、リン酸カルシウム沈殿法（calcium phosphate precipitation）、DEAE-dextran法、エレクトロポレーション法（electroporation）、直接マイクロインジェクション法（direct microinjection）、DNA担持リポソーム（DNA loaded liposome）法、Lipofectamine-DNA複合体（Lipofectamine-DNA complex）法、細胞音波粉砕法（cell sonication）、高速ミクロ射出粒子（high velocity microprojectile）を利用した遺伝子銃（gene bombardment）、ポリカチオン（polycation）法と受容体媒介形質転換法（receptor-mediated transfection）によって形質転換することができる。この技術の一部は、生体内又は生体外の使用のために改良されることができる。
本発明は、また、（a）宿主細胞を提供する段階；と、（b）指定された細胞を培養する段階；と（c）前記細胞又は培養培地から免疫サイトカインを回収することにより、免疫サイトカインを製造する段階；を含む、免疫サイトカインの製造方法を提供する。
形質転換微生物の培養は、目的タンパク質であるヒトインターフェロン−β変異体と抗体又はその断片が結合された免疫サイトカインの発現を可能にする適切な条件の下で行い、これらの条件は、当業者によく理解された公知の方法に基づいて行うことができる。形質転換微生物は、通常の培養方法により大量に培養することができる。培養培地には、炭素源、窒素源、ビタミン及びミネラルで構成された培地を使用することができ、例えば、LB培地（Luria-Bertani Broth）を使用することができる。微生物の培養は、通常の微生物の培養条件で可能であり、例えば、温度範囲15℃〜45℃で10時間〜40時間の間培養することができる。培養液中の培養培地を除去し、濃縮された菌体のみを回収するために遠心分離（centrifugation）又は濾過（filtration）過程を経ることができ、これらの手順は、当業者が必要に応じて行うことができる。濃縮された菌体は、通常の方法によって冷凍（frozen）又は凍結乾燥（lyophilized）して、その活性を失わないように維持することができる。
形質転換微生物（又は形質転換体）で発現させたタンパク質は、通常の方法で精製されることができ、例えば、塩析（例えば、硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿）、溶媒沈殿（アセトン、エタノール等を利用したタンパク質分画沈殿）、透析、ゲルろ過、イオン交換、逆相カラムクロマトグラフィーのようなカラムクロマトグラフィー、及び限外濾過などの技法を単独又は組み合わせで適用させて、本発明の免疫サイトカインを精製することができる（Maniatis et al．、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY（1982）； Sambrook et al．、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、2d Ed．、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）； Deutscher、M.、Guide to Protein Purification Methods Enzymology、vol．182 Academic Press．Inc．、San Diego、CA（1990））。
本発明のヒトインターフェロン−β変異体が接合された免疫サイトカインの場合、ヒトインターフェロン−βが接合された免疫サイトカインより顕著に優れた効率で免疫サイトカインを製造することができる（実施例2参照）。
一方、本発明は、
（a）ヒトインターフェロン−β変異体；と（b）ペプチドリンカー；と（c）抗体又はその断片を含む融合ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングする段階；と
（b）前記発現ベクターを宿主細胞にクローニングする段階；と
（c）前記宿主細胞を培養する段階；と
（d）前記細胞又は培養培地から前記融合ポリペプチドを回収する段階を含み、
前記ヒトインターフェロン−β変異体は、配列番号1〜配列番号4からなる群から選択されたペプチド配列からなることを特徴とするターゲット特異的ヒトインターフェロン−βの生産量の増加方法を提供する。
本発明の生産量の増加方法の各構成要素については、前記で記載した通りであり、ターゲット特異的ヒトインターフェロン−βは、本発明の免疫サイトカインを示すことができる。
［有利な効果］
本発明のヒトインターフェロン−β変異体と抗体又はその断片を含む免疫サイトカインはインターフェロン−βの活性及び抗体の特性を同時に示し多発性硬化症やがんの標的治療に利用することができ、本発明に係る免疫サイトカインは、天然型インターフェロン−βが接合された免疫サイトカインと比較して優れた効率で生産することができる。
図１は、本発明による宿主細胞から製造された免疫サイトカインの発現量をウエスタンブロットを介して確認した結果である（1：培養培地（Media）、2：B12重鎖−天然型インターフェロン、3：B12重鎖−インターフェロン変異体、4：B12軽鎖−天然型インターフェロン、5：B12軽鎖−インターフェロン変異体）。 図２は、本発明のヒトインターフェロン−β変異体が接合された免疫サイトカインを示した模式図である。 図３は、pRBLX2ベクターに重鎖−リンカー−インターフェロンで構成された遺伝子の塩基配列を挿入してpRBLX2-INFを製作する過程（左）とpRBLX2ベクターに重鎖−リンカー−インターフェロン−β変異体で構成された遺伝子の塩基配列を挿入してpRBLX2-INFを製作する過程（右）を示した模式図である。 図４は、本発明のヒトインターフェロン−β変異体が接合された免疫サイトカイン（右）とヒトインターフェロン−βが接合された免疫サイトカイン（左）の発現をSDS-PAGEで確認したものである。このとき、それぞれの重鎖及び軽鎖は、▲で表示した（1番レーンはマーカー（Marker）である）。 図５は、本発明のヒトインターフェロン−β変異体が接合された免疫サイトカイン（2番レーン）と対照群のヒトインターフェロン−βが接合された免疫サイトカイン（1番レーン）のタンパク質発現を、それぞれ抗ヒトIgG抗体（左）及び抗インターフェロン−β抗体（右）を用いたウエスタンブロットで確認したものである。 図６は、宿主細胞から製造された免疫サイトカインの発現量を、BCA分析を介して確認した結果である（ACC＃1：B12重鎖−天然型インターフェロン、ACC＃2：B12重鎖−インターフェロン変異体、ACC＃6：B12軽鎖−天然型インターフェロン、ACC＃7：B12軽鎖−インターフェロン変異体）。 図７は、本発明に係るヒトインターフェロン−β変異体とB12抗体が結合された免疫サイトカインのインターフェロン活性をSTAT-1のリン酸化によって確認した結果である。 図８は、本発明に係るヒトインターフェロン−β変異体とB12抗体が結合された免疫サイトカインを細胞に24時間処理した後、細胞毒性を介してインターフェロン−β活性を確認した結果である（Carbiferon：ヒトインターフェロン−β変異体、B12：B12抗体、ACC＃2：ヒトインターフェロン−β変異体とB12が結合された免疫サイトカイン）。 図９は、本発明に係るヒトインターフェロン−β変異体とB12抗体が結合された免疫サイトカインを細胞に48時間処理した後、細胞毒性を介してインターフェロン−β活性を確認した結果である（Carbiferon：ヒトインターフェロン−β変異体、B12：B12抗体、ACC＃2：ヒトインターフェロン−β変異体とB12が結合された免疫サイトカイン）。 図１０は、ERBB2（Herceptin）抗体（A）及びc-MET抗体（B）にRigid Helicalリンカーを結合した後、ヒトインターフェロン−β変異体を結合して製造した免疫サイトカインを図で表したものである。
以下、本発明を詳細に説明する。
但し、下記の実施例は、本発明を例示するものであり、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
［実施例1］
ベクタークローニング及び宿主細胞形質転換
抗体重鎖とインターフェロン−β変異体が結合された免疫サイトカイン（ACC＃2）と抗体軽鎖とインターフェロン−β変異体が結合された免疫サイトカイン（ACC＃7）をクローニングするために、B12の配列を用いた。B12配列の重鎖と軽鎖にそれぞれリンカーを利用して、ヒトインターフェロン−β変異体配列を挿入した後、ベクターに合成した。合成された遺伝子を、それぞれに合った制限酵素で切断して保有しているIgG発現ベクターにライゲーションさせた後、シーケンシング作業を通じて、最終的にACC＃2と＃7を発現するベクターを作製した。クローニングが完了したACC＃2、ACC＃7ベクターは、形質転換を通じて大量に抽出した後、形質転換に使用した。
CHO-S cellは3×105cells／mlの密度で5 passage以上継代培養を行い、形質転換を準備した。継代培養が行われた後、細胞の生存率が90％以上に維持がされると、5×105cells／mlの密度で細胞を播種し、形質転換を準備した。細胞播種をして、24時間後の生存率（95％）と細胞密度（1×106 cells／ml）を確認した後、形質転換溶媒を利用して、50μg DNAを30ml培養培地で培養されているCHO-S cellに形質転換した。
［実施例2］
宿主細胞での免疫サイトカイン発現を確認
細胞を形質転換してから48時間経過後に、濃度測定（BCAアッセイ）とウエスタンブロットでACC＃2、＃7の発現量を確認した。
BCA分析の場合には、試薬A（Sodium carbonate、Bicinchoninic acidなどを含む）と試薬B（4％ cupric sulfateを含む）を50：1の割合で製造して標準溶液（BSA溶液で、0〜2000μg／mL）と試料と混合した（10μlの試料と200μlの試薬）。この溶液を37℃で30分間インキュベーションした後、562nmで吸光度を測って濃度を計算した。濃度の計算には、標準液をもとに得られた検量線を用いた。
ウエスタンブロット実験は、以下のように行った。まず、培養したそれぞれの培地を集め、10％ SDS PAGEをした。ゲルをPVDF膜にトランスファーし、5％BSA溶液でブロッキングし、1、2次抗体を付けた。TBST溶液で洗浄まで完了した後で、フィルムで膜を仕上げた。Developerとfixerでフィルムの画像を現像した。
その結果、B12の重鎖と軽鎖に天然型のヒトインターフェロンが接合された免疫サイトカインに比べてヒトインターフェロン−β変異体が接合された免疫サイトカインの発現量が多いことが分かった（図１）。
［実施例3］
免疫サイトカインの製造
抗体の重鎖（Heavy chain）の部位に配列番号5で示されるリンカーを挿入し、インターフェロン−β又はインターフェロン−β変異体を結合するようにした。図２に、ヒトインターフェロン−β変異体が接合された免疫サイトカインの構造を模式図に示した。
抗体の重鎖（heavy chain）の部位に配列番号5で表されるリンカーとインターフェロン−βとインターフェロン−β変異体をクローニングした。その後、全体の遺伝子の3'-末端と5'-末端にそれぞれ制限酵素AvrII（CCTAGG）切断部位とBstz17I（GTATAC）切断部位を挿入して重鎖の最終的な遺伝子を確保した。また、抗体の軽鎖（light chain）の3'-末端と5'-末端にそれぞれ制限酵素EcoRV（GATATC）切断部位とPacI（TTAATTAA）を挿入して軽鎖の最終的な遺伝子を確保した。図３に製作する過程を模式図に示した。
［実施例4］
免疫サイトカインの発現を確認
ヒトインターフェロン−βが接合された免疫サイトカインとインターフェロン-ベータ変異体が接合された免疫サイトカインの発現を確認するために、50μgのpRBLX2-INFあるいはpRBLX2-CAFベクターをCHO-S細胞にトランスフェクションした後、7日間培養しながら発現を誘導した。7日後に培養液を回収し、遠心分離（8000rpm、10分）をして、細胞を除去した。細胞が除去された培養液を少量採取し、5xサンプルバッファーと混合し、100℃で10分間沸騰させて、タンパク質が十分に変性するように誘導した。用意されたサンプルを、マーカー（Marker）と一緒にTricine SDS-PAGEゲルにロードし、130vの電圧で1時間30分間電気泳動を行った。この後、ゲルを慎重に分離した後、クマシブルー染色溶液（comassie blue staning solution）に浸して30分間振って染色した。染色が終わった後、ゲルを脱染色（Destaning）バッファーに移し、30分間振りながら脱染色をした。脱染色は、3回繰り返して行った。
より明確な発現量の比較のために抗インターフェロン−β抗体と抗ヒトIgG-HRPを使用してウェスタンブロッティングを行った。前記と同様の方法でTricine SDS-PAGEを実行した後、ゲルを慎重に取り外して3Mペーパー上に置いて、その上にPVDF（polyvinylidene difluoride）膜を置いた後、再び3Mペーパーを載せ、1xトランスファーバッファーに浸し、100v電圧で70分間、タンパク質をトランスファーした。Tris-buffered saline-Tween20（TBS-T、0.1％Tween20）を5％加えて膜を1時間30分間室温でブロッキングした。PVDF膜をTBS-Tで2回洗浄したあと、TBS-Tに浸しておいた。抗インターフェロン−β抗体の場合、TBS-Tで1：1000に希釈して準備し、抗ヒトIgG-HRP抗体の場合、TBS-Tで1：3000に希釈して準備した。膜を抗体希釈水に浸し、室温で2時間振盪して反応させた。このプロセスが完了したら、10分間に3回TBS-Tで拭き、常温で西洋わさびペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase； HRP）が結合された二次抗体を添加して1時間反応した。もう一度洗浄工程を行った後、バンドをECL試薬（enhanced chemiluminescence reagent、Intron）で確認した。バンドの強度は、C-DiGit（LI-COR、USA）を用いて測定した。
その結果、図４に示すように、25KDaの場所で軽鎖が観察され、70〜100KDaの間にヒトインターフェロン−βが接合された免疫サイトカインあるいはヒトインターフェロン−β変異体が接合された免疫サイトカイン複合体が観察された。
また、図５のレーン1は、ヒトインターフェロン−βが接合された免疫サイトカイン、レーン2は、ヒトインターフェロン−β変異体が接合された免疫サイトカインである。Tricine-SDS PAGE及びウェスタンブログティングの結果は、ヒトインターフェロン−βが接合された免疫サイトカインよりヒトインターフェロン−β変異体が接合された免疫サイトカインの発現量が高いことが確認できた。また、正確な発現量の比較のために培養液をそれぞれCedex bio（Roche社、米国）で測定を行った。その結果、ヒトインターフェロン−βが接合された免疫サイトカインは、濃度が測定範囲以下（10mg／L以下）の低発現量が確認され、ヒトインターフェロン−β変異体が接合された免疫サイトカインは、約32mg／Lのレベルで、少なくとも3倍以上に発現量が増加したことを確認した。
［実施例5］
pSTAT-1のリン酸化を介して、免疫サイトカインのインターフェロン活性確認
本発明に係るヒトインターフェロン−β変異体とB12抗体が結合された免疫サイトカインのインターフェロン機能を確認するために、インターフェロン又は抗体−インターフェロン接合体の処理によってSTAT-1がリン酸化するかどうかを検証した。
6ウェルプレートの各ウェルに3x105個のOVCAR-3細胞を分取した後、24時間、37.5℃、5％ CO2環境で培養した。24時間後、細胞培養液を除去し、ヒトインターフェロン−β変異体（carbiferon）600ng／ml、ヒトインターフェロン−β変異体とB12抗体が結合された免疫サイトカイン（ACC）600ng／ml又は1800ng／mlの濃度になるように培養液に希釈して1時間処理した。この後、プレートを回収し、各ウェルをPBSで3回洗浄した後、プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤が含まれているRIPAバッファー100μlで処理して、30分間氷上に置いて、細胞を溶解させた。溶解された細胞を1.5mlチューブに入れて13000rpm、4℃の条件で遠心分離して上澄み液（lysate）のみ回収した後、新しいチューブに集めた。BCA定量法を用いて、溶解物のタンパク質濃度を定量した後30μgの溶解物を採取し、5xサンプルバッファーと混合し、100℃で10分間沸騰させて、タンパク質が十分に変性されるように誘導した。用意されたサンプルを、マーカー（Marker）と一緒に10％SDS-PAGEゲルにロードして、70Vで30分、120Vで1時間電気泳動した。その後、ゲルを慎重に取り外して3Mペーパー上に置いて、その上にPVDF（polyvinylidene difluoride）膜を置いた後、再び3Mペーパーを載せてトランスファーバッファーに浸し、100Vで90分間のタンパク質トランスファーを行った。5％のBSAを含むTris-buffered saline-Tween20（TBS-T、0.1％Tween20）で膜を1時間30分の間ブロッキングした後、抗p-STAT1抗体の場合TBS-Tで1：1000に希釈して準備し、抗GAPDH抗体の場合、TBS-Tで1：3000に希釈して準備した。膜を抗体希釈水に浸し、室温で2時間振盪して反応させた。このプロセスの終了後、10分間3回TBS-Tで拭いて、常温で西洋わさびペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase； HRP）が結合された二次抗体を添加して1時間反応した。もう一度洗浄工程を行った後、バンドをECL試薬（enhanced chemiluminescence reagent、Intron）で処理した後、フィルムに現像した。
結果として、ヒトインターフェロン−β変異体（carbiferon）とB12抗体が結合された免疫サイトカイン中のインターフェロン−βの活性は、ヒトインターフェロン−βと免疫サイトカインの両方において、pSTAT-1のリン酸化を示した（図７）。
［実施例6］
細胞毒性実験による免疫サイトカインのインターフェロン活性確認
本発明に係るヒトインターフェロン−β変異体とB12抗体が結合された免疫サイトカインのインターフェロン機能を確認するために、インターフェロン又は抗体−インターフェロン接合体の処理に伴う細胞毒性かどうかを確認した。
細胞毒性を確認するために、96-ウェルプレートの各ウェルに1x104個のOVCAR-3細胞を分取した後、24時間、37.5℃、5％ CO2の環境で培養した。24時間後、細胞培養液を除去し、ヒトインターフェロン−β変異体（carbiferon）、B12抗体との免疫サイトカインを10〜10000ng／mlの濃度で処理した後、24時間若しくは48時間培養した。24時間あるいは48時間培養した後、培養液を除去し、PBS洗浄を2回行った後、WST試薬を1:10で培養液に混ぜて、各ウェル当たり100μlずつ処理した後、37.5℃、5％ CO2環境で2時間の間放置した後、430nmの波長で吸光度を測定した。
その結果、B12抗体だけを処理した細胞群では、細胞毒性が示されなかったが、ヒトインターフェロン−β変異体と免疫サイトカインを処理した細胞群では、細胞毒性が濃度依存的に示されることから見て、ヒトインターフェロン−β変異体が免疫サイトカインの形態でもまだインターフェロン活性を示すことを確認した（図８及び図９）。
［実施例7］
抗体重鎖とインターフェロン-ベータ変異体が結合された免疫サイトカインの製造
B12抗体以外のERBB2（Herceptin）抗体とc-MET抗体を利用して、インターフェロン−β変異体を組み合わせた免疫サイトカインを次のように製造した。
図１０に示すように、ERBB2（Herceptin）抗体とc-MET抗体の重鎖（heavy chain）の部位にRigid Helicalリンカーを結合した。その後、ヒトインターフェロン−β変異体を結合して抗c-Met免疫サイトカイン（A）と抗ERBB2免疫サイトカイン（B）を発現する発現カセットを製造した。
これをpRBLX2にそれぞれクローニングし、各ベクターをCHO-S細胞にトランスフェクションした後、7日間培養しながら発現を誘導した。トランスフェクション、培養及び発現物の回収は、実施例4に記載されたところにより行った。
各発現量をCHO-S細胞を用いて、c-Met抗体又はERBB2抗体にヒトインターフェロン−βが接合された免疫サイトカインとヒトインターフェロン−β変異体が接合された免疫サイトカインの発現量を比較すると、ヒトインターフェロン−βが接合された免疫サイトカインに比べて、ヒトインターフェロン−β変異体が接合された免疫サイトカインの発現量がより多く、インターフェロンの活性がより優れて確認することができた。
これにより、本発明のヒトインターフェロン−β変異体が発現時、野生型のインターフェロン−βに比べても発現が非常によく行われることが確認できた。
本発明に係るヒトインターフェロン−β変異体が接合された免疫サイトカインの場合は、天然型インターフェロン−βより優れたインターフェロン活性と特定の抗原を認識する抗体の特性がすべて現れるという点で多発性硬化症、癌などの疾患の標的治療剤として使用することができ、天然型インターフェロン−βが接合された免疫サイトカインと比較して、その生産効率が著しく高いことから、産業上の利用可能性に優れる。

Claims (11)

  1. （a）配列番号2で表示されるペプチド配列を含むヒトインターフェロン−β変異体と、
    （b）前記ヒトインターフェロン−β変異体に直接又は間接的に共有結合された抗体又はその断片とを含む免疫サイトカインであって、
    前記ヒトインターフェロン−β変異体は、ヒトインターフェロン−β活性を有し、N-結合型糖鎖を含む、免疫サイトカイン。
  2. 前記抗体又はその断片は、腫瘍性抗原に対する抗体又はその断片であることを特徴とする請求項１に記載の免疫サイトカイン。
  3. 前記ヒトインターフェロン−β変異体は、ペプチドリンカーによって前記抗体又はその断片に結合している請求項１に記載の免疫サイトカイン。
  4. 前記リンカーは、配列番号5〜配列番号11からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項３に記載の免疫サイトカイン。
  5. 前記ヒトインターフェロン−β変異体のポリペプチドのアミノ酸配列は、前記の抗体又はその断片のアミノ酸配列に対して重鎖C末端、軽鎖C末端又は重鎖及び軽鎖C末端にあることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の免疫サイトカイン。
  6. 前記免疫サイトカインは、配列番号12、13、15、又は17からなる群から選択されたいずれかのアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の免疫サイトカイン。
  7. 請求項１に記載の免疫サイトカインをエンコードするポリヌクレオチド。
  8. 請求項７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  9. 請求項８に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
  10. （a）請求項９に記載の宿主細胞を提供する段階；
    （b）提供された細胞を培養する段階；及び
    （c）前記細胞又は前記培養培地から免疫サイトカインを回収することにより、免疫サイトカインを製造する段階
    を含む、免疫サイトカインの製造方法。
  11. （a）ヒトインターフェロン−β変異体とペプチドリンカーと、前記ヒトインターフェロン−β変異体に直接又は間接的に共有結合された抗体又はその断片とを含む融合ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングする段階；
    （b）前記発現ベクターを宿主細胞にクローニングする段階；
    （c）前記宿主細胞を培養する段階；及び
    （d）前記細胞又は前記培養培地から前記融合ポリペプチドを回収する段階を含み、
    前記ヒトインターフェロン−β変異体は、配列番号2で表示されるペプチド配列からなることを特徴とする、免疫サイトカインの生産量増加方法。
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