JP6773951B2 - How to prepare saliva sample - Google Patents
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本発明は、被験者から一定量の唾液を採取し、保存安定性と取扱い性に優れた唾液試料を調製する方法、及び当該方法により得られた唾液試料から有機酸を検出する方法に関する。 The present invention relates to a method of collecting a certain amount of saliva from a subject to prepare a saliva sample having excellent storage stability and handleability, and a method of detecting an organic acid from the saliva sample obtained by the method.
唾液は、非侵襲的に容易に採取可能な生体試料であり、唾液中の有機酸等の生体分子の中にはバイオマーカーとして機能し得るものがある。このため、血液と同様、唾液も臨床検査等の検体として有用である。唾液は、通常、流涎として容器に採取されたり、濾紙やスワブに吸収させることにより採取される。唾液を採取するスワブとしては、例えば、唾液を採取し、その後放出するためのアプリケーターと海島バイコンポーネント繊維を含有するスワブ（例えば、特許文献１参照。）や、採取した唾液を培地等に擦り付けることによって放出可能なスワブ（例えば、特許文献２参照。）が開示されている。また、ＤＮＡを解析するための生体試料を採取するために使用されるスワブであって、乾燥剤と共に収納されるスワブ（例えば、特許文献３参照。）も開示されている。 Saliva is a non-invasive and easily collectable biological sample, and some biomolecules such as organic acids in saliva can function as biomarkers. Therefore, like blood, saliva is also useful as a sample for clinical examinations and the like. Saliva is usually collected by collecting it in a container as saliva or by absorbing it in a filter paper or swab. Examples of the swab for collecting saliva include a swab containing an applicator for collecting and then releasing saliva and Kaijima bicomponent fiber (see, for example, Patent Document 1), and rubbing the collected saliva on a medium or the like. Disclosed are swabs that can be released by (see, eg, Patent Document 2). Further, a swab used for collecting a biological sample for analyzing DNA and stored together with a desiccant (see, for example, Patent Document 3) is also disclosed.
一方で、生体試料中の有機酸の中には、バイオマーカーとして有用なものがあり、これらの測定方法が開示されている。例えば、肝臓での脂肪酸異化を評価するバイオマーカーとして有用な３−ヒドロキシ酪酸（３−ＨＢ）の定量には、ＮＡＤとＤ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを添加した後にＮＡＤＨを検出する酵素分光光度法が使用されている（例えば、非特許文献１又は２参照。）。その他にもＮＡＤＨの定量方法としては、３ＨＢをアセト酢酸（ＡＡ）に酵素変換した後にｐ−ニトロベンゼンジアゾニウムフルオロホウ酸で誘導体化し、この誘導体を、分光光度又は紫外線により検出する高感度ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）アッセイにより定量する方法が報告されている（例えば、非特許文献３又は４参照。）。また、３−ＨＢを直接検出する方法としては、誘導体化後にガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）法により検出する方法（例えば、非特許文献５又は６参照。）や、誘導体化せずに、正イオンモードのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析）法（ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）によって検出する方法（例えば、非特許文献７参照。）も報告されているが、これらの方法の検出感度は、酵素分光光度法と同様に低い。
On the other hand, some organic acids in biological samples are useful as biomarkers, and methods for measuring these are disclosed. For example, for the quantification of 3-hydroxybutyric acid (3-HB), which is useful as a biomarker for evaluating fatty acid catabolism in the liver, enzyme spectrophotometry is used to detect NADH after adding NAD and D-3-hydroxybutyric acid dehydrogenase. Is used (see, for example, Non-Patent
一方で、消化器疾患患者において、代謝・消化・吸収能低下あるいは栄養過多状態により、栄養代謝異常が生じる。多くの消化器疾患では、糖・脂質代謝異常がみられるため、エネルギー供給源としてアミノ酸の重要性が高い。特に分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ：バリン、ロイシン、イソロイシン）は、飢餓や低栄養状態、長時間運動や代謝疾患時に、糖質・脂質に代わって骨格筋のミトコンドリア内で異化され、エネルギー源となる。骨格筋で異化されたＢＣＡＡは、アセチルＣｏＡやスクシニルＣｏＡに代謝される。ＢＣＡＡは、ミトコンドリア内で共通の酵素反応によって、ミトコンドリア膜を通過できないＣｏＡが結合される。具体的には、ＢＣＡＡは、ミトコンドリア内でＢＣＡＴ（ＢＣＡＡアミノ基転移酵素）とＢＣＫＤＨ ｃｏｍｐｌｅｘ（分岐鎖αケト酸脱水素酵素複合体）によって、分岐鎖αケト酸（バリンからα−ケトイソ吉草酸へ、ロイシンからα−ケトイソカプロン酸（ＫＩＣ）へ、イソロイシンからα−ケト−β−メチル吉草酸へ）を経て、ＣｏＡ体（α−ケトイソ吉草酸からイソブチリルＣｏＡへ、ＫＩＣからイソバレリルＣｏＡへ、α−ケト−β−メチル吉草酸からα−メチルブチリルＣｏＡへ）に代謝される。ＢＣＡＡの異化過程では、ＣｏＡの結合が必須であるが、バリンのみは、異化経路の途中で、特異的酵素反応によってＣｏＡが一旦外され、中間代謝産物の３−ヒドロキシイソ酪酸（３−ＨＩＢ）ができる。ＣｏＡが結合していない３−ＨＩＢは、分子量が小さいためミトコンドリア膜を通過し、一部が細胞外へ漏出する。実際に、飢餓状態や肝硬変患者では、骨格筋の萎縮と共に血清３−ＨＩＢ濃度が上昇する。 On the other hand, in patients with digestive disorders, abnormal nutritional metabolism occurs due to decreased metabolism, digestion, absorption capacity, or overnutrition. Amino acids are of high importance as an energy source because of abnormal glucose and lipid metabolism in many digestive disorders. In particular, branched-chain amino acids (BCAA: valine, leucine, isoleucine) are catabolized in the mitochondria of skeletal muscle instead of sugars and lipids during starvation, hyponutrition, long-term exercise and metabolic diseases, and serve as an energy source. BCAAs catabolized in skeletal muscle are metabolized to acetyl-CoA and succinyl-CoA. BCAAs bind CoA that cannot cross the mitochondrial membrane by a common enzymatic reaction within the mitochondria. Specifically, BCAA is converted from branched-chain α-keto acid (from valine to α-ketoisovaleric acid) in mitochondria by BCAT (BCAA amino acid transtransferase) and BCKDH complex (branched chain α-keto acid dehydrogenase complex). , From leucine to α-ketoisocaproic acid (KIC), from isoleucine to α-keto-β-methylvaleric acid), then to CoA form (α-ketoisovaleric acid to isobutyryl CoA, KIC to isovaleryl CoA, α-keto It is metabolized from -β-methylketo acid to α-methylbutyryl CoA). CoA binding is essential in the BCAA catabolism process, but only valine has CoA removed by a specific enzymatic reaction during the catabolism pathway, and the intermediate metabolic product 3-hydroxyisobutyric acid (3-HIB). Can be done. Since 3-HIB to which CoA is not bound has a small molecular weight, it passes through the mitochondrial membrane and a part of it leaks out of the cell. In fact, in starved and cirrhotic patients, serum 3-HIB levels increase with skeletal muscle atrophy.
このことから、３−ＨＩＢは骨格筋におけるアミノ酸異化状態を反映する指標、すなわち骨格筋におけるＢＣＡＡ異化マーカーとしての利用が期待される。しかしながら、生体試料中の微量の３−ＨＩＢを充分な感度で検出できる方法は、現在までには報告されていない。例えば、３−ＨＩＢを直接検出する方法としては、誘導体化せずに、負イオンモードのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法（ＬＣ−Ｎ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）によって検出する方法（例えば、非特許文献７参照。）が報告されているが、当該方法は感度が低いため、例えば血清中の３−ＨＩＢを検出するためには多量の血清を必要とする。また、ＧＣ−ＭＳ法により、血液中の３−ＨＢを検出した場合には、３−ＨＩＢは３−ＨＢとはクロマトグラフィーによっては分離できなかったことが報告されている（例えば、非特許文献８参照。）。 From this, 3-HIB is expected to be used as an index reflecting the amino acid catabolism state in skeletal muscle, that is, as a BCAA catabolism marker in skeletal muscle. However, a method capable of detecting a trace amount of 3-HIB in a biological sample with sufficient sensitivity has not been reported so far. For example, as a method for directly detecting 3-HIB, it is detected by the LC-MS / MS method (LC-N-ESI-MS / MS) by electrospray ionization (ESI) in the negative ion mode without derivatization. Although a method (see, for example, Non-Patent Document 7) has been reported, the method has low sensitivity and therefore requires a large amount of serum, for example, to detect 3-HIB in serum. Further, it has been reported that when 3-HB in blood was detected by the GC-MS method, 3-HIB could not be separated from 3-HB by chromatography (for example, non-patent documents). 8).
３−ＨＢや３−ＨＩＢ以外の有機酸の検出方法としては、マロン酸をジ−（１−メチル−３−ピペリジニル）マロン酸に誘導体化した後、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）によって検出する方法（例えば、非特許文献９参照。）が報告されている。当該方法では、マロン酸にアミン残基を導入してマロン酸エステルとすることにより、イオン化が促進され、検出感度が顕著に増大した。 As a method for detecting organic acids other than 3-HB and 3-HIB, after derivatizing malonic acid to di- (1-methyl-3-piperidinyl) malonic acid, LC-P-ESI-MS / MS) is used. A method for detecting (see, for example, Non-Patent Document 9) has been reported. In this method, by introducing an amine residue into malonic acid to form a malonic acid ester, ionization was promoted and the detection sensitivity was significantly increased.
また、ＢＣＡＡの１つであるロイシンの代謝産物として、３−ヒドロキシイソ吉草酸（３−ＨＭＢ）が挙げられる。ロイシンは、他のＢＣＡＡと同様にミトコンドリア内でＫＩＣを経てＣｏＡ体（イソバレリルＣｏＡ）に代謝されるが、ＫＩＣの５〜１０％程度がミトコンドリア膜を通過し、細胞質内においてＫＩＣ−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅによって３−ＨＭＢに代謝される。３−ＨＭＢの作用としては、ｍＴＯＲ経路により蛋白合成促進、ユビキチン／プロテアソーム経路の抑制による蛋白質分解抑制、ＨＭＢ−ＣｏＡから変換されたヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）によるコレステロール合成促進による筋鞘安定化等が知られている。これらの作用により、３−ＨＭＢは、ＢＣＡＡ由来の肝臓蛋白（アルブミン等）合成マーカーや骨格筋肥大のマーカーとしての利用が期待される。実際に、３−ＨＭＢは筋肉増強効果を目的としたサプリメントとして利用されていることから、３−ＨＭＢを摂取した場合の血中動態を検討するため、３−ＨＭＢ摂取後のラットの血中３−ＨＭＢ濃度を、誘導体化せずにＬＣ−Ｎ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって測定したことが報告されている（例えば、非特許文献１０参照。）。また、ＨＩＬＩＣ（親水性相互作用クロマトグラフィー）−ＭＳ／ＭＳにより、３−ＨＢと３−ＨＭＢを誘導体化せずに同時測定する方法も報告されているが、当該測定方法では、３−ＨＭＢの検出限界は０．４μＭであり、生体試料中（血液や唾液など）の３−ＨＭＢは、３−ＨＢや３−ＨＭＢより微量であるため、より高感度に検出する方法が求められている（例えば、非特許文献１１参照。）。 Moreover, as a metabolite of leucine which is one of BCAA, 3-hydroxyisovaleric acid (3-HMB) can be mentioned. Like other BCAAs, leucine is metabolized in the mitochondria via KIC to the CoA body (isovaleryl CoA), but about 5 to 10% of KIC passes through the mitochondrial membrane and is 3-bye in the cytoplasm by KIC-dioxygenase. It is metabolized to HMB. The effects of 3-HMB include promotion of protein synthesis by the mTOR pathway, suppression of protein degradation by suppression of the ubiquitin / proteasome pathway, and muscle synthesis by promotion of cholesterol synthesis by hydroxymethylglutaryl-CoA (HMG-CoA) converted from HMB-CoA. Sheath stabilization is known. Due to these actions, 3-HMB is expected to be used as a marker for BCAA-derived liver protein (albumin, etc.) synthesis and a marker for skeletal muscle hypertrophy. In fact, since 3-HMB is used as a supplement for the purpose of muscle-building effect, in order to examine the blood dynamics when 3-HMB is ingested, 3 in the blood of rats after ingestion of 3-HMB. It has been reported that the −HMB concentration was measured by LC-N-ESI-MS / MS without derivatization (see, for example, Non-Patent Document 10). In addition, a method of simultaneously measuring 3-HB and 3-HMB without derivatization by HILIC (hydrophilic interaction chromatography) -MS / MS has also been reported, but in the measurement method, 3-HMB Since the detection limit is 0.4 μM and the amount of 3-HMB in a biological sample (blood, saliva, etc.) is smaller than that of 3-HB or 3-HMB, a method for more sensitive detection is required (). For example, see Non-Patent Document 11).
また、３−ＨＢ等と構造類似の有機酸として、２−ヒドロキシ酪酸（２−ＨＢ）がある。２−ＨＢは、スレオニンとメチオニンの代謝産物であるαケト酪酸が、ＮＡＤＨ依存性のＬＤＨやＬＤＨのアイソザイムである２−ＨＢ脱水素酵素（α−ＨＢＤＨ）による異化反応の副産物として生成される。また、αケト酪酸は、スクシニルＣｏＡの前駆体であるプロピオニルＣｏＡに代謝されることから、２−ＨＢの上昇は、ＬＤＨやα−ＨＢＤＨによるαケト酪酸の異化亢進か、αケト酪酸からプロピオニルＣｏＡへの代謝不全によって生じる。さらに、αケト酪酸は、強力な抗酸化物質であるグルタチオンの前駆体アミノ酸であるシステインがシスタチオンより代謝される際の副産物としても産生されるため、グルタチオンの生成とも関連している。２−ＨＢは、非糖尿病者のインスリン抵抗性やグルコース不耐性を予測する早期マーカーとして利用できるとの報告がある（例えば、非特許文献１２参照。）。これは、インスリン抵抗性やグルコース不耐性発症には、肝臓での脂質過酸化や酸化ストレスが関与しており、肝臓でのグルタチオン生成亢進や脂質過酸化に伴うＮＡＤＨやＮＡＤ＋の増加によるものと考えられる。この検討では、ＵＨＰＬＣ−ＭＳやＨＩＬＩＣ−ＭＳ／ＭＳ装置にて、血清中や全血中の２−ＨＢを測定しているが、血清中の濃度（１μｇ／ｍＬ＝約９．６μＭ以上）より微量な生体試料（唾液など）での測定は、これまで検討されていない（例えば、非特許文献１１及び非特許文献２参照。）。
Further, as an organic acid having a structure similar to that of 3-HB or the like, there is 2-hydroxybutyric acid (2-HB). 2-HB is produced by α-ketobutyric acid, which is a metabolite of threonine and methionine, as a by-product of catabolism by NADH-dependent LDH and 2-HB dehydrogenase (α-HBDH), which is an isozyme of LDH. In addition, since α-ketobutyric acid is metabolized to propionyl-CoA, which is a precursor of succinyl-CoA, an increase in 2-HB may be due to increased catabolism of α-ketobutyric acid by LDH or α-HBDH, or from α-ketobutyric acid to propionyl-CoA. Caused by metabolic deficiency. In addition, α-ketobutyric acid is also associated with glutathione production because it is also produced as a by-product of the metabolism of cysteine, a precursor amino acid of glutathione, a potent antioxidant, from cystathione. It has been reported that 2-HB can be used as an early marker for predicting insulin resistance and glucose intolerance in non-diabetic patients (see, for example, Non-Patent Document 12). This is because lipid peroxidation and oxidative stress in the liver are involved in the onset of insulin resistance and glucose intolerance, and it is due to the increase in NADH and NAD + associated with the increase in glutathione production in the liver and lipid peroxidation. Conceivable. In this study, 2-HB in serum and whole blood was measured by UHPLC-MS or HILIC-MS / MS device, and it was determined from the concentration in serum (1 μg / mL = about 9.6 μM or more). Measurement with a small amount of biological sample (serum, etc.) has not been studied so far (see, for example, Non-Patent
本発明は、被験者から一定量の唾液を採取し、保存安定性と取扱い性に優れた唾液試料を調製する方法、及び当該方法により得られた唾液試料から有機酸を検出する方法の提供を目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for collecting a certain amount of saliva from a subject to prepare a saliva sample having excellent storage stability and handleability, and a method for detecting an organic acid from the saliva sample obtained by the method. And.
すなわち、本発明は、下記［１］〜［１３］の唾液試料の調製方法、下記［１４］〜［１８］の有機酸の検出方法、下記［１９］の有機酸濃度の経時的変化の測定方法を提供するものである。
［１］ 本発明に係る第一の唾液試料の調製方法は、唾液を、唾液吸収部材に吸収させる吸収工程と、前記吸収工程において唾液を吸収させた唾液吸収部材を乾燥させる乾燥工程と、を有し、前記吸収工程において、前記唾液吸収部材に所定量の唾液を吸収させること、及び前記乾燥工程後、前記唾液吸収部材から、所定量の唾液由来の固形分が吸着している領域を切断して回収することにより、所定量の唾液に由来する固形分が唾液吸収部材に乾燥状態で保持された唾液試料を調製し、前記唾液吸収部材が短冊状又は棒状であり、前記吸収工程において、前記唾液吸収部材の一方の端部を唾液に接触させ、毛細管現象により唾液を吸い上げることにより当該唾液吸収部材に唾液を吸収させ、前記乾燥工程後、前記唾液吸収部材の唾液由来の固形分が吸着している領域のうち、吸い上げられた唾液の先端から８ｍｍ以上離れている部位から唾液に接触させた端部側方向に向かって、所定の面積分又は体積分の領域を切断したものを、唾液試料として回収することを特徴とする。
［２］ 前記［１］の唾液試料の調製方法においては、前記唾液が、液体状態で唾液容器に収容されているものであることが好ましい。
［３］ 前記［１］又は［２］の唾液試料の調製方法においては、前記吸収工程を、前記唾液吸収部材を被検者の口腔内において唾液と接触させることにより行うことが好ましい。
［４］ 前記［３］の唾液試料の調製方法においては、前記唾液吸収部材が短冊状又は棒状であり、前記吸収工程において、前記唾液吸収部材の一方の端部を被検者の口に入れて、毛細管現象により唾液を吸い上げることにより当該唾液吸収部材に唾液を吸収させ、前記乾燥工程後、前記唾液吸収部材の唾液由来の固形分が吸着している領域のうち、被検者の口腔内において唾液と直接接触していなかった領域であり、かつ吸い上げられた唾液の先端から８ｍｍ以上離れている部位から唾液に接触させた端部側方向に向かって、所定の面積分又は体積分の領域を切断したものを、唾液試料として回収することが好ましい。
［５］ 前記［１］〜［４］のいずれかの唾液試料の調製方法においては、前記乾燥工程前に、前記吸収工程において唾液を吸収させた唾液吸収部材に、抗菌剤を含有させることが好ましい。
［６］ 前記［１］又は［２］の唾液試料の調製方法においては、前記吸収工程において、唾液と抗菌剤の混合物を前記唾液吸収部材に吸収させることが好ましい。
［７］ 前記［１］〜［４］のいずれかの唾液試料の調製方法においては、前記唾液吸収部材が、予め抗菌剤を保持していることが好ましい。
［８］ 本発明に係る第二の唾液試料の調製方法は、唾液を、唾液吸収部材に吸収させる吸収工程と、前記吸収工程において唾液を吸収させた唾液吸収部材を、抗菌剤を含有する溶液中に浸漬させる抗菌剤処理工程と、を有し、前記吸収工程において、前記唾液吸収部材に所定量の唾液を吸収させること、及び前記吸収工程後、前記唾液吸収部材から所定量の唾液由来の固形分が吸着している領域を切断して回収したものを、前記抗菌剤を含有する溶液中に浸漬させることにより、所定量の唾液に由来する固形分と唾液吸収部材を含有する溶液である唾液試料を調製し、前記唾液吸収部材が短冊状又は棒状であり、前記吸収工程において、前記唾液吸収部材の一方の端部を唾液に接触させ、毛細管現象により唾液を吸い上げることにより当該唾液吸収部材に唾液を吸収させ、前記乾燥工程後、前記唾液吸収部材の唾液由来の固形分が吸着している領域のうち、吸い上げられた唾液の先端から８ｍｍ以上離れている部位から唾液に接触させた端部側方向に向かって、所定の面積分又は体積分の領域を切断したものを、唾液試料として回収することを特徴とする。
［９］ 前記［５］〜［８］のいずれかの唾液試料の調製方法においては、前記抗菌剤が、第四級アンモニウム塩系抗菌剤であることが好ましい。
［１０］ 前記［１］〜［９］のいずれかの唾液試料の調製方法においては、前記吸収工程において前記唾液吸収部材に吸収させる唾液量が、前記唾液吸収部材の最大吸収量であることも好ましい。
［１１］ 前記［１］〜［１０］のいずれかの唾液試料の調製方法においては、前記所定量が、１〜５０μＬであることが好ましい。
［１２］ 前記［１］〜［１１］のいずれかの唾液試料の調製方法においては、前記唾液吸収部材が、合成樹脂繊維からなることが好ましい。
［１３］ 前記［１］〜［７］のいずれかの唾液試料の調製方法においては、前記乾燥工程における乾燥が、自然乾燥であることが好ましい。
［１４］ 本発明に係る唾液中の有機酸の検出方法は、前記［１］〜［１３］のいずれかの唾液試料の調製方法により唾液試料を調製し、得られた唾液試料を、極性有機溶剤に浸漬させることにより、前記唾液試料から唾液由来の有機酸を抽出する抽出工程と、前記抽出工程の後、有機酸が抽出された極性有機溶剤を、唾液由来有機酸検出用試料として、前記唾液試料から分離して回収する回収工程と、前記回収工程により回収された唾液由来有機酸検出用試料中の有機酸を下記一般式（１）−１〜（１）−３（式（１）−１〜３中、Ｒ１及びＲ２は、一方が炭素数１〜６のヒドロキシアルキル基を表し、他方が水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表す。）のいずれかで表される誘導体化試薬とエステル結合させることにより誘導体を合成し、当該誘導体を、正イオンモードのエレクトロスプレーイオン化ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析）法により検出する検出工程と、を有することを特徴とする。
That is, the present invention relates to the following methods for preparing saliva samples [1] to [13], the following methods [14] to [18] for detecting organic acids, and the following [19] for measuring changes in organic acid concentration over time. It provides a method.
[1] The first method for preparing a saliva sample according to the present invention comprises an absorption step of absorbing saliva into a saliva absorbing member and a drying step of drying the saliva absorbing member having absorbed saliva in the absorption step. In the absorption step, the saliva absorbing member is made to absorb a predetermined amount of saliva, and after the drying step, a region in which a predetermined amount of saliva-derived solid content is adsorbed is cut from the saliva absorbing member. To prepare a saliva sample in which a predetermined amount of solid content derived from saliva is held in a saliva absorbing member in a dry state, the saliva absorbing member is in the shape of a strip or a rod, and in the absorption step, One end of the saliva absorbing member is brought into contact with saliva, and saliva is sucked up by a capillary phenomenon to cause the saliva absorbing member to absorb saliva, and after the drying step, the saliva-derived solid content of the saliva absorbing member is adsorbed. Of the areas that are being sucked up, saliva is obtained by cutting a predetermined area or volume of area from a part that is 8 mm or more away from the tip of the sucked saliva toward the end side in contact with saliva. It is characterized in that it is collected as a sample.
[2] In the method for preparing a saliva sample according to the above [1], it is preferable that the saliva is contained in a saliva container in a liquid state.
[3] In the method for preparing a saliva sample according to [1] or [2], it is preferable to carry out the absorption step by bringing the saliva absorbing member into contact with saliva in the oral cavity of the subject.
[4] In the method for preparing a saliva sample according to [3], the saliva absorbing member has a strip shape or a rod shape, and in the absorption step, one end of the saliva absorbing member is put into the mouth of the subject. By sucking saliva by the capillary phenomenon, the saliva absorbing member absorbs saliva, and after the drying step, the saliva-derived solid content of the saliva absorbing member is adsorbed in the oral cavity of the subject. in an area not in direct contact with the saliva, and sucked obtained towards the site which is located more than 8mm from the tip of the saliva to the contacted end portion side direction saliva, a predetermined region of the surface integral or volume fraction It is preferable to collect the cut saliva sample as a saliva sample.
[5] In the method for preparing a saliva sample according to any one of [1] to [4], an antibacterial agent may be contained in a saliva absorbing member that has absorbed saliva in the absorbing step before the drying step. preferable.
[6] In the method for preparing a saliva sample according to the above [1] or [2], it is preferable that the saliva absorbing member absorbs a mixture of saliva and an antibacterial agent in the absorption step.
[7] In the method for preparing a saliva sample according to any one of [1] to [4], it is preferable that the saliva absorbing member holds an antibacterial agent in advance.
[8] The second method for preparing a saliva sample according to the present invention is an absorption step of absorbing saliva into a saliva absorbing member and a solution containing the saliva absorbing member having absorbed saliva in the absorption step containing an antibacterial agent. It has an antibacterial agent treatment step of immersing it in, and in the absorption step, the saliva absorbing member absorbs a predetermined amount of saliva, and after the absorption step, a predetermined amount of saliva is derived from the saliva absorbing member. A solution containing a predetermined amount of saliva-derived solids and a saliva absorbing member by immersing the recovered solid content by cutting the adsorbed region in the solution containing the antibacterial agent. A saliva sample is prepared, and the saliva absorbing member is in the shape of a strip or a rod. In the absorption step, one end of the saliva absorbing member is brought into contact with saliva, and saliva is sucked up by a capillary phenomenon. After the drying step, the end of the region where saliva-derived solids of the saliva absorbing member are adsorbed and brought into contact with saliva from a
[9] In the method for preparing a saliva sample according to any one of [5] to [8], the antibacterial agent is preferably a quaternary ammonium salt-based antibacterial agent.
[10] In the method for preparing a saliva sample according to any one of [1] to [9], the amount of saliva absorbed by the saliva absorbing member in the absorption step may be the maximum amount of saliva absorbed by the saliva absorbing member. preferable.
[11] In the method for preparing a saliva sample according to any one of [1] to [10], the predetermined amount is preferably 1 to 50 μL.
[12] In the method for preparing a saliva sample according to any one of [1] to [11], it is preferable that the saliva absorbing member is made of a synthetic resin fiber.
[13] In the method for preparing a saliva sample according to any one of [1] to [7], it is preferable that the drying in the drying step is natural drying.
[14] In the method for detecting an organic acid in saliva according to the present invention, a saliva sample is prepared by the method for preparing a saliva sample according to any one of [1] to [13] above, and the obtained saliva sample is used as a polar organic substance. An extraction step of extracting a saliva-derived organic acid from the saliva sample by immersing it in a solvent, and a polar organic solvent from which the organic acid has been extracted after the extraction step are used as a saliva-derived organic acid detection sample. The recovery step of separating and recovering from the saliva sample and the organic acid in the saliva-derived organic acid detection sample recovered by the recovery step are described in the following general formulas (1) -1 to (1) -3 (formula (1)). Of -1 to 3, R 1 and R 2 are represented by either one of a hydroxyalkyl group having 1 to 6 carbon atoms and the other representing a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. It has a detection step of synthesizing a derivative by ester-bonding with a derivatizing reagent and detecting the derivative by an electrospray ionized LC-MS / MS (liquid chromatography-tandem mass analysis) method in a positive ion mode. It is characterized by that.
［１５］ 前記［１４］の唾液中の有機酸の検出方法においては、前記極性有機溶剤が、アセトニトリルであることが好ましい。
［１６］ 前記［１４］又は［１５］の唾液中の有機酸の検出方法においては、前記抽出工程において、前記唾液試料を、予め内部標準物質を含有させた極性有機溶剤に浸漬させることが好ましい。
［１７］ 前記［１４］〜［１６］のいずれかの唾液中の有機酸の検出方法においては、前記誘導体化試薬が２−ピリジンメタノール、１−ピペリジンエタノール、及び２−（２−ヒドロキシエチル）−１−メチルピロリジンからなる群より選択される１種以上であることが好ましい。
［１８］ 前記［１４］〜［１７］のいずれかの唾液中の有機酸の検出方法においては、前記有機酸が３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシイソ吉草酸、２−ヒドロキシ酪酸、及び乳酸からなる群より選択される１種以上であることが好ましい。
［１９］ 本発明に係る有機酸濃度の経時的変化の測定方法は、同一の被験者から経時的に調製された複数の唾液試料に対して、前記［１４］〜［１８］のいずれかの唾液中の有機酸の検出方法を行い、前記被験者の唾液中の有機酸濃度の経時的変化を調べることを特徴とする。
[ 15 ] In the method for detecting an organic acid in saliva according to [ 14 ], it is preferable that the polar organic solvent is acetonitrile.
[ 16 ] In the method for detecting an organic acid in saliva according to [ 14 ] or [ 15 ], it is preferable to immerse the saliva sample in a polar organic solvent containing an internal standard substance in advance in the extraction step. ..
[ 17 ] In the method for detecting an organic acid in saliva according to any one of [ 14 ] to [ 16 ], the derivatizing reagents are 2-pyridinemethanol, 1-piperidineethanol, and 2- (2-hydroxyethyl). It is preferably one or more selected from the group consisting of -1-methylpyrrolidine.
[ 18 ] In the method for detecting an organic acid in saliva according to any one of [ 14 ] to [ 17 ], the organic acid is 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxyisobutyric acid, 3-hydroxyisovaleric acid, 2-. It is preferably one or more selected from the group consisting of hydroxybutyric acid and lactic acid.
[ 19 ] The method for measuring the change over time in the organic acid concentration according to the present invention is the saliva according to any one of [ 14 ] to [ 18 ] above for a plurality of saliva samples prepared over time from the same subject. A method for detecting the organic acid in the sample is performed, and the change over time in the saliva concentration of the subject is examined.
本発明に係る唾液試料の調製方法により、簡便に、被験者から一定量の唾液を採取し、保存安定性と取扱い性に優れた唾液試料を調製することができる。
また、本発明に係る有機酸の検出方法や有機酸濃度の経時的変化の測定方法は、本発明に係る唾液試料の調製方法により調製された唾液試料中の有機酸を、特定の誘導体化試薬を用いて誘導体化した後にＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって検出する方法であり、これらの方法により、極少量の唾液から、３−ＨＩＢや３−ＨＢ、３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、乳酸等の有機酸を高感度に検出することができる。
According to the method for preparing a saliva sample according to the present invention, a certain amount of saliva can be easily collected from a subject to prepare a saliva sample having excellent storage stability and handleability.
Further, the method for detecting an organic acid and the method for measuring a change in organic acid concentration with time according to the present invention are obtained by using a specific derivatizing reagent for an organic acid in a saliva sample prepared by the method for preparing a saliva sample according to the present invention. It is a method of detecting by LC-P-ESI-MS / MS after derivatization using, and by these methods, 3-HIB, 3-HB, 3-HMB, 2-HB, from a very small amount of saliva, Organic acids such as lactic acid can be detected with high sensitivity.
＜第一の唾液試料の調製方法＞
本発明に係る唾液試料の調製方法は、所定量の唾液に由来する固形分が唾液吸収部材に乾燥状態で保持された唾液試料を調製することを特徴とする。当該調製方法により調製された唾液試料は、乾燥状態であるため、臨床検査等に供されるまでの間、室温や外気温中で保存した場合であっても、唾液中の各種生体分子が安定して維持される。また、液状の唾液をそのまま容器等に回収して保存する場合よりも、保管や移送等が容易であり、取扱い性にも優れている。さらに、当該調製方法により調製された唾液試料は、予め定められた所定量の唾液に由来する固形分を含有しているため、当該調製方法により調製された複数の唾液試料について同一の検査方法に供することにより、試料ごとの測定のばらつきを抑えることができる上に、ノーマライズ処理を行うことなく、各唾液試料に含有されている生体分子の含有量同士を直接比較することができる。
<First method of preparing saliva sample>
The method for preparing a saliva sample according to the present invention is characterized in that a saliva sample in which a predetermined amount of solids derived from saliva is held in a saliva absorbing member in a dry state is prepared. Since the saliva sample prepared by the preparation method is in a dry state, various biomolecules in saliva are stable even when stored at room temperature or outside air temperature until it is subjected to clinical examination or the like. And be maintained. In addition, it is easier to store and transfer than the case where liquid saliva is collected and stored as it is in a container or the like, and it is also excellent in handleability. Further, since the saliva sample prepared by the preparation method contains a predetermined amount of solids derived from saliva, the same inspection method can be applied to a plurality of saliva samples prepared by the preparation method. By providing this, it is possible to suppress variations in measurement for each sample, and it is possible to directly compare the contents of biomolecules contained in each saliva sample without performing normalization treatment.
なお、唾液に由来する固形分とは、唾液から水分を除いた残りの成分を意味する。すなわち、当該固形分には、有機酸、核酸、蛋白質、糖類、多糖類、糖蛋白質、脂質等が含まれる。 The solid content derived from saliva means the remaining components obtained by removing water from saliva. That is, the solid content includes organic acids, nucleic acids, proteins, sugars, polysaccharides, sugar proteins, lipids and the like.
所定量の唾液に由来する固形分を含有する唾液試料を調製するために、本発明に係る唾液試料の調製方法は、具体的には、唾液を、唾液吸収部材に吸収させる吸収工程と、前記吸収工程において唾液を吸収させた唾液吸収部材を乾燥させる乾燥工程と、を有し、前記吸収工程において、前記唾液吸収部材に所定量の唾液を吸収させる、又は前記乾燥工程後、前記唾液吸収部材から、所定量の唾液由来の固形分が吸着している領域を切断して回収する。 In order to prepare a saliva sample containing a solid content derived from a predetermined amount of saliva, the method for preparing a saliva sample according to the present invention specifically comprises an absorption step of absorbing saliva into a saliva absorbing member and the above-mentioned. It has a drying step of drying a saliva absorbing member that has absorbed saliva in the absorption step, and in the absorbing step, the saliva absorbing member absorbs a predetermined amount of saliva, or after the drying step, the saliva absorbing member. Then, the region where a predetermined amount of saliva-derived solids are adsorbed is cut and recovered.
前記吸収工程において、唾液吸収部材に吸収させる唾液は、唾液吸収部材を被検者の口腔内において唾液と接触させることによって被験者の口腔内から直接採取されたものであってもよく、容器に収容された液体状態の唾液（流涎）であってもよい。流涎は、被験者が容器に直接垂れ流して採取したものであってもよく、他の手段で採取されたものを容器に収容したものであってもよい。例えば、唾液吸収部材を口腔内に含む、又は唾液吸収部材の少なくとも一部を口にくわえて毛細管現象によって唾液を吸い上げる等により、当該唾液吸収部材に唾液を吸収させることができる。特に、唾液吸収部材が短冊状や棒状の場合には、被験者が寝たままの姿勢である場合や、運動を継続している場合であっても、被験者から容易に唾液を採取することができる。また、例えば、容器に採取された流涎に、唾液吸収部材を浸漬させることにより、又は唾液吸収部材の一部を接触させて毛細管現象によって唾液を吸い上げることにより、当該唾液吸収部材に唾液を吸収させることができる。 In the absorption step, the saliva to be absorbed by the saliva absorbing member may be directly collected from the oral cavity of the subject by bringing the saliva absorbing member into contact with the saliva in the oral cavity of the subject, and is stored in a container. It may be saliva (saliva) in a liquid state. The hypersalivation may be collected by the subject directly dripping into the container, or may be collected by other means and contained in the container. For example, the saliva absorbing member can absorb saliva by including the saliva absorbing member in the oral cavity, or by holding at least a part of the saliva absorbing member in the mouth and sucking up saliva by a capillary phenomenon. In particular, when the saliva absorbing member is strip-shaped or rod-shaped, saliva can be easily collected from the subject even when the subject is in a lying posture or is continuing exercise. .. Further, for example, by immersing the saliva absorbing member in the saliva collected in the container, or by bringing a part of the saliva absorbing member into contact and sucking saliva by the capillary phenomenon, the saliva absorbing member absorbs saliva. be able to.
前記吸収工程において、唾液吸収部材に吸収させる唾液の量は特に限定されるものではないが、口腔内で唾液吸収部材を湿らせることにより採取可能な程度の量であることが好ましい。具体的には、１００μＬ以下が好ましく、１〜５０μＬがより好ましく、１０〜５０μＬがさらに好ましい。本発明に係る唾液試料の調製方法においては、唾液の採取を、極少量の唾液を唾液吸収部材に吸収させることにより行うため、子供や老人、患者等のように唾液量の少ない被検者や、運動中の被験者からも、必要量の唾液を、安全かつ迅速に採取することができる。 In the absorption step, the amount of saliva absorbed by the saliva absorbing member is not particularly limited, but it is preferably an amount that can be collected by moistening the saliva absorbing member in the oral cavity. Specifically, 100 μL or less is preferable, 1 to 50 μL is more preferable, and 10 to 50 μL is further preferable. In the method for preparing a saliva sample according to the present invention, since saliva is collected by absorbing a very small amount of saliva into a saliva absorbing member, a subject having a small amount of saliva such as a child, an elderly person, a patient, etc. The required amount of saliva can be safely and quickly collected from a subject who is exercising.
本発明に係る唾液試料の調製方法において用いられる唾液吸収部材としては、液性成分を吸収可能な多孔質部材であればよく、唾液や涙液等の液性成分を含む生体試料の採取に使用される多孔質部材の中から適宜選択して用いることができる。中でも、濾紙やスワブを用いることが好ましい。また、当該唾液吸収部材の形状は特に限定されるものではなく、塊状であってもよく、短冊状であってもよく、棒状であってもよい。さらに、例えば、唾液を吸収しない棒状の部材の先端部に、唾液吸収部材であるスワブを結合させた部材のように、唾液吸収部材と唾液を吸収しない部材との複合部材であってもよい。なお、当該唾液吸収部材は、吸収工程に用いられる前に、予めシリカゲルなどの乾燥剤と共に保存する等により乾燥させておくことも好ましい。 The saliva absorbing member used in the method for preparing a saliva sample according to the present invention may be a porous member capable of absorbing a liquid component, and is used for collecting a biological sample containing a liquid component such as saliva or tears. It can be appropriately selected and used from the porous members. Above all, it is preferable to use filter paper or a swab. The shape of the saliva absorbing member is not particularly limited, and may be lump-shaped, strip-shaped, or rod-shaped. Further, for example, it may be a composite member of a saliva absorbing member and a member that does not absorb saliva, such as a member in which a swab, which is a saliva absorbing member, is bonded to the tip of a rod-shaped member that does not absorb saliva. It is also preferable to dry the saliva absorbing member by preserving it with a desiccant such as silica gel before using it in the absorption step.
前記唾液吸収部材が短冊状又は棒状であり、一方の端部を被検者が口にくわえて毛細管現象によって当該唾液吸収部材に唾液を吸い上げる場合には、当該唾液吸収部材に吸収された唾液の量は、被検者が口にくわえていた端部から吸い上げられた唾液の先端までの距離に依存する。そこで、唾液吸収部材に必要な量の唾液を吸収させたことが可視化できるように、予め、唾液吸収部材の被検者が口にくわえる端部から所定の距離の位置に、唾液と接触すると可視化する色素を保持させておくことも好ましい。 When the saliva absorbing member is strip-shaped or rod-shaped, and the subject holds one end in the mouth and sucks saliva into the saliva absorbing member by capillarity, the saliva absorbed by the saliva absorbing member The amount depends on the distance from the end of the subject's mouth to the tip of the saliva sucked up. Therefore, in order to visualize that the saliva absorbing member has absorbed the required amount of saliva, it is visualized in advance when the subject of the saliva absorbing member comes into contact with saliva at a predetermined distance from the end of the mouth. It is also preferable to retain the dye to be used.
本発明に係る唾液試料の調製方法において用いられる唾液吸収部材の素材としては、例えば、綿、ウール、絹、麻、リグノセルロース、デンプン、デキストラン等の天然素材であってもよく、アクリル、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリウレタン、ポリアミド、ポリビニルアルコール、レーヨン、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ＡＢＳ（アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン）樹脂、又はこれらを適宜組み合わせた混合物等の合成樹脂繊維であってもよく、ガラス繊維、シリカゲル、活性白土、ケイソウ土、炭素粉末、活性アルミナ等の無機素材であってもよい。本発明において用いられる唾液吸収部材の素材としては、唾液を吸収させた後に乾燥させやすいことから、合成樹脂繊維や無機素材が好ましく、さらに、唾液の吸収性が高いことから、合成樹脂繊維がより好ましい。 The material of the saliva absorbing member used in the method for preparing a saliva sample according to the present invention may be, for example, a natural material such as cotton, wool, silk, linen, lignocellulose, starch, dextran, or acrylic or polyethylene terephthalate. Polyester such as polyester, polyolefin such as polyethylene and polypropylene, polyurethane, polyamide, polyvinyl alcohol, rayon, nitrocellulose, cellulose acetate, ABS (acrylonitrile, butadiene, styrene) resin, or synthetic resin fiber such as a mixture thereof as appropriate. It may be an inorganic material such as glass fiber, silica gel, active white clay, polyester clay, carbon powder, active alumina and the like. As the material of the saliva absorbing member used in the present invention, synthetic resin fibers and inorganic materials are preferable because they are easily dried after absorbing saliva, and synthetic resin fibers are more preferable because they have high saliva absorption. preferable.
吸収工程の後、乾燥工程として、当該吸収工程において唾液を吸収させた唾液吸収部材を乾燥させる。乾燥方法は、唾液吸収部材に吸収させた唾液中の有機酸等の生体成分を損なうことなく水分を除去し得る方法であれば特に限定されるものではなく、自然乾燥させてもよく、温風乾燥させてもよく、減圧乾燥させてもよく、凍結乾燥させてもよい。本発明においては、特別な乾燥装置を要することなく簡便に乾燥させられることから、自然乾燥することが好ましい。 After the absorption step, as a drying step, the saliva absorbing member that has absorbed saliva in the absorption step is dried. The drying method is not particularly limited as long as it can remove water without damaging biological components such as organic acids in saliva absorbed by the saliva absorbing member, and may be naturally dried and warm air. It may be dried, dried under reduced pressure, or freeze-dried. In the present invention, it is preferable to dry naturally because it can be easily dried without requiring a special drying device.
当該乾燥工程においては、唾液を吸収させた唾液吸収部材の表面に紙等を接触させた場合に、当該紙に水分がにじまない程度に十分に乾燥させることが好ましい。乾燥時の温度や乾燥時間等の条件は、唾液吸収部材の素材や乾燥方法に応じて適宜調整できる。例えば、唾液吸収部材の素材が綿セルロースであり、２０〜２５℃の環境下で自然乾燥する場合には、乾燥時間は２４時間以上が好ましく、４８時間以上がより好ましい。唾液吸収部材の素材が合成樹脂繊維であり、２０〜２５℃の環境下で自然乾燥する場合には、乾燥時間は２０分間以上が好ましく、１時間以上がより好ましい。 In the drying step, when a paper or the like is brought into contact with the surface of the saliva absorbing member that has absorbed saliva, it is preferable that the paper is sufficiently dried so that moisture does not bleed. Conditions such as the drying temperature and the drying time can be appropriately adjusted according to the material of the saliva absorbing member and the drying method. For example, when the material of the saliva absorbing member is cotton cellulose and it is naturally dried in an environment of 20 to 25 ° C., the drying time is preferably 24 hours or more, more preferably 48 hours or more. When the material of the saliva absorbing member is a synthetic resin fiber and it is naturally dried in an environment of 20 to 25 ° C., the drying time is preferably 20 minutes or more, more preferably 1 hour or more.
本発明に係る唾液試料の調製方法において得られた唾液試料は、唾液中に含まれている生体分子の分析に用いられる。分析方法によっては、当該唾液試料から分析対象の生体分子を有機溶媒により抽出するが、唾液吸収部材の水分含有率が高い場合には、極性有機溶剤が十分に浸透せず、唾液由来の有機酸が抽出され難くなるおそれがある。このため、当該乾燥工程においては、特に、乾燥後の唾液吸収部材の水分含有率が、当該唾液吸収部材を極性有機溶剤に浸漬させた場合に、当該唾液吸収部材の中心部にまで極性有機溶剤が浸透可能な程度に低くなるまで乾燥させることが好ましい。 The saliva sample obtained in the method for preparing a saliva sample according to the present invention is used for analysis of biomolecules contained in saliva. Depending on the analysis method, the biomolecule to be analyzed is extracted from the saliva sample with an organic solvent, but when the water content of the saliva absorbing member is high, the polar organic solvent does not sufficiently permeate and the organic acid derived from saliva. May be difficult to extract. Therefore, in the drying step, the water content of the saliva absorbing member after drying is such that the polar organic solvent extends to the center of the saliva absorbing member when the saliva absorbing member is immersed in the polar organic solvent. Is preferably dried until it is low enough to penetrate.
乾燥工程後の唾液吸収部材は、分析に供されるまでの間、室温等の特段の温度調節を行わない環境下で保管することができる。乾燥された唾液吸収部材は、乾燥剤と保管しておくことも好ましい。また、乾燥工程を自然乾燥にて行う場合、唾液を吸収させた唾液吸収部材を、シリカゲルなどの乾燥剤と共に室温環境下で放置して自然乾燥させることが好ましい。 The saliva absorbing member after the drying step can be stored in an environment where no special temperature control such as room temperature is performed until it is subjected to analysis. It is also preferable to store the dried saliva absorbing member with a desiccant. When the drying step is carried out by natural drying, it is preferable that the saliva absorbing member that has absorbed saliva is left to stand in a room temperature environment together with a desiccant such as silica gel to be naturally dried.
本発明に係る唾液試料の調製方法においては、前記吸収工程において、唾液吸収部材に所定量の唾液を吸収させることにより、予め定められた一定の量の唾液由来の固形分が保持された唾液試料を調製することができる。例えば、唾液吸収部材の最大吸収量を、当該所定量になるように調節し、吸収工程において唾液吸収部材に対し限界まで（すなわち、それ以上唾液を吸収できなくなるまで）吸収させる。一定の大きさの唾液吸収部材を用いることにより、常に一定の量の唾液を採取することができる。 In the method for preparing a saliva sample according to the present invention, a saliva sample in which a predetermined fixed amount of saliva-derived solid content is retained by allowing a saliva absorbing member to absorb a predetermined amount of saliva in the absorption step. Can be prepared. For example, the maximum absorption amount of the saliva absorbing member is adjusted to the predetermined amount, and the saliva absorbing member is allowed to absorb saliva to the limit (that is, until no more saliva can be absorbed) in the absorption step. By using a saliva absorbing member having a certain size, a certain amount of saliva can always be collected.
本発明に係る唾液試料の調製方法においては、前記乾燥工程後の唾液吸収部材から、所定量の唾液由来の固形分が吸着している領域を切断して回収することによっても、予め定められた一定の量の唾液由来の固形分が保持された唾液試料を調製することができる。例えば、唾液吸収部材が短冊状又は棒状の場合には、唾液吸収部材の一方の端部を唾液に接触させ、毛細管現象により唾液を吸い上げることにより当該唾液吸収部材に唾液を吸収させることができる（吸収工程）。毛細管現象を利用するため、吸収工程において予め定めてある一定の量の唾液のみを唾液吸収部材に吸収させることは困難であるが、唾液吸収部材に吸収されている唾液量は原則として唾液吸収部材中の唾液が吸い上げられた体積に比例する。また、短冊状又は棒状のように厚みが一定の唾液吸収部材においては、吸収されている唾液量は原則として唾液吸収部材中の唾液が吸い上げられた面積に比例する。このため、乾燥工程後の唾液吸収部材の唾液が吸い上げられた領域から所定の面積分又は体積分の領域を切り出すことにより、常に所定量の唾液由来の固形分が保持された唾液吸収部材が得られる。この切断して回収された唾液吸収部材が、目的の唾液試料である。 In the method for preparing a saliva sample according to the present invention, a region in which a predetermined amount of saliva-derived solids are adsorbed is cut and recovered from the saliva absorbing member after the drying step. A saliva sample can be prepared in which a certain amount of saliva-derived solids is retained. For example, when the saliva absorbing member is strip-shaped or rod-shaped, one end of the saliva absorbing member is brought into contact with saliva, and saliva is sucked up by a capillary phenomenon, so that the saliva absorbing member can absorb saliva ( Absorption process). Since the capillary phenomenon is used, it is difficult for the saliva absorbing member to absorb only a predetermined amount of saliva in the absorption process, but in principle, the amount of saliva absorbed by the saliva absorbing member is the saliva absorbing member. The saliva inside is proportional to the volume sucked up. Further, in a saliva absorbing member having a constant thickness such as a strip shape or a rod shape, the amount of saliva absorbed is, in principle, proportional to the area in which saliva is sucked up in the saliva absorbing member. Therefore, by cutting out a region of a predetermined surface integral or volume from the region where saliva of the saliva absorbing member after the drying step is sucked up, a saliva absorbing member always holding a predetermined amount of saliva-derived solid content can be obtained. Be done. The saliva absorbing member cut and recovered is the target saliva sample.
乾燥工程後の短冊状又は棒状の唾液吸収部材から切断して回収される領域は、当該唾液吸収部材の唾液由来の固形分が吸着している領域のうち、吸い上げられた唾液の先端から離れた領域であることが好ましい。毛細管現象により唾液吸収部材中を吸い上げられた唾液の先端近傍では、単位面積当たり又は単位体積当たりの唾液吸収部材に吸収された唾液量にばらつきが生じやすく、当該先端近傍を含む唾液試料では、乾燥前に吸収されていた唾液量にばらつきが生じやすいためである。本発明においては、乾燥工程後の短冊状又は棒状の唾液吸収部材から切断して回収される領域は、吸い上げられた唾液の先端から８ｍｍ以上離れている領域であることが好ましく、吸い上げられた唾液の先端から１０ｍｍ以上離れている領域であることがより好ましい。 The region cut and recovered from the strip-shaped or rod-shaped saliva absorbing member after the drying step is separated from the tip of the sucked saliva in the region where the saliva-derived solid content of the saliva absorbing member is adsorbed. It is preferably a region. In the vicinity of the tip of saliva sucked up in the saliva absorbing member due to the capillary phenomenon, the amount of saliva absorbed by the saliva absorbing member per unit area or unit volume tends to vary, and the saliva sample including the vicinity of the tip is dried. This is because the amount of saliva that was previously absorbed tends to vary. In the present invention, the region cut and collected from the strip-shaped or rod-shaped saliva absorbing member after the drying step is preferably a region separated from the tip of the sucked saliva by 8 mm or more, and the sucked saliva. It is more preferable that the region is separated from the tip of the above by 10 mm or more.
別の容器に収容されている流涎に短冊状又は棒状の唾液吸収部材の一方の端部を浸漬させて毛細管現象により唾液を吸収させた場合には、吸い上げられた唾液の先端近傍以外は、単位面積当たり又は単位体積当たりの唾液吸収部材に吸収された唾液量はほぼ均一であるから、吸い上げられた唾液の先端近傍以外の領域であれば、唾液試料として切断して回収する領域は、唾液に浸漬させていた領域を含んでいてもよく、唾液に浸漬させていなかった領域のみであってもよい。一方で、唾液吸収部材の一方の端部を被検者の口に入れて毛細管現象により唾液を吸い上げることにより当該唾液吸収部材に唾液を吸収させた場合には、前記乾燥工程後の唾液吸収部材の唾液由来の固形分が吸着している領域のうち、被検者の口腔内において唾液と直接接触していなかった領域であり、かつ吸い上げられた唾液の先端から８ｍｍ以上、好ましくは１０ｍｍ以上離れている領域から、所定の面積分又は体積分の領域を切断し、唾液試料として回収する。唾液吸収部材のうち、被検者の口内で唾液に直接接触していた領域では、単位面積当たり又は単位体積当たりの唾液吸収部材に吸収された唾液量にばらつきが生じやすく、唾液と直接接触していなかった領域のほうが、単位面積当たり又は単位体積当たりの唾液の吸収量が均一である可能性が高いためである。唾液と直接接触していた領域における単位面積当たり又は単位体積当たりの唾液の吸収量にばらつきが大きくなる理由としては、口腔内において唾液吸収部材に直接触れる唾液量や、唾液吸収部材において唾液と直接接触した領域が占める割合にばらつきがあることや、被験者の口腔内表面との物理的な接触により唾液吸収部材が変形することによる影響があることが考えられる。 When one end of a strip-shaped or rod-shaped saliva absorbing member is immersed in saliva contained in another container to absorb saliva by the capillary phenomenon, the unit is other than the vicinity of the tip of the sucked saliva. Since the amount of saliva absorbed by the saliva absorbing member per area or unit volume is almost uniform, the area other than the vicinity of the tip of the sucked saliva can be cut and collected as a saliva sample. It may include the area that has been immersed, or may be only the area that has not been immersed in saliva. On the other hand, when one end of the saliva absorbing member is put into the mouth of the subject and the saliva is sucked up by the capillary phenomenon to cause the saliva absorbing member to absorb saliva, the saliva absorbing member after the drying step is performed. Of the regions where solids derived from saliva are adsorbed, the region is the region that was not in direct contact with saliva in the oral cavity of the subject, and is 8 mm or more, preferably 10 mm or more away from the tip of the sucked saliva. A predetermined area or volume of the area is cut from the area and collected as a saliva sample. In the region of the saliva absorbing member that was in direct contact with saliva in the subject's mouth, the amount of saliva absorbed by the saliva absorbing member per unit area or unit volume tends to vary, and the saliva is in direct contact with saliva. This is because it is more likely that the amount of saliva absorbed per unit area or unit volume is more uniform in the region that was not used. The reason why the amount of saliva absorbed per unit area or unit volume in the area that was in direct contact with saliva varies widely is the amount of saliva that directly touches the saliva absorbing member in the oral cavity and the amount of saliva that directly touches the saliva in the saliva absorbing member. It is considered that the proportion occupied by the contacted area varies, and that the saliva absorbing member is deformed by the physical contact with the oral surface of the subject.
唾液吸収部材の一方の端部を被検者の口に入れて毛細管現象により唾液を吸い上げることにより当該唾液吸収部材に唾液を吸収させる場合には、口腔内において唾液と直接接触する表面積が常に一定となるように、予め、唾液吸収部材の表面の一部を撥水性の部材により被覆しておく等により、唾液吸収部材に、口腔内に入れた場合でも唾液が直接接触しない領域（非接触領域）を設けておくことも好ましい。撥水性の部材としては、例えば、アルミホイル等の金属箔、パラフィン紙、合成樹脂フィルム等が挙げられる。 When one end of the saliva absorbing member is put into the subject's mouth and saliva is sucked up by the capillary phenomenon to cause the saliva absorbing member to absorb saliva, the surface area in direct contact with saliva in the oral cavity is always constant. By covering a part of the surface of the saliva absorbing member with a water-repellent member in advance so that saliva does not come into direct contact with the saliva absorbing member even when it is placed in the oral cavity (non-contact area). ) Is also preferable. Examples of the water-repellent member include metal foil such as aluminum foil, paraffin paper, and synthetic resin film.
本発明に係る唾液試料の調製方法により得られた唾液試料は、唾液中の生体成分の検査等に用いることができる。このため、本発明において用いられる唾液吸収部材には、予め、唾液試料が供される検査において内部標準物質となり得る物質を含有させておいてもよい。当該内部標準物質としては、検査対象の物質の放射性同位体等が挙げられる。例えば、唾液吸収部材に内部標準物質が溶解した溶液を染み込ませた後、充分に乾燥させることによって、内部標準物質を唾液吸収部材中に保持させることができる。内部標準物質は、唾液吸収部材のうち、被検者の口腔内において唾液と直接接触しない非接触領域に保持させておくことが好ましい。 The saliva sample obtained by the method for preparing a saliva sample according to the present invention can be used for inspection of biological components in saliva and the like. Therefore, the saliva absorbing member used in the present invention may contain in advance a substance that can serve as an internal standard substance in the test in which the saliva sample is provided. Examples of the internal standard substance include radioactive isotopes of the substance to be inspected. For example, the internal standard substance can be retained in the saliva absorbing member by impregnating the saliva absorbing member with a solution in which the internal standard substance is dissolved and then sufficiently drying the saliva absorbing member. The internal standard substance is preferably held in a non-contact region of the saliva absorbing member that does not come into direct contact with saliva in the oral cavity of the subject.
本発明に係る唾液試料の調製方法を用いることにより、少量ではあるが常に一定量の唾液が保持された唾液試料を、被検者から比較的簡便に調製することができる。さらに、調製された唾液試料は、乾燥された状態であり、長期保存や郵送等が容易であるため、唾液の採取時や採取場所と、唾液試料の分析時や分析場所が離れている場合の試料としても好ましい。本発明に係る唾液試料の調製方法は、多数の被験者の唾液中の生体成分を分析するための唾液試料を調製する場合や、唾液中の生体成分の経時的変化を調べる（モニタリングする）ために同一の被験者から経時的に唾液試料を調製する場合に特に適している。 By using the method for preparing a saliva sample according to the present invention, a saliva sample in which a small amount of saliva is always retained at all times can be relatively easily prepared from a subject. Furthermore, since the prepared saliva sample is in a dry state and can be easily stored for a long period of time or mailed, when the saliva collection time or collection place is separated from the saliva sample analysis time or analysis place. It is also preferable as a sample. The method for preparing a saliva sample according to the present invention is for preparing a saliva sample for analyzing the biological components in saliva of a large number of subjects and for investigating (monitoring) changes in biological components in saliva over time. It is particularly suitable for preparing saliva samples from the same subject over time.
本発明に係る唾液試料の調製方法により得られた唾液試料は、１００μＬ以下、好ましくは１〜５０μＬという極少量の唾液中の生体分子を分析し得るような、高感度の分析方法に供される試料として好適である。特に、１〜５０μＬの唾液に含有されている唾液中の有機酸を分析するための試料として好適であり、中でも、３−ヒドロキシ酪酸（３−ＨＢ）、３−ヒドロキシイソ酪酸（３−ＨＩＢ）、３−ヒドロキシイソ吉草酸（３−ＨＭＢ）、２−ヒドロキシ酪酸（２−ＨＢ）、及び乳酸からなる群より選択される１種以上を分析するための試料として好適である。 The saliva sample obtained by the method for preparing a saliva sample according to the present invention is subjected to a highly sensitive analysis method capable of analyzing a very small amount of biomolecules in saliva of 100 μL or less, preferably 1 to 50 μL. Suitable as a sample. In particular, it is suitable as a sample for analyzing organic acids in saliva contained in 1 to 50 μL of saliva, and among them, 3-hydroxybutyric acid (3-HB) and 3-hydroxyisobutyric acid (3-HIB). , 3-Hydroxyisovaleric acid (3-HMB), 2-hydroxybutyric acid (2-HB), and lactic acid are suitable as samples for analysis of one or more selected from the group.
本発明に係る唾液試料の調製方法においては、唾液試料中の唾液由来の固形分は、抗菌剤と共存させておくことが好ましい。唾液中における２−ＨＢ及び乳酸は、３−ＨＢ等に比べて保存安定性が低いが、抗菌剤と共存させることにより、唾液試料中の２−ＨＢ及び乳酸をより安定して保存させることができる。抗菌剤としては、グラム陽性菌、グラム陰性菌等の細菌類や酵母様真菌に対して、生育や増殖を抑制する作用や死滅させる作用を有する物質であれば特に限定されるものではなく、抗菌剤や消毒薬として用いられている各種抗菌剤の中から適宜選択して用いることができる。当該抗菌剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等の第四級アンモニウム塩系抗菌剤、次亜塩素酸ナトリウム等の塩素類、過酸化水素水、ポビドンヨード等のヨウ素剤、エタノール、イソプロパノール等のアルコール類等が挙げられる。本発明においては、一般的に唾液中に含まれている細菌類等の細胞膜を変質・損傷させる活性が高く、抗菌活性が高い点から、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等の第四級アンモニウム塩系抗菌剤が好ましい。また、多くの細菌類は、酸性環境下では死滅したり、生育や増殖が抑制されるため、唾液のｐＨを４．０以下にまで低下させることができる濃度の酸類を含有する溶液も、本発明において抗菌剤として使用できる。当該酸類としては、塩酸等の無機酸であってもよく、ギ酸等の有機酸であってもよい。 In the method for preparing a saliva sample according to the present invention, it is preferable that the saliva-derived solid content in the saliva sample coexists with the antibacterial agent. 2-HB and lactic acid in saliva have lower storage stability than 3-HB and the like, but by coexisting with an antibacterial agent, 2-HB and lactic acid in saliva samples can be stored more stably. it can. The antibacterial agent is not particularly limited as long as it is a substance having an action of suppressing growth or growth or an action of killing bacteria such as Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria and yeast-like fungi, and is antibacterial. It can be appropriately selected and used from various antibacterial agents used as agents and disinfectants. Examples of the antibacterial agent include a quaternary ammonium salt-based antibacterial agent such as benzalkonium chloride and benzethonium chloride, chlorine such as sodium hypochlorite, an iodine agent such as hydrogen peroxide solution and povidone iodine, ethanol and isopropanol. Alcohols and the like can be mentioned. In the present invention, quaternary ammonium salts such as benzalkonium chloride and benzethonium chloride are generally high in activity of altering and damaging cell membranes of bacteria and the like contained in saliva and high in antibacterial activity. Antibacterial agents are preferred. In addition, since many bacteria die in an acidic environment and their growth and growth are suppressed, a solution containing an acid having a concentration capable of lowering the pH of saliva to 4.0 or less is also available. It can be used as an antibacterial agent in the invention. The acids may be inorganic acids such as hydrochloric acid or organic acids such as formic acid.
例えば、前記乾燥工程前に、前記吸収工程において唾液を吸収させた唾液吸収部材に抗菌剤を含有させることにより、唾液由来の固形分を抗菌剤と共存させた状態で唾液吸収部材に保持させることができる。乾燥工程前に、唾液を吸収させた唾液吸収部材に抗菌剤を含有させる方法としては、例えば、唾液吸収部材を抗菌剤溶液（抗菌剤を適当な溶媒に溶解させた溶液）に浸漬させる方法や、唾液吸収部材表面に抗菌剤溶液を噴霧させる方法や、唾液吸収部材の表面に抗菌剤溶液をスポイト等を用いて滴下する方法等が挙げられる。抗菌剤溶液を調製するための溶媒としては、水であってもよく、エタノールやイソプロパノール等のアルコール類であってもよく、水とアルコール類との混合溶媒であってもよく、各種界面活性剤等の抗菌剤の溶解助剤を含有していてもよい。 For example, before the drying step, the saliva absorbing member that has absorbed saliva in the absorbing step contains an antibacterial agent so that the saliva-derived solid content is retained in the saliva absorbing member in a state of coexisting with the antibacterial agent. Can be done. As a method of incorporating an antibacterial agent into a saliva absorbing member that has absorbed saliva before the drying step, for example, a method of immersing the saliva absorbing member in an antibacterial agent solution (a solution in which the antibacterial agent is dissolved in an appropriate solvent) or , A method of spraying the antibacterial agent solution on the surface of the saliva absorbing member, a method of dropping the antibacterial agent solution on the surface of the saliva absorbing member using a dropper or the like, and the like. The solvent for preparing the antibacterial agent solution may be water, alcohols such as ethanol and isopropanol, a mixed solvent of water and alcohols, and various surfactants. It may contain a dissolving aid of an antibacterial agent such as.
また、唾液吸収部材に吸収させる前の唾液に抗菌剤を混合させておき、前記吸収工程において、唾液と抗菌剤の混合物を前記唾液吸収部材に吸収させることによっても、唾液由来の固形分を抗菌剤と共存させた状態で唾液吸収部材に保持させることができる。例えば、容器に収容された流涎に、唾液中の抗菌剤濃度が充分な抗菌活性を示すために必要充分な濃度となるように抗菌剤を添加して混合する。また、予め抗菌剤を入れておいた容器に、流涎を採取し、当該容器内において流涎と抗菌剤を混合してもよい。容器に採取された流涎に添加する抗菌剤及び採取用の容器内に予め入れておく抗菌剤は、水等の溶媒に溶解させた抗菌剤溶液であってもよく、粉末状等の固形の抗菌剤であってもよい。目的の抗菌剤濃度への調節が比較的容易であることから、採取用の容器内に予め入れておく抗菌剤としては、固形の抗菌剤であることが好ましく、流涎とより均一に混合しやすい点から粉末状の抗菌剤がより好ましい。採取用の容器に直接流涎を採取する場合には、採取される流涎の量を厳密に調節することは困難な場合が多いが、採取用の容器内に固形の抗菌剤を比較的多量に収容しておくことにより、採取される流涎の量を厳密に調整せずとも、保存安定性を高めるために必要充分な量の抗菌剤と混合させることができる。 Further, by mixing an antibacterial agent with saliva before being absorbed by the saliva absorbing member and allowing the saliva absorbing member to absorb a mixture of saliva and the antibacterial agent in the absorption step, the solid content derived from saliva is also antibacterial. It can be held by the saliva absorbing member in a state of coexisting with the agent. For example, the antibacterial agent is added to the saliva contained in the container and mixed so that the concentration of the antibacterial agent in saliva becomes a concentration necessary and sufficient to exhibit sufficient antibacterial activity. Alternatively, the hypersalivation may be collected in a container containing an antibacterial agent in advance, and the hypersalivation and the antibacterial agent may be mixed in the container. The antibacterial agent to be added to the saliva collected in the container and the antibacterial agent to be placed in the container for collection in advance may be an antibacterial agent solution dissolved in a solvent such as water, or a solid antibacterial agent such as powder. It may be an agent. Since it is relatively easy to adjust the concentration of the desired antibacterial agent, it is preferable that the antibacterial agent to be placed in the container for collection in advance is a solid antibacterial agent, and it is easy to mix more uniformly with the saliva. From the point of view, powdered antibacterial agents are more preferable. When collecting hypersalivation directly in the collection container, it is often difficult to strictly control the amount of hypersalivation collected, but a relatively large amount of solid antibacterial agent is contained in the collection container. By doing so, it is possible to mix with a sufficient amount of antibacterial agent necessary for enhancing storage stability without strictly adjusting the amount of saliva collected.
唾液を吸収させる前の唾液吸収部材に、予め抗菌剤を保持させておいてもよい。予め抗菌剤を保持させた唾液吸収部材に唾液を吸収させることによって、唾液由来の固形分を抗菌剤と共存させた状態で唾液吸収部材に保持させることができる。例えば、唾液吸収部材を抗菌剤溶液に浸漬させた後に乾燥させる方法や、唾液吸収部材表面に抗菌剤溶液を均一に噴霧した後に乾燥させる方法、唾液吸収部材表面に抗菌剤溶液を均一に塗布した後に乾燥させる方法によって、唾液吸収部材中に抗菌剤を保持させることができる。また、唾液吸収部材中の唾液と直接接触しない非接触領域であって、毛細管現象によって唾液が吸い上げられる領域にのみ、抗菌剤を保持させておいてもよい。特に、予め抗菌剤を保持させた唾液吸収部材の一方の端部を被検者の口に入れて毛細管現象により唾液を吸い上げる場合には、抗菌剤は、唾液吸収部材中の唾液や口腔内に直接接触しない非接触領域に保持させておくことが好ましい。 The antibacterial agent may be held in advance in the saliva absorbing member before the saliva is absorbed. By allowing the saliva absorbing member holding the antibacterial agent in advance to absorb saliva, the saliva absorbing member can hold the solid content derived from saliva in a state of coexisting with the antibacterial agent. For example, a method of immersing the saliva absorbing member in an antibacterial agent solution and then drying it, a method of uniformly spraying the antibacterial agent solution on the surface of the saliva absorbing member and then drying it, or a method of uniformly applying the antibacterial agent solution to the surface of the saliva absorbing member. The antibacterial agent can be retained in the saliva absorbing member by a method of drying later. Further, the antibacterial agent may be retained only in the non-contact region in the saliva absorbing member that does not come into direct contact with saliva and in which saliva is sucked up by the capillary phenomenon. In particular, when one end of a saliva absorbing member holding an antibacterial agent in advance is put into the subject's mouth and saliva is sucked up by capillarity, the antibacterial agent is put into saliva in the saliva absorbing member or in the oral cavity. It is preferable to keep it in a non-contact area where it does not come into direct contact.
＜第二の唾液試料の調製方法＞
唾液中の有機酸のうち、３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、及び乳酸は、いずれも、前記抗菌剤の存在下で比較的長時間、安定して保存することができる。そこで、唾液を吸収させた唾液吸収部材を乾燥させることなく、抗菌剤を含有する溶液中に浸漬させることによっても、唾液由来の有機酸を安定的に含有する唾液試料を調製することができる。具体的には、唾液を、唾液吸収部材に吸収させる吸収工程と、前記吸収工程において唾液を吸収させた唾液吸収部材を、抗菌剤を含有する溶液中に浸漬させる抗菌剤処理工程と、により行う。使用する唾液吸収部材及び抗菌剤は、前記の第一の唾液試料の調製方法で用いられるものと同様のものを用いることができ、吸収工程は、前記の第一の唾液試料の調製方法における吸収工程と同様にして行うことができる。また、抗菌剤処理工程において唾液吸収部材を浸漬させる抗菌剤を含有する溶液としては、前記抗菌剤溶液を用いることができる。
<Method of preparing the second saliva sample>
Of the organic acids in saliva, 3-HB, 3-HIB, 3-HMB, 2-HB, and lactic acid can all be stably stored for a relatively long time in the presence of the antibacterial agent. it can. Therefore, a saliva sample that stably contains a saliva-derived organic acid can also be prepared by immersing the saliva absorbing member that has absorbed saliva in a solution containing an antibacterial agent without drying it. Specifically, it is carried out by an absorption step of absorbing saliva into a saliva absorbing member and an antibacterial agent treatment step of immersing the saliva absorbing member having absorbed saliva in the absorption step in a solution containing an antibacterial agent. .. As the saliva absorbing member and the antibacterial agent used, the same ones as those used in the above-mentioned method for preparing the first saliva sample can be used, and the absorption step is the absorption in the above-mentioned method for preparing the first saliva sample. It can be carried out in the same manner as the process. Further, the antibacterial agent solution can be used as the solution containing the antibacterial agent for immersing the saliva absorbing member in the antibacterial agent treatment step.
所定量の唾液に由来する固形分を含有する唾液試料を調製するためには、唾液吸収部材のうち、所定量の唾液由来の固形分を保持している部分のみを、抗菌剤溶液に浸漬させる必要がある。このため、吸収工程において、唾液吸収部材に所定量の唾液を吸収させるか、又は吸収工程後の唾液吸収部材から所定量の唾液由来の固形分が吸着している領域を切断して回収したものを、抗菌剤溶液中に浸漬させる。吸収工程において、唾液吸収部材に所定量の唾液を吸収させる方法や、唾液吸収部材から所定量の唾液由来の固形分が吸着している領域を切断して回収する方法は、前記の第一の唾液試料の調製方法と同様にして行うことができる。 In order to prepare a saliva sample containing a predetermined amount of saliva-derived solids, only the portion of the saliva absorbing member holding the predetermined amount of saliva-derived solids is immersed in the antibacterial agent solution. There is a need. Therefore, in the absorption step, a predetermined amount of saliva is absorbed by the saliva absorbing member, or a region in which a predetermined amount of saliva-derived solid content is adsorbed is cut and recovered from the saliva absorbing member after the absorption step. Is immersed in an antibacterial agent solution. In the absorption step, the method of causing the saliva absorbing member to absorb a predetermined amount of saliva and the method of cutting and recovering the region where a predetermined amount of saliva-derived solids are adsorbed from the saliva absorbing member are described in the first method. It can be carried out in the same manner as the method for preparing a saliva sample.
＜唾液中の有機酸の検出方法＞
本発明に係る唾液中の有機酸の検出方法（以下、「本発明に係る検出方法」ということがある。）は、本発明に係る唾液試料の調製方法により得られた唾液試料中の有機酸を、特定の誘導体化試薬により誘導体化した後にＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって検出することを特徴とする。本発明に係る検出方法では、有機酸を、特定の誘導体化試薬により誘導体化して検出するため、供される唾液試料が１〜５０μＬという極少量の唾液から調製されたものであっても、３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、乳酸等（以下、まとめて「３−ＨＢ等」ということがある。）の有機酸を検出することができる。
<Method of detecting organic acids in saliva>
The method for detecting an organic acid in saliva according to the present invention (hereinafter, may be referred to as “detection method according to the present invention”) is an organic acid in a saliva sample obtained by the method for preparing a saliva sample according to the present invention. Is derivatized with a specific derivatizing reagent and then detected by LC-P-ESI-MS / MS. In the detection method according to the present invention, since the organic acid is derivatized with a specific derivatizing reagent and detected, even if the provided saliva sample is prepared from a very small amount of saliva of 1 to 50 μL, 3 It is possible to detect organic acids such as −HB, 3-HIB, 3-HMB, 2-HB, and lactic acid (hereinafter, collectively referred to as “3-HB and the like”).
具体的には、まず、本発明に係る唾液試料の調製方法により得られた唾液試料を、極性有機溶剤に浸漬させることにより、当該唾液試料から唾液由来の有機酸を抽出した後（抽出工程）、有機酸が抽出された極性有機溶剤を、当該唾液試料から分離して回収する（回収工程）。回収された極性有機溶媒は、唾液由来有機酸検出用試料として用いることができる。 Specifically, first, the saliva sample obtained by the method for preparing a saliva sample according to the present invention is immersed in a polar organic solvent to extract a saliva-derived organic acid from the saliva sample (extraction step). , The polar organic solvent from which the organic acid has been extracted is separated from the saliva sample and recovered (recovery step). The recovered polar organic solvent can be used as a sample for detecting saliva-derived organic acids.
当該極性有機溶剤としては、有機酸が溶解可能なものであれば特に限定されるものではなく、例えば、アセトニトリル、アセトン、エチルメチルケトン、２−ペンタノン、３−ペンタノン、エタノール、又はメタノール等が挙げられる。当該極性有機溶剤としては、３−ＨＢ等の溶解性が良好であることから、アセトニトリルが好ましい。 The polar organic solvent is not particularly limited as long as it can dissolve an organic acid, and examples thereof include acetonitrile, acetone, ethyl methyl ketone, 2-pentanone, 3-pentanone, ethanol, methanol and the like. Be done. As the polar organic solvent, acetonitrile is preferable because it has good solubility of 3-HB and the like.
唾液中の有機酸を定量的に検出するために、当該唾液由来有機酸検出用試料には、内部標準物質を一定量添加しておくことが好ましい。内部標準物質としては、検出対象の有機酸の安定同位体が挙げられる。当該内部標準物質は、回収工程において回収された極性有機溶媒（唾液由来有機酸検出用試料）に添加してもよく、唾液試料に添加する前の極性有機溶媒に添加しておいてもよい。 In order to quantitatively detect organic acids in saliva, it is preferable to add a certain amount of an internal standard substance to the saliva-derived organic acid detection sample. Examples of the internal standard substance include stable isotopes of organic acids to be detected. The internal standard substance may be added to the polar organic solvent (sample for detecting saliva-derived organic acid) recovered in the recovery step, or may be added to the polar organic solvent before being added to the saliva sample.
当該唾液由来有機酸検出用試料中の有機酸は、下記一般式（１）−１〜（１）−３（式（１）−１〜３中、Ｒ１及びＲ２は、一方が炭素数１〜６のヒドロキシアルキル基を表し、他方が水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表す。）のいずれかで表される誘導体化試薬とエステル結合させることにより誘導体を合成し、当該誘導体を、正イオンモードのエレクトロスプレーイオン化ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析）法により検出することができる（検出工程）。 The organic acid in the saliva-derived organic acid detection sample has the following general formulas (1) -1 to (1) -3 (in the formulas (1) -1 to 3, R 1 and R 2 have one carbon number. A derivative is synthesized by ester-bonding with a derivatizing reagent represented by either a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, which represents 1 to 6 hydroxyalkyl groups, and the other represents the derivative. Can be detected by the electrospray ionized LC-MS / MS (liquid chromatography-tandem mass analysis) method in the positive ion mode (detection step).
一般式（１）−１〜３中、Ｒ１及びＲ２は、一方が炭素数１〜６のヒドロキシアルキル基を表し、他方が水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表す。つまり、Ｒ１が炭素数１〜６のヒドロキシアルキル基の場合、Ｒ２が水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ２が炭素数１〜６のヒドロキシアルキル基の場合、Ｒ１が水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基である。窒素原子を含む６員又は５員のヘテロ環を有し、当該窒素原子付近にアルキル基で連結された水酸基が存在する化合物を誘導体化試薬として用いることにより、有機酸を効率よくイオン化することができ、さらに得られた誘導体（エステル化体）のＬＣの保持時間は比較的長いため、誘導体化に使用した試薬と明確に分離することができる。 In the general formulas (1) -1 to 3, R 1 and R 2 represent one of them represents a hydroxyalkyl group having 1 to 6 carbon atoms and the other represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. That is, when R 1 is a hydroxyalkyl group having 1 to 6 carbon atoms, R 2 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and when R 2 is a hydroxyalkyl group having 1 to 6 carbon atoms, R 1 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. By using a compound having a 6- or 5-membered heterocycle containing a nitrogen atom and a hydroxyl group linked by an alkyl group near the nitrogen atom as a derivatization reagent, the organic acid can be efficiently ionized. Furthermore, since the LC retention time of the obtained derivative (esterified product) is relatively long, it can be clearly separated from the reagent used for derivatization.
炭素数１〜６のアルキル基としては、直鎖状のアルキル基であってもよく、分岐鎖状のアルキル基であってもよい。具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−へキシル基等が挙げられる。一般式（１）−１〜３中のＲ１又はＲ２としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、又はｉ−プロピル基が好ましい。 The alkyl group having 1 to 6 carbon atoms may be a linear alkyl group or a branched-chain alkyl group. Specifically, methyl group, ethyl group, n-propyl group, i-propyl group, n-butyl group, i-butyl group, s-butyl group, t-butyl group, n-pentyl group, n-hexyl. Group etc. can be mentioned. As R 1 or R 2 in the general formula (1) -1 to 3, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, or an i-propyl group is preferable.
炭素数１〜６のヒドロキシアルキル基としては、炭素数１〜６の直鎖状のアルキル基中の１個の水素原子が水酸基に置換されている基であってもよく、炭素数１〜６の分岐鎖状のアルキル基中の１個の水素原子が水酸基に置換されている基であってもよい。具体的には、２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキシブチル基、５−ヒドロキシペンチル基、６−ヒドロキシヘキシル基等が挙げられる。 The hydroxyalkyl group having 1 to 6 carbon atoms may be a group in which one hydrogen atom in a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is substituted with a hydroxyl group, and the hydroxyalkyl group has 1 to 6 carbon atoms. It may be a group in which one hydrogen atom in the branched alkyl group of is substituted with a hydroxyl group. Specific examples thereof include a 2-hydroxyethyl group, a 3-hydroxypropyl group, a 4-hydroxybutyl group, a 5-hydroxypentyl group, a 6-hydroxyhexyl group and the like.
一般式（１）で表される誘導体化試薬としては、２−ピリジンメタノール、１−ピペリジンエタノール、及び２−（２−ヒドロキシエチル）−１−メチルピロリジンからなる群より選択される１種以上であることが好ましい。これらの化合物によってカルボキシル基をエステル化することにより、３−ＨＩＢと３−ＨＢと３−ＨＭＢと２−ＨＢのように構造類似の有機酸同士を、ＬＣにより良好に分離することが可能となり、ひいては、両者の同時検出（一の試料に対する１回のＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによる検出）が可能となる。一般式（１）で表される誘導体化試薬としては、中でも、リテンションタイムが遅く、誘導体化された検出対象の有機酸エステルのピークに対する誘導体化試薬によるピークの影響が小さいことから、２−ピリジンメタノールが特に好ましい。 The derivatization reagent represented by the general formula (1) is one or more selected from the group consisting of 2-pyridinemethanol, 1-piperidineethanol, and 2- (2-hydroxyethyl) -1-methylpyrrolidine. It is preferable to have. By esterifying the carboxyl group with these compounds, organic acids having similar structures such as 3-HIB, 3-HB, 3-HMB and 2-HB can be well separated by LC. As a result, simultaneous detection of both (detection by one LC-P-ESI-MS / MS for one sample) becomes possible. Among the derivatizing reagents represented by the general formula (1), 2-pyridine is used because the retention time is slow and the effect of the derivatizing reagent on the peak of the derivatized organic acid ester to be detected is small. Methanol is particularly preferred.
本発明に係る検出方法において、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ法は、誘導体化試薬として前記一般式（１）で表される化合物を用いる以外は、常法により行うことができる。具体的には、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおけるＨＰＬＣやＭＳは、カルボン酸エステルを検出するための公知の条件と同様に、又は適宜改変した条件で行うことができる。 In the detection method according to the present invention, the LC-P-ESI-MS / MS method can be carried out by a conventional method except that the compound represented by the general formula (1) is used as the derivatization reagent. Specifically, HPLC or MS in LC-MS / MS can be performed in the same manner as known conditions for detecting a carboxylic acid ester, or under appropriately modified conditions.
本発明に係る検出方法では、１回のＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにおいて、１種類の有機酸のみを検出してもよく、２種類以上の有機酸を同時に検出してもよい。本発明に係る検出方法において検出対象とされる有機酸としては、カルボキシル基を有する化合物であれば特に限定されるものではなく、当該検出方法は、カルボキシル基を有する多くの有機酸の検出に適用できる。本発明に係る検出方法は、解糖系、ＴＣＡサイクル、脂肪酸合成系等の中間代謝物たる有機酸の検出や定量に用いられることが好ましい。中でも、本発明に係る検出方法は、下記一般式（２）で表される有機酸の検出に用いられることが好ましい。 In the detection method according to the present invention, only one kind of organic acid may be detected in one LC-P-ESI-MS / MS, or two or more kinds of organic acids may be detected at the same time. The organic acid to be detected in the detection method according to the present invention is not particularly limited as long as it is a compound having a carboxyl group, and the detection method is applicable to the detection of many organic acids having a carboxyl group. it can. The detection method according to the present invention is preferably used for the detection and quantification of organic acids which are intermediate metabolites such as glycolysis system, TCA cycle and fatty acid synthesis system. Above all, the detection method according to the present invention is preferably used for detecting an organic acid represented by the following general formula (2).
一般式（２）中、Ｒ３は、炭素数２〜６のヒドロキシアルキル基を表す。炭素数２〜６のヒドロキシアルキル基としては、分岐鎖状のヒドロキシアルキル基であってもよく、直鎖状のヒドロキシアルキル基であってもよい。当該ヒドロキシアルキル基としては、例えば、２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキシブチル基、２−ヒドロキシブチル基、２−（ ヒドロキシメチル）プロピル基、２−ヒドロキシペンチル基、３−ヒドロキシ−２、２−ジメチルプロピル基、３−ヒドロキシペンチル基、５−ヒドロキシペンチル基、６−ヒドロキシヘキシル基、２−ヒドロキシヘキシル基等が挙げられる。 In the general formula (2), R 3 represents a hydroxyalkyl group having 2 to 6 carbon atoms. The hydroxyalkyl group having 2 to 6 carbon atoms may be a branched-chain hydroxyalkyl group or a linear hydroxyalkyl group. Examples of the hydroxyalkyl group include 2-hydroxyethyl group, 3-hydroxypropyl group, 2-hydroxypropyl group, 4-hydroxybutyl group, 2-hydroxybutyl group, 2- (hydroxymethyl) propyl group and 2-. Examples thereof include a hydroxypentyl group, 3-hydroxy-2, 2-dimethylpropyl group, 3-hydroxypentyl group, 5-hydroxypentyl group, 6-hydroxyhexyl group, 2-hydroxyhexyl group and the like.
一般式（２）で表される有機酸としては、Ｒ３が、炭素数２〜３のヒドロキシアルキル基であることが好ましい。特に、一般式（２）で表される有機酸としては、３−ＨＩＢ、３−ＨＢ、３−ＨＭＢ、及び２−ＨＢからなる群より選択される１種以上であることが好ましく、３−ＨＢと３−ＨＩＢ、又は３−ＨＩＢと３−ＨＢと３−ＨＭＢを同時に検出することがより好ましい。３−ＨＢは肝臓での脂肪酸異化のマーカーであり、３−ＨＩＢ及び３−ＨＭＢは骨格筋におけるＢＣＡＡ異化マーカーとなり得る。つまり、本発明に係る検出方法により、肝臓での脂肪酸異化のマーカーと骨格筋におけるＢＣＡＡ異化マーカーを同時に検出することができる。 As the organic acid represented by the general formula (2), R 3 is preferably a hydroxyalkyl group having 2 to 3 carbon atoms. In particular, the organic acid represented by the general formula (2) is preferably one or more selected from the group consisting of 3-HIB, 3-HB, 3-HMB, and 2-HB, and 3-. It is more preferable to detect HB and 3-HIB, or 3-HIB, 3-HB and 3-HMB at the same time. 3-HB is a marker of fatty acid catabolism in the liver, and 3-HIB and 3-HMB can be markers of BCAA catabolism in skeletal muscle. That is, according to the detection method according to the present invention, a marker for fatty acid catabolism in the liver and a marker for BCAA catabolism in skeletal muscle can be detected at the same time.
本発明に係る検出方法では、他のＬＣ−ＭＳ／ＭＳを利用した検出方法と同様に、検出対象たる有機酸を、濃度既知の有機酸を用いて作成した検量線に基づいて定量的に検出することができる。検量線作成時には、より定量性を高めるために、濃度既知の有機酸の希釈系列の全てに、一定量の安定同位体を添加しておくことも好ましい。 In the detection method according to the present invention, as in the case of other detection methods using LC-MS / MS, the organic acid to be detected is quantitatively detected based on a calibration curve prepared using an organic acid having a known concentration. can do. When preparing the calibration curve, it is also preferable to add a certain amount of stable isotope to all the dilution series of the organic acid having a known concentration in order to improve the quantitativeness.
また、生体試料中の有機酸の検出においては、従来の分析方法では、感度が不十分なためにより多くの生体試料を必要としたり、含有量が少なすぎてそもそも検出不可能な場合が多い。これに対して、本発明に係る検出方法は、非常に検出感度が高いため、従来よりも少量の生体試料から目的の有機酸を検出することができる。また、従来は含有量が極微量であるために検出ができなかった生体試料中の有機酸をも検出し得る。 Further, in the detection of an organic acid in a biological sample, the conventional analysis method often requires more biological samples due to insufficient sensitivity, or the content is too small to detect in the first place. On the other hand, since the detection method according to the present invention has extremely high detection sensitivity, it is possible to detect the target organic acid from a smaller amount of biological sample than before. In addition, it is possible to detect organic acids in biological samples that could not be detected in the past because the content is extremely small.
例えば、３−ＨＩＢを本発明に係る検出方法により検出した場合の検出感度は、従来の誘導体化せずにＬＣ−Ｎ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳで検出した場合と比べて、１００倍以上である。また、３−ＨＩＢをＨＣｌ−ブタノールを用いて誘導体化した誘導体をポジティブＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより検出した場合と比べても、１０倍以上高感度である。このため、本発明に係る検出方法は、５μＬ以下の唾液でも、３−ＨＩＢと３−ＨＢの同時定量や、３−ＨＩＢと３−ＨＢと３−ＨＭＢと２−ＨＢの同時定量、３−ＨＩＢと３−ＨＢと３−ＨＭＢと２−ＨＢと乳酸の同時定量が可能である。 For example, the detection sensitivity when 3-HIB is detected by the detection method according to the present invention is 100 times or more as compared with the case where 3-HIB is detected by LC-N-ESI-MS / MS without derivatization. .. In addition, the sensitivity is 10 times or more higher than that when a derivative obtained by derivatizing 3-HIB with HCl-butanol is detected by positive ESI-LC-MS / MS. Therefore, the detection method according to the present invention includes simultaneous quantification of 3-HIB and 3-HB, simultaneous quantification of 3-HIB, 3-HB, 3-HMB and 2-HB, and 3-HB even in saliva of 5 μL or less. Simultaneous quantification of HIB, 3-HB, 3-HMB, 2-HB and lactic acid is possible.
筋肉中において、ロイシンが代謝されると３−ＨＭＢが産生され、バリンが代謝されると３−ＨＩＢが産生される。つまり、生体中の３−ＨＭＢ濃度及び３−ＨＩＢ濃度は、筋肉中のＢＣＡＡ異化を反映しており、３−ＨＭＢ及び３−ＨＩＢは、筋肉中のＢＣＡＡ異化を反映するアミノ酸代謝マーカーとして機能する。また、肝臓においてスレオニンとメチオニン、及び脂肪酸が代謝されると、２−ＨＢ及び３−ＨＢが産生される。つまり、２−ＨＢ及び３−ＨＢは、スレオニンとメチオニンの代謝経路マーカー又は脂肪代謝マーカーとして機能する。さらに、グルコースが代謝されると、乳酸が産生される。つまり、乳酸は、糖代謝マーカーとして機能する。 In muscle, metabolism of leucine produces 3-HMB, and metabolism of valine produces 3-HIB. That is, the 3-HMB concentration and 3-HIB concentration in the living body reflect BCAA catabolism in muscle, and 3-HMB and 3-HIB function as amino acid metabolism markers reflecting BCAA catabolism in muscle. .. In addition, when threonine, methionine, and fatty acids are metabolized in the liver, 2-HB and 3-HB are produced. That is, 2-HB and 3-HB function as metabolic pathway markers or fat metabolism markers for threonine and methionine. In addition, when glucose is metabolized, lactic acid is produced. That is, lactic acid functions as a glucose metabolism marker.
なお、骨格筋におけるＢＣＡＡの異化の程度、すなわち、生体中の３−ＨＭＢ濃度及び３−ＨＩＢ濃度は、例えば、肝硬変、肝性脳症、筋炎、ステロイド筋症、心不全、抗がん剤の使用による悪疫質、横紋筋融解症、廃用性筋萎縮、甲状腺機能亢進症、慢性疲労症候群、サルコペニア（加齢性筋肉減弱現象）、ミトコンドリア脂肪酸酸化異常症等の疾患に罹患している患者、透析患者、手術侵襲患者、高齢者等の、血中アルブミン濃度や血中ＢＣＡＡ濃度が低下している若しくは低下しているおそれのある者についての、低栄養や筋蛋白分解の指標（バイオマーカー）とすることができる。また、マラソンやトライアスロン等の筋蛋白質異化が亢進しやすいアスリートについての低栄養や筋蛋白分解の指標とすることもできる。 The degree of BCAA catabolism in skeletal muscle, that is, the 3-HMB concentration and 3-HIB concentration in vivo depends on, for example, liver cirrhosis, hepatic encephalopathy, myitis, sarcopenia, heart failure, and the use of anticancer agents. Patients suffering from diseases such as plague, rhabdomyolysis, disused muscle atrophy, hyperthyroidism, chronic fatigue syndrome, sarcopenia (age-related muscle weakness), mitochondrial fatty acid dysoxidation, dialysis An index (biomarker) of hyponutrition and muscle atrophy for patients, surgically invasive patients, elderly people, etc. who have decreased or may have decreased blood albumin concentration or blood BCAA concentration. can do. It can also be used as an index of undernutrition and muscle protein degradation for athletes such as marathons and triathlons, who are prone to promote muscle protein catabolism.
唾液中の３−ＨＩＢ濃度は、栄養状態の指標とすることができるため、唾液中の３−ＨＩＢ濃度は、例えば、創薬スクリーニング、特に前述の各種疾患に対する治療剤候補の薬理効果を示すマーカーとして、また有効成分の安全性試験における毒性評価のマーカーとしても使用することが期待される。 Since the 3-HIB concentration in saliva can be used as an index of nutritional status, the 3-HIB concentration in saliva is a marker indicating, for example, drug discovery screening, particularly the pharmacological effect of a therapeutic agent candidate for various diseases described above. It is also expected to be used as a marker for toxicity evaluation in safety tests of active ingredients.
運動によるエネルギー消費増加に伴い、肝臓での脂肪酸異化が亢進し、体液（血、唾液）中の３−ＨＢ量が増加する。また、骨格筋のＢＣＡＡ異化が亢進している状態では、３−ＨＩＢ量及び３−ＨＭＢ量が増加する。このため、唾液中の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＢ濃度、３−ＨＭＢ濃度は、運動中又は運動後における肝臓と骨格筋のエネルギー供給源バランス（エネルギー代謝組織と供給栄養素の依存度）を評価する指標（バイオマーカー）となり得る。運動中又は運動後に、唾液中の３−ＨＢ濃度や３−ＨＩＢ濃度が、安静時からさほど変化がない場合には、糖がエネルギー供給源として使用されていると評価できる。運動中又は運動後に、唾液中の３−ＨＢ濃度や３−ＨＩＢ濃度が安静時よりも有意に上昇した場合には、肝臓での脂肪酸異化又は骨格筋におけるＢＣＡＡ異化によりエネルギーが産生されていると評価できる。運動中又は運動後の骨格筋ＢＣＡＡのエネルギー供給源としての利用を評価するバイオマーカーとしては、３−ＨＭＢよりも、唾液中３−ＨＩＢ濃度が好ましい。運動中又は運動後の肝臓と骨格筋での異なる組織と異なる栄養源によるエネルギー産生状態を評価するバイオマーカーとしては、唾液中の３−ＨＩＢ濃度と３−ＨＢ濃度の両方を測定する必要がある。 As energy expenditure increases due to exercise, fatty acid catabolism in the liver increases, and the amount of 3-HB in body fluids (blood, saliva) increases. In addition, in a state where BCAA catabolism of skeletal muscle is enhanced, the amount of 3-HIB and the amount of 3-HMB increase. Therefore, the 3-HIB concentration, 3-HB concentration, and 3-HMB concentration in saliva evaluate the energy supply source balance (dependence of energy metabolic tissue and nutrient supply) of the liver and skeletal muscle during or after exercise. It can be an index (biomarker) to be used. If the 3-HB concentration and 3-HIB concentration in saliva do not change much from rest during or after exercise, it can be evaluated that sugar is used as an energy supply source. When the 3-HB concentration or 3-HIB concentration in saliva is significantly higher than that at rest during or after exercise, it is said that energy is produced by fatty acid catabolism in the liver or BCAA catabolism in skeletal muscle. Can be evaluated. As a biomarker for evaluating the use of skeletal muscle BCAA as an energy supply source during or after exercise, the concentration of 3-HIB in saliva is preferable to 3-HMB. Both 3-HIB and 3-HB concentrations in saliva need to be measured as biomarkers for assessing energy production by different tissues and different nutrient sources in the liver and skeletal muscle during or after exercise. ..
具体的には、本発明に係る唾液試料の調製方法により、運動中の被検者から採取した唾液から調製した唾液試料から、３−ＨＩＢ及び／又は３−ＨＢを本発明に係る検出方法により検出して３−ＨＩＢ濃度及び／又は３−ＨＢ濃度を測定し、当該濃度を予め設定された所定の閾値と比較することにより、当該被験者における運動時のエネルギー供給源を評価することができる。当該閾値は、被験者ごとに設定することが好ましいが、多数の被験者について運動負荷量が同程度となることが期待される運動を行った後の３−ＨＩＢ濃度等を測定した結果から設定してもよい。 Specifically, according to the method for preparing a saliva sample according to the present invention, 3-HIB and / or 3-HB is detected from a saliva sample prepared from saliva collected from a subject during exercise by the detection method according to the present invention. The energy supply source during exercise in the subject can be evaluated by detecting and measuring the 3-HIB concentration and / or 3-HB concentration and comparing the concentration with a preset predetermined threshold. The threshold value is preferably set for each subject, but it is set from the result of measuring the 3-HIB concentration and the like after performing exercise that is expected to have the same exercise load for a large number of subjects. May be good.
また、運動開始直前から運動終了後一定期間経過後までの間に経時的に被検者から唾液試料を調製し、各唾液試料中の３−ＨＩＢ濃度及び／又は３−ＨＢ濃度を本発明に係る検出方法によって測定することにより、唾液中の３−ＨＩＢ濃度及び／又は３−ＨＢ濃度をモニタリングする（経時的変化を調べる）ことができる。モニタリングの結果得られた３−ＨＩＢ濃度及び／又は３−ＨＢ濃度の経時的変化に基づいて、当該被験者における運動時のエネルギー供給源を評価することができる。なお、運動開始直前が安静時（平常状態）ではない場合には、予め、安静時の被験者から唾液試料を調製し、各唾液試料中の３−ＨＩＢ濃度及び／又は３−ＨＢ濃度を本発明に係る検出方法によって測定しておき、得られた測定値を運動時のエネルギー供給源の評価の参考にすることが好ましい。 In addition, saliva samples are prepared from the subject over time from immediately before the start of exercise to after a certain period of time after the end of exercise, and the 3-HIB concentration and / or 3-HB concentration in each saliva sample is determined in the present invention. By measuring by such a detection method, it is possible to monitor the 3-HIB concentration and / or the 3-HB concentration in saliva (examine the change with time). Based on the time course of 3-HIB concentration and / or 3-HB concentration obtained as a result of monitoring, the energy supply source during exercise in the subject can be evaluated. If the patient is not at rest (normal state) immediately before the start of exercise, a saliva sample is prepared in advance from the resting subject, and the 3-HIB concentration and / or 3-HB concentration in each saliva sample is determined in the present invention. It is preferable to measure by the detection method according to the above, and to use the obtained measured value as a reference for evaluation of the energy supply source during exercise.
過度の運動に加え、休養と栄養が不十分であると、相対的運動負荷量が過大となる、いわゆるオーバーワーク状態となる。飢餓時などの低栄養状態では、肝臓での脂肪酸異化によって得られるケトン体産生亢進と、骨格筋での蛋白質分解によって得られるＢＣＡＡ異化亢進によるエネルギー産生が活性化するため、唾液中の３−ＨＢ濃度と３−ＨＩＢ濃度が上昇する。特に、持久性競技者や減量や食事制限を行っているスポーツ選手や愛好家は、糖消費後のエネルギー源となる脂質貯蔵量が少ないため、骨格筋のアミノ酸をエネルギー源としての利用依存度が高くなる。その様な骨格筋アミノ酸の利用度の増加や持続により、筋蛋白質分解が亢進し、骨格筋萎縮等の症状を伴う全身のエネルギー代謝不全状態が生じる。この様な場合の多くは、いわゆるオーバーワーク状態に陥っている。この様なオーバーワーク状態では、唾液中の３−ＨＢ濃度と３−ＨＩＢ濃度測定を行うことにより、肝臓の脂肪酸異化由来のケトン体と骨格筋蛋白由来のＢＣＡＡ異化によるエネルギー供給源バランス、依存度を評価できることから、オーバーワーク状態の指標ともなり得る。例えば、運動をしていない安静時（平常状態）における３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＢ濃度と、オーバーワークとならない程度の運動を行った後の唾液中の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＢ濃度とを本発明に係る検出方法によって測定しておき、これらの測定値から、オーバーワーク状態における３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＢ濃度と、オーバーワークではない状態における３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＢ濃度とを分ける閾値（オーバーワーク閾値）を予め設定しておく。オーバーワークが引き起こされる様な過度な繰り返しの運動後の被検者から調製した唾液試料中から３−ＨＩＢ及び３−ＨＢ濃度を本発明に係る検出方法により検出して唾液中の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＢ濃度を測定し、当該濃度を予め設定されたオーバーワーク閾値と比較することにより、当該被験者におけるエネルギー供給源バランスを評価する。具体的には、当該被験者の３−ＨＩＢ濃度と３−ＨＢ濃度がオーバーワーク閾値よりも低い場合には、当該被験者の運動負荷量は適正であり、被験者はオーバーワークではない可能性が高く、当該被験者の３−ＨＩＢ濃度がオーバーワーク閾値以上である場合には、当該被験者の運動負荷量は過大であって、当該被験者はオーバーワークである可能性が高い、と評価できる。また、当該被験者の３−ＨＢ濃度のみが閾値以上である場合には、当該被験者がエネルギー不足状態であっても、当該被験者はまだオーバーワークに至っていない可能性が高い、と評価できる。当該オーバーワーク閾値は、被験者ごとに設定することが好ましいが、多数の健常者についてオーバーワークとならない程度の運動を行った後の３−ＨＩＢ濃度又は３−ＨＢ濃度を測定した結果から設定してもよい。運動中の被験者から経時的に唾液試料を調製し、３−ＨＩＢ濃度と３−ＨＢ濃度を経時的に測定してモニタリングすることにより、危険なオーバーワーク状態となる前に運動を終了させることもできる。この場合、被験者からの試料採取は必ずしも運動中である必要はなく、長期の運動プログラムやトレーニングを行っている被験者の安静時から採取した試料から得られる結果を、運動プログラム前やトレーニング前の同一被験者から採取した試料から得られた結果と比較することにより、オーバーワーク状態の評価に用いることもできる。すなわち、本発明に係る方法によって運動中あるいは長期的な３−ＨＩＢ濃度と３−ＨＢ濃度をモニタリングすることにより、適正な運動量を評価し、オーバーワーク状態を予防することができる。 Insufficient rest and nutrition, in addition to excessive exercise, results in an excessive relative exercise load, a so-called overwork condition. Undernutrition, such as during starvation, activates the increased ketone body production obtained by fatty acid catabolism in the liver and the increased energy production by BCAA catabolism obtained by protein degradation in skeletal muscle, resulting in 3-HB in saliva. Concentration and 3-HIB concentration increase. In particular, endurance athletes and athletes and enthusiasts who are losing weight or restricting their diet are more dependent on using amino acids in skeletal muscle as an energy source because the amount of lipid stored as an energy source after sugar consumption is small. It gets higher. By increasing or sustaining the utilization of such skeletal muscle amino acids, muscle protein decomposition is promoted, resulting in a systemic energy metabolism deficiency state accompanied by symptoms such as skeletal muscle atrophy. In many of these cases, we are in a so-called overwork state. In such an overwork state, by measuring the 3-HB concentration and 3-HIB concentration in saliva, the energy supply source balance and dependence due to the ketone body derived from fatty acid catabolism in the liver and BCAA catabolism derived from skeletal muscle protein Since it can be evaluated, it can be an index of overwork status. For example, the 3-HIB concentration and 3-HB concentration at rest (normal state) when not exercising, and the 3-HIB concentration and 3-HB concentration in saliva after exercising to the extent that it does not cause overwork. Was measured by the detection method according to the present invention, and from these measured values, the 3-HIB concentration and 3-HB concentration in the overwork state and the 3-HIB concentration and 3-HB concentration in the non-overwork state were obtained. The threshold for dividing (overwork threshold) is set in advance. The 3-HIB and 3-HB concentrations in the saliva sample prepared from the subject after excessive repeated exercise that causes overwork are detected by the detection method according to the present invention, and the 3-HIB concentration in the saliva is detected. And 3-HB concentrations are measured and the concentration is compared to a preset overwork threshold to assess the energy supply source balance in the subject. Specifically, when the 3-HIB concentration and 3-HB concentration of the subject are lower than the overwork threshold, the exercise load of the subject is appropriate, and it is highly possible that the subject is not overwork. When the 3-HIB concentration of the subject is equal to or higher than the overwork threshold value, it can be evaluated that the exercise load of the subject is excessive and the subject is likely to be overworked. Further, when only the 3-HB concentration of the subject is equal to or higher than the threshold value, it can be evaluated that there is a high possibility that the subject has not yet reached overwork even if the subject is in an energy deficient state. The overwork threshold is preferably set for each subject, but is set from the result of measuring the 3-HIB concentration or 3-HB concentration after exercising to the extent that it does not cause overwork for a large number of healthy subjects. May be good. By preparing saliva samples from exercising subjects over time and measuring and monitoring 3-HIB and 3-HB concentrations over time, exercise can be terminated before a dangerous overwork condition occurs. it can. In this case, sampling from the subject does not necessarily have to be during exercise, and the results obtained from the sample taken from the rest of the subject undergoing a long-term exercise program or training are the same before the exercise program and before training. It can also be used to evaluate the overwork state by comparing it with the results obtained from the samples collected from the subjects. That is, by monitoring the 3-HIB concentration and 3-HB concentration during or for a long period of time by the method according to the present invention, an appropriate amount of exercise can be evaluated and an overwork state can be prevented.
また、例えば、本発明に係る検出方法によって、一の動物個体から経時的に調製された唾液試料中の３−ＨＩＢや３−ＨＢの濃度測定することにより、骨格筋のＢＣＡＡ異化や肝臓における脂肪酸異化の状態をモニタリングすることもできる。３−ＨＩＢ濃度モニタリングや３−ＨＢ濃度モニタリングは、例えば、肝硬変患者、低栄養状態や寝たきり状態の患者に対する、骨格筋萎縮予防、低栄養状態改善を目的としたＢＣＡＡ製剤投与や栄養療法の開始の必要性の有無の判断やそれらの治療の判定に利用可能である。例えば、３−ＨＢ濃度に変化がみられないのにも関わらず、３−ＨＩＢ濃度のみ上昇傾向がみられる場合には、肝機能の低下による肝臓での低エネルギー産生能を、骨格筋蛋白異化によるアミノ酸由来のエネルギー産生で代償する低栄養状態である可能性が高いと評価できる。 Further, for example, by measuring the concentration of 3-HIB or 3-HB in a saliva sample prepared from one animal individual over time by the detection method according to the present invention, BCAA catabolism of skeletal muscle and fatty acids in the liver can be measured. It is also possible to monitor the state of catabolism. 3-HIB concentration monitoring and 3-HB concentration monitoring are, for example, the administration of BCAA preparations and the start of nutrition therapy for the purpose of preventing skeletal muscle atrophy and improving malnutrition in patients with liver cirrhosis, malnutrition or bedridden. It can be used to determine the presence or absence of necessity and to determine the treatment of them. For example, if there is no change in 3-HB concentration but only 3-HIB concentration tends to increase, the ability to produce low energy in the liver due to decreased liver function is skeletal muscle protein catabolism. It can be evaluated that there is a high possibility that the liver is undernourished by compensating for the production of energy derived from amino acids.
その他にも、本発明に係る検出方法によって３−ＨＩＢや３−ＨＢの濃度を測定することにより、スポーツ医学領域において、肝臓と骨格筋における脂質とアミノ酸のエネルギー源依存バランス（エネルギー代謝状態）を、唾液を用いてもモニターすることも可能となる。さらに、アンチエイジングやダイエットによる体重管理や美容の領域において、本発明に係る検出方法によって唾液を分析して３−ＨＩＢや３−ＨＢの濃度を測定することにより、糖、アミノ酸、脂肪酸の代謝状態を評価しながら、効果的に栄養・運動・体調管理を行うことも可能となる。さらに、本発明に係る検出方法は、ＢＣＡＡ等の栄養素が含まれるサプリメントや栄養ドリンクを摂取した際の栄養・摂取効果などの評価にも利用できる。 In addition, by measuring the concentrations of 3-HIB and 3-HB by the detection method according to the present invention, the energy source-dependent balance (energy metabolism state) of lipids and amino acids in the liver and skeletal muscle in the field of sports medicine can be determined. , It is also possible to monitor using saliva. Furthermore, in the fields of weight management and cosmetology by anti-aging and dieting, the metabolic state of sugars, amino acids and fatty acids is measured by analyzing saliva by the detection method according to the present invention and measuring the concentrations of 3-HIB and 3-HB. It is also possible to effectively manage nutrition, exercise, and physical condition while evaluating. Further, the detection method according to the present invention can also be used for evaluation of nutritional / ingestion effect when a supplement containing nutrients such as BCAA or a nutritional drink is ingested.
また、肝硬変患者では、肝機能の低下による肝臓から骨格筋への糖の供給が低下することにより、飢餓状態に陥り、アミノ酸異化が亢進する。このため、健常者群よりも肝硬変患者群の方が、体液中の３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、及び２−ＨＢの濃度が高い傾向にある。そこで、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、及び２−ＨＢは、肝硬変のバイオマーカーとして利用できる。具体的には、予め肝硬変患者と健常者とを分ける閾値を設定し、被検者の唾液中の３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、及び２−ＨＢの濃度を本発明に係る検出方法によって測定し、当該濃度を所定の閾値と比較することにより、肝硬変発症可能性を評価することができる。具体的には、被検者の唾液中の３−ＨＩＢ等の濃度が所定の閾値以上であった場合に、前記被検者が肝硬変を発症している可能性が高いと評価することができる。肝硬変患者と健常者とを分ける閾値は、実験的に設定することができる。例えば、肝硬変を発症していないことが分かっている集団から採取された唾液と、肝硬変を発症していることが分かっている集団から採取された唾液とに対して、本発明に係る検出方法を行ってこれらの唾液中の３−ＨＩＢ等の濃度を測定し、両集団の測定値を比較することにより、適宜設定することができる。肝硬変のバイオマーカーとしては、３−ＨＩＢ又は３−ＨＭＢが好ましく、肝硬変患者群と健常者群の差がよりはっきりしていることから、唾液中の３−ＨＩＢ又は唾液中の３−ＨＭＢがより好ましい。 In addition, in patients with liver cirrhosis, the supply of sugar from the liver to skeletal muscle decreases due to the decrease in liver function, resulting in starvation and increased amino acid catabolism. Therefore, the concentration of 3-HIB, 3-HMB, and 2-HB in the body fluid tends to be higher in the liver cirrhosis patient group than in the healthy subject group. Therefore, 3-HIB, 3-HMB, and 2-HB can be used as biomarkers for liver cirrhosis. Specifically, a threshold value for separating a cirrhosis patient and a healthy person is set in advance, and the concentrations of 3-HIB, 3-HMB, and 2-HB in the saliva of the subject are measured by the detection method according to the present invention. , The possibility of developing liver cirrhosis can be evaluated by comparing the concentration with a predetermined threshold value. Specifically, when the concentration of 3-HIB or the like in the saliva of the subject is equal to or higher than a predetermined threshold value, it can be evaluated that the subject is highly likely to have cirrhosis. .. The threshold for separating cirrhosis patients and healthy subjects can be set experimentally. For example, the detection method according to the present invention is used for saliva collected from a population known not to develop cirrhosis and saliva collected from a population known to develop cirrhosis. It can be appropriately set by measuring the concentration of 3-HIB or the like in these saliva and comparing the measured values of both populations. As a biomarker for liver cirrhosis, 3-HIB or 3-HMB is preferable, and since the difference between the liver cirrhosis patient group and the healthy subject group is clearer, 3-HIB in saliva or 3-HMB in saliva is more preferable. preferable.
肝硬変が進行し、肝機能の一つである尿素回路が低下すると、アンモニアは骨格筋で代償的にグルタミンやアラニンに代謝されて無毒化される。その際に、ＢＣＡＡが骨格筋でＢＣＡＴにより分岐鎖α−ケト酸に異化される過程で副産物として生じるグルタミン酸が、アンモニア解毒に用いられている。そのため、肝硬変時に骨格筋で代償するアンモニア解毒の際にも骨格筋ＢＣＡＡ異化の亢進が必要であり、結果として、体液中の３−ＨＩＢ濃度は上昇する。アンモニア解毒が不十分で、体液中のアンモニア濃度が高くなると、脳症が誘発されやすくなると考えられている。したがって、肝硬変患者の肝臓でのアンモニア解毒能の低下に加え、骨格筋ＢＣＡＡ異化を介したアンモニア解毒代償能の低下が生じると、肝性脳症をきたすものと考えられる。この様な理由で、３−ＨＩＢは、肝性脳症又はその発症可能性のバイオマーカーとして利用でき、その予防や早期治療のために有用な情報を提供することができる。例えば、３−ＨＩＢ濃度から肝性脳症を発症するリスクが高いと評価された肝硬変患者に対しては、脳症が顕在化していない場合であっても蛋白制限食を推奨したり、ＢＣＡＡの摂取を推奨したりすることにより、肝性脳症の発症を予防し得る可能性がある。 When cirrhosis progresses and the urea cycle, which is one of the liver functions, declines, ammonia is compensatoryly metabolized to glutamine and alanine in skeletal muscle and detoxified. At that time, glutamic acid produced as a by-product in the process of catabolizing BCAA to branched chain α-keto acid by BCAT in skeletal muscle is used for ammonia detoxification. Therefore, it is necessary to enhance skeletal muscle BCAA catabolism during ammonia detoxification, which is compensated by skeletal muscle during liver cirrhosis, and as a result, the 3-HIB concentration in body fluid increases. It is thought that encephalopathy is more likely to be induced when ammonia detoxification is insufficient and the concentration of ammonia in body fluids is high. Therefore, in addition to the decrease in ammonia detoxification ability in the liver of patients with liver cirrhosis, the decrease in ammonia detoxification compensation ability mediated by skeletal muscle BCAA catabolism is considered to cause hepatic encephalopathy. For this reason, 3-HIB can be used as a biomarker for hepatic encephalopathy or its potential to develop, and can provide useful information for its prevention and early treatment. For example, for patients with liver cirrhosis who are evaluated to have a high risk of developing hepatic encephalopathy based on 3-HIB concentration, a protein-restricted diet is recommended or BCAA intake is recommended even if encephalopathy is not manifested. It may be possible to prevent the onset of hepatic encephalopathy by making recommendations.
例えば、肝硬変患者から経時的に採取した唾液中の３−ＨＩＢ濃度をモニタリングした場合に、３−ＨＩＢ濃度が低下傾向にある場合には、当該肝硬変患者が肝性脳症を発症する可能性が高い。そこで、肝硬変を発症している被検者から採取された唾液中の３−ＨＩＢ濃度を本発明に係る検出方法によって測定し、得られた３−ＨＩＢ濃度を、当該唾液が採取された時点以前に前記被験者から採取された唾液中の３−ＨＩＢ濃度と比較することにより、肝性脳症発症可能性を評価できる。具体的には、得られた３−ＨＩＢ濃度が、以前に採取された唾液の３−ＨＩＢ濃度よりも有意に低い場合や、モニタリングの結果、以前に採取された唾液の３−ＨＩＢ濃度よりも低くなる傾向がある程度継続している場合には、当該被検者が肝性脳症を発症する可能性が高いと評価する。 For example, when the 3-HIB concentration in saliva collected from a liver cirrhosis patient over time is monitored, if the 3-HIB concentration tends to decrease, the liver cirrhosis patient is likely to develop hepatic encephalopathy. .. Therefore, the 3-HIB concentration in saliva collected from a subject suffering from hepatic cirrhosis was measured by the detection method according to the present invention, and the obtained 3-HIB concentration was measured before the time when the saliva was collected. The possibility of developing hepatic encephalopathy can be evaluated by comparing with the 3-HIB concentration in saliva collected from the subject. Specifically, when the obtained 3-HIB concentration is significantly lower than the 3-HIB concentration of previously collected saliva, or as a result of monitoring, it is higher than the 3-HIB concentration of previously collected saliva. If the tendency to decrease continues to some extent, it is evaluated that the subject is likely to develop hepatic encephalopathy.
肝硬変患者における３−ＨＩＢ濃度が低下しているか否かは、肝硬変患者と健常者とを分ける閾値を用いても評価することができる。具体的には、肝硬変を発症している被検者から採取した唾液中の３−ＨＩＢ濃度を本発明に係る検出方法によって測定し、得られた３−ＨＩＢ濃度を、所定の閾値（例えば、前記の肝硬変患者と健常者とを分ける閾値）と比較することにより、肝性脳症発症可能性を評価することができる。具体的には、被検者の３−ＨＩＢ濃度が所定の閾値未満であった場合や、所定の閾値未満である状態がある程度継続している場合に、前記被検者が肝性脳症を発症する可能性が高いと評価することができる。 Whether or not the 3-HIB concentration in a liver cirrhosis patient is decreased can also be evaluated by using a threshold value that separates a liver cirrhosis patient and a healthy person. Specifically, the 3-HIB concentration in saliva collected from a subject developing liver cirrhosis is measured by the detection method according to the present invention, and the obtained 3-HIB concentration is set to a predetermined threshold value (for example, The possibility of developing hepatic encephalopathy can be evaluated by comparing with the above-mentioned threshold value for separating a patient with liver cirrhosis and a healthy person). Specifically, the subject develops hepatic encephalopathy when the 3-HIB concentration of the subject is less than a predetermined threshold value or when the state of being below the predetermined threshold value continues to some extent. It can be evaluated that there is a high possibility of doing so.
また、前述のように、唾液や血清等の生体試料中の３−ＨＩＢ濃度は、サルコペニアの予測因子となり得るが、サルコペニアは長期的な変化によるものであるため、３−ＨＩＢ濃度の上昇は観察し難い場合がある。また、３−ＨＩＢ濃度は、測定の際の栄養状態や代謝状態にも影響されるため、長期的な変化は短期的な影響に隠れて見落とされるおそれもある。測定前に予めＢＣＡＡを負荷（経口投与）しておくことにより、健常者とサルコペニア患者又はその予備群とにおける３−ＨＩＢ濃度の差をより明確にすることができる。例えば健常者では、ＢＣＡＡ製剤を１日３回、２週間経口摂取した場合でも、血中の３−ＨＩＢ濃度は摂取前と比べてほとんど変化しないが、骨格筋におけるＢＣＡＡへのエネルギー依存度が高い被検者では、ＢＣＡＡ摂取前に比べてＢＣＡＡ摂取後に、血中又は唾液中の３−ＨＩＢ濃度が上昇する。このため、ＢＣＡＡ負荷前後の唾液又は血液中の３−ＨＩＢ濃度を測定し、ＢＣＡＡ負荷によって３−ＨＩＢ濃度が上昇している場合には、骨格筋におけるＢＣＡＡ異化が亢進しており、サルコペニアである可能性が高い、又はサルコペニアを発症する危険性が高いと予測することができる。 In addition, as described above, 3-HIB concentration in biological samples such as saliva and serum can be a predictor of sarcopenia, but since sarcopenia is due to long-term changes, an increase in 3-HIB concentration is observed. It may be difficult to do. In addition, since the 3-HIB concentration is also affected by the nutritional status and metabolic status at the time of measurement, long-term changes may be overlooked because of short-term effects. By preloading BCAA (oral administration) before measurement, the difference in 3-HIB concentration between healthy subjects and sarcopenia patients or their reserve group can be clarified more clearly. For example, in healthy subjects, even when BCAA preparations are taken orally three times a day for two weeks, the 3-HIB concentration in blood does not change much compared to before ingestion, but the energy dependence of BCAA in skeletal muscle is high. In the subject, the 3-HIB concentration in blood or saliva increases after ingesting BCAA as compared with before ingesting BCAA. Therefore, the 3-HIB concentration in saliva or blood before and after the BCAA load is measured, and when the 3-HIB concentration is increased by the BCAA load, BCAA catabolism in skeletal muscle is enhanced, which is sarcopenia. It can be predicted that there is a high probability or that there is a high risk of developing sarcopenia.
なお、ＢＣＡＡ負荷を行う場合には、摂取したＢＣＡＡの腸吸収や血中濃度変化などの影響を考慮して、バリン濃度を基準とし、３−ＨＩＢ濃度とバリン濃度の比をバイオマーカーとすることが好ましい。ＢＣＡＡ摂取による３−ＨＩＢ濃度の上昇度を、バリン濃度の上昇度を基準として評価することにより、より信頼性の高い結果を期待できる。 When BCAA loading is performed, the valine concentration should be used as a reference, and the ratio of 3-HIB concentration to valine concentration should be used as a biomarker in consideration of the effects of intestinal absorption of ingested BCAA and changes in blood concentration. Is preferable. By evaluating the degree of increase in 3-HIB concentration due to BCAA intake based on the degree of increase in valine concentration, more reliable results can be expected.
３−ＨＭＢは、ＢＣＡＡ由来の肝臓や骨格筋における蛋白合成のマーカーや骨格筋肥大のマーカーとして利用可能であり、また、２−ＨＢは、早期インスリン抵抗性のマーカーや、グルコース不耐性のマーカーであり、大腸癌マーカーとしても有用である。乳酸は、代謝性アシドーシス（乳酸アシドーシス）の判断に用いられ、低酸素症、循環不全、管理不良の糖尿病、肝不全、及び骨格筋の痙攣時に高値になり、糖原病や乳酸脱水素酵素欠損症の際に低値になる。また、乳酸は、運動負荷（運動強度）のマーカーとしても利用されている。本発明に係る検出方法を用いることにより、これらのバイオマーカーを感度よく検出することができる。 3-HMB can be used as a marker for protein synthesis in liver and skeletal muscle derived from BCAA and a marker for skeletal muscle hypertrophy, and 2-HB is a marker for early insulin resistance and glucose intolerance. It is also useful as a marker for colorectal cancer. Lactate is used to determine metabolic acidosis (lactic acidosis) and is elevated during hypoxia, circulatory failure, poorly managed diabetes, liver failure, and skeletal muscle spasm, resulting in glycogen storage disease and lactate dehydrogenase deficiency. It becomes low at the time of illness. Lactic acid is also used as a marker for exercise load (exercise intensity). By using the detection method according to the present invention, these biomarkers can be detected with high sensitivity.
肝臓におけるアルコール分解にはＮＡＤを補酵素として使用するため、肝臓内のＮＡＤ／ＮＡＤＨ比が低くなる。このＮＡＤ／ＮＡＤＨ比の低下によって、肝臓における脂肪酸異化（β酸化）が低下するため、アルコール摂取が脂肪肝や肥満の原因となる。ＮＡＤはミトコンドリア内におけるα−ケト酪酸からプロピオニルＣｏＡへの代謝にも用いられるため、ＮＡＤ／ＮＡＤＨ比が低下すると、ミトコンドリア内でα−ケト酪酸が代謝されず、細胞質内でα−ケト酪酸が２−ＨＢに代謝される割合が高くなると考えられる。このため、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＳＨ）患者に比べて、アルコール性脂肪肝（ＡＳＨ）患者において、２−ＨＢ量は高くなり、２−ＨＢは、ＮＡＳＨとＡＳＨを識別するためのバイオマーカーとして利用し得る。 Since NAD is used as a coenzyme for alcohol degradation in the liver, the NAD / NADH ratio in the liver is low. This decrease in the NAD / NADH ratio reduces fatty acid catabolism (β-oxidation) in the liver, so that alcohol intake causes fatty liver and obesity. Since NAD is also used for metabolism of α-ketobutyric acid into propionyl-CoA in mitochondria, when the NAD / NADH ratio decreases, α-ketobutyric acid is not metabolized in mitochondria, and α-ketobutyric acid is 2 in the cytoplasm. -It is thought that the rate of metabolism to HB is high. Therefore, the amount of 2-HB is higher in alcoholic fatty liver (ASH) patients than in non-alcoholic fatty liver (NASH) patients, and 2-HB is a biomarker for distinguishing between NASH and ASH. Can be used.
本発明に係る検出方法は、微量の唾液から、アミノ酸、脂肪、又は糖のエネルギー代謝マーカーである３−ＨＩＢと３−ＨＭＢと２−ＨＢと３−ＨＢと乳酸の同時定量が可能である。このため、本発明に係る検出方法を用いることにより、被験者のエネルギー代謝の状態をより詳細に解析することができる。これらの有機酸の量を解析することにより、高齢者等における糖、脂肪、及びアミノ酸の代謝バランスを調べることができる。 The detection method according to the present invention can simultaneously quantify 3-HIB, 3-HMB, 2-HB, 3-HB, and lactic acid, which are energy metabolism markers of amino acids, fats, or sugars, from a trace amount of saliva. Therefore, by using the detection method according to the present invention, the state of energy metabolism of the subject can be analyzed in more detail. By analyzing the amount of these organic acids, the metabolic balance of sugars, fats, and amino acids in the elderly and the like can be investigated.
また、本発明に係る検出方法は、疲労の蓄積度合の評価にも有用である。例えば、ヒトをはじめとする哺乳動物は、安静時は糖を主たるエネルギー供給源としているが、運動時は、脂質及びアミノ酸への依存度が増す。運動後安静にすることによって、糖を主たるエネルギー供給源とする運動前のエネルギー供給源バランスに復帰し、疲労が回復する。エネルギー供給源バランスが安静時の状態にまで復帰する前に運動負荷をかけることにより、エネルギー供給源バランスがアミノ酸及び脂肪への依存度が高い状態から運動前の安静時状態にまで復帰できない。本発明に係る検出方法により３−ＨＩＢと３−ＨＭＢと２−ＨＢと３−ＨＢと乳酸を同時に検出することによって、アミノ酸、脂肪、及び糖のエネルギー代謝の程度を評価してエネルギー供給源バランスを調べることができ、疲労の蓄積度合を調べることができる。 The detection method according to the present invention is also useful for evaluating the degree of fatigue accumulation. For example, humans and other mammals use sugar as their main energy source at rest, but become more dependent on lipids and amino acids during exercise. Resting after exercise restores the pre-exercise energy source balance, which uses sugar as the main energy source, and recovers from fatigue. By applying an exercise load before the energy supply source balance returns to the resting state, the energy supply source balance cannot return from the state of high dependence on amino acids and fat to the resting state before exercise. By simultaneously detecting 3-HIB, 3-HMB, 2-HB, 3-HB, and lactic acid by the detection method according to the present invention, the degree of energy metabolism of amino acids, fats, and sugars is evaluated to balance the energy supply source. Can be examined, and the degree of accumulation of fatigue can be examined.
次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Next, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and the like, but the present invention is not limited thereto.
＜試薬類＞
以下の実施例や参考例等で用いた試薬は次の通りである。Ｄ−３−ＨＢ、Ｌ−３−ＨＢ、及び３−ＨＩＢナトリウム塩は、シグマアルドリッチケミカル社製のものを用いた。ＤＬ−３−ＨＢ−１３Ｃ４ナトリウム塩は、太陽日酸社製のものを用いた。２−ピリジンメタノール、２−メチル−６−ニトロ安息香酸無水物、１−ピペリジンエタノール、２−（２−ヒドロキシエチル）−１−メチルピロリジン、３−ピリジンメタノール、２−ジエチルアミノエタノール、３−ヒドロキシ−１−メチルピペリジン、及び４−ピリジンメタノールは、東京化成工業社製のものを、４−ジメチルアミノピリジンは和光純薬社製のものを用いた。３−ＨＢデヒドロゲナーゼは、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製のものを用いた。
<Reagents>
The reagents used in the following examples and reference examples are as follows. As the D-3-HB, L-3-HB, and 3-HIB sodium salts, those manufactured by Sigma-Aldrich Chemical Co., Ltd. were used. DL-3-HB- 13 C 4 sodium salt was used made of Taiyo Nippon Sanso Corporation. 2-Pyridinemethanol, 2-methyl-6-nitrobenzoic acid anhydride, 1-piperidinethanol, 2- (2-hydroxyethyl) -1-methylpyrrolidin, 3-pyridinemethanol, 2-diethylaminoethanol, 3-hydroxy- As 1-methylpiperidine and 4-pyridinemethanol, those manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd. were used, and as 4-dimethylaminopyridine, those manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. were used. As the 3-HB dehydrogenase, one manufactured by Roche Diagnostics was used.
＜血清試料の調製＞
以下の参考例において使用した血清試料は、以下のようにして調製した。
健常人から採取した血液から血清を回収し、測定に使用する時点まで−２０℃で保存したものを用いた。血清（１０μＬ）を、１．５ｍＬの遠心分離用プラスチックチューブにいれ、さらに内部標準として７６９ｐｍｏｌ（１００ｎｇ）のＤＬ−３−ＨＢ−１３Ｃ４ナトリウム塩を含むアセトニトリル／水（１／１９、容量比）溶液（１００μＬ）を添加して１分間撹拌した後、２０００×ｇで１分間遠心分離処理した。上清を、水／アセトニトリル（１／１９、容量比）溶液に入れ、脱蛋白処理をした後、液相を回収して８０℃、窒素ガス吹き付け下でエバポレートして乾燥させた。
<Preparation of serum sample>
The serum samples used in the following reference examples were prepared as follows.
Serum was collected from blood collected from a healthy person and stored at −20 ° C. until the time of use for measurement. Serum (10 [mu] L), placed in a 1.5mL centrifuge plastic tube, further acetonitrile / water (1/19 containing DL-3-HB- 13 C 4 sodium salt of 769pmol (100ng) as an internal standard, volume ratio ) Solution (100 μL) was added and stirred for 1 minute, and then centrifuged at 2000 × g for 1 minute. The supernatant was placed in a water / acetonitrile (1/19, volume ratio) solution, deproteinized, and then the liquid phase was recovered and evaporated to dryness at 80 ° C. under a nitrogen gas spray.
＜３−ＨＢ−フリー血清の調製＞
以下の参考例において使用した３−ＨＢ−フリー血清は、以下のようにして調製した。
３−ＨＢ−フリー血清は、正常な血清（１０μＬ）を１．８ｍＭのＮＡＤと０．０７５Ｕの３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを添加した１５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）に添加して、３７℃で３０分間インキュベートすることにより調製した。
<Preparation of 3-HB-free serum>
The 3-HB-free serum used in the following reference examples was prepared as follows.
3-HB-free serum is prepared by adding normal serum (10 μL) to 150 mM Tris-HCl (pH 8.6) supplemented with 1.8 mM NAD and 0.075 U 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase at 37 ° C. Prepared by incubating for 30 minutes in.
＜２−ピリジンメタノールを誘導体化試薬とする有機酸のエステル化反応＞
以下の参考例において、２−ピリジンメタノールを誘導体化試薬とする有機酸のエステル化反応は、以下のようにして調製した。
２−ピリジンメタノールを誘導体化試薬とする有機酸のエステル化反応は、シイナらによるカルボキシエステルの合成方法（非特許文献１３参照。）を改良して行った。具体的には、２−メチル−６−ニトロ安息香酸無水物（６７ｍｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（２０ｍｇ）、ピリジン（９００μＬ）、及び２−ピリジンメタノール（１００μＬ）からなる２ＰＭ誘導体化用混合試薬を用いた。まず、直前に調製した前記２ＰＭ誘導体化用混合試薬（５０μＬ）を、有機酸を含む乾燥させたサンプルに加えた反応溶液を、室温で３０分間静置した。次いで、当該反応液にｎ−ヘキサン（１ｍＬ）を加えて３０秒間撹拌した後、７００×ｇで１分間遠心分離処理し、回収した上清を、８０℃、窒素ガス吹き付け下でエバポレートした。残留物を１容量％のギ酸水溶液（１５０μＬ）に再溶解させ、再度７０００×ｇで１分間遠心分離処理し、回収した上清を、測定試料としてＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供した。
<Esterification reaction of organic acids using 2-pyridinemethanol as a derivatization reagent>
In the following reference example, the esterification reaction of an organic acid using 2-pyridinemethanol as a derivatization reagent was prepared as follows.
The esterification reaction of an organic acid using 2-pyridinemethanol as a derivatization reagent was carried out by improving the method for synthesizing a carboxy ester by Siina et al. (See Non-Patent Document 13). Specifically, a mixed reagent for 2PM derivatization consisting of 2-methyl-6-nitrobenzoic anhydride (67 mg), 4-dimethylaminopyridine (20 mg), pyridine (900 μL), and 2-pyridinemethanol (100 μL). Was used. First, the reaction solution prepared by adding the 2PM derivatization mixed reagent (50 μL) prepared immediately before to a dried sample containing an organic acid was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Then, n-hexane (1 mL) was added to the reaction solution, and the mixture was stirred for 30 seconds, centrifuged at 700 × g for 1 minute, and the recovered supernatant was evaporated at 80 ° C. under a nitrogen gas spray. The residue was redissolved in a 1 volume% aqueous solution of formic acid (150 μL), centrifuged again at 7000 × g for 1 minute, and the recovered supernatant was subjected to ESI-LC-MS / MS as a measurement sample.
＜ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ＞
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムは、ＨＥＳＩ−IIプローブとＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ Ｕｌｔｒａ Ｆａｓｔ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＵＦＬＣ）システム（島津製作所製）を備えたトリプル四重極型質量分析計ＴＳＱ Ｖａｎｔａｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。クロマトグラフィーにおける分離は、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＧＯＬＤ ａＱカラム（２．１×１５０ｍｍ、３μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて４０℃で行った。はじめに、移動相を０．２容量％のギ酸を含むアセトニトリル／水（１／１９、容量比）として流速３００μＬ／分で５分間流した。５分後に、移動相を０．２容量％のギ酸を含むアセトニトリルに変更し、流速３００μＬ／分で７分間流した。一般的なＭＳ／ＭＳ条件は、以下の通りである；
スプレー電圧：３０００Ｖ、
噴霧器温度：４５０℃、
シースガス（窒素）圧：５０ｐｓｉ、
補助ガス（窒素）流量：１５任意単位、
イオントランスファーキャピラリー温度：２２０℃、
衝突ガス（アルゴン）圧：１．０ｍＴｏｒｒ、
衝突エネルギー：１５Ｖ、
イオン極性：正モード。
<LC-P-ESI-MS / MS>
The LC-MS / MS system is a triple quadrupole mass spectrometer TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) equipped with a HESI-II probe and a Prominence Ultra Fast Liquid Chromatography (UFLC) system (manufactured by Shimadzu Corporation). .. Separation in chromatography was performed at 40 ° C. using a Hypersil GOLD aQ column (2.1 × 150 mm, 3 μm, manufactured by Thermo Fisher Scientific). First, the mobile phase was flowed as acetonitrile / water (1/19, volume ratio) containing 0.2% by volume of formic acid at a flow rate of 300 μL / min for 5 minutes. After 5 minutes, the mobile phase was changed to acetonitrile containing 0.2% by volume of formic acid and allowed to flow at a flow rate of 300 μL / min for 7 minutes. General MS / MS conditions are as follows;
Spray voltage: 3000V,
Atomizer temperature: 450 ° C,
Sheath gas (nitrogen) pressure: 50 psi,
Auxiliary gas (nitrogen) flow rate: 15 arbitrary units,
Ion transfer capillary temperature: 220 ° C,
Collision gas (argon) pressure: 1.0 mTorr,
Collision energy: 15V,
Ion polarity: Positive mode.
図１Ｂに、２−ピリジンメタノールで誘導体化された３−ＨＢ（２ＰＭ−３−ＨＢ）の典型的なＰ−ＥＳＩ ＭＳスペクトラムを示す。２ＰＭ−３−ＨＢは、［Ｍ＋Ｈ］＋イオンがベースピークとしてｍ／ｚ １９６にみられる。このｍ／ｚ １９６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンＭＳスペクトラム（図１Ａ）では、［Ｃ５Ｈ４ＮＣＨ２ＯＨ＋Ｈ］＋のフラグメントイオンが最も突出したピークとしてｍ／ｚ １１０にみられる。ＳＲＭは、２ＰＭ−３−ＨＢの検出にはｍ／ｚ １９６→ｍ／ｚ １１０を用いて行い、［１３Ｃ４］同位体（内部標準）の検出にはｍ／ｚ ２００→ｍ／ｚ １１０を用いて行った。
FIG. 1B shows a typical P-ESIMS spectrum of 3-HB (2PM-3-HB) derivatized with 2-pyridinemethanol. 2PM-3-HB is found at m /
＜キャリブレーションカーブの作成＞
キャリブレーションカーブの作成には、アセトニトリル／水（１／１９、容量比）にＤ−３−ＨＢナトリウム塩を溶解させた標品保存溶液（２００ｎｇ／μＬ）を、さらにアセトニトリル／水（１／１９、容量比）を用いて適宜希釈することにより調製した濃度既知のＤ−３−ＨＢナトリウム標準溶液（１〜２００ｎｇ／１００μＬ）を用いた。各標準溶液には、内部標準として、ＤＬ−３−ＨＢ−１３Ｃ４ナトリウム塩（１００ｎｇ）を添加し、混合物をエバポレートして乾燥させた後に、誘導体化（誘導体によるエステル化）をしたものを、ＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。キャリブレーションカーブのマトリックス効果を調べるために、各標準溶液にブランクマトリックスとして、３−ＨＢ−フリー血清を添加した。
<Creation of calibration curve>
To create the calibration curve, add a standard storage solution (200 ng / μL) in which D-3-HB sodium salt is dissolved in acetonitrile / water (1/19, volume ratio), and then acetonitrile / water (1/19). A standard solution of D-3-HB sodium (1 to 200 ng / 100 μL) having a known concentration was used, which was prepared by appropriately diluting with (volume ratio). Each standard solution as an internal standard, were added DL-3-HB- 13 C 4 sodium salt (100 ng), after the mixture was evaporated to dryness and the obtained by the derivatization (esterification with derivatives) , ESI-LC-MS / MS. To examine the matrix effect of the calibration curve, 3-HB-free serum was added to each standard solution as a blank matrix.
＜ＬＣ−Ｎ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ＞
３−ＨＢのＬＣ−Ｎ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳは、誘導体化を行わずに、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳで用いたＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムと同じものを用いて実施した。クロマトグラフィーにおける分離は、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＧＯＬＤ ａＱカラム（２．１×１５０ｍｍ、３μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて４０℃で行った。移動相は、０．１容量％のギ酸を含むメタノール／水（１／９、容量比）を流速２００μＬ／分で流した。一般的なＭＳ／ＭＳ条件は、以下の通りである；
スプレー電圧：２５００Ｖ、
噴霧器温度：４５０℃、
シースガス（窒素）圧：５０ｐｓｉ、
補助ガス（窒素）流量：１５任意単位、
イオントランスファーキャピラリー温度：２２０℃、
衝突ガス（アルゴン）圧：１．０ｍＴｏｒｒ、
衝突エネルギー：１５Ｖ、
イオン極性：負モード、
３−ＨＢのＳＲＭ（選択反応モニタリング）：ｍ／ｚ １０３ → ｍ／ｚ ５９、
［１３Ｃ４］のＳＲＭ：ｍ／ｚ １０７ → ｍ／ｚ ６１。
<LC-N-ESI-MS / MS>
LC-N-ESI-MS / MS of 3-HB was carried out using the same LC-MS / MS system used in LC-P-ESI-MS / MS without derivatization. Separation in chromatography was performed at 40 ° C. using a Hypersil GOLD aQ column (2.1 × 150 mm, 3 μm, manufactured by Thermo Fisher Scientific). For the mobile phase, methanol / water (1/9, volume ratio) containing 0.1% by volume of formic acid was flowed at a flow rate of 200 μL / min. General MS / MS conditions are as follows;
Spray voltage: 2500V,
Atomizer temperature: 450 ° C,
Sheath gas (nitrogen) pressure: 50 psi,
Auxiliary gas (nitrogen) flow rate: 15 arbitrary units,
Ion transfer capillary temperature: 220 ° C,
Collision gas (argon) pressure: 1.0 mTorr,
Collision energy: 15V,
Ion polarity: Negative mode,
3-HB SRM (selective reaction monitoring): m / z 103 → m /
[ 13 C 4 ] SRM: m /
＜統計処理＞
以下の実施例及び参考例等における数値は、平均±ＳＤ（標準偏差）である。キャリブレーションカーブの直線性は単回帰分析により分析した。再現性は、一元配置分散分析法（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）（ＪＭＰソフトウェア、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）により分析した。推定値±９５％信頼限界を、精度指標として得た（非特許文献１４参照。）。値を算出するために、ＪＭＰソフトウェアを用いた再現性試験においては、直交回帰分析を行った。異なるグループ間の差の統計的有意性は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ ｔ−ｔｅｓｔにより評価した。全ての分析では、Ｐ＜０．０５で有意差ありとした。
<Statistical processing>
The numerical values in the following examples and reference examples are mean ± SD (standard deviation). The linearity of the calibration curve was analyzed by simple regression analysis. Reproducibility was analyzed by one-way analysis of variance (one-way ANOVA) (JMP software, manufactured by SAS Institute). An estimated ± 95% confidence limit was obtained as an accuracy index (see Non-Patent Document 14). In order to calculate the value, orthogonal regression analysis was performed in the reproducibility test using JMP software. The statistical significance of the differences between the different groups was assessed by Student's two-tailed t-test. In all analyzes, P <0.05 was considered significant.
［参考例１］
２−ピリジンメタノールで誘導体化された３−ＨＢ及び３−ＨＩＢを、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより検出した。具体的には、アセトニトリル／水（１／１９、容量比）（１００μＬ）にＤ−３−ＨＢナトリウム塩（標品、１μｇ）のみを溶解させた試料溶液、Ｄ−３−ＨＩＢナトリウム塩（標品、１μｇ）のみを溶解させた試料溶液、及びＤ−３−ＨＢナトリウム塩（標品、１μｇ）とＤ−３−ＨＩＢナトリウム塩（標品、１μｇ）を溶解させた試料溶液を調製し、それぞれをエバポレートして乾燥させた後に、前記２ＰＭ誘導体化用混合試薬により誘導体化（誘導体によるエステル化）をした。最終的に１容量％のギ酸水溶液（１ｍＬ）に再溶解させ、１μＬ（Ｄ−３−ＨＢナトリウム塩、Ｄ−３−ＨＩＢナトリウム塩それぞれ１ｎｇ相当）を、前述の通りにＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。
[Reference example 1]
3-HB and 3-HIB derivatized with 2-pyridinemethanol were detected by LC-P-ESI-MS / MS. Specifically, a sample solution prepared by dissolving only D-3-HB sodium salt (standard, 1 μg) in acetonitrile / water (1/19, volume ratio) (100 μL), D-3-HIB sodium salt (standard). A sample solution in which only the product (1 μg) was dissolved, and a sample solution in which D-3-HB sodium salt (standard product, 1 μg) and D-3-HIB sodium salt (standard product, 1 μg) were dissolved were prepared. After each was evaporated and dried, it was derivatized (esterified with a derivative) with the above-mentioned mixed reagent for 2PM derivatization. Finally, it is redissolved in 1% by volume of formic acid aqueous solution (1 mL), and 1 μL (equivalent to 1 ng each of D-3-HB sodium salt and D-3-HIB sodium salt) is added to LC-P-ESI- as described above. Measured by MS / MS.
２−ピリジンメタノールで誘導体化された３−ＨＢ及び３−ＨＩＢを、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより検出した結果を図２に示す。図２Ａに誘導体化された３−ＨＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図２Ｂに前記図２ＡのＭＳスペクトラムを、図２Ｃに誘導体化された３−ＨＩＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図２Ｄに前記図２ＣのＭＳスペクトラムを、図２Ｅに誘導体化された３−ＨＢと３−ＨＩＢを含む試料のｍ／ｚ １９６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、図２Ｆに前記図２Ｅの３−ＨＩＢピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを、それぞれ示す。
The results of detecting 3-HB and 3-HIB derivatized with 2-pyridinemethanol by LC-P-ESI-MS / MS are shown in FIG. FIG. 2A shows the total ion chromatogram (upper) and MS chromatogram (lower) of the sample containing only the derivatized 3-HB, FIG. 2B shows the MS spectrum of FIG. 2A, and FIG. 2C shows the derivatized 3 The total ion chromatogram (upper) and MS chromatogram (lower) of the sample containing only −HIB, the MS spectrum of FIG. 2C in FIG. 2D, and 3-HB and 3-HIB derivatized in FIG. 2E are included. The product ion chromatogram when m /
この結果、測定に供した試料には１ｎｇしか含まれていなかったにもかかわらず、低感度高情報量のスキャンモードで、３−ＨＢと３−ＨＩＢの誘導体はいずれもスペクトル解析することができた。また、ＬＣクロマトグラムにおいて、３−ＨＢの誘導体と３−ＨＩＢの誘導体の分離が良好であった。また、ＬＣの保持時間が遅いため、カラムから最初に出てくる誘導体化試薬等（例えば、４−ジメチルアミノピリジンなど）の３−ＨＢの誘導体や３−ＨＩＢの誘導体のピークに対する影響は非常に小さかった。つまり、これらの結果から、２−ピリジンメタノールで誘導体化することにより、３−ＨＢや３−ＨＩＢ等の有機酸を、精度よく高感度に検出できることがわかった。 As a result, although the sample used for the measurement contained only 1 ng, both the 3-HB and 3-HIB derivatives could be spectrally analyzed in the low-sensitivity and high-information scan mode. It was. Moreover, in the LC chromatogram, the separation of the 3-HB derivative and the 3-HIB derivative was good. In addition, since the LC retention time is slow, the effect on the peak of the 3-HB derivative or 3-HIB derivative of the derivatization reagent or the like (for example, 4-dimethylaminopyridine) that first comes out from the column is very large. It was small. That is, from these results, it was found that organic acids such as 3-HB and 3-HIB can be detected with high accuracy and high sensitivity by derivatization with 2-pyridinemethanol.
［参考例２］
１−ピペリジンエタノールで誘導体化された３−ＨＢ及び３−ＨＩＢを、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより検出した。具体的には、誘導体化試薬として、２ＰＭ誘導体化用混合試薬に代えて、２−メチル−６−ニトロ安息香酸無水物（６７ｍｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（２０ｍｇ）、ピリジン（９００μＬ）、及び１−ピペリジンエタノール（１００μＬ）からなる１ＰＥ誘導体化用混合試薬を用いた以外は、参考例１と同様にして誘導体化し、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。
[Reference example 2]
3-HB and 3-HIB derivatized with 1-piperidine ethanol were detected by LC-P-ESI-MS / MS. Specifically, as the derivatization reagent, instead of the mixed reagent for 2PM derivatization, 2-methyl-6-nitrobenzoic acid anhydride (67 mg), 4-dimethylaminopyridine (20 mg), pyridine (900 μL), and Derivatization was carried out in the same manner as in Reference Example 1 except that a 1PE derivatization mixed reagent consisting of 1-piperidin ethanol (100 μL) was used, and the measurement was performed by LC-P-ESI-MS / MS.
図３に、１−ピペリジンエタノールで誘導体化された３−ＨＢ及び３−ＨＩＢを、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより検出した結果を示す。図３Ａに誘導体化された３−ＨＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図３Ｂに前記図３ＡのＭＳスペクトラムを、図３Ｃに誘導体化された３−ＨＩＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図３Ｄに前記図３ＣのＭＳスペクトラムを、図３Ｅに誘導体化された３−ＨＢと３−ＨＩＢを含む試料のｍ／ｚ ２１６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、図３Ｆに前記図３Ｅの３−ＨＩＢピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを、それぞれ示す。
FIG. 3 shows the results of detecting 3-HB and 3-HIB derivatized with 1-piperidine ethanol by LC-P-ESI-MS / MS. 3A shows the total ion chromatogram (upper) and MS chromatogram (lower) of the sample containing only the derivatized 3-HB, FIG. 3B shows the MS spectrum of FIG. 3A, and FIG. 3C shows the derivatized 3 The total ion chromatogram (upper) and MS chromatogram (lower) of the sample containing only −HIB, the MS spectrum of FIG. 3C in FIG. 3D, and 3-HB and 3-HIB derivatized in FIG. 3E are included. The product ion chromatogram when m /
この結果、測定に供した試料には１ｎｇしか含まれていなかったにもかかわらず、低感度高情報量のスキャンモードで、３−ＨＢと３−ＨＩＢの誘導体はいずれもスペクトル解析することができた。また、ＬＣクロマトグラムにおいて、３−ＨＢの誘導体と３−ＨＩＢの誘導体の分離が良好であった。また、３−ＨＢの誘導体と３−ＨＩＢの誘導体のいずれのピークも、プロダクトイオンクロマトグラムにおけるＳ／Ｎが良好であり、感度が特に良好であった。つまり、これらの結果から、１−ピリジンエタノールで誘導体化することにより、３−ＨＢや３−ＨＩＢ等の有機酸を、精度よく高感度に検出できることがわかった。 As a result, although the sample used for the measurement contained only 1 ng, both the 3-HB and 3-HIB derivatives could be spectrally analyzed in the low-sensitivity and high-information scan mode. It was. Moreover, in the LC chromatogram, the separation of the 3-HB derivative and the 3-HIB derivative was good. In addition, the peaks of both the 3-HB derivative and the 3-HIB derivative had good S / N in the product ion chromatogram, and the sensitivity was particularly good. That is, from these results, it was found that organic acids such as 3-HB and 3-HIB can be detected with high accuracy and high sensitivity by derivatization with 1-pyridineethanol.
［参考例３］
２−（２−ヒドロキシエチル）−１−メチルピロリジンで誘導体化された３−ＨＢ及び３−ＨＩＢを、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより検出した。具体的には、誘導体化試薬として、２ＰＭ誘導体化用混合試薬に代えて、２−メチル−６−ニトロ安息香酸無水物（６７ｍｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（２０ｍｇ）、ピリジン（９００μＬ）、及び２−（２−ヒドロキシエチル）−１−メチルピロリジン（１００μＬ）からなる１ＰＥ誘導体化用混合試薬を用いた以外は、参考例１と同様にして誘導体化し、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。
[Reference example 3]
3-HB and 3-HIB derivatized with 2- (2-hydroxyethyl) -1-methylpyrrolidine were detected by LC-P-ESI-MS / MS. Specifically, as the derivatization reagent, instead of the mixed reagent for 2PM derivatization, 2-methyl-6-nitrobenzoic acid anhydride (67 mg), 4-dimethylaminopyridine (20 mg), pyridine (900 μL), and Derivatized in the same manner as in Reference Example 1 except that a mixed reagent for 1PE derivatization consisting of 2- (2-hydroxyethyl) -1-methylpyrrolidin (100 μL) was used, and by LC-P-ESI-MS / MS. It was measured.
２−（２−ヒドロキシエチル）−１−メチルピロリジンで誘導体化された３−ＨＢ及び３−ＨＩＢを、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより検出した結果を図４に示す。図４Ａに誘導体化された３−ＨＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図４Ｂに前記図４ＡのＭＳスペクトラムを、図４Ｃに誘導体化された３−ＨＩＢのみを含む試料の総イオンクロマトグラム（上段）とＭＳクロマトグラム（下段）を、図４Ｄに前記図４ＣのＭＳスペクトラムを、図４Ｅに誘導体化された３−ＨＢと３−ＨＩＢを含む試料のｍ／ｚ ２１６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、図４Ｆに前記図４Ｅの３−ＨＩＢピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを、それぞれ示す。
The results of detecting 3-HB and 3-HIB derivatized with 2- (2-hydroxyethyl) -1-methylpyrrolidine by LC-P-ESI-MS / MS are shown in FIG. FIG. 4A shows the total ion chromatogram (upper) and MS chromatogram (lower) of the sample containing only the derivatized 3-HB, FIG. 4B shows the MS spectrum of FIG. 4A, and FIG. 4C shows the derivatized 3 The total ion chromatogram (upper) and MS chromatogram (lower) of the sample containing only −HIB, the MS spectrum of FIG. 4C in FIG. 4D, and 3-HB and 3-HIB derivatized in FIG. 4E are included. The product ion chromatogram when m /
この結果、測定に供した試料には１ｎｇしか含まれていなかったにもかかわらず、低感度高情報量のスキャンモードで、３−ＨＢと３−ＨＩＢの誘導体はいずれもスペクトル解析することができた。また、ＬＣクロマトグラムにおいて、３−ＨＢの誘導体と３−ＨＩＢの誘導体の分離が良好であった。また、３−ＨＢの誘導体と３−ＨＩＢの誘導体のいずれのピークも、プロダクトイオンクロマトグラムにおけるＳ／Ｎが良好であり、感度が特に良好であった。つまり、これらの結果から、２−（２−ヒドロキシエチル）−１−メチルピロリジンで誘導体化することにより、３−ＨＢや３−ＨＩＢ等の有機酸を、精度よく高感度に検出できることがわかった。 As a result, although the sample used for the measurement contained only 1 ng, both the 3-HB and 3-HIB derivatives could be spectrally analyzed in the low-sensitivity and high-information scan mode. It was. Moreover, in the LC chromatogram, the separation of the 3-HB derivative and the 3-HIB derivative was good. In addition, the peaks of both the 3-HB derivative and the 3-HIB derivative had good S / N in the product ion chromatogram, and the sensitivity was particularly good. That is, from these results, it was found that by derivatizing with 2- (2-hydroxyethyl) -1-methylpyrrolidine, organic acids such as 3-HB and 3-HIB can be detected with high accuracy and high sensitivity. ..
［参考例４］
健常者から採取された１０μＬの血清に内部標準としてＤＬ−３−ＨＢ−１３Ｃ４ナトリウム塩を添加した試料を、参考例１と同様にして２−ピリジンメタノールで誘導体化し、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。図５に、２−ピリジンメタノールで誘導体化された３−ＨＢ（２ＰＭ−３−ＨＢ）と［１３Ｃ４］同位体の典型的なＳＲＭクロマトグラムを示した。当該クロマトグラムより、２ＰＭ−３−ＨＢの［１３Ｃ４］同位体に対するピークエリア面積比を算出し、当該比率をキャリブレーションカーブに当てはめて血清中の３−ＨＢ濃度を決定した。当該クロマトグラム中の２ＰＭ−３−ＨＢのピークは５．１ｐｍｏｌ（７６μＭ）に相当した。クロマトグラムＡの４．５３分に見られたピークは、２ＰＭ−３ＨＩＢ標品との比較から、３−ＨＩＢの２ＰＭエステル誘導体であると同定された。
[Reference example 4]
The sample added DL-3-HB- 13 C 4 sodium salt as an internal standard serum harvested 10μL from healthy subjects, in the same manner as in Reference Example 1 was derivatized with 2-pyridinemethanol, LC-P-ESI -Measured by MS / MS. FIG. 5 shows typical SRM chromatograms of 3-HB (2PM-3-HB) and [ 13 C 4 ] isotopes derivatized with 2-pyridinemethanol. From the chromatogram, the peak area area ratio of 2PM-3-HB to the [ 13 C 4 ] isotope was calculated, and the ratio was applied to the calibration curve to determine the 3-HB concentration in serum. The peak of 2PM-3-HB in the chromatogram corresponded to 5.1 pmol (76 μM). The peak seen at 4.53 minutes of chromatogram A was identified as a 2PM ester derivative of 3-HIB by comparison with the 2PM-3HIB standard.
［参考例５］
２−ピリジンメタノールで誘導体化された３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、及び２−ＨＢを、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより検出した。具体的には、アセトニトリル／水（１／１９、容量比）（１００μＬ）に、Ｄ−３−ＨＢナトリウム塩（標品、３０ｎｇ）とＤ−３−ＨＩＢナトリウム塩（標品、３０ｎｇ）とＤ−３−ＨＭＢナトリウム塩（標品、３０ｎｇ）とＤ−２−ＨＢナトリウム塩（標品、３０ｎｇ）とＤＬ−３−ＨＢ−１３Ｃ４ナトリウム塩（標品、８０ｎｇ）を溶解させた試料溶液を調製し、エバポレートして乾燥させた後に、前記２ＰＭ誘導体化用混合試薬により誘導体化（誘導体によるエステル化）をした。最終的に１容量％のギ酸水溶液（１ｍＬ）に再溶解させ、１μＬ（Ｄ−３−ＨＢナトリウム塩、Ｄ−３−ＨＩＢナトリウム塩、Ｄ−３−ＨＭＢナトリウム塩、Ｄ−２−ＨＢナトリウム塩がそれぞれ３ｎｇ相当、ＤＬ−３−ＨＢ−１３Ｃ４ナトリウム塩が８ｎｇ相当）を、前述の通りにＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。
[Reference example 5]
3-HB, 3-HIB, 3-HMB, and 2-HB derivatized with 2-pyridinemethanol were detected by LC-P-ESI-MS / MS. Specifically, D-3-HB sodium salt (standard, 30 ng), D-3-HIB sodium salt (standard, 30 ng) and D in acetonitrile / water (1/19, volume ratio) (100 μL). -3-HMB sodium salt (preparation, 30 ng) and D-2-HB sodium salt (preparation, 30 ng) and DL-3-HB- 13 C 4 sodium salt (preparation, 80 ng) sample solution obtained by dissolving Was prepared, evaporated and dried, and then derivatized (esterified with a derivative) with the above-mentioned mixed reagent for 2PM derivatization. Finally, it is redissolved in 1% by volume of formic acid aqueous solution (1 mL), and 1 μL (D-3-HB sodium salt, D-3-HIB sodium salt, D-3-HMB sodium salt, D-2-HB sodium salt) is dissolved. There corresponds
２−ピリジンメタノールで誘導体化された３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、及び２−ＨＢを、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより検出した結果を図６に示す。図６の上段に試料の総イオンクロマトグラムを、上から２段目にｍ／ｚ １９６を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、上から３段目にｍ／ｚ ２００を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、最下段にｍ／ｚ ２１０を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、それぞれ示す。
The results of detecting 3-HB, 3-HIB, 3-HMB, and 2-HB derivatized with 2-pyridinemethanol by LC-P-ESI-MS / MS are shown in FIG. The total ion chromatogram of the sample is in the upper part of FIG. 6, the product ion chromatogram when m /
この結果、測定に供した試料には３ｎｇしか含まれていなかったにもかかわらず、低感度高情報量のスキャンモードで、３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、及び２−ＨＢの２ＰＭエステル誘導体は、いずれもスペクトル解析することができた。また、ＬＣクロマトグラムにおいて、３−ＨＢの誘導体と３−ＨＩＢの誘導体と３−ＨＭＢの誘導体と２−ＨＢの誘導体の分離が良好であった。つまり、これらの結果から、２−ピリジンメタノールで誘導体化することにより、構造類似の３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、及び２−ＨＢを、精度よく高感度に同時検出できることがわかった。 As a result, although the sample used for the measurement contained only 3 ng, 2 PM of 3-HB, 3-HIB, 3-HMB, and 2-HB in the scan mode with low sensitivity and high information amount. All of the ester derivatives could be spectrally analyzed. Moreover, in the LC chromatogram, the separation of the 3-HB derivative, the 3-HIB derivative, the 3-HMB derivative and the 2-HB derivative was good. That is, from these results, it was found that by derivatizing with 2-pyridinemethanol, structurally similar 3-HB, 3-HIB, 3-HMB, and 2-HB can be simultaneously detected with high accuracy and high sensitivity. ..
［参考例６］
被検者から採取された血清と唾液を一定時間室温放置した場合における、血清中と唾液中の３−ＨＩＢ及び３−ＨＢの安定性を検討した。
[Reference example 6]
The stability of 3-HIB and 3-HB in serum and saliva was examined when the serum and saliva collected from the subject were left at room temperature for a certain period of time.
＜血清＞
健常者から６本の採血管に血液を採取した。６本の採血管のうちの１本については、採血後速やかに遠心分離処理を行い、回収した血清を−２０℃で凍結保存した。残りの５本については、それぞれ、室温で１、２、４、６、又は２４時間放置した後、遠心分離処理を行い、回収した血清を−２０℃で保存した。
−２０℃で保存後の各血清中の３−ＨＩＢ及び３−ＨＢの濃度を、内部標準としてＤＬ−３−ＨＢ−１３Ｃ４ナトリウム塩を用い、誘導体化試薬として２−ピリジンメタノールを用いて、参考例４と同様にしてＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。クロマトグラムより、２ＰＭ−３−ＨＢの［１３Ｃ４］同位体に対するピークエリア面積比を算出し、当該比率をキャリブレーションカーブに当てはめて、血清中の３−ＨＢ濃度及び３−ＨＩＢ濃度を決定した。測定結果を図７に示す。この結果、血清中の３−ＨＢ濃度及び３−ＨＩＢ濃度は、採血後室温で放置される時間が６時間に至るまで減少するが、その後２４時間まで変化はなかった。
<Serum>
Blood was collected from healthy subjects in 6 blood collection tubes. One of the six blood collection tubes was centrifuged immediately after blood collection, and the collected serum was cryopreserved at −20 ° C. The remaining 5 sera were left at room temperature for 1, 2, 4, 6 or 24 hours, respectively, and then centrifuged, and the collected sera were stored at −20 ° C.
The concentration of 3-HIB and 3-HB in each serum after storage at -20 ° C., using a DL-3-HB- 13 C 4 sodium salt as an internal standard, using 2-pyridinemethanol as a derivatizing reagent , Measured by LC-P-ESI-MS / MS in the same manner as in Reference Example 4. From the chromatogram, calculate the peak area area ratio of 2PM-3-HB to the [ 13 C 4 ] isotope, apply the ratio to the calibration curve, and determine the 3-HB concentration and 3-HIB concentration in serum. did. The measurement results are shown in FIG. As a result, the 3-HB concentration and 3-HIB concentration in the serum decreased until 6 hours after the blood was collected and left at room temperature, but did not change until 24 hours thereafter.
＜唾液＞
健常者から１本のチューブに採取（流涎）した唾液を６本のチューブに分注した。６本のチューブのうちの１本については、採取後速やかに−２０℃で凍結保存した。残りの５本については、それぞれ、室温で１、２、４、６、又は２４時間放置した後、−２０℃で保存した。凍結保存した唾液試料は、分析時に室温で自然解凍した。ボルテックスミキサーを用いて混和した後、遠心分離処理（３０００ｒｐｍ、１５分間）し、粘性蛋白質（ムチン）を分解し、唾液中に含まれている食べかす等と共に沈殿させ、上清を分析に用いた。
−２０℃で保存後の各唾液中の３−ＨＩＢ及び３−ＨＢの濃度を、内部標準としてＤＬ−３−ＨＢ−１３Ｃ４ナトリウム塩を用い、誘導体化試薬として２−ピリジンメタノールを用いて、参考例４と同様にしてＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。クロマトグラムより、２ＰＭ−３−ＨＢの［１３Ｃ４］同位体に対するピークエリア面積比を算出し、当該比率をキャリブレーションカーブに当てはめて、唾液中の３−ＨＢ濃度及び３−ＨＩＢ濃度を決定した。測定結果を図８に示す。この結果、唾液中の３−ＨＢ濃度及び３−ＨＩＢ濃度は、採取後室温で放置される時間にかかわらず、ほぼ安定していた。
<Saliva>
Saliva collected (saliva) from a healthy subject into one tube was dispensed into six tubes. One of the six tubes was cryopreserved at −20 ° C. immediately after collection. The remaining 5 bottles were left at room temperature for 1, 2, 4, 6 or 24 hours, respectively, and then stored at −20 ° C. The cryopreserved saliva sample was naturally thawed at room temperature at the time of analysis. After mixing using a vortex mixer, the mixture was centrifuged (3000 rpm, 15 minutes) to decompose the viscous protein (mucin), precipitated together with food debris contained in saliva, and the supernatant was used for analysis.
The concentration of 3-HIB and 3-HB in the saliva after storage at -20 ° C., using a DL-3-HB- 13 C 4 sodium salt as an internal standard, using 2-pyridinemethanol as a derivatizing reagent , Measured by LC-P-ESI-MS / MS in the same manner as in Reference Example 4. From the chromatogram, calculate the peak area area ratio of 2PM-3-HB to the [ 13 C 4 ] isotope, apply the ratio to the calibration curve, and determine the 3-HB concentration and 3-HIB concentration in saliva. did. The measurement results are shown in FIG. As a result, the 3-HB concentration and 3-HIB concentration in saliva were almost stable regardless of the time left at room temperature after collection.
［参考例７］
被検者から採取された血清と唾液（流涎）中における、３−ＨＩＢ、３−ＨＢ、及び２−ＨＢの濃度の相関性を調べた。具体的には、健常人３名（被検者α、β、γ）から、各５サンプルずつ、血清及び唾液を採取し、これらの３−ＨＩＢ、３−ＨＢ、及び２−ＨＢの濃度を測定し、血清中濃度と唾液中濃度の相関性を調べた。血清中及び唾液中の３−ＨＩＢ、３−ＨＢ、及び２−ＨＢの濃度は、参考例６と同様にして測定した。３−ＨＢ濃度の測定結果を図９Ａに、３−ＨＩＢ濃度の測定結果を図９Ｂに、２−ＨＢ濃度の測定結果を図９Ｃに、それぞれ示す。この結果、３−ＨＩＢ、３−ＨＢ、及び２−ＨＢのいずれにおいても、唾液中濃度は、血清中濃度と相関することが確認された。
[Reference Example 7]
The correlation between the serum collected from the subject and the concentrations of 3-HIB, 3-HB, and 2-HB in saliva (saliva) was examined. Specifically, serum and saliva were collected from 3 healthy subjects (subjects α, β, γ), 5 samples each, and the concentrations of 3-HIB, 3-HB, and 2-HB were measured. It was measured and the correlation between serum concentration and saliva concentration was investigated. The concentrations of 3-HIB, 3-HB, and 2-HB in serum and saliva were measured in the same manner as in Reference Example 6. The measurement result of 3-HB concentration is shown in FIG. 9A, the measurement result of 3-HIB concentration is shown in FIG. 9B, and the measurement result of 2-HB concentration is shown in FIG. 9C. As a result, it was confirmed that the saliva concentration correlates with the serum concentration in all of 3-HIB, 3-HB, and 2-HB.
［参考例８］
走運動前後の血清中、唾液中、及び尿中の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＢ濃度を測定し、経時的変化を観察した。
具体的には、被験者（男性健常者）に、前日の午前１１時から走運動当日の午前１１時までの２４時間蓄尿した後、６０分間ジョギング（走行距離：約９ｋｍ、速度：約６．７分／ｋｍ）し、その後２４時間経過時点（走運動日の翌日の昼１２時）までを実験期間とした。被験者は、前日の午前１１時から実験期間終了時点までの間、前日の昼食及び夕食、走運動当日の昼食及び夕食、翌日の朝食を摂取した。被験者の運動と食事状況、及び血液、唾液、尿の採取時点を図１０に示す。なお、実施した６０分間ジョギングは、当該被験者にとって日常的に行っている運動よりもやや負荷の高い運動であった。
[Reference Example 8]
The 3-HIB and 3-HB concentrations in serum, saliva, and urine before and after running exercise were measured, and changes over time were observed.
Specifically, a subject (healthy male subject) was jogging for 60 minutes (mileage: about 9 km, speed: about 6.7) after collecting urine for 24 hours from 11:00 am on the previous day to 11:00 am on the day of running exercise. Minutes / km), and then 24 hours (12:00 noon on the day after the running exercise day) was used as the experimental period. The subjects ingested lunch and supper on the previous day, lunch and supper on the day of running exercise, and breakfast on the next day from 11:00 am on the previous day to the end of the experimental period. FIG. 10 shows the subject's exercise and dietary status, and the time points for collecting blood, saliva, and urine. The 60-minute jogging performed was a slightly higher load exercise than the exercise routinely performed for the subject.
血清中、唾液中、及び尿中の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＢ濃度は、参考例４と同様にして測定した。採取された各サンプル中の３−ＨＩＢ及び３−ＨＢの測定結果を図１１〜１３に示す。図１１は、血清中の３−ＨＩＢ及び３−ＨＢの濃度の経時的変化を示す。図１２は、３−ＨＩＢ及び３−ＨＢの各採取時点における単位時間当たり尿***量（［尿***量］／［前回採取時からの経過時間］）（μｍｏｌ／ｈ）の経時的変化を、それぞれ示す。図１３は、唾液中の３−ＨＩＢ及び３−ＨＢの濃度の経時的変化を示す。図１３の下段の図は、上段の走運動中の測定結果を、縦軸スケールを拡大して示した図である。
この結果、２−ピリジンメタノールで誘導体化してＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを行うことにより、被験者から採取された血清、唾液、尿のいずれにおいても、３−ＨＩＢと３−ＨＢの両方を検出できることが確認された。
The 3-HIB concentration and 3-HB concentration in serum, saliva, and urine were measured in the same manner as in Reference Example 4. The measurement results of 3-HIB and 3-HB in each collected sample are shown in FIGS. 11 to 13. FIG. 11 shows the time course of the concentrations of 3-HIB and 3-HB in serum. FIG. 12 shows the time course of the urine excretion amount ([urine excretion amount] / [elapsed time from the previous collection]) (μmol / h) per unit time at each collection time of 3-HIB and 3-HB. Each is shown. FIG. 13 shows changes over time in the concentrations of 3-HIB and 3-HB in saliva. The lower part of FIG. 13 is an enlarged view of the vertical axis scale showing the measurement result during the running motion of the upper part.
As a result, by derivatizing with 2-pyridinemethanol and performing LC-P-ESI-MS / MS, both 3-HIB and 3-HB were obtained in all of serum, saliva and urine collected from the subjects. It was confirmed that it could be detected.
３−ＨＢは、走運動により、血清中と唾液中のいずれにおいても濃度は上昇したが、血清中３−ＨＢ濃度は、走運動後もそのまま上昇しており、唾液中３−ＨＢ濃度は、走運動直後は低下したものの、その後再び上昇した（図１１及び図１３上段）。これらの結果から、運動によって上昇する血清中の３−ＨＢ濃度と同様に、唾液中の３−ＨＢ濃度も運動により上昇する事が確認された。また、運動後は、血清中と唾液中ともに、３−ＨＢ濃度は、食事を摂取するまで上昇し続けることから、運動後の肝脂肪酸異化（脂肪の燃焼）を、血液と唾液の両試料にてモニターできることも確認できた。 The concentration of 3-HB increased in both serum and saliva due to running exercise, but the serum 3-HB concentration increased as it was after running exercise, and the saliva 3-HB concentration was increased. Although it decreased immediately after the running exercise, it increased again after that (Fig. 11 and FIG. 13, upper row). From these results, it was confirmed that the 3-HB concentration in saliva is increased by exercise as well as the 3-HB concentration in serum which is increased by exercise. In addition, after exercise, the 3-HB concentration in both serum and saliva continues to rise until food is ingested, so post-exercise hepatic fatty acid catabolism (fat burning) is applied to both blood and saliva samples. I was also able to confirm that it can be monitored.
一方で、３−ＨＩＢは、血清中と唾液中のいずれにおいても、走運動により濃度が上昇し、運動終了後ある程度時間が経過すると速やかに濃度は低下し、運動前の平常状態にまで戻ることが確認された（図１１及び図１３上段）。運動中に比べて運動後は、骨格筋ＢＣＡＡ異化反応は持続せず、健常人では、一過性の運動を行ったのみでは、骨格筋蛋白質分解由来ＢＣＡＡ又は遊離ＢＣＡＡの異化は生じないことが確認された。特に唾液中３−ＨＩＢ濃度は、運動終了後３０分経過時点から実験期間終了時点までの間、ほとんど変動せず、食事等の影響を受けにくいことがわかった。これに対して、血清中３−ＨＩＢ濃度は、運動終了後１時間経過時点では平常状態にまで低下したものの、運動終了後４時間経過時点ではやや上昇していた。運動終了後２．２５時間経過時点で食事を摂取しているため、この運動終了後４時間経過時点での血清中３−ＨＩＢ濃度の上昇は、わずかながら食事の影響を受けた可能性が考えられた。
On the other hand, the concentration of 3-HIB in both serum and saliva increases due to running exercise, and after a certain period of time has passed after the end of exercise, the concentration rapidly decreases and returns to the normal state before exercise. Was confirmed (FIG. 11 and 13 upper row). The skeletal muscle BCAA catabolism does not persist after exercise compared to during exercise, and in healthy individuals, only transient exercise does not result in catabolism of skeletal muscle proteolytic BCAAs or free BCAAs. confirmed. In particular, it was found that the 3-HIB concentration in saliva hardly fluctuated from the time when 30 minutes passed after the end of exercise to the time when the end of the experimental period, and was not easily affected by food and the like. On the other hand, the serum 3-HIB concentration decreased to a
これらの結果から、血清中と唾液中の３−ＨＢ濃度及び３−ＨＩＢ濃度は、運動により上昇することから、運動による肝脂肪酸異化（脂肪燃焼）マーカー及び骨格筋ＢＣＡＡ異化マーカーとしてこれらを同時に評価が可能であり、運動時又は運動後の組織別（肝と骨格筋）のエネルギー代謝状態（ひいては、エネルギー供給源のバランス）を評価するマーカーとして有用であること、食事等の影響を受けにくいことから、３−ＨＩＢについては、血清中濃度よりも唾液中濃度のほうがマーカーとして好ましいこと、がわかった。 From these results, since 3-HB concentration and 3-HIB concentration in serum and saliva are increased by exercise, they are simultaneously evaluated as liver fatty acid catabolism (fat burning) marker and skeletal muscle BCAA catabolism marker by exercise. It is possible, useful as a marker for evaluating the energy metabolism state (and thus the balance of energy supply sources) by tissue (liver and skeletal muscle) during or after exercise, and is not easily affected by diet, etc. From this, it was found that for 3-HIB, the concentration in saliva is preferable to the concentration in serum as a marker.
図１２下段に示すように、走運動中の唾液中３−ＨＩＢ濃度は、運動開始から１５分経過時点までは、運動開始時点（平常状態）からあまり変化がないが、その後ゆるやかに上昇する傾向が観察された。走運動中の唾液中３−ＨＢ濃度は、運動開始から３５分経過時点までは運動開始時点（平常状態）からあまり変化がないが、その後は３−ＨＩＢ濃度と比較してより急激に上昇する傾向が観察された。運動時のエネルギー源として、まずは糖が優先的に利用されるが、運動時間や強度が増すにつれ、脂肪やアミノ酸がエネルギー源として利用される。これらの結果から、３−ＨＢ濃度及び３−ＨＩＢ濃度の上昇は、糖の代わりに脂肪やアミノ酸がエネルギー源として利用された事を示しており、両者が上昇した時点は、エネルギー産生の依存度が糖代謝から脂質、アミノ酸代謝へ移行したポイントを示していると考えられる。また、近年、運動早期から、糖や脂質に加え、アミノ酸もエネルギー源として利用されていると示唆されているが、３−ＨＢよりも３−ＨＩＢの方が早期に上昇し始める結果は、アミノ酸代謝も運動早期から活性化されることを示していると考えられる。本参考例では、唾液中の３−ＨＩＢ濃度は、走運動終了後速やかに定常状態にまで低下したが、運動負荷が過大となりすぎた場合、いわゆるオーバーワーク状態には、運動終了後にも定常状態にまで戻りにくくなると推察される。 As shown in the lower part of FIG. 12, the 3-HIB concentration in saliva during running exercise does not change much from the start of exercise (normal state) until 15 minutes after the start of exercise, but tends to increase gradually thereafter. Was observed. The 3-HB concentration in saliva during running exercise does not change much from the start of exercise (normal state) until 35 minutes after the start of exercise, but after that, it rises more rapidly than the 3-HIB concentration. A tendency was observed. Sugar is preferentially used as an energy source during exercise, but fat and amino acids are used as an energy source as exercise time and intensity increase. From these results, the increase in 3-HB concentration and 3-HIB concentration indicates that fat and amino acids were used as energy sources instead of sugar, and when both increased, the dependence on energy production Is considered to indicate the point of transition from glucose metabolism to lipid and amino acid metabolism. In recent years, it has been suggested that amino acids are used as an energy source in addition to sugars and lipids from the early stage of exercise, but the result that 3-HIB starts to rise earlier than 3-HB is that amino acids It is considered that metabolism is also activated from the early stage of exercise. In this reference example, the 3-HIB concentration in saliva dropped to a steady state immediately after the end of running exercise, but when the exercise load became too excessive, the so-called overwork state became a steady state even after the end of exercise. It is presumed that it will be difficult to return to.
図１２に、運動前後の単位時間当たりの尿中３−ＨＢ***量及び３−ＨＩＢ***量を示す。血清や唾液とは異なり、運動によって、尿中３−ＨＢ***量及び３−ＨＩＢ***量の増加はみられず、尿中３−ＨＩＢ***量は、寧ろ低下傾向にあった（運動１時間後）。尿中３−ＨＢ***量は、その後、運動３時間まで増加傾向にあり、その後一旦減少したが、運動１２．５時間まで再度増加傾向にあった。尿中３−ＨIＢ***量は、多少の増減を繰り返しながら、運動９．５時間まで増加した。尿中３−ＨＢと３−ＨＩＢ***量ともに、血清や唾液のそれぞれの濃度変化との関連はみられず、腎臓組織における再吸収が影響した結果と推測された。尿を試料とする場合、随時尿か畜尿か、又はクレアチニン等での補正の必要を考慮すると、３−ＨＢと３−ＨＩＢともに、運動時、運動後の組織別エネルギー代謝状態を評価するマーカーとしては、尿中***量より、血清や唾液での評価が好ましいことがわかった。 FIG. 12 shows the amount of 3-HB excreted in urine and the amount of 3-HIB excreted per unit time before and after exercise. Unlike serum and saliva, exercise did not increase urinary 3-HB excretion and 3-HIB excretion, and urinary 3-HIB excretion tended to decrease (1 hour after exercise). ). The amount of 3-HB excreted in urine then tended to increase until 3 hours of exercise, then decreased once, but then increased again until 12.5 hours of exercise. The amount of 3-HIB excreted in urine increased up to 9.5 hours of exercise with repeated slight increases and decreases. Neither urinary 3-HB nor 3-HIB excretion was associated with changes in serum or saliva concentrations, suggesting that reabsorption in renal tissue had an effect. When urine is used as a sample, considering the need for correction with urine, livestock urine, or creatinine at any time, both 3-HB and 3-HIB are markers for evaluating the energy metabolism status of each tissue during and after exercise. It was found that evaluation by serum or saliva is preferable to the amount of excretion in urine.
［参考例９］
健常者１５名と肝硬変患者２０名から血液及び唾液を採取し、血清中と唾液中の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＭＢ濃度を測定し、比較した。血清中と唾液中の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＭＢ濃度は、参考例６と同様にして測定した。
血清中の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＭＢ濃度の測定結果を図１４Ａに、唾液中の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＭＢ濃度の測定結果を図１４Ｂに、それぞれ示す。この結果、唾液中と血清中のいずれにおいても、肝硬変患者群の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＭＢ濃度は、健常者群よりも高い傾向が観察され、これらが肝硬変マーカーとして有用であることが示された。特に唾液中の３−ＨＩＢ濃度及び３−ＨＭＢ濃度は、肝硬変患者群のほうが健常者群よりも有意に高かった。
[Reference example 9]
Blood and saliva were collected from 15 healthy subjects and 20 patients with liver cirrhosis, and 3-HIB and 3-HMB concentrations in serum and saliva were measured and compared. The 3-HIB concentration and 3-HMB concentration in serum and saliva were measured in the same manner as in Reference Example 6.
The measurement results of 3-HIB concentration and 3-HMB concentration in serum are shown in FIG. 14A, and the measurement results of 3-HIB concentration and 3-HMB concentration in saliva are shown in FIG. 14B, respectively. As a result, it was observed that the 3-HIB concentration and 3-HMB concentration in the liver cirrhosis patient group tended to be higher than those in the healthy subject group in both saliva and serum, indicating that they are useful as liver cirrhosis markers. Was done. In particular, the 3-HIB concentration and 3-HMB concentration in saliva were significantly higher in the liver cirrhosis patient group than in the healthy subject group.
［実施例１］
容器に採取された流涎に、短冊状の濾紙の一方の端部を浸漬させて毛細管現象により唾液を吸収させた後、乾燥させた唾液試料を用いて、３−ＨＩＢ、３−ＨＢ、２−ＨＢ、及び３−ＨＭＢの含有量（濃度）を測定し、唾液試料間のばらつきを調べた。
[Example 1]
After immersing one end of a strip-shaped filter paper in the saliva collected in a container to absorb saliva by capillarity, and then using a dried saliva sample, 3-HIB, 3-HB, 2- The contents (concentrations) of HB and 3-HMB were measured, and the variation between saliva samples was examined.
具体的には、まず、一名の被験者から採取された流涎を１０本のチューブに分けた。各チューブに、それぞれシルマー濾紙（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）の先端部（唾液と接触させる領域側の端部）から１０ｍｍまでの領域を浸漬させ、毛細管現象により唾液が当該先端部から２５ｍｍ付近にまで吸い上げた後、当該シルマー濾紙を室温（２０〜２５℃）で２０分間放置することにより乾燥させた。乾燥後のシルマー濾紙を、先端部から１０ｍｍの箇所と１５ｍｍの箇所と２０ｍｍの箇所の３箇所で切断し、当該先端部から１０ｍｍまでの断片（採取部位（１））、当該先端部からの距離が１０ｍｍから１５ｍｍまでの断片（採取部位（２））、当該先端部からの距離が１５ｍｍから２０ｍｍまでの断片（採取部位（３））を得た。つまり、採取部位（１）は、唾液に直接接触させて吸収させた部位であり、採取部位（２）及び（３）は、唾液には直接接触させず、採取部位（１）からの毛細管現象により唾液を吸い上げた部位である。 Specifically, first, the hypersalivation collected from one subject was divided into 10 tubes. Each tube is immersed in a region up to 10 mm from the tip of Schirmer filter paper (manufactured by Alcon Laboratories) (the end on the region side where it comes into contact with saliva), and saliva is sucked up to about 25 mm from the tip by capillary action. After that, the Schirmer filter paper was allowed to dry at room temperature (20 to 25 ° C.) for 20 minutes. The dried Schirmer filter paper is cut at three points, 10 mm, 15 mm, and 20 mm from the tip, and a fragment from the tip to 10 mm (collection site (1)) and a distance from the tip. Obtained a fragment from 10 mm to 15 mm (collection site (2)) and a fragment from the tip portion from 15 mm to 20 mm (collection site (3)). That is, the collection site (1) is a site that is directly contacted with saliva and absorbed, and the collection sites (2) and (3) are not in direct contact with saliva, and the capillary phenomenon from the collection site (1). It is the part that sucked up saliva.
図１５に、使用したシルマー濾紙１の模式図を示す。図１５において、シルマー濾紙１の先端部（唾液と接触させる領域側の端部）は、左端部である。また、図中、「（１）」の領域が採取部位（１）（シルマー濾紙１の先端部から１０ｍｍまでの領域）であり、「（２）」の領域が採取部位（２）（シルマー濾紙１の先端部からの距離が１０ｍｍから１５ｍｍまでの領域）であり、「（３）」の領域が採取部位（３）（シルマー濾紙１の先端部からの距離が１５ｍｍから２０ｍｍまでの領域）である。また、シルマー濾紙１に吸い上げられた唾液の先端を、矢頭で示した。
FIG. 15 shows a schematic view of the
１０本のシルマー濾紙から切断された採取部位（１）、採取部位（２）、及び採取部位（３）について、各断片をそれぞれ１００μＬの内部標準含有アセトニトリル溶液（１００μＬのアセトニトリルに、１５０ｎｇのＤＬ−３−ＨＢ−１３Ｃ４ナトリウム塩（標品）を溶解させた溶液）に約１分間、ボルテックスミキサーを用いて混和させながら浸漬させることにより、各断片に含有されていた唾液由来の有機酸を抽出した。有機酸を抽出させたアセトニトリル溶液を有機酸検出用試料として回収した。 For the collection site (1), collection site (2), and collection site (3) cut from 10 Sylmer filter papers, each fragment was added to 100 μL of an internal standard-containing acetonitrile solution (100 μL of acetonitrile in 150 ng of DL-. 3-HB- 13 C 4 sodium salt solution prepared by dissolving (preparation)) to about 1 minute, by immersing while mixing with a vortex mixer, the organic acid of saliva from that had been present in each fragment Extracted. The acetonitrile solution from which the organic acid was extracted was recovered as a sample for detecting the organic acid.
各有機酸検出用試料を、それぞれエバポレートして乾燥させた後に、参考例４と同様にして、前記２ＰＭ誘導体化用混合試薬により誘導体化（誘導体によるエステル化）をした後、最終的に１容量％のギ酸水溶液（１ｍＬ）に再溶解させ、１μＬをＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより測定し、３−ＨＩＢ、３−ＨＢ、２−ＨＢ、及び３−ＨＭＢの含有量（濃度）を求めた。
Each organic acid detection sample is evaporated and dried, and then derivatized (esterified with a derivative) with the above-mentioned 2PM derivatization mixed reagent in the same manner as in Reference Example 4, and finally 1 volume is used. Resolve in% aqueous formic acid solution (1 mL) and
１０本の採取部位（１）の各有機酸の濃度を比較し、ばらつき（変動係数、％ＣＶ）を算出した。同様に、１０本の採取部位（２）の各有機酸の濃度のばらつきと、１０本の採取部位（３）の各有機酸の濃度のばらつきを、それぞれ算出した。算出結果を図１６に示す。この結果、４種類の有機酸全てにおいて、採取部位（３）が最もばらつきが大きく、採取部位（１）と採取部位（２）のばらつきは同程度であった。これらの結果から、シルマー濾紙のような短冊状又は棒状の濾紙を唾液吸収部材とし、唾液を毛細管現象により一方の端部から吸いあげる場合には、吸い上げられた唾液の先端近傍の領域を含む断片よりも、吸い上げられた唾液の先端からより離れた領域を含む断片を用いるほうが、試料間のばらつきが抑えられ、より信頼性の高い検出結果が得られることがわかった。 The concentrations of each organic acid in the 10 collection sites (1) were compared, and the variation (coefficient of variation,% CV) was calculated. Similarly, the variation in the concentration of each organic acid in the 10 collection sites (2) and the variation in the concentration of each organic acid in the 10 collection sites (3) were calculated, respectively. The calculation result is shown in FIG. As a result, among all four types of organic acids, the collection site (3) had the largest variation, and the collection site (1) and the collection site (2) had the same variation. From these results, when a strip-shaped or stick-shaped filter paper such as Schirmer filter paper is used as a saliva absorbing member and saliva is sucked up from one end by a capillary phenomenon, a fragment containing a region near the tip of the sucked saliva. It was found that using a fragment containing a region farther from the tip of the sucked saliva suppresses the variation between the samples and gives more reliable detection results.
［実施例２］
シルマー濾紙の一方の端部を被検者が口にくわえることにより毛細管現象により唾液を吸収させた後、乾燥させた唾液試料を用いて、３−ＨＩＢ、３−ＨＢ、２−ＨＢ、及び３−ＨＭＢの含有量（濃度）を測定し、唾液試料間のばらつきを調べた。
具体的には、まず、口腔内で唾液に直接触れる領域が先端部から１０ｍｍまでの領域（採取部位（１））のみとなるように、その他の領域（採取部位（２）及び採取部位（３））を銀紙で覆ったシルマー濾紙（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１０本用意した。この１０本のシルマー濾紙について、１本ずつ順次、銀紙で覆われていない先端部から１０ｍｍまでの領域を同一の被検者の舌下に約５秒間接触させ、毛細管現象により唾液を吸い上げて吸収させた後、室温（２０〜２５℃）で２０分間放置することにより乾燥させた。
乾燥後の１０本のシルマー濾紙から銀紙を外し、実施例１と同様にして、先端部から１０ｍｍの箇所と１５ｍｍの箇所と２０ｍｍの箇所の３箇所で切断し、当該先端部から１０ｍｍまでの断片（採取部位（１））、当該先端部からの距離が１０ｍｍから１５ｍｍまでの断片（採取部位（２））、当該先端部からの距離が１５ｍｍから２０ｍｍまでの断片（採取部位（３））を得、採取部位（１）、採取部位（２）、及び採取部位（３）から３−ＨＩＢ、３−ＨＢ、２−ＨＢ、及び３−ＨＭＢの含有量（濃度）を求めた。
[Example 2]
After absorbing saliva by capillarity by the subject holding one end of the Sylmer filter paper in the mouth, using a dried saliva sample, 3-HIB, 3-HB, 2-HB, and 3 -The content (concentration) of HMB was measured and the variation between saliva samples was examined.
Specifically, first, the other areas (collection site (2) and collection site (3)) so that the area in the oral cavity that comes into direct contact with saliva is only the area from the tip to 10 mm (collection site (1)). ))) Was covered with silver paper, and 10 Schirmer filter papers (manufactured by Alcon Laboratories) were prepared. For these 10 Schirmer filter papers, one by one, the area from the tip not covered with silver paper to 10 mm is brought into contact with the same subject's tongue for about 5 seconds, and saliva is sucked up and absorbed by capillary action. After that, it was dried by leaving it at room temperature (20 to 25 ° C.) for 20 minutes.
The silver paper is removed from the 10 Schirmer filter papers after drying, and in the same manner as in Example 1, the pieces are cut at 3 points of 10 mm, 15 mm and 20 mm from the tip, and fragments from the tip to 10 mm. (Collection site (1)), fragments with a distance from the tip of 10 mm to 15 mm (collection site (2)), fragments with a distance from the tip of 15 mm to 20 mm (collection site (3)) The contents (concentrations) of 3-HIB, 3-HB, 2-HB, and 3-HMB were determined from the obtained, collected site (1), collected site (2), and collected site (3).
１０本の採取部位（１）の各有機酸の濃度のばらつき（変動係数、％ＣＶ）と、１０本の採取部位（２）の各有機酸の濃度のばらつきと、１０本の採取部位（３）の各有機酸の濃度のばらつきを、それぞれ算出した。算出結果を図１７に示す。この結果、４種類の有機酸全てにおいて、吸い上げられた唾液の先端との距離が最も短い採取部位（３）が最もばらつきが大きく、採取部位（２）のばらつきが最も小さかった。また、実施例１に比べ、ばらつきが大きい傾向にあった。唾液と直接接触させなかった採取部位（２）が、唾液と直接接触させた採取部位（１）よりもばらつきが小さかったのは、採取部位（１）は口内で唾液に触れる量がまばらであったため、唾液が採取後部位（３）に向かって濾紙内を浸透するものの、直接唾液に触れる量の影響が残っている可能性があるためと考えられた。採取部位（２）は、採取部位（１）に比べ均一の唾液を含んでいる可能性が高かった。 Variations in the concentration of each organic acid in the 10 collection sites (1) (coefficient of variation,% CV), variations in the concentration of each organic acid in the 10 collection sites (2), and 10 collection sites (3) ), The variation in the concentration of each organic acid was calculated. The calculation result is shown in FIG. As a result, among all four types of organic acids, the collection site (3) having the shortest distance from the tip of the sucked saliva had the largest variation, and the collection site (2) had the smallest variation. In addition, there was a tendency for the variation to be larger than in Example 1. The collection site (2) that was not in direct contact with saliva had less variation than the collection site (1) that was in direct contact with saliva because the amount of contact with saliva in the mouth was sparse. Therefore, although saliva permeates the inside of the filter paper toward the site (3) after collection, it is considered that the influence of the amount of direct contact with saliva may remain. The collection site (2) was more likely to contain more uniform saliva than the collection site (1).
［実施例３］
シルマー濾紙の先端に、容器に採取した流涎５μＬを染み込ませて乾燥させた唾液試料について有機酸濃度を測定し、乾燥時間が有機酸濃度の測定値に及ぼす影響を調べた。
具体的には、９本のシルマー濾紙（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）の先端から１０ｍｍの範囲内に、それぞれ、流涎５μＬを滴下した後、室温（２０〜２５℃）で放置することにより自然乾燥させた。乾燥時間は、９本のシルマー濾紙のうち、５本を２０分間とし、２本を１日とし、２本を２日間とした。
[Example 3]
The organic acid concentration of the saliva sample dried by impregnating the tip of the Sylmer filter paper with 5 μL of saliva collected in a container was measured, and the effect of the drying time on the measured value of the organic acid concentration was investigated.
Specifically, 5 μL of each of the salivation was dropped into a range of 10 mm from the tip of nine Schirmer filter papers (manufactured by Alcon Laboratories), and then naturally dried by leaving at room temperature (20 to 25 ° C.). .. The drying time was 20 minutes for 5 of the 9 Schirmer filter papers, 1 day for 2 sheets, and 2 days for 2 sheets.
乾燥後のシルマー濾紙から、先端から１０ｍｍの断片（唾液を染み込ませた領域）を切り出し、実施例１と同様にして、各断片を１００μＬの内部標準含有アセトニトリル溶液（１００μＬのアセトニトリルに、１５０ｎｇのＤＬ−３−ＨＢ−１３Ｃ４ナトリウム塩（標品）を溶解させた溶液）に浸漬させ、有機酸を抽出したアセトニトリル溶液を有機酸検出用試料として回収し、各有機酸検出用試料中のＤＬ−３−ＨＢ−１３Ｃ４ナトリウム塩、３−ＨＢ、及び３−ＨＭＢを検出し、それらの含有量（ｎｇ／５μＬ）を求めた。ＤＬ−３−ＨＢ−１３Ｃ４ナトリウム塩の含有量を図１８に、３−ＨＢの含有量を図１９に、３−ＨＭＢの含有量を図２０に、それぞれ示す。図１８〜２０中、点線で示す濃度は、同じ流涎５μＬを１００μＬの前記内部標準含有アセトニトリル溶液に混合した混合液を有機酸検出用試料として同様にして測定したＤＬ−３−ＨＢ−１３Ｃ４ナトリウム塩、３−ＨＢ、及び３−ＨＭＢの含有量（ｎｇ／５μＬ）（実際の濃度）（ｎ＝４）を示す。
From the dried Sylmer filter paper, 10 mm fragments (areas impregnated with saliva) were cut out from the tip, and each fragment was divided into 100 μL of an internal standard-containing acetonitrile solution (100 μL of acetonitrile and 150 ng of DL in the same manner as in Example 1. -3-HB- 13 C 4 is immersed in a sodium salt solution obtained by dissolving (preparation)), the acetonitrile solution was extracted and the organic acid is recovered as a sample for detection organic acids, DL of the detection in a sample each
この結果、ＤＬ−３−ＨＢ−１３Ｃ４ナトリウム塩の濃度は、乾燥時間が２０分間の場合には実際の濃度よりもはるかに少なく、乾燥時間が長くなるほど実際の濃度に近づいた（図１７）。これは、放置（乾燥）時間が短いと濾紙に多くの水分が残存しているため、内部標準含有アセトニトリル溶液が当該濾紙に充分に染み込まないことが原因と推察された。また、３−ＨＢと３−ＨＭＢの濃度は、乾燥時間が２０分間の場合には実際の濃度よりもはるかに高かったが、乾燥時間が１〜２日間の試料では、実際の濃度に近似した濃度となった。乾燥時間が２０分間の場合に３−ＨＢと３−ＨＭＢの濃度が直接測定値より高く算出されたのは、内部標準値が低く測定されたためと推察される。これらの結果から、濾紙に吸収させることによって採取された唾液試料は、充分に乾燥させた後に測定に供することにより、唾液中の３−ＨＢ等の有機酸を直接測定した値とほぼ同等の測定結果が得られることが確認された。 As a result, the concentration of DL-3-HB- 13 C 4 sodium salt is much less than the actual concentration in the case the drying time is 20 minutes, close to the actual concentration as the drying time becomes longer (Fig. 17 ). It was presumed that this was because a large amount of water remained in the filter paper when the standing (drying) time was short, and the acetonitrile solution containing the internal standard did not sufficiently soak into the filter paper. In addition, the concentrations of 3-HB and 3-HMB were much higher than the actual concentrations when the drying time was 20 minutes, but were close to the actual concentrations in the samples having a drying time of 1 to 2 days. It became the concentration. It is presumed that the reason why the concentrations of 3-HB and 3-HMB were calculated higher than the directly measured values when the drying time was 20 minutes was that the internal standard values were measured low. From these results, the saliva sample collected by absorbing it in a filter paper is measured after it has been sufficiently dried and then subjected to measurement, which is almost the same as the value obtained by directly measuring organic acids such as 3-HB in saliva. It was confirmed that the results were obtained.
［実施例４］
３種類の素材の異なる濾紙を唾液吸収部材とし、唾液吸収部材の素材が有機酸の測定値に与える影響を調べた。
具体的には、唾液吸収部材として、シルマー濾紙（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、ガラス繊維からなるＧＦ／Ｂ濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ社製）、及び合成樹脂繊維からなるＳＯＳ（ＳＡＬＩＭＥＴＲＩＣＳ ＯＲＡＬ ＳＷＡＢ）濾紙（ＳＡＬＩＭＥＴＲＩＣＳ社製）を用いた。各濾紙に、一の被験者から容器に採取した流涎を５μＬずつ滴下した後、室温（２０〜２５℃）で２０分間放置することにより自然乾燥させた。シルマー濾紙の場合には先端から１０ｍｍの領域を切り出した断片に（ｎ＝５）、ＧＦ／Ｂ濾紙の場合には８等分した断片に（ｎ＝５）、ＳＯＳ濾紙の場合には高さが５ｍｍとなるように切断した円柱を半分に切断した断片に（ｎ＝５）、それぞれ流涎を滴下した。
[Example 4]
Using filter papers made of three different materials as saliva absorbing members, the effect of the materials of the saliva absorbing members on the measured values of organic acids was investigated.
Specifically, as a saliva absorbing member, Schirmer filter paper (manufactured by Alcon Laboratories), GF / B filter paper made of glass fiber (manufactured by Whatman), and SOS (SALIMETRICS ORAL SWAB) filter paper made of synthetic resin fiber (manufactured by SALIMETRICS). ) Was used. After dropping 5 μL of the saliva collected from one subject into a container on each filter paper, the mixture was allowed to air dry at room temperature (20 to 25 ° C.) for 20 minutes. In the case of Schirmer filter paper, the
実施例１と同様にして、乾燥後の各濾紙断片を１００μＬの内部標準含有アセトニトリル溶液（１００μＬのアセトニトリルに、１５０ｎｇのＤＬ−３−ＨＢ−１３Ｃ４ナトリウム塩（標品）を溶解させた溶液）に浸漬させ、有機酸を抽出したアセトニトリル溶液を有機酸検出用試料として回収し、各有機酸検出用試料中のＤＬ−３−ＨＢ−１３Ｃ４ナトリウム塩、３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、及び２−ＨＢを検出し、それらの含有量（ｎｇ／５μＬ）を求めた。また、同じ流涎５μＬを１００μＬの前記内部標準含有アセトニトリル溶液に混合した混合液を有機酸検出用試料として同様にして各有機酸の濃度（実際の濃度）を測定した（ｎ＝４）（唾液直接測定）。ＤＬ−３−ＨＢ−１３Ｃ４ナトリウム塩の含有量を図２１に、３−ＨＢの含有量を図２２に、３−ＨＩＢの含有量を図２３に、３−ＨＭＢの含有量を図２４に、２−ＨＢの含有量を図２５に、それぞれ示す。この結果、３種類の濾紙のうち、ＳＯＳ濾紙では、自然乾燥時間が２０分間であっても、内部標準の測定値が直接唾液測定値と同等であり、唾液中の４種の有機酸はいずれもほぼ正確に測定できた。
The solution in the same manner as in Example 1, in which each filter paper fragments after drying 100 [mu] L of internal standard-containing acetonitrile solution (100 [mu] L of acetonitrile to dissolve the DL-3-HB- 13 C 4 sodium salt of 150 ng (preparation) ) the soaked, the acetonitrile solution was extracted and the organic acid is recovered as a sample for detection organic acid, DL-3-HB- 13 C 4 sodium salt of the organic acid for detection in a sample, 3-HB, 3-HIB , 3-HMB and 2-HB were detected, and their contents (ng / 5 μL) were determined. Further, the concentration (actual concentration) of each organic acid was measured in the same manner using a mixed solution prepared by mixing 5 μL of the same saliva with 100 μL of the acetonitrile solution containing the internal standard as a sample for detecting organic acids (n = 4) (saliva direct). Measurement). The content of DL-3-HB- 13 C 4 sodium salt 21, 22 the content of 3-HB, in Figure 23 the content of 3-HIB, the content of 3-
［参考例１０］
健常者の唾液中の乳酸及びＤ−乳酸の重水素同位体について、２−ピリジンメタノールで誘導体化した後、ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより検出した。
まず、健常者から採取された流涎を、−２０℃にて一旦凍結し、その後解凍したものを、遠心分離処理（３０００ｒｐｍ、１５分間）し、粘性蛋白質（ムチン）を分解し、唾液中に含まれている食べかす等と共に沈殿させ、上清を得た。得られた唾液上清を分析に用いた。
次いで、アセトニトリル／水（１／１９、容量比）（１００μＬ）に、Ｄ−乳酸（標品、１００ｎｇ）又は前記唾液上清（５μＬ）と、Ｄ−乳酸の重水素同位体（標品、Ｄ−乳酸−ｄ３、５００ｎｇ）とを溶解させた試料溶液を調製し、エバポレートして乾燥させた後に、前記２ＰＭ誘導体化用混合試薬により誘導体化（誘導体によるエステル化）をした。最終的に１容量％のギ酸水溶液（１００μＬ）に再溶解させ、５μＬ（唾液２５０ｎＬ中の固形分相当、Ｄ−乳酸が５ｎｇ相当、Ｄ−乳酸−ｄ３が２５ｎｇ相当）を、前述の通りにＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。
[Reference Example 10]
The deuterium isotopes of lactic acid and D-lactic acid in the saliva of healthy subjects were derivatized with 2-pyridinemethanol and then detected by LC-P-ESI-MS / MS.
First, the saliva collected from a healthy person is frozen at -20 ° C, then thawed, and then centrifuged (3000 rpm, 15 minutes) to decompose the viscous protein (mucin) and contain it in saliva. It was precipitated together with the food waste and the like to obtain a supernatant. The obtained saliva supernatant was used for analysis.
Then, in acetonitrile / water (1/19, volume ratio) (100 μL), D-lactate (standard, 100 ng) or the saliva supernatant (5 μL) and the deuterium isotope of D-lactate (standard, D) A sample solution in which -lactic acid-d 3 , 500 ng) was dissolved was prepared, evaporated and dried, and then derivatized (esterified with a derivative) with the above-mentioned mixed reagent for 2PM derivatization. Finally, it is redissolved in a 1 volume% aqueous solution of formic acid (100 μL), and 5 μL (equivalent to solid content in 250 nL of saliva, equivalent to 5 ng of D-lactic acid, equivalent to 25 ng of D-lactic acid-d 3 ) is added as described above. Measured by LC-P-ESI-MS / MS.
ＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより検出した結果を図２６に示す。図２６Ａに、２−ピリジンメタノールで誘導体化された乳酸（２ＰＭ−Ｌａｃｔａｔｅ）と重水素同位体（２ＰＭ−Ｌａｃｔａｔｅ−ｄ３）を含む試料のｍ／ｚ １８２．１を前駆イオンとした時のプロダクトイオンクロマトグラムを、図２６Ｂに図２６Ａの２ＰＭ−ＬａｃｔａｔｅピークのＭＳ／ＭＳスペクトラムを、それぞれ示す。また、図２６Ｃに、標品のＤ−乳酸を用いた場合の２ＰＭ−Ｌａｃｔａｔｅと２ＰＭ−Ｌａｃｔａｔｅ−ｄ３のＳＲＭクロマトグラムを、図２６Ｄに、唾液上清を用いた場合の２ＰＭ−Ｌａｃｔａｔｅと２ＰＭ−Ｌａｃｔａｔｅ−ｄ３のＳＲＭクロマトグラムを示した。当該クロマトグラムより、２ＰＭ−Ｌａｃｔａｔｅ−ｄ３に対するピークエリア面積比を算出し、当該比率をキャリブレーションカーブに当てはめることにより、唾液中の乳酸濃度を決定できる。この結果、測定に供した試料には、唾液５μＬに由来する乳酸しか含まれていなかったにもかかわらず、２−ピリジンメタノールで誘導体化することにより、低感度高情報量のスキャンモードで、乳酸をスペクトル解析することができた。また、ＬＣクロマトグラムにおいて、乳酸の２ＰＭエステル誘導体は、３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、及び２−ＨＢの２ＰＭエステル誘導体とはいずれも明らかに分離して解析できた。これらの結果から、２−ピリジンメタノールで誘導体化してＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを行うことにより、唾液中の微量の乳酸を、構造類似の３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、及び２−ＨＢと区別して、精度よく高感度に同時検出できることがわかった。 The results detected by LC-P-ESI-MS / MS are shown in FIG. FIG. 26A shows a product using m / z 182.1 as a precursor ion of a sample containing lactic acid (2PM-Lactate) derivatized with 2-pyridinemethanol and a deuterium isotope (2PM-Lactate-d 3 ). Ion chromatograms are shown in FIG. 26B and the MS / MS spectrum of the 2PM-Lactate peak in FIG. 26A, respectively. Further, in FIG. 26C, the SRM chromatograms of 2 PM-Lactate and 2 PM-Lactate-d 3 in the case of using the preparation D- lactic acid, in FIG. 26D, and 2 PM-Lactate in the case of using a saliva supernatant 2PM The SRM chromatogram of -Lactate-d 3 is shown. The lactic acid concentration in saliva can be determined by calculating the peak area area ratio with respect to 2PM-Lactate-d 3 from the chromatogram and applying the ratio to the calibration curve. As a result, although the sample used for the measurement contained only lactic acid derived from 5 μL of saliva, lactic acid was derivatized with 2-pyridinemethanol in a scan mode with low sensitivity and high information content. Was able to be spectrally analyzed. Moreover, in the LC chromatogram, the 2PM ester derivative of lactic acid could be clearly separated and analyzed from the 2PM ester derivatives of 3-HB, 3-HIB, 3-HMB, and 2-HB. From these results, by derivatizing with 2-pyridinemethanol and performing LC-P-ESI-MS / MS, trace amounts of lactic acid in saliva can be removed with structurally similar 3-HB, 3-HIB, 3-HMB, And 2-HB, it was found that simultaneous detection can be performed with high accuracy and high sensitivity.
［参考例１１］
被検者から採取された唾液（流涎）中の３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、及び乳酸の室温における保存安定性を調べた。
具体的には、健常者から１本のチューブに採取（流涎）した唾液を７本のチューブに分注した。７本のチューブのうちの１本については、採取後速やかに−２０℃で凍結保存した。残りの６本については、それぞれ、室温で１、２、４、６、１０、又は２４時間放置した後、−２０℃で保存した。凍結保存した唾液試料は、分析時に室温で自然解凍した。ボルテックスミキサーを用いて混和した後、遠心分離処理（３０００ｒｐｍ、１５分間）し、粘性蛋白質（ムチン）を分解し、唾液中に含まれている食べかす等と共に沈殿させ、上清を分析に用いた。
[Reference Example 11]
The storage stability of 3-HB, 3-HIB, 3-HMB, 2-HB, and lactic acid in saliva (saliva) collected from the subject was examined at room temperature.
Specifically, saliva collected (saliva) from a healthy subject into one tube was dispensed into seven tubes. One of the seven tubes was cryopreserved at −20 ° C. immediately after collection. The remaining 6 bottles were left at room temperature for 1, 2, 4, 6, 10 or 24 hours, respectively, and then stored at −20 ° C. The cryopreserved saliva sample was naturally thawed at room temperature at the time of analysis. After mixing using a vortex mixer, the mixture was centrifuged (3000 rpm, 15 minutes) to decompose the viscous protein (mucin), precipitated together with food debris contained in saliva, and the supernatant was used for analysis.
−２０℃で保存後の各唾液中の３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、及び乳酸の濃度を、内部標準としてＤＬ−３−ＨＢ−１３Ｃ４ナトリウム塩及びＤ−乳酸−ｄ３を用い、誘導体化試薬として２−ピリジンメタノールを用いて、参考例４と同様にしてＬＣ−Ｐ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。クロマトグラムより、２ＰＭ−３−ＨＢの［１３Ｃ４］同位体及びＤ−乳酸−ｄ３に対するピークエリア面積比を算出し、当該比率をキャリブレーションカーブに当てはめて、唾液中の３−ＨＢ濃度、３−ＨＩＢ濃度、３−ＨＭＢ濃度、２−ＨＢ濃度、及び乳酸濃度を決定した。測定結果を図２７に示す。この結果、唾液試料から、３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、及び乳酸を分離して定量的に検出することができた。また、唾液中の３−ＨＢ濃度及び３−ＨＩＢ濃度は、採取後室温で放置される時間にかかわらず、ほぼ安定しており、３−ＨＭＢ濃度は室温保存６時間までは安定しており、室温保存１０時間以降で緩やかな減少傾向が観察された。これに対して、唾液中の２−ＨＢ濃度及び乳酸濃度は、室温保存１時間後から急激に濃度が減少しており、室温における保存安定性が低いことが確認された。 3-HB of the saliva after storage at -20 ℃, 3-HIB, 3 -HMB, 2-HB, and the concentration of lactic acid, DL-3-HB- 13 C 4 sodium salt and as an internal standard D- It was measured by LC-P-ESI-MS / MS in the same manner as in Reference Example 4 using lactic acid-d 3 and 2-pyridinemethanol as a derivatization reagent. From the chromatogram, calculate the peak area area ratio of 2PM-3-HB to the [ 13 C 4 ] isotope and D-lactic acid-d 3 , apply the ratio to the calibration curve, and apply the 3-HB concentration in saliva. , 3-HIB concentration, 3-HMB concentration, 2-HB concentration, and lactic acid concentration were determined. The measurement result is shown in FIG. As a result, 3-HB, 3-HIB, 3-HMB, 2-HB, and lactic acid could be separated and quantitatively detected from the saliva sample. In addition, the 3-HB concentration and 3-HIB concentration in saliva are almost stable regardless of the time left at room temperature after collection, and the 3-HMB concentration is stable up to 6 hours of storage at room temperature. A gradual decreasing tendency was observed after 10 hours of storage at room temperature. On the other hand, the 2-HB concentration and the lactic acid concentration in saliva decreased sharply after 1 hour of storage at room temperature, and it was confirmed that the storage stability at room temperature was low.
［参考例１２］
流涎法にて採取した唾液に対し、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）阻害剤であるオキサミン酸ナトリウムを最終濃度２００μＭとなるように添加した状態で、参考例１１と同様にして室温で１〜２４時間放置し、室温保存時における唾液中の２−ＨＢ濃度及び乳酸濃度の低下に対するＬＤＨ阻害剤の効果を調べた。この結果、唾液中の乳酸濃度の減少傾向は、オキサミン酸ナトリウム無添加の場合に比べてやや緩やかではあるものの、依然として乳酸濃度は経時的に低下していた。また、唾液中の２−ＨＢ濃度は、オキサミン酸ナトリウムを添加した場合と無添加の場合で差はなかった（データ図示せず。）。
また、添加するオキサミン酸ナトリウムの最終濃度を、５００μＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、又は１０ｍＭまで増加させ、２４時間放置してした後の試料を検討した場合であっても、唾液中の２−ＨＢ濃度及び乳酸濃度の低下は、抑制できなかった（データ図示せず。）。
[Reference Example 12]
To saliva collected by the saliva method, sodium oxamate, which is an LDH (lactate dehydrogenase) inhibitor, was added to a final concentration of 200 μM, and the same as in Reference Example 11 for 1 to 24 hours at room temperature. The effect of the LDH inhibitor on the decrease of 2-HB concentration and lactic acid concentration in saliva when left at room temperature was investigated. As a result, although the decreasing tendency of the lactic acid concentration in saliva was slightly slower than that in the case where sodium oxamate was not added, the lactic acid concentration was still decreasing with time. In addition, the 2-HB concentration in saliva was not different between the case where sodium oxamate was added and the case where sodium oxamate was not added (data not shown).
Further, even when the final concentration of sodium oxamate to be added is increased to 500 μM, 1 mM, 5 mM, or 10 mM and the sample is examined after being left for 24 hours, the 2-HB concentration in saliva and The decrease in lactic acid concentration could not be suppressed (data not shown).
被検者から採取された唾液（流涎）に、ギ酸、水酸化ナトリウム、塩酸、又は塩化ベンザルコニウムを有効成分とする抗菌剤「Ｃｌｅａｒ Ｂａｔｈ（登録商標）」（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、組成：５０質量％ 塩化ベンザルコニウム、１０質量％ エタノール、４０質量％ 水）を添加し、３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、及び乳酸の室温における保存安定性を調べた。
具体的には、健常者から１本のチューブに採取（流涎）した唾液を、８本のチューブにチューブ１本当たり５００μＬずつ分注した。８本のチューブのうちの１本については、採取後速やかに−２０℃で凍結保存した。残りの７本のうちの１本は何も添加せず、残る６本には、それぞれ、０．００１容量％ ギ酸水溶液、０．０１容量％ ギ酸水溶液、１容量％ ギ酸水溶液、０．００１Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液、０．００１Ｎ 塩酸、又は０．１容量％ Ｃｌｅａｒ Ｂａｔｈ水溶液をそれぞれ１／１００倍量（５μＬ）を直ちに混和し、室温で２４時間放置した後、−２０℃で保存した。なお、ｐＨ試験紙を用いて各唾液のｐＨを測定したところ、１容量％ ギ酸水溶液を添加した唾液のｐＨは３〜４程度の酸性であり、その他の唾液のｐＨは６〜８程度の中性であった。凍結保存した唾液試料は、分析時に室温で自然解凍した。ボルテックスミキサーを用いて混和した後、遠心分離処理（３０００ｒｐｍ、１５分間）し、粘性蛋白質（ムチン）を分解し、唾液中に含まれている食べかす等と共に沈殿させ、得られた唾液上清を分析に用いた。
Antibacterial agent "Clear Bath®" (manufactured by Specrum Laboratories) containing formic acid, sodium hydroxide, hydrochloric acid, or benzalkonium chloride as an active ingredient in saliva (salting) collected from a subject, composition: 50 Mass% benzalkonium chloride, 10 mass% ethanol, 40 mass% water) was added, and the storage stability of 3-HB, 3-HIB, 3-HMB, 2-HB, and lactic acid at room temperature was examined.
Specifically, saliva collected (saliva) from a healthy subject into one tube was dispensed into eight tubes by 500 μL per tube. One of the eight tubes was cryopreserved at −20 ° C. immediately after collection. Nothing was added to one of the remaining seven, and the remaining six were 0.001% by volume caustic aqueous solution, 0.01% by volume caustic aqueous solution, 1% by volume caustic aqueous solution, and 0.001N water, respectively. A 1/100 times amount (5 μL) of each of an aqueous sodium oxide solution, 0.001N hydrochloric acid, or a 0.1% by volume Clear Bath aqueous solution was immediately mixed, left at room temperature for 24 hours, and then stored at −20 ° C. When the pH of each saliva was measured using pH test paper, the pH of saliva to which a 1% by volume aqueous solution of formic acid was added was about 3 to 4, and the pH of other saliva was about 6 to 8. It was sex. The cryopreserved saliva sample was naturally thawed at room temperature at the time of analysis. After mixing using a vortex mixer, centrifugation (3000 rpm, 15 minutes) is performed to decompose the viscous protein (mucin) and precipitate it together with food debris contained in saliva, and the obtained saliva supernatant is analyzed. Used for.
−２０℃で保存後の各唾液中の３−ＨＢ、３−ＨＩＢ、３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、及び乳酸の濃度を、参考例１１と同様にして測定した。測定結果を図２８に示す。この結果、２４時間室温放置後の唾液では、３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、及び乳酸の濃度が顕著に低下しており、３−ＨＢの濃度が上昇していたが、０．１容量％ Ｃｌｅａｒ Ｂａｔｈを添加した唾液では、室温２４時間放置後でも、２−ＨＢ、乳酸、及び３−ＨＭＢの濃度がほとんど低下しておらず、３−ＨＢの濃度も上昇しておらず、室温放置していない唾液とほぼ同程度の濃度であった。また、ｐＨが酸性であった１容量％ ギ酸水溶液を添加した唾液も、３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、及び乳酸の濃度低下並びに３−ＨＭＢの濃度上昇が抑制されることがわかった。その他の添加剤を添加した唾液では、添加剤無添加の場合と同様に、室温放置によって３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、及び乳酸の濃度低下並びに３−ＨＭＢの濃度上昇が観察された。これらの結果から、唾液に抗菌剤を添加したり、唾液のｐＨを酸性に調整することによって、唾液中の３−ＨＢ、３−ＨＭＢ、２−ＨＢ、及び乳酸の保存安定性が改善できることがわかった。また、２−ＨＢ及び乳酸の濃度低下が抗菌剤添加により抑制されたことから、唾液の室温放置による２−ＨＢ量及び乳酸量の低下は、口内バクテリアによる分解のためと推察された。 The concentrations of 3-HB, 3-HIB, 3-HMB, 2-HB, and lactic acid in each saliva after storage at −20 ° C. were measured in the same manner as in Reference Example 11. The measurement result is shown in FIG. As a result, in saliva left at room temperature for 24 hours, the concentrations of 3-HMB, 2-HB, and lactic acid were remarkably decreased, and the concentration of 3-HB was increased, but 0.1% by volume Clear. In saliva to which Bath was added, the concentrations of 2-HB, lactic acid, and 3-HMB hardly decreased, and the concentration of 3-HB did not increase even after being left at room temperature for 24 hours, and the saliva was left at room temperature. The concentration was about the same as that of no saliva. It was also found that saliva to which a 1% by volume formic acid aqueous solution having an acidic pH was added also suppressed a decrease in the concentration of 3-HMB, 2-HB, and lactic acid and an increase in the concentration of 3-HMB. In saliva to which other additives were added, a decrease in the concentration of 3-HMB, 2-HB, and lactic acid and an increase in the concentration of 3-HMB were observed when left at room temperature, as in the case where no additive was added. From these results, it can be said that the storage stability of 3-HB, 3-HMB, 2-HB, and lactic acid in saliva can be improved by adding an antibacterial agent to saliva or adjusting the pH of saliva to be acidic. all right. Moreover, since the decrease in the concentration of 2-HB and lactic acid was suppressed by the addition of the antibacterial agent, it was presumed that the decrease in the amount of 2-HB and the amount of lactic acid due to leaving saliva at room temperature was due to the decomposition by oral bacteria.
また、前記２ＰＭ誘導体化用混合試薬による誘導体化を行う試料として、唾液上清にアセトニトリル／水（１／１９、容量比）を混合したところ、添加剤を添加していない唾液上清では濁りがあったが、０．１容量％ Ｃｌｅａｒ Ｂａｔｈ水溶液を添加した唾液上清では凝集沈殿が生じており、液性部分は透明であった。唾液の濁りは、主にバクテリアであり、抗菌剤の添加により死滅して凝集して沈殿した結果、唾液が透明になったと推測された。 Further, when acetonitrile / water (1/19, volume ratio) was mixed with the saliva supernatant as a sample to be derivatized with the above-mentioned 2PM derivatization mixed reagent, the saliva supernatant to which no additive was added became turbid. However, in the saliva supernatant to which 0.1% by volume Clear Bath aqueous solution was added, coagulation and precipitation occurred, and the liquid part was transparent. It was speculated that the turbidity of saliva was mainly bacteria, and that the saliva became transparent as a result of being killed by the addition of an antibacterial agent, agglutinating and precipitating.
［参考例１３］
被検者から採取された血清と唾液（流涎）中における、乳酸の濃度の相関性を調べた。具体的には、健常人１名から異なる日に同時に採取した血液及び唾液について、これらの乳酸の濃度を測定し、血清中濃度と唾液中濃度の相関性を調べた。
血液は、血清分離剤入りの採血管に採取し、凝固後、遠心分離処理により血清を採取し、分析まで−２０℃にて保存した。唾液は、流涎法にて採取後、５００μＬに対し５μＬの０．１％ Ｃｌｅａｒ Ｂａｔｈ水溶液を直ちに混和し、分析まで−２０℃にて保存した。血清中及び唾液中の乳酸の濃度は、参考例１１と同様にして測定した。測定結果を図２９に示す。この結果、乳酸の唾液中濃度は、血清中濃度と相関することが確認された。
[Reference Example 13]
The correlation between the serum collected from the subject and the concentration of lactic acid in saliva (saliva) was investigated. Specifically, the concentrations of these lactic acids were measured for blood and saliva collected simultaneously from one healthy person on different days, and the correlation between the serum concentration and the saliva concentration was investigated.
Blood was collected in a blood collection tube containing a serum separating agent, and after coagulation, serum was collected by centrifugation and stored at −20 ° C. until analysis. After collecting saliva by the saliva method, 5 μL of 0.1% Clear Bath aqueous solution was immediately mixed with 500 μL, and the saliva was stored at −20 ° C. until analysis. The concentrations of lactic acid in serum and saliva were measured in the same manner as in Reference Example 11. The measurement result is shown in FIG. As a result, it was confirmed that the salivary concentration of lactic acid correlates with the serum concentration.
１…シルマー濾紙 1 ... Schirmer filter paper
Claims (19)
前記吸収工程において唾液を吸収させた唾液吸収部材を乾燥させる乾燥工程と、
を有し、
前記吸収工程において、前記唾液吸収部材に所定量の唾液を吸収させること、及び
前記乾燥工程後、前記唾液吸収部材から、所定量の唾液由来の固形分が吸着している領域を切断して回収すること
により、所定量の唾液に由来する固形分が唾液吸収部材に乾燥状態で保持された唾液試料を調製し、
前記唾液吸収部材が短冊状又は棒状であり、
前記吸収工程において、前記唾液吸収部材の一方の端部を唾液に接触させ、毛細管現象により唾液を吸い上げることにより当該唾液吸収部材に唾液を吸収させ、
前記乾燥工程後、前記唾液吸収部材の唾液由来の固形分が吸着している領域のうち、吸い上げられた唾液の先端から８ｍｍ以上離れている部位から唾液に接触させた端部側方向に向かって、所定の面積分又は体積分の領域を切断したものを、唾液試料として回収することを特徴とする、唾液試料の調製方法。 An absorption process that allows saliva to be absorbed by the saliva absorbing member,
In the absorption step, a drying step of drying the saliva absorbing member that has absorbed saliva, and a drying step.
Have,
In the absorption step, the saliva absorbing member absorbs a predetermined amount of saliva, and after the drying step, a region in which a predetermined amount of saliva-derived solid content is adsorbed from the saliva absorbing member is formed. By cutting and collecting, a saliva sample in which a predetermined amount of solids derived from saliva is held in a saliva absorbing member in a dry state is prepared.
The saliva absorbing member is in the shape of a strip or a rod,
In the absorption step, one end of the saliva absorbing member is brought into contact with saliva, and saliva is sucked up by a capillary phenomenon so that the saliva absorbing member absorbs saliva.
After the drying step, in the region where the saliva-derived solid content of the saliva absorbing member is adsorbed, from a portion 8 mm or more away from the tip of the sucked saliva toward the end side in contact with saliva. A method for preparing a saliva sample, which comprises collecting a saliva sample obtained by cutting a region of a predetermined area or volume.
前記吸収工程において、前記唾液吸収部材の一方の端部を被検者の口に入れて、毛細管現象により唾液を吸い上げることにより当該唾液吸収部材に唾液を吸収させ、
前記乾燥工程後、前記唾液吸収部材の唾液由来の固形分が吸着している領域のうち、被検者の口腔内において唾液と直接接触していなかった領域であり、かつ吸い上げられた唾液の先端から８ｍｍ以上離れている部位から唾液に接触させた端部側方向に向かって、所定の面積分又は体積分の領域を切断したものを、唾液試料として回収する、請求項３に記載の唾液試料の調製方法。 The saliva absorbing member is in the shape of a strip or a rod,
In the absorption step, one end of the saliva absorbing member is put into the mouth of the subject, and saliva is sucked up by the capillary phenomenon so that the saliva absorbing member absorbs saliva.
After the drying step, among the regions where saliva-derived solids of the saliva absorbing member are adsorbed, the regions that are not in direct contact with saliva in the oral cavity of the subject and the tip of the sucked saliva. The saliva sample according to claim 3, wherein a saliva sample obtained by cutting a region of a predetermined surface integral or volume from a portion separated from the saliva by 8 mm or more toward the end side in contact with saliva is collected. Preparation method.
前記吸収工程において唾液を吸収させた唾液吸収部材を、抗菌剤を含有する溶液中に浸漬させる抗菌剤処理工程と、
を有し、
前記吸収工程において、前記唾液吸収部材に所定量の唾液を吸収させること、及び
前記吸収工程後、前記唾液吸収部材から所定量の唾液由来の固形分が吸着している領域を切断して回収したものを、前記抗菌剤を含有する溶液中に浸漬させること
により、所定量の唾液に由来する固形分と唾液吸収部材を含有する溶液である唾液試料を調製し、
前記唾液吸収部材が短冊状又は棒状であり、
前記吸収工程において、前記唾液吸収部材の一方の端部を唾液に接触させ、毛細管現象により唾液を吸い上げることにより当該唾液吸収部材に唾液を吸収させ、
前記乾燥工程後、前記唾液吸収部材の唾液由来の固形分が吸着している領域のうち、吸い上げられた唾液の先端から８ｍｍ以上離れている部位から唾液に接触させた端部側方向に向かって、所定の面積分又は体積分の領域を切断したものを、唾液試料として回収することを特徴とする、唾液試料の調製方法。 An absorption process that allows saliva to be absorbed by the saliva absorbing member,
An antibacterial agent treatment step of immersing a saliva absorbing member that has absorbed saliva in the absorption step in a solution containing an antibacterial agent,
Have,
In the absorption step, the saliva absorbing member absorbs a predetermined amount of saliva, and after the absorption step, a region in which a predetermined amount of saliva-derived solid content is adsorbed is cut from the saliva absorbing member. By immersing the recovered product in a solution containing the antibacterial agent, a saliva sample, which is a solution containing a predetermined amount of saliva-derived solids and a saliva absorbing member, is prepared.
The saliva absorbing member is in the shape of a strip or a rod,
In the absorption step, one end of the saliva absorbing member is brought into contact with saliva, and saliva is sucked up by a capillary phenomenon so that the saliva absorbing member absorbs saliva.
After the drying step, in the region where the saliva-derived solid content of the saliva absorbing member is adsorbed, from a portion 8 mm or more away from the tip of the sucked saliva toward the end side in contact with saliva. A method for preparing a saliva sample, which comprises collecting a saliva sample obtained by cutting a region of a predetermined area or volume.
得られた唾液試料を、極性有機溶剤に浸漬させることにより、前記唾液試料から唾液由来の有機酸を抽出する抽出工程と、
前記抽出工程の後、有機酸が抽出された極性有機溶剤を、唾液由来有機酸検出用試料として、前記唾液試料から分離して回収する回収工程と、
前記回収工程により回収された唾液由来有機酸検出用試料中の有機酸を下記一般式（１）−１〜（１）−３
のいずれかで表される誘導体化試薬とエステル結合させることにより誘導体を合成し、当該誘導体を、正イオンモードのエレクトロスプレーイオン化ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析）法により検出する検出工程と、
を有することを特徴とする、唾液中の有機酸の検出方法。 A saliva sample is prepared by the method for preparing a saliva sample according to any one of claims 1 to 13 .
An extraction step of extracting the organic acid derived from saliva from the saliva sample by immersing the obtained saliva sample in a polar organic solvent.
After the extraction step, a recovery step of separating and recovering the polar organic solvent from which the organic acid has been extracted from the saliva sample as a saliva-derived organic acid detection sample,
The organic acid in the saliva-derived organic acid detection sample recovered by the recovery step is represented by the following general formula (1) -1 to (1) -3.
A derivative is synthesized by ester-bonding with a derivatization reagent represented by any of the above, and the derivative is detected by the electrospray ionization LC-MS / MS (liquid chromatography-tandem mass spectrometry) method in the positive ion mode. Detection process and
A method for detecting an organic acid in saliva, which comprises having.
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