JP6767976B2 - 関節疾患の治療のためのメッセンジャーrna治療法 - Google Patents
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Description
本出願は、2014年12月5日に出願された米国仮出願シリアル番号62/088,141号に対する優先権を主張するものであり、この開示は、本明細書に参考として組み込まれる。
本明細書は、配列表(2015年12月4日に「200685−1291_SL.txt」と命名された.txtファイルとして電子提出されたもの)を参照する。この.txtファイルは、2015年12月3日に生成され、4,115バイトのサイズである。この配列表の内容全体は、参考として本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
メッセンジャーRNA(mRNA)の関節内送達の方法であって、その送達を必要としている対象の関節に、1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上のmRNAを含む組成物を投与し、これにより、前記組成物の投与が、前記関節において1つ以上のmRNAによってコードされた前記1つ以上のポリペプチドの発現をもたらすことを含む、前記方法。
(項目2)
前記組成物が、前記関節に局所的に投与される、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記関節が、線維性関節、軟骨性関節、または滑膜関節である、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記関節が、滑膜関節である、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目5)
前記組成物が、前記滑膜腔に直接投与される、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記1つ以上のポリペプチドの前記発現及び/または活性が、軟骨、靭帯、筋肉、滑膜内膜細胞、軟骨細胞、及び/または前記関節の滑液において検出される、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目7)
前記1つ以上のポリペプチドの前記発現及び/または活性が、投与後、少なくとも約6時間、12時間、18時間、24時間、2日、3日、4日、5日、6日、1週、2週、3週、4週、または1ヶ月で検出可能である、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目8)
前記1つ以上のmRNAのそれぞれが、約0.5kb、1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、または15kbを超える長さを有する、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目9)
前記1つ以上のmRNAによってコードされる前記1つ以上のポリペプチドが、関節内で正常に機能する、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目10)
前記1つ以上のmRNAによってコードされる前記1つ以上のポリペプチドが、抗炎症性である、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目11)
前記1つ以上のmRNAが、抗体をコードする、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目12)
前記抗体が、完全型免疫グロブリン、(Fab) 2 、(Fab’) 2 、Fab、Fab’、またはscFvである、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記1つ以上のmRNAが、抗体重鎖、軽鎖、またはそれらの断片をコードする、項目11または12に記載の方法。
(項目14)
前記組成物が、それぞれ抗体重鎖及び軽鎖をコードする2つの別個のmRNAを含む、項目11〜13のいずれか1項に記載の方法。
(項目15)
前記1つ以上のmRNAによってコードされる前記抗体が、抗TNFα抗体、抗IL−6抗体、抗IL−1β抗体、抗sTNFR−I抗体、抗−sTNFR−II抗体、抗IL−2抗体、抗IFN−γ抗体、抗IL−18抗体、抗IL−12抗体、または抗IL−12p40抗体である、項目11〜14のいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
前記1つ以上のmRNAが、可溶性受容体をコードする、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目17)
関節疾患、障害、または病状を治療する方法であって、先行項目のいずれか1項に記載の方法を用いて、1つ以上のmRNAを送達することを含む、前記方法。
(項目18)
前記関節疾患、障害、または病状は、炎症性疾患、障害、または病状である、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記炎症性疾患、障害、または病状が、関節炎である、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記炎症性疾患、障害、または病状が、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、痛風、偽性痛風、腱炎、滑液包炎、手根管症候群、骨関節炎、滑膜炎、脊椎炎、アミロイドーシス、腰部脊椎管狭窄症、及び/または仙腸関節機能障害からなる群から選択される、項目18または19に記載の方法。
(項目21)
前記組成物が、1週間に1回投与される、項目17〜20のいずれか1項に記載の方法。
(項目22)
前記組成物が、1ヶ月に2回投与される、項目17〜20のいずれか1項に記載の方法。
(項目23)
前記組成物が、1ヶ月に1回投与される、項目17〜20のいずれか1項に記載の方法。
(項目24)
前記1つ以上のmRNAが、1つ以上のナノ粒子内に封入される、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目25)
前記1つ以上のナノ粒子が、脂質またはポリマーベースのナノ粒子である、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記1つ以上のナノ粒子が、リポソームを含む、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記リポソームが、1つ以上のカチオン性脂質、1つ以上の非カチオン性脂質、1つ以上のコレステロールベースの脂質、及び1つ以上のPEG修飾脂質を含む、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記1つ以上のカチオン性脂質が、C12−200、MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、cKK−E12、ICE(イミダゾールベースの)、HGT5000、HGT5001、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMAならびにDMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin−K−DMA、DLin−K−XTC2−DMA、HGT4003、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記1つ以上のカチオン性脂質は、cKK−E12:
を含む、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記1つ以上の非カチオン性脂質が、DSPC(1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DPPC(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DOPE(1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOPC(1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホチジルコリン)、DPPE(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOPG(2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−(1’−rac−グリセロール))、及びこれらの組み合わせから選択される、項目27〜29のいずれか1項に記載の方法。
(項目31)
前記1つ以上のコレステロールベースの脂質が、コレステロールまたはペグ(PEG)化コレステロールである、項目27〜30のいずれか1項に記載の方法。
(項目32)
前記1つ以上のPEG修飾脂質が、C 6 〜C 20 の長さのアルキル鎖(複数可)を有する脂質に共有結合された最大5kDaの長さのポリ(エチレン)グリコール鎖を含む、項目27〜31のいずれか1項に記載の方法。
(項目33)
前記カチオン性脂質が、モル比で前記リポソームの約30〜70%を構成する、項目27〜32のいずれか1項に記載の方法。
(項目34)
前記リポソームが、cKK−E12、DOPE、コレステロール、及びDMG−PEG2Kを含む、項目27〜33のいずれか1項に記載の方法。
(項目35)
前記リポソームが、cKK−E12、DOPE、コレステロール、及びDMG−PEG2Kを、約50:25:20:5、50:20:25:5、50:27:20:3、40:30:20:10、40:30:25:5、または40:32:25:3の比で含む、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記リポソームが、C12−200、DOPE、コレステロール、及びDMG−PEG2Kを含む、項目27〜33のいずれか1項に記載の方法。
(項目37)
前記リポソームが、C12−200、DOPE、コレステロール、及びDMG−PEG2Kを、約50:25:20:5、50:20:25:5、50:27:20:3、40:30:20:10、40:30:25:5、または40:32:25:3の比で含む、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記リポソームが、HGT5001、DOPE、コレステロール、及びDMG−PEG2Kを含む、項目27〜33のいずれか1項に記載の方法。
(項目39)
前記リポソームが、HGT5001、DOPE、コレステロール、及びDMG−PEG2Kを、約50:25:20:5、50:20:25:5、50:27:20:3、40:30:20:10、40:30:25:5、または40:32:25:3の比で含む、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記ナノ粒子が、ポリマーベースのナノ粒子を含む、項目25に記載の方法。
(項目41)
前記ポリマーベースのナノ粒子が、PEIを含む、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記PEIが、分岐鎖PEIである、項目41に記載の方法。
(項目43)
前記ナノ粒子が、約40〜100nm未満のサイズを有する、項目24〜42のいずれか1項に記載の方法。
(項目44)
前記1つ以上のmRNAが、1つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目45)
前記1つ以上の修飾ヌクレオチドが、プソイドウリジン、N−1−メチル−プソイドウリジン、2−アミノアデノシン、2−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、3−メチルアデノシン、5−メチルシチジン、C−5プロピル−シチジン、C−5プロピニル−ウリジン、2−アミノアデノシン、C5−ブロモウリジン、C5−フルオロウリジン、C5−ヨードウリジン、C5−プロピニル−ウリジン、C5−プロピニル−シチジン、C5−メチルシチジン、2−アミノアデノシン、7−デアザアデノシン、7−デアザグアノシン、8−オキソアデノシン、8−オキソグアノシン、O(6)−メチルグアニン、及び/または2−チオシチジンを含む、項目44に記載の方法。
(項目46)
前記1つ以上のmRNAが、非修飾である、項目1〜43のいずれか1項に記載の方法。
本発明がより容易に理解されるために、特定の用語が先ず以下に定義される。以下の用語及びその他の用語についての追加の定義は、明細書全体を通して記載される。
本発明は、とりわけ、mRNA治療法に基づく、関節疾患、障害及び病状を治療するための方法及び組成物を提供する。特に、本発明は、治療を必要とする対象に、関節疾患、障害及び病状の治療に好適な1つ以上のポリペプチド(例えば、治療用ポリペプチド)をコードする1つ以上のmRNAを含む組成物を投与することによって、関節疾患、障害及び病状を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、1つ以上のmRNAは、1つ以上の脂質及び/またはポリマーベースのナノ粒子内に封入される。いくつかの実施形態において、1つ以上のmRNAは、1つ以上のリポソーム内に封入される。本明細書で使用される、用語「リポソーム」とは、あらゆるラメラ小胞、多重ラメラ小胞、または固体ナノ粒子小胞を指す。通常、本明細書で使用されるリポソームは、1つ以上の脂質を混合することによって、または1つ以上の脂質及びポリマー(複数可)を混合することによって形成することができる。いくつかの実施形態において、本発明に適したリポソームは、カチオン性脂質(複数可)、非カチオン性脂質(複数可)、コレステロール系脂質(複数可)、及びPEG修飾脂質(複数可)を含有する。
本発明は、関節疾患、障害または病状に冒されているかまたは感受性のある対象を治療するために用いることができる。本明細書で使用される「関節疾患、障害または病状」とは、関節、関節の構造及び/または関節運動に影響を及ぼす疾患、障害もしくは病状を指す。したがって、関節疾患、障害または病状は、関節(joint)疾患、障害または病状とも称される。関節疾患、障害または病状は、あらゆる種類の関節または関節のあらゆる構造を冒し得る。いくつかの実施形態において、関節の構造は、骨、靭帯、腱、軟骨、筋肉、滑液包、及び/または滑膜を含む。通常、本明細書に記載される関節疾患、障害または病状は、線維性関節、軟骨性関節、または滑膜関節を冒し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される関節疾患、障害または病状は、滑膜関節を冒す。
本発明は、関節疾患、障害または病状を治療するために適切であるあらゆるmRNAを送達するために用いることができる。様々な実施形態において、本発明は、関節疾患、障害または病状のいずれかにおいて欠乏しているタンパク質をコードするmRNAを送達するために用いることができる。このような実施形態において、mRNAの送達は、通常、タンパク質欠乏を治療するのに十分な関節におけるタンパク質発現及び/または活性の増加をもたらす。いくつかの実施形態において、本発明に好適なmRNAは、健康な関節中に通常存在する野生型または天然起源のタンパク質配列をコードすることができる。いくつかの実施形態において、本発明に好適なmRNAは、野生型または天然起源の配列であってもよい。いくつかの実施形態において、本発明に好適なmRNAは、コドン最適化配列であってもよい。本発明に好適なmRNAは、野生型または天然起源のアミノ酸のタンパク質配列と実質的に相同性または同一性を有する(例えば、野生型または天然起源の配列に対して少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%の配列同一性を有する)アミノ酸配列をコードしてもよい。
本発明に好適なmRNAは、様々な既知の方法のうちのいずれかに従って合成することができる。例えば、本発明に好適なmRNAは、インビトロ転写(IVT)を介して合成されてもよい。簡単に言うと、IVTは、通常、プロモーター、リボヌクレオチド三リン酸のプール、DTT及びマグネシウムイオンを含み得る緩衝系、ならびに適切なRNAポリメラーゼ(例えば、T3、T7またはSP6 RNAポリメラーゼ)、DNAse I、プロホスファターゼ、及び/またはRNAse阻害薬を含有する線状または環状DNA鋳型を用いて行われる。正確な条件は、特定の用途に準じて変化するであろう。
いくつかの実施形態において、本発明によるmRNAは、非修飾または修飾mRNAとして合成されてもよい。通常、mRNAは、安定性を増強させるために修飾される。mRNAの修飾は、例えば、RNAのヌクレオチドの修飾を含むことができる。したがって、本発明による修飾mRNAは、例えば、骨格修飾、糖修飾、または塩基修飾を含むことができる。いくつかの実施形態において、mRNAは、天然起源のヌクレオチド及び/またはヌクレオチド類似体(修飾ヌクレオチド)から合成することができ、これらとしては、プリン(アデニン(A)、グアニン(G))またはピリミジン(チミン(T)、シトシン(C)、ウラシル(U))、ならびに修飾ヌクレオチド類似体またはプリン及びピリミジンの誘導体として(例えば、1−メチル−アデニン、2−メチル−アデニン、2−メチルチオ−N−6−イソペンテニル−アデニン、N6−メチル−アデニン、N6−イソペンテニル−アデニン、2−チオ−シトシン、3−メチル−シトシン、4−アセチル−シトシン、5−メチル−シトシン、2,6−ジアミノプリン、1−メチル−グアニン、2−メチル−グアニン、2,2−ジメチル−グアニン、7−メチル−グアニン、イノシン、1−メチル−イノシン、プソイドウラシル(5−ウラシル)、ジヒドロ−ウラシル、2−チオ−ウラシル、4−チオ−ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオ−ウラシル、5−(カルボキシヒドロキシメチル)−ウラシル、5−フルオロ−ウラシル、5−ブロモ−ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル、5−メチル−2−チオ−ウラシル、5−メチル−ウラシル、N−ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、5−メチルアミノメチル−ウラシル、5−メトキシアミノエチル−2−チオ−ウラシル、5’−メトキシカルボニルメチル−ウラシル、5−メトキシ−ウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、1−メチル−プソイドウラシル、クエオシン、ベータ−D−マンノシル−クエオシン、ワイブトシン、ならびにホスホルアミデート、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホネート、7−デアザグアノシン、5−メチルシトシン及びイノシンなど)が挙げられるが、これらに限定されない。このような類似体の調製は、例えば、米国特許第4,373,071号、米国特許第4,401,796号、米国特許第4,415,732号、米国特許第4,458,066号、米国特許第4,500,707号、米国特許第4,668,777号、米国特許第4,973,679号、米国特許第5,047,524号、米国特許第5,132,418号、米国特許第5,153,319号、米国特許第5,262,530号、及び同第5,700,642号から、当業者に既知であり、これらの開示は、それらの全体が参考として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、mRNAは、5’キャップ構造を含む。5’キャップは、通常、以下のように付加される:最初に、RNA末端ホスファターゼが、2つの末端リン酸をそのまま残しながら、末端リン酸基を5’ヌクレオチドから除去し;次いでグアノシン三リン酸(GTP)が、グアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸塩に付加され、5’5’5三リン酸結合を生成し;次いで、グアニンの7−窒素が、メチルトランスフェラーゼによってメチル化される。キャップ構造の例としては、m7G(5’)ppp(5’(A,G(5’)ppp(5’)A及びG(5’)ppp(5’)Gが挙げられるが、これらに限定されない。
通常、「テール」の存在は、mRNAをエキソヌクレアーゼ分解から保護するように機能する。ポリAテールは、天然のメッセンジャーRNA及び合成センスRNAを安定化すると考えられている。したがって、ある特定の実施形態において、長いポリAテールがmRNAに付加され、これにより、RNAをより安定化させることが可能である。ポリAテールは、様々な当該技術分野で認識された技術を用いて付加することができる。例えば、長いポリAテールは、合成RNAに、またはポリAポリメラーゼを用いてインビトロで転写されたRNAに付加することができる(Yokoe,et al.,Nature Biotechnology.1996;14:1252−1256)。転写ベクターは、長いポリAテールをコードすることができる。加えて、ポリAテールは、PCR生成物からの転写によって直接的に付加することも可能である。ポリAは、RNAリガーゼによってセンスRNAの3’末端に連結されてもよい(例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd Ed.,Sambrook、Fritsch及びManiatis編集(Cold Spring Harbor Laboratory Press:1991 edition)を参照)。
いくつかの実施形態において、mRNAは、5’及び/または3’非翻訳領域を含む。いくつかの実施形態において、5’非翻訳領域は、mRNAの安定性または翻訳に影響を及ぼす1つ以上の要素、例えば鉄応答要素を含む。いくつかの実施形態において、5’非翻訳領域は、約50〜500個のヌクレオチドの長さであってもよい。
本発明によると、本明細書に記載されるmRNAは、裸の(naked)RNA(非パッケージ化)として、または送達担体を介して送達され得る。本明細書で使用される、用語「送達担体」、「移送担体」、「ナノ粒子」または文法上の等価物は、ほぼ同じ意味で用いられる。
いくつかの実施形態において、好適な送達担体は、リポソーム送達担体、例えば、脂質ナノ粒子である。本明細書で使用されるリポソーム送達担体、例えば脂質ナノ粒子は、通常、1つ以上の二層の膜によって外部の媒質から隔離された内部の水空間を有するごく小さい小胞である。リポソームの二層膜は、通常は、空間的に分離された親水性及び疎水性ドメインを含む、合成または天然起源の脂質などの両親媒性分子によって形成される(Lasic,Trends Biotechnol.,16:307−321,1998)。リポソームの二層膜は、両親媒性ポリマー及び界面活性剤によっても形成され得る(例えば、ポリマーソーム、ニオソームなど)。本発明の文脈において、リポソーム送達担体は、通常、所望のmRNAを標的細胞または組織に輸送するよう機能する。所望のmRNAをリポソーム中に組み込むプロセスは、しばしば「ローディング」と称される。例示的な方法は、参考として本明細書に組み込まれる、Lasic,et al.,FEBS Lett.,312:255−258,1992に記載されている。リポソームに組み込まれた核酸は、二層膜内のリポソームの内部空間中に完全にもしくは部分的に位置することができるか、またはリポソーム膜の外表面と結合することができる。核酸のリポソームへの組み込みは、核酸がリポソームの内部空間内に完全に封じ込められている「封入」とも称される。mRNAを、リポソームなどの移送担体中に組み込む目的は、多くの場合、核酸を、核酸の急激な排出を引き起こす、核酸及び/もしくは系または受容体を分解する酵素もしくは化学物質を含有し得る環境から保護するためである。したがって、いくつかの実施形態において、好適な送達担体は、その中に封じ込められたmRNAの安定性を増強することができ、及び/またはmRNAの標的細胞または組織への送達を容易にする。
いくつかの実施形態において、リポソームは、1つ以上のカチオン性脂質を含んでもよい。本明細書で使用される、フレーズ「カチオン性脂質」とは、生理的pHなどの選択されたpHにおいて正味の正電荷を有する多くの脂質種のうちのいずれかを指す。数種のカチオン性脂質が、文献に記載されており、それらの多くは市販されている。本発明の組成物及び方法において使用するために特に好適なカチオン性脂質としては、国際特許公開第WO2010/053572号(特に、段落[00225]に記載されたCI2−200)及び同第WO2012/170930号に記載されており、これらのどちらも参考として本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態において、本発明宇の組成物及び方法は、2012年3月29出願の米国仮特許出願第61/617,468号(参考として本明細書に組み込まれる)に記載されたイオン化可能なカチオン性脂質を含有する脂質ナノ粒子を使用し、このイオン化可能なカチオン性脂質は、例えば、(15Z,18Z)−N,N−ジメチル−6−(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イル)テトラコサ−15,18−ジエン−1−アミン(HGT5000)、(15Z,18Z)−N,N−ジメチル−6−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イル)テトラコサ−4,15,18−トリエン−1−アミン(HGT5001)、及び(15Z,18Z)−N,N−ジメチル−6−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イル)テトラコサ−5,15,18−トリエン−1−アミン(HGT5002)などである。
各R2は、独立して、水素またはC1〜3アルキルであり;
各qは、独立して、2〜6であり;
各R’は、独立して、水素またはC1〜3アルキルであり;
各RLは、独立して、C8〜12アルキルである。
いくつかの実施形態において、提供されるリポソームは、1つ以上の非カチオン性(「ヘルパー」)脂質を含有する。本明細書で使用される、フレーズ「非カチオン性脂質」とは、あらゆる中性、両性イオン性、またはアニオン性脂質を指す。本明細書で使用される、フレーズ「アニオン性脂質」とは、生理的pHなどの選択されたpHにおいて正味の負電荷を担持する多くの脂質種のうちのいずれかを指す。非カチオン性脂質としては、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン(POPE)、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシレート(DOPE−mal)、ジパルミトイル−ホスファチジル−エタノールアミン(DPPE)、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン(DSPE)、16−O−モノメチルPE、16−O−ジメチルPE、18−1−トランスPE、1−ステアロイル−2−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン(SOPE)、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、提供されるリポソームは、1つ以上のコレステロールベースの脂質を含む。例えば、好適なコレステロールベースのカチオン性脂質としては、例えば、DC−Choi(N,N−ジメチル−N−エチルカルボキサミドコレステロール)、1,4−ビス(3−N−オレイルアミノ−プロピル)ピペラジン(Gao,et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991);Wolf et al.,Bio Techniques 23,139(1997);米国特許第5,744,335号)、またはICEが挙げられる。いくつかの実施形態において、コレステロールベースの脂質は、リポソーム中に存在する全脂質の約2%〜約30%、または約5%〜約20%のモル比を含む。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子中のコレステロールベースの脂質の割合は、5%超、10%超、20%超、30%超、または40%超であってもよい。
いくつかの実施形態において、提供されるリポソームは、1つ以上のPEG化脂質を含む。例えば、ポリエチレングリコール(PEG)修飾リン脂質、及びN−オクタノイル−スフィンゴシン−1−[スクシニル(メトキシポリエチレングリコール)−2000](C8 PEG−2000セラミド)を含む誘導体化セラミド(PEG−CER)などの誘導体化脂質の使用も、カチオン性脂質の1つ以上、いくつかの実施形態においては、リポソームを構成する他の脂質と共に組み合わせて、本発明により企図される。考えられるPEG−修飾脂質としては、C6〜C20の長さのアルキル鎖(複数可)を有する脂質に共有結合された最大5kDaの長さのポリエチレングリコール鎖が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、PEG修飾またはPEG化脂質は、ペグ化コレステロールまたはPEG−2Kである。このような成分の付加は、複合体の凝集を予防することができ、循環寿命を増加させ、脂質−核酸組成物の標的細胞への送達を増大させるための手段も提供することができ(Klibanov et al.(1990)FEBS Letters,268(1):235−237)、あるいはこれらの成分は、インビボでの製剤からの迅速な交換を行うよう選択されてもよい(米国特許第5,885,613号を参照)。
いくつかの実施形態において、好適な送達担体は、ポリマーをキャリアとして、単独でまたは本明細書に記載される様々な脂質を含む他のキャリアと組み合わせて用いて製剤化される。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書で使用されるリポソーム送達担体は、ポリマー含有ナノ粒子も包含する。好適なポリマーとしては、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド−ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルジネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、プロタミン、PEG化プロタミン、PLL、PEG化PLL、及びポリエチレンイミン(PEI)を挙げることができる。PEIが存在するとき、これは、10〜40kDAの範囲の分子量の分岐鎖PEI、例えば、25kDaの分岐鎖PEI(Sigma#408727)であってもよい。
本発明において使用するためのリポソーム移送担体は、現在、当該技術分野において既知である様々な技術によって調製することができる。提供される組成物において使用するためのリポソームは、現在、当該技術分野において既知である様々な技術によって調製することができる。例えば、多層ラメラ小胞(MLV)は、選択された脂質を、脂質を適切な溶媒中に溶解することによって、好適なコンテナまたは容器の内壁上に堆積させ、次いで溶媒を蒸発させ、容器の内側に薄膜を残すことによって、またはスプレー乾燥によってなど、従来の技術に従って調製されてもよい。次いで、水相が、渦運動を用いて容器に添加され、これにより、MLVの形成をもたらすことができる。次いで、多層ラメラ小胞のホモジナイゼ―ションョン、超音波処理または押出によって、単層ラメラ小胞(ULV)を形成することができる。加えて、単層ラメラ小胞は、洗浄剤除去技術によって形成することも可能である。
本発明による好適なリポソームまたは他のナノ粒子は、様々なサイズに作製されてもよい。本明細書で使用される、用語「サイズ」は、ナノ粒子と関連付けて使用される場合、ナノ粒子の最大直径を意味する。いくつかの実施形態において、好適なナノ粒子は、約100nm以下のサイズ(例えば、約90nm以下、80nm以下、70nm以下、60nm以下、50nm以下、40nm以下、30nm以下、または20nm以下のサイズ)を有する。いくつかの実施形態ナノ粒子は、約60nm以下のサイズ(例えば、約55nm以下の、約50nm以下の、約45nm以下の、約40nm以下の、約35nm以下の、約30nm以下の、または25nm以下のサイズ)を有する。いくつかの実施形態において、好適なナノ粒子は、約10〜100nmの範囲の(例えば、約10〜90nm、10〜80nm、10〜70nm、10〜60nm、10〜50nm、10〜40nm、または10〜30nmの範囲の)サイズを有する。
インビボにおけるmRNAの発現を容易にするために、リポソームなどの送達担体は、1つ以上の核酸、キャリア、標的化リガンドまたは安定化剤と組み合わせて、あるいは送達担体が好適な賦形剤と混合されている医薬組成物で製剤化することができる。薬物の製造か及び投与のための技術は、「Remington’s Pharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,latest editionで見ることができる。
本実施例は、インビボでのmRNAの有効な送達及び発現のための例示的なリポソーム製剤を提供する。
本明細書に記載される製剤は、様々な核酸ベースの材料を封入するように設計された、1つ以上の脂質、ヘルパー脂質及びペグ化脂質を使用する、様々な比率の多成分脂質混合物に基づく。カチオン性脂質としては、(ここに列記されるものに限られるものではないが)DOTAP(1,2−ジオレイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン)、DODAP(1,2−ジオレイル−3−ジメチルアンモニウムプロパン)、DOTMA(1,2−ジ−O−オクタデセニル−3−トリメチルアンモニウムプロパン)、DLinDMA(Heyes,J.;Palmer,l.;Bremner,K.;MacLachlan,I.“Cationic lipid saturation influences intrasellular delivery of encapsulated nucleic acids”J.Contr.Rel.2005,107,276−287)、DLin−KC2−DMA(Semple,S.C.et al.“Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery” Nature Biotech.2010,28,172−176)、C12−200(Love,K.T.et al.“Lipid−like materials for low−dose in vivo gene silencing”PNAS 2010, 107,1864−1869)、cKK−E12(3,6−ビス(4−ビス(2−ヒドロキシドデシル)アミノ)ブチル)ピペラジン−2,5−ジオン)、HGT5000、HGT5001、HGT4003、ICE、ジアルキルアミノベース、イミダゾールベース、グアニジンベースなどを挙げることができる。ヘルパー脂質としては、(ここに列記されるものに限られるものではないが)DSPC(1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、DPPC(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、DOPE(1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOPC(1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスフホコリン、DPPE(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOPG(1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOPG(1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−(1’−rac−グリセロール))、コレステロールなどを挙げることができる。PEG化脂質としては、(これに限られるものではないが)C6〜C20の長さのアルキル鎖(複数可)を有する脂質に共有結合された最大5kDaの長さのポリ(エチレン)グリコール鎖を挙げることができる。ポリエチレンイミンは、直鎖または分岐鎖であり得る。分岐鎖PEIについては、25kDaが好ましいが、これに限られるものではない。
コドン最適化ホタルルシフェラーゼ(FFL)のメッセンジャーRNAを、この遺伝子をコードするプラスミドDNA鋳型からのインビトロ転写によって合成し、その後、5’キャップ構造の付加(Fechter,P.; Brownlee,G.G.“Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins”J.Gen.Virology 2005, 86,1239−1249)及びゲル電気泳動によって決定されるおよそ250個のヌクレオチドの長さの3’ポリ(A)テールの付加を行った。各mRNA生成物中に存在する5’及び3’非翻訳領域を、それぞれX及びYと表し、記載したように定義した(下記参照)。
コドン最適化ホタルルシフェラーゼ(FFL)mRNA:
XAUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAUCGCCUUUACCGACGCACAUAUCGAGGUGGACAUUACCUACGCCGAGUACUUCGAGAUGAGCGUUCGGCUGGCAGAAGCUAUGAAGCGCUAUGGGCUGAAUACAAACCAUCGGAUCGUGGUGUGCAGCGAGAAUAGCUUGCAGUUCUUCAUGCCCGUGUUGGGUGCCCUGUUCAUCGGUGUGGCUGUGGCCCCAGCUAACGACAUCUACAACGAGCGCGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCCAGCCCACCGUCGUAUUCGUGAGCAAGAAAGGGCUGCAAAAGAUCCUCAACGUGCAAAAGAAGCUACCGAUCAUACAAAAGAUCAUCAUCAUGGAUAGCAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAAAGCAUGUACACCUUCGUGACUUCCCAUUUGCCACCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGUGCCCGAGAGCUUCGACCGGGACAAAACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGUAGUGGCAGUACCGGAUUGCCCAAGGGCGUAGCCCUACCGCACCGCACCGCUUGUGUCCGAUUCAGUCAUGCCCGCGACCCCAUCUUCGGCAACCAGAUCAUCCCCGACACCGCUAUCCUCAGCGUGGUGCCAUUUCACCACGGCUUCGGCAUGUUCACCACGCUGGGCUACUUGAUCUGCGGCUUUCGGGUCGUGCUCAUGUACCGCUUCGAGGAGGAGCUAUUCUUGCGCAGCUUGCAAGACUAUAAGAUUCAAUCUGCCCUGCUGGUGCCCACACUAUUUAGCUUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUACGACCUAAGCAACUUGCACGAGAUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGGAGGUAGGUGAGGCCGUGGCCAAACGCUUCCACCUACCAGGCAUCCGCCAGGGCUACGGCCUGACAGAAACAACCAGCGCCAUUCUGAUCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCUGGCGCAGUAGGCAAGGUGGUGCCCUUCUUCGAGGCUAAGGUGGUGGACUUGGACACCGGUAAGACACUGGGUGUGAACCAGCGCGGCGAGCUGUGCGUCCGUGGCCCCAUGAUCAUGAGCGGCUACGUUAACAACCCCGAGGCUACAAACGCUCUCAUCGACAAGGACGGCUGGCUGCACAGCGGCGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCACUUCUUCAUCGUGGACCGGCUGAAGAGCCUGAUCAAAUACAAGGGCUACCAGGUAGCCCCAGCCGAACUGGAGAGCAUCCUGCUGCAACACCCCAACAUCUUCGACGCCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACGACGAUGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCGUCGUGCUGGAACACGGUAAAACCAUGACCGAGAAGGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUUACAACCGCCAAGAAGCUGCGCGGUGGUGUUGUGUUCGUGGACGAGGUGCCUAAAGGACUGACCGGCAAGUUGGACGCCCGCAAGAUCCGCGAGAUUCUCAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUCGCCGUGUAAY[配列番号1]
5’及び3’UTR配列
X(5’UTR配列)=
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG[配列番号2]
Y(3’UTR配列)=
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU[配列番号3]
または
GGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAAGCU(配列番号4)
A.cKK−E12
cKK−E12、DOPE、コレステロール、及びDMG−PEG2Kの50mg/mLのエタノール溶液のアリコートを混合し、エタノールで希釈し、3mLの最終容量にした。別に、FFL mRNAの水性緩衝溶液(10mMのクエン酸/150mMのNaCl、pH4.5)を、1mg/mLの保存液から調製した。脂質溶液を、水性mRNA溶液に迅速に注入し、振盪して、20%エタノール中の最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、1×PBS(pH7.4)で透析し、濃縮して、2〜8℃で保存した。最終濃度=1.0mg/mLのFFL mRNA(封入された)。Zave=78nm;PDI:0.13。
C12−200、DOPE、コレステロール、及びDMG−PEG2Kの50mg/mLのエタノール溶液のアリコートを混合し、エタノールで希釈し、3mLの最終容量にした。別に、FFL mRNAの水性緩衝溶液(10mMのクエン酸/150mMのNaCl、pH4.5)を、1mg/mLの保存液から調製した。脂質溶液を、水性mRNA溶液に迅速に注入し、振盪して、20%エタノール中の最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、1×PBS(pH7.4)で透析し、濃縮して、2〜8℃で保存した。最終濃度=0.82mg/mLのFFL mRNA(封入された)。Zave=83nm;PDI:0.13。
HGT5001、DOPE、コレステロール、及びDMG−PEG2Kの50mg/mLのエタノール溶液のアリコートを混合し、エタノールで希釈し、3mLの最終容量にした。別に、FFL mRNAの水性緩衝溶液(10mMのクエン酸/150mMのNaCl、pH4.5)を、1mg/mLの保存液から調製した。脂質溶液を、水性mRNA溶液に迅速に注入し、振盪して、20%エタノール中の最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、1×PBS(pH7.4)で透析し、濃縮して、2〜8℃で保存した。最終濃度=1.0mg/mLのFFL mRNA(封入された)。Zave=80nm;PDI:0.13。
1.34mg/mL(pH5.0)の濃度の25kDaの分岐鎖PEI溶液を、等量のFFL mRNA(1.0mg/ml)と混合した。得られた製剤を2〜8℃で保存した。最終濃度=0.50mg/mLのFFL mRNA。
本実施例は、FFL mRNAの投与が、インビボでタンパク質産生を成功裏にもたらすことを立証する。
コドン最適化FFL mRNAをローディングした脂質を介してのホタルルシフェラーゼタンパク質の産生を、単回ボーラス関節内注射として、CD−1マウスで試験した。図1A〜4Cは、IVISイメージャを用いて、インビボ生物発光イメージングを介して検出された発光を表す。このような発光は、FFL mRNAナノ粒子の野生型マウスにおける注射後24時間で測定した。表1は、ルシフェリン投与後の発光値を表す(全発光束(光子数/秒)、ルシフェリン後10分)。注射後24時間でマウスをトサツし、臓器を回収した(上記記載の通りに)。
当業者であれば、日常的な実験を用いるだけで、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識し、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記説明に限定するように意図されておらず、むしろ、以下の特許請求の範囲に記載されている。
Claims (39)
- 1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上のメッセンジャーRNA(mRNA)を含む、関節において1つ以上のmRNAによってコードされる1つ以上のポリペプチドを発現させるための組成物であって、前記組成物は、対象の前記関節に投与され、前記mRNAが関節内送達されることを特徴とし、
ここで、前記1つ以上のmRNAは、リポソームを含む1つ以上のナノ粒子内に封入され、前記リポソームは、1つ以上のカチオン性脂質、1つ以上の非カチオン性脂質、1つ以上のコレステロールベースの脂質、及び1つ以上のPEG修飾脂質を含み、前記組成物の投与は、1つ以上のmRNAによってコードされる前記1つ以上のポリペプチドの前記関節における少なくとも6時間にわたる発現をもたらすことを特徴とする、組成物。 - 前記組成物が、前記関節に局所的に投与されることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記関節が、線維性関節、軟骨性関節、または滑膜関節である、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記関節が、滑膜関節である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物が、前記滑膜関節の滑膜腔に直接投与される、請求項4に記載の組成物。
- 前記1つ以上のポリペプチドの前記発現及び/または活性が、軟骨、靭帯、筋肉、滑膜内膜細胞、軟骨細胞、及び/または前記関節の滑液において検出されることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1つ以上のポリペプチドの前記発現及び/または活性が、投与後、少なくとも約6時間、12時間、18時間、24時間、2日、3日、4日、5日、6日、1週、2週、3週、4週、または1ヶ月で検出可能である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1つ以上のmRNAのそれぞれが、約0.5kb、1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、または15kbを超える長さを有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1つ以上のmRNAによってコードされる前記1つ以上のポリペプチドが、関節内で正常に機能する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1つ以上のmRNAによってコードされる前記1つ以上のポリペプチドが、抗炎症性である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1つ以上のmRNAが、抗体をコードする、請求項1〜10のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記抗体が、完全型免疫グロブリン、(Fab)2、(Fab’)2、Fab、Fab’、またはscFvである、請求項11に記載の組成物。
- 前記1つ以上のmRNAが、抗体重鎖、軽鎖、またはそれらの断片をコードする、請求項11または12に記載の組成物。
- 前記組成物が、それぞれ抗体重鎖及び軽鎖をコードする2つの別個のmRNAを含む、請求項11〜13のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1つ以上のmRNAによってコードされる前記抗体が、抗TNFα抗体、抗IL−6抗体、抗IL−1β抗体、抗sTNFR−I抗体、抗−sTNFR−II抗体、抗IL−2抗体、抗IFN−γ抗体、抗IL−18抗体、抗IL−12抗体、または抗IL−12p40抗体である、請求項11〜14のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1つ以上のmRNAが、可溶性受容体をコードする、請求項1〜15のいずれか1項に記載の組成物。
- 関節疾患、障害、または病状を治療するための、請求項1〜16のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記関節疾患、障害、または病状は、炎症性疾患、障害、または病状である、請求項17に記載の組成物。
- 前記炎症性疾患、障害、または病状が、関節炎である、請求項18に記載の組成物。
- 前記炎症性疾患、障害、または病状が、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、痛風、偽性痛風、腱炎、滑液包炎、手根管症候群、骨関節炎、滑膜炎、脊椎炎、アミロイドーシス、腰部脊椎管狭窄症、及び/または仙腸関節機能障害からなる群から選択される、請求項18または19に記載の組成物。
- 前記組成物が、1週間に1回投与されることを特徴とする、請求項17〜20のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物が、1ヶ月に2回投与されることを特徴とする、請求項17〜20のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物が、1ヶ月に1回投与されることを特徴とする、請求項17〜20のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1つ以上のカチオン性脂質が、C12−200、MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、cKK−E12、ICE(イミダゾールベースの)、HGT5000、HGT5001、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMAならびにDODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、DLin−K−XTC2−DMA、HGT4003、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1〜23のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1つ以上のカチオン性脂質は、cKK−E12:
を含む、請求項24に記載の組成物。 - 前記1つ以上の非カチオン性脂質が、DSPC(1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DPPC(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DOPE(1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOPC(1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホチジルコリン)、DPPE(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOPG(2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−(1’−rac−グリセロール))、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項23〜25のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1つ以上のコレステロールベースの脂質が、コレステロールまたはペグ(PEG)化コレステロールである、請求項23〜25のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1つ以上のPEG修飾脂質が、C6〜C20の長さのアルキル鎖(複数可)を有する脂質に共有結合された最大5kDaの長さのポリ(エチレン)グリコール鎖を含む、請求項23〜27のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記カチオン性脂質が、モル比で前記リポソームの約30〜70%を構成する、請求項23〜28のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記リポソームが、cKK−E12、DOPE、コレステロール、及びDMG−PEG2Kを含む、請求項23〜29のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記リポソームが、cKK−E12、DOPE、コレステロール、及びDMG−PEG2Kを、約50:25:20:5、50:20:25:5、50:27:20:3、40:30:20:10、40:30:25:5、または40:32:25:3の比で含む、請求項30に記載の組成物。
- 前記リポソームが、C12−200、DOPE、コレステロール、及びDMG−PEG2Kを含む、請求項23〜29のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記リポソームが、C12−200、DOPE、コレステロール、及びDMG−PEG2Kを、約50:25:20:5、50:20:25:5、50:27:20:3、40:30:20:10、40:30:25:5、または40:32:25:3の比で含む、請求項32に記載の組成物。
- 前記リポソームが、HGT5001、DOPE、コレステロール、及びDMG−PEG2Kを含む、請求項23〜29のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記リポソームが、HGT5001、DOPE、コレステロール、及びDMG−PEG2Kを、約50:25:20:5、50:20:25:5、50:27:20:3、40:30:20:10、40:30:25:5、または40:32:25:3の比で含む、請求項34に記載の組成物。
- 前記ナノ粒子が、約40〜100nm未満のサイズを有する、請求項1〜23のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1つ以上のmRNAが、1つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜36のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1つ以上の修飾ヌクレオチドが、プソイドウリジン、N−1−メチル−プソイドウリジン、2−アミノアデノシン、2−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、3−メチルアデノシン、5−メチルシチジン、C−5プロピル−シチジン、C−5プロピニル−ウリジン、2−アミノアデノシン、C5−ブロモウリジン、C5−フルオロウリジン、C5−ヨードウリジン、C5−プロピニル−ウリジン、C5−プロピニル−シチジン、C5−メチルシチジン、2−アミノアデノシン、7−デアザアデノシン、7−デアザグアノシン、8−オキソアデノシン、8−オキソグアノシン、O(6)−メチルグアニン、及び/または2−チオシチジンを含む、請求項37に記載の組成物。
- 前記1つ以上のmRNAが、非修飾である、請求項1〜36のいずれか1項に記載の組成物。
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