JP6762296B2 - ポリマー及びポリマーを含むコンジュゲート - Google Patents
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Description
本願は、2015年10月20日に出願された米国仮特許出願第62/059073号及び2015年9月1日に出願された米国仮特許出願第62/212879号の出願日の利益を主張するものである。以上の仮出願の開示内容は、本明細書中に参照により援用される。
(式中、「オリゴ」は、1から約50ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は70℃未満のTmを有し;「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から32個の炭素原子を有し;「リンカー」は、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよ、く、4から18個の炭素原子を有する分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり;「標識」は、ハプテン、フルオロフォア、色素原、酵素、及び量子ドットからなる群から選択され;Rは、末端基であり(非限定的な例は水素、ヒドロキシル基、カルボニル基、アミノ基、リン酸基、ホスホジエステル基又はカチオンを含む);Tは、末端反応性部分を有する基であり;xは、1又は2であり;yは、0、1又は2であり;zは、1から18の整数であり;mは、0、1又は2であり;nは、1又は2であり;aは、1から8の整数であり;bは、1又は2である)のポリマーであって、「オリゴ」、「スペーサー」、「リンカー」又は「標識」のいずれも、相互に直接又は任意の基(例えばリン酸基又はホスホジエステル基)を介して結合され得;yが0の場合、[スペーサー]が結合であり、mが0の場合、[リンカー]が結合である)
のポリマーがある。式(V)のポリマーのいくつかの実施態様において、Tの末端反応性部分は、アミノ基、カルボキシル基若しくはスルフヒドリル基又は特異的結合実体にカップリングし得る他の基である。いくつかの実施態様では、「オリゴ」は、2から約50ヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、「オリゴ」は、2から約24ヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、「オリゴ」は、4から約24ヌクレオチドを含み;xは、1であり;yは、1であり;且つaは、1又は2である。yがゼロで[スペーサー]が結合である実施態様では、[リンカー]は、存在する場合、直接又は任意の基(例えばリン酸基又はホスホジエステル基)を介して[オリゴ]にカップリング又は結合されている。mがゼロで[リンカー]が結合である実施態様では、[標識]は、直接又は任意の基(例えばリン酸基又はホスホジエステル基)を介して[スペーサー]にカップリング又は結合されている。yがゼロであり、mもゼロである実施態様では、[標識]は、直接又は任意の基(例えばリン酸基又はホスホジエステル基)を介して[オリゴ]に結合されている。
(式中、d及びeは、1から32の整数であり;Qは、結合、O、S又はN(Rc)(Rd)であり;Ra及びRbは、独立してH、C1−C4のアルキル基、F、Cl、N(Rc)(Rd)であり;Rc及びRdは、独立してCH3又はHである)
の構造を有する。いくつかの実施態様では、Ra及びRbは、Hであり;Qは、Oであり;dは、1から4であり;eは、2から8である。いくつかの実施態様では、Ra及びRbは、Hであり;Qは、Oであり;dは、2であり;eは、2から8である。いくつかの実施態様では、「スペーサー」は、正味の正電荷を有する。
(式中、d及びeは、1から32の整数であり;Qは、結合、O、S又はN(Rc)(Rd)であり;Ra及びRbは、独立してH、C1−C4のアルキル基、F、Cl、N(Rc)(Rd)であり;Rc及びRdは、独立してCH3又はHである)
の構造を有する。いくつかの実施態様では、「リンカー」は、ポリ(アルキレン)グリコールに由来する。
(式中、「オリゴ」は、1から約32ヌクレオチドを有する一本鎖オリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は70℃未満のTmを有し;「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から24個の炭素原子を有し;「リンカー」は、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から18個の炭素原子を有する脂肪族基であり;「標識」は、ハプテン、フルオロフォア、及び量子ドットからなる群から選択され;Rは末端基であり(非限定的な例は水素、ヒドロキシル基、カルボニル基、アミノ基、リン酸基、ホスホジエステル基又はカチオンを含む);Tは、抗体にカップリングし得る末端反応性部分を有する基であり;xは、1又は2であり;yは、0、1又は2であり;mは、0、1又は2であり;nは、1又は2であり;zは、1から18の整数であり;aは、1から8の整数であり;bは、1又は2である)の構造を有し、「オリゴ」、「スペーサー」又は「リンカー」のいずれも、相互に直接、又は任意の基(例えばリン酸基又はホスホジエステル基)を介して結合され得;yが0の場合、[スペーサー]が結合であり、mが0の場合、[リンカー]が結合である。yがゼロで[スペーサー]が結合である実施態様では、[リンカー]は、存在する場合、直接又は任意の基(例えばリン酸基又はホスホジエステル基)を介して[オリゴ]にカップリング又は結合されている。mがゼロで[リンカー]が結合である実施態様では、[標識]は、直接又は任意の基(例えばリン酸基又はホスホジエステル基)を介して[スペーサー]にカップリング又は結合されている。yがゼロであり、mもゼロである実施態様では、[標識]は、直接又は任意の基(例えばリン酸基又はホスホジエステル基)を介して[オリゴ]に結合されている。
(式中、「オリゴ」は、1から約32ヌクレオチドを有する一本鎖オリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は70℃未満のTmを有し;「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から24個の炭素原子を有し;「リンカー」は、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から18個の炭素原子を有する脂肪族基であり;「標識」は、ハプテン、フルオロフォア、及び量子ドットからなる群から選択され;「特異的結合実体」は、抗体、抗体断片、核酸又は薬物/抗体コンジュゲートであり;Rは、末端基であり(非限定的な例は水素、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボニル基、リン酸基、ホスホジエステル基又はカチオンを含む);xは、1又は2であり;yは、0、1又は2であり;mは、0、1又は2であり;nは、1又は2であり;zは、1から18の整数であり;aは、1から8の整数であり;bは、1から8の整数である)による二以上の異なるコンジュゲートであって、「オリゴ」、「スペーサー」又は「リンカー」のいずれも、相互に直接、又は任意の基を介して結合され得;yが0の場合、[スペーサー]が結合であり;mが0の場合、[リンカー]が結合であり、各々が試料内の異なる標的に特異的に結合し、異なる標識を含むコンジュゲートと、ホルマリン固定パラフィン包埋試料(例えば組織試料)とを接触させること;異なる抗体コンジュゲートの標識に特異的で、それぞれが異なる検出可能な部分を含む検出試薬と試料とを接触させること;及び異なる検出可能な部分を用いて複数の標的を検出することを含む、試料中の複数の標的を検出するための方法がある。いくつかの実施態様では、検出試薬の検出可能な部分は、有機染料、フルオロフォア、酵素、量子ドット又はハプテンからなる群から選択される。いくつかの実施態様では、試料内の異なる標的の量は、検出可能な標識からのシグナル出力に基づいて定量化される。いくつかの実施態様では、この方法は、定量化された標的に基づいて試料をスコアリングする工程をさらに含む。
(式中、「オリゴ」は、1から約32ヌクレオチドを有する一本鎖オリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は70℃未満のTmを有し;「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から24個の炭素原子を有し;「リンカー」は、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から18個の炭素原子を有する脂肪族基であり;「標識」は、ハプテン、フルオロフォア、及び量子ドットからなる群から選択され;「特異的結合実体」は、抗体、抗体断片、核酸又は薬物/抗体コンジュゲートであり;Rは末端基であり(非限定的な例は水素、ヒドロキシル基、カルボニル基、アミノ基、リン酸基、ホスホジエステル基又はカチオンを含む);xは、1又は2であり;yは、0、1又は2であり;mは、0、1又は2であり;nは、1又は2であり;aは、1から8の整数であり;bは、1又は2であり;zは、1から18の整数である)のコンジュゲートであって、「オリゴ」、「スペーサー」又は「リンカー」のいずれも、相互に直接、又は任意の基を介して結合され得;yが0の場合、[スペーサー]が結合であり;mが0の場合、[リンカー]が結合であるコンジュゲートがある。yがゼロで[スペーサー]が結合である実施態様では、[リンカー]は、存在する場合、直接又は任意の基(例えばリン酸基又はホスホジエステル基)を介して[オリゴ]にカップリング又は結合されている。mがゼロで[リンカー]が結合である実施態様では、[標識]は、直接又は任意の基(例えばリン酸基又はホスホジエステル基)を介して[スペーサー]にカップリング又は結合されている。yがゼロであり、mもゼロである実施態様では、[標識]は、直接又は任意の基(例えばリン酸基又はホスホジエステル基)を介して[オリゴ]に結合されている。いくつかの実施態様では、任意の「スペーサー」の少なくとも4個の炭素原子、又は4個の炭素原子とヘテロ原子との組み合わせが、ポリマー骨格の一部を含む。
(式中、d及びeは、1から32の整数であり;Qは、結合、O、S又はN(Rc)(Rd)であり;Ra及びRbは、独立してH、C1−C4のアルキル基、F、Cl、N(Rc)(Rd)であり;Rc及びRdは、独立してCH3又はHである)
の構造を有する。いくつかの実施態様では、Ra及びRbは、Hであり;Qは、Oであり;dは、1から4であり;eは、2から8である。いくつかの実施態様では、Ra及びRbは、Hであり;Qは、Oであり;dは、2であり;eは、2から8である。いくつかの実施態様では、「スペーサー」は、正味の正電荷を有する。
(式中、d及びeは、1から32の整数であり;Qは、結合、O、S又はN(Rc)(Rd)であり;Ra及びRbは、独立してH、C1−C4のアルキル基、F、Cl、N(Rc)(Rd)であり;Rc及びRdは、独立してCH3又はHである)
の構造を有する。いくつかの実施態様では、「リンカー」は、ポリ(アルキレン)グリコールに由来する。
の少なくとも二のポリマーを含む、式(IVb):
(式中、[A]は、オリゴヌクレオチド配列と任意のスペーサーとを含むポリマー骨格であり;[B]は、直接又は任意のリンカーを介してポリマー骨格に付着した標識を含み;aは、1から8の整数であり;bは、1から8の整数であり;zは、1から24の整数であり;Rは、水素、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボニル基、リン酸基、ホスホジエステル基又はカチオンであり;特異的結合実体は、抗体、抗体断片、核酸又は薬物/抗体複合体/コンジュゲートである)のコンジュゲートが存在する。いくつかの実施態様では、[A]の長さ又はサイズは、約8nmから約12nmである。いくつかの実施態様では、前記の長さ又はサイズは、約10nm未満である。いくつかの実施態様では、aは、1又は2であり;bは、1又は2であり;zは、3、4、5又は9から選択される整数である。いくつかの実施態様では、a:bの比は、1:1である。他の実施態様では、a:bの比は、2:1である。さらに他の実施態様では、a:bの比は、3:1である。いくつかの実施態様では、特異的結合実体当たりのポリマーの数は、約2から約5である。他の実施態様では、特異的結合実体当たりのポリマーの数は、約2から約4である。いくつかの実施態様では、[A]の構成成分及び[B]に対して[A]が繰り返される回数は、骨格に付着した標識が抗標識抗体である二次抗体の抗原結合部位間の距離に近似する距離を相互に空けるように最適化される。
本開示は、ハプテンなどの標識用担体として役立つ新規なポリマーに関する。開示されたポリマーの一又は複数は、それ自体、本明細書に開示の抗体コンジュゲートなどのコンジュゲートを形成するために、抗体などの特異的結合実体にカップリングされ得る。
(式中、Aはオリゴヌクレオチド配列及び任意のスペーサー(「ポリマー骨格」)を含み、Bは標識及び任意のリンカーを含み;aは1から8の整数であり、bは1又は2であり、zは1から24の整数である)
の構造を有し得る。式(I)に示すように、A及びBは繰り返し基であり、式(I)のポリマーは末端反応性基(例えばアミノ基、カルボキシル基又はスルフヒドリル基)で5’末端で終結してもよく、末端基で3’末端で終結してもよい(末端基の非限定的な例には、水素、ヒドロキシル基、カルボニル基、アミノ基、リン酸基、ホスホジエステル基又はカチオンが含まれる)。任意の基[A]又は[B]、あるいは[A]又[B]を含む任意の成分若しくは構成成分は、相互に直接、又は当業者に知られている任意の基、例えばリン酸基又はホスホジエステル基を介して結合され得る。例えば、「標識」は、スペーサー又は[リンカー]が存在しない場合、[オリゴ]及び[標識]を架橋する基を介して[オリゴ]基に結合され得、このような基は当業者には知られており、限定されないが、リン酸基又はホスホジエステル基を含む。いくつかの実施態様では、式(I)のa:bの比は、1:1、2:1、1:2又は3:1である。いくつかの実施態様では、[A]のサイズ又は長さは、約8nmから約12nmである。他の実施態様では、[A]のサイズ又は長さは、約8nm未満である。他の実施態様では、[A]のサイズ又は長さにより、[B]を含む標識が、抗体(例えば標識に特異的で、その標識を検出するために使用される二次抗体)の抗原結合部位間の距離に近似する間隔を空けることを可能にする。いくつかの実施態様では、[A]は、正味の中性電荷(neutral charge)(例えば正に荷電したスペーサー成分によりほぼ中和され、負に荷電したオリゴヌクレオチド配列)を含む。
(式中、「オリゴ」は、1から約50ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列(例えば一本鎖又は二本鎖)であり、オリゴヌクレオチド配列は70℃未満のTmを有し;「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基で、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から32個の炭素原子を有し;xは1又は2であり、yは0、1又は2である)
の構造を有する。yが0である実施態様では、[スペーサー]は結合であり、隣接する[オリゴ]基及び/又は[B]基(「標識」及び/又は「リンカー」)を[オリゴ]にカップリングすることができる。いくつかの実施態様では、xは1であり、yは1である。他の実施態様では、xは1であり、yは1である。さらに他の実施態様ではxは1であり、yは2である。
(式中、「リンカー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有し、4から18個の炭素原子を有してもよく;「標識」は、ハプテン、色素原、酵素、フルオロフォア、及び量子ドットからなる群から選択され;mは0、1又は2であり、nは1又は2である)の構造を有し、mが0である場合、[リンカー]は結合であり、その結果「標識」がポリマー骨格[A].にカップリングし得る。いくつかの実施態様では、mは1であり、nは1である。
(式中、「特異的結合実体」は、用語が本明細書に定義されているような特異的結合実体(例えば抗体、抗体断片、薬物/抗体複合体、核酸)を表し;Rは末端基(例えば水素、ヒドロキシル基、カルボニル基、カチオン、アミノ基、リン酸基、ホスホジエステル基)であり;a及びbは、それぞれ独立して1から8の整数であり;zは1から24の整数である)
に示されるようなコンジュゲートを形成する。
(式中、
「オリゴ」は、1から約50ヌクレオチドを有する一本鎖オリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は70℃未満のTmを有し;
「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有し、4から32個の炭素原子を有してもよく;
「リンカー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から18個の炭素原子を有し;
「標識」は、ハプテン、フルオロフォア、色素原、及び酵素からなる群から選択され;
Rは、末端基であり(非限定的例は水素、ヒドロキシル基、カルボニル基、アミノ基、リン酸基、ホスホジエステル基又はカチオンを含む);
Tは、末端反応性部分を有する基であり;
xは、1又は2であり;yは、0、1又は2であり;zは、1から24の整数であり;
mは、0、1又は2であり;nは、1又は2であり;
aは、1から8の整数であり;bは、1又は2である)の構造を有し、
「オリゴ」、「スペーサー」又は「リンカー」のいずれも、相互に直接、又はリン酸基若しくはホスホジエステル基を含むがこれらに限定されない任意の基又は反応性基を介して結合され得、yが0の場合、[スペーサー]が結合であり、mが0の場合、[リンカー]が結合である。
(式中、「オリゴ」は、1から約32ヌクレオチドを有する一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は70℃未満のTmを有し;「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から24個の炭素原子を有し;「リンカー」は、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から18個の炭素原子を有する脂肪族基であり;「標識」は、ハプテン、酵素、色素原、フルオロフォア、及び量子ドットからなる群から選択され;「特異的結合実体」は、抗体、抗体断片、核酸又は薬物/抗体コンジュゲートであり;Rは、末端基であり(非限定的な例は水素、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボニル基、リン酸基、ホスホジエステル基又はカチオンを含む);xは、1又は2であり;yは、0、1又は2であり;zは、1から8の整数であり;aは、1から8の整数であり;bは、1から8の整数である)に示されるようなコンジュゲートであって、「オリゴ」、「スペーサー」又は「リンカー」のいずれも、相互に直接、又は任意の基を介して結合され得;yが0の場合、[スペーサー]が結合であり;mが0の場合、[リンカー]が結合であるコンジュゲートを形成することができる。yがゼロで[スペーサー]が結合である実施態様では、[リンカー]は、存在する場合、直接又は任意の基(例えばリン酸基又はホスホジエステル基)を介して[オリゴ]にカップリング又は結合されている。mがゼロで[リンカー]が結合である実施態様では、[標識]は、直接又は任意の基(例えばリン酸基又はホスホジエステル基)を介して[スペーサー]にカップリング又は結合されている。yがゼロであり、mもゼロである実施態様では、[標識]は、直接又は任意の基(例えばリン酸基又はホスホジエステル基)を介して[オリゴ]に結合されている。
本開示のポリマーは、本明細書に記載されているように、ポリマー骨格の構成部分としてオリゴヌクレオチドを利用するのであり、ポリマー骨格はポリマーが一又は複数の標識用の担体として役立つことを可能にする。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は、約1から約50ヌクレオチド(「mer」)又は約2から約50mer(すなわち[オリゴ]xの[オリゴ]は1から50は1〜50merを含み、この場合xは1より大きく、[オリゴ]x基は50mer超を含有し得る)。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は、約70°C未満の溶融温度(Tm)を有する。他の実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は、約37°C未満の溶融温度(Tm)を有する。他の実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は、35mer未満を含む。さらに他の実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は、2から24merを含む。なおさらなる実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は、20mer以下を含む。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは六量体である。いくつかの実施態様では、配列は、自己相補的構造を形成しないように選択される。
24−mer: TATTTT TATTTT TATTTT TATTTT (Tm 36.9℃)
30−mer: TATTTT TATTTT TATTTT TATTTT TATTTT (Tm 42.5℃)
42−mer:: TATTTT TATTTT TATTTT TATTTT TATTTT TATTTT TATTTT (Tm 48.9℃)
64−mer: TATTTT TATTTT TATTTT TATTTT TATTTT TATTTT TATTTT TATTTT TATTTT (Tm 52.4℃)
ポリマー骨格にカップリングされた標識(例えば式(I)参照)は、ハプテン、フルオロフォア、色素原、酵素、リガンド、リン光若しくは化学発光剤、又は量子ドット、又は他の任意の適切な実体から選択することができる。選択する標識の種類は、合成するポリマーと、適切な特異的結合実体へのコンジュゲーション後のポリマーの最終的な役割とによって決まる。例えば、いくつかの実施態様では、標識は、ポリマーを抗体にコンジュゲートする場合、直接検出され得るように選択することができる(例えばフルオレセイン又はフルオレセイン誘導体若しくは類似体)。他の実施態様では、標識は、ポリマーを抗体にコンジュゲートする場合、間接的に検出され得るように選択することができる(例えばハプテンに特異的な二次抗体を用いることによるハプテン標識の検出。この場合二次抗体は、検出可能な部分にコンジュゲートされる)。様々な目的に適した標識の選択についてのガイダンスが、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)及びAusubel ら, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Intersciences (1987)に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に援用される。
ポリマーは、一又は複数のスペーサーを含んでもよい。いくつかの実施態様では、「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和基(例えば脂肪族基)であり、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から32個の炭素原子を有する。他の実施態様では、「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和基(例えば脂肪族基)であり、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から24個の炭素原子を有する。さらなる他の実施態様では、「スペーサー」は、置換又は無置換であり得、O、N又はSから選択される1つ以上のヘテロ原子を有してもよく、4から24個の炭素原子を有する線状鎖である。
(式中、d及びeは、各々独立して1から32の整数であり;Qは、結合、O、S、N(Rc)(Rd)又は第4級アミン(N+H(Rc)(Rd))であり;Ra及びRbは、独立してH、C1−C4アルキル基、F、Cl又はN(Rc)(Rd)であり;Rc及びRdは、独立してCH3又はHである)
に示す構造を有する。いくつかの実施態様では、d及びeは、各々独立して2から18の整数である。いくつかの実施態様では、dは1から8の整数であり;eは2から16の整数である。他の実施態様では、dは2から8の整数であり;eは2から12の整数である。いくつかの実施態様では、式(VII)の「スペーサー」全体がポリマー骨格[A]内に組み込まれる。
(式中、d及びeは、各々独立して1から32の整数であり;Qは、結合、O、S又はN(Rc)(Rd)であり;Rc及びRdは、独立してCH3又はH.である)
に示す構造を有する。いくつかの実施態様では、QはOである。いくつかの実施態様では、dは1から8の整数であり;eは2から16の整数である。他の実施態様では、dは2から8の整数であり;eは2から12の整数である。いくつかの実施態様では、式(VIII)の「スペーサー」全体がポリマー骨格[A]内に組み込まれる。
(式中、d及びeは、各々独立して1から32の整数である)
に示す構造を有する。いくつかの実施態様では、dは1から4であり;eは1から8である。いくつかの実施態様では、dは1から8の整数であり;eは2から16の整数である。他の実施態様では、dは2から8の整数であり;eは2から12の整数である。いくつかの実施態様では、式(IX)の「スペーサー」全体がポリマー骨格[A]内に組み込まれる。
ポリマーは、一又は複数のリンカーを含んでもよい。いくつかの実施態様では、「リンカー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和基(例えば脂肪族基)であり、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から18個の炭素原子を有する。
(式中、d及びeは、各々独立して4から18の整数であり;Qは、結合、O、S又はN(Rc)(Rd)であり;Ra及びRbは、独立してH、C1−C4アルキル基、F、Cl又はN(Rc)(Rd)であり;Rc及びRdは、独立してCH3又はHである)
に示す構造を有する。いくつかの実施態様では、d及びeは、各々独立して4から12の整数である。
(式中、d及びeは、各々独立して4から18の整数であり;Qは、結合、O、S又はN(Rc)(Rd)であり;Rc及びRdは、独立してCH3又はHである)
に示す構造を有する。いくつかの実施態様では、QはOである。
(式中、d及びeは、各々独立して4から18の整数である)
に示す構造を有する。いくつかの実施態様では、dは4から8の整数である。
ポリマーの例1
一つの特定の実施態様において、ポリマーは、以下の式(Xa):
5’(アミノC6)−TATTTT[DNP]TATTTT[DNP]TATTTT[DNP]T (Xa)
に示される構造を有し、
上式中、アミノC6は、6個の炭素原子を有する末端官能基(例えば反応性基)及び特異的結合実体にカップリングし得る第一級又は第二級アミンを表し;[TATTTT]は、オリゴヌクレオチド配列であり;DNPはハプテンである。この特定の例では、「スペーサー」は存在せず、DNPは「リンカー」(図示せず)を介してポリマー骨格にカップリングされている。この例では、オリゴヌクレオチド配列を[TATTT]として表しているが、ヌクレオチドの任意の組み合わせを有するより長い又はより短い配列を利用することもできる。この特定の実施態様は、3つの標識及び3つのオリゴヌクレオチド配列を含むものとして示されている。無論、この特定の実施態様は、スペーサーを含むように変更することができる。
5’(アミノC6)−TATTTT[DNP]TATTTT[DNP]TATTTT[DNP]TATTTT[DNP]T (Xb)
例2は、4つの標識及び4つのオリゴヌクレオチド配列を含有すること以外は、例1のポリマーと同様である。例1と同様に、この特定の実施態様は、スペーサーを含むように変更することができ、リンカーを介して骨格にDNPをカップリングすることができる。
別の特定の実施態様において、ポリマーは、以下の式(Xc):
5’(アミノC6)−TATTTT[DNP]TATTTT[DNP]TATTTT[DNP]TATTTT[DNP]TATTTT[DNP]T (Xc)
に示される構造を有し、
上式中、アミノC6は、特異的結合実体にカップリングし得る末端官能基を表し;[TATTTT]は、オリゴヌクレオチド配列であり;DNPはハプテンである。この特定の例では、「スペーサー」は存在せず、DNPは「リンカー」(図示せず)を介してポリマー骨格にカップリングされている。この例では、オリゴヌクレオチド配列を[TATTT]として表しているが、ヌクレオチドの任意の組み合わせを有するより長い又はより短い配列を利用することもできる。この特定の実施態様は、5つの標識及び5つのオリゴヌクレオチド配列を含むものとして示されているが、以下の例4で示すように、9つの標識及び9つのオリゴヌクレオチド配列を含む変異体も考えられる。例3及び4は、スペーサーを含むように変更することができる。
例4は、9つの標識及び9つのオリゴヌクレオチド配列を含有すること以外は、例3のポリマーと同様である。例3と同様に、この特定の実施態様は、スペーサーを含むように変更することができ、リンカーを介して骨格にDNPをカップリングすることができる。
5’(アミノC6)−TATTTT[DNP]TATTTT[DNP]TATTTT[DNP]TATTTT[DNP]TATTTT[DNP]TATTTT[DNP]TATTTT[DNP] TATTTT[DNP]TATTTT[DNP]T (Xd)
別の特定の実施態様において、ポリマーは、以下の式(Xe):
5’(アミノC6)−TA[Sp〜C18][DNP]TA[Sp〜C18][DNP]TA[Sp〜C18][DNP]
TA[Sp〜C18][DNP]TA[Sp〜C18][DNP]TA[Sp〜C18][DNP]TA[Sp〜C18][DNP]TA[Sp〜C18][DNP]TA[Sp〜C18][DNP]T (Xe)
に示される構造を有し、
上式中、アミノC6は、特異的結合実体にコンジュゲートし得る末端官能基を表し;[TA]は、オリゴヌクレオチド配列であり;[SP〜C18]は、少なくとも18個の原子を含むスペーサーであり; DNPはハプテンである。DNPは、「リンカー」(図示せず)を介してポリマー骨格にカップリングされている。この例では、オリゴヌクレオチド配列を[TA]として表しているが、ヌクレオチドの任意の組み合わせを有するより長い配列を利用することもできる。この特定の実施態様は、9つの標識、9つのスペーサー、及び9つのオリゴヌクレオチド配列を含むが、5つの標識、5つのスペーサー、及び5つのオリゴヌクレオチド配列を含む同様の変異体;並びに3つの標識、3つのスペーサー、及び3つのオリゴヌクレオチド配列を含む同様の変異体のものも考えられる。
別の特定の実施態様において、ポリマーは、以下の式:
5’(アミノC6)−TA[Sp〜C18][Fl]TA[Sp〜C18][Fl]TA[Sp〜C18][Fl]TA[Sp〜C18][Fl]TA[Sp〜C18][Fl]TA[Sp〜C18][Fl]TA[Sp〜C18][Fl]TA[Sp〜C18][Fl]TA[Sp〜C18][Fl]T (Xf)
(Xf)により示される構造を有し、
上式中、アミノC6は、特異的結合実体にカップリングし得る末端官能基を表し;[TA]は、オリゴヌクレオチド配列であり;[SP〜C18]は、少なくとも18個の原子を含むスペーサーであり;[FI]はフルオレセイン(又はフルオレセイン誘導体)などのフルオロフォアである。FIは、「リンカー」(図示せず)を介してポリマー骨格にカップリングされている。この例では、オリゴヌクレオチド配列を[TA]として表しているが、ヌクレオチドの任意の組み合わせを有するより長い配列を利用することもできる。この特定の実施態様は、9つの標識、9つのスペーサー、及び9つのオリゴヌクレオチド配列を含むが、5つの標識、5つのスペーサー、及び5つのオリゴヌクレオチド配列を含む同様の変異体;4つの標識、4つのスペーサー、及び4つのオリゴヌクレオチド配列を含む同様の変異体のもの;並びに3つの標識、3つのスペーサー、及び3つのオリゴヌクレオチド配列を含む同様の変異体のものも考えられる。
別の特定の実施態様において、ポリマーは、以下の式(Xg):
5’(アミノC6)−T[Sp〜C18]T[Sp〜C18][FI]T[Sp〜C18]T[Sp〜C18][FI]T[Sp〜C18]T[Sp〜C18][FI]T[Sp〜C18]T[Sp〜C18][FI]T[Sp〜C18]T[Sp〜C18][FI]T[Sp〜C18]T[Sp〜C18][FI]T[Sp〜C18]T[Sp〜C18][FI]T[Sp〜C18]T[Sp〜C18][FI]T[Sp〜C18]T[Sp〜C18][FI]T (Xg)
により示される構造を有し、
上式中、アミノC6は、特異的結合実体にカップリングし得る末端官能基を表し;[T]は、オリゴヌクレオチド配列であり;[SP〜C18]は、少なくとも18個の原子を含むスペーサーであり;[FI]はフルオレセイン(又はフルオレセイン誘導体)などのフルオロフォアである。FIは、「リンカー」(図示せず)を介してポリマー骨格にカップリングされている。この特定の実施態様では、ポリマー骨格は、2つのオリゴヌクレオチド配列と2つのスペーサーを交互配置で含む。[FI]基は、このポリマー骨格にコンジュゲートされる。この例では、オリゴヌクレオチド配列を[T]として表しているが、ヌクレオチドの任意の組み合わせを有するより長い配列を利用することもできる。この特定の実施態様は、9つの標識、9つのスペーサー、及び9つのオリゴヌクレオチド配列を含むが、5つの標識、5つのスペーサー、及び5つのオリゴヌクレオチド配列を含む同様の変異体;4つの標識、4つのスペーサー、及び4つのオリゴヌクレオチド配列を含む同様の変異体のもの;並びに3つの標識、3つのスペーサー、及び3つのオリゴヌクレオチド配列を含む同様の変異体のものも考えられる。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載のポリマーは、式(IVa)、(IVb)又は(VId)に示すような特異的結合実体にカップリングすることができる。いくつかの実施態様では、少なくとも一のポリマーが特異的結合実体にカップリングされる。他の実施態様では、式(I)、(V)、(VIa)、(VIb)又は(VIc)のいずれかの又は式(XaからXg)におけるポリマーを含めた複数のポリマーが特異的結合実体にカップリングされている。いくつかの実施態様では、特異的結合実体は、核酸配列である。他の実施態様では、特異的結合実体は、抗体、例えば一次抗体である。さらなる他の実施態様では、特異的結合実体は、薬物/抗体コンジュゲートである。
ポリマーコンジュゲートが間接的に検出される実施態様では、コンジュゲート及びゆえに標的の検出を可能にするために特異的試薬が利用される。いくつかの実施態様では、ポリマーコンジュゲートの標識に特異的な検出試薬が利用される。いくつかの実施態様では、検出試薬は、ポリマーコンジュゲートの標識に特異的な二次抗体を含む。すなわち、二次抗体は抗標識抗体である。二次抗体は、ポリマーコンジュゲートの検出を達成するために「検出可能な部分」にコンジュゲートしてもよい。
「検出可能な部分」は、試料中の標識の存在(すなわち定性分析)及び/又は濃度(すなわち定量分析)を示す、(例えば視覚的に、電子的に又は他の方法で)検出可能なシグナルを生成し得る分子又は材料である。検出可能なシグナルは、光子(無線周波数、マイクロ波周波数、赤外周波数、可視周波数、及び紫外周波数の光子を含む)の吸収、放射、及び/又は散乱を含めた、任意の知られている機構又は未だ発見されていない機構により生成することができる。
又はペルオキシダーゼ(例えばHRP、AP)を含む。これらの実施態様では、検出試薬(例えば標識コンジュゲート)にコンジュゲートされた酵素は、発色基質(又はシグナル伝達コンジュゲート)の、標的に近位の試料に又は標的に直接共有結合する反応性部分への変換を触媒する。
いくつかの実施態様では、本開示のコンジュゲートは、「検出キット」の一部である。一般に、いずれの検出キットも、コンジュゲート(検出プローブ)及びコンジュゲートを検出するための検出試薬(検出可能な部分を含む)を含む。
本開示はまた、本明細書に記載のコンジュゲートのいずれかを用いて標的を検出する方法も企図する。特定の実施態様では免疫組織化学のための抗体又は抗体コンジュゲートの使用に触れているものの、他の特異的結合実体(例えばin situハイブリダイゼーションのための核酸)も企図されており、当業者に知られている方法に従って使用してもよい。
本開示は、ポリマー−抗体コンジュゲートを作製するための方法の例示的な実施態様を提供する。適切なコンジュゲーション方法もまた、当業者に一般的に知られているであろう。例えば、参照により本明細書に援用される米国特許出願第2013/0184184号を参照されたい。特定の例示的な実施態様では、コンジュゲーションは、抗体のヒンジ又はFc領域で達成することができる。抗体のヒンジ領域におけるジスルフィド結合は、典型的にはDTTを使用する穏やかな還元を用いて選択的に減少させることができる。次いで、得られたスルフヒドリル結合を、マレイミド−dPEG8−ハプテンエステルリンカーなどで標識化する。単なる一例として、ポリマー−抗体コンジュゲートを形成するための一つの方法を以下のスキーム1に示す。この方法は一般に、抗体2を5−HyNic4と反応させ、5−HyNic−抗体コンジュゲート6を形成させることを含む。別個に、(ポリマーの一部である)3’−又は5’−アミノ修飾オリゴヌクレオチド8をS−4FB10と反応させ、4FB−ポリマー12を形成する。次いで、触媒の存在下で5−HyNic−抗体コンジュゲート6を4FB−オリゴ12にカップリングさせ、bus−アリールヒドラジンによりポリマーのオリゴヌクレオチド部分にカップリングされた抗体を含むコンジュゲート14を形成する。代替合成スキームを図8に示す。
特定の実施態様では、式(I)のポリマーにコンジュゲートされる抗体は、目的の特異的抗原に対するモノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、式(I)のポリマーのようなポリマーにコンジュゲートされ、コンジュゲートを形成し得る。適切な末端反応性基(例えばアミノ基)を有するポリマーは、固相ホスホラミダイト化学を用いて調製することができる。スルホ−スクシンイミジル活性化4−ホルミルベンゾエート(S−4FB)のN−ヒドロキシスクシンイミドを用いて、ポリマー(例えばポリマーの[オリゴ]部分)を修飾し、活性化することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドを含むポリマーは、末端4FBホスホラミダイトモノマーを用いた固相ホスホラミダイト化学を用いて調製することができる。ポリマーのオリゴヌクレオチド骨格は、例えば代替的な骨格、塩基又は不活性リンカー又は幾何学構造を組み込むために、異なる長さ、異なる化学的性質を有し得る。さらに、4FB部分は、複数の代替的な化学によって、又は酵素を用いる生化学的手段によって組み込まれ得る。4FB部分は、オリゴヌクレオチドの3‘末端又は5’末端のいずれかに、又はその中間に、又はいずれかの末端の近くに配置することができる。
3’及び5’OH基を利用する末端修飾(例えばC6及びC7アミノ修飾因子、ビオチン−OT、ビオチン−TEG、コレステロール−TEG、フルオレセイン、チオール修飾、リン酸);
塩基修飾(例えば5−ブロモ−dU、5−ブロモ−dC、5−フルオロ−dU、デオキシイノシン、5−ヨード−dC、5−ヨードU、5−メチル−dC、5−ニトロインドール、デオキシウリジン);
配列中のT残基を置換するチミジン類似体(例えばC2dT及びC6dTアミノ修飾因子、ビオチン−dT、ダブシル−dT、フルオレセイン−dT、TAMRA−dT);
合成後修飾(適切なアミノ修飾因子を選択することにより、該修飾をオリゴヌクレオチドの異なる位置に加えることができる);
リン酸基の修飾(例えばホスホロチオエート化);及び
2’修飾(2’−O−メチルA/C/G/U、リボA/C/G/U)。
試料は、生物学的成分を含み、一般に一又は複数の目的の標的分子を含むと思われる。標的分子は、細胞の表面上に存在し得、細胞は、懸濁液中又は組織切片中に存在し得る。標的分子はまた、細胞内に存在し得、プローブによる細胞溶解又は細胞侵入の際に検出され得る。当業者は、試料中の標的分子を検出する方法が使用される試料及びプローブの種類に応じて変化することを理解するであろう。試料を収集し調製する方法は、当技術分野で既知である。
対比染色は、標的の構造が顕微鏡下でより容易に視覚化され得るように、一又は複数の標的を検出するための薬剤で既に染色した後の試料を後処理する方法である。例えば、対比染料をカバースリッピングの前に任意選択的に使用し、免疫組織化学染色をより明瞭にする。対比染料は、一次染料と色が異なる。多くの対比染料、例えばヘマトキシリン、エオシン、メチルグリーン、メチレンブルー、ギムザ、アルシアンブルー、及びニュークリアファストレッド(Nuclear Fast Red)がよく知られている。
本開示の実施態様のすべて又は特定の態様は、コンピュータ解析及び/又は画像解析システムによって自動化され、容易にされ得る。いくつかのアプリケーションでは、正確な色の比率が測定される。いくつかの実施態様では、画像解析のために光学顕微鏡法が利用される。特定の本開示の実施態様は、デジタル画像を取得することを伴う。これは、デジタルカメラを顕微鏡に連結することにより行うことができる。染色した試料から得られたデジタル画像は、画像解析ソフトウェアを用いて解析する。色は、いくつかの異なる方法で測定することができる。たとえば、色は、赤、青、緑の値;色相、彩度、強度の値として、及び/又はスペクトルイメージングカメラを使用して特定の波長又は波長の範囲を測定することによって測定することができる。
アミノ残基上で式Xbのポリマーにより無作為に標識した抗HER−2/neu(4B5)ウサギ抗体及びHER2 4B5ウサギ抗体を用いるHER2タンパク質の染色をBenchMark ULTRA自動染色装置で実施した。簡単に説明すると、厚さ約4mmの未染色の***腫瘍切片を切って、SuperFrost Plusガラススライドに乗せた。BenchMark ULTRA自動染色装置は、約72℃でのオンライン式脱パラフィン及び抗原回収(約95℃で約36分間)を含む。抗HER−2/neu(4B5)ウサギ抗体(約6μg/ml)又はウサギ抗HER−2/neu(4B5)抗体を式Xbのポリマー(1μg/ml)により無作為に標識し、約37℃で約12分間インキュベートした。抗HER−2/neu(4B5)抗体の場合、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)で標識された約25μg/mlのヤギ抗ウサギ抗体で抗原検出を行った。アミノ残基上で式Xbのポリマーにより無作為に標識した抗HER−2/neu(4B5)抗体の場合、約0.5〜1.0mg/mlの魚DNAをブロッキング試薬として塊状にした。抗原検出は、約10μg/mlのマウス抗DNP−HRP抗体を用いて行った。色素原としてジアミノベンジジン(DAB)を用い、対比染料としてヘマトキシリンを用いた。次いで、それぞれの別個の組織切片を0〜3+の強度スケール(1+=弱く不完全な膜染色、2+=適度に強く且つ完全な膜染色、3+=強く/強烈且つ完全な膜染色)で4B5染色についてスコアをつけた。
ヒンジ領域のチオール残基上で式Xdのポリマーにより標識した抗HER−2/neu(4B5)ウサギ抗体及びHER2 4B5ウサギ抗体を用いるHER2タンパク質の染色をBenchMark ULTRA自動染色装置で行った。簡単に説明すると、厚さ約4mmの未染色の***腫瘍切片を切って、SuperFrost Plusガラススライドに乗せた。BenchMark ULTRA自動染色装置は、約72℃でのオンライン式脱パラフィン及び抗原回収(約95℃で約36分間)を含む。ヒンジ領域のチオール残基上で式Xdのポリマー(1μg/ml)により標識した抗HER−2/neu(4B5)ウサギ抗体(約6μg/ml)又はウサギ抗HER−2/neu(4B5)抗体を約37℃で約12分間インキュベートした。抗HER−2/neu(4B5)抗体の場合、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)(ULTRAVIEW UNIVERSAL DAB DETECTION KIT、760−500から調製)で標識された約25μg/mlのヤギ抗ウサギ抗体で抗原検出を行った。ヒンジ領域のチオール残基上で式Xdのポリマーにより標識した抗HER−2/neu(4B5)抗体の場合、約0.5〜1.0mg/mlの魚DNAをブロッキング試薬として塊状にした。約10μg/mlのマウス抗DNP−HRP抗体(DISCOVERY抗DNP HRP Multimer RUO、760−4821から調製)を用いて抗原検出を行った。色素原としてジアミノベンジジン(DAB)を用い、対比染料としてヘマトキシリンを用いた。次いで、それぞれの別個の組織切片を0〜3+の強度スケール(1+=弱く不完全な膜染色、2+=適度に強く且つ完全な膜染色、3+=強く/強烈且つ完全な膜染色)で4B5染色についてスコアをつけた。
ネイティブ抗CD3、CD8、CD20、CD68、FoxP3ウサギ抗体及びヒンジ領域のチオール残基上で式(Xe)のポリマーで標識したウサギ抗体を用いるCD3、CD8、CD20、CD68、FoxP3タンパク質の染色をBenchMark ULTRA自動染色装置で行った。簡単に説明すると、厚さ約4mmの未染色の扁桃切片を切って、SuperFrost Plusガラススライドに乗せた。BenchMark ULTRA自動染色装置は、約72℃でのオンライン式脱パラフィン及び抗原回収(約95℃で約64分間)を含む。ネイティブなウサギ抗体(約1μg/ml)又はそれぞれの抗体コンジュゲート(約1μg/ml)を約37℃で約16分間インキュベートした。ネイティブなウサギ抗体の場合、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)(ULTRAVIEW UNIVERSAL DAB DETECTION KIT、760−500から調製)で標識された約25μg/mlのヤギ抗ウサギ抗体で抗原検出を行った。式(Xe)のポリマーを含むそれぞれの抗体コンジュゲートの場合、約1.0mg/mlの魚DNAをブロッキング試薬として塊状にした。約20μg/mlのマウス抗DNP−HRP抗体(DISCOVERY抗DNP HRP Multimer RUO、760−4821から調製)を用いて抗原検出を行った。色素原としてジアミノベンジジン(DAB)を用い、対比染料としてヘマトキシリンを用いた。
本実施例は、Ventana Medical Systems、Inc.のBenchmark Instrumentを用いて、ポリハプテニル化(polyhaptenylated)オリゴヌクレオチド−一次抗体コンジュゲートと結合した二次抗体を認識するために量子ドットを用いて扁桃上のKi−67などの組織エピトープを検出することに関する。パラフィン被覆組織をスライド上で75℃まで4分間加熱し、EZPrep容積アジャスト(volume adjust)(VMSI)により75℃で2回処理した後、EZPrep容積アジャストと共に液体カバースリップ(VMSI)を適用する。75℃で4分後、スライドをすすぎ、EZPrep容積アジャストを液体カバースリップと共に添加し、前記組織を76℃で4分間脱パラフィンする。スライドを40℃に冷却し、3回すすいだ後、抗Ki67 15(100μL、VMSI)抗体−ハプテン化ポリマーコンジュゲート(例えば式(I))、続いて液体カバースリップを添加し、40℃で16分間インキュベーベーションを行う。スライドをすすいだ後、組織を抗ハプテン抗体(100μL)、続いて液体カバースリップで処理し、40℃で8分間のインキュベーションを行う。スライドを緩衝液で2回すすぎ、続いて液体カバースリップを適用する。スライドを緩衝液で3回すすぎ、洗剤洗浄で処理した後、スライドにカバースリップを手動で適用し、その後スライドを顕微鏡で観察する。
本実施例は、発色染色(すなわちDABのHRP媒介沈着)又はポリハプテニル化ポリマーとコンジュゲートされた抗体を認識するための量子ドットのいずれかを用いて組織エピトープ、特に扁桃上のKi−67を検出することに関する。以下は、Ventana Benchmark Instrumentの適用手順である。パラフィン被覆組織をスライド上で75℃まで4分間加熱し、EZPrep容積アジャスト(VMSI)により75℃で2回処理した後、EZPrep容積アジャストと共に液体カバースリップ(VMSI)を適用する。75℃で4分後、スライドをすすぎ、EZPrep容積アジャストを液体カバースリップと共に添加し、前記組織を76℃で4分間脱パラフィンする。スライドを40℃に冷却し、3回すすいだ後、マウス抗Ki67(100μL、VMSI)抗体、続いて液体カバースリップを添加し、40℃で16分間インキュベーベーションを行う。スライドをすすいだ後、組織をヤギ抗マウス−ポリマー−DNP抗体(100μL)、続いて液体カバースリップで処理し、40℃で8分間のインキュベーションを行う。スライドを緩衝液で2回すすいだ後、液体カバースリップを適用し、655nm QDot:抗DNP MAbコンジュゲート(100μL、20nmol)を添加し、37°Cで16分間のインキュベーションを行う。スライドを緩衝液20で3回すすぎ、洗剤洗浄で処理した後、スライドにカバースリップを手動で適用し、その後スライドを顕微鏡で観察する。
本実施例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−抗体コンジュゲートを評価すること、特にSISH検出のためのFcコンジュゲートポリマー−ビオチンコンジュゲートを用いる様々な組織におけるHPVの評価に関する。以下は、Ventana Benchmark Instrumentの適用手順である。パラフィン被覆組織をスライド上で75℃まで4分間加熱し、EZPrep容積アジャスト(VMSI)により75℃で2回処理した後、EZPrep容積アジャストと共に液体カバースリップ(VMSI)を適用する。75℃で4分後、スライドをすすぎ、EZPrep容積アジャストを液体カバースリップと共に添加し、前記組織を76℃で4分間脱パラフィンする。Cell Conditioner#2(VMSI)を添加し、スライドを90°Cに加温し、8分間インキュベートする。これにCell Conditioner#2の別の適用及び90℃で12分間のインキュベーションが続く。スライドをReaction Buffer(VMSI)ですすぎ、37℃に冷却し、ISH−プロテアーゼ3(100μL、VMSI)を添加する。4分間のインキュベーションの後、スライドを3回すすぎ、iView+HybReady(100μL、VMSI)を適用し、これを4分間インキュベートする。HPVプローブ(200μL、VMSI)の添加後、37℃で4分間、95℃で12分間及び52℃で124分間のインキュベーションを行う。次いで、スライドを2回すすぎ、72℃に加温する。この直前の工程をさらに2回繰り返しスライドを37℃に冷却し、iView+Anti−DNP(100μL、VMSI)を添加する。一次抗体を20分間インキュベートし、次いでスライドを2回すすいだ後、オリゴヌクレオチド−ビオチン化二次抗体 (例えばヤギ抗ウサギ、100μL、10μg/mL)を手動で添加する。二次抗体のインキュベーションを8分間行い、スライドを2回すすぐ。次いで、ウサギ抗ビオチン抗体を適用し(100μL)、インキュベーションをさらに20分間行う。さらに2回のすすぎ工程の後、HRP多量体を適用し(100μL、10μg/mL)、8分間インキュベートする。さらに4回のすすぎ工程に続き、4分間のインキュベーションでSISH Chromagen A(100μL、VMSI)を、4分間のインキュベーションでSISH Chromagen B(100μL、VMSI)を、及び4分間のインキュベーションでSISH Chromagen C(100μL、VMSI)を適用する。スライドを3回すすぎ、ヘマトキシリンII(100μL、VMSI)を添加する。対比染色で4分間インキュベートした後、スライドをすすぎ、Bluing Reagent(100μL、VMSI)を適用し、4分間インキュベートする。次いで、スライドをさらに3回すすぎ、器具から取り外す。スライドを洗剤洗浄で処理した後、エタノール、アセトン、及びキシレンで脱水し、次にカバースリップをスライドに適用し、その後スライドを顕微鏡で観察する。
Claims (21)
- 標的特異的抗体にカップリングされた式(V)
(式中、
「オリゴ」は、1から約50ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は70℃未満のTmを有し;
「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から32個の炭素原子を有し;
「リンカー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から18個の炭素原子を有し;
「標識」は、ハプテン、フルオロフォア、色素原、酵素、及び量子ドットからなる群から選択され;
Rは、末端基であり;
Tは、末端反応性部分を有する基であり;
xは、1又は2であり;
yは、1又は2であり;
zは、1から18の整数であり;
mは、0、1又は2であり;
nは、1又は2であり;
aは、1から8の整数であり;
bは、1又は2である)
のポリマーであって、
「オリゴ」、「スペーサー」、「リンカー」又は「標識」のいずれも、相互に直接、又は任意の基を介して結合され得;且つ
mが0の場合、[リンカー]が結合である、
ポリマーの少なくとも一を含む抗体コンジュゲートであって、
「スペーサー」が式(VII)
(式中、d及びeは、1から32の整数であり;Qは、結合、O、S又はN(Rc)(Rd)であり;Ra及びRbは、独立してH、C1−C4のアルキル基、F、Cl、N(Rc)(Rd)又は第4級アミンであり;Rc及びRdは、独立してCH3又はHである)
の構造を有する、抗体コンジュゲート。 - Ra及びRbがHであり;QがOであり;dが1から4であり;eが2から8である、請求項1に記載の抗体コンジュゲート。
- 「スペーサー」が正味の正電荷を有する、請求項1に記載の抗体コンジュゲート。
- 標的特異的抗体にカップリングされた式(V)
(式中、
「オリゴ」は、1から約50ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は70℃未満のTmを有し;
「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から32個の炭素原子を有し;
「リンカー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から18個の炭素原子を有し;
「標識」は、ハプテン、フルオロフォア、色素原、酵素、及び量子ドットからなる群から選択され;
Rは、末端基であり;
Tは、末端反応性部分を有する基であり;
xは、1又は2であり;
yは、0、1又は2であり;
zは、1から18の整数であり;
mは、1又は2であり;
nは、1又は2であり;
aは、1から8の整数であり;
bは、1又は2である)
のポリマーであって、
「オリゴ」、「スペーサー」、「リンカー」又は「標識」のいずれも、相互に直接、又は任意の基を介して結合され得;且つ
yが0の場合、[スペーサー]が結合であり、[リンカー]が直接又は任意の基を介して[オリゴ]に結合する、
ポリマーの少なくとも一を含む抗体コンジュゲートであって、
「リンカー」が式(VII)
(式中、d及びeは、1から32の整数であり;Qは、結合、O、S又はN(Rc)(Rd)であり;Ra及びRbは、独立してH、C1−C4のアルキル基、F、Cl又はN(Rc)(Rd)であり;Rc及びRdは、独立してCH3又はHである)
の構造を有する、抗体コンジュゲート。 - 標的特異的抗体にカップリングされた式(V)
(式中、
「オリゴ」は、1から約50ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は70℃未満のTmを有し;
「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から32個の炭素原子を有し;
「リンカー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から18個の炭素原子を有し;
「標識」は、ハプテン、フルオロフォア、色素原、酵素、及び量子ドットからなる群から選択され;
Rは、末端基であり;
Tは、末端反応性部分を有する基であり;
xは、1又は2であり;
yは、0、1又は2であり;
zは、1から18の整数であり;
mは、1又は2であり;
nは、1又は2であり;
aは、1から8の整数であり;
bは、1又は2である)
のポリマーであって、
「オリゴ」、「スペーサー」、「リンカー」又は「標識」のいずれも、相互に直接、又は任意の基を介して結合され得;且つ
yが0の場合、[スペーサー]が結合であり、[リンカー]が直接又は任意の基を介して[オリゴ]に結合する、
ポリマーの少なくとも一を含む抗体コンジュゲートであって、
「リンカー」がポリ(アルキレン)グリコールに由来する、抗体コンジュゲート。 - 標的特異的抗体にカップリングされた式(V)
(式中、
「オリゴ」は、1から約50ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は70℃未満のTmを有し;
「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から32個の炭素原子を有し;
「リンカー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から18個の炭素原子を有し;
「標識」は、ハプテン、フルオロフォア、色素原、酵素、及び量子ドットからなる群から選択され;
Rは、末端基であり;
Tは、末端反応性部分を有する基であり;
xは、1であり;
yは、1又は2であり;
zは、3から18の整数であり;
mは、0、1又は2であり;
nは、1又は2であり;
aは、1又は2であり;
bは、1又は2である)
のポリマーであって、
「オリゴ」、「スペーサー」、「リンカー」又は「標識」のいずれも、相互に直接、又は任意の基を介して結合され得;且つ
mが0の場合、[リンカー]が結合である、
ポリマーの少なくとも一を含む抗体コンジュゲート。 - aが2であり;m、n、及びbが1であり、「標識」がフルオレセイン又はフルオレセイン誘導体であり、「オリゴ」が4から18ヌクレオチドを含み、「リンカー」が4から12個の炭素原子を含む、請求項6に記載の抗体コンジュゲート。
- aが1であり;m、n、及びbが1であり、「標識」がジ−ニトロフェニルであり、「オリゴ」が4から18ヌクレオチドを含み、「リンカー」が4から12個の炭素原子を含む、請求項6に記載の抗体コンジュゲート。
- 標的特異的抗体にカップリングされた式(V)
(式中、
「オリゴ」は、4から18ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は70℃未満のTmを有し;
「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から32個の炭素原子を有し;
「リンカー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から12個の炭素原子を有し;
「標識」は、ジ−ニトロフェニルであり;
Rは、末端基であり;
Tは、末端反応性部分を有する基であり;
xは、1であり;
yは、0であり;
zは、3から9の整数であり;
mは、1又は2であり;
nは、1又は2であり;
aは、1又は2であり;
bは、1又は2である)
のポリマーであって、
「オリゴ」、「スペーサー」、「リンカー」又は「標識」のいずれも、相互に直接、又は任意の基を介して結合され得;且つ
[スペーサー]が結合であり、[リンカー]が直接又は任意の基を介して[オリゴ]に結合する、
ポリマーの少なくとも一を含む、抗体コンジュゲート。 - 標的特異的抗体にカップリングされた式(V)
(式中、
「オリゴ」は、1から約50ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は70℃未満のTmを有し;
「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から32個の炭素原子を有し;
「リンカー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、O、N又はSから選択される1個以上のヘテロ原子を有してもよく、4から18個の炭素原子を有し;
「標識」は、ハプテン、フルオロフォア、色素原、酵素、及び量子ドットからなる群から選択され;
Rは、末端基であり;
Tは、末端反応性部分を有する基であり;
xは、1又は2であり;
yは、0、1又は2であり;
zは、1から18の整数であり;
mは、0、1又は2であり;
nは、1又は2であり;
aは、1から8の整数であり;
bは、1又は2である)
のポリマーであって、
「オリゴ」、「スペーサー」、「リンカー」又は「標識」のいずれも、相互に直接、又は任意の基を介して結合され得;且つ
yが0の場合、[スペーサー]が結合であり、[リンカー]が直接又は任意の基を介して[オリゴ]に結合し;mが0の場合、[リンカー]が結合である、
ポリマーの少なくとも一を含む抗体コンジュゲートであって、
a:bの比が2:1又は3:1であり、ポリマー当たりの存在する「標識」基の数が3から9である、抗体コンジュゲート。 - 「標識」がジ−ニトロフェニル、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン若しくはそれらの誘導体又はローダミンからなる群から選択される、又は「標識」がオキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ロテノイド、クマリン又はシクロリグナンからなる群から選択される、又は「標識」が5−ニトロ−3−ピラゾール カルバミド、2−(3,4−ジメトキシフェニル)キノリン−4−カルボン酸)、3−ヒドロキシ−2−キノキサリンカルバミド、2,1,3−ベンゾオキサジアゾール−5−カルバミド、及び2−アセトアミド−4−メチル−5−チアゾールスルホンアミドからなる群から選択される、請求項1〜6、9、及び10のいずれか1項に記載の抗体コンジュゲート。
- Tの末端反応性部分がアミノ基、カルボキシル基又はスルフヒドリル基である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の抗体コンジュゲート。
- 少なくとも一のポリマーが抗体のFc領域又はヒンジ領域の一つにカップリングされる、請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
- 少なくとも二のポリマーが標的特異的抗体にカップリングされる、請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
- 請求項1〜14のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲートと、試料中の標識を検出するための検出試薬とを含むキット。
- 標識を検出するための検出試薬が標識に特異的な抗体であり、前記標識に特異的な抗体が検出可能な部分を含む、請求項15に記載のキット。
- 請求項1〜14のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲートと試料を接触させること、及び標識を用いて標的を検出することを含む、試料中の標的を検出する方法。
- 試料が二以上の異なる抗体コンジュゲートと接触され、各抗体コンジュゲートは異なる標的に特異的な抗体及び異なる標識を含み、試料を異なる標識を検出するための検出試薬と接触させる工程をさらに含み、任意に試料が前記二以上の異なる抗体コンジュゲートと同時に又は連続的に接触される、請求項17に記載の方法。
- 異なる標識を検出するための検出試薬が異なる標識のそれぞれに特異的な抗標識抗体であり、各抗標識抗体が検出可能な部分を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記抗体コンジュゲートの標識がハプテンであり、ハプテンを検出するための特異的試薬が、異なる抗体コンジュゲートのそれぞれに特異的な抗ハプテン抗体であり、各抗ハプテン抗体が検出可能な部分を含み、任意にハプテンがジ−ニトロフェニル、フルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニン、及びローダミンからなる群より選択され、任意に抗体コンジュゲートの第一のハプテンがジ−ニトロフェニルであり、第一の抗ハプテン抗体が抗ジ−ニトロフェニル抗体である、請求項19に記載の方法。
- 標識が酵素であり、検出試薬が各酵素に特異的な基質であり、又は抗体コンジュゲートの標識がフルオロフォアであり、直接検出される、請求項18に記載の方法。
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