JP6761536B2 - プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型の結合タンパク質及びその使用 - Google Patents

プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型の結合タンパク質及びその使用 Download PDF

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Description

本発明は免疫学分野に属し、具体的に、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型（Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ ９，ＰＣＳＫ９）の結合タンパク質及びその使用に関するものである。
心血管疾患は、人類の死亡を引き起こす第一の原因である。低密度リポタンパク質コレステロール（Ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ，ＬＤＬ−Ｃ）は、心血管疾患を引き起こす主要な原因であると既に証明されていた。ＬＤＬ−Ｃのこのような作用は、比較的独立し、効果的に制御されることが可能である。過去２０年間で、スタチン系（ｓｔａｔｉｎｓ）の脂質低下薬の使用は、心血管疾患の発病率の低減に成功した。
しかし、スタチン系の薬物による治療方法は、必ずしも効果的ではなく、さらに他の脂質低下療法が要求されている。患者の一部、特に家族性高コレステロール血症（ｆａｍｉｌｉａｌ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌａｅｍｉａ ＦＨ）の患者は、しばしばスタチン系の薬物に非常に鈍感である。たとえ最高用量のスタチン系薬物を使用しても、これらの患者は、比較的に低レベルのＬＤＬ−Ｃを達成するのが困難である。また、スタチン系薬物には、筋肉痛及び横紋筋融解などの副作用があり、患者の一部は、スタチン系薬物を使用できなく、或いは非常に少量のスタチン系薬物を使用して血中脂質レベルを制御する。プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型（ＰＣＳＫ９）阻害剤は、まさにそのような新しいタイプの薬物であり、血液中のＬＤＬ−Ｃ濃度を制御するための新しい選択を提供する。
ＰＣＳＫ９は、セリンプロテアーゼであり、低密度リポタンパク質受容体（Ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＬＤＬＲ）のレベルの調節に関与する。インビトロ実験は、ＨｅｐＧ２細胞へのＰＣＳＫ９の添加後に細胞表面上のＬＤＬＲのレベルが低減することを確認した。マウス実験によれば、ＰＣＳＫ９タンパク質のレベルの増加は、肝臓におけるＬＤＬＲのタンパク質のレベルを低下させることができると共に、ＬＤＬＲのレベルは、正常マウスと比較してＰＣＳＫ９ノックアウトマウスにおいて上昇することを示した。ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬＲに直接結合し、ＬＤＬＲと共に貪食され、エンドサイトーシス経路全体にわたってＰＣＳＫ９とＬＤＬＲが同時に免疫発光することが示されている。現在、ＰＣＳＫ９による細胞外ＬＤＬＲの分解についての直接的な証拠がなく、ＰＣＳＫ９により細胞外ＬＤＬＲタンパク質のレベルを低下させるメカニズムがまだ不明である。
研究により、ＰＣＳＫ９がＬＤＬの産生の調節において役割を果たすことが確認されている。ＰＣＳＫ９の発現またはアップレギュレーションは、増加したＬＤＬコレステロールの血漿レベルに関連し、ＰＣＳＫ９発現の阻害または欠如は、ＬＤＬコレステロールの血漿レベルの低下に関連する。
従って、ＰＣＳＫ９の活性及びＰＣＳＫ９の様々な治療状況において発揮する相応作用を阻害し又は拮抗する、治療に基づくＰＣＳＫ９拮抗剤、特にＰＣＳＫ９に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造は、非常に重要である。現在、研究されているＰＣＳＫ９阻害剤は、概して低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）、 アンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ＡＳＯｓ）、モノクローナル抗体、及び新しい技術によって産生された特異的結合する融合タンパク質（例えば、ａｄｎｅｃｔｉｎ技術によって産生された融合タンパク質）を含む。現在、研究されているＰＣＳＫ９阻害剤は、主にｓｉＲＮＡ系薬物であるＲＧ７６５２（Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ａｄｎｅｃｔｉｎ技術による融合タンパク質であるＢＭＳ−９６２４７６ （ＢＭＳ）、ＡＳＯ系薬物であるＡＬＮ−ＰＣＳ０２（Ｉｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、及び、Ｂｏｃｏｃｉｚｕｍａｂ（Ｐｆｉｚｅｒ／Ｒｉｎａｔ）、ＬＧＴ−２０９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）などのような抗体系薬物がある。
しかし、動物試験または臨床研究により、いくつかのＰＣＳＫ９モノクローナル抗体系阻害剤には、特異性、親和性が十分的に優れていなく、または副作用があるとの問題が存在することが分かった。よって、当分野において、さらに最適化された新しいＰＣＳＫ９抗体を製造する必要がある。
本発明の目的は、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型（ＰＣＳＫ９）の結合タンパク質及びその使用を提供することにある。
本発明の第一の態様は、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する結合タンパク質を提供し、当該結合タンパク質が軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を有し、かつ、
前記重鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示されるアミノ酸配列のようであり；
前記重鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されるもののようであり；
前記重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるアミノ酸配列のようであり；
前記軽鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるもののようであり；
前記軽鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で示されるもののようであり；
前記軽鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるもののようである。
本発明の一つの好ましい態様において、前記ＰＣＳＫ９に特異的に結合する結合タンパク質は、以下のものから選ばれ、
（ａ） 重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示されるもののようであり；軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるもののようであり；或いは
（ｂ） 重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるもののようであり；軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるもののようである。
もう一つの好ましい態様において、前記ＰＣＳＫ９に特異的に結合する結合タンパク質は、その重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるもののようであり；或いはその重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されるもののようである。
もう一つの好ましい態様において、前記結合タンパク質は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二価一本鎖抗体、一本鎖ファージ抗体、二重特異性二本鎖抗体、四本鎖抗体である。
もう一つの好ましい態様において、前記結合タンパク質は、モノクローナル抗体である。
もう一つの好ましい態様において、前記結合タンパク質は、その重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（リーダーペプチドを含む）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（リーダーペプチドを含む）で示されるアミノ酸配列を有し、或いは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（リーダーペプチドを含む）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を有し、或いは、その重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２（リーダーペプチドを含まない）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４（リーダーペプチドを含まない）で示されるもののようであり、或いは、その重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４で示されるもののようである。
前記結合タンパク質は、その重鎖定常領域がＩｇＧｌ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３からなる重鎖タイプの１種の定常領域から選ばられ、その軽鎖定常領域がκ鎖及びλ鎖からなる軽鎖タイプの１種の定常領域から選ばれる。
本発明のもう一つの態様は、前記ＰＣＳＫ９に特異的に結合する結合タンパク質をコードした核酸を提供する。
本発明のもう一つの態様は、前記核酸を含む発現ベクターを提供する。
本発明のもう一つの態様は、前記発現ベクターを含む宿主細胞、又は、ゲノムに前記核酸が組み込まれた宿主細胞を提供する。
本発明のもう一つの態様は、ＰＣＳＫ９の発現又は活性障害に関連する疾患の診断、治療及び／又は予防のための医薬の製造における前記ＰＣＳＫ９に特異的に結合する結合タンパク質の使用を提供する。
好ましい態様において、前記ＰＣＳＫ９の発現又は活性障害に関連する疾患は、高血清コレステロールレベルに関連する疾患を含み、好ましくは、高コレステロール血症、冠動脈心疾患、メタボリックシンドローム、急性冠動脈症候群を含むが、これらに限定されない。
本発明のもう一つの態様は、有効量の前記ＰＣＳＫ９に特異的に結合する結合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
本発明のもう一つの態様は、前記ＰＣＳＫ９に特異的に結合する結合タンパク質、又は、前記医薬組成物を含むＰＣＳＫ９の発現又は活性障害に関連する疾患の治療及び／又は予防のためのキットを提供する。
本発明のもう一つの態様は、前記ＰＣＳＫ９に特異的に結合する結合タンパク質、及び検出可能な標識体を含む免疫抱合体を提供し、好ましくは、前記検出可能な標識体が蛍光標識体、発色標識体を含む。
本発明のもう一つの態様は、前記ＰＣＳＫ９に特異的に結合する結合タンパク質、又は前記免疫抱合体を含むＰＣＳＫ９レベルの検出のための検出キットを提供する。
本発明の他の態様は、本文の公開内容により、当業者にとって自明なものである。
モノクローナル抗体Ｂ９２８７、Ｂ９２８８がそれぞれに、ヒトＰＣＳＫ９抗原に対する動力学解析結果を示す。 モノクローナル抗体Ｂ９２８７、Ｂ９２８８がそれぞれに、カニクイザルＰＣＳＫ９抗原に対する動力学解析結果を示す。 モノクローナル抗体Ｂ９２８７、Ｂ９２８８がそれぞれに、マウスＰＣＳＫ９抗原に対する動力学解析結果を示す。 本発明の抗原結合タンパク質が細胞のＬＤＬ吸収を低下させる能力の測定を示す。 抗ＰＣＳＫ９好適抗体が高脂血症赤毛猿の血清ＬＤＬレベルに対する反応を示す。１群毎に７歳以上の雄及び雌のアカゲザルをそれぞれに４頭有し、第０日にて示された用量の抗ＰＣＳＫ９好適抗体又は同等体積の食塩水キャリアーを皮下注射によって投与する。示された時点で血漿サンプルを採取して、血漿ＬＤＬ量を第０日の血清ＬＤＬ量と比較する。
本発明者は、広範かつ詳細な研究を行ったところ、独特な相補性決定領域（ＣＤＲ領域）を含有するプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型（Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ ９，ＰＣＳＫ９）に特異的に結合する結合タンパク質を得て、これはＰＣＳＫ９に特異的に結合し、かつＰＣＳＫ９の機能を効果的に抑制して、血漿中のＬＤＬコレステロールレベルを低減させることができ、ＰＣＳＫ９の機能に関連する疾患又はＰＣＳＫ９の機能に影響される疾患の治療に使用される。
＜結合タンパク質＞
本発明は、ＰＣＳＫ９に特異的に結合することができる結合タンパク質を提供する。本発明の結合タンパク質は、完全な免疫グロブリン分子であってもよく、抗原結合断片であってもよく、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ドメイン抗体、二価一本鎖抗体、一本鎖ファージ抗体、二重特異性二本鎖抗体、三本鎖抗体、四本鎖抗体などを含むが、これらに限定されない。
＜結合タンパク質＞
本発明は、ＰＣＳＫ９に特異的に結合することができる結合タンパク質を提供する。本発明の結合タンパク質は、完全な免疫グロブリン分子であってもよく、抗原結合断片であってもよく、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ドメイン抗体、二価一本鎖抗体、一本鎖ファージ抗体、二重特異性二本鎖抗体、四本鎖抗体などを含むが、これらに限定されない。
本発明のもう一つの態様は、本明細書に記載の結合タンパク質の機能的変異体を含む。変異体は、親結合タンパク質と競合して、ＰＣＳＫ９に特異的に結合することができれば、当該変異体が本発明の結合タンパク質の機能的変異体であると考えられる。言い換えれば、前記機能的変異体は、依然としてＰＣＳＫ９又はその断片に結合することができる。機能的変異体は、一級構造配列が基本的に類似しているが、例えば親結合タンパク質において発現されていないインビトロまたはインビボでの化学的および／または生化学的に修飾された誘導体を含むが、これらに限定されない。このような修飾には、アセチル化、アシル化、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、架橋、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、酸化、ＰＥＧ化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化などが挙げられる。言い換えれば、親結合タンパク質のアミノ酸および／またはヌクレオチド配列における修飾は、前記ヌクレオチド配列によってコードされているか、または前記アミノ酸配列を含む前記結合タンパク質の結合特性に有意に影響しないか、またはそれを変更しなく、つまり、前記結合タンパク質は依然としてその標的部位を認識して結合することができる。
前記機能的変異体は、ヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、付加および欠失を含む保存的配列修飾を有してもよい。これらの修飾は、当分野で知られている標準技術、例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在突然変異誘発により導入することができ、かつ天然および非天然ヌクレオチドおよびアミノ酸を含むことができる。
保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の構造又は化学性質を有する別のアミノ酸残基に置換されることを含む。似ている側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で既に定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖アミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖アミノ酸（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖アミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、分岐側鎖アミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族性側鎖アミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）を含む。当業者であれば、上記ファミリー以外の他のアミノ酸残基のファミリー分類方式も使用できることを理解する。また、変異体は、非保存的アミノ酸置換を有することができ、例えば、アミノ酸が、異なる構造又は化学性質を有する他のアミノ酸残基によって置換される。類似している小さな変異は、アミノ酸の欠失又は挿入、又はその両方を含むことができる。免疫学的活性を排除することなく、どのアミノ酸残基が置換、挿入または欠失され得るかを決定するためのガイダンスは、当分野で周知のコンピュータプログラムを用いて見出すことができる。
機能的変異体は、アミノ酸配列がアミノ末端またはカルボキシ末端、またはその両方の端部にあるトランケート体を含むことができる。本発明の機能的変異体は、親結合タンパク質と同じかまたは異なる、より高いまたはより低い結合親和性を有し得るが、依然としてＰＣＳＫ９またはその断片に結合することができる。例えば、本発明の機能的変異体は、親結合タンパク質と比較して、ＰＣＳＫ９またはその断片に対する結合親和性の増加または減少（好ましくは増加）を有することができる。好ましくは、フレームワーク領域、超可変領域またはＣＤＲ領域を含むが、これに限定されない可変領域のアミノ酸配列は修飾される。通常、軽鎖および重鎖可変領域は、３つのＣＤＲを含む３つの超可変領域、およびより保存されている領域、いわゆるフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。超可変領域は、ＣＤＲ由来のアミノ酸残基及び超可変ループ由来のアミノ酸残基を含む。本発明の範囲内の機能的変異体は、本明細書に記載の親結合タンパク質の少なくとも約５０％〜約９９％、好ましくは少なくとも約６０％〜約９９％、より好ましくは少なくとも約７０％〜約９９％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％〜約９９％、最も好ましくは少なくとも約９０％〜約９９％、特に少なくとも約９５％〜約９９％、特に少なくとも約９７％〜約９９％のアミノ酸配列相同性を有する。ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔのような当業者に公知のコンピュータアルゴリズムは、比較のためにアミノ酸配列を最適に配列すること、及び類似または同一のアミノ酸残基を同定することに用いられる。機能的変異体は、当業者に公知の一般的な分子生物学的方法により親分子結合タンパク質またはその一部を改変することによって得ることができ、前記方法は、エラープローンＰＣＲ、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発、部位特異的変異誘発、重鎖および／または軽鎖シャッフリング法を含むが、これらに限定されない。
本発明の好ましい態様として、前記結合タンパク質はモノクローナル抗体である。抗体の抗原結合特性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される重鎖および軽鎖可変領域に位置する３つの特異的領域によって記述することができ、前記ＣＤＲ領域は可変領域を４つのフレームワーク領域（ＦＲ）に分割しており、４つのＦＲのアミノ酸配列は比較的保存的であり、結合反応に直接関与しない。これらのＣＤＲは、環状構造を形成し、その間のＦＲによって形成されたβシートが空間的に互いに近接し、重鎖上のＣＤＲおよび対応する軽鎖上のＣＤＲが抗体の抗原結合部位を構成する。本発明の抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体のＣＤＲ領域は新規であり、既存の抗ＰＣＳＫ９抗体とは異なる。
本発明のモノクローナル抗体は、全部がヒト由来であり、免疫原性が低く、安全性が高いという特徴を有する。
本発明のもう一つの態様は、少なくとも１種の結合タンパク質、その機能的変異体また免疫抱合体をコードした核酸分子を提供する。そのような核酸分子は、例えば、上記のような親和性成熟方法において、クローニングのための中間体として使用することができる。好ましい一実施態様において、前記核酸分子は単離または精製されたものである。ＤＮＡ分子の配列は、通常の技術を用いて、またはハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。
一旦関連配列が得られると、組換え法によって関連配列を大量に得ることができる。これは、通常、上記関連配列をベクターにクローニングし、それを細胞に移し、次いで、通常の方法によって増殖した宿主細胞から関連配列を単離することによって行われる。
さらに、人工合成の方法により関係配列を合成し、特に断片長さが短い場合に、関連配列を合成することができる。通常、最初に複数の小さな断片を合成し、そしてそれらを連結することによって配列が長い断片を得ることができる。
現在、本発明の結合タンパク質（またはその断片、またはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列は、化学合成によって完全に得ることができる。その後、当該ＤＮＡ配列を、当分野で公知の様々な既存のＤＮＡ分子（またはベクター）および細胞に導入することができる。さらに、化学合成によって本発明の結合タンパク質の配列に突然変異を導入することもできる。
さらに、本発明は、上記の適切なＤＮＡ配列、及び適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターにも関する。これらのベクターは、タンパク質を発現できるように適切な宿主細胞を形質転換することに使用され得る。好ましくは、本発明のベクターは、例えば、ウイルスプロモーターを含むプラスミド発現ベクターであり、かつ前記発現ベクターに抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体重鎖可変領域（ＶＨ）と定常領域ＩｇＧ２（ヒトＩｇＧ２由来の定常領域）の融合配列、および軽鎖可変領域とヒトＩｇＬａｍｂｄａ（ヒトＩｇｌａｍｂｄａ由来の定常領域）の融合配列をそれぞれ挿入した。
宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞、または酵母細胞などの下等真核細胞、または哺乳動物細胞などの高等真核細胞であってもいい。代表的な例は、大腸菌、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などの細菌細胞；サルモネラティフィムリウム；酵母などの真菌細胞；植物細胞；ショウジョウバエＳ２またはＳｆ９などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ７、ＮＳＯまたはＢｏｗｅｓメラノーマ細胞などの動物細胞などがある。本発明に特に適用する宿主細胞は、真核宿主細胞、特にＣＨＯ細胞、２９３細胞などの哺乳動物細胞である。
必要であれば、組換え結合タンパク質は、その物理的、化学的および他の特性を利用する様々な分離方法によって単離および精製することができる。これらの方法は、当業者にとって周知である。このような方法の例としては、通常のリフォールディング処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透滅菌、超音波処理、超遠心分離、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および様々な他の液体クロマトグラフィー技術およびこれらの方法の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
＜医薬組成物＞
本発明の結合分子は、ＰＣＳＫ９の発現または活性障害に関連する疾患の診断、治療および／または予防のための医薬組成物の製造に使用される。
前記「ＰＣＳＫ９の発現または活性障害に関連する疾患」は、高血清コレステロールレベルに関連する疾患を含む。好ましくは、前記「ＰＣＳＫ９の発現または活性障害に関連する疾患」は、高コレステロール血症、冠動脈心疾患、メタボリックシンドローム、急性冠動脈症候群および関連疾患を含むが、これらに限定されない。前記ＰＣＳＫ９機能は、ＰＣＳＫ９が関与することを必要とするか、またはＰＣＳＫ９によって激化または強化される任意の活性および機能を指す。前記ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体は、種々の診断目的のためにＰＣＳＫ９を検出および定量することができる。
本発明の新規な知見に基づいて、有効量の本発明の結合分子と、薬学的に許容される担体とを含む、ＰＣＳＫ９発現または活性障害に関連する疾患を診断、治療および／または予防するための医薬組成物をも提供する。
本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、分子本体および組成物が動物またはヒトに適切に投与されるとき、有害な、アレルギーまたは他の不都合な反応を生じないことを意味する。本明細書中で使用される「薬学的に許容される担体」は、本発明の結合分子との相溶性があるべきであり、すなわち、通常の状況下で組成物の効果を実質的に低下させることなく、本発明の結合分子と混じり合い得る。
薬学的に許容される担体またはその成分として使用されるいくつかの物質の具体的な例は、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよびメチルセルロースなどのセルロースおよびその誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；ステアリン酸およびステアリン酸マグネシウムなどの固体潤滑剤；硫酸カルシウム；落花生油、綿実油、ごま油、オリーブ油、トウモロコシ油、カカオ脂などの植物油；プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；アルギン酸；Ｔｗｅｅｎ（登録商標）などの乳化剤；ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤；着色剤；調味剤；製錠剤、安定剤；酸化防止剤；防腐剤；パイロジェンフリー水；等張食塩水；およびリン酸緩衝液などが挙げられる。
本発明の医薬組成物は、必要に応じて種々の剤形に調製することができ、患者の種類、年齢、体重及び一般的な疾患状態、投与方法などの要因に応じて、医師が有効量で投与することができる。投与方法は、例えば、注射または他の治療方式により行うことができる。
本発明の結合分子は、分離されていないかまたは単離された形態で使用される。さらに、本発明の結合分子は、単独で、または本発明の少なくとも１種の結合分子（またはその変異体もしくは断片）を含む混合物中で使用される。言い換えれば、前記結合分子は、例えば本発明の２種類以上の結合分子、その変異体または断片を含む医薬組成物として組み合わせて使用することができる。例えば、活性が異なるが、相補的な活性を有する結合分子は、所望の予防的、治療的または診断的効果を達成するように単一の治療レジメンで組み合わせることができるが、同じ活性を有する結合分子を、所望の予防、治療または診断効果を達成するように単一の治療レジメンで組み合わせることができる。
本発明の結合分子または医薬の組み合わせは、ヒトで使用する前に適切な動物モデル系で検出することができる。そのような動物モデル系には、マウス、サルが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の結合分子の適切な用量範囲は、例えば、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１〜１５ｍｇ／ｋｇ体重である。さらに、例えば、ボーラスを投与してもよく、経時的に複数の分割用量を投与してもよく、または治療状況の緊急性に応じて用量を比例して減少または増加させてもよい。本発明の分子および組成物は、無菌であることが好ましい。これらの分子および組成物を無菌にするための方法は、当該分野で周知である。診断、予防および／または治療のための他の分子は、本発明の結合分子と同様の投与計画で投与することができる。他の分子が別々に投与される場合、本発明の１種もしくは複数種の結合分子または医薬組成物の投与の前、同時、またはその後に患者に投与され得る。ヒト患者への正確な投与計画は、通常、臨床試験中に選択される。
本発明の結合分子は、臨床医による使用の便宜のために、適切なパッケージに入れてキットを形成することができる。好ましくは、前記キットは、さらに投与方法に関する使用説明書を含むことができる。
また、本発明は、血清コレステロールレベルを低下させ、患者の高血清コレステロールレベルに関連する疾患を治療または予防する方法を含み、前記方法は、有効量の本発明の少なくとも１種のモノクローナル抗体を患者に投与することを含む。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、ＬＤＬＲタンパク質の利用率を向上させる医薬と組み合わせて投与することができる。前述したＬＤＬＲタンパク質の利用率を向上させる医薬は、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチンを含み、またはＬＤＬＲタンパク質の利用率を向上させるための上記の２種以上の医薬を選択することができる。
＜免疫抱合体＞
もう一つの態様では、本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つの結合タンパク質、及び少なくとも１つの機能性分子（例えば、検出可能な部分／物質の分子）を含む免疫抱合体に関する。前記抗体と前記機能性分子は、共有結合、カップリング、付着、架橋などの方式によって抱合体を構成することができる。本発明の免疫抱合体は、１つ以上の標識を含むことができる。前記標識は、共有結合によって本発明の結合タンパク質に直接的に結合／抱合することもできる。あるいは、前記標識は、１種又は複数種の連結化合物によって前記結合タンパク質に結合／抱合することができる。標識及び結合タンパク質の抱合技術は、当業者に周知である。本発明の免疫抱合体の標識は治療剤であることができる。
前記免疫抱合体は、本発明の抗体及び検出可能な標識体を含むことができる。検出可能な標識体には、蛍光標識体、発色標識体が含まれ、例えば、酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。１つ以上の標識体を含むこともできる。検出および／または分析および／または診断のために、抗体を標識するために使用される標識は、免疫組織化学染色（組織）試料、フローサイトメトリーなどのような特定の検出／分析／診断技術および／または方法に依存する。当該分野で公知の検出／分析／診断技術および／または方法に適する標識は、当業者に周知である。
また、本発明のヒト結合タンパク質または免疫抱合体は、ＰＣＳＫ９タンパク質またはその断片のインビトロ免疫アッセイまたは精製に特に有用な固体支持体に結合させることもできる。そのような固体支持体は、多孔性または非多孔性、平面または非平面である。本発明の結合タンパク質は、精製の便宜のため、標識配列に融合することができる。前記標識配列の例としては、ヘキサヒスチジン標識、ヘマグルチニン（ＨＡ）標識、ｍｙｃ標識、またはｆｌａｇ標識が挙げられるが、これらに限定されない。或いは、１種の抗体は、別の抗体に抱合して抗体ヘテロ抱合体を形成することができる。
本発明の結合タンパク質（抗体）の配列は、リーダーペプチドを含むことができ、またはリーダーペプチドを含んでいなくてもよく、細胞によって発現された場合、成熟した結合タンパク質（抗体）はリーダーペプチドを含まない。
＜検出試薬およびキット＞
本発明の前記結合分子に基づいて、試験される試料中のＰＣＳＫ９のレベルを簡便、迅速かつ正確に検出するための試薬またはキットを調製することができる。
本明細書中で使用したように、用語「試験される試料」は、生物学由来の血液および他の体液試料、生検組織試料または組織培養物などの固体組織試料、またはそれらから誘導される細胞またはその子孫を含む様々な試料タイプを包含する。この用語はまた、タンパク質またはポリヌクレオチドのような特定の成分の試薬による処理、溶解、または富化などの、獲得後の任意の手段によって処理された試料を包含する。
従って、本発明は、試験される試料中のＰＣＳＫ９のレベルを検出するための検出キットを提供し、当該検出キットは、本発明のＰＣＳＫ９結合分子またはＰＣＳＫ９結合分子と検出可能な標識体の免疫抱合体を含む。
本発明により提供されるＰＣＳＫ９結合分子を得た後、ＰＣＳＫ９レベルを特異的に検出するための検出キットを簡便に製造することができる。
検出の便宜のために、前記キットは、本発明の結合分子またはＰＣＳＫ９結合分子と検出可能な標識体を含む免疫抱合体に加えて、他の検出試薬または補助試薬をさらに含むことができる。前記補助試薬は、例えば、ＥＬＩＳＡキットにおいて通常に使用されている試薬のいくつかであり、これらの試薬の特性およびそれらの配合方法は、当業者に周知であり、例えば顕色剤、標識物、二次抗体、抗抗体、増感剤などがある。当業者であれば、本発明の結合分子がＰＣＳＫ９を認識するための試薬として利用される限り、検出キットの様々な変形が本発明に含まれることを理解すべきである。
さらに、前記キットには、その中に装填された試薬の使用方法を示すための使用説明書が含まれていてもよい。
本発明により提供される結合分子および／またはキットを得た後、種々の免疫学的に関連する方法を使用して、試料中のＰＣＳＫ９またはその含有量を検出し、それによって試験される試料の供与体にＰＣＳＫ９の発現または活性障害と関連する疾患が存在するかどうかを知ることができる。
以下、具体的な実施例に基づいて、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明の説明のみに用いられ、本発明の範囲を限定するつもりがないと理解されるべきである。以下の実施例において、具体的な実験方法を特定していないが、通常、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら編著、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第三版、科学出版社、２００２年に記載のような通常の条件に従って、または製造者に推薦された条件に従って実験を行う。
＜実施例１＞ＰＣＳＫ９モノクローン抗体の最適化とスクリーニング
要望に応じたＰＣＳＫ９抗体を見出すために、本発明者は、広範な研究およびスクリーニングの後、完全ヒトファージライブラリーから優れた性能を有する２株のモノクローナル抗体を得た。それらの可変ドメインの核酸配列およびアミノ酸配列は、以下のように記載されている。
（１）モノクローン抗体Ｂ９２８７
リーダーペプチドを含む重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のようであり；リーダーペプチドを含まない重鎖可変領域のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１のようである。
リーダーペプチドを含む重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のようであり；リーダーペプチドを含まない重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のようである。
重鎖の各ＣＤＲ領域のアミノ酸配列：
ＨＣＤＲ１：ＡＦＴＦＤＳＦＧＭＨ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；
ＨＣＤＲ２：ＬＬＷＳＤＧＳＤＥＹＹＡＤＳＡＫＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）；
ＨＣＤＲ３：ＡＶＧＡＩＹＱＦＹＡＭＤＶ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）。
重鎖の各ＣＤＲ領域のヌクレオチド配列：
ＨＣＤＲ１：ＧＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＴＴＣＧＧＣＡＴＧＣＡＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）；
ＨＣＤＲ２：ＣＴＧＣＴＴＴＧＧＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＧＡＣＧＡＧＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＴＣＣＧＣ ＴＡＡＧＧＧＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）；
ＨＣＤＲ３：ＧＣＧＧＴＧＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＣＡＧＴＴＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＣＧＴＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）。
軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のようであり；リーダーペプチドを含まない軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のようである。
軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のようであり；リーダーペプチドを含まない軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のようである。
軽鎖の各ＣＤＲ領域のアミノ酸配列：
ＬＣＤＲ１：ＴＧＴＳＳＮＩＧＮＱＦＶＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）；
ＬＣＤＲ２：ＥＹＮＫＲＰＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；
ＬＣＤＲ３：ＧＳＷＤＳＳＬＳＧＹＶ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）。
軽鎖の各ＣＤＲ領域のヌクレオチド配列：
ＬＣＤＲ１：ＡＣＣＧＧＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＣＡＡＣＣＡＡＴＴＣＧＴＧＴＣＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）；
ＬＣＤＲ２：ＧＡＧＴＡＣＡＡＣＡＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）；
ＬＣＤＲ３：ＧＧＣＴＣＣＴＧＧＧＡＣＴＣＴＴＣＣＣＴＧＴＣＣＧＧＣＴＡＴＧＴＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）。
（２）モノクローン抗体Ｂ９２８８
重鎖のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のようであり；リーダーペプチドを含まない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のようである。
重鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のようであり；リーダーペプチドを含まない重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６のようである。
重鎖の各ＣＤＲ領域のアミノ酸配列：
ＨＣＤＲ１：ＡＦＴＦＤＳＦＧＭＨ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；
ＨＣＤＲ２：ＬＬＷＳＤＧＳＤＥＹＹＡＤＳＡＫＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）；
ＨＣＤＲ３：ＡＶＧＳＩＹＹＹＹＡＭＤＶ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）。
重鎖の各ＣＤＲ領域のヌクレオチド配列：
ＨＣＤＲ１：ＧＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＴＴＣＧＧＣＡＴＧＣＡＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）；
ＨＣＤＲ２：ＣＴＧＣＴＴＴＧＧＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＧＡＣＧＡＧＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＴＣ ＣＧＣＴＡＡＧＧＧＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）；
ＨＣＤＲ３：ＧＣＧＧＴＧＧＧＣＴＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＣＧＴＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）。
モノクローナル抗体Ｂ９２８８の軽鎖ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、Ｂ９２８７の軽鎖ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列と同じであり、対応する各ＣＤＲ領域もＢ９２８７と同じである。
＜実施例２＞トランスフェクトされた細胞からのＰＣＳＫ９モノクローナル抗体の調製
前記モノクローナル抗体Ｂ９２８７の重鎖ヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１；リーダーペプチドコード配列を含む）の両端にＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ部位を付加し、これをｐＣＤＮＡ３．１＋プラスミドの対応する部位に挿入し；前記モノクローナル抗体Ｂ９２８７の軽鎖ヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３；リーダーペプチドコード配列を含む）の両端にＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ部位を付加し、これをｐＣＤＮＡ３．１＋プラスミドの対応する部位に挿入する。前記モノクローナル抗体Ｂ９２８７を発現する組換えプラスミドを得た。
前記モノクローナル抗体Ｂ９２８８の重鎖ヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５；リーダーペプチドコード配列を含む）の両端にＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ部位を付加し、これをｐＣＤＮＡ３．１＋プラスミドの対応する部位に挿入し；前記モノクローナル抗体Ｂ９２８８の軽鎖ヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の両端にＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ部位を付加し、これをｐＣＤＮＡ３．１＋プラスミドの対応する部位に挿入する。前記モノクローナル抗体Ｂ９２８８を発現する組換えプラスミドを得た。
（１）一過性トランスフェクション
上記した前記モノクローナル抗体Ｂ９２８７を発現する組換えプラスミドまたは前記モノクローナル抗体Ｂ９２８８を発現する組換えプラスミドを、リポソーム法により懸濁ＨＥＫ２９３細胞に一過的にトランスフェクトした。
得られたトランスフェクションされた細胞をＥｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地で３７℃、８％ＣＯ2、回転数１２０ｒｐｍの条件下で培養した。
トランスフェクション細胞を大量に培養した後、二段階遠心分離（第１段階遠心分離条件１０分間、１０００ｇ；第２段階遠心分離条件３０分間、１００００ｇ）により、細胞および細胞破片を除去することで、上清を得た。清澄化された上清を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラムに充填し、３回の溶出（溶出緩衝液が、順次にＰＢ １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．５、２０ｍＭ Ｎａ−ｃｉｔｒａｔｅ １Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ５．５、２０ｍＭ Ｎａ−ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ５．５である）によって不純物を除去し、ｐＨ直線溶出法（開始緩衝液Ａ：２０ｍＭ Ｎａ−ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ５．５；標的緩衝液Ｂ：２０ｍＭ Ｎａ−ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ３．０）によって標的抗体を分離して捕捉した。最後に、限外濾過濃縮工程によって、標的抗体を２００ｍＭ ＨＥＰＥ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ７．０緩衝液に置き換えた。
（２）Ｂ９２８７を安定に発現する細胞の電気的トランスフェクション
Ｂ９２８７軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）およびＢ９２８７重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）を含む構築プラスミド（プラスミドＤＮＡ総量２０μｇ）を、１．０×１０7個の宿主細胞ＣＨＯ−Ｋ１細胞中に混合し；当該細胞とプラスミドの混合液をエレクトロポレーター（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ）に入れ、電圧３００Ｖおよび容量９５０μＦの指数関数的な減衰波を用いて細胞とプラスミドの混合液に対して電気ショック同時トランスフェクションにかけた。電気的トランスフェクションが行われた細胞とＤＮＡの混合液を、２ｍＬの宿主細胞基礎培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標） ＡｄｖａｎｃｅｄTM ＣＨＯ Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｉｇｍａ；６ｍＭ Ｌ−グルタミンを含む、Ｓｉｇｍａ）を含有する６ウェルプレートに加え、細胞を二酸化炭素インキュベーターに入れて３７℃で２４時間インキュベートし、その後、培地を選択増殖培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標） ＡｄｖａｎｃｅｄTM ＣＨＯ Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｉｇｍａ； Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ含有、２０μｇ／ｍＬ、ＧＩＢＣＯおよび６ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ， Ｓｉｇｍａ）に置き換えて、細胞生存率が９０％以上に回復するまで約３週間圧力スクリーニングを行い、ＣＨＯ−Ｋ１ゲノムに組み込まれた重鎖および軽鎖を含むＰｏｏｌ細胞系を得た。Ｐｏｏｌ細胞の生存率が９０％以上に回復したとき、１２５ｍＬ振とうフラスコで流加培養し、培養体積が３０ｍＬであり、初期細胞濃度が０．３×１０6／ｍＬであった。３、５、７、９、１１、１３日目に添加培地（Ｅｘ−ＣＥＬＬ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯ ｆｅｅｄ １（ｗｉｔｈ ｇｌｕｃｏｓｅ）、Ｓｉｇｍａ）を補充し、サンプルを採取して細胞密度と生存率を測定し、グルコース濃度が３ｇ／Ｌに低減したときにグルコースを６ｇ／Ｌになるように添加し、生存率が７０％以下に低減したときに培養を停止し、抗体濃度を検出する。
（３）Ｂ９２８７トランスフェクタントを安定に発現する半固体クローニングおよびＥＬＩＳＡスクリーニング
抗体濃度が比較的に高いＰｏｏｌ細胞を選択してモノクローナルスクリーニングを行い、５０−２００個のＰｏｏｌ細胞を含有する細胞懸濁液を１０ｍＬ半固体培地（ＣｌｏｎｅＭｅｄｉａ ＣＨＯ Ｇｒｏｗｔｈ Ａ ｗｉｔｈ Ｌ−Ｇｌｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）と均一に混合した後に、１００ｍｍ培養皿に敷き広げて、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで１４日間培養し、中程度の細胞群落を採取して、２００μＬの選択培地を含む９６ウェルプレートに移して、４−５日間で培養し、細胞懸濁液をブローし、均一に混合し、２枚の９６ウェルプレートに平均に分け、それぞれ新鮮な培地を補充して２００μＬの培養系にした。そのうち、１枚のプレートについて通常の液体交換と増殖を行い、液体交換と増殖を行うときに、細胞懸濁液をブローし、均一に混合し、培地１００μＬを採取して捨てて、１００μＬの新鮮な培地を添加し、このように繰り返した。他の１枚のプレートについて、液体交換を行わず、１０日間連続的に培養し、細胞上清を採取してＥＬＩＳＡ検出を行った。ＯＤ値に基づいて細胞株を選択して、増殖及びサブクローニングスクリーニングを行った。第１ラウンドの半固体スクリーニングによって得られた好ましい細胞株を、０．５細胞／ウェルの密度で９６ウェル細胞プレートに敷広げた。７日後、単一細胞クローンが特定のスクリーニングスケールまで増殖するまで細胞を観察し、単一細胞集落のみを有するウェルを単一細胞ウェルとして選択した。９６ウェル培養プレートの単一細胞ウェルの培地（適切に希釈することができる）を被覆ＥＬＩＳＡプレートに移し、ＥＬＩＳＡスクリーニング分析を行い、ＴＯＰ３単一細胞系までスクリーニングし、流加培養して発現量を確認した。
＜実施例３＞ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体の生物分析の特性評価
（１）キャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＳＤＳ）
抗体について、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステムによって、キャピラリー電気泳動による分析を行った。結果により、還元および非還元の条件下で、本発明のＰＣＳＫ９モノクローナル抗体（リーダーペプチドを含まない、以下同様）の試料のピーク純度百分率および分子量は、表１（非還元条件）および表２（還元条件）に示されると分かる。
（２）モレキュラーシーブ液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）
モノクローナル抗体を０．２μｍフィルター（Ｔｈｏｍｓｏｎ、カタログ番号２５５３５−１００）で濾過し、ＭＡｂＰａｃ ＳＥＣ−１カラム（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号０７４６９６２０）にロードした。移動相緩衝液は５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．２であり、流速は０．２ｍｌ／分間であった。ピーク計算はＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用して統合された。本発明のＰＣＳＫ９モノクローナル抗体の主ピークおよび凝集ピークの百分率を表３に示す。
（３）示差走査熱量測定法によるタンパク質安定性の評価
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）は、試料と基準温度との間の熱の差を温度の関数として測定する技術である。示差走査熱量測定法は、５０％タンパク質変性（ＴＭ）における温度／融解温度を含む、複数のタンパク質の特性を測定するために使用することができ、これがタンパク質の安定性を評価する方法である。
検出される抗体を１ｍｇ／ｍｌの濃度でＮａｎｏ ＤＳＣサンプルチャンバーに装填し、温度を１℃／分間の速度で２５℃から１００℃まで昇温した。実施前に正確な開始温度を保証するために、サンプルを測定する前に、予め１５分間で走査した。緩衝液のみのサンプルの数値をサンプルデータから差し引き、Ｎａｎｏ ＤＳＣソフトウェアを使用してＴｍを計算した。結果を表４に示した。
＜実施例４＞抗体とＰＣＳＫ９との結合の特性評価
ヒト、マウスまたはカニクイザルのＰＣＳＫ９に対してＰＣＳＫ９モノクローナル抗体の結合能力は、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて評価した。抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（ＡＨＣ）の動力学的グレードのバイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、＃１８−５０６３）を、ｐＨ１．７でのグリシン前処理の後、アッセイ緩衝液に浸漬した。検出されるＰＣＳＫ９モノクローナル抗体は、１０μｇ／ｍｌの濃度でＡＨＣバイオセンサーに１２０秒間固定された。次いで、ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体がロードされたＡＨＣバイオセンサーは、異なる濃度のヒトＰＣＳＫ９抗原（ＧｅｎｅＢａｎｋ ＡＸ１２７５３０．１）、マウスＰＣＳＫ９抗原（ＮＣＢＩ ＮＭ＿１５３５６５．２）またはカニクイザルＰＣＳＫ９抗原（ＮＣＢＩ ＮＭ＿００１１１２６６０．１）及び緩衝液に浸漬された。分析物カラムの最終希釈点は、緩衝液とロードされたバイオセンサーとの間の非特異的結合を検出するための検出緩衝液のみを含む。抗原と抗体の結合は、８０秒から１２０秒まで検出され、続いて１２０秒から１８０秒まで解離した。検出緩衝液で６０秒のベースラインを決定した。抗ＰＣＳＫ９のモノクローナル抗体の親和性曲線は、１：１で結合する動態センシング１価結合モデルを用いてフィッティングさせたものである。動態分析を図１および表５に示した。
＜実施例５＞細胞ＬＤＬ吸収アッセイ
ヒトＨｅｐＧ２細胞を、黒色、透明の９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）における、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｉｎｃ）に、５×１０4細胞／ウェルの濃度で敷広げて、３７℃（５％ＣＯ2）で一晩インキュベートした。ＰＣＳＫ９と抗体との複合体を形成するために、２０μｇ／ｍｌのヒトＰＣＳＫ９を、吸収緩衝液（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）で希釈した種々の濃度の抗体、または緩衝液単独（対照）と共に室温で１時間インキュベートした。細胞上清を除去した後、ＰＣＳＫ９／抗体の混合物を添加し、続いて吸収緩衝液中で最終濃度８μｇ／ｍｌに希釈したＤｉｌ−ＬＤＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。３７℃（５％ＣＯ2）で１６〜１８時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで徹底的に洗浄し、細胞蛍光シグナルをＴＥＣＡＮ Ｍ１０００ ５５４ｎｍ（励起）および５７１ｎｍ（発射）によって検出した。
細胞吸収アッセイの結果を図２に示した。すなわち、ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体のＩＣ５０値を測定し、具体的には数値が３．９４ｎＭ（Ｂ９２８７）および１．４６ｎＭ（Ｂ９２８８）ｐＭ（図２）であった。
以上の結果から、本発明の抗原結合タンパク質は、細胞のＬＤＬ吸収を低減する優れた能力を有することが示された。
＜実施例６＞アカゲザル体内におけるＰＣＳＫ９モノクローナル抗体の血中ＬＤＬレベルへの影響
高脂血症アカゲザルで、ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体Ｂ９２８７が非霊長類動物疾患モデルの体内における血清ＬＤＬを低減する効果について試験した。７歳以上の高脂血症の４頭のアカゲザルに、ビヒクル（ＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）または３ｍｇ／ｋｇの用量でＰＣＳＫ９モノクローナル抗体Ｂ９２８７を第０日に１回皮下注射した。それぞれ、第０、１、３、５、７、９、１１、１４日で一晩絶食後の血清ＬＤＬレベルについて分析した。
結果を図３に示した。３ｍｇ／ｋｇのＰＣＳＫ９モノクローナル抗体Ｂ９２８７を１回注射したすべて４頭の動物において、血清ＬＤＬ（５０％以上）の有意な低減が生じた。
また、本発明者は同様に、高脂血症アカゲザルにおいて、ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体Ｂ９２８８が体内血清ＬＤＬを低減する効果について試験した。この結果は、ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体Ｂ９２８８が、アカゲザルにおける血清ＬＤＬレベルを有意に低減させたことをも実証した。
従って、ＰＣＳＫ９抗体は、非ヒト霊長類動物疾患モデルにおける血清ＬＤＬレベルを低下させる。
本発明に言及されている全ての文献は、文献毎に参照として別々に引用されるように、その内容が参照により本出願に組み込まれる。さらに、本発明の上記開示内容を読んだ後に、当業者は、本発明に対して様々な修正および変更をすることができ、これらの同等の形式も本願に添付の特許請求の範囲により限定される範囲に落ちると理解されるべきである。

Claims (13)

  1. 抗体および抗原結合断片が軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を有し、
    前記重鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示されるアミノ酸配列であり；
    前記重鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されるアミノ酸配列であり；
    前記重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるアミノ酸配列であり；
    前記軽鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるアミノ酸配列であり；
    前記軽鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で示されるアミノ酸配列であり；
    前記軽鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるアミノ酸配列であり、かつ
    前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列であり；或いは
    前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列であり；或いは
    前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４で示されるアミノ酸配列であり；或いは
    前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４で示されるアミノ酸配列である、ことを特徴とするＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体および抗原結合断片。
  2. （ａ） 重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示されるアミノ酸配列であり；軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるアミノ酸配列であり；或いは
    （ｂ） 重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるアミノ酸配列であり；軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるアミノ酸配列である、ことを特徴とする請求項１に記載のＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体および抗原結合断片。
  3. 請求項１または２に記載のＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体および抗原結合断片をコードした核酸。
  4. 請求項３に記載の核酸を含む発現ベクター。
  5. 請求項４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞、又は、ゲノムに請求項３に記載の核酸が組み込まれた宿主細胞。
  6. ＰＣＳＫ９の発現又は活性障害に関連する疾患の診断、治療及び／又は予防のための医薬の製造における請求項１または２に記載のＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体および抗原結合断片の使用。
  7. 前記ＰＣＳＫ９の発現又は活性障害に関連する疾患が、高血清コレステロールレベルに関連する疾患を含む、請求項６に記載の使用。
  8. 前記疾患が、高コレステロール血症、冠動脈心疾患、メタボリックシンドローム、急性冠動脈症候群を含む、請求項７に記載の使用。
  9. 有効量の請求項１または２に記載のＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体および抗原結合断片、及び薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
  10. 請求項１または２に記載のＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体および抗原結合断片、又は、請求項９に記載の医薬組成物を含むことを特徴とするＰＣＳＫ９の発現又は活性障害に関連する疾患の治療及び／又は予防のためのキット。
  11. 請求項１または２に記載のＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体および抗原結合断片、及び検出可能な標識体を含むことを特徴とする免疫抱合体。
  12. 前記検出可能な標識体が、蛍光標識体、発色標識体を含むことを特徴とする請求項１１に記載の免疫抱合体。
  13. 請求項１または２に記載のＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体および抗原結合断片、又は請求項１１に記載の免疫抱合体を含むことを特徴とするＰＣＳＫ９レベルの検出のための検出キット。
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