JP6757249B2 - 硫酸化ポリグルロン酸多糖又はその薬学的塩、その調製方法及びその使用 - Google Patents
硫酸化ポリグルロン酸多糖又はその薬学的塩、その調製方法及びその使用 Download PDFInfo
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Description
下記の構造式(II)において示される通りのポリグルロン酸を、スルホン化試薬と反応させ、続いて還元剤を介する還元により、一般式(I)において示される通りの硫酸ポリグルロン酸を得るステップ
を含み、
デキストランに対して10000Daの重量平均分子量を有するポリグルロン酸を、青島海洋大学(Ocean University of China)のLan Tai Pharmaceuticals社から購入した。ホルムアミド、クロロスルホン酸等、ARグレードは、Sinopharm Group Chemical Reagent社により提供された。デキストラン分子量標準は、Fluka社から購入した。ドキソルビシン注射剤(アドリアマイシン(ADM,Adriamycin))は、Zhejiang Haimen Pharmaceutical Factory社によって製造されたZhejiang health medicine accurate (1996) No. 135501であり、含有量は10mg/バイアルであり、溶媒は生理食塩水であり、各投与前に生理食塩水で所望の濃度に希釈して調剤した。TSK gel2000SWXL、TSK gel G3000SWXLカラムは日本のTOSOH社から入手可能であり、Bio-Gel-P6、Bio-Gel-P10は、Bio-Rad社製であり、Sephadex G-10、Sepharose CL-4Bは、Pharmacia社製であり、チューブリン、アクチンはSIGMA社から購入した。
NICOLET社製NEXUS-470インテリジェント赤外分光計;Bruker社製DPX-300 NMR分光計;Beijing Longzhida社製ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC,Gel Permeation Chromatography);米国Unocal社製UV-2102紫外線及び可視分光光度計。
ヌードマウス、BALB/cA、18〜22gは、中国科学院上海薬物研究所(Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences)によって提供され、
C57BL/6マウス、6〜7週齢は、中国科学院上海実験動物センター(Shanghai Animal Center, Chinese Academy of Sciences)によって提供され、
新鮮な卵は、Shanghai ShenbaoChicken Farmから購入した。
[実施例]
3mlのクロロスルホン酸を、温度を5℃未満に維持しながら、10mlのホルムアミドに滴下添加した。反応の20分後、1gのポリグルロン酸を添加し、65〜70℃の温度で3時間反応させた。2倍量の80%エタノール溶液を反応生成物に添加し、繰り返しかき混ぜて、粘性物質を得た。追加の80%エタノール溶液を添加し、上記のステップを2回繰り返した。溶液をデカントし、水を添加して、粘性物質を得た。粘性物質を1%Na2CO3溶液で7.0のpHに調整し、2倍量の95%エタノール溶液によるアルコール沈殿に供した。得られた沈殿物を50〜60℃の温度で乾燥させて、ポリグルロン酸の硫酸化誘導体を得た。該誘導体を4mg/mlの酢酸ナトリウム溶液(pH7.0)に配合し、該溶液に、水素化ホウ素ナトリウムを50mMまで添加した。反応は、30〜40℃の温度で30分間にわたって行い、氷浴で終了させた。pHを0.1M酢酸で調整し、未反応の水素化ホウ素ナトリウムを放出し、pHを中性に調整した。得られた溶液を繰り返し沈殿させ、エタノールで洗浄し、乾燥させて、硫酸ポリグルロン酸(PGAS)の粗製物を得た。PGAS粗製物を10%溶液に配合し、95%エタノール溶液による沈殿に供した。得られた沈殿物を無水エタノールで洗浄し、乾燥させ、5%溶液に配合した。溶液を3μmの膜で濾過して不純物を除去し、移動相として水を用い、画分収集を使用するSephadex G-10カラム(15×100cm)中で脱塩した。溶出液を硫酸−カルバゾール法で検出し、糖含有成分を合わせ、減圧で濃縮し、脱塩し、フリーズドライして、精製硫酸ポリグルロン酸を得た。
構造的特徴付けは、上記の硫酸ポリグルロン酸の調製によって生じた画分中の糖類成分に対して行った。
上記の硫酸ポリグルロン酸を好適な濃度に希釈し、蒸留水をブランクとして用いて、UV-2102紫外線−可視分光光度計により190nm〜400nmでスキャンした。画分は紫外領域内に特異的な吸収ピークを有さないことが分かり、構造内に共役した二重結合がないことを指示している。しかしながら、190〜200nmにおいては非特異的吸収がある。
0.5mgのPGASを押圧してKBrペレットとし、NEXUS-470インテリジェント赤外分光計を用いて赤外分光法を実施した。ヒドロキシル基の対称伸縮振動は3219.53cm−1で存在し、カルボキシレート中のカルボニル基の対称伸縮振動は1612.58cm−1で存在し、ヒドロキシル基のはさみ振動は1414.33cm−1で存在し、カルボキシル基中の炭素−酸素結合の対称伸縮振動は1103.97cm−1で存在し、C−O−Sの伸縮振動ピークは823.30cm−1で存在し、硫酸化後の硫酸化物中のS=Oの伸縮振動ピークは1274.62cm−1で存在することが分かり、これは、化合物が、カルボキシル、ヒドロキシル及びスルホン基(sulfoic groups)を含有する主鎖構造を有することを指示している。
PGASのNMR分光法(13C−NMR)は、Bruker社製Auance DPX-300 NMR分光計を用いて決定した。スペクトルにおいて、非スルホン化C−2シグナルピークは実質的に見られないのに対し、非スルホン化C−3シグナルピークは依然として存在していることが分かった。C−2位におけるヒドロキシル基は比較的完全に硫酸化されており、C−3位におけるヒドロキシル基は部分的にしか硫酸化されていないことが指示されている。
PGASの分子量は、GPC法を用いて決定した。検出は、屈折率検出器を使用し、分子量標準としてFluka社製デキストラン、クロマトグラフィーカラムとしてTSK gel2000SWXLカラム、並びに移動相として0.2%アジ化ナトリウム及び2.84%Na2SO4を含有する水溶液を用い、0.5ml/分の流速、35℃の温度及び25μlの注入体積で実施した。デキストランに対するPGASの重量平均分子量は2513Daであり、複数バッチの試料の決定結果は、デキストランに対するその重量平均分子量が1500〜8500Daであることを示すことが分かった。
上記で調製されたPGASの試料を採取し、5%溶液に配合し、3μmの膜で濾過して不純物を除去し、移動相として0.2mol/LのNH4HCO3を用いてBio-Gel-P6ゲルカラム(1.6×180cm)上で分離し、画分を収集した。硫酸−カルバゾール法を用いて溶出液を検出し、糖含有成分を収集し、空隙体積成分をBio-Gel-P10ゲルカラム(1.6×180cm)上でさらに分離した。得られた生成物をフリーズドライして、PGASの一連の糖類成分を得、これを質量分光分析によって同定した。結果は、PGASの、二糖、三糖、四糖、五糖、六糖、七糖、八糖、九糖、十糖、十一糖及びそれより高次の糖成分の産生を裏付けるものである。
指数増殖期における2.5×107細胞/mlの濃度のヒト乳がんMDA−MB−435細胞(American Type Culture Collection社製、ATCC、ロックビル、MD、USA)を、4〜5週齢の雌ヌードマウス(BALB/cA、中国科学院上海薬物研究所によって提供されたもの)の左から二番目の***脂肪体に接種した。腫瘍が100〜200mm3の大きさに成長したら、動物を、腫瘍体積に従って、陰性対照群、ドキソルビシン注射剤(アドリアマイシン、ADM)処置群(陽性対照群)、並びに5mg/kg及び20mg/kgのPGAS処置群(PGAS実験群)に20匹/群で均等に分割した。PGAS実験群及び陽性対照群には、静脈内注射によって週に1回、連続7週間にわたって投薬し、陰性対照群には、同量の生理食塩水を投薬した。実験において、ノギスを使用して腫瘍の直径を週に2回測定し、腫瘍体積(V)を以下の式:
V = 1/2 × a × b2
[式中、a及びbは、腫瘍の長さ及び幅をそれぞれ表す]に準じて計算した。相対腫瘍体積(RTV,relative tumor volume)は、測定結果に基づき、算定式:RTVt= Vt /V0[式中、V0は、動物を異なる投薬に分割した際(すなわちd0)の測定腫瘍体積であり、Vtは測定日における腫瘍体積である]を使用して計算した。抗腫瘍活性の薬力学的評価指標は相対腫瘍増殖率T/C(%)であり、その算定式は次の通りである:
6〜7週齢C57BL/6マウス(中国科学院上海実験動物センターによって提供されたもの)を、生理食塩水陰性対照群、並びに5mg/kgのPGAS処置群及び20mg/kgのPGAS処置群に、10匹/群で無作為に分割した。指数増殖期における2.5×106細胞/mlの濃度のマウス黒色腫B16F10細胞(American Type Culture Collection社製、ATCC、ロックビル、MD、USA)を、マウスの尾静脈に接種した。細胞接種の20分前、PGAS群には腹腔内(i.p.,intraperitoneal)注射を1回投薬し、陰性対照群には同量の生理食塩水を投薬した。11日後、肺をマウスから取り出し、肺組織を、ブアン液(飽和ピクリン酸:ホルムアルデヒド:氷酢酸=75:25:5)中で24時間以上にわたって固定した。片肺当たりの肺転移結節の数を観察し、解剖顕微鏡下で記録した。代替として、肺組織が正常な色を取り戻すまで2日間にわたって肺組織をさらに無水エタノールに浸漬した後、そのような観察を実施した。接種の11日後、マウスの肺組織において多数の転移が現れ、転移率は100%であり、単回i.p.注射の投薬レジメンにおいて、5mg/kgのPGAS処置群は、有意な腫瘍転移阻害を示し、阻害率は最大40.81%であり、20mg/kgのPGAS処置群は、黒色腫B16F10細胞の肺転移に対してより有意な阻害を示し、阻害率は最大82.20%であることが分かった。結果は、PGASが、黒色腫B16F10細胞の肺転移を有意に阻害できることを示す(図5)。
新鮮な卵(Shanghai Shenbao Chicken Farmから購入したもの)を、39℃及び50%湿度(ガス室を上にして)のインキュベーターRoll-X base(Lyon Electric社、CA、USA)に入れた。7日間にわたる連続インキュベーション後、卵に照明を当てて、ニワトリ胚が生存しているか、並びに絨毛尿膜の位置が決定及びマーク付けされたかを同定した。卵の気嚢の端部に1つの小さな穴を作製し、ニワトリ胚を水平方向に置いた(絨毛尿膜を上にして)。絨毛尿膜が崩壊して卵殻から分離するように、気嚢をピペットゴム球で穏やかに吸引し、一定期間にわたって静置した。次いで、1cm2の窓開き部をニワトリ胚上に作製し、窓開きを研磨し、はさみで切り取り、卵殻の塵埃を吹き払い、窓開きの卵殻を剥がし、絨毛尿膜を明確に視認できるようにした。0.25×0.25×0.25(長さ×幅×高さ)cm3のサイズを有するゼラチンスポンジを、200、400、800μg/卵の最終濃度の10μlのPGAS及びビヒクル対照で処理し、次いで、絨毛尿膜内の大血管のない部位に穏やかに置いた。小窓を滅菌透明テープで密封し、卵をさらに48時間インキュベートした。観察のためにテープをはがし、写真を撮影し(倍率:40倍)、ニワトリ胚絨毛尿膜の血管新生に対するPGASの阻害効果を評価した。PGASを含有するスポンジに隣接する絨毛尿膜において、血管密度は有意に低減しており、濃度依存性阻害の傾向を呈したことが分かった(図6)。これは、PGASが血管新生阻害効果を有することを示す。
ヘパラナーゼの無血清昆虫発現系及び親和性カラム精製系を、PCR増幅及び遺伝子組換えによってヒト胎盤から取得されたヒトヘパラナーゼのcDNAを使用して確立し、95%以上の純度を有する高活性ヘパラナーゼを取得した。150μlの反応緩衝液(50mM酢酸ナトリウム、pH4.2)に、0.5μgのフルオレセインイソチオシアネート標識ヘパラン硫酸(FITC−HS,fluorescein isothiocyanate-labeled heparan sulfate)及び25ng/mlの最終濃度のヘパラナーゼ、並びに種々の濃度のPGASも添加し、37℃で3時間反応させた。100℃で5分後、遠心分離を10000rpmで20分間にわたって実施して、不溶性材料をペレット化した。上清を0.45μmのフィルター膜で濾過し、次いで、緩衝液50mMのTris/150mMのNaCl、pH7.5、及び0.8ml/分の流速を使用して、20μlのローディングでTSK gel G3000SWXLカラムに注入した。FITC−HS生成物の蛍光強度を蛍光検出器(励起:485nm、発光:538nm)で検出した。酵素の相対活性を、インタクトなFITC−HSピークの前方半分の面積の減少によって評価して、ヘパラナーゼ活性に対するPGASの効果を決定した。PGASは、ヘパラナーゼ活性を用量依存様式で阻害し、IC50は6.55ng/mlであり、用量が40ng/mlである場合、活性は、陽性対照ヘパリンのものより良好であることが分かった(図7)。
酵素反応基質ポリ(Glu、Tyr)をマイクロタイタープレートに被覆し、ATP溶液及び硫酸ポリグルロン酸及びc−Met酵素溶液を適切な濃度で添加し、反応(reacttion)のために37℃で1時間シェーカー上に置いた。次いで、T−PBS希釈PY99抗体含有5mg/mlのBSAを添加し、シェーカー上、37℃で0.5時間反応させた。さらに、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgGを添加し、シェーカー上、37℃でさらに0.5時間反応させた。最後に、2mg/mlのOPD展開溶液を添加し、25℃、暗所で1〜10分間反応させ、2M H2SO4を添加して反応を終了させた。490nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーによって測定し、酵素活性阻害率を計算した:
10μlのPGASを種々の濃度で96ウェルプレートに添加し、37℃で10分間予熱した。チューブリン凍結乾燥粉末を、PEM緩衝液(100mMのPIPES、1mMのMgCl2、1mMのEGTA)+1mMのGTP、5%グリセリン中で、12μMの濃度に希釈した。90μlのこの溶液を96ウェルプレートに添加し、マイクロプレートリーダーを起動し、温度を37℃に設定し、検出波長を340nmに設定した。これを徹底的に混合し、1分当たり1回、連続30分間にわたって読み取った。結果は、PGASが、無細胞系においてチューブリン重合を有意に阻害でき、PGASの濃度が2.5μMから40μMに増大した場合、阻害率は18.26%から73.44%に増大し、これは用量依存であり、IC50は8.58μMであることを示す(図8)。
ピレニル標識アクチンを凝集緩衝液(100mMのTris−HCl、20mMのMgCl2、500mMのKCl、2mMのCaCl2、pH7.5)に添加し、37℃で30分間インキュベートして線維に凝集させた。次いで、アクチン脱重合緩衝液(10mMのTris−HCl、0.2mMのCaCl2、0.2mMのATP、pH8.0)及び異なる濃度のPGASを希釈のために添加して、脱重合させた。蛍光マイクロプレートリーダーを、360nmの発光波長及び410nmの吸収波長並びに37℃の温度に設定した。これを徹底的に混合し、1分当たり1回、連続30分間にわたって読み取った。結果は、PGASが、無細胞系においてアクチン脱重合プロセスを有意に阻害でき、用量依存性を呈することを示す(IC50は10.6μMである)(図9)。
硫酸ポリグルロン酸をSepharose CL-4Bと連結して、硫酸ポリグルロン酸の親和性クロマトグラフィーカラムを調製した。このクロマトグラフィーカラムを使用して、肺がん細胞株A549における硫酸ポリグルロン酸の結合タンパク質を抽出し、分離した。質量分析同定により、コフィリンは、硫酸ポリグルロン酸と強く結合するタンパク質の1つであることが分かった。さらなる研究は、硫酸ポリグルロン酸が、コフィリンのアクチン脱重合/切断活性を有意に阻害できることを示す(図10)。これは、硫酸ポリグルロン酸が、コフィリンと結合してコフィリンのアクチン脱重合/切断活性を阻害し、故に、腫瘍細胞の細胞移動を阻害するように機能できることを指示している。
実施形態3において調製されたPGAS糖成分の抗腫瘍活性を試験した。15mg/kg未満の静脈内注射用量におけるPGASの四糖〜十二糖成分(一般式(I)においてnが2〜10であるものに対応する)は、ヌードマウスにおけるヒト乳がんMDA−MB−435同所異種移植片の成長に対して30%以下のT/C値を有し、その肺転移に対して95%以上の阻害率を有し;10mg/kg未満の用量における六糖〜十二糖成分(一般式(I)において、n=4〜8)は、ヌードマウスにおけるヒト乳がんMDA−MB−435同所異種移植片の成長に対して30%以下のT/C値を有し、その肺転移に対して95%以上の阻害率を有することが分かった。結果は、硫黄含有量が7〜15重量%である場合により良好であり、9〜13重量%である場合が最良であった。
実施例3において分離された異なるPGAS糖成分の、腫瘍転移に対する効果は、Transwell細胞アッセイを用いて検出した。トリプシンを使用して、指数関数的に成長した段階においてインビトロで継代培養された乳がんMDA−MB−435細胞を消化し、続いて、無血清培養液で3回洗浄し、2×106/mlに希釈した。100μlの細胞希釈物を、Transwell細胞内のウェルの上方室に添加し、600μlの10%FBS含有培養液を下方室に添加し、100μg/mlの異なるPGAS成分を上方及び下方室の両方に添加した。細胞を、5%CO2含有インキュベーター内、37℃で12時間インキュベートした後、培養培地を除去し、細胞を90%エタノール溶液中で30分間固定した。細胞を、0.1%クリスタルバイオレット溶液(0.1Mホウ酸、0.1%(w/v)クリスタルバイオレット、2%エタノール)により、室温で10分間染色し、透明な水ですすぎ、綿棒で拭って上層中の移動しなかった細胞を除去した。顕微鏡下で細胞を観察し、撮影し、記録した。最後に、抽出を100μl/ウェルの10%酢酸溶液により10分間にわたって実施し、OD値を595nmで決定し、乳がん細胞における異なる糖成分の移動阻害率を計算した。
移動阻害率(%) = (1-OD処置/OD対照) ×100%
上記のデータを、Statviewソフトウェアによる統計的分析に供し、結果を「平均値±SE」として表現し、比較にはANOVAを使用した。
Claims (15)
- 以下の一般式(I):
[式中、
nは、0又は1〜23の整数を表し、
R1は、SO3Hであり、
R2は、互いに独立に、H又はSO3Hを表す]
の構造を有する、硫酸ポリグルロン酸又は薬学的に許容されるその塩であって、但し、硫酸ポリグルロン酸の硫黄含有量として計算される硫酸化度が5〜20重量%であり、
L−グルロン酸単位が1,4−グリコシド結合によって互いに結合しており、ヒドロキシルが還元末端の1位に位置しており、糖環がC−2位において完全に硫酸化されている、前記硫酸ポリグルロン酸又は薬学的に許容されるその塩を調製するための方法であって、下記の構造式(II)において示される通りのポリグルロン酸を、スルホン化試薬と反応させ、続いて、還元剤を介する還元により、一般式(I)において示される通りの硫酸ポリグルロン酸を得るステップを含み、
構造式(II)において、mは、0又は1〜48の整数を表し、
一般式(I)において、n、R1及びR2は、前記の意味を有し、
以下の条件を満たす、前記方法。
(a)スルホン化試薬がクロロスルホン酸であり、
(b)スルホン化温度が、45〜85℃であり、
(c)反応時間が、1.5〜4.5時間であり、及び
(d)還元剤が、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ニッケル水素化物試薬若しくはハロゲンベースの還元剤である。 - スルホン化温度が、60〜75℃である、請求項1に記載の方法。
- 反応時間が、2〜3.5時間である、請求項1又は2に記載の方法。
- 反応時間が、3時間である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 以下の一般式(I):
[式中、
nは、0又は1〜23の整数を表し、
R1は、SO3Hであり、
R2は、互いに独立に、H又はSO3Hを表す]
の構造を有する、硫酸ポリグルロン酸又は薬学的に許容されるその塩であって、但し、硫酸ポリグルロン酸の硫黄含有量として計算される硫酸化度が5〜20重量%であり、
L−グルロン酸単位が1,4−グリコシド結合によって互いに結合しており、ヒドロキシルが還元末端の1位に位置しており、糖環がC−2位において完全に硫酸化されている、硫酸ポリグルロン酸又は薬学的に許容されるその塩を含む、腫瘍成長及び/又は転移を阻害するための薬剤。 - 一般式(I)において、nが、2〜13の整数である、請求項5に記載の薬剤。
- 一般式(I)において、nが、3、4、5、6、7又は8である、請求項5又は6に記載の薬剤。
- 硫黄含有量が、7〜15重量%である、請求項5〜7のいずれかに記載の薬剤。
- 硫黄含有量が、9〜13重量%である、請求項5〜8のいずれかに記載の薬剤。
- 腫瘍が、肝臓がん、胃がん、結腸直腸がん、肺がん、乳がん、膵臓がん、腎臓がん、膀胱がん、前立腺がん、黒色腫及び脳腫瘍からなる群から選択される、請求項5〜9のいずれかに記載の薬剤。
- 以下の一般式(I):
[式中、
nは、0又は1〜23の整数を表し、
R1は、SO3Hであり、
R2は、互いに独立に、H又はSO3Hを表す]
の構造を有する、硫酸ポリグルロン酸又は薬学的に許容されるその塩であって、但し、硫酸ポリグルロン酸の硫黄含有量として計算される硫酸化度が5〜20重量%であり、
L−グルロン酸単位が1,4−グリコシド結合によって互いに結合しており、ヒドロキシルが還元末端の1位に位置しており、糖環がC−2位において完全に硫酸化されている、硫酸ポリグルロン酸又は薬学的に許容されるその塩を含む、血管新生阻害剤、ヘパラナーゼ阻害剤、C−Met酵素阻害剤、微小管重合阻害剤、アクチン脱重合因子活性阻害剤、又はアクチン凝集阻害剤。 - 一般式(I)において、nが、2〜13の整数である、請求項11に記載の血管新生阻害剤、ヘパラナーゼ阻害剤、C−Met酵素阻害剤、微小管重合阻害剤、アクチン脱重合因子活性阻害剤、又はアクチン凝集阻害剤。
- 一般式(I)において、nが、3、4、5、6、7又は8である、請求項11又は12に記載の血管新生阻害剤、ヘパラナーゼ阻害剤、C−Met酵素阻害剤、微小管重合阻害剤、アクチン脱重合因子活性阻害剤、又はアクチン凝集阻害剤。
- 硫黄含有量が、7〜15重量%である、請求項11〜13のいずれかに記載の血管新生阻害剤、ヘパラナーゼ阻害剤、C−Met酵素阻害剤、微小管重合阻害剤、アクチン脱重合因子活性阻害剤、又はアクチン凝集阻害剤。
- 硫黄含有量が、9〜13重量%である、請求項11〜14のいずれかに記載の血管新生阻害剤、ヘパラナーゼ阻害剤、C−Met酵素阻害剤、微小管重合阻害剤、アクチン脱重合因子活性阻害剤、又はアクチン凝集阻害剤。
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