JP6744542B2

JP6744542B2 - ラクトバチルス属乳酸菌の培養方法

Info

Publication number: JP6744542B2
Application number: JP2016029147A
Authority: JP
Inventors: 浩樹二川; 伸治石原; クマルマズムダルタパン
Original assignee: YAEGAKI BIO-INDUSTRY, INC.; Hiroshima University NUC
Current assignee: YAEGAKI BIO-INDUSTRY, INC.; Hiroshima University NUC
Priority date: 2016-02-18
Filing date: 2016-02-18
Publication date: 2020-08-19
Anticipated expiration: 2036-02-18
Also published as: JP2017143802A

Description

本発明は、ラクトバチルス属乳酸菌の培養方法に関し、特に、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）、または、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）の培養方法に関する。

乳酸菌として、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＫＯ３株（ＮＩＴＥＢＰ−７７１）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）ＹＵ３株（ＮＩＴＥＢＰ−７７２）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）ＹＵ４株（ＮＩＴＥＢＰ−７７５）が知られている（特許文献１）。これらの乳酸菌は、う蝕菌、歯周病菌、カンジダ菌などの口内細菌に対して非常に高い抗菌力を有している。これらの乳酸菌は、果汁培地、野菜汁培地、牛乳培地、脱脂粉乳培地又は乳成分を含む培地で培養しても良いと記載されているが、実際には合成培地で培養されていた。

しかしながら、培養物を食品等に使用することを考慮すると、人工培地ではなく、天然成分からなる培地で培養することが求められていた。

国際公開第２０１１／００７５８４号

本発明は、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）、または、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）の新たな培養方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）、または、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）の天然成分からなる培地について、検討を進めたところ、天然培地の中でも穀物を用いて培養すると、得られた培養物は非常に高い抗菌活性を有するという新たな知見を見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）、または、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）を、穀物を含有する培地で培養する工程を有するラクトバチルス属乳酸菌の培養方法に関する。

穀物が、大豆または米であることが好ましい。

培地が、さらに糖類を含むことが好ましい。

本発明の培養方法では、ラクトバチルス属の乳酸菌を、穀物を含有する培地で培養するため、培養物は非常に高い殺菌効果を奏する。

ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＫＯ３株（ＮＩＴＥＢＰ−７７１）を乳培地またはＭＲＳ培地で培養した培養物の培地とＡＴＰ量を表す。Ａは１２％脱脂粉乳＋０．５％酵母エキス培地での培養、ＢはＭＲＳ培地での培養の結果である。ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＫＯ３株（ＮＩＴＥＢＰ−７７１）を穀物培地で培養した培養物の培地とＡＴＰ量を表す。Ｃは大豆ペプチド１０％＋グルコース２％での培養、Ｄは大豆ペプチド１０％＋アラビノース２％での培養、Ｅは米ペプチド１０％＋グルコース２％での培養の結果である。

本発明のラクトバチルス属乳酸菌の培養方法は、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）、または、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）を、穀物を含有する培地で培養する工程を有することを特徴とする。

ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓ）属の中でも、ＫＯ３株（ＮＩＴＥＢＰ−７７１）は、国際公開第２０１１／００７５８４号に記載されているように、ヒト唾液中から分離された乳酸菌の一種であって、国際寄託されているものである。１６ＳｒＲＮＡの塩基配列がラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ｓｔｒａｉｎＩＤＣＣ３２０１の塩基配列と１４８５／１４８５の間で１００％の相同性を示し、グラム染色後の顕鏡下においてグラム陽性桿菌の様相を呈することから、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓ）と同定さている。ＫＯ３株の主な菌学的性質を以下に示す。
１）グラム陽性乳酸桿菌
２）ホモ型乳酸発酵
３）カタラーゼ陰性
４）芽胞形成能無し
５）好気条件下でも培養可
６）菌体外多糖類を産生

ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）属の中でも、ＹＵ３株は、国際公開第２０１１／００７５８４号に記載されているように、ヒト唾液中から分離されたものであり、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列がラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）ＡＴＣＣ３３４の塩基配列と１４８５／１４８５の間で１００％の相同性を示し、グラム染色後の顕鏡下においてクラム陽性桿菌の様相を呈することから、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）と同定されている。ＹＵ３株の主な菌学的性質を以下に示す。
１）グラム陽性乳酸球菌
２）ホモ型乳酸発酵
３）カタラーゼ陰性
４）芽胞形成能無し
５）好気条件下でも培養可
６）菌体外多糖類を産生

ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）の中でも、ＹＵ４株は、国際公開第２０１１／００７５８４号に記載されているように、ヒト唾液中から分離されたものであり、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列がラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）ｓｔｒａｉｎＤＪ１１６ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡｇｅｎｅのＰａｒｔｉａｌＳｅｑｕｅｎｃｅと１４７７／１４７７（１００％）の相同性を示し、グラム染色後の顕鏡下においてグラム陽性桿菌の様相を呈することから、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）と同定されている。ＹＵ４株の主な菌学的性質を以下に示す。
１）グラム陽性乳酸球菌
２）ホモ型乳酸発酵
３）カタラーゼ陰性
４）芽胞形成能無し
５）好気条件下でも培養可
６）菌体外多糖類を産生

培養の方法は、培地として穀物を含有する培地を使用する限り、特に限定されず、当業者に周知の乳酸菌の培養方法をそのまま適用することができる。穀物培地としては、例えば米、豆類、麦類、トウモロコシなどが挙げられる。穀物そのものだけでなく、米等の加工品を使用することもできる。豆類としては、大豆、小豆、エンドウ豆、ソラ豆などが挙げられ、麦類としては、小麦、大麦、ライ麦などが挙げられる。穀物を含む培地では、合成培地、たとえば乳培地と異なり、透明な培養物が得られる。培地中の穀物の含有量は０．１〜１０重量％が好ましく、２〜１０重量％がより好ましい。

培養方法としては、培地が穀物を有していれば、特に限定されず、静置培養、ｐＨを一定にした中和培養や、回分培養、連続培養などが挙げられる。

培地は穀物を有していれば、果汁培地、野菜汁培地、牛乳培地、脱脂粉乳培地又は乳成分を配合しても良い。このような培地としては、脱脂乳を還元して加熱殺菌した還元脱脂乳培地、酵母エキスを添加した脱脂粉乳培地、ＭＲＳ培地、ＧＡＭ培地等を例示することができる。培養方法は、静置培養又はｐＨを一定にした中和培養や、回分培養及び連続培養等、菌体が良好に生育する条件であれば、特に制限はない。必要に応じて発酵促進物質、例えば糖類、澱粉、デキストリン、などの炭素源、酵母エキス、ペプトンなどの窒素源、ビタミン類、ミネラル類などを加えることができる。糖類としては、グルコース、アラビノース、ショ糖、乳糖、ソルビトール、フラクトースなどが挙げられる。なかでもグルコース、アラビノースなどを含有することが好ましい。糖類を使用する場合、使用量は培地中に０．１〜１０重量％が好ましく、０．２〜５重量％がより好ましい。

培養温度は特に限定されないが、２０〜４２℃が好ましく、２５〜３７℃がより好ましい。４２℃を超えると、培養できなくなる傾向があり、２０℃未満では、培養時間が長くなる傾向がある。

培養時間も特に限定されないが、２４〜５００時間が好ましく、２４〜２４０時間がより好ましく、７２〜２４０時間がさらに好ましい。ヨーグルトなどの培養時間と比較して、長い時間の培養が必要である。

培養時の雰囲気も限定されないが、好気条件下であることが好ましい。

本発明の培養方法によって得られた培養物は、そのまま使用することも、菌体または菌体培養物を、溶媒抽出することにより得られる各種溶剤抽出液、その希釈液、その濃縮液又はその乾燥末として使用することもできる。

抽出物を得るために用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができ、これらを混合して用いることもできる。例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ピリジン類等が挙げられ、このうち、酢酸エチル等のエステル類、エタノール等のアルコール類が好ましい。

抽出条件は、使用する溶剤によっても異なるが、例えば、培養液１質量部に対して1〜１０質量部の溶剤を用い、０〜５０℃、好ましくは２５〜３７℃の温度で、０．５時間〜３時間抽出するのが好ましい。

抽出物をそのまま用いることもできるが、当該抽出物を希釈、濃縮若しくは凍結乾燥した後、必要に応じて粉末又はペースト状に調製して用いることもできる。また、液々分配等の技術により、適宜精製して用いることもできる。

培養物は、様々な用途に使用することができる。たとえば、口腔内疾患、デオドラントなどの化粧品などの用途が挙げられる。

口腔内疾患とは、口腔内疾患の予防、改善又は治療剤におけるものであって、う蝕菌、歯周病菌及びカンジダ菌によって引き起こされる口腔内疾患をいい、例えば、う蝕症；歯肉炎、歯周炎等の歯周病、舌炎、鵞口瘡、口角炎等の口腔カンジダ症等が挙げられる。また、う蝕菌としては、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｏｂｒｉｎｕｓ）、歯周病菌としてはポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、タンネレラ・フォーサイセンシス（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ）、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍ）等が挙げられ、カンジダ菌としては、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）等が挙げられる。

本発明の培養方法によって得られた乳酸菌は、う蝕菌であるストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）及びストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｏｂｒｉｎｕｓ）、歯周病菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）及びカンジダ菌であるカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）の何れに対しても増殖抑制効果を有する。また、口腔内の歯肉縁下プラークフォーマーとして知られるＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ等のＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌の増殖を抑制する作用を有する。

したがって、当該乳酸菌の菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、口腔内疾患の予防、改善又は治療剤として、或いはう蝕菌、歯周病菌及びカンジダ菌の増殖抑制剤となり得る。斯かる口腔内疾患の予防、改善又は治療剤、う蝕菌、歯周病菌及びカンジダ菌の増殖抑制剤は、それ自体で、当該口腔内の病原微生物により引き起こされる、う蝕症、歯周病、口腔カンジダ症等の口腔内疾患の予防、改善又は治療のための、或いはう蝕菌、歯周病菌及びカンジダ菌の増殖抑制のための食品、医薬品、口腔用組成物等として使用でき、或いは食品、医薬品、口腔用組成物に配合するための素材として使用可能である。また、食品は、虫歯、歯周病、その他の口腔内感染症の予防・改善等をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した健康食品、サプリメント若しくは特定保健用食品等の機能性食品とすることも可能である。

医薬品として用いる場合の形態としては経口投与の形態が好ましく、その剤型は、例えば、液剤；錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉剤、タブレット等の固形剤；或いは当該液剤又は固形剤を封入したカプセル剤、口腔用スプレー、トローチ等の様々な形態が挙げられる。このような種々の剤型の医薬製剤やサプリメントを調製するには、本発明の菌体や培養物の作用を妨げない範囲で、他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて用いることができる。斯かる経口投与用製剤として用いる場合の該製剤中の本発明の乳酸菌の菌体若しくは菌体培養物又はこれらの抽出物の含有量は、全組成中の１質量％〜５０質量％、好ましくは１０質量％〜２０質量％である。

食品として用いる場合の形態としては、果汁又は野菜汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、乳飲料、発酵乳、発酵果汁、発酵野菜汁、アルコール飲料、清涼飲料等の飲料や、ゼリー状食品や各種スナック類、焼き菓子、ケーキ類、チョコレート、ジャム、パン、ガム、飴、スープ類、漬物、佃煮等の各種食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）のサプリメント等が挙げられる。

本発明の培養方法によって得られた培養物は、そのままヨーグルト、チーズ、味噌、醤油、漬物等の発酵食品となり、斯かる発酵乳やチーズを素材として使用し、虫歯や歯周病予防、改善用のパンやスナック菓子、ケーキ等にすることもできる。

本発明の培養方法によって得られた乳酸菌の接種量は、一般には発酵用原料物質含有液１ｍＬ中に菌体が約１×１０^６ｃｅｌｌｓ以上、好ましくは１×１０^７ｃｅｌｌｓ前後含まれるものとなる量から選ばれるのが適当である。培養条件は、一般に、発酵温度２０〜４２℃程度、好ましくは２５〜３７℃程度、発酵時間５〜７２時間程度から選ばれる。斯くして得られる乳酸発酵物は、カード状形態（ヨーグルト様形態）を有しており、このものはそのまま固形食品となり得る。該カード状形態の乳酸発酵物は、これを更に均質化することにより、所望の飲料形態とすることができる。

本発明の培養方法によって得られた乳酸菌を、口腔内疾患の予防、改善又は治療剤等を口腔用組成物として用いる場合の具体的な形態としては、洗口剤、マウスウオッシュ、練歯磨、粉歯磨、水歯磨、口腔用軟膏剤、ゲル剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、グミゼリー、トローチ、タブレット、カプセル、キャンディー、チューインガム等が挙げられ、好ましくは、練歯磨、洗口剤、グミゼリー、トローチが挙げられる。

上記医薬品や食品への本発明の培養方法によって得られた乳酸菌の含有量は、特に限定されないが、一日投与量等に合わせて適宜調節すれば良いが、例えば剤型が液体の場合には、乳酸菌体濃度を１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ〜１×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌとすることが好ましく、固体の場合には、１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｇ〜１×１０^１０ｃｅｌｌｓ／ｇとすることが好ましい。

本発明の培養方法によって得られた乳酸菌を生菌として投与する場合は、成人一人当たり、１×１０^８〜５×１０^１０ｃｆｕ／日投与することが好ましい。

以下、実施例に基づき本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１
米タンパク「製品名プロファイン、ヤヱガキ醗酵技研（株）製」を２〜１０％含み、必要に応じて炭素源としてグルコースまたはアラビノースを０．２〜５％付加したもの（残部は水）を加熱殺菌した培地にラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＫＯ３株（ＮＩＴＥＢＰ−７７１）を接種し、３０〜４５℃で２４〜２４０時間培養後、デキストリン等の賦形剤を液中に加え乾燥、粉砕したものを乳酸菌発酵粉末として得た。

実施例２〜３
大豆タンパク「製品名ハイニュート、不二製油（株）製」を２〜１０％含み、必要に応じて炭素源としてグルコースまたはアラビノースを０．２〜５％付加したもの（残部は水）を加熱殺菌した培地にラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＫＯ３株（ＮＩＴＥＢＰ−７７１）を接種し、３０〜４５℃で２４〜２４０時間培養後、デキストリン等の賦形剤を液中に加え乾燥、粉砕したものを乳酸菌発酵粉末として得た。

比較例１〜２
培地として、１０％脱脂粉乳、０．５％酵母エキスを加熱殺菌した培地、または、ＭＲＳ培地にラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＫＯ３株（ＮＩＴＥＢＰ−７７１）を接種し、３０〜４５℃で２４〜２４０時間培養後、デキストリン等の賦形剤を液中に加え乾燥、粉砕したものを乳酸菌発酵粉末として得た。

＜抗菌活性の評価方法＞
抗菌活性の指標として、ＡＴＰ量を用い、以下の方法で評価した。各粉末の２５％溶液１００μｌに対し，９００μｌのＡＴＰ抽出試薬を入れ，室温で３０分静置してＡＴＰを抽出した。各試料のＡＴＰ量をＡＴＰアナライザー（ＴＯＡＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓＬｔｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて計測した。なお，各条件につき同様の試料を各々８つずつ作製し，平均値±ＳＤを算出した。

図１に、比較例１および２で得た培養物のＡＴＰ量をプロットしたが、ＭＲＳ培地での培養物であっても、コントロールの値１１０００００に対して約１／１０程度であった。図２に、実施例１〜３で得た培養物のＡＴＰ量をプロットしたが、いずれもＡＴＰ量が検出できないほど低減した。

本発明の培養方法は、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）、または、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）の培養に適しており、得られた培養物は抗菌活性が高く、天然由来の培地を使用して培養しているため、得られた培養物は飲食物を含む様々な用途に適用することができる。

Claims

ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＫＯ３株を、米または大豆に由来するペプチドを０．１〜１０重量％含有する培地で培養する工程を有するラクトバチルス属乳酸菌の培養方法。
培地が、さらに糖類を含む請求項１に記載のラクトバチルス属乳酸菌の培養方法。