JP6739472B2 - Agent containing horse placenta extract as active ingredient - Google Patents

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Description

本発明は、ウマプラセンタ加水分解物を有効成分とする剤に関し、詳細には、ミトコンドリア活性化剤、Ｉ型コラーゲン産生促進剤および創傷治癒剤からなる群より選択される１または２以上のウマプラセンタ加水分解物を有効成分とする剤に関する。 The present invention relates to an agent containing a horse placenta hydrolyzate as an active ingredient, and more specifically, one or more horse placenta selected from the group consisting of mitochondrial activator, type I collagen production promoter and wound healing agent. The present invention relates to an agent containing a hydrolyzate as an active ingredient.

プラセンタ（ｐｌａｃｅｎｔａ）とは、有胎盤類などの雌の妊娠時に子宮内に形成されて、母体と胎児とを連絡する器官である胎盤のことであり、近年、家畜の胎盤からの抽出物を配合した皮膚外用剤が開発されている（特許文献１および特許文献２）。 Placenta is a placenta that is an organ that is formed in the uterus during pregnancy of females such as placenta and connects the mother and fetus, and in recent years, it contains an extract from the placenta of livestock. The skin external preparations have been developed (Patent Document 1 and Patent Document 2).

そして、特許文献１には、プラセンタエキスがサイコサポニンｂ１およびｂ２の創傷治癒効果を向上させる旨、ならびにプラセンタエキスが人以外の哺乳動物の胎盤から得られる抽出物である旨が開示されており、特許文献２には、プラセンタエキスが人以外の哺乳類動物の胎盤、特にウシ胎盤から得られる抽出物であり、創傷治癒促進作用を有している旨、およびプラセンタエキスが一般にアミノ酸、ペプチド、核酸塩基、無機物、ビタミンなどを成分として含む旨が開示されている。 Then, Patent Document 1 discloses that placenta extract improves the wound healing effect of saikosaponins b1 and b2, and that placenta extract is an extract obtained from the placenta of a mammal other than human, Patent Document 2 discloses that the placenta extract is an extract obtained from the placenta of mammals other than humans, particularly bovine placenta, and has a wound healing promoting action, and that the placenta extract generally contains amino acids, peptides, and nucleobases. It is disclosed that an inorganic substance, a vitamin and the like are contained as components.

特開平５−２６２６３５JP-A-5-262635 特開平１０−１０１５４５JP-A-10-101545

しかしながら、特許文献１および特許文献２に開示されているプラセンタエキスはプラセンタの抽出物であり、いずれも加水分解物ではない。すなわち、特許文献１および特許文献２に開示されているプラセンタエキスによる創傷治癒効果は、従来、プラセンタエキス（プラセンタ抽出物）に含まれていることが知られているＥＧＦ(上皮細胞増殖因子)、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＦＧＦ(線維芽細胞増殖因子)などの成長因子によるものであるが、加水分解物においては、これら成長因子がタンパク質であるために分解・失活してしまうことから、加水分解物による創傷治癒効果とは異なるものである。また、特許文献１および特許文献２には、ウマプラセンタ加水分解物がミトコンドリアを活性化すること、Ｉ型コラーゲンの産生を促進することも開示されていない。 However, the placenta extracts disclosed in Patent Documents 1 and 2 are extracts of placenta, and neither is a hydrolyzate. That is, the wound healing effect of the placenta extract disclosed in Patent Document 1 and Patent Document 2 is conventionally known to be contained in the placenta extract (placenta extract), EGF (epithelial cell growth factor), This is due to growth factors such as HGF (hepatocyte growth factor) and FGF (fibroblast growth factor), but in the hydrolyzate, since these growth factors are proteins, they are decomposed and inactivated. , The wound healing effect of the hydrolyzate is different. Further, Patent Documents 1 and 2 do not disclose that the horse placenta hydrolyzate activates mitochondria and promotes the production of type I collagen.

本発明は、ヒトの肌に優しく、安全で、かつ、ミトコンドリアの活性化、Ｉ型コラーゲンの産生の促進、創傷治癒に優れた剤、これを用いたスキンケア化粧料を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide an agent which is kind to human skin, safe, and which is excellent in activating mitochondria, promoting production of type I collagen, and healing wounds, and a skin care cosmetic using the same. ..

本発明者らは、鋭意研究の結果、ウマプラセンタの加水分解物、特に果実由来システインプロテアーゼによるウマプラセンタの加水分解物が、ミトコンドリアの活性化、Ｉ型コラーゲンの産生の促進、創傷治癒に優れていることを見いだし、下記の各発明を完成した。 As a result of diligent research, the inventors of the present invention have found that a hydrolyzate of horse placenta, particularly a hydrolyzate of horse placenta by a fruit-derived cysteine protease, is excellent in mitochondrial activation, promotion of type I collagen production, and wound healing. It was found that the following inventions were completed.

（１）下記の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群より選択される１または２以上のウマプラセンタ加水分解物を有効成分とする剤；
（ａ）ミトコンドリア活性化剤、
（ｂ）Ｉ型コラーゲン産生促進剤、
（ｃ）創傷治癒剤。 (1) An agent containing, as an active ingredient, one or more horse hydrolysis products of horse placenta selected from the group consisting of the following (a), (b) and (c):
(A) mitochondrial activator,
(B) type I collagen production promoter,
(C) Wound healing agent.

（２）果実由来システインプロテアーゼによるウマプラセンタ加水分解物である、（１）に記載の剤。 (2) The agent according to (1), which is a horse placenta hydrolyzate derived from a fruit-derived cysteine protease.

（３）ウマプラセンタ加水分解物が、構成成分としてペプチドを最も多く含有する、（１）または（２）に記載の剤。 (3) The agent according to (1) or (2), wherein the horse placenta hydrolyzate contains most of the peptide as a constituent.

（４）ウマプラセンタ加水分解物が、構成成分として１，０００以上３，０００未満の分子量を有するペプチドを最も多く含有する、（１）から（３）のいずれか一項に記載の剤。 (4) The agent according to any one of (1) to (3), wherein the horse placenta hydrolyzate contains most of peptides having a molecular weight of 1,000 or more and less than 3,000 as a constituent.

（５）（１）から（４）のいずれか一項に記載の剤と、保湿剤と、防腐剤とを含有するスキンケア化粧料。 (5) A skin care cosmetic containing the agent according to any one of (1) to (4), a moisturizing agent, and a preservative.

本発明に係る剤によれば、ヒトの肌に優しく、安全で、かつ、ミトコンドリアの活性化、Ｉ型コラーゲンの産生の促進、創傷治癒に優れた剤、これを用いたスキンケア化粧料を提供することができる。 The agent according to the present invention provides an agent which is kind to human skin, safe, and which is excellent in mitochondrial activation, promotion of type I collagen production, and wound healing, and a skin care cosmetic using the same. be able to.

ウマプラセンタの加水分解物の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分子量分布を表すクロマトグラムである。It is a chromatogram showing the molecular weight distribution of the hydrolyzate of horse placenta by high performance liquid chromatography (HPLC). ウマプラセンタの加水分解物、ブタ由来低分子量ハイグレードゼラチンおよびブタ由来中分子量ハイグレードゼラチンを添加した培地で正常ヒト線維芽細胞を培養した場合の細胞数を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing the number of cells when normal human fibroblasts were cultured in a medium to which a hydrolyzate of horse placenta, low molecular weight high-grade gelatin derived from pig, and medium molecular weight high-grade gelatin derived from pig were added. ウマプラセンタの加水分解物、ブタ由来低分子量ハイグレードゼラチンおよびブタ由来中分子量ハイグレードゼラチンを添加した培地で正常ヒト線維芽細胞を培養した場合の、細胞におけるミトコンドリアの量を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing the amount of mitochondria in normal human fibroblasts when cultured in a medium supplemented with horse placenta hydrolyzate, porcine-derived low-molecular-weight high-grade gelatin and porcine-derived medium-molecular-weight high-grade gelatin. ウマプラセンタの加水分解物、ブタ由来低分子量ハイグレードゼラチンおよびブタ由来中分子量ハイグレードゼラチンを添加した培地で正常ヒト線維芽細胞を培養した場合の、細胞におけるミトコンドリアの活性を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing mitochondrial activity in normal human fibroblasts cultured in a medium supplemented with horse placenta hydrolyzate, porcine-derived low-molecular-weight high-grade gelatin, and porcine-derived medium-molecular-weight high-grade gelatin. ウマプラセンタの加水分解物、ブタ由来低分子量ハイグレードゼラチンおよびブタ由来中分子量ハイグレードゼラチンを添加した培地で正常ヒト線維芽細胞を培養した場合の、細胞におけるＩ型コラーゲン量を示す図である。FIG. 3 is a graph showing the amount of type I collagen in cells when normal human fibroblasts were cultured in a medium containing a horse placenta hydrolyzate, porcine-derived low molecular weight high-grade gelatin and porcine-derived medium molecular weight high-grade gelatin. ウマプラセンタの加水分解物を添加しない場合と、ウマプラセンタの加水分解物を添加した場合（１００μｇ／ｍＬ）との細胞遊走試験の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of a cell migration test when the hydrolyzate of a horse placenta is not added, and when the hydrolyzate of a horse placenta is added (100 microgram/mL). ヒト表皮モデルの増殖例における培養過程を示す図である。It is a figure which shows the culture process in the proliferation example of a human epidermis model. ヒト表皮モデル（ＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ）の断面とヒト正常皮膚（眼瞼部）の断面との対比を示す図（ａ）および三次元培養キットにおける継代培養の構成と様子を示す図（ｂ）である。In the figure (a) which shows the contrast of the cross section of a human epidermis model (LabCyte EPI-MODEL) and the cross section of human normal skin (eyelid part), and the figure (b) which shows the structure and mode of subculture in a three-dimensional culture kit. is there. 皮膚増殖能確認試験の結果を示す図である。図中、（ａ）はコントロール、（ｂ）は５％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物を添加した場合、（ｃ）は５０％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物を添加した場合を、それぞれ示す。It is a figure which shows the result of the skin growth ability confirmation test. In the figure, (a) is a control, (b) is the case where 5% (w/w) of horse placenta hydrolyzate is added, and (c) is the case where 50% (w/w) of horse placenta hydrolyzate is added. The respective cases are shown below. 皮膚刺激性試験の結果を示す図である。図中、（ａ）は５％ＳＬＳを検体とした場合、（ｂ）は５０％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物を検体とした場合、（ｃ）は５％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物を検体とした場合の結果を示す。It is a figure which shows the result of a skin irritation test. In the figure, (a) uses 5% SLS as a sample, (b) uses 50% (w/w) horse placenta hydrolyzate as a sample, and (c) uses 5% (w/w). The results when using the horse placenta hydrolyzate of 1.

以下、本発明に係る剤について詳細に説明する。本発明に係る剤は、ウマプラセンタ加水分解物を有効成分とし、（ａ）ミトコンドリア活性化剤、（ｂ）Ｉ型コラーゲン産生促進剤、（ｃ）創傷治癒剤からなる群より選択される１または２以上の剤である。 Hereinafter, the agent according to the present invention will be described in detail. The agent according to the present invention contains a horse placenta hydrolyzate as an active ingredient, and is selected from the group consisting of (a) mitochondrial activator, (b) type I collagen production promoter and (c) wound healing agent 1 or Two or more agents.

本発明において用いられるプラセンタは、ウマプラセンタ（ウマ由来のプラセンタ）である。ウマはブタやウシなどと比較して体温が５〜６℃高いため寄生虫の心配がないばかりか、奇蹄類に分類されるウマは、狂牛病（牛海綿状脳症）や***などの偶蹄類に発症する病気にかからない。また、ウシのように反芻をしないウマの内臓は清潔でデリケートなため、添加物やホルモンを受けつけず、他の家畜のように薬物を多用できないうえに、ウマは抗原度が非常に低くアレルゲンになりにくいとされている点でブタ由来のプラセンタやウシ由来のプラセンタよりも優れている。 本発明において用いるウマプラセンタは、ウマの胎盤であれば特に限定されないが、粉砕品（ミンチ品）であると扱いやすく、好適である。また、ウマプラセンタには、血液やその他の部位が付着あるいは混在していることが考えられるため、あらかじめ洗浄などがされているものが好ましい。 The placenta used in the present invention is equine placenta (placenta derived from horse). Horses do not have to worry about parasites because their body temperature is 5 to 6 degrees Celsius higher than that of pigs and cows. Horses that are classified as Perissodactyla include mad cow disease (bovine spongiform encephalopathy) and foot-and-mouth disease. Not affected by the disease that occurs in artiodactyla. In addition, since the internal organs of horses that do not ruminate like cows are clean and delicate, they do not accept additives and hormones, they cannot use drugs as often as other livestock, and horses have a very low antigenicity and become an allergen. It is superior to porcine-derived placenta and bovine-derived placenta in that it is said to be difficult to become. The horse placenta used in the present invention is not particularly limited as long as it is a placenta of a horse, but a crushed product (minced product) is preferable because it is easy to handle. Further, since it is considered that blood or other parts are attached or mixed in the horse placenta, it is preferable that the placenta has been washed in advance.

本発明において、ウマプラセンタの加水分解に用いられる酵素は、プロテアーゼであれば特に限定されないが、システインプロテアーゼ（システインエンドペプチダーゼ）が好適であり、果実由来のシステインプロテアーゼがより好適である。そのようなプロテアーゼとしては、例えば、パパイン、キモパパイン、アスクレパイン、ブロメライン（ブロメリン）、ジンギパイン（ジンギバイン）、フィカイン（ファカイン、フィシン）、アクチニダイン（アクチニジン）、ジアリールヘプタノイド代謝産物（生ウコン由来のクルクミン）などを挙げることができる。 In the present invention, the enzyme used for hydrolysis of horse placenta is not particularly limited as long as it is a protease, but cysteine protease (cysteine endopeptidase) is preferable, and fruit-derived cysteine protease is more preferable. Examples of such proteases include papain, chymopapain, asclepain, bromelain (bromelin), zingipain (zingibain), ficaine (facaine, ficin), actinidyne (actinidine), diarylheptanoid metabolites (curcumin derived from raw turmeric). And so on.

本発明に係る剤は、細胞のミトコンドリアを活性化する作用を有する。すなわち、本発明に係る剤はミトコンドリア活性化剤である。当該細胞は、哺乳動物の細胞であれば特に限定されないが、ヒト細胞が好適であり、ヒト線維芽細胞がより好適である。また、細胞のミトコンドリアが活性化されているか否かを検出するための手法は、特に限定されず、当業者によって適宜選択可能な手法を用いることができる。本明細書実施例においては、ローダミンを用いた細胞染色および蛍光強度値の測定により検出している。 The agent according to the present invention has an action of activating cell mitochondria. That is, the agent according to the present invention is a mitochondrial activator. The cells are not particularly limited as long as they are mammalian cells, but human cells are preferable, and human fibroblasts are more preferable. Further, the method for detecting whether or not the mitochondria of cells are activated is not particularly limited, and a method that can be appropriately selected by those skilled in the art can be used. In the examples of the present specification, detection is performed by cell staining using rhodamine and measurement of fluorescence intensity value.

また、本発明に係る剤は、細胞におけるＩ型コラーゲンの産生を促進する作用を有する。すなわち、本発明に係る剤はＩ型コラーゲン産生促進剤である。細胞におけるＩ型コラーゲンの産生が促進されているか否かを検出するための手法は、特に限定されず、当業者によって適宜選択可能な手法を用いることができる。本明細書実施例においては、エライザによる測定により検出している。 Further, the agent according to the present invention has an action of promoting the production of type I collagen in cells. That is, the agent according to the present invention is a type I collagen production promoter. The method for detecting whether or not the production of type I collagen in cells is promoted is not particularly limited, and a method that can be appropriately selected by those skilled in the art can be used. In the examples of the present specification, detection is performed by measurement with an ELISA.

さらに、本発明に係る剤は、細胞組織の創傷治癒する作用を有する。すなわち、本発明に係る剤は創傷治癒剤である。上述の通り、従来、プラセンタエキス（プラセンタ抽出物）が含むことが知られているＥＧＦ(上皮細胞増殖因子)、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＦＧＦ(線維芽細胞増殖因子)などの成長因子は、タンパク質であるがゆえに、加水分解反応により分解・失活してしまうため、本発明に係る創傷治癒剤は、従来のプラセンタエキス（プラセンタ抽出物）の奏する創傷治癒効果とは異なるといえる。細胞における創傷治癒効果を確認するための手法は、特に限定されず、当業者によって適宜選択可能な手法を用いることができる。本明細書実施例においては、スクラッチ法による細胞遊走試験により確認している。 Furthermore, the agent according to the present invention has an action of healing wounds of cell tissues. That is, the agent according to the present invention is a wound healing agent. As described above, growth factors such as EGF (epithelial cell growth factor), HGF (hepatocyte growth factor), FGF (fibroblast growth factor), which are conventionally known to contain placenta extract (placenta extract), Since it is a protein, it is degraded and inactivated by a hydrolysis reaction, so it can be said that the wound healing agent according to the present invention is different from the wound healing effect exhibited by the conventional placenta extract (placenta extract). The method for confirming the wound healing effect on cells is not particularly limited, and a method that can be appropriately selected by those skilled in the art can be used. In the examples of the present specification, confirmation was made by a cell migration test by the scratch method.

また、本発明におけるウマプラセンタ加水分解物は、構成成分としてペプチドを最も多く含有する加水分解物であることが、後述する実施例より明らかとなっている。また、本発明におけるウマプラセンタ加水分解物は、構成成分として１，０００以上３，０００未満の分子量を有するペプチドを最も多く含有することが、後述する実施例より明らかとなっている。なお、本発明において、「構成成分としてペプチドを最も多く含有する」とは、構成する成分の全重量を基準として（構成する成分の重量％を基準として）、ペプチドを最も多く含有することを意味し、「構成成分としてペプチドを最も多く含有する」は、「（ウマプラセンタ加水分解物において）構成成分としてのペプチドが最大組成比率の第一組成物である」と置換可能に用いられる。 Further, it has been clarified from the examples described later that the horse placenta hydrolyzate in the present invention is a hydrolyzate containing the largest amount of peptides as constituent components. Further, it has been clarified from the examples described later that the horse placenta hydrolyzate according to the present invention contains most of peptides having a molecular weight of 1,000 or more and less than 3,000 as a constituent. In the present invention, the phrase "contains the largest amount of peptides as constituent components" means that it contains the largest amount of peptides based on the total weight of constituent components (based on the weight% of constituent components). However, the phrase "contains the most peptide as a constituent" is used interchangeably with "(in the horse placenta hydrolyzate) the peptide as a constituent is the first composition having the maximum composition ratio".

また、本発明に係るスキンケア化粧料は、本発明に係る剤と、保湿剤と、防腐剤とを含有する。すなわち、本発明は、保湿剤と防腐剤とを選択して特定の剤に加え、スキンケア用化粧料に適用した点に特徴があり、保存安定性に優れるスキンケア用化粧料を提供するに至ったものである。 Further, the skin care cosmetic according to the present invention contains the agent according to the present invention, a moisturizer, and a preservative. That is, the present invention is characterized in that a moisturizer and an antiseptic agent are selected and added to a specific agent and applied to a cosmetic for skin care, and a cosmetic for skin care having excellent storage stability is provided. It is a thing.

本発明において用いられる保湿剤は、本発明に係る剤の特徴を損なわない範囲で選択することができ、そのような保湿剤としては、例えば、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、１，３−プロパンジオール、１，２−ペンタンジオール、ポリグリセリン、ソルビトール等の多価アルコール、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸などのムコ多糖類またはそれらの塩を挙げることができる。 The moisturizer used in the present invention can be selected within a range that does not impair the characteristics of the agent according to the present invention. Examples of such moisturizers include glycerin, 1,3-butylene glycol and 1,3- Examples thereof include polyhydric alcohols such as propanediol, 1,2-pentanediol, polyglycerin and sorbitol, mucopolysaccharides such as hyaluronic acid and chondroitin sulfate, and salts thereof.

また、本発明において用いられる防腐剤は、本発明に係る剤の特徴を損なわない範囲で選択することができ、そのような防腐剤としては、例えば、安息香酸、安息香酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、フェノキシエタノール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−オクタンジオール、カプリル酸グリセリル、エチルヘキシルグリセリンを挙げることができる。 The preservative used in the present invention can be selected within a range that does not impair the characteristics of the agent according to the present invention. Examples of such preservatives include benzoic acid, sodium benzoate, and paraoxybenzoic acid ester. , Sorbic acid, potassium sorbate, phenoxyethanol, 1,2-hexanediol, 1,2-octanediol, glyceryl caprylate, and ethylhexylglycerin.

本発明に係る剤の製造方法は、（ｉ）ウマプラセンタに加水分解酵素を添加して加水分解し、加水分解物を調製する工程（加水分解物調製工程）、（ｉｉ）加水分解物を調製した後に加水分解酵素を失活させる工程（酵素失活工程）、（ｉｉｉ）等電点処理する工程（等電点処理工程）、そしてその後、（ｉｖ）上澄みを分取して濾過する工程（上澄み分取濾過工程）、以上（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を包含する。 The method for producing the agent according to the present invention comprises: (i) a step of adding a hydrolase to horse placenta to hydrolyze it to prepare a hydrolyzate (hydrolyzate preparation step); and (ii) a hydrolyzate And then deactivating the hydrolase (enzyme deactivating step), (iii) isoelectric point treatment step (isoelectric point treatment step), and then (iv) collecting and filtering the supernatant ( Supernatant preparative filtration step), and the above steps (i) to (iv) are included.

なお、（ｉ）加水分解物調製工程において、加水分解反応の温度設定や所要時間の設定は、加水分解反応に支障がない範囲で、適宜設定が可能である。また、（ｉｉ）酵素失活工程における酵素を失活させるための温度設定や所要時間の設定もまた、酵素を失活させることができる範囲で、適宜設定が可能である。 In addition, in the (i) hydrolyzate preparation step, the temperature and time required for the hydrolysis reaction can be appropriately set within a range that does not interfere with the hydrolysis reaction. Further, the temperature setting and the required time period for inactivating the enzyme in (ii) the enzyme inactivating step can also be appropriately set within the range in which the enzyme can be inactivated.

一方、（ｉｉｉ）等電点処理工程において用いる物質やｐＨの設定、（ｉｖ）上澄み分取濾過工程において用いられるメンブランフィルターの選択、例えば孔径の選択もまた、これら工程の実施が可能な範囲で、適宜選択が可能である。 On the other hand, (iii) setting of substances and pH to be used in the isoelectric point treatment step, (iv) selection of a membrane filter used in the supernatant preparative separation/filtration step, for example, selection of pore size is also within a range in which these steps can be performed. Can be appropriately selected.

本発明において、スキンケア化粧料には、本発明の特徴を損なわない範囲で、化粧品の分野において通常用いられる添加成分を適宜配合することができ、例えば、真珠光沢材料、酸化防止剤、色素、増粘剤、およびｐＨ調整剤から選択される１種以上の成分が挙げられる。また、芳香剤、抗菌剤、各種の油性成分、紫外線吸収剤、活性酸素除去剤、抗酸化剤、抗微生物剤、育毛剤、ミネラル、アミノ酸を用いることができる。さらに、公知の美白成分を併用してもよい。 In the present invention, the skin care cosmetics can be appropriately blended with additive components usually used in the field of cosmetics, as long as the characteristics of the present invention are not impaired. For example, pearlescent materials, antioxidants, pigments, One or more components selected from sticky agents and pH adjusting agents are included. Further, a fragrance, an antibacterial agent, various oily components, an ultraviolet absorber, an active oxygen remover, an antioxidant, an antimicrobial agent, a hair-growing agent, minerals and amino acids can be used. Further, known whitening ingredients may be used in combination.

以下、本発明に係る剤について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される実施態様に限定されない。 Hereinafter, the agent according to the present invention will be described based on Examples. The technical scope of the present invention is not limited to the embodiments shown by these examples.

１．ウマプラセンタ加水分解物の調製
本実施例で用いるウマプラセンタの加水分解物を調製した。あらかじめ冷凍で保存しておいた北海道産駒サラブレッドの胎盤のミンチ１００重量部を半解凍し、精製水３００重量部を加えて室温にて解凍した後、いずれも果実由来システインプロテアーゼであるパパイン０．０８重量部とブロメライン０．１２重量部とを加え、４５〜５５℃の条件下で計６時間加水分解反応させた。続いて、当該プロテアーゼを失活させて水冷し、乳酸を用いた等電点処理（ｐＨ４．３７）と活性炭（粉末；０．２５重量部）処理を行い、室温にて一晩静置した。その後、上澄みを分取し、メンブランフィルター（孔径３μｍ程度）を用いて濾過し、１０％（ｖ／ｖ）の水酸化ナトリウムを用いて中和（ｐＨ７．３）した後、メンブランフィルター（孔径１．０μｍおよび孔径０．４５μｍ）を用いて濾過してウマプラセンタの加水分解物を得た。 1. Preparation of Horse Placenta Hydrolyzate A hydrolyzate of horse placenta used in this example was prepared. 100 parts by weight of minced placenta of Koma Thoroughbreds from Hokkaido, which had been frozen and stored in advance, was thawed halfway, 300 parts by weight of purified water was added thereto, and thawed at room temperature. 08 parts by weight and 0.12 parts by weight of bromelain were added, and hydrolysis reaction was carried out at 45 to 55° C. for a total of 6 hours. Subsequently, the protease was inactivated, cooled with water, subjected to isoelectric point treatment (pH 4.37) using lactic acid and activated carbon (powder; 0.25 part by weight), and allowed to stand at room temperature overnight. After that, the supernatant was separated, filtered through a membrane filter (pore size: about 3 μm), neutralized (pH 7.3) with 10% (v/v) sodium hydroxide, and then filtered with a membrane filter (pore size: 1 0.0 μm and a pore size of 0.45 μm) to obtain a hydrolyzate of horse placenta.

２．ウマプラセンタ加水分解物の一般栄養分析試験
１．で調製したウマプラセンタの加水分解物について、一般栄養分析試験を行った。当該分析試験は、一般財団法人日本食品分析センターへ委託した。具体的な試験方法は下記の通りである。 2. General nutritional analysis test of horse placenta hydrolyzate 1. A general nutritional analysis test was conducted on the hydrolyzate of horse placenta prepared in 1. The analysis test was outsourced to the Japan Food Analysis Center. The specific test method is as follows.

［２−１］一般栄養分析試験の試験方法
分析試験項目を水分、タンパク質、脂質、灰分、炭水化物、エネルギー、ナトリウム、食塩相当量とし、水分については常圧加熱乾燥法により、タンパク質については燃焼法により（窒素・タンパク質換算係数：６．２５）、脂質については酸分解法により、灰分については直接灰化法により、炭水化物については食品表示基準（平成２７年内閣府令第１０号）による計算式（１００−（水分＋タンパク質＋脂質＋灰分））により、エネルギーについては食品表示基準（平成２７年内閣府令第１０号）によるエネルギー換算係数（タンパク質４：脂質９：炭水化物４）により、ナトリウムについては原子吸光光度法により、食塩相当量については所定の計算式（ナトリウム×２．５４）により、それぞれの値を求めた。ウマプラセンタの加水分解物についての一般栄養分析試験結果を表１に示す。 [2-1] Test method for general nutrition analysis test The analysis test items are water, protein, lipid, ash, carbohydrate, energy, sodium, and sodium chloride equivalent. The water content is the atmospheric heating drying method, and the protein is the combustion method. (Nitrogen/protein conversion factor: 6.25), lipids by the acid decomposition method, ash by the direct ashing method, and carbohydrates by the food labeling standards (2015 Cabinet Office Ordinance No. 10) ( 100-(water + protein + lipid + ash)), the energy conversion factor (protein 4: lipid 9: carbohydrate 4) according to the food labeling standard (2015 Cabinet Office Ordinance No. 10) for energy, and the atom for sodium Each value was calculated|required by the predetermined calculation formula (sodium x2.54) about the salt equivalent by the absorptiometric method. Table 1 shows the results of a general nutrition analysis test on the hydrolyzate of horse placenta.

Figure 0006739472
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［２−２］結果
表１に示すように、本実施例に係るウマプラセンタの加水分解物は、構成成分としてタンパク質を８８．１ｇ／１００ｇ含んでいることが示された。このことから、本実施例に係るウマプラセンタの加水分解物は、構成成分として、タンパク質、すなわちペプチドを最も多く含有することが明らかとなった。 [2-2] Results As shown in Table 1, it was shown that the hydrolyzate of horse placenta according to the present example contained 88.1 g/100 g of protein as a constituent component. From this, it was clarified that the hydrolyzate of horse placenta according to the present example contains the most protein, that is, peptide as a constituent component.

３．分子量分布の分析試験
１．で調製したウマプラセンタの加水分解物について、分子量分布の分析試験を行った。当該分析試験は、一般財団法人日本食品分析センターへ委託した。具体的な試験方法は下記の通りである。 3. Analytical test of molecular weight distribution 1. The analysis test of the molecular weight distribution was conducted on the hydrolyzate of horse placenta prepared in 1. The analysis test was outsourced to the Japan Food Analysis Center. The specific test method is as follows.

［３−１］標準溶液の調製
下掲の表２に示した分子量標準品（タンパク質、ペプチド）を、水、アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸の混液（体積比が５５：４５：０１）に溶解し、標準溶液とした。なお、表１中、＊１はグリシン残基、＊２中はチロシン残基、＊３はアルギニン残基を示す。 [3-1] Preparation of Standard Solution The molecular weight standards (protein, peptide) shown in Table 2 below were dissolved in a mixed solution of water, acetonitrile and trifluoroacetic acid (volume ratio 55:45:01), A standard solution was prepared. In Table 1, *1 represents a glycine residue, *2 represents a tyrosine residue, and *3 represents an arginine residue.

Figure 0006739472
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［３−２］試験溶液の調製
１．で調製したウマプラセンタの加水分解物０．０２ｇを採取し、水、アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸の混液（体積比が５５：４５：０１）１０ｍＬを加えた。室温で一晩静置した後、メンブランフィルター（孔径０．４５μｍ）を用いて濾過し、試験溶液とした。 [3-2] Preparation of test solution 1. 0.02 g of the hydrolyzate of horse placenta prepared in 1. was collected, and 10 mL of a mixed solution of water, acetonitrile and trifluoroacetic acid (volume ratio: 55:45:01) was added. After left standing overnight at room temperature, it was filtered using a membrane filter (pore size 0.45 μm) to obtain a test solution.

［３−３］ＨＰＬＣによる分析
［３−２］で得られた試験溶液について、［３−１］で得られた標準溶液に基づき、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分子量分布の分析試験（サイズ排除クロマトグラフ法）を行った。下記にＨＰＬＣの操作条件を示し、下掲の表３に基点分子量の溶出時間を示す。
機種：ＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所社）
検出器：紫外可視検出器 ＳＰＤ−２０Ａ（島津製作所社）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ２５００ＰＷＸＬ、φ７．８ｍｍ×３００ｍｍ（東ソー社）
カラム温度：４０℃
移動相：上述した、水、アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸の混液
流量：０．５ｍＬ／分
測定波長：２２０ｎｍ
注入量：２０μＬ [3-3] Analysis by HPLC Regarding the test solution obtained in [3-2], based on the standard solution obtained in [3-1], analysis test of molecular weight distribution by high performance liquid chromatography (HPLC) (size Exclusion chromatography). The operating conditions of HPLC are shown below, and the elution time of the starting point molecular weight is shown in Table 3 below.
Model: LC-20AD (Shimadzu Corporation)
Detector: UV-visible detector SPD-20A (Shimadzu Corporation)
Column: TSKgel G2500PW XL , φ7.8 mm x 300 mm (Tosoh Corporation)
Column temperature: 40°C
Mobile phase: Mixture of water, acetonitrile and trifluoroacetic acid described above Flow rate: 0.5 mL/min Measurement wavelength: 220 nm
Injection volume: 20 μL

Figure 0006739472
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また、分子量（Ｍ）および溶出時間（Ｔ）の関係式（検量線）は、下記の通りである。
ｌｏｇＭ＝−０．３１５４１０３Ｔ＋７．６９２８７０９ The relational expression (calibration curve) of the molecular weight (M) and the elution time (T) is as follows.
logM=-0.3154103T+7.6928709

［３−４］結果
以上より、試験溶液について得られたクロマトグラムを図１に示し、分析試験結果であるウマプラセンタの加水分解物についての分子量分布を表４に示す。なお、表４に示す分子量分布は、図１のクロマトグラムのピーク面積を百分率で示したものである。 [3-4] Results From the above, the chromatogram obtained for the test solution is shown in FIG. 1, and the molecular weight distribution of the hydrolysis product of horse placenta, which is the analytical test result, is shown in Table 4. The molecular weight distribution shown in Table 4 is the peak area of the chromatogram in FIG. 1 expressed as a percentage.

Figure 0006739472
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図１および表４に示すように、本実施例に係るウマプラセンタの加水分解物は、分子量分布のピークが１，０００以上３，０００未満であることが示された。なお、本実施例に係る分子量標準品はタンパク質とペプチドである。このことから、本実施例に係るウマプラセンタの加水分解物は、構成成分として１，０００以上３，０００未満の分子量を有するペプチドを最も多く含有することが明らかとなった。 As shown in FIG. 1 and Table 4, the peak of the molecular weight distribution of the hydrolyzate of horse placenta according to this example was shown to be 1,000 or more and less than 3,000. The molecular weight standards of this example are proteins and peptides. From this, it was clarified that the hydrolyzate of horse placenta according to the present example contains most of the peptides having a molecular weight of 1,000 or more and less than 3,000 as a constituent component.

４．Ｄｙｅ Ｃ５７を用いたペプチドアッセイ
アミノカルボン酸の存在により蛍光物質に変化するＤｙｅ Ｃ５７を用いて、試料中の２〜２０アミノ酸よりなるペプチド濃度をＰｅｐｔｉｄｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ ＰＥＰ２００（ＰｒｏＦｏｌｄｉｎ社）を用いて、蛍光法により測定した。具体的な試験方法は下記の通りである。 4. Peptide Assay Using Dye C57 Using Dye C57, which changes into a fluorescent substance in the presence of aminocarboxylic acid, a peptide concentration of 2 to 20 amino acids in a sample was measured by a fluorescence method using Peptide Assay Kit PEP200 (ProFoldin). It was measured by. The specific test method is as follows.

［４−１］ペプチドアッセイの試験方法
１．で調製したウマプラセンタの加水分解物またはウマプラセンタ原料そのもののリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液１００μｇ／ｍＬを１ｍＬ、９６穴プレートの３箇所に滴下し、またブランクとしてＰＢＳを１ｍＬ、９６穴プレートの１箇所に滴下した。これらに２５μＬの１×Ｄｙｅ Ｃ５７をＰＢＳで１００μＬに濃度調整した溶液を各々加え、混釈した後、室温にて１５分間静置し、プレートリーダー（Ｐｒｏｍｅｇａ ＧｌｏＭａｘ ＤＩＳＣＯＶＥＲ ＧＭ３０００）を用いて、励起４７５ｎｍ、測定５００〜５５０ｎｍの条件で蛍光法により測定した。 [4-1] Test method of peptide assay 1. Hydrolyzate of horse placenta prepared in 1. or 100 μg/mL of phosphate buffered saline (PBS) solution of the raw material of horse placenta itself was dropped into 1 mL of 3 places of a 96-well plate, and PBS of 1 mL, 96 wells as a blank. It was dripped at one place on the plate. To each of these, 25 μL of 1×Dye C57 was adjusted to a concentration of 100 μL with PBS, and after pouring, the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes, and excitation was performed at 475 nm using a plate reader (Promega GloMax DISCOVER GM3000). Measurement was carried out by a fluorescence method under the condition of 500 to 550 nm.

［４−２］結果
ウマプラセンタ原料そのものの蛍光強度が２４８（ブランク補正後）であったのに対し、本実施例に係るウマプラセンタの加水分解物の蛍光強度は６２６（ブランク補正後）であった。このことから、ウマプラセンタを果実由来システインプロテアーゼで加水分解処理した本実施例に係るウマプラセンタの加水分解物は、ウマプラセンタ原料そのものと比較してペプチドの含有量が約８倍になったことが明らかとなった。 [4-2] Results The fluorescence intensity of the horse placenta raw material itself was 248 (after blank correction), whereas the fluorescence intensity of the hydrolyzate of horse placenta according to this example was 626 (after blank correction). It was From this, it was found that the content of peptides in the hydrolyzate of horse placenta according to the present example obtained by hydrolyzing horse placenta with a cysteine protease derived from fruit was about 8 times that of the raw material of horse placenta. It became clear.

５．ミトコンドリアの賦活性およびＩ型コラーゲンの産生促進性についての検証試験
正常ヒト線維芽細胞を用いてウマプラセンタの加水分解物、医療用として使用されているブタ由来低分子量ハイグレードゼラチン（平均分子量が約８，０００）およびブタ由来中分子量ハイグレードゼラチン（平均分子量が約６０，０００）によるミトコンドリアの賦活性（量・活性）、Ｉ型コラーゲンの産生促進性について、検証試験を行った。当該分析試験は、株式会社エーセルへ委託した。具体的な試験方法は下記の通りである。なお、ウマプラセンタ加水分解物との比較サンプルとしてブタ由来低分子量ハイグレードゼラチンおよびブタ由来中分子量ハイグレードゼラチン（コラーゲン）を用いた理由は、（１）他のウマプラセンタもしくはその他哺乳動物由来のプラセンタの加水分解物で、ペプチドの分子量をはっきりと提示している他社製品サンプルが存在しなかったこと、（２）コラーゲンは一般的に哺乳類のタンパク構成成分として生体内に広く分布しておりプラセンタ中にも存在することが推測されること、（３）ブタ由来低分子量ハイグレードゼラチンおよびブタ由来中分子量ハイグレードゼラチン（コラーゲン）は医療用グレードで品質管理がなされ、かつ、低分子量および中分子量であることがはっきりと提示されていることにより比較対象物となりうると判断したためである。 5. Verification test for mitochondrial activation and type I collagen production promotion Normal horse fibroblasts were used to hydrolyze horse placenta, a low molecular weight high-grade gelatin derived from pigs used for medical purposes (average molecular weight is about 8,000) and porcine-derived medium-molecular-weight high-grade gelatin (average molecular weight of about 60,000) were used to carry out verification tests on mitochondrial activation (amount/activity) and type I collagen production acceleration. The analysis test was entrusted to ASEL Co., Ltd. The specific test method is as follows. The reason why low-molecular weight high-grade gelatin derived from pigs and medium-molecular high-grade gelatin derived from pigs (collagen) were used as samples for comparison with the horse placenta hydrolyzate was (1) other horse placenta or other mammalian placenta. There was no sample of other company's product that clearly showed the molecular weight of the peptide in the hydrolyzate of (2) Collagen is generally widely distributed in vivo as a protein component of mammals (3) Pig-derived low-molecular-weight high-grade gelatin and porcine-derived medium-molecular-weight high-grade gelatin (collagen) are medical grade and quality-controlled, and have low and medium molecular weights. This is because it was determined that the fact that something was clearly presented could be a comparison target.

［５−１］正常ヒト線維芽細胞の培養条件
正常ヒト線維芽細胞を起眠後に基本培地（ＤＭＥＭ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社；Ｃａｔ．Ｎｏ．０８４５６−６５）、１０％ＦＢＳ（ｂｉｏｗｅｓｔ社；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ１８２０，Ｌｏｔ Ｎｏ．５１６５３６）および１％抗生物質）にてＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）内で必要細胞数に達するまで培養した。培養後、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡを用いて剥離し細胞数を測定した後に試験に使用した。 なお、試験培地の組成は、ＤＭＥＭ、１％ＦＢＳおよび１％抗生物質である。 [5-1] Culture Conditions for Normal Human Fibroblasts After nap of normal human fibroblasts, basal medium (DMEM (nacalai tesque; Cat. No. 08456-65), 10% FBS (biowest; Cat. No.) S1820, Lot No. 516536) and 1% antibiotic) in a CO 2 incubator (5% CO 2 , 37° C.) until the required cell number was reached. After culturing, the cells were detached with trypsin/EDTA, the number of cells was measured, and then used in the test. The composition of the test medium was DMEM, 1% FBS and 1% antibiotic.

［５−２］被験物質の調整
１．で調製したウマプラセンタの加水分解物、ブタ由来低分子量ハイグレードゼラチンおよびブタ由来中分子量ハイグレードゼラチンは２５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように試験培地に添加し、濾過滅菌後、濃縮検体溶液として使用した。陽性対照物質として、レスベラトロール（ＳＩＧＭＡ社；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ５０１０−１００ＭＧ）を２００ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶解し濾過滅菌後に濃縮溶液として使用した。同じく陽性対照物質として、ビタミンＣ（アスコルビン酸、和光純薬社；０１３−１９６４１）を２００ｍＭとなるようにＰＢＳに溶解し濾過滅菌後に濃縮溶液として使用した。 [5-2] Preparation of test substance 1. The horse placenta hydrolyzate, swine-derived low-molecular-weight high-grade gelatin, and swine-derived medium-molecular-weight high-grade gelatin prepared in Step 2 were added to the test medium at a concentration of 25 mg/mL, and they were sterilized by filtration and used as a concentrated sample solution. did. As a positive control substance, resveratrol (SIGMA; Cat. No. R5010-100MG) was dissolved in DMSO to a concentration of 200 mM, sterilized by filtration, and used as a concentrated solution. Similarly, as a positive control substance, vitamin C (ascorbic acid, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; 013-19641) was dissolved in PBS to a concentration of 200 mM, sterilized by filtration and used as a concentrated solution.

［５−３］細胞培養
基本培地で調整した正常ヒト線維芽細胞を１×１０４ｃｅｌｌｓ／０．１ｍＬ／ウェル／９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒＢｉｏ−ｏｎｅ社；Ｃａｔ．Ｎｏ．６５５０９０の蛍光観察用ブラックプレート）に播種し、２４時間培養後に培養上清を、被験物質を含む基本培地に置換し、再び培養した。最大で２１日間培養し、その間に２〜３日毎に培地交換した（図１参照）。 [5-3] Cell Culture Normal human fibroblasts adjusted with a basic medium were placed on 1×10 4 cells/0.1 mL/well/96 well plate (grainerBio-one; Cat. No. 655090 black plate for fluorescence observation). After seeding and culturing for 24 hours, the culture supernatant was replaced with a basal medium containing the test substance, and the cells were cultured again. The cells were cultured for 21 days at maximum, and the medium was replaced every 2-3 days during that period (see FIG. 1).

［５−４］細胞数、ミトコンドリア量およびミトコンドリア活性の測定
培養終了後に培養上清を除去した後、ＰＢＳで２回細胞を洗浄、１０００倍希釈したＢａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１を含む試験培地（１００μＬ／ウェル）を添加し、６０分間、３７℃にて培養した。その後、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＯＪＩＮＤＯ社；Ｃａｔ．Ｎｏ．３４６−０７９５１、終濃度５μｇ／ｍＬ）、１０μｇ／ｍＬのＶｅｃｔａＣｅｌｌ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３ (フナコシ社；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＢ−２１００)、５００ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭ−Ｈ２Ｘｒｏｓ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；Ｍ７５１２） を含む試験培地に置換し（１００μＬ／ウェル）、３０分間、ＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃）で反応後に各ウェルから染色液を除去、ＰＢＳで２回洗浄した後、新たに試験培地を添加して、マイクロプレートリーダーにて各ウェルの蛍光強度値を測定した。ヘキスト染色での蛍光強度により総細胞数を算出し、ＶｅｃｔａＣｅｌｌ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３染色および ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭ−Ｈ２Ｘｒｏｓ染色の蛍光強値をヘキスト値で平均化し各相対蛍光値を算出した。それぞれの測定波長を下記に示す。 [5-4] Measurement of cell number, mitochondrial amount and mitochondrial activity After the culture was completed, the culture supernatant was removed, the cells were washed twice with PBS, and a 1000-fold diluted test medium containing Bafilomycin A1 (100 μL/well) was added. The mixture was added and incubated at 37° C. for 60 minutes. Thereafter, Hoechst 33342 solution (DOJINDO; Cat. No. 346-07951, final concentration 5 μg/mL), 10 μg/mL VectaCell Rhodamine 123 (Funakoshi; Cat. No. CB-2100), 500 nM MitoTracker Red-. After replacing with a test medium containing H2Xros (Invitrogen; M7512) (100 μL/well) and reacting in a CO 2 incubator (5% CO 2 , 37° C.) for 30 minutes, the staining solution was removed from each well, and the cells were washed with PBS 2 After washing twice, a new test medium was added and the fluorescence intensity value of each well was measured with a microplate reader. The total number of cells was calculated from the fluorescence intensity of Hoechst staining, and the fluorescence intensity values of VectaCell Rhodamine 123 staining and MitoTracker Red CM-H2Xros staining were averaged by Hoechst value to calculate each relative fluorescence value. The respective measurement wavelengths are shown below.

Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（細胞数）：
３４０ｎｍ（励起波長）／４６１ｎｍ（蛍光波長）
ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭ−Ｈ２Ｘｒｏｓ（ミトコンドリア）：
５７９ｎｍ（励起波長）／５９９ｎｍ（蛍光波長）
Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３（ミトコンドリア活性）：
５０５ｎｍ（励起波長）／５３４ｎｍ（蛍光波長） Hoechst 33342 (cell number):
340 nm (excitation wavelength)/461 nm (fluorescence wavelength)
MitoTracker Red CM-H2Xros (mitochondria):
579 nm (excitation wavelength)/599 nm (fluorescence wavelength)
Rhodamine 123 (mitochondrial activity):
505nm (excitation wavelength)/534nm (fluorescence wavelength)

［５−５］Ｉ型コラーゲン量の測定
各培養終了後に培養上清（各３日間培養後のコラーゲン蓄積）を回収し、測定まで−８０℃にて保管した。測定時に氷上で解凍し原液をヒトＩ型コラーゲンＥＬＩＳＡキット（ＡＣＥＬ社；ＥＣ１−Ｅ１０５）にて測定した。Ｉ型コラーゲン量の測定は、キットに添付のプロトコールに従い、下記のように行った。 [5-5] Measurement of type I collagen amount The culture supernatant (collagen accumulation after 3 days of culture) was collected after each culture and stored at -80°C until measurement. At the time of measurement, it was thawed on ice and the stock solution was measured with a human type I collagen ELISA kit (ACEL; EC1-E105). The amount of type I collagen was measured as follows according to the protocol attached to the kit.

コラーゲン標準原液（２００μｇ／ｍＬ）をもとに、反応緩衝液を用いて１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５、０．１５６２５μｇ／ｍＬのコラーゲン標準溶液を調製し、コラーゲン標準溶液および検体（培養上清）と、ビオチン標識コラーゲン抗体溶液を、９：１の割合になるよう新たなチューブ中で混合した。 コラーゲン固相化マイクロプレートを洗浄液で３回洗浄し、コラーゲン標準溶液および検体（培養上清）とビオチン標識コラーゲン抗体溶液との混合液を、それぞれのウェルに５０μＬずつ添加した後、プレートミキサーで振とうしながら、室温で６０分間反応させた（一次反応）。 その後、ウェル内の溶液を除去し、洗浄液で３回洗浄し、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識アビジン溶液を各ウェルに５０μＬずつ添加し、プレートミキサーで振とうしながら、室温で６０分間反応させた（二次反応）。続いて、ウェル内の溶液を除去し、洗浄液で３回洗浄し、酵素基質溶液を各ウェルに５０μＬずつ添加し、遮光・室温下で１５分間静置した（発色反応）。その後、反応停止溶液を各ウェルに５０μＬずつ添加し、プレートミキサーで１分間混和後、プレートリーダーで各ウェルの吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ）、標準曲線から、検体中のコラーゲン濃度を算出した。 Preparation of 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.15625 μg/mL collagen standard solution using reaction buffer based on collagen standard stock solution (200 μg/mL) Then, the collagen standard solution and the sample (culture supernatant) were mixed with a biotin-labeled collagen antibody solution in a new tube at a ratio of 9:1. The collagen-immobilized microplate was washed three times with a washing solution, and 50 μL of a collagen standard solution and a mixed solution of a sample (culture supernatant) and a biotin-labeled collagen antibody solution were added to each well and shaken with a plate mixer. While reacting, the reaction was carried out at room temperature for 60 minutes (primary reaction). Then, the solution in the well was removed, and the well was washed three times with a washing solution, and 50 μL of Horseradish peroxidase (HRP)-labeled avidin solution was added to each well, and the mixture was reacted at room temperature for 60 minutes while shaking with a plate mixer ( Secondary reaction). Subsequently, the solution in the well was removed, and the well was washed three times with a washing solution, 50 μL of the enzyme substrate solution was added to each well, and the mixture was allowed to stand for 15 minutes under light shielding and room temperature (coloring reaction). After that, 50 μL of the reaction stop solution was added to each well, mixed for 1 minute with a plate mixer, and then the absorbance of each well was measured with a plate reader (measurement wavelength 450 nm), and the collagen concentration in the sample was calculated from the standard curve. ..

［５−６］結果
細胞数、ミトコンドリア量、ミトコンドリア活性およびＩ型コラーゲン量の測定結果を図２〜５に示す。細胞数については、図２に示すように、各被験物質および各濃度区において差異は認められなかった。このことから、各被験物質による細胞増殖促進性は認められないことが明らかとなった。また、ミトコンドリア量については、図３に示すように、培養３日間においてウマプラセンタ加水分解物添加区で顕著なミトコンドリア量の増加を示したが、７日間処理以降の長期処理ではウマプラセンタ加水分解物添加のミトコンドリア量増加作用は認められなかった。一方、ブタ由来低分子量ハイグレードゼラチンおよびブタ由来中分子量ハイグレードゼラチンにおいてミトコンドリア量増加作用は認められなかった。これらのことから、ウマプラセンタ加水分解物添加処理では、線維芽細胞において短期的にミトコンドリア量が増大したことが明らかとなった。 [5-6] Results The results of measurement of cell number, mitochondrial amount, mitochondrial activity and type I collagen amount are shown in FIGS. Regarding the number of cells, as shown in Fig. 2, no difference was observed between each test substance and each concentration group. From this, it became clear that the cell growth promoting properties of each test substance were not observed. As for the amount of mitochondria, as shown in FIG. 3, a significant increase in the amount of mitochondria was observed in the horse-placenta hydrolyzate-added group after 3 days of culture. The effect of increasing the amount of mitochondria was not observed. On the other hand, no increase in mitochondrial amount was observed in porcine-derived low-molecular-weight high-grade gelatin and porcine-derived medium-molecular-weight high-grade gelatin. From these results, it was revealed that the addition of horse placenta hydrolyzate caused a short-term increase in the amount of mitochondria in fibroblasts.

続いて、ミトコンドリア活性評価について、図４に示すように、培養７日間以降の長期処理においてウマプラセンタ加水分解物処理によりミトコンドリア活性が顕著に増大したが、ブタ由来低分子量ハイグレードゼラチンおよびブタ由来中分子量ハイグレードゼラチンにおいては、ミトコンドリア活性増大作用は認められなかった。また、ミトコンドリア賦活作用の陽性対照として使用したレスベラトロールは培養２１日間処理においてのみミトコンドリア活性増大作用が認められた。これらのことから、ウマプラセンタ加水分解物は、正常ヒト線維芽細胞のミトコンドリアの活性を増大させることが明らかとなった。また、Ｉ型コラーゲン産生評価について、図５に示すように、培養１４日間、２１日間においてウマプラセンタ加水分解物処理でＩ型コラーゲンの産生が増大したが、ブタ由来低分子量ハイグレードゼラチンおよびブタ由来中分子量ハイグレードゼラチンにおいてコラーゲンの増加は認められず、むしろ、一部減少が認められた。Ｉ型コラーゲン産生促進の陽性対照として使用したビタミンＣ（アスコルビン酸）ではいずれの培養区においても顕著なＩ型コラーゲン増加作用を示した。また、各被験物質中のコラーゲンがＩ型コラーゲンとして検出される可能性があることから、事前に被験物質を含む試験培地のコラーゲンを測定したが、いずれの培地においてＩ型コラーゲンは未検出レベルであった。これらのことから、ウマプラセンタ加水分解物は、正常ヒト線維芽細胞のＩ型コラーゲンの産生を促進させることが明らかとなった。 Subsequently, as to the evaluation of mitochondrial activity, as shown in FIG. 4, the mitochondrial activity was significantly increased by the treatment with horse placenta hydrolyzate in the long-term treatment after 7 days of culture. In high-molecular-weight gelatin, the effect of increasing mitochondrial activity was not observed. Further, resveratrol used as a positive control for mitochondrial activation was observed to increase mitochondrial activity only after treatment for 21 days in culture. From these results, it was revealed that the horse placenta hydrolyzate increases the activity of mitochondria of normal human fibroblasts. Regarding the evaluation of type I collagen production, as shown in FIG. 5, the production of type I collagen was increased by the treatment with horse placenta hydrolyzate during 14 days and 21 days of culture. In medium-molecular-weight high-grade gelatin, an increase in collagen was not observed, but rather a partial decrease was observed. Vitamin C (ascorbic acid), which was used as a positive control for promoting type I collagen production, showed a remarkable type I collagen-increasing action in all culture groups. In addition, since collagen in each test substance may be detected as type I collagen, collagen in the test medium containing the test substance was measured in advance. there were. From these, it was revealed that the horse placenta hydrolyzate promotes the production of type I collagen by normal human fibroblasts.

以上をまとめると、ウマプラセンタ加水分解物は、ヒト線維芽細胞のミトコンドリア量を増加させ、ミトコンドリアの活性を増大し、かつ、コラーゲン産生を促進する作用を有していることが明らかとなった。また、ウマプラセンタ加水分解物は、短期的な処理によってもミトコンドリア量を増加させ、さらに長期的な処理によりミトコンドリア活性を増大させることも明らかとなった。Ｉ型コラーゲンの産生が促進されたのは、 ヒト線維芽細胞中のミトコンドリアの活性に伴い、ヒト繊維芽細胞のＩ型コラーゲン産生能が高まったと考えられる。また、細胞数自体は各培養期間において変化がないことから、ウマプラセンタ加水分解物による、ヒト線維芽細胞のミトコンドリア量を増加させ、ミトコンドリアの活性を増大し、かつ、コラーゲン産生を促進する作用については、細胞増殖を伴う作用ではなく、細胞機能自体を促進したものと考えられる。 In summary, it was revealed that horse placenta hydrolyzate has the actions of increasing the amount of mitochondria in human fibroblasts, increasing the activity of mitochondria, and promoting collagen production. It was also clarified that the horse placenta hydrolyzate increased the amount of mitochondria by a short-term treatment and increased the mitochondrial activity by a long-term treatment. It is considered that the production of type I collagen was promoted because the ability of human fibroblasts to produce type I collagen increased due to the activity of mitochondria in human fibroblasts. In addition, since the cell number itself does not change during each culture period, there is an effect of increasing the mitochondrial amount of human fibroblasts, increasing the activity of mitochondria, and promoting collagen production by the horse placenta hydrolyzate. Is considered to have promoted the cell function itself, not the action involving cell proliferation.

６．スクラッチ法による細胞遊走試験
創傷治癒の過程では、傷に向かって線維芽細胞が増殖・遊走して創が収縮・閉鎖されることが知られており、これを利用してウマプラセンタの加水分解物による細胞遊走促進作用を検証することとした。具体的な試験方法は下記の通りである。 6. Cell migration test by scratch method In the process of wound healing, it is known that fibroblasts proliferate and migrate toward the wound, and the wound contracts and closes. It was decided to verify the cell migration-promoting effect of the. The specific test method is as follows.

［６−１］細胞遊走試験の試験方法
あらかじめ、６０ｍｍのＤｉｓｈの裏側に十字の線を描いておき、そこに、ヒト正常線維芽細胞を４０００個／ｃｍ２の割合で播種し、当該細胞がコンフルエントになるまで培養した後、コンフルエントな状態となった当該細胞を専用のスティックで剥がし、スクラッチした。続いて、本実施例に係るウマプラセンタ加水分解物試料を添加した培地または添加しない培地に交換し、０時間、２４時間および４８時間後に画像を撮影し、スクラッチによる十字の線を参考にして、空白部分への進む距離を測定した。なお、１ウェルにおいて２、３箇所測定して平均し、ｎ数は４または５とした。その結果を図６に示す。 [6-1] Test method for cell migration test In advance, a cross line was drawn on the back side of the 60 mm dish, and human normal fibroblasts were seeded at a rate of 4000 cells/cm 2 , and the cells were After culturing until the cells became confluent, the cells in the confluent state were peeled off with a dedicated stick and scratched. Subsequently, the medium was added with or without the horse placenta hydrolyzate sample according to the present example, and images were taken after 0 hours, 24 hours, and 48 hours, with reference to the cross line due to scratch, The distance traveled to the blank part was measured. In addition, the number of n was set to 4 or 5 by averaging measured values at 2 and 3 points in one well. The result is shown in FIG.

［６−２］結果
図６に示すように、本実施例で用いるウマプラセンタの加水分解物を添加した場合（１００μｇ／ｍＬ）は、当該添加しない場合と比較して、０時間、２４時間、４８時間と時間が経過するにつれ、ヒト正常線維芽細胞が増殖するとともに遊走活性が向上する。このことから、本実施例で用いるウマプラセンタの加水分解物は、創傷治癒能を有することが明らかとなった。また、上述の通り、従来、プラセンタエキス（プラセンタ抽出物）に含まれることが知られているＥＧＦ(上皮細胞増殖因子)、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＦＧＦ(線維芽細胞増殖因子)などの成長因子は、タンパク質であるがゆえに、加水分解反応により分解・失活してしまうため、本発明に係る創傷治癒剤は、従来のプラセンタエキス（プラセンタ抽出物）の奏する創傷治癒効果とは異なるといえる。 [6-2] Results As shown in FIG. 6, when the hydrolyzate of horse placenta used in this Example (100 μg/mL) was added, 0 hours, 24 hours, As the time elapses for 48 hours, normal human fibroblasts proliferate and their migration activity improves. From this, it was revealed that the hydrolyzate of horse placenta used in this example has a wound healing ability. As described above, EGF (epithelial cell growth factor), HGF (hepatocyte growth factor), FGF (fibroblast growth factor), etc., which are conventionally known to be contained in placenta extract (placenta extract), Since the growth factor is a protein, it is decomposed and inactivated by a hydrolysis reaction. Therefore, the wound healing agent according to the present invention is different from the wound healing effect exhibited by the conventional placenta extract (placenta extract). I can say.

７．皮膚増殖能確認試験
ウマプラセンタの加水分解物が皮膚増殖能を有しているか否かを確認するため、表皮組織の三次元培養キットを用いて試験した。具体的な試験方法は下記の通りである。なお、作業はクリーンベンチ内で行い、器具は滅菌済ディスポーサルの器具を使用した。 7. Skin Growth Ability Confirmation Test In order to confirm whether or not the hydrolyzate of horse placenta has a skin growth ability, a test was performed using a three-dimensional culture kit for epidermal tissue. The specific test method is as follows. The work was carried out in a clean bench, and a sterilized disposable instrument was used as the instrument.

［７−１］皮膚増殖能確認試験の試験方法
当該試験は、ヒト表皮モデル作成キット（ＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ−ＫＩＴ；ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング社）を用い、その取扱説明書の記載に従って試験した。 [7-1] Test Method for Skin Proliferation Ability Confirmation Test The test was performed using a human epidermis model preparation kit (LabCyte EPI-KIT; Japan Tissue Engineering Co., Ltd.) according to the instruction manual.

［７−２］結果
図７にヒト表皮モデルの増殖例における培養過程（１日目→４日目→７日目→１０日目→１４日目→１８日目→２１日目および２８日目）を、図８（ａ）にヒト表皮モデル（ＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ）の断面とヒト正常皮膚（眼瞼部）の断面との対比を、図８（ｂ）に三次元培養キットにおける継代培養の構成と様子を、図９に本試験結果（（ａ）はコントロール、（ｂ）は５％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物を添加した場合、（ｃ）は５０％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物を添加した場合を、それぞれ示す）を、それぞれ示す。図９に示すように、本実施例で用いるウマプラセンタの加水分解物を添加しない培地でヒト正常線維芽細胞を継代培養した場合（図９（ａ））は、表皮組織が形成されていないが、本実施例で用いるウマプラセンタの加水分解物を添加した培地でヒト正常線維芽細胞を継代培養した場合（図９（ｂ）および（ｃ））は、表皮組織が形成されて増殖している。このことから、本実施例で用いるウマプラセンタの加水分解物は、皮膚増殖能を有することが明らかとなった。 [7-2] Results FIG. 7 shows the culture process in the proliferation example of the human epidermis model (1st day→4th day→7th day→10th day→14th day→18th day→21st day and 28th day. Fig. 8(a) shows a comparison between a cross section of a human epidermis model (LabCyte EPI-MODEL) and a cross section of normal human skin (eyelid part), and Fig. 8(b) shows the subculture of the three-dimensional culture kit. The composition and appearance are shown in FIG. 9, where the results of this test ((a) are controls, (b) is 5% (w/w) of horse placenta hydrolyzate, and (c) is 50% (w/w)). 2) shows the case where the horse placenta hydrolyzate in 1) was added). As shown in FIG. 9, when human normal fibroblasts were subcultured in a medium not containing the hydrolyzate of horse placenta used in this example (FIG. 9(a)), no epidermal tissue was formed. However, when human normal fibroblasts were subcultured in a medium to which the hydrolyzate of horse placenta used in this Example was subcultured (FIGS. 9(b) and (c)), epidermal tissue was formed and proliferated. ing. From this, it was clarified that the hydrolyzate of horse placenta used in this example has a skin growth ability.

８．皮膚刺激安全性試験
ウマプラセンタの加水分解物の皮膚刺激性について確認するため、表皮組織の三次元培養キットおよび皮膚刺激性の測定キットを用いて試験した。具体的な試験方法は下記の通りである。 8. Skin irritation safety test In order to confirm the skin irritation of the horse mackerel hydrolyzate, a test was performed using a three-dimensional culture kit for epidermal tissue and a skin irritation measurement kit. The specific test method is as follows.

［８−１］皮膚刺激性試験の試験方法
当該試験は、ヒト表皮モデル作成キット（ＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ−ＫＩＴ；ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング社）および皮膚刺激性の測定キットであるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、ＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ−ＫＩＴの取扱説明書および「ヒト３次元培養表皮ＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ２４を用いた皮膚刺激性試験法」の記載に従って試験した。皮膚刺激性の測定は下記の手順で行った。 [8-1] Test method for skin irritation test The test is a human epidermis model preparation kit (LabCyte EPI-KIT; Japan Tissue Engineering Co., Ltd.) and a skin irritation measurement kit, CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay. (Promega), and the test was performed according to the instruction manual of LabCyte EPI-KIT and the description of “Skin irritation test method using human three-dimensional cultured epidermis LabCyte EPI-MODEL 24”. The skin irritation was measured by the following procedure.

先ず、「７．皮膚増殖能確認試験」と同様の手法にてヒト表皮モデルを作成した。続いて、陽性対照物質として、皮膚刺激剤である５％（ｗ／ｗ）のＳｏｄｉｕｍ ｌａｕｒｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＬＳ）、５０％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物および５％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物を検体として、各々を当該作成したヒト表皮モデルに接触させ、５日間培養した後、それぞれの検体を除去し、ＭＴＴ法により細胞毒性を測定した。６０ｍｍディッシュで培養したＭＴＴ培地（２ｍＬまたは３ｍＬ）にＤｙｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μＬ添加し、３７℃で４時間、ＣＯ２インキュベーター内で培養した後、１ｍＬのＳｏｌｕｂｉｌｌｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ／Ｓｔｏｐ Ｍｉｘを加え、３７℃で１時間、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。続いて、９６ウェルプレートのウェル内に２００μＬずつ移した後、５６０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定した。 First, a human epidermis model was prepared in the same manner as in “7. Skin proliferation ability confirmation test”. Subsequently, as a positive control substance, 5% (w/w) of sodium lauryl sulphate (SLS) which is a skin stimulant, 50% (w/w) of horse placenta hydrolyzate and 5% (w/w) of Each of the horse placenta hydrolysates was used as a sample and brought into contact with the prepared human epidermis model, and after culturing for 5 days, each sample was removed and the cytotoxicity was measured by the MTT method. 100 μL of Dye Solution was added to MTT medium (2 mL or 3 mL) cultivated in 60 mm dish, cultivated in a CO 2 incubator at 37° C. for 4 hours, 1 mL of Solubilization Solution/Stop Mix was added, and 37° C. for 1 hour. , Cultured in a CO 2 incubator. Then, 200 μL of each was transferred into the well of the 96-well plate, and the absorbance at 560 nm was measured with a plate reader.

［８−２］結果
図１０に本試験結果を示す。なお、図１０中、（ａ）は５％ＳＬＳを検体とした場合、（ｂ）は５０％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物を検体とした場合、（ｃ）は５％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物を検体とした場合の結果を示す。図１０に示すように、５％ＳＬＳを検体とした場合は細胞数が約３５％となり、ヒト表皮モデルに対してダメージを与えているが、５０％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物を検体とした場合は細胞数が約１１５％と約１５％増加し、５％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物を検体とした場合は細胞数が約１０８％と約８％増加している。このことから、本実施例で用いるウマプラセンタの加水分解物は、皮膚に対する安全性が高く、むしろ皮膚の各組織・細胞の成長を促していることが明らかとなった。 [8-2] Results FIG. 10 shows the results of this test. In addition, in FIG. 10, (a) uses 5% SLS as a sample, (b) uses 50% (w/w) horse placenta hydrolyzate as a sample, and (c) uses 5% (w). /W) shows the results when the horse placenta hydrolyzate was used as a sample. As shown in FIG. 10, when 5% SLS was used as a sample, the number of cells was about 35%, which damages the human epidermis model, but 50% (w/w) horse placenta hydrolyzate. The number of cells increased about 115% to about 15% when the sample was used as a sample, and the number of cells increased about 108% to about 8% when 5% (w/w) of the horse placenta hydrolyzate was used as a sample. ing. From this, it was clarified that the hydrolyzate of horse placenta used in this example has high safety to the skin and rather promotes the growth of each tissue/cell of the skin.

Claims (2)

構成成分として１，０００以上３，０００未満の分子量を有するペプチドを最も多く含有する、果実由来システインプロテアーゼによるウマプラセンタ加水分解物からなる、ヒト線維芽細胞におけるミトコンドリア活性化剤。 To most containing a peptide having a molecular weight of less than 1,000 or more 3,000 as a component, consisting of horse placenta hydrolyzate by fruit-derived cysteine protease, mitochondrial activator definitive human fibroblasts. 構成成分として１，０００以上３，０００未満の分子量を有するペプチドを最も多く含有する、果実由来システインプロテアーゼによるウマプラセンタ加水分解物からなる、ヒト線維芽細胞を増殖させるとともに遊走活性を向上させることによる創傷治癒剤。 By proliferating human fibroblasts and improving their migratory activity, which consists of a horse-placenta hydrolyzate by a fruit-derived cysteine protease, which contains most of peptides having a molecular weight of 1,000 or more and less than 3,000 as a constituent component. Wound healing agent.
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