JP6736437B2 - Immunochromatography detection kit - Google Patents
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Description
本発明は、コンジュゲート試薬とイムノクロマトグラフィーテストストリップを含む検出キットに関する。特に、前記テストストリップが、サンプル供給部の下流側に高分子粘性物質が溶出可能に保持されたテストストリップである検出キットに関する。また、前記検出キットを用いた検出方法に関する。 The present invention relates to a detection kit containing a conjugate reagent and an immunochromatographic test strip. In particular, the present invention relates to a detection kit in which the test strip is a test strip in which a polymeric viscous substance can be eluted at a downstream side of a sample supply section. It also relates to a detection method using the above detection kit.
イムノクロマトグラフィーテストストリップを用いて試料中の被検出物質である抗原を検出する方法は次のとおりである。まず、第一の抗体が標識体に固定化されたコンジュゲートと、サンプルとを接触させる。これらの接触によりサンプル中の被検出物質である抗原とコンジュゲートとの複合体が形成される。イムノクロマトグラフィーテストストリップは、第二の抗体が固定化された捕捉部位(検出部位)を有し、前記複合体を担体に提供すると複合体は、担体中を展開しながら、捕捉部位に捕捉され、目視あるいは光学的手段などにより複合体標識物質の有無や強度を検出することができる。
ここで、イムノクロマトグラフィーを利用した検出におけるコンジュゲートの存在様式としては、テストストリップ(典型的にはサンプルパッド上)のサンプル供給部より下流側にコンジュゲート部として存在する様式がある。あるいは、テストストリップとは別にコンジュゲートチップなど、コンジュゲート試薬として存在する様式がある(特許文献1)。コンジュゲートチップとは、検体液を濾過するフィルターにコンジュゲートが塗布されたものである。
前者の、コンジュゲートがテストストリップの一部として存在する場合には、サンプル供給部にサンプルが滴下されると、サンプルは、サンプル供給部の下流のコンジュゲート部に到達したときから、サンプル中の被検出物質である抗原とコンジュゲートとの結合反応が開始することになる。したがって、コンジュゲート部のコンジュゲートがすべて流れきってしまうことにより、捕捉部位(検出部位)における発色強度の増強は停止することになる。
一方、コンジュゲートチップとして存在する場合、サンプルを当該チップで濾過した液体をテストストリップのサンプルパッドに滴下すると、サンプルおよびコンジュゲートの混合物である液体がサンプルパッドの全体に一気に分散することになる。したがって、滴下直後からサンプル中の抗原とコンジュゲートの結合反応が開始し、混合物の液体の流れが平衡に達するまで捕捉部位(検出部位)の発色強度は増強し続けることになる。
イムノクロマトグラフィーを利用した検出における感度の調節方法としては、例えば特許文献2が知られている。特許文献2には、分析対象成分を減らすために、分析対象試料を感度調節物質と反応させる方法が開示されている。具体的には、感度調節物質は、識別可能物質で標識した抗体とは別の、識別不能標識(例えば、テストストリップと区別できないような白色物質)で標識した抗体であり、これを、標識可能物質で標識した抗体の固定化部よりも上流に保持させて、分析を行う。分析対象成分は、一部は感度調節物質と反応しながらクロマトグラフ担体を移動し、感度調節物質と反応しない分析対象成分は、標識物質と反応し、検出部で固定されることになる。
本方法では、分析対象物を減らすという一定の効果は期待できるものの、標識抗体の存在様式は、上記存在様式のテストストリップの一部として存在する場合に相当し、そもそも発色強度の増強が液体サンプルの流れが平衡に達するまで続くという問題は生じない。
また、特許文献3には、糞便潜在血液のような被検体のイムノクロマトグラフィー検出において、あらかじめ所定量の被検体をサンプルパッドに固定化された抗体と接触させて結合させてから、未結合の検体を着色ラテックスに結合された抗体と結合させ、検出する方法が開示されている。
本方法も、特許文献2と同様に、標識抗体の存在様式は、上記存在様式のテストストリップの一部として存在する場合に相当し、そもそも発色強度の増強が液体サンプルの流れが平衡に達するまで続くという問題は生じない。
このように、コンジュゲートチップなどを使って、コンジュゲートを液体サンプルと混合した状態で、テストストリップに供給する場合に、検出部位における発色強度が長時間上がり続けることを抑制するような方法はこれまで存在しなかった。
The method for detecting the antigen, which is the substance to be detected, in the sample using the immunochromatographic test strip is as follows. First, the conjugate in which the first antibody is immobilized on the label is brought into contact with the sample. By these contact, a complex of the antigen and the conjugate which is the substance to be detected in the sample is formed. The immunochromatographic test strip has a capture site (detection site) on which the second antibody is immobilized, and when the complex is provided to the carrier, the complex is captured in the capture site while developing in the carrier, The presence or absence and strength of the complex labeling substance can be detected by visual observation or optical means.
Here, as a mode of existence of the conjugate in the detection using immunochromatography, there is a mode of existence as a conjugate part on the downstream side of the sample supply part of the test strip (typically on the sample pad). Alternatively, in addition to the test strip, there is a mode of existing as a conjugate reagent such as a conjugate chip (Patent Document 1). The conjugate chip is a filter in which a conjugate is applied to a filter for filtering a sample liquid.
In the former case, where the conjugate is present as part of the test strip, when the sample is dropped onto the sample supply, the sample will be present in the sample from the time it reaches the conjugate downstream of the sample supply. The binding reaction between the conjugate, which is the substance to be detected, and the conjugate will start. Therefore, when all the conjugates in the conjugate portion flow out, the enhancement of the coloring intensity at the capture site (detection site) is stopped.
On the other hand, when the sample is present as a conjugate chip, when the liquid obtained by filtering the sample with the chip is dropped on the sample pad of the test strip, the liquid, which is a mixture of the sample and the conjugate, is dispersed all over the sample pad at once. Therefore, the binding reaction between the antigen in the sample and the conjugate starts immediately after the dropping, and the color development intensity of the capture site (detection site) continues to increase until the liquid flow of the mixture reaches equilibrium.
For example, Patent Document 2 is known as a method of adjusting the sensitivity in detection using immunochromatography. Patent Document 2 discloses a method of reacting a sample to be analyzed with a sensitivity adjusting substance in order to reduce components to be analyzed. Specifically, the sensitivity adjusting substance is an antibody labeled with an indistinguishable label (for example, a white substance that is indistinguishable from a test strip) different from an antibody labeled with an identifiable substance. The analysis is carried out by holding the antibody labeled with the substance upstream of the immobilized part. A part of the analysis target component moves on the chromatographic carrier while partially reacting with the sensitivity adjusting substance, and an analysis target component which does not react with the sensitivity adjusting substance reacts with the labeling substance and is fixed at the detection part.
In this method, although a certain effect of reducing the number of analytes can be expected, the presence mode of the labeled antibody corresponds to the case where it is present as a part of the test strip of the above presence mode, and in the first place, the enhancement of the color development intensity is caused by the liquid sample. There is no problem that the flow of continues until equilibrium is reached.
Further, in Patent Document 3, in the immunochromatographic detection of an analyte such as fecal latent blood, a predetermined amount of the analyte is brought into contact with the antibody immobilized on the sample pad to bind the analyte, and then the unbound analyte. A method of detecting by binding to a colored latex with an antibody bound thereto is disclosed.
This method also corresponds to the case where the presence mode of the labeled antibody is present as a part of the test strip of the above-mentioned presence mode, like the case of Patent Document 2, and in the first place, the enhancement of the coloring intensity is until the flow of the liquid sample reaches the equilibrium The problem of continuing does not occur.
Thus, when a conjugate is mixed with a liquid sample and supplied to a test strip using a conjugate chip, etc., a method that suppresses the continuous increase in color intensity at the detection site is Didn't exist until.
本発明は、コンジュゲートチップなどを使って、コンジュゲートを液体サンプルと混合した状態で、テストストリップに供給する場合に、検出部位における発色強度が長時間上がり続けることを抑制し、一定時間で複合体の検出部位における捕捉を完了させ、発色強度の増強が停止するようなイムノクロマトグラフィーを利用した検出キットおよび検出方法の提供を課題とする。 INDUSTRIAL APPLICABILITY When the conjugate is mixed with a liquid sample and supplied to a test strip using a conjugate chip or the like, it is possible to prevent the color development intensity at the detection site from continuing to rise for a long time, and to perform the complexing at a constant time. An object of the present invention is to provide a detection kit and a detection method using immunochromatography that completes the capture at the detection site of the body and stops the enhancement of the coloring intensity.
上記課題を解決するために、本発明者らは、抗原の検出には、一定時間内に一定量の複合体が必要であり、それ以上の複合体の検出を抑制するためにはどうすればよいか鋭意検討を行った。
その結果、特定の高分子粘性物質をサンプル供給部の下流側に存在させることで、抗原が結合したコンジュゲート(複合体)の流れを抑制し、不要な複合体の検出部位での捕捉を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
<1>以下を含むイムノクロマトグラフィーを利用した検出キット。
(1)被検出物質に対して免疫学的に反応する第一の抗体が標識体に固定化されたコンジュゲート試薬
(2)サンプルを展開させることによりサンプル中の被検出物質を検出する不溶性担体を備えたイムノクロマトグラフィー用テストストリップであって、
前記不溶性担体は、上流から順に
サンプルを供給するサンプル供給部、
高分子粘性物質が担持された高分子粘性物質担持部、
および
被検出物質に対して免疫学的に反応する第二の抗体が固定化された検出部、
を含む、前記テストストリップ
<2>高分子粘性物質が分子量6000以上、かつ、粘度が4〜1000mPa・Sである<1>に記載の検出キット。
<3>高分子粘性物質担持部は、不溶性担体上にサンプルの展開方向と直行するようにライン状に形成されている<1>または<2>に記載の検出キット。
<4>不溶性担体は、少なくともサンプルパッドおよびサンプルパッドとは別体のメンブレンパッドを含み、
サンプルパッドは、サンプル供給部及び高分子粘性物質担持部を有し、
メンブレンパッドは、検出部を有する<1>〜<3>のいずれかに記載の検出キット。
<5>高分子粘性物質担持部が、サンプルパッドのサンプル供給部の下流側に配置されている<4>に記載の検出キット。
<6>(1)の標識体が着色ラテックス又は金コロイドである<1>〜<5>のいずれかに記載の検出キット。
<7>被検出物質がヘモグロビンであり、第一及び第二の抗体が抗ヘモグロビン抗体である<1>〜<6>のいずれかに記載の検出キット。
<8>イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法であって、以下の工程を含む検出方法。
(A)被検出物質に対して免疫学的に反応する第一の抗体が標識体に固定化されたコンジュゲート試薬、検体および検体希釈液を混合し、これらの混合物からなるサンプルを得る工程
(B)下記イムノクロマトグラフィー用テストストリップのサンプル供給部に(A)で得られたサンプルを滴下し、不溶性担体中を展開させる工程
イムノクロマトグラフィー用テストストリップ;
前記不溶性担体を備え、上流から順に
サンプルを供給するサンプル供給部、
高分子粘性物質が担持された担持部、及び
被検出物質に対して免疫学的に反応する第二の抗体が固定化された検出部、を含む、前記テストストリップ
(C)サンプル中の被検出物質とコンジュゲートの複合体、を検出部において検出する工程
<9>高分子粘性物質が分子量6000以上、かつ、粘度が4〜1000mPa・Sである<8>に記載の検出方法。
<10>高分子粘性物質の担持部は、不溶性担体上にサンプルの展開方向と直行するようにライン状に形成されている<8>または<9>に記載の検出方法。
<11>不溶性担体は、少なくともサンプルパッドおよびサンプルパッドとは別体のメンブレンパッドを含み、
サンプルパッドは、サンプル供給部及び高分子粘性物質担持部を有し、
メンブレンパッドは、検出部を有する<8>〜<10>のいずれかに記載の検出方法。
<12>高分子粘性物質担持部が、サンプルパッドのサンプル供給部の下流側に配置されている<11>に記載の検出方法。
<13>(1)の標識体が着色ラテックス又は金コロイドである<8>〜<12>のいずれかに記載の検出方法。
<14>被検出物質がヘモグロビンであり、第一及び第二の抗体が抗ヘモグロビン抗体である<8>〜<13>のいずれかに記載の検出方法。
<15>検体が、糞便である、<8>〜<14>のいずれかに記載の検出方法。
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors need to detect a fixed amount of a complex within a fixed period of time for detecting an antigen, and what should be done to suppress the detection of further complexes. Diligently studied.
As a result, the presence of a specific polymer viscous substance on the downstream side of the sample supply section suppresses the flow of the conjugate (complex) to which the antigen is bound, and suppresses the capture of unnecessary complex at the detection site. They have found that they can do so and have completed the present invention.
That is, the present invention has the following configurations.
<1> A detection kit using immunochromatography including the following.
(1) A conjugate reagent in which a first antibody that immunologically reacts with a substance to be detected is immobilized on a label (2) An insoluble carrier for detecting the substance to be detected in the sample by developing the sample A test strip for immunochromatography comprising:
The insoluble carrier is a sample supply unit that supplies samples in order from the upstream,
A polymer viscous substance supporting part supporting a polymer viscous substance,
And a detection unit in which a second antibody that immunologically reacts with the substance to be detected is immobilized,
<2> The detection kit according to <1>, wherein the test strip <2> the polymeric viscous substance has a molecular weight of 6000 or more and a viscosity of 4 to 1000 mPa·S.
<3> The detection kit according to <1> or <2>, wherein the polymeric viscous substance-supporting portion is formed in a line on the insoluble carrier so as to be orthogonal to the direction of sample development.
<4> The insoluble carrier includes at least a sample pad and a membrane pad separate from the sample pad,
The sample pad has a sample supply unit and a polymer viscous substance supporting unit,
The detection kit according to any one of <1> to <3>, wherein the membrane pad has a detection unit.
<5> The detection kit according to <4>, wherein the polymeric viscous substance-supporting part is arranged on the downstream side of the sample supply part of the sample pad.
<6> The detection kit according to any one of <1> to <5>, in which the labeled body of (1) is a colored latex or a gold colloid.
<7> The detection kit according to any one of <1> to <6>, wherein the substance to be detected is hemoglobin, and the first and second antibodies are anti-hemoglobin antibodies.
<8> A detection method using immunochromatography, which comprises the following steps.
(A) A step of mixing a conjugate reagent in which a first antibody that immunologically reacts with a substance to be detected is immobilized on a label, a sample, and a sample diluent to obtain a sample composed of these mixtures ( B) A step of dropping the sample obtained in (A) into the sample supply part of the immunochromatographic test strip below and developing it in an insoluble carrier. Immunochromatographic test strip;
A sample supply unit that includes the insoluble carrier and supplies samples sequentially from the upstream side;
Detected in the test strip (C) sample, which includes a carrying part carrying a polymeric viscous substance, and a detecting part having a second antibody immobilized thereon which immunologically reacts with the detected substance. Step <9> of detecting a complex of a substance and a conjugate in a detection section <9> The detection method according to <8>, wherein the high molecular viscous substance has a molecular weight of 6000 or more and a viscosity of 4 to 1000 mPa·S.
<10> The detection method according to <8> or <9>, wherein the polymeric viscous substance-supporting portion is formed in a line on the insoluble carrier so as to be orthogonal to the direction in which the sample is developed.
The <11> insoluble carrier includes at least a sample pad and a membrane pad separate from the sample pad,
The sample pad has a sample supply unit and a polymer viscous substance supporting unit,
The detection method according to any one of <8> to <10>, in which the membrane pad has a detection unit.
<12> The detection method according to <11>, wherein the polymer viscous substance-supporting portion is arranged on the downstream side of the sample supply portion of the sample pad.
<13> The detection method according to any one of <8> to <12>, in which the labeled body of (1) is a colored latex or a gold colloid.
<14> The detection method according to any one of <8> to <13>, wherein the substance to be detected is hemoglobin, and the first and second antibodies are anti-hemoglobin antibodies.
<15> The detection method according to any one of <8> to <14>, in which the sample is feces.
検体をあらかじめコンジュゲート試薬と接触させた状態でイムノクロマトグラフィーテストストリップのサンプル供給部に提供し、検体中の被検出物質である抗原を検出する方法において、テストストリップのサンプル供給部の下流側に高分子粘性物質を存在させることにより、余分な抗原の検出部位への流入を抑制し、検出部位における発色強度の増強を一定時間内に抑えることができることから、短時間で正確な検出が可能となった。 In the method of providing the sample to the sample supply section of the immunochromatographic test strip in a state of being brought into contact with the conjugate reagent in advance, and detecting the antigen that is the substance to be detected in the sample, the sample is supplied to the downstream side of the sample supply section of the test strip. The presence of the molecular viscous substance suppresses the influx of excess antigen to the detection site and suppresses the increase of the color development intensity at the detection site within a certain time, which enables accurate detection in a short time. It was
(サンプル)
本発明において、サンプルとしては、血液、尿、痰、唾液、鼻汁、その他の体液、糞便等の生体試料を用いる。生体試料は、そのままサンプルとして用いてもよく、適宜希釈液によって希釈したり、ろ過してサンプルとしてもよい。
(sample)
In the present invention, biological samples such as blood, urine, sputum, saliva, nasal discharge, other body fluids, and feces are used as the sample. The biological sample may be used as a sample as it is, or may be appropriately diluted with a diluting solution or filtered to obtain a sample.
(被検出物質)
本発明の被検出物質としては、サンプルである生体試料中に含まれ、抗原抗体反応を利用して検出し得るものであればいずれでもよく、ウイルス、細菌、寄生虫、タンパク質などが挙げられる。
被検出物質となるウイルスとしてインフルエンザウイルス、被検出物質となるタンパク質としては、糞便潜在血液中のヒトヘモグロビン、B型肝炎ウイルス抗体、C型肝炎ウイルス抗体、ヒト免疫不全ウイルス抗体等が挙げられる。
(Substance to be detected)
The substance to be detected of the present invention may be any substance contained in a biological sample as a sample and can be detected by utilizing an antigen-antibody reaction, and examples thereof include viruses, bacteria, parasites and proteins.
Examples of the virus to be the substance to be detected include influenza virus, and examples of the protein to be the substance to be detected include human hemoglobin, hepatitis B virus antibody, hepatitis C virus antibody, human immunodeficiency virus antibody in fecal latent blood.
(キット)
本発明のイムノクロマトグラフィーを利用した検出キットは、
(1)被検出物質に対して免疫学的に反応する第一の抗体が標識体に固定化されたコンジュゲート試薬、及び
(2)サンプルを展開させることによりサンプル中の被検出物質を検出する不溶性担体を備えたイムノクロマトグラフィー用テストストリップであって、
前記不溶性担体は、上流から順に
サンプルを供給するサンプル供給部、
高分子粘性物質が担持された高分子粘性物質担持部、
および
被検出物質に対して免疫学的に反応する第二の抗体が固定化された検出部、
を含む、前記テストストリップ
を含むものであればよい。
本検出キットは、他に検出に必要な試薬、サンプルの希釈液、試験用チューブ、便採取用の綿棒、取扱い説明書、テストストリップ格納用のハウジングなどを含んでもよい。
(kit)
The detection kit utilizing the immunochromatography of the present invention,
(1) A conjugate reagent in which a first antibody that immunologically reacts with a substance to be detected is immobilized on a label, and (2) a sample is developed to detect the substance to be detected in the sample. A test strip for immunochromatography provided with an insoluble carrier,
The insoluble carrier is a sample supply unit that supplies samples in order from the upstream,
A polymer viscous substance supporting part supporting a polymer viscous substance,
And a detection unit in which a second antibody that immunologically reacts with the substance to be detected is immobilized,
It suffices to include the test strip including the above.
The detection kit may further include reagents necessary for detection, a sample diluent, a test tube, a swab for collecting feces, an instruction manual, a housing for storing a test strip, and the like.
(イムノクロマトグラフィー用テストストリップ)
本発明のテストストリップにおいて、上記サンプルを供給するサンプル供給部は、サンプルパッドとして、検出部を備えた不溶性メンブレンと別個に存在する場合、または、前記不溶性メンブレンと同一メンブレン上に、検出部の上流側のサンプル供給部として存在する場合等がある。このうちでもサンプルパッドとして存在する場合が望ましい。
本発明のテストストリップには、コンジュゲートパッドが存在せず、コンジュゲートはテストストリップとは別に、コンジュゲート試薬として存在する。コンジュゲート試薬は、例えば、フィルター中にコンジュゲートが含浸されたコンジュゲートチップの形態、凍結乾燥試薬の形態、凍結試薬の形態、乾燥試薬の形態等、検体希釈液等の液体にあらかじめ添加されている液状試薬の形態が挙げられる。コンジュゲートチップは、フィルターそのままであってもよいし、ハウジングに内蔵されていてもよい。このようなコンジュゲートチップを使って、検体希釈液を濾過して通過させることでチップ内のコンジュゲートと被検出物質が結合し、複合体を形成することができる。凍結乾燥試薬の形態、凍結試薬の形態、乾燥試薬の形態の場合は、使用直前に、被検出物質、又は検体希釈液に添加して使用することができる。
(Test strip for immunochromatography)
In the test strip of the present invention, the sample supply unit for supplying the sample is present as a sample pad separately from an insoluble membrane having a detection unit, or on the same membrane as the insoluble membrane, upstream of the detection unit. It may exist as a sample supply unit on the side. Of these, it is desirable that the sample pad exists.
The test strip of the present invention does not have a conjugate pad and the conjugate is present as a conjugate reagent separately from the test strip. The conjugate reagent is previously added to a liquid such as a sample diluent, for example, in the form of a conjugate chip in which the conjugate is impregnated in a filter, a freeze-dried reagent form, a frozen reagent form, a dry reagent form, etc. The form of the liquid reagent is The conjugate chip may be the filter itself or may be built in the housing. By using such a conjugate chip to filter and pass the sample diluent, the conjugate in the chip and the substance to be detected can bind to each other to form a complex. In the case of a freeze-dried reagent form, a freeze-reagent form, or a dry reagent form, it can be used by adding it to a substance to be detected or a sample diluent immediately before use.
(サンプルパッド)
本発明のイムノクロマトグラフィーテストストリップがサンプルパッドを含む場合、サンプルパッドとはサンプルを受け入れる部位(サンプル供給部)を有するパッドであればよく、パッドに成型された状態で液体のサンプルを吸収し、液体と検出対象物とが通り抜けることができるどんな物質及び形態をも含む。サンプルパッドに適した材料の具体例として、ガラス繊維(グラスファイバー)、アクリル繊維、親水性ポリエチレン材、乾燥紙、紙パルプ、織物等が含まれるが、これらに限定されない。好適には、グラスファイバー製パッドが用いられる。サンプルパッドには、後述する抗体固定化メンブレンにおける非特異的反応(吸着)を防止・抑制する目的で、通常使用されるブロッキング試薬を含ませることができる。
(Sample pad)
When the immunochromatographic test strip of the present invention includes a sample pad, the sample pad may be a pad having a site for receiving a sample (sample supply unit), and absorbs a liquid sample in a state where the pad is molded, And any substance and form through which the object to be detected can pass. Specific examples of suitable materials for the sample pad include, but are not limited to, glass fiber, acrylic fiber, hydrophilic polyethylene material, dry paper, paper pulp, fabric, and the like. A glass fiber pad is preferably used. The sample pad may contain a commonly used blocking reagent for the purpose of preventing/suppressing nonspecific reaction (adsorption) on the antibody-immobilized membrane described later.
(高分子粘性物質)
本発明のテストストリップに担持させる高分子粘性物質は、サンプル中の抗原とコンジュゲートの複合体を凝集させ、検出部への流れをコントロールできる作用があるものであればよく、粘度は4〜1000mPa・Sが好ましい。4mPa・S未満では、前記複合体を凝集させる能力に乏しく、また1000mPa・Sより大きいと、前記複合体を速く凝集させてしまい、検出部において必要な感度が得られないからである。また、分子量は6000以上が好ましい。さらに好ましくは、粘度が4〜1000mPa・Sで、かつ、分子量が6000以上である。粘度は、5〜500mPa・Sがより好ましく、10〜200mPa・Sがさらにいっそう好ましい。分子量は、20000以上がより好ましく、20000以上〜400000以下が更にいっそう好ましい。具体的には、分子量が6000以上のポリエチレングリコール(PEG)、プルラン、デキストラン、ポリビニルピロリドン(PVP)等から選ばれるいずれか1以上が好ましい。
(Polymer viscous substance)
The polymer viscous substance to be supported on the test strip of the present invention may be any substance as long as it has an action of aggregating the complex of the antigen and the conjugate in the sample and controlling the flow to the detection part, and the viscosity is 4 to 1000 mPas. -S is preferable. If it is less than 4 mPa·S, the ability to aggregate the complex will be poor, and if it is more than 1000 mPa·S, the complex will be aggregated quickly and the necessary sensitivity cannot be obtained in the detection part. The molecular weight is preferably 6000 or more. More preferably, the viscosity is 4 to 1000 mPa·S and the molecular weight is 6000 or more. The viscosity is more preferably 5 to 500 mPa·S, and even more preferably 10 to 200 mPa·S. The molecular weight is more preferably 20,000 or more, and even more preferably 20,000 or more and 400000 or less. Specifically, any one or more selected from polyethylene glycol (PEG) having a molecular weight of 6000 or more, pullulan, dextran, polyvinylpyrrolidone (PVP) and the like is preferable.
本発明において、高分子粘性物質は、テストストリップがサンプルパッドを有する場合には、サンプルパッドのうち、サンプル供給部より下流側に担持される必要がある。また、サンプルパッドを有さず、同一の不溶性メンブレン上にサンプル供給部および検出部を有する場合には、不溶性メンブレンのうち、サンプル供給部の下流側に担持されることが望ましい。また、サンプル供給部の下流側でもサンプル供給部より下流であって、かつ、メンブレンとの重なり部分より上流側に担持されることがさらに望ましい。 In the present invention, when the test strip has a sample pad, the polymeric viscous substance needs to be carried on the downstream side of the sample supply unit in the sample pad. When the sample supply unit and the detection unit are provided on the same insoluble membrane without the sample pad, it is desirable that the sample supply unit and the detection unit are supported on the downstream side of the sample supply unit in the insoluble membrane. Further, it is more desirable that the sample be supported on the downstream side of the sample supply section, on the downstream side of the sample supply section, and on the upstream side of the overlapping portion with the membrane.
高分子粘性物質をサンプルパッドや不溶性メンブレンに溶出可能に担持させる方法としては、高分子粘性物質を含む溶液をサンプルパッド等に塗布したり、これらの溶液にサンプルパッドを浸漬して乾燥する方法が挙げられる。 As a method of supporting the polymeric viscous substance on the sample pad or the insoluble membrane so that it can be eluted, there is a method of applying a solution containing the polymeric viscous substance to the sample pad or the like, or immersing the sample pad in these solutions and drying. Can be mentioned.
上記の高分子粘性物質を所定の濃度で含有する液を調製し、ノズルから液を一定の速度で吐出しながら水平方向に移動させることのできる機構を有する装置などを用いて、上記液をライン状にサンプルパッドや不溶性メンブレン担体に塗布し、乾燥させることにより溶出可能に担持させることができる。上記高分子粘性物質溶液の濃度は前述の好ましい粘度となるような濃度に調整して利用することが好ましい。また、高分子粘性物質のサンプルパッドまたは不溶性メンブレン担体への担持量は、ラテラルフロー式の場合には上記の装置のノズルからの吐出速度を調節することによって最適化でき、1〜20μL/cmが好ましく、5〜10μL/cmより好ましい。
また、担持部は、流れ方向に直行するようにライン状に形成されることが望ましく、ラインの幅は、1〜10mmが好ましく、2〜8mmがより好ましく、3〜5mmがよりいっそう好ましい。
A liquid containing the above-mentioned high-molecular viscous substance at a predetermined concentration is prepared, and the liquid is lined using a device having a mechanism capable of moving the liquid in a horizontal direction while discharging the liquid from a nozzle at a constant speed. It can be supported so that it can be eluted by applying it to a sample pad or an insoluble membrane carrier in a state of shape and drying. It is preferable to adjust the concentration of the polymer viscous substance solution so as to obtain the above-mentioned preferable viscosity before use. Further, the loading amount of the polymer viscous substance on the sample pad or the insoluble membrane carrier can be optimized by adjusting the discharge rate from the nozzle of the above-mentioned device in the case of the lateral flow type, and 1 to 20 μL/cm can be obtained. Preferably, it is more preferably 5 to 10 μL/cm.
Further, it is desirable that the carrying portion is formed in a line shape so as to be orthogonal to the flow direction, and the width of the line is preferably 1 to 10 mm, more preferably 2 to 8 mm, and even more preferably 3 to 5 mm.
このようなテストストリップのサンプルパッドに、コンジュゲート試薬、被検出物質、検体希釈液を含有するサンプルが供給されると、被検出物質とコンジュゲートが接触して複合体を形成しながら当該パッドを通過する。その後、複合体は検出用抗体が固定化された不溶性メンブレンへと展開される。
不溶性メンブレンには、その一部に被検出物質に対して免疫学的に反応する第二の抗体が固定化されているため、該複合体は第二の抗体に結合して固定化されることになる。固定化された複合体は、コンジュゲートの標識物質に由来する吸光度、反射光、蛍光、磁気等を検出する手段により検出される。
ここで、本発明の作用について説明する。サンプル供給部に供給されたサンプルはメンブレン上で四方に拡散することから、下流に展開するものと、上流に回り込んでしまうものがある。このうち上流に回り込んでしまうものは、その後遅れて展開し、検出部における発色強度を長く増強させる原因となる。本発明の高分子粘性物質の作用は、おそらく、この上流に回り込んでしまうサンプルとコンジュゲートと反応することで、これらの複合体が凝集してしまい、それ以上下流側に流れなくなり、コンジュゲートの下流への供給が停止される。つまり、高分子粘性物質担持部位で複合体は捕捉されることから、捕捉されずに通過した分のみが検出部で結合されることになる。したがって、検出部での結合を抑制することができると思われる。
When a sample containing a conjugate reagent, a substance to be detected, and a sample diluent is supplied to the sample pad of such a test strip, the substance is contacted with the conjugate to form a complex, and pass. Then, the complex is developed on the insoluble membrane on which the detection antibody is immobilized.
Since the second antibody that immunologically reacts with the substance to be detected is immobilized on a part of the insoluble membrane, the complex should be immobilized by binding to the second antibody. become. The immobilized complex is detected by means of detecting absorbance, reflected light, fluorescence, magnetism, etc. derived from the labeling substance of the conjugate.
Here, the operation of the present invention will be described. Since the sample supplied to the sample supply unit diffuses in all directions on the membrane, there are one that spreads downstream and one that spreads upstream. Of these, the one that wraps around upstream develops afterwards and becomes a cause of increasing the coloring intensity in the detection section for a long time. The action of the macromolecular viscous substance of the present invention is probably that the complex reacts with the sample and the conjugate that wrap around to the upstream side, and these complexes agglomerate, and the complex does not flow to the downstream side any more. The supply to the downstream of is stopped. That is, since the complex is captured at the high-molecular-weight viscous substance-supporting site, only the portion that has passed without being captured is bound at the detection unit. Therefore, it seems that the binding at the detection part can be suppressed.
(サードパッド)
サードパッドは、試料の性状等により必要に応じて配置されることが望ましく、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートの複合体を透過させることができるものであればいずれでもよい。具体的には、ガラス繊維(グラスファイバー)、アクリル繊維、親水性ポリエチレン材、乾燥紙、紙パルプ、織物等が含まれるが、特に、ポリスルホンまたはセルロースアセテートからなる多孔質性の部材であることが望ましい。
また、本発明の多孔質性サードパッドの孔径は、平均孔径で1〜100μmであることが望ましく、より望ましくは10〜100μm、よりいっそう望ましくは20〜80μmであり25〜70μmがもっとも望ましい。1μm未満では詰まりの原因となり、検体の流れ自体が不良となるからであり100μmより大きいと前記非特異反応物質を捕捉することができないためと思われるからである。
(Third pad)
It is desirable that the third pad is arranged as necessary depending on the properties of the sample, and any third pad can be used as long as it can pass the complex of the substance to be detected and the conjugate in the sample. Specific examples thereof include glass fiber (glass fiber), acrylic fiber, hydrophilic polyethylene material, dry paper, paper pulp, woven fabric, and the like. In particular, it is a porous member made of polysulfone or cellulose acetate. desirable.
The average pore diameter of the porous third pad of the present invention is preferably 1 to 100 μm, more preferably 10 to 100 μm, even more preferably 20 to 80 μm, and most preferably 25 to 70 μm. This is because if it is less than 1 μm, it causes clogging and the flow of the sample itself becomes poor, and if it is more than 100 μm, it is considered that the non-specific reaction substance cannot be captured.
(不溶性メンブレン)
本発明に用いられる不溶性メンブレンは、被検出物質に対して免疫学的に反応する第一の抗体が固定化された少なくとも1つの検出部を有する。被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体の不溶性メンブレン担体への固定化は、従来公知の方法で実施することができる。ラテラルフロー式のイムノクロマト試薬の場合には、上記の抗体を所定の濃度で含有する液を調製し、ノズルから液を一定の速度で吐出しながら水平方向に移動させることのできる機構を有する装置などを用いて、上記液をライン状に不溶性メンブレン担体に塗布し、乾燥させることにより固定化させることができる。上記液の抗体の濃度は0.1〜5mg/mLが好ましく、0.5〜2mg/mLがさらに好適である。また、抗体の不溶性メンブレン担体への固定化量は、ラテラルフロー式の場合には上記の装置のノズルからの吐出速度を調節することによって最適化でき、0.5〜2μL/cmが好適である。
なお、上記ラテラルフロー式のイムノクロマト試薬を用いた測定方法は、サンプルが毛細管現象により不溶性メンブレン担体に対して並行方向に移動するように展開する方式の測定方法である。
また、上記の抗体を所定の濃度で含有する液は、緩衝液に抗体を添加することにより調製することができる。該緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。緩衝液のpHは6.0〜9.5の範囲が好ましく、6.5〜8.5がより好ましく、7.0〜8.0がさらに好ましい。緩衝液には、さらに塩化ナトリウムなどの塩類、スクロースなどの安定剤や保存剤、プロクリン(登録商標)などの防腐剤等を含んでもよい。塩類は塩化ナトリウムなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のpHを調整する目的で添加するものも含まれる。
不溶性メンブレンに抗体を固定化した後、さらに、通常使用されるブロッキング剤を溶液あるいは蒸気状にして抗体を固定化した部位以外を被覆し、ブロッキングを行うこともできる。
なお、不溶性メンブレンには、従来からイムノクロマト試薬で用いられているコントロール捕捉試薬を固定化してもよい。該コントロール捕捉試薬は、アッセイの信頼性を担保するための試薬であって、コンジュゲート試薬に含ませたコントロール試薬を捕捉するものである。例えば、コンジュゲート試薬に標識されたKLHをコントロール試薬として含む場合には、抗KLH抗体などがコントロール捕捉試薬に該当する。コントロール捕捉試薬を固定化する位置は、アッセイ系の設計に適合するよう適宜選択することができる。
(Insoluble membrane)
The insoluble membrane used in the present invention has at least one detection part on which the first antibody that immunologically reacts with the substance to be detected is immobilized. Immobilization of an antibody that immunologically reacts with the substance to be detected on the insoluble membrane carrier can be carried out by a conventionally known method. In the case of a lateral flow type immunochromatographic reagent, an apparatus having a mechanism capable of preparing a liquid containing the above antibody at a predetermined concentration and horizontally moving it while discharging the liquid from a nozzle at a constant speed, etc. The above solution can be immobilized on the insoluble membrane carrier by applying the solution in a line on the insoluble membrane carrier and drying. The antibody concentration of the above liquid is preferably 0.1 to 5 mg/mL, more preferably 0.5 to 2 mg/mL. In the case of the lateral flow type, the amount of the antibody immobilized on the insoluble membrane carrier can be optimized by adjusting the discharge rate from the nozzle of the above device, and 0.5 to 2 μL/cm is preferable. ..
The measurement method using the lateral flow immunochromatographic reagent is a measurement method in which the sample is developed so as to move in parallel to the insoluble membrane carrier due to a capillary phenomenon.
A solution containing the above antibody at a predetermined concentration can be prepared by adding the antibody to a buffer solution. Examples of the buffer solution include phosphate buffer solution, Tris buffer solution, Good's buffer solution and other commonly used buffer solutions. The pH of the buffer solution is preferably in the range of 6.0 to 9.5, more preferably 6.5 to 8.5, and further preferably 7.0 to 8.0. The buffer solution may further contain salts such as sodium chloride, stabilizers and preservatives such as sucrose, and preservatives such as Proclin (registered trademark). Salts include those added for the purpose of adjusting the ionic strength such as sodium chloride, and those added for the purpose of adjusting the pH of the buffer solution such as sodium hydroxide.
After immobilizing the antibody on the insoluble membrane, blocking can also be performed by further applying a commonly used blocking agent in a solution or vapor form to cover the area other than the area on which the antibody is immobilized.
A control capture reagent conventionally used in immunochromatographic reagents may be immobilized on the insoluble membrane. The control capture reagent is a reagent for ensuring the reliability of the assay and captures the control reagent contained in the conjugate reagent. For example, when the conjugated reagent contains KLH labeled as a control reagent, an anti-KLH antibody or the like corresponds to the control capture reagent. The position for immobilizing the control capture reagent can be appropriately selected to suit the design of the assay system.
本発明で用いられる不溶性メンブレンを構成するメンブレンとしては、従来からイムノクロマト試薬の不溶性メンブレン担体として用いられている公知のメンブレンが使用できる。例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン類、ガラス、セルロースやセルロース誘導体などの多糖類、セラミックス等からなる繊維から構成されるメンブレンがあげられる。具体的には、ザルトリウス社、ミリポア社、東洋濾紙社、ワットマン社などから市販されているガラス繊維ろ紙やセルロースろ紙などが挙げられる。中でも、ザルトリウス社、UniSart CN140が好ましい。また、この不溶性メンブレン担体の孔径と構造を適宜選択することにより、コンジュゲートとサンプル中の被検出物質との複合体が不溶性メンブレン担体中を流れる速度を制御することが可能である。 As the membrane that constitutes the insoluble membrane used in the present invention, a known membrane that has been conventionally used as an insoluble membrane carrier for immunochromatographic reagents can be used. Examples include membranes composed of fibers made of polyethylene, polyethylene terephthalate, nylons, glass, polysaccharides such as cellulose and cellulose derivatives, and ceramics. Specific examples thereof include glass fiber filter paper and cellulose filter paper commercially available from Sartorius, Millipore, Toyo Roshi, Whatman and the like. Of these, UniSart CN140 manufactured by Sartorius is preferable. Further, by appropriately selecting the pore size and structure of the insoluble membrane carrier, it is possible to control the speed at which the complex of the conjugate and the substance to be detected in the sample flows through the insoluble membrane carrier.
上記イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、プラスチック製粘着シートのような固相支持体上に配置させることが好ましい。該固相支持体は、サンプル及びコンジュゲートの毛管流を妨げない物質で構成する。また、イムノクロマトグラフィー用テストストリップを固相支持体上に接着剤等で固定化してもよい。この場合、接着剤の成分等においてもサンプル及びコンジュゲートの毛管流を妨げない物質で構成する。該イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、イムノクロマトグラフィー用テストストリップの大きさ、サンプルの添加方法や添加位置、不溶性メンブレンの検出部の形成位置、シグナルの検出方法などを考慮した適当な容器(ハウジング)に格納・搭載して使用することができ、このように格納・搭載された状態を「デバイス」という。 The immunochromatographic test strip is preferably placed on a solid support such as a plastic pressure-sensitive adhesive sheet. The solid support is composed of a material that does not interfere with the capillary flow of the sample and conjugate. Also, the immunochromatographic test strip may be immobilized on a solid support with an adhesive or the like. In this case, the components of the adhesive and the like are composed of substances that do not interfere with the capillary flow of the sample and conjugate. The immunochromatographic test strip is stored in an appropriate container (housing) in consideration of the size of the immunochromatographic test strip, sample addition method and position, insoluble membrane detection part formation position, signal detection method, and the like. -It can be installed and used, and the state of being stored and installed in this way is called "device".
(被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体)
本発明で用いられる被検出物質に対して免疫学的に反応する第一及び第二の抗体は、被検出物質に結合可能な抗体であり、後述する標識体および検出部に固定化される。
また、第一及び第二の抗体は別のものであることが好ましい。上記抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。また、機能性抗体断片、Fab、Fabプライム等であってもよい。
(Antibody that immunologically reacts with the substance to be detected)
The first and second antibodies that immunologically react with the substance to be detected used in the present invention are antibodies capable of binding to the substance to be detected, and are immobilized on a labeled body and a detection part described later.
Also, the first and second antibodies are preferably different. The antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. It may also be a functional antibody fragment, Fab, Fab prime or the like.
(標識体)
本発明で用いられる標識体は、従来からイムノクロマトグラフィー用テストストリップに用いられている公知の標識体を用いることができる。例えば、金コロイド粒子や白金コロイド粒子などのコロイド状金属粒子、着色ラテックス粒子、磁性粒子、蛍光粒子などが好ましく、特に金コロイド粒子、着色ラテックス粒子が好ましい。
(Marked body)
As the label used in the present invention, a known label conventionally used for immunochromatography test strips can be used. For example, colloidal metal particles such as gold colloid particles and platinum colloid particles, colored latex particles, magnetic particles and fluorescent particles are preferable, and gold colloid particles and colored latex particles are particularly preferable.
(コンジュゲート試薬)
本発明で用いられるコンジュゲートは、上記のような標識体に被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体が固定化されたものである。被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体を標識体へ固定化させる方法としては、物理吸着、化学結合等が挙げられ、物理吸着により固定化させるのが一般的である。本発明におけるコンジュゲートは、テストストリップとは別に、検体と混合されるように個別のコンジュゲート試薬として存在する。コンジュゲート試薬は、コンジュゲートそのままであってもよいし、必要に応じてコンジュゲート以外の他の成分や構成を含むものであってもよい。例えば、フィルター中にコンジュゲートが含浸されたコンジュゲートチップの形態が挙げられる。コンジュゲートチップを使って、検体希釈液を濾過することでコンジュゲートと被検出物質が結合し、複合体を形成することができる。
コンジュゲートチップは、検体希釈液容器と嵌合する開口部及びノズルを備えたキャップに内蔵されていることが望ましい。このようなコンジュゲートチップを特にコンジュゲートキャップということがある。コンジュゲートキャップを使ったろ過方法が次の通りである。コンジュゲートキャップを検体希釈液容器の開口部に嵌合し、検体希釈液容器を逆さにして、容器を圧迫することにより、希釈液がコンジュゲートキャップ内のコンジュゲートチップを通過する。その結果、コンジュゲートを含む希釈液がノズルから排出されることなる。これをイムノクロマトグラフィーテストストリップのサンプル供給部に提供する。
(Conjugate reagent)
The conjugate used in the present invention is one in which an antibody that immunologically reacts with the substance to be detected is immobilized on the above-mentioned labeled substance. Examples of the method for immobilizing an antibody that immunologically reacts with a substance to be detected on a labeled substance include physical adsorption and chemical bonding, and immobilization is generally performed by physical adsorption. The conjugate in the present invention is present as a separate conjugation reagent so as to be mixed with the analyte separately from the test strip. The conjugate reagent may be the conjugate as it is or may contain other components or components other than the conjugate as necessary. For example, it may be in the form of a conjugate chip in which the conjugate is impregnated in a filter. The conjugate and the substance to be detected can be bound to each other to form a complex by filtering the sample diluent using the conjugate chip.
It is desirable that the conjugate chip is built in a cap having an opening and a nozzle that fit into the sample diluent container. Such a conjugate tip may be particularly referred to as a conjugate cap. The filtration method using the conjugate cap is as follows. The diluent is passed through the conjugate tip in the conjugate cap by fitting the conjugate cap into the opening of the specimen diluent container, inverting the specimen diluent container, and pressing the container. As a result, the diluent containing the conjugate is discharged from the nozzle. This is provided to the sample supply of the immunochromatographic test strip.
本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップは、さらに測定条件やサンプルの種類に応じて他の試薬や構成を含み得る。
他の試薬としては、例えば、非特異反応を防止するブロッキング剤が挙げられる。
他の構成としては、例えば、不溶性メンブレンを移動・通過したサンプルを吸収することにより、サンプルの展開を制御する吸収パッドが挙げられる。
本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製は実施例に記載の方法を適宜、修飾・改変して行うことができる。
The immunochromatographic test strip of the present invention may further contain other reagents and components depending on the measurement conditions and the type of sample.
Other reagents include, for example, blocking agents that prevent non-specific reactions.
Other configurations include, for example, an absorption pad that controls the spread of the sample by absorbing the sample that has moved/passed through the insoluble membrane.
The test strip for immunochromatography of the present invention can be produced by appropriately modifying/altering the method described in Examples.
(その他)
本明細書中、上流または下流という意味は、サンプルの流れる方向の上流側、下流側という意味で用いる。すなわち、本発明のテストストリップで上からサンプルパッド、サードパッド、不溶性メンブレンが一部で重なるように積層されている場合、サンプルパッドがもっとも上流であり、不溶性メンブレンが下流ということになる。また、不溶性メンブレンの下流側端部が重なるように上に吸収パッド(エンドパッドともいう)が積層されることがあるが、この場合、吸収パッドがもっとも下流である。
また、本明細書中の検体希釈液は、検体抽出液ともいう。また、検体希釈液は検体を展開する作用も有することから、展開液と表現されることもある。
(Other)
In this specification, the meaning of “upstream” or “downstream” is used to mean “upstream side” or “downstream side” in the sample flow direction. That is, in the test strip of the present invention, when the sample pad, the third pad, and the insoluble membrane are laminated so as to partially overlap with each other, the sample pad is the most upstream and the insoluble membrane is the downstream. In addition, an absorption pad (also referred to as an end pad) may be laminated on the insoluble membrane so that the downstream ends thereof overlap, but in this case, the absorption pad is the most downstream.
Further, the sample diluent in the present specification is also referred to as a sample extract. Further, since the sample diluent has a function of developing the sample, it may be expressed as a developing solution.
〔実施例1〕本願発明の効果確認試験
サンプルパッドのサンプル供給部の下流側に高分子粘性物質を溶出可能に含ませて、ヘモグロビンの検出反応における制御効果を確認した。以下、着色ラテックス標識抗ヘモグロビン抗体は、マウスモノクローナル抗体を、サンプルパッド及びテストストリップの抗ヘモグロビン抗体は、ヤギポリクローナル抗体をそれぞれ使用した。
1.コンジュゲートチップの作製
コンジュゲート(着色ラテックス標識抗ヘモグロビン抗体)及びコントロール試薬としてGSA(Goat Serum Albumin)感作ラテックスを焼結フィルターに含浸して乾燥し、コンジュゲートチップを作製した。
[Example 1] Effect confirmation test of the present invention The control effect in the hemoglobin detection reaction was confirmed by allowing a polymeric viscous substance to be dissolved in the sample pad on the downstream side of the sample supply part. Hereinafter, a mouse monoclonal antibody was used as the colored latex-labeled anti-hemoglobin antibody, and a goat polyclonal antibody was used as the anti-hemoglobin antibody of the sample pad and the test strip.
1. Preparation of Conjugate Chip A conjugate (colored latex labeled anti-hemoglobin antibody) and GSA (Goat Serum Albumin) sensitized latex as a control reagent were impregnated into a sintered filter and dried to prepare a conjugate chip.
2.テストデバイスの作製
(1)本発明のサンプルパッドの作製
下記に示す高分子粘性物質を1%、5%、10%の濃度で含む10mMリン酸緩衝生理食塩溶液(pH7.2)(以下、PBS溶液という)を、10μL/cmでサンプルパッドのサンプル供給部(図11の(g))より下流側の表面に塗布し乾燥させて、高分子粘性物質の担持部を有する本発明のサンプルパッドを作製した。高分子粘性物質を含まないPBS溶液のみを塗布して乾燥させたサンプルパッドも作製した。また、上記高分子粘性物質を含む溶液をスクロース(33%)、グリセロール(30%)に代えたサンプルパッドも作製した。各高分子粘性物質及び高分子物質の各濃度における粘度(mPa・s)を粘度計を用いて測定した結果を表1に示す。
<高分子粘性物質>
PEG 2K(和光純薬工業)
PEG 4K(和光純薬工業)
PEG 6K(和光純薬工業)
PEG 20K(和光純薬工業)
プルラン(林原生物化学研究所製)
デキストラン 40K(和光純薬工業)
デキストラン 200K(和光純薬工業)
PVP K−25(和光純薬工業)
PVP K−90(和光純薬工業)
2. Preparation of test device (1) Preparation of sample pad of the present invention 10 mM phosphate buffered saline solution (pH 7.2) containing 1%, 5% and 10% of the polymer viscous substance shown below (hereinafter referred to as PBS) (Referred to as a solution) at 10 μL/cm on the surface of the sample pad on the downstream side of the sample supply part ((g) in FIG. 11) and dried to obtain a sample pad of the present invention having a polymeric viscous substance-supporting part. It was made. A sample pad was also prepared in which only a PBS solution containing no polymer viscous substance was applied and dried. A sample pad was also prepared in which the solution containing the polymer viscous substance was replaced with sucrose (33%) and glycerol (30%). Table 1 shows the results of measuring the viscosity (mPa·s) of each polymer viscous substance and each concentration of the polymer substance using a viscometer.
<Polymer viscous substance>
PEG 2K (Wako Pure Chemical Industries)
PEG 4K (Wako Pure Chemical Industries)
PEG 6K (Wako Pure Chemical Industries)
PEG 20K (Wako Pure Chemical Industries)
Pullulan (made by Hayashibara Institute of Biochemistry)
Dextran 40K (Wako Pure Chemical Industries)
Dextran 200K (Wako Pure Chemical Industries)
PVP K-25 (Wako Pure Chemical Industries)
PVP K-90 (Wako Pure Chemical Industries)
図11に、本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの模式構成図を示した。
プラスチックバッキングシート(a)に抗体固定化メンブレン(b)を貼り、その上に上記(1)で作製した高粘性物質の担持部(d)を有する本発明のサンプルパッド(e)を装着し、反対側の端には吸収パッド(f)を配置装着した。抗体固定化メンブレンは、不溶性メンブレンに、抗ヘモグロビン抗体およびコントロール試薬が流れ方向に対して垂直にライン状に固定化されている。各パッドは、上下のパッドとその一部が接するように積層して配置される。抗ヘモグロビン抗体からなるラインをテストライン(c1)、コントロール試薬からなるラインをコントロールライン(c2)という。
このように各構成要素を重ね合わせた構造物を一定幅に切断してイムノクロマトグラフィー用テストストリップを作製した。
テストストリップをサンプル添加窓部及び検出窓部(図示せず)を有するプラスチック製ハウジングに収容し、テストデバイスを作製した。
An antibody-immobilized membrane (b) is attached to a plastic backing sheet (a), and the sample pad (e) of the present invention having the high-viscosity substance-carrying part (d) produced in (1) above is mounted thereon. An absorbent pad (f) was arranged and attached to the opposite end. In the antibody-immobilized membrane, the anti-hemoglobin antibody and the control reagent are linearly immobilized on the insoluble membrane in a direction perpendicular to the flow direction. The pads are laminated and arranged so that the upper and lower pads are partially in contact with each other. The line containing the anti-hemoglobin antibody is called the test line (c1), and the line containing the control reagent is called the control line (c2).
Thus, the structure in which the respective constituent elements were superposed was cut into a certain width to prepare a test strip for immunochromatography.
The test strip was housed in a plastic housing having a sample addition window portion and a detection window portion (not shown) to fabricate a test device.
3.検体希釈液
10mM PBSを含む検体希釈液に、ヒトヘモグロビンを120ng/mLとなるように添加し、測定サンプルとした。
3. Specimen Diluting Solution Human hemoglobin was added to a specimen diluting solution containing 10 mM PBS at a concentration of 120 ng/mL to prepare a measurement sample.
4.試験方法
測定サンプルをコンジュゲートチップでろ過して、テストデバイスのサンプル添加窓部よりサンプルパッドのサンプル供給部上に5滴滴下した。滴下後2.5,5,7.5,10、15,20,30分の各時点でラインの発色強度を測定し、数値化した。サンプル中のヘモグロビンは、コンジュゲートチップ内部のフィルターを通過し、通過途中で着色ラテックス標識抗ヘモグロビン抗体と複合体を形成する。複合体は、メンブレンを展開し、テストラインに固定化された抗ヘモグロビン抗体と結合し、検出される。
4. Test Method The measurement sample was filtered with a conjugate chip, and 5 drops were dropped onto the sample supply section of the sample pad through the sample addition window section of the test device. The color development intensity of the line was measured and quantified at 2.5, 5, 7.5, 10, 10, 15, 20 and 30 minutes after the dropping. The hemoglobin in the sample passes through the filter inside the conjugate chip and forms a complex with the colored latex-labeled anti-hemoglobin antibody during the passage. The complex is detected by unfolding the membrane and binding to the anti-hemoglobin antibody immobilized on the test line.
5.試験結果と考察
結果を図1〜図10に示す。
図3、図8より、PEG 6K、PVP K−25は、10%の濃度(粘度5.44、4.36)でわずかにヘモグロビンの検出反応抑制効果が認められた。
特に、図4、図5、図7、図9より、PEG 20Kは5%(粘度4.14)、10%(粘度11.4)、プルランは5%(粘度14.0)、10%(粘度86.8)で、デキストラン 200Kは5%(粘度4.34)、10%(粘度13.0)、PVP K−90は5%(粘度30.3)、10%(粘度160.0)、でヘモグロビンの検出反応抑制効果が認められた。
一方、 図1、図2、図6、より、PEG 2K、PEG 4K、デキストラン 40K、は、いずれの濃度でも(粘度それぞれ、1.0〜2.14、1.03〜2.68、1.11〜3.85)、ヘモグロビンの検出反応抑制効果が認められなかった。
また、図10より、スクロースとグリセロールは濃度30%以上(粘度それぞれ3.27、2.08)でもヘモグロビンの検出反応抑制効果は認められなかった。
これより、検出反応抑制効果を得るためには、高分子粘性物質は、粘度は4.0以上必要であることがわかった。
5. Test Results and Discussion Results are shown in FIGS.
From FIGS. 3 and 8, PEG 6K and PVP K-25 were found to have a slight hemoglobin detection reaction inhibitory effect at a concentration of 10% (viscosity 5.44, 4.36).
In particular, from FIGS. 4, 5, 7, and 9, PEG 20K is 5% (viscosity 4.14), 10% (viscosity 11.4), pullulan is 5% (viscosity 14.0), 10% ( Viscosity 86.8), dextran 200K 5% (viscosity 4.34), 10% (viscosity 13.0), PVP K-90 5% (viscosity 30.3), 10% (viscosity 160.0) , The effect of suppressing the detection reaction of hemoglobin was observed.
On the other hand, from FIGS. 1, 2, and 6, PEG 2K, PEG 4K, and dextran 40K were found to have different viscosities (viscosity 1.0 to 2.14, 1.03 to 2.68, 1. 11-3.85), the effect of suppressing the detection reaction of hemoglobin was not observed.
Further, from FIG. 10, the effect of suppressing the detection reaction of hemoglobin was not observed even when the concentrations of sucrose and glycerol were 30% or more (viscosities of 3.27 and 2.08, respectively).
From this, it was found that the viscosity of the polymer viscous substance is required to be 4.0 or more in order to obtain the detection reaction suppressing effect.
検体をあらかじめコンジュゲート試薬と接触させた状態でイムノクロマトグラフィーテストストリップのサンプル供給部に提供し、検体中の被検出物質である抗原を検出する方法において、テストストリップのうち、サンプル供給部の下流側に特定の高分子粘性物質を存在させることにより、検出部位における発色強度の増強を一定時間内に抑えることができ、反応制御が可能となった。 In the method of providing the sample to the sample supply unit of the immunochromatographic test strip in a state where the sample is brought into contact with the conjugate reagent in advance, and detecting the antigen that is the substance to be detected in the sample, in the test strip, the downstream side of the sample supply unit. The presence of a specific high-molecular viscous substance in the solution could suppress the enhancement of the coloring intensity at the detection site within a certain period of time, and the reaction could be controlled.
(a)バッキングシート
(b)抗体固定化メンブレン
(c1)テストライン
(c2)コントロールライン
(d)高分子粘性物質の担持部
(e)サンプルパッド
(f)吸収パッド
(g)サンプル供給部
(A) Backing sheet (b) Antibody-immobilized membrane (c1) Test line (c2) Control line (d) Polymeric viscous substance carrying part (e) Sample pad (f) Absorption pad (g) Sample supply part
Claims (11)
(1)被検出物質に対して免疫学的に反応する第一の抗体が標識体に固定化されたコンジ ュゲート試薬
(2)サンプルを展開させることによりサンプル中の被検出物質を検出する不溶性担体を備えたイムノクロマトグラフィー用テストストリップであって、 前記不溶性担体は、上流から順にサンプルを供給するサンプル供給部、分子量6000以上、かつ、粘度が4〜1000mPa・Sである高分子粘性物質が担持された高分子粘性物質担持部、
および
被検出物質に対して免疫学的に反応する第二の抗体が固定化された検出部、
を含み、
高分子粘性物質担持部は、不溶性担体上にサンプルの展開方向と直交するようにライン状に形成されている、前記テストストリップ A detection kit utilizing immunochromatography, including:
(1) Conjugate reagent in which a first antibody that immunologically reacts with a substance to be detected is immobilized on a label
(2) A test strip for immunochromatography provided with an insoluble carrier for detecting a substance to be detected in the sample by developing the sample, wherein the insoluble carrier is a sample supply unit for supplying the sample in order from the upstream, and a molecular weight of 6000. Above, a polymer viscous substance supporting portion supporting a polymer viscous substance having a viscosity of 4 to 1000 mPa·S ,
and
A detection unit in which a second antibody that immunologically reacts with the substance to be detected is immobilized,
Only including,
The test strip, wherein the high-molecular-weight viscous substance-supporting portion is formed in a line on the insoluble carrier so as to be orthogonal to the sample developing direction
サンプルパッドは、サンプル供給部及び高分子粘性物質担持部を有し、 メンブレンパッドは、検出部を有する請求項1に記載の検出キット。 The insoluble carrier includes at least a sample pad and a membrane pad separate from the sample pad,
Sample pad has a sample supply unit and the polymer gum carrier part, the membrane pad, detection kit according to claim 1 having a detectable unit.
(B)下記イムノクロマトグラフィー用テストストリップのサンプル供給部に(A)で得られたサンプルを滴下し、不溶性担体中を展開させる工程
イムノクロマトグラフィー用テストストリップ;
前記不溶性担体を備え、上流から順に
サンプルを供給するサンプル供給部、
分子量6000以上、かつ、粘度が4〜1000mPa・Sである高分子粘性物質が担持された担持部、及び
被検出物質に対して免疫学的に反応する第二の抗体が固定化された検出部、を含み、高分子粘性物質の担持部は、不溶性担体上にサンプルの展開方向と直交するようにライン状に形成されている前記テストストリップ
(C)サンプル中の被検出物質とコンジュゲートの複合体、を検出部において検出する工程 A detection method using immunochromatography, comprising the following steps. (A) A step of mixing a conjugate reagent in which a first antibody that immunologically reacts with a substance to be detected is immobilized on a label, a sample, and a sample diluent to obtain a sample composed of these mixtures
(B) A step of dropping the sample obtained in (A) into the sample supply unit of the following immunochromatographic test strip to develop in the insoluble carrier
Immunochromatographic test strips;
A sample supply unit that includes the insoluble carrier and supplies samples sequentially from the upstream side;
A supporting part supporting a polymeric viscous substance having a molecular weight of 6000 or more and a viscosity of 4 to 1000 mPa·S , and
Detector which second antibody is immobilized to react immunologically against the substance to be detected, only free and carrying portion of the polymeric gum, as perpendicular to the deployment direction of the sample on an insoluble carrier The test strip formed in a line shape
(C) A step of detecting a complex of a substance to be detected and a conjugate in a sample in a detection part
サンプルパッドは、サンプル供給部及び高分子粘性物質担持部を有し、
メンブレンパッドは、検出部を有する請求項6に記載の検出方法。 The insoluble carrier includes at least a sample pad and a membrane pad separate from the sample pad,
The sample pad has a sample supply unit and a polymer viscous substance supporting unit,
The detection method according to claim 6 , wherein the membrane pad has a detection unit.
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