JP6733890B2 - 神経再生のための生体適合性移植物及びその使用方法 - Google Patents
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Description
この出願は、2015年4月15日に出願された米国仮出願62/148,087号に対する優先権の利益を主張し、その出願は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
この研究は、米軍再生医療研究所の受賞番号W81XWH−08−2−0034によって全体的又は部分的に資金援助された。また、この研究は、軍バイオマテリアル研究センター(CeMBR)の受賞番号W81XWH−04−2−0031、ラトガース大学のニュージャージー州バイオマテリアルセンター、及び国立衛生研究所の受賞番号R01NS078385によって資金援助された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
式中、a及びbは独立に0又は1以上6以下の整数であり;c及びdは、独立に0又は1以上6以下の整数であり;各R1は18個までの炭素原子を含む直鎖及び分岐アルキル基からなる群から独立に選択され;各R2は独立に6個までの炭素原子を含むアルキレン基であり;kは約20から約200までであり;及びxは約0.002から約0.20までの範囲であり;zは約0.005から0.1までの範囲であり;及びx+y+z=1.00である。
デスアミノチロシルチロシンエチルエステル(DTE)、デスアミノチロシルチロシン(DT)及びポリ(エチレングリコール)(PEG)からなるE10−0.5(1k)の化学構造。
図2
導管の走査型電子顕微鏡(SEM)画像。(A、D)非多孔質ポリエチレン(NP−PE)導管、(B、E)多孔質E10−0.5(1K)[P−E10−0.5(1k)]導管、及び(C、F)非多孔質E10−0.5(1k)[NPE10−0.5(1k)]導管それぞれの横断面。各列のスケールバー:100μm
図3
対照基質、組織培養ポリスチレン(TCPS)及びガラスとの比較における、E10−0.5(1k)及びポリエチレン(PE)の二次元(2D)フィルムでの神経突起伸長及びシュワン細胞増殖及び伸長のin vitro評価
図4
対照基質TCPSとの比較における、E10−0.5(1k)及びポリエチレン(PE)の二次元(2D)フィルムでの神経支持細胞外マトリックス(ECM)タンパク質(ラミニン、フィブロネクチン及びI型コラーゲン)の相対吸着。(*p<0.05、テューキーの事後検定による一元配置分散分析)
図5
導管の移植、及び、E10−0.5(1k)及びNP−PE導管によって促進した機能的回復の計量後にマウスで行われた機能測定を示すビデオフレーム。フレームA及びCは損傷前の測定を表し、フレームB及びDは損傷後(inj)の測定を表す。ビデオフレームに描かれた白線は、足底角(FBA)(A、B)、及び伸展四肢比(PLR)(C、D)の計算に使用された四肢の長さを示す。(A)損傷前のFBAは平均50−70°である。(B)損傷後1週間のマウスのFBAは平均90−110°である。機能回復は、この配向角度の減少によって示される。(C)鉛筆グリップ試験は、両足が同様に伸長され、マウスの損傷前のPLRを測定し、1の比を与える。(D)損傷後1週間のマウスのPLRは、傷害による四肢の進展における差を示し、PLR>1をもたらす。(F)15週目のFBAの回復指数。各ドットは1匹の動物を表す。(G)全条件についてのPLR。(H)15週目のPLRの回復指数。(*p<0.001、テューキーの事後検定による一元配置分散分析)
図6
E10−0.5(1K)及びNP−PE導管で再生された大腿神経の組織形態計測分析。(A−C)(A)非多孔質PE導管(NP−PE)、(B)多孔質E10−0.5(1K)導管[P−E10−0.5(1K)]又は(C)非多孔質E10−0.5(1K)導管[NP−E10−0.5(1K)]のいずれかでの包管術後の再生大腿神経の中点由来のトルイジンブルーで染色された神経切片の代表的な断面画像(40倍、スケールバー:50μm)。(D)各導管型の中間導管神経切片における再生ケーブル中の有髄軸索の軸索数。(E)原組織面積。(F)再生された神経線維の断面積。(G)再生神経ケーブル中の有髄神経線維率(%)。*NP−PEからの群平均値間の有意差(*p<0.05、テューキーの事後検定による一元配置分散分析)
図7
代表的な神経切片及び線維直径分析。(A)非多孔質PE導管(NP−PE)、(B)多孔質E10−0.5(1K)導管[P−E10−0.5(1K)]又は(C)非多孔質E10−0.5(1K)導管[NP−E10−0.5(1K)]のいずれかでの包管術後の再生大腿神経の中点由来のトルイジンブルーで染色された神経切片の代表的な断面画像(100倍、スケールバー:20μm)及び神経線維直径の相対分布のヒストグラム。線維直径のヒストグラムは、NP−PE導管で処置された動物と比較して、E10−0.5(1K)導管で処置された動物で、小さな軸索の数の減少及びより大きな軸索の数の増加を示す。NP−PEと比較して、P−E10−0.5(1K)及びNP−E10−0.5(1K)導管において、4、5、6、7及び8mmの線維直径測定の統計的に高い相対分布(%)があった(*p<0.05、テューキーの事後検定による一元配置分散分析)。
図8
導管材料間の神経修復における初期の違い。(A)及び(B)は、移植2週間後の導管内の無細胞フィブリンマトリックスの縦断面の代表的な画像を示す。(A)E10−0.5(1K)導管に見出される天然マトリックス。(B)NP−PE導管中に存在するマトリックス。E10−0.5(1K)中の天然のフィブリンマトリックスを含むポリマーは、優勢な縦配向(黒色矢印A)を有する一方、フィブリン鎖はNPPE導管で観察されなかった。白い矢印は、各導管タイプ内の内腔の端を示す。スケールバー:0.5mm。(C)移植1週間で非多孔質E10−0.5(1K)及びNP−PE導管滲出液から採取されたS100b及びグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)の代表的なウェスタンブロット解析。バンドの右側の値は、バンドの相対光学密度を示す(NP−E10−0.5(1K)/NPPE)。
さまざまな実施態様は、神経再生のための神経導管を提供する。適切な形態で本発明のポリマーで製造された導管は、生分解及び再吸収速度の適切な範囲、所望の力学的特性及び周囲組織との適合性を含む潜在的利益を提供する。かかる導管の多孔質線維チューブのコーティングは軸索成長をさらに促進し、非神経組織に対する障壁として役割を果たす。ヒドロゲル管腔充填剤はまた、線維性組織の浸潤と比較してより速い軸索再生を促進する。本発明の導管はまた、神経再生のためのシード、プロモーター又はブリッジとして移植前の神経又は神経組織を含んでもかまわない。したがって、本発明のデバイスは、ヒト又は動物の体内での神経又は神経(nerves)に対する外傷又は損傷の治療に有用である。
本明細書で用いられるところの冠詞「a」及び「an」は、他に示されない限り、「1つ以上」又は「少なくとも1つ」を指す。すなわち、不定冠詞「a」又は「an」による本発明のいずれかの要素への言及は、1つよりも多い要素が存在する可能性を排除するものではない。
式中、a及びbは独立に0又は1以上6以下の整数であり;c及びdは、独立に0又は1以上6以下の整数であり;
各R1は18個までの炭素原子を含む直鎖及び分岐アルキル基からなる群から独立に選択され;各R2は独立に6個までの炭素原子を含むアルキレン基であり;kは約20から約200までであり;及びxは約0.02から約0.20までの範囲であり;zは約0.005から0.1までの範囲であり;及びx+y+z=1.00である。
導管製造
89.5mol%デスアミノチロシルチロシンエチルエステル(DTE)、10mol%デスアミノチロシルチロシン(DT)及び1kDaのMwの0.5mol%ポリ(エチレングリコール)からなるE10−0.5(1K)(図1)は、以前に公開された手順を利用して合成された(Magno, et al., J Mater Chem 20, 8885, 2010)。テフロンでコーティングされたマンドレルが一定速度(40mm/分)でポリマー溶液に浸漬された浸漬コーティング(KSVディップコーター; KSV Instruments、Inc.)技術を用いて、内径580mmの中空導管が製造された。非多孔質導管については、3mLの塩化メチレンに900mgのポリマーを含む溶液が用いられた。多孔質導管については、25mmから45mmまでにふるい分けしたショ糖結晶450mgと、塩化メチレン3mL中に溶解したポリマー450mgとの溶液が使用された。浸漬コーティング後、マンドレルを真空中で一晩乾燥させ、in vivo評価のために導管が引き抜かれ、5mmの長さに切断された。多孔質導管については、ショ糖が多孔質構造を作製するために水中で浸出された。また、市販のPEチューブが神経導管として使用された(長さ5mm、内径0.58mm、Becton Dickinson)。
脊髄ニューロン及びシュワン細胞を用いた導管材料のin vitro評価が実施された。神経突起伸長及びシュワン細胞の接着及び伸長における89.5mol%DTE、10mol%DT、0.5mol%PEG 1Kのポリマー及びポリエチレン(PE)の効果が、89.5mol%DTE、10mol%DT、0.5mol%PEG 1Kのポリマー(2.5%w/vのテトラヒドロフラン溶液)をスピンコーティングされたか、又はPE(VWR)の薄い自己接着性フィルムでコーティングされたカバーガラスを用いて決定された。細胞の生存及び増殖を促進するために、カバーガラスが200μg/mLのポリ−L−リジン(PLL;Sigma)に続いて20μg/mLのラミニン(Invitrogen)でコーティングされた。胚性脊髄ニューロンは、運動量の多い集団について単離され、精製された。シュワン細胞は、公開されたプロトコール(Honkanen, et al., Eur J Neurosci 26, 953, 2007)に従って、P2新生児の坐骨神経から単離及び精製され、S100βに対して陽性に染色された細胞が95%よりも多い培養物を得た。細胞はカバーガラスに播種され(1.5×104個の細胞/カバーガラス)、37℃、5%CO2で48時間維持された。ニューロン及びシュワン細胞の神経突起及び突起伸長がそれぞれβチューブリン抗体(Covance;1:500)及びS100β(Abcam;1:500)を用いて評価され、両方の細胞タイプは、Alexa Fluor 488二次抗体(Invitrogen)を用いて可視化された。核染色はHoechst33258染色(AnaSpec, Inc.)を用いて実施された。細胞あたりの全神経突起/突起の長さがImageJ(NIH)を用いて測定された。各カバーガラスについては、無作為に選択した代表画像10枚が二重盲検法で分析され、神経突起がその長さに基づいてビニングされた。
89.5mol%DTE、10mol%DT、0.5mol%PEG 1Kのポリマー及びPEフィルムにおける3種類の細胞外マトリックス(ECM)分子(ラミニン(Invitrogen)、フィブロネクチン(Invitrogen)及びI型コラーゲン(Advanced Biomatrix))のタンパク質吸着の相対量が評価された。圧縮成形によって調製された89.5mol%DTE、10mol%DT、0.5mol%PEG 1Kのポリマーフィルム及びPEフィルム(VWR)を、96ウェルプレートに適合された。各タンパク質の70mL溶液(ddH2O中に20mg/mL)を、各ウェルに添加し、37℃で48時間フィルムに接着された。上清が除去された後、各ウェルが徹底的にすすがれ、ウシ胎仔血清を含む培地でブロッキングされた。すすぎ後、各タンパク質に対する一次抗体が室温で1時間添加された(Millipore;1:100)。すすぎプロセス全体が繰り返えされ、二次ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗体(Millipore;1:200希釈)が室温で1時間添加された。すすぎプロセスがもう一度繰り返えされ、ルミノール(Invitrogen)が各ウェルに添加された。5分後、各ウェルからの発光が、Tecanプレートリーダーを用いて1000msの積分時間及び500msの整定時間で読み取られた。タンパク質量は組織培養ポリスチレンの対照表面に対して正規化された。
外科的方法及び動物群。すべての実験は、動物管理使用委員会(IACUC)に従って実施された。メスのC57BL/6Jマウス(3ヵ月齢)は、ケタミン(80mg/kg)及びキシラジン(12mg/mg)混合物の腹腔内注射によって麻酔された。左大腿神経が外科的に露出させられ、神経切断が神経の分岐部の近位から約3mmの距離で行われた。神経の切断端が生理食塩水で満たされた神経管に挿入され、近位端及び遠位端の間に5mmのギャップが存在するように、10−0のナイロン縫合糸(Ethicon)を用いて各端部に固定された。切開した皮膚が創傷クリップで閉じられ、外科手術2週間後に除去した。P−E10−0.5(1K)、NP−E10−0.5(1K)及びNP−PEを含む、3つの導管を移植された3つの動物群(各動物8匹)が15週間の期間にわたって比較された。
機能回復は、単一フレーム運動解析アプローチ(SFMA)を用いて評価された。40匹の動物が、導管の移植前にビーム歩行試験を行うために訓練された。外科手術後、この試験が実験のエンドポイントまで毎週行われた。高速度カメラ(A602fc; Basler)を用いて、歩行しているマウスの背面を撮影したビデオ(Rear view videos)が収集された。正常歩行周期中の後肢の動きが、Simi−Motion(SIMI Reality Motion Systems)を用いて個々のビデオフレームから分析された。足底角(FBA)40が大腿四頭筋の機能を評価するために測定された。さらに、マウスが鉛筆グリップ試験中に随意運動を行った際に、伸展四肢比(protraction limb ratio)(PLR)40が測定された。
を用いて百分率として計算され、
式中、Xweek 0、Xweek 1及びXweek yは、(FBA又はPLRのいずれかの)0週で未変化の値であり、値はそれぞれ損傷後1週目又は週y(ここで、yは研究のエンドポイントであり、15週目)で測定した(Irintchev, et al., Eur J Neurosci 22, 802, 2005)。RI値100は、大腿神経の完全な回復を示す。
16週目の4%パラホルムアルデヒドでのかん流後、大腿神経が動物から切り取られ、形態計測分析が標準プロトコールに従って行われた。
神経導管内のシュワン細胞の存在を評価するために、シュワン細胞マーカーのウェスタンブロット解析が神経滲出液で行われた(Kaewkhaw, et al., Glia 59, 734, 2011)。導管(n=3)がマウス大腿神経に1週間移植され、その後動物が屠殺され、導管内の神経滲出液が除去され、SDS−PAGEゲル(Invitrogen)上で流され、PVDF膜(Biorad)に移された。膜はブロッキングされ、S100β(1:1000)、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP、1:50,000)、GAPDH(1:1000)及びβ−アクチン(1:5000)(Abcam)に対する抗体で調べられ、二次抗体のHPR発光によって同定された。デンシトメトリー分析が、ImageJ(NIH)を用いてウェスタンブロットのGFAP、S100β及びアクチンのバンド密度を定量するために行われた。量は、アクチン充填対照に基づいて正規化された。
フィブリン鎖の存在を視覚化するために、動物(条件あたりn=3)が移植後2週目で屠殺された。神経外植片が、標準プロトコールに従って四酸化オスミウムで後固定され、樹脂に包埋された。神経の縦方向の1mm厚の切片が切断され、1%トルイジンブルー/1%ホウ砂の蒸留水で染色された。従来の光学顕微鏡法が、フィブリンマトリックスの存在及び配向性を視覚化するために用いられた。
研究は、神経再生での2D及び導管様式の両方において、89.5mol%DTE、10mol%DT、0.5mol%PEG 1Kのポリマー及びPEのポリマーの効果の比較を可能にするように設計された。一元配置分散分析を用いる分散分析が使用され、その後、テューキーの検定で事後の事前比較(post hoc planned comparisons)が行われた。差はp<0.05で有意とみなされた。
in vitroでの特性評価
PE及び89.5mol%DTE、10mol%DT、0.5mol%PEG 1Kのポリマーの両方の非多孔質導管は、SEM顕微鏡写真に基づいた類似の外観を有した(図2A、D、C、F)。多孔質の89.5mol%DTE、10mol%DT、0.5mol%PEG 1Kのポリマーの導管は相互接続した細孔構造を有し、導管の多孔度及び平均細孔サイズはそれぞれ55.2%〜1.2%及び35.7mm〜9.0mmであった(図2B、E)。E10−0.5(1K)から製造された導管は、(5mmの長さで)不透明で非伸縮性であり、580mmの内径及び680mmの外径を有する。全ての導管は、試験中、無傷のままであった。材料及び細胞の研究は、導管タイプ間で異なる特性を明らかにした。異なる材料に対する運動ニューロンの応答は、PLL及びラミニンでコーティングされた89.5mol%DTE、10mol%DT、0.5mol%PEG1Kのポリマー及びPL2Dフィルムで評価された。PE及び対照基質ピークの右側への89.5mol%DTE、10mol%DT、0.5mol%PEG 1Kのポリマーのピークシフトによって示されるように、PEと比較したとき、より長い軸索が、89.5mol%DTE、10mol%DT、0.5mol%PEG 1Kのポリマーで観察された(図3)。異なる基質に対するシュワン細胞の接着及び突起の伸長の評価は、89.5mol%DTE、10mol%DT、0.5mol%PEG 1KのポリマーがPEと比較してこれらの局面を同様に促進したことを明らかにした(図3B、C)。異なる材料に対する神経再生に必要不可欠なタンパク質の吸着もまた有意に異なった(図4)。89.5mol%DTE、10mol%DT、0.5mol%PEG 1Kのポリマーに吸着する3種類のECMタンパク質の量は、PEフィルムと比べて有意に多かった。
運動機能回復。機能回復は、十分に確立された方法(Irintchev, et al., Eur J Neurosci 22, 802, 2005)を用いて、FBA及びPLRのSFMAによって定量化された(図5A−D)。8週目までに、89.5mol%DTE、10mol%DT、0.5mol%PEG 1Kのポリマー導管を移植された動物は、NP−PE導管を移植されたマウスと比較して、FBAにおける著しい改善を示した(図5E)。また、多孔質又は非多孔質の導管が使用されたかどうかにかかわらず、早ければ2週目ほどで、89.5mol%DTE、10mol%DT、0.5mol%PEG 1Kのポリマーで処置された動物における運動機能の改善がPLRによって実証された(図5G)。15週目までに収集された結果は、89.5mol%DTE、10mol%DT、0.5mol%PEG 1Kのポリマー導管を有する動物のPLR値は、NP−PEで処置された動物よりも早い速度で術前値に近づいたことを実証した。
研究のエンドポイントで、神経は組織形態計測の特徴について分析された(図6)。外壁の細孔の存在にかかわらず、著しく多くの軸索は、原線維組織面積がより小さい89.5mol%DTE、10mol%DT、0.5mol%PEG 1Kのポリマー導管内に形成された再生神経ケーブル内に存在した。有髄神経線維の断面積は、NP−PE導管と比較して89.5mol%DTE、10mol%DT、0.5mol%PEG 1Kのポリマー導管において有意に大きく、この面積のより大きな割合が有髄神経線維よって占められた。オスミウム四酸化物中に後固定された1mm厚の断面の代表的な100倍の画像ならびに各条件の線維直径分布がそれぞれ図7に示される。89.5mol%DTE、10mol%DT、0.5mol%PEG 1Kのポリマー導管は、多数の軸索、束状構造、広範囲な神経線維直径及び小さな線維組織を有する神経ケーブルを生成した一方、NP−PE導管はたとえあったとしても、明らかな軸索はほとんど含まなかった。内腔は、密度の高い線維組織であると思われるもので完全に満たされた。
材料及び方法
ポリマー合成及び特性評価
溶融押出によって線維を生成するためにチロシン誘導ポリカーボネートを用いて研究が行われた。ポリ(DTEカーボネート)と呼ばれ、「E0000」と省略されるポリ(デスアミノチロシルチロシンエチルエステルカーボネート)の単一のポリマー組成物が研究のために選択された。ポリ(DTEカーボネート)はin vivoで非常にゆっくりと分解し、分子量の顕著な変化が明らかになるまでに1年を超える期間を要する。従って、ポリ(DTEカーボネート)からなる導管は、本発明者らの研究の期間内にごくわずかしか分解せず、導管性能の変数として分解を効果的に除外する。
異なる編組設計が、導管の細孔サイズ及び力学的特性における編組パターン及び線維密度の効果を決定するために60μm厚の工業用ポリプロピレン(PP)の試作品の糸(ATEX Technologies Inc、Pinebluff、NC)を用いて最初に実施された。以下の方法論が導管を製造するために利用された:A)単線維編組:24つのキャリア、1回ねじられたPP線維/キャリア、2/2編組;B)3軸編組:24つのキャリア、3回ねじられたPPファイバ/キャリア+4本の縦3軸線維;C)3つの編組:24つのキャリア、3回ねじられたPP線維/キャリア、2/2編組;D)3つの線維編組:24つのキャリア、3回ねじられたE0000線維/キャリア、2/2編組。
導管は、以前に公開された手順(Ezra et al., Tissue Eng Part A 2013)を使用して、塩化メチレン中に20%(w/v)ポリ(DTEカーボネート)溶液の浸漬コーティングによって製造され、1.5mmのODテフロンでコーティングされたマンドレルに沈着された。
二次電界紡糸層は、高電圧電源(Gamma High Voltage Research Inc.,フロリダ州オマハビーチ)と、20ゲージ×3インチのテフロンチューブを介して平滑な先端の23Gステンレス鋼針(両方ともHamilton Company製、ネバダ州リノ)に接続した注射器ポンプ(KD Scientific、マサチューセッツ州ホリストン)とを使用する電界紡糸装置において回転マンドレル上の編組導管上に形成された。89mol%DTE、10mol%DT、1.0mol%PEG 1Kのポリマーの10%(w/v)のポリマー溶液は、電界紡糸線維からビーディング(beading)を排除するために、1:25の比のトランス−4−ヒドロキシ−L−プロリン(tHyp):89mol%DTE、10mol%DT、1.0mol%PEG 1Kポリマーを用いて氷酢酸(Fisher Scientific、ペンシルベニア州ピッツバーグ)中で調製された。厚さ300μmのコーティングが編組導管の周囲に形成されるまで、電界紡糸が続けられた。導管は、残留溶剤を除去するためにドラフトチャンバー内で完全に乾燥された。
滅菌編組導管が、1%(w/v)滅菌チオール修飾ヒアルロン酸溶液(HyStem)に浸漬コーティングされ、続いて超音波処理した水浴中で滅菌1%(w/v)ポリ(エチレングリコールジアクリレート)(PEGDA)溶液(両方ともGlycosan Biosystems−BioTime、Inc.、カリフォルニア州アラメダ)に浸漬コーティングすることによって即座に架橋される。導管は各浸漬コーティング工程後に5分間乾燥され、このプロセスが合計5回繰り返された。また、デュアル電界紡糸及びHAコーティングを有する導管は、上記したように編組導管上に電界紡糸層を最初に沈着し、続いてヒアルロン酸及びPEGDA溶液に浸漬コーティングすることによって製造された。HAでコーティングされた導管は、クリーンベンチ内で一晩乾燥され、in vivo実験のために乾燥状態で移植された。
汚染微生物数を減少させるために、全ての導管がin vivoでの使用に先立って、UV照射に40分間曝露された。
スパッターコーティングした(SCD 004スパッターコーター、Au/Pdで120秒間30ミリアンペア)標本の細孔サイズ及びトポグラフィーがSEM(Amray 1830I、20kV)を使用して評価された。導管の細孔サイズ、編組角度及び壁厚、及び電界紡糸マットの線維直径が、ImageJ(国立衛生研究所の公開ドメインソフトウェア)を用いてSEM画像上で測定された。編組角度が、編組の縦軸に垂直な線と、チューブ軸に近接して整列された線維群に平行な線との間で測定された。
編組導管の力学的特性は、Syntec 5/D力学的試験機を用いる圧縮及び3点曲げ試験と、MTS Tytron(商標)250微小力試験システム(両方ともMTS、ミネソタ州エデンプレイリー)を用いる引張試験とによって特徴付けられた。試料は37℃で一晩PBS中でインキュベーションすることによって予め適当な状態にされ、インキュベーターから取り出した直後に試験された。圧縮試験は、1cmの長さの導管で、6mm/分の横断クロスヘッド速度で、初期導管直径の60%に相当するエンドポイント変位まで行われた。圧縮剛性は、力対変位曲線における線形領域の傾きから算出された。
すべての実験は、ラトガース動物管理施設委員会及び動物管理使用委員会(IACUC)の承認されたプロトコールのもとで行われた。
体重250gから300gまでのオスのスプラグ・ドーリーラット(Charles River Labs、マサチューセッツ州ウィルミントン)はケタミン/キシラジン(それぞれ75/10mg/kg)の腹腔内注射により麻酔され、編組導管が動物の背中の4つの皮下ポケットに移植された。動物は移植後3週間で屠殺され、導管は周囲の結合組織で外植された。外植直後、導管が10%緩衝ホルマリン中で固定され、続いて組織学的染色のために組織処理され、パラフィン包埋された。標準的な方法を用いて6μmの切片が調製され、ヘマトキシリン・エオジン(H&E)で染色された。
神経損傷後の電気生理学的機能の回復は、坐骨神経の腓骨及び脛骨の分枝の最も遠位の標的である背側の筋及び足底筋における複合筋活動電位(CMAPs)を測定することにより、全身麻酔下で評価された。CMAPは、VikingQuest EMGシステム(Natus Medical Inc.、カリフォルニア州サンカルロス)を用いて、手術直前(無傷な動物)及び手術後4週ごとに記録された。皮下EEG針が、記録電極、参照電極及び接地電極として使用した。参照電極及び接地電極が、ラットの手術した側の、第5中足骨及び踵骨の側面にそれぞれ配置された。記録電極は、腓骨CMAPの第3中足骨にわたる背側足筋と、脛骨CMAPの足底筋との皮下に挿入された。坐骨神経は、脛骨のすぐに後ろの足首の高さで双極刺激電極を使用して経皮的に刺激された。電極が最大のCMAP振幅を生じさせるために局所的に調整され、刺激が超極大応答を生じさせるために漸進的に増加された。CMAP信号の開始からピークの頂部まで測定された3つの連続的なCMAP振幅の平均、及び3つの連続的な潜時が各動物について計算され、プロットするために同一処置群の動物について平均された。
術後16週間で、ラットはケタミン/キシラジン麻酔を用いて深く麻酔され、手術した側の坐骨神経が露出され、神経のin−situ固定がトランプの固定剤に神経を30分間浸漬することによって行われた。その後、前述のように神経が採取され、処理された。各1μm厚の神経の切片について無作為な100倍画像において最小500個の有髄軸索を計測し、神経切片を3回反復して平均化することにより、神経の断面あたりの有髄軸索の総数がImageJ 1.43uソフトウェアを用いて計測された。原組織面積、有髄神経ケーブルの断面積及び神経再生率が10倍画像で測定され、ImageJ 1.43uソフトウェアで分析された。(ミエリン鞘の内側の)軸索及び(ミエリン鞘を含む)神経線維の直径が、G比を計算するために各切片の3つの無作為な100倍試料で測定された。
神経採取時に、動物がCO2窒息により安楽死させられた。両後肢の前脛骨筋及び腓腹筋が、膝からくるぶしまで縦走した皮膚切開部を介して筋肉組織を曝すことによって直ちに採取された。筋肉が起始から挿入部まで採取され、電子天秤で秤量された。
この研究のデータは、特に明記しない限り、平均±SEとして表される。Dunnettの事後検定による一元配置分散分析(ANOVA)検定が、有意差を評価するために、この研究で使用された。統計的有意性はp<0.05として定義された。
導管の製造及び物理的特性評価
市販の非分解性ポリプロピレンの試作品を製造する線維を用いて、糸のフィラメント数及びひねり数を変えることにより、3つの導管の試作品が構築された。得られる導管は、実際に、細孔サイズ及び編組角などの物理的特性において実質的な違いを示した。3本の線維糸から構成された2/2編組が最も良好な力学的特徴を有し、優れたねじれ耐性及び弾性変形を示した。三軸編組は最小細孔サイズを有し、より硬く、変形時に望ましくない形状記憶を有していた。細孔サイズと力学的特性との組み合わせのため、ポリ(DTEカーボネート)線維を用いてより詳細に調査するために従来の2/2編組法が選択された。ポリ(DTEカーボネート)編組導管は、直径が80μmから110μmまでの線維で製造された。得られる導管は、65±19μmの平均細孔サイズ及び1.5mmの内腔直径を有した。
移動性の高い領域で大きな神経ギャップを修復するために、柔軟性及びねじれの防止は、重要な導管設計基準である。本発明者らは、厚さ183±15μmの壁を有する編組ポリ(DTEカーボネート)導管、非多孔質浸漬ポリ(DTEカーボネート)導管、及び、I型コラーゲンからなる臨床的に使用されるNeuraGen(登録商標)導管(Integra Lifesciences、ニュージャージー州サウスプレインフィールド)の力学的特性を比較した。十分な量のNeuraGen(登録商標)導管を確保することができないため、全ての実験を再現することができず、これらの導管を使用するYaoらの以前の所見が、比較を完成するために時々引用される。
導管材料が、その後の神経再生研究で得られた結果に影響を与え得る強い炎症応答を引き出さないということを確かめるために、小規模な対照研究が行われた。総組織応答を評価するために、ポリ(DTEカーボネート)編組導管が成体ラットの背中の皮下ポケットに移植された。3週間後、導管が取り出され、H&E組織学が実施された。切片は、導管の周囲に線維性カプセルの期待される形成を示した。カプセル組織は拡散的に組織化され、高濃度の炎症細胞を欠いており、ポリ(DTEカーボネート)編組導管に対する宿主応答は最小限であり、チロシン誘導ポリカーボネートファミリー内のポリマーに対する宿主応答に関する以前の所見と一致することを示す。
H&E染色はまた、導管材料に接着し、細孔を通して浸透し、ポリ(DTEカーボネート)導管内腔に入り込んだ周囲組織を明らかにした。神経再生の成果における導管の細孔サイズの影響が調査され、この重要な態様の結果及び解釈が幅広く変化する一方、導管の最適細孔サイズは、栄養及び廃棄物の拡散を可能にし、線維性及び炎症性細胞の浸潤を最小限にするために、5μmから30μmまでの範囲となると報告された。ポリ(DTEカーボネート)編組導管は、20μmから140μmの細孔を有する。編組導管への細胞の浸潤を示すH&E染色切片のために、発明者らは、栄養交換を可能にするが、非神経細胞の導管への浸潤及び再生を妨げる能力を低下させる一時的なマイクロ又はナノ多孔質バリアコーティングを開発した。
神経再生を支持するための基本的な能力を評価するために、ポリ(DTEカーボネート)編組導管が、十分に記載されたギャップ1cmのラット坐骨神経損傷モデルで試験された。処置群は、コーティングされていない編組導管(n=7動物/群)、HAでコーティングされた編組導管(n=7)、89mol%DTE、10mol%DT、1.0mol%PEG 1Kのポリマーの電界紡糸でコーティングされた編組導管(n=4)、89mol%DTE、10mol%DT、1.0mol%PEG 1Kのポリマーの電界紡糸で、その後HAで連続的にコーティングされた編組導管(n=4)を含む。損傷部位内で反転された自家移植片(n=7)の対照群が使用され、すべての群の再生神経は16週間後に採取された。
すべての条件が軸索の再生を支持したが、顕著な変化が観察されたことを、導管の中心の再生神経セグメントの切片は示した。コーティングされていない編組導管内の再生組織は、緩やかに組織された束の中に多くの再生軸索を示した。線維状の外観を有するかなりの量の非神経組織が、再生神経の外側の導管内と、再生神経の周辺に位置する束の間に挿入された導管内との両方で観察された。同様の特徴が、電界紡糸線維コーティングを有する編組導管内で再生された神経に認められた。電界紡糸でコーティングされた編組導管における神経ケーブルは、サイズが小さく、軸索領域と周辺組織との境界の存在下で可変であり、いくつかの試料は緩い神経の束を持っていたが、他のサンプルでは、束はよりいっそう詰め込まれ、神経ケーブルは、緩く配置された非神経組織の層によって取り囲まれていた。この結果は驚くべきことであり、編組導管を囲む電界紡糸マットが線維組織の浸潤を促進した可能性があることを示唆する。
坐骨神経二等分後に、前脛骨筋(TA)及び腓腹筋の萎縮及び筋重量の回復は、回復を示す。これらの筋肉は、16週間の回復期間の終わりに両方の後肢から採取され、重量が測定された。筋重量の回復は、自家移植片群で最大であり、続いてHAでコーティングされた編組導管であった。HAでコーティングされた編組導管のTA筋重量回復は、コーティングされていない導管よりも有意に高かった。TA及び腓腹筋の重量回復は、他の導管群において同等であった。HAでコーティングされた編組導管でのTA筋重量の回復の改善は、強化された再生が線維組織の浸潤の程度と、これらの導管での神経周膜層を形成する能力とを制限することと一致するという点で神経組織学の所見を支持する。
機能的な神経再生を評価するために、欠陥及び再建された筋肉群による神経伝導の電気生理学的測定が、腓骨神経及び脛骨神経の複合筋活動電位(CMAP)の最大振幅及び潜時を記録することにより、評価された。脛骨及び腓骨の両方のCMAPについて、最も初期の術後CMAPシグナルは、自家移植については8週間、導管群については12週間で同定された。CMAPシグナルの37%が、16週のエンドポイントで自家移植群において回復され、処置の中で最大の振幅を示した。導管群の中で、HAでコーティングされた編組導管は最も高いCMAP振幅を有し、16週のエンドポイントで約14%のCMAP信号が回復した。
Claims (14)
- 生体吸収性ヒドロゲルでコーティングされた多孔質線維チューブを含む神経再生のための生体適合性神経導管であって、
該線維は、内在性タンパク質の優先的吸着によって神経再生を支持するポリマーを含み、
ここで、該線維は、ねじれ耐性の編組パターンを使用して、5マイクロメートルから200マイクロメートルまでの範囲の細孔で編組され、該ヒドロゲルコーティング材料及び厚さは、栄養素及び酸素が前記ヒドロゲルコーティングを通って拡散することができるが、コーティングを通る線維組織の浸潤が防止されるように、全体的な多孔性を制御するように選択され、
前記ポリマーは、構造:
式中、a及びbは独立に0又は1以上6以下の整数であり;
c及びdは、独立に0又は1以上6以下の整数であり;
各R1は18個までの炭素原子を含む直鎖及び分岐アルキル基からなる群から独立に選択され;
各R2は独立に6個までの炭素原子を含むアルキレン基であり;
kは約20から約200までであり;及び
xは約0.002から約0.20までの範囲であり;zは約0.005から約0.01までの範囲であり;及びx+y+z=1.00である、神経再生のための生体適合性神経導管。 - a及びbはそれぞれ2及び1である、請求項1に記載の生体適合性神経導管。
- c及びdはそれぞれ2及び1であり、R1はエチルである、請求項1に記載の生体適合性神経導管。
- 前記ポリマーのR2はエチレンであり、kは約20から約100までである、請求項1に記載の生体適合性神経導管。
- 前記多孔質線維チューブは、螺旋状に巻かれた二軸の編組を含む、請求項1に記載の生体適合性神経導管。
- 前記生体吸収性ヒドロゲルは架橋ヒアルロン酸(HA)を含む、請求項1に記載の生体適合性神経導管。
- 前記ヒアルロン酸ゲル(HA)はPEGDAで架橋される、請求項6に記載の生体適合性神経導管。
- 生体適合性神経導管は、生体適合性神経導管の内腔を充填するための第2生体吸収性ヒドロゲルをさらに含む、請求項1に記載の生体適合性神経導管。
- 前記第2生体吸収性ヒドロゲルは、ヒトナチュラルキラー1(m−HNK−1)グリカンの共有結合した神経突起促進ペプチド模倣体を有するコラーゲンを含む、請求項8に記載の生体適合性神経導管。
- 損傷した神経の近位及び遠位の切開部は、損傷又は瘢痕組織が残らないように、きれいにかつ垂直に切開するステップと、
約1mmの各切開部が生体適合性神経導管の近位端及び遠位端にそれぞれ組み込まれるように、前記生体適合性神経導管をその場に置くステップと、
従来の微小神経外科技術を使用して前記生体適合性神経導管に前記切開部を固定するステップとを含む、
末梢神経損傷の治療又は修復のための方法に用いられる、請求項1に記載の生体適合性神経導管。 - 前記生体適合性神経導管が、縫合糸で周辺軟組織に、又は修復部位をフィブリン様接着剤で満たすことによって、又は両方で安定化される、請求項10に記載の生体適合性神経導管。
- 前記生体適合性神経導管の内腔に神経又は神経組織又は神経細胞成分を挿入することにより使用される、請求項1に記載の生体適合性神経導管。
- 前記神経細胞成分が、前記内腔を充填するためにヒドロゲル内に注入されるか、又は前記内腔のヒドロゲル型充填剤に注入されることにより使用される、請求項12に記載の生体適合性神経導管。
- 前記神経組織成分が、前記内腔に置かれて使用される、請求項12に記載の生体適合性神経導管。
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