JP6732656B2 - ヌクレアーゼを用いた微細加工コンポーネントによる細胞分別方法 - Google Patents
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Description
本発明の課題は、細胞分別処理中のMEMSチップにおける通路の目詰まりを回避することである。
マイクロ流体デバイスを用いた場合、流路内で細胞が凝集、凝固または目詰まりする傾向があるため、デバイスの長期間にわたる機能性が脅かされる可能性がある。このことは特に、成分粒子が強い凝固傾向をもつ血液または細胞懸濁液などのような生体物質について当てはまる。物質が小さい流路の表面に付着する傾向にあることで、デバイスに対し望ましくなく場合によっては非可逆的な変化が引き起こされる可能性もある。望ましくない変化には、結果として生じる流体抵抗の増加、結果としてデバイスに導入される何らかの試料の汚染、およびデバイス内の流れのパターン変化が含まれる。溶液中の核酸が少量であっても、流路が目詰まりして、流路内の細胞をその目的場所まで搬送できなくなる程度に、物質の粘度が高まるか物質のスパンが形成される可能性がある。ここで開示するように、このような結果は、以下で説明する液体懸濁における特定の化学的性質を用いることで、低減または改善することができる。
・緩衝剤のpH値、
・緩衝剤のイオン強度、
・温度、
・EDTA(さもなければ凝集および相互の固着に資する細胞)、
が含まれる。
・pH約7.2〜7.6で活性、
・4℃〜37℃の温度で活性、
・ホスホン酸イオンと塩イオンが存在しているときに活性、
・オプションとして、EDTAが存在しているときに活性、つまりはCa2+またはMg2+など遊離したカチオンが存在していないときに活性、
・(核酸以外に)細胞により放出された物質が存在しているときに活性、
が含まれる。
・非特異的に核酸を分解すべきである、すなわち分解が小さい個体群の核酸に限られるようではならない。
・核酸を「高速で」分解すべきである(培養時間は数分〜数10分であって数時間ではない)。
・Benzonase(登録商標)(およびDenarase(登録商標)のように複製されたそれらの変種):Mg2+
・Cryonase(商標):Mg2+
・DNアーゼI、ウシ:Ca2+, Mg2+
・DNアーゼ、ヒト(ドルナーゼアルファ):Ca2+, Mg2+
・DNアーゼ、シュリンプ:Mg2+
・ヌクレアーゼ、ミクロコッカス(黄色ブドウ球菌):Ca2+
・ヌクレアーゼS1:Ca2+, Zn2+
・ヌクレアーゼS7:Ca2+
図1は、微細加工された細胞分別メカニズムであるMEMSチップソーター10の概略図であり、ここで説明する粒子分別処理においてこれを使用することができる。細胞分別メカニズムの詳細については、米国特許出願第13/998,095号明細書を参照されたい。微細加工された細胞分別メカニズム10の主たる独特な特徴は、細胞分別バルブ10の動きが、バルブの製造面と平行なことである。これに加え廃棄流路140が、試料流入路120と分別流出路122とに対し、実質的に直交している。これらの特徴によって、マイクロ流体分別における速度および精度、バルブのスループットならびに容易さの点で、めざましい利点が得られるようになる。
図3は細胞分別システム1の概略図であり、このシステムは、マイクロ流体通路、使い捨てカートリッジ1000内に収容されたMEMSチップソーター10、および磁束発生装置400を使用することができる。以下では、このシステムの他のいくつかのコンポーネントについて、およびそれらのコンポーネントがMEMSチップソーター10とどのように相互作用するのかについて述べる。特に図3では、インタロゲーション領域200に対するインタロゲーションレーザーの光路と、流路120〜140内の液流の制御と、MEMSチップソーター10の制御について説明する。システムレベルの説明をした後で、マイクロ流体システム1を高精度かつ高い信頼性で予期されるとおりに動作させることのできるシステム1の独特の特徴について論じることにする。
流体制御手段2500は、MEMSチップ細胞分別バルブ10の流路中を通過して流れる液体の方向と速度を制御することができる。以下で説明する複数の判定基準に基づき、流体制御手段2500を制御することができる。流体制御手段2500は、空気圧バルブ、液圧バルブ、および/または一方向バルブを含むことができ、および/またはピストンまたはポンプおよび対応する流体通路を含むことができる。通常動作中、コントローラー2900を含むフィードバックループにおいて流体制御手段2500により、たとえば細胞速度、流体圧力、または事象率などが一定に維持されるように、流れを制御することができる。
図4は、図3に示した粒子分別システムにおいて使用することのできる、使い捨てカートリッジ1000の一例を示す分解斜視図である。使い捨てカートリッジ1000は、天板1135および基部1130などのような複数の組立部品を含むことができる。
試料貯蔵器20内において、天板1135と基部1130との間に、磁化されたプロペラ1150と、磁化されたプロペラ1150のためのシャフトとして動作可能なニードル1160とを封入することができる。循環する磁場に晒されると、磁化されたプロペラ1150はシャフト1160において回転することができ、それによって試料貯蔵器20の内容物が混合または均質化される。最終的に、0.20μmのフィルター1170を分別貯蔵器22の上に配置することができ、これによって分別された内容物が周囲環境の汚染物から保護される。別の選択肢として、プロペラ1150を小型モータと機械的に結合することによりダイレクトに駆動することもでき、この小型モータによってプロペラ1150の回転を生じさせることができ、つまりは試料貯蔵器20の内容物を混合することができる。混合器の構造の詳細は、図6にさらに詳しく示されており、あとでこの図面を参照しながら説明する。
MEMSチップの狭い通路を、それよりもかなり大きい肉眼で見える構造部材に整合させなければならず、また、特に希少細胞を分別する場合には、少量の液体を扱えるようにしなければならない。
1)MEMSチップソーター10をインターポーザー1400に接着するステップ、
2)インターポーザー1400をカートリッジ1000の位置決めピンに配置するステップ、
3)インターポーザー1400を押圧するステップ、
4)インターポーザー1400とカートリッジ1000との間のギャップに接着剤を導入するステップ、
5)紫外線により接着剤を硬化するステップ、
6)カートリッジ基部1130を、たとえばグルー、セメント、または超音波溶接などによって、カートリッジ天板1135に取り付けるステップ。
図1、図2および図3を参照しながら説明したシステムのさらに別の観点は、小さいMEMSチップソーター10を作動させる、厳密に局在化された磁場の必要性である。
図13には、カチオン非依存性ヌクレアーゼのための適切な製造方法が示されている。ステップS100でプロセスを開始する。ステップS200において、DNA分解タンパク質(ヌクレアーゼ)のためのコード配列を、誘導性プロモーターの制御のもとでプラスミドベクターにクローニングした。ステップS300において、組換えベクターを大腸菌細胞に形質転換した。ステップ400において、ヌクレアーゼを発現するクローンを選択し、それらから細胞バンクを生成した。組換え大腸菌細胞が液体の複合培地において成長し、組換え遺伝子の発現が誘導されると(ステップS500)、ステップS600において、細胞が細胞のサイトゾル内にヌクレアーゼを発現する。標準的な条件のもとでヌクレアーゼは、いわゆる封入体として不溶性かつ非活性の配座で発現される。温度、誘導時点、発現期間など特定の培養パラメーターを調整することにより、ヌクレアーゼの50%までを可溶型として1つのステップで発現させることができる。特別に費やされた所定の時間で培養を中止し、沈殿によって細胞を液体媒体から分離する(ステップS700)。分離された細胞を高圧で分断し(ステップS800)、細胞断片および不可溶性タンパク質を、ステップS900において沈殿によって可溶性断片から分離する。可溶性断片(上澄み)を収集し、さらにステップS1000における分取クロマトグラフィーステップにより精製する。その後、ステップS1100において製剤を行い、ステップS1200においてプロセスを終了する。なお、すべてのステップS100〜ステップS1200を必須としなくてもよく、また、これらのステップを必ずしも図示の順序で実行しなくてもよい、ということを理解されたい。
・Nuc(サルモネラ由来、複数のNuc同族体は大腸菌、シトロバクター、ナウチリア(Nautilia)、プロテウスなど他のバクテリア内に存在する)
・GBSV1-NSN(好熱性のバクテリオファージGBSV1由来)
・Bfi I特にN末端触媒サブドメイン(バシラス属の制限酵素)
・PC1タンパク質(鶏痘ウィルス由来)
・WSSV-NSN(シュリンプ白斑症ウィルス由来)
図14には、組換え大腸菌細胞の培養および組換えヌクレアーゼ発現後のタンパク質について、ゲル電気泳動法(SDS-PAGE)による分析が示されている。標的タンパク質は矢印でマークされている。活性型は、約40kDaのホモダイマーであり、モノマーは約20kDaのサイズである。二量体タンパク質の約50%が、可溶性断片として検出された。
・レーン1:規定サイズのマーカータンパク質
・レーン2:可溶性断片
・レーン3:不可溶性断片
図15には、精製後のヌクレアーゼについてゲル電気泳動法(SDS-PAGE)による分析が示されている。活性型は、約40kDaのホモダイマーであり、モノマーは約20kDaのサイズである。
・レーン1:規定サイズのマーカータンパク質
・レーン2:精製されたヌクレアーゼ
精製されたヌクレアーゼの特性を、複数の条件のもとでヌクレアーゼアッセイにおいて決定した。260nmの吸光度によって、ヌクレアーゼの活性を測定することができる。DNAがいっそう小さい断片に分解されると、260nmの吸光度が増加する(Kunitz 1950)。したがってOD260値の増加は、ヌクレアーゼの活性と相関する。
微細加工された分別バルブを介してポンピングされた溶解血液を用いたテストによって示されたのは、分別処理中のMEMSチップの目詰まりを阻止するには、MgCl2が存在するときに10U/mLよりも低いベンゾナーゼの濃度で十分なことである。100U/mLよりも高いベンゾナーゼの濃度であっても、それ以上の利点は示されなかった。ベンゾナーゼが存在しないときに実施された同じテストによれば、装置が目詰まりする結果となった。
Claims (15)
- ケイ素基板表面に微細加工された細胞分別バルブにより、前記細胞分別バルブから導かれている微細加工流路と、使い捨てカートリッジと、を用いて、試料から標的細胞と非標的細胞とを分別する方法であって、
前記細胞分別バルブは、標的細胞である標的粒子を、非標的細胞を含む非標的物質から分離し、
前記使い捨てカートリッジは、試料貯蔵器と分別貯蔵器と廃棄貯蔵器とを含み、
前記試料を、ヌクレアーゼを含む緩衝剤において供給する、
方法。 - 前記ヌクレアーゼは、カチオン非依存性である、
請求項1記載の方法。 - 前記ヌクレアーゼは、カチオン非依存性であり、前記緩衝剤は、カチオンとの錯体を生成可能なキレート剤を含有する、
請求項1または2記載の方法。 - 前記ヌクレアーゼは、カチオン依存性である、
請求項1記載の方法。 - 前記ヌクレアーゼは、DNアーゼである、
請求項1から4までのいずれか1項記載の方法。 - 前記ヌクレアーゼは、非特異性である、
請求項1から5までのいずれか1項記載の方法。 - 前記ケイ素基板の前記微細加工流路と前記使い捨てカートリッジの前記貯蔵器との間の流体連通を、インターポーザーによって形成する、
請求項1から6までのいずれか1項記載の方法。 - 前記使い捨てカートリッジの前記分別貯蔵器と前記ケイ素基板の分別流路との間の分別流体経路と、前記使い捨てカートリッジの前記廃棄貯蔵器と廃棄流路との間の廃棄流体経路と、試料流路と前記試料貯蔵器との間の試料流体経路とを、前記インターポーザーによって形成する、
請求項7記載の方法。 - 前記インターポーザーの流路の底部に付加的な小さい流路を設け、前記付加的な小さい流路は、前記付加的な小さい流路が配置される前記流路の深さおよび幅の5〜20%である、
請求項7または8記載の方法。 - 前記細胞分別バルブは、前記標的粒子を前記試料流路から前記ケイ素基板に形成された前記分別流路へと向かわせ、前記非標的物質を前記試料流路からやはり前記ケイ素基板に形成された前記廃棄流路へと向かわせる、
請求項1から9までのいずれか1項記載の方法。 - 前記分別貯蔵器は、さらにサイフォン構造を有しており、前記サイフォン構造は、前記分別貯蔵器の前記サイフォン構造内の少量の分別流体を収集し、前記少量の分別流体は、前記分別貯蔵器の流体総量の約10%よりも少ない、
請求項1から10までのいずれか1項記載の方法。 - 前記試料貯蔵器はさらに、前記試料貯蔵器の壁に形成された漏斗状構造部材を有しており、前記漏斗状構造部材は少量の試料流体を収集し、前記少量の試料流体は、前記試料貯蔵器の流体総量の約10%よりも少ない、
請求項1から11までのいずれか1項記載の方法。 - 前記廃棄貯蔵器はさらに、前記廃棄貯蔵器の壁に形成された漏斗状構造部材を有しており、前記漏斗状構造部材は少量の廃棄流体を収集し、前記少量の廃棄流体は、前記廃棄貯蔵器の流体総量の約10%よりも少ない、
請求項1から12までのいずれか1項記載の方法。 - 前記試料流路は、インタロゲーション手段を含み、前記インタロゲーション手段は、前記試料流路において前記標的粒子を前記非標的物質から区別する、
請求項1から13までのいずれか1項記載の方法。 - 前記インタロゲーション手段は、レーザー誘起蛍光システムのレーザーを含み、標的粒子に蛍光標識を付着し、前記蛍光標識は前記レーザーにより照射されると蛍光信号を発生する、
請求項14記載の方法。
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