JP6732656B2 - ヌクレアーゼを用いた微細加工コンポーネントによる細胞分別方法 - Google Patents

Description

本発明は、ヌクレアーゼを用い、微細加工された可動の細胞分別メカニズムを使って、細胞系を分別する方法に関する。

マイクロエレクトロメカニカルシステム（MEMS）は、半導体デバイスの製造に用いられるような表面またはバルクに対するリソグラフィ処理技術を利用して基板上に製造された、極めて小さくかつ多くの場合には可動の構造である。ＭＥＭＳデバイスとしてたとえば可動のアクチュエータ、センサ、バルブ、ピストン、またはスイッチなどが挙げられ、これらは数μｍ〜数１００μｍという特徴的な寸法を有する。可動のＭＥＭＳスイッチをたとえば、すべてが基板上に微細加工された１つまたは複数の入力端を１つまたは複数の出力端に接続するために、使用することができる。この場合、可動スイッチの作動手段をたとえば、熱による手段、圧電による手段、静電的な手段、または磁気的な手段とすることができる。さらに、ＭＥＭＳデバイスのところを液流として通過する粒子を操作するＭＥＭＳデバイスを形成することもできる。

さらにたとえば、ＭＥＭＳデバイスを可動バルブとすることができ、これは液流から種々の粒子を分別する分別メカニズムとして使用され、たとえば血液から細胞を分別する分別メカニズムとして使用される。マイクロ流路内に封入され圧力を受けて流れる液流の中に設けられた分別装置へ向けて、粒子を搬送することができる。粒子がＭＥＭＳ分別装置に到達すると、分別装置は、血液幹細胞など着目対象粒子を隔離されたレセプタクルへと向かわせ、残りの液流を廃棄レセプタクルへと向かわせる。

以前より、蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）を用いた粒子ソーターが存在しており、これはフローサイトメーターとして知られている。フローサイトメーターは一般的に大きく高価なシステムであり、このシステムは、着目対象細胞に付着された標識からの蛍光信号に基づき、細胞を分別する。それらの細胞は希釈されてシース液中に懸濁され、ついでノズルを通過して急速に減圧されることで、個々の液滴に分離される。それらの液滴は、ノズルから噴射された後、標識からの蛍光信号に基づき、静電作用によってそれぞれ異なる容器に分離される。このようなシステムによる主だった問題点とは、減圧に起因する細胞損傷または機能喪失、難しくかつコストのかかる各試料間の滅菌処置、異なるパラメーターに従い部分母集団の再分別が不可能なこと、このような大きく高価な機器の部品を所有し、操作し、かつ維持するためにはかなりのトレーニングが必要なこと、などである。少なくともこれらの理由のために、フローサイトメーターの利用は、これまで大きな病院や研究所に限られており、その技術を小規模な企業や事業所が利用することはできなかった。ＭＥＭＳベースの細胞分別システムは、コスト、速度およびサイズの点で、フローサイトメーターよりも実質的に有利になる可能性がある。この種のＭＥＭＳベースの粒子分別装置に関して、多数の特許が付与されている。たとえば、米国特許第6,838,056号（’056特許）明細書は、ＭＥＭＳベースの細胞分別装置に関するものであり、米国特許第7,264,972 b1号（’972特許）明細書は、ＭＥＭＳベースの細胞分別装置のためのマイクロメカニカルアクチュエータに関する。さらに米国特許第7,220,594号（’594特許）明細書は、ＭＥＭＳ細胞分別装置とともに製造された光学的構造に関するものであり、米国特許第7,229,838号（’838特許）明細書は、ＭＥＭＳベースの粒子分別システムを動かすための作動メカニズムに関する。これらに加え、米国特許出願第13/374,899号（’899出願）明細書および第13/374,898号（’898出願）明細書には、他のＭＥＭＳ設計が詳述されている。上述のような細胞分別システムにマイクロ流体デバイスを使用することによって遭遇する主たる問題点は、狭い通路の目詰まり、それらの狭い通路と肉眼で見える世界とのインターフェース、さらにはこのような極めて小さい可動デバイスの運動の制御、である。

本願は、微細加工された細胞分別ＭＥＭＳチップを用いるようにした細胞分別システムに関する。ＭＥＭＳチップの通路はリソグラフィによって形成され、したがって著しく小さい。それらの狭い通路の目詰まりによって、信頼性のある長期間の動作が多いに脅かされる。

発明の課題
本発明の課題は、細胞分別処理中のＭＥＭＳチップにおける通路の目詰まりを回避することである。

たとえばカチオン非依存性のＤＮアーゼを、分別すべき細胞が懸濁している緩衝剤に与えることによって、試料の粘度を著しく低減できることが見出された。ヌクレアーゼの添加によって、装置内の小さい流路の目詰まりが低減され、あるいは排除さえも行われる。

ここで述べる方法によれば、上述のようなＭＥＭＳ細胞分別システムを実現できるようにするために、様々な設計要素が設けられる。分別メカニズムを、ケイ素基板に形成されたＭＥＭＳ流体バルブとすることができ、これはインターポーザーに取り付けられて、使い捨てカートリッジ内に設置される。このカートリッジは、試料液を扱う流体経路をすべて用意することができ、所定の液量を蓄積するための比較的大きい貯蔵器（たとえば分別貯蔵器、試料貯蔵器および廃棄貯蔵器）を有することができる。この場合、ＭＥＭＳ流体バルブの微視的な通路と貯蔵器の巨視的な構造部材との間の相互接続のために、プラスチックのインターポーザーが用いられる。細胞分別システムの滅菌が簡単になるよう、ＭＥＭＳ流体バルブ、インターポーザーおよび貯蔵器をすべて、１つの使い捨てカートリッジ内に含めることができ、このカートリッジは単に処分されるだけである。

この場合、特別に設計された電磁石によって、厳密に配置された電磁場を与えることができ、この電磁場によって、著しく小さいＭＥＭＳチップがそれよりも著しく大きいシステム内で動かされる。この電磁石によって、発生する熱が最小限に抑えられ、したがって効率が改善される。最終的には、目詰まりを低減または排除するために、液体物質の特別な製剤が用いられる。

使い捨てカートリッジおよびインターポーザーは、混合器や漏斗形状領域など複数の新規の特徴を含むことができ、それらによって少量の液体の処理を支援することができる。混合器を試料貯蔵器内に沈めることができ、それによって内容物を混合できるようになる。少量の液体を収集するため、分別貯蔵器内、試料貯蔵器内および廃棄貯蔵器内に、漏斗形状領域を設けることができる。

以上のとおり本発明の対象は、ケイ素基板表面に微細加工された細胞分別バルブにより、試料から標的細胞と非標的細胞とを分別する方法である。この場合、細胞分別バルブから導かれている微細加工流路と、使い捨てカートリッジとが設けられており、細胞分別バルブは、標的粒子を非標的物質から分離し、使い捨てカートリッジは、試料貯蔵器と分別貯蔵器と廃棄貯蔵器とを含み、その際、試料はヌクレアーゼを含む緩衝剤において供給される。

この方法は、テーパー形状の先端部とコイルと磁気コアとを備えた電磁石を含む細胞分別システムを用いることができ、この場合、テーパー形状は、コイルとコアとにより形成された磁束線を集中させ、先端部付近で電磁石から送出させるために用いられる。

次に、以下の図面を参照しながら種々の実施形態の詳細について説明する。

ＭＥＭＳチップソーターを第１のポジションで略示した図 ＭＥＭＳチップソーターを第２のポジションで略示した図 図１および図２のＭＥＭＳソーターを使用できるようにしたＭＥＭＳ細胞分別システムの実施形態を略示した図 ＭＥＭＳチップソーターとインターポーザーとを含む図３のＭＥＭＳ細胞分別システムにおいて使用可能な使い捨てカートリッジの実施形態を示す分解図 図５ａは、ＭＥＭＳチップソーターとインターポーザーとを含む図３のＭＥＭＳ細胞分別システムにおいて使用可能な使い捨てカートリッジの実施例を示す側面図、図５ｂは使い捨てカートリッジの実施例を示す端面図 ＭＥＭＳチップソーターとインターポーザーとを含む図３のＭＥＭＳ細胞分別システムにおいて使用可能な使い捨てカートリッジの実施例を別の側面から見た図 図４の使い捨てカートリッジと共に使用可能なインターポーザーの実施例を示す平面図 図８ａは、図４の使い捨てカートリッジと共に使用可能なインターポーザーの実施例を、カートリッジ端面を示しながら描いた斜視図、図８ｂは流路の断面図、図８ｃは流路の別の実施形態を示す断面図 インターポーザーの実施例の表側を示す斜視図 インターポーザーの実施例の表側を示す斜視図 インターポーザーの変形実施形態を示す断面図 図１２ａは、ＭＥＭＳチップソーターを第１のポジション（図１）から第２のポジション（図２）へ動かすことのできる磁場を発生可能である、本発明による電磁石を示す平面図、図１２ｂは磁石先端の拡大図、図１２ｃは本発明による電磁石の斜視図 ＭＥＭＳ細胞分別システムに使用するためのヌクレアーゼを製造する方法の実施例を示す図 組換え大腸菌細胞の培養および組換えヌクレアーゼ発現後のタンパク質について、ゲル電気泳動法（SDS-PAGE）による分析を示す図 精製後のヌクレアーゼについて、ゲル電気泳動法（SDS-PAGE）による分析を示す図 組換えヌクレアーゼの活性を市販のカチオン依存性のヌクレアーゼと対比して示す図 組換えヌクレアーゼの活性を市販のカチオン依存性のヌクレアーゼと対比して示す図 組換えヌクレアーゼの活性の温度依存性を示す図 組換えヌクレアーゼの活性のｐＨ依存性を示す図

なお、これらの図面は必ずしも正確な縮尺で描かれているわけではなく、また、同じ部材には同じ参照符号が付されている場合もあることを理解されたい。

本願は、液流中の非標的物質から標的粒子を分別する方法に関する。この場合、微細加工された（ＭＥＭＳによる）可動バルブが用いられ、または、標的粒子を試料流入路から分別流路へ向かわせる一方、非標的物質を廃棄流路へ流すことができる分別メカニズムが用いられる。分別流路と廃棄流路の双方は、それぞれ別個の貯蔵器すなわち分別貯蔵器と廃棄貯蔵器とへ導かれ、取り出されるまでそこに貯蔵される。分別貯蔵器、試料貯蔵器および廃棄貯蔵器を、ＭＥＭＳチップソーターと共に、プラスチックの使い捨てカートリッジに収容することができる。このカートリッジは、液体を貯蔵器から収集してから、廃棄することができる。これによって、各試料間でシステムを滅菌する負担を大幅に低減することができる。このシステムおよび方法は、コスト、パフォーマンス、速度、複雑さの点でも、著しい利点を有することができる。さらにこのシステムによれば、流出液中の細胞生存性が小滴ベースのフローサイトメーターに比べて著しく改善されるといったように、細胞を著しく丁寧に取り扱うこともできる。

このセルソーティングシステムのマイクロ流体という性質上、目詰まりを少なくするまたは排除するための、また、少量の液体を扱うための、さらに著しく小さい可動バルブを制御するための措置がとられる。その際、肉眼では見えない微視的な通路と肉眼で見える巨視的な構造部材との間の相互接続のために、インターポーザーが用いられる。最終的には、特別に設計された電磁石によって、厳密に配置された電磁場が与えられ、この電磁場によって、著しく小さいＭＥＭＳチップが、それよりも著しく大きいシステム内で動かされるようになる。この電磁石によって、発生する熱が最小限に抑えられ、したがって効率が改善される。これらの特徴各々について、以下で説明する。

ヌクレアーゼ
マイクロ流体デバイスを用いた場合、流路内で細胞が凝集、凝固または目詰まりする傾向があるため、デバイスの長期間にわたる機能性が脅かされる可能性がある。このことは特に、成分粒子が強い凝固傾向をもつ血液または細胞懸濁液などのような生体物質について当てはまる。物質が小さい流路の表面に付着する傾向にあることで、デバイスに対し望ましくなく場合によっては非可逆的な変化が引き起こされる可能性もある。望ましくない変化には、結果として生じる流体抵抗の増加、結果としてデバイスに導入される何らかの試料の汚染、およびデバイス内の流れのパターン変化が含まれる。溶液中の核酸が少量であっても、流路が目詰まりして、流路内の細胞をその目的場所まで搬送できなくなる程度に、物質の粘度が高まるか物質のスパンが形成される可能性がある。ここで開示するように、このような結果は、以下で説明する液体懸濁における特定の化学的性質を用いることで、低減または改善することができる。

細胞培養中、細胞が溶解した結果として、ＤＮＡなどの核酸が細胞培養液中に放出される。核酸によって水溶液の粘度が高まり、したがってこのことが、ＭＥＭＳチップおよび／またはインターポーザーの狭い流路の目詰まりの主要な原因となる。

核酸分解酵素の作用によって、処理すべき試料の粘度を低減することができる。以下の説明では、そのような酵素のことを「ヌクレアーゼ」と称する。ＤＮＡの分解能力を備えたヌクレアーゼは、「ＤＮアーゼ」と呼ばれ、および／または、ＲＮＡの分解能力を備えているならば、「ＲＮアーゼ」と呼ばれる。本発明の場合には、ヌクレアーゼとしてＤＮアーゼを使用するのが好ましい。

できるかぎり粘度を低減するためには、核酸をできるかぎり小さい断片に分解するのが好ましい。

これを達成するためには、ＤＮアーゼＩ、ベンゾナーゼ（Benzonase）、Ｓ１ヌクレアーゼなど非特異的ヌクレアーゼを使用するのが好ましい。非特異的ヌクレアーゼは、何らかの特異的ＤＮＡ構造の切断を必要としない。そうではなくそれらのヌクレアーゼは、ＤＮＡの構造および配列に依存することなく、一本鎖ＤＮＡおよび／または二本鎖ＤＮＡを切断することができる。

本発明において用いられるヌクレアーゼを、カチオン依存性とすることができ、たとえばＤＮアーゼＩおよびベンゾナーゼ（Benzonase ＤＮＡとＲＮＡの分解特性を備えたヌクレアーゼの登録商標）とすることができ、これらは双方ともに市販されている。これらのヌクレアーゼは一般に、Mg2+および／またはCa2+のイオンが活性（＝核酸の分解）であることを必要とする。これらのカチオンが存在しない場合、またはこれらのカチオンがEDTAなどのようなキレート剤と複合しているならば、それらのヌクレアーゼは活性ではなく、つまり核酸を分解する能力がなく、その結果、セルソーターの目詰まりが生じてしまう。したがって、カチオン依存性のヌクレアーゼを本発明による方法において使用する場合、緩衝剤にはキレート剤すなわちカチオンとの錯体を形成し得る化合物が含まれないようにする。

本発明の別の実施形態によれば、カチオン非依存性のヌクレアーゼが用いられる。この実施形態の場合には、緩衝剤にカチオンとの錯体を形成し得る１つまたは複数のキレート剤が含まれていてもよい。

ここで用語「キレート剤」とは、何らかの金属イオンとの可溶性の複合分子を形成するすべての物質、化学薬品および分子のことを表し、その際、イオンが酵素または生存細胞または緩衝剤からの沈降物といった他の分子と干渉できないように、それらのイオンが生物学的に不活性化される。本願において用いられるキレート剤にはたとえば、EDTA（エチレンジアミン四酢酸）、EGTA（グリコールエーテルジアミン四酢酸）、DOTA（1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸）、DTPA（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）、およびホスホン酸塩が含まれる。

細胞培養中の細胞は通常、生存および生育のために所定の条件を必要とする。それらの条件には
・緩衝剤のｐＨ値、
・緩衝剤のイオン強度、
・温度、
・EDTA（さもなければ凝集および相互の固着に資する細胞）、
が含まれる。

したがって、細胞分別中つまりは粘度の低減中、核酸の分解に適したヌクレアーゼに対する要求には、
・ｐＨ約７．２〜７．６で活性、
・４℃〜３７℃の温度で活性、
・ホスホン酸イオンと塩イオンが存在しているときに活性、
・オプションとして、EDTAが存在しているときに活性、つまりはCa2+またはMg2+など遊離したカチオンが存在していないときに活性、
・（核酸以外に）細胞により放出された物質が存在しているときに活性、
が含まれる。

マイクロ流体デバイスを用いた本発明による方法において、核酸を効果的に分解するために、ヌクレアーゼを以下のようにすべきである。すなわち、
・非特異的に核酸を分解すべきである、すなわち分解が小さい個体群の核酸に限られるようではならない。
・核酸を「高速で」分解すべきである（培養時間は数分〜数１０分であって数時間ではない）。

ほぼ中性のｐＨ値ではたらく市販のヌクレアーゼは、EDTA適合性ではなく、つまり活性のためにカチオンを必要とするように、カチオン依存性である。
・Benzonase（登録商標）（およびDenarase（登録商標）のように複製されたそれらの変種）：Mg2+
・Cryonase（商標）：Mg2+
・ＤＮアーゼＩ、ウシ：Ca2+, Mg2+
・ＤＮアーゼ、ヒト（ドルナーゼアルファ）：Ca2+, Mg2+
・ＤＮアーゼ、シュリンプ：Mg2+
・ヌクレアーゼ、ミクロコッカス（黄色ブドウ球菌）：Ca2+
・ヌクレアーゼＳ１：Ca2+, Zn2+
・ヌクレアーゼＳ７：Ca2+

上述の要求（たとえばｐＨなど）に適合したEDTA適合性のあるヌクレアーゼは、細胞分別という状況で粘度を低減するために有利であり、そのためマイクロ流体の環境で目詰まりを防止するためにも有利である。

たとえばこの実施例で説明するEDTA適応性のＤＮアーゼは、本発明において開示するマイクロ流体環境において細胞を分別するために有利である。細胞の溶解および細胞からのＤＮＡの放出は、マイクロ流体のスケールをもつ流路において特に問題である。その理由は、少量のＤＮＡであっても溶液の粘度を増加させる可能性があり、その結果、流路の目詰まりを生じさせるからである。

ヌクレアーゼおよびオプションとして用いられるキレート剤を、すでに緩衝剤中に存在する試料に加えることができる。分別のために試料が懸濁されている緩衝剤に、これらを加えてもよい。いずれのケースにせよ、細胞と緩衝剤とを含む最終的な試料は有利には、１〜１００Ｕ／ｍＬのヌクレアーゼと、オプションとして用いられる０．１〜５ｍｍｏｌ／ｌのキレート剤とともに準備される。

セルソーター／ＭＥＭＳチップ
図１は、微細加工された細胞分別メカニズムであるＭＥＭＳチップソーター１０の概略図であり、ここで説明する粒子分別処理においてこれを使用することができる。細胞分別メカニズムの詳細については、米国特許出願第13/998,095号明細書を参照されたい。微細加工された細胞分別メカニズム１０の主たる独特な特徴は、細胞分別バルブ１０の動きが、バルブの製造面と平行なことである。これに加え廃棄流路１４０が、試料流入路１２０と分別流出路１２２とに対し、実質的に直交している。これらの特徴によって、マイクロ流体分別における速度および精度、バルブのスループットならびに容易さの点で、めざましい利点が得られるようになる。

なお、用語「チップソーター」１０とは、「チップ」が基板上に微細加工されたデバイスであることから、微細加工された細胞分別バルブ１０に対する略語である、と理解されたい。どちらの用語も、ＭＥＭＳ製造技術を利用して基板表面に形成された微細加工による可動バルブを表そうとしており、このバルブはその運動によって、標的粒子を非標的物質から分離することができる。

図１の平面図の場合、新規なＭＥＭＳチップソーターまたは細胞分別バルブ１０は、静止（非作動）ポジションにある。チップソーター１０は、微細加工された流体バルブまたは可動部材１１０（ハッチングされた領域）と、微細加工された複数の流路１２０，１２２，１４０とを含むことができる。微細加工流路１４０（図１および図２において破線で示された領域１４０）は流出路として用いられ、微細加工部材１１０の少なくとも一部分の直下に配置することができ、これは微細加工流路１２０，１２２または微細加工部材１１０の平面とは平行ではない。微細加工部材１１０は、この平面と平行にまたはこの平面内に製造され、所定の経路中を移動する。好ましくは微細加工流路１４０は、微細加工流路１２０，１２２の平面および微細加工部材１１０の運動経路に対し直交している。微細加工流路１４０の開口部は、微細加工部材１１０の運動経路の少なくとも一部分をカバー好ましくはオーバラップすることができ、つまり図１および図２に示されているように破線領域は、微細加工部材１１０とその運動の少なくとも一部分にわたりオーバラップしている。このようなオーバラップによって、微細加工部材が「廃棄」ポジションまたは非作動ポジションにあるときには（図１）、流入路１２０と流出路１４０との間に流動経路を生じさせることができ、「分別」ポジションまたは作動ポジションにあるときには（図２）、この経路が閉鎖されて粒子の方向が切り換えられる。既述のように、このアーキテクチャによって流体抵抗を低減することができ、それによって微細加工部材１１０の速度が上昇する。

可動部材１１０および微細加工流路１２０，１２２および１４０を、ケイ素基板など適切な基板の表面に、’095出願に詳述されているようなＭＥＭＳリソグラフィ製造技術を用いて形成することができる。製造基板は、デバイスが形成され可動部材１１０が移動する製造面を有することができる。

試料流入路１２０を介して、微細加工による可動部材１１０へ試料流を導入することができる。可動部材１１０による分別前に、試料液を試料貯蔵器２０に貯蔵しておくことができる。試料流は、少なくとも１つの所望の標的粒子と、他の不所望な複数の非標的粒子とを含有する、粒子の混合物を含むことができる。これらの粒子を、液体中に懸濁させておくことができる。たとえば標的粒子を、幹細胞、癌細胞、接合子、タンパク質、Ｔ細胞、バクテリア、血液成分、ＤＮＡ断片などのような生体物質とすることができ、たとえばこれらは生理食塩水または以下で述べる新規の化学物質などのような緩衝液中に懸濁される。流入路１２０を、可動部材１１０と同じ製造面に形成することができ、それによって液体が実質的にその面に流れるようになる。細胞分別バルブ１０の運動も、この製造面内で行われる。ある所定の粒子を分別／保存または排出／廃棄する決定を、任意の数の識別信号に基づき行うことができる。１つの実施形態によればこの判定は、粒子に付着され照射レーザーにより励起された蛍光標識をベースとして、粒子から放出された蛍光信号に基づくものである。レーザーインタロゲーション領域２００は、マイクロ流体経路の一部分であり、標的粒子を液体試料の他の成分と区別するために、この領域において照射レーザーまたはインタロゲーションレーザーが標的粒子に向けられる。この検出メカニズムに関する詳細は、文献において周知であり、さらにあとで図３を参照しながら説明する。ただし、他の種類の識別信号も考えられ、そのような信号として挙げられるのは、粒子の形態学に基づくことができる散乱光または側方散乱光、あるいは様々な機械的、化学的、電気的または磁気的な作用であり、それらの作用によって粒子を、標的粒子つまりは分別または保存される粒子であると同定することができ、あるいは非標的粒子つまりは拒否される粒子またはさもなければ廃棄される粒子であると同定することができる。

可動部材１１０が図示のポジションにあるとき、到来流は妨害を受けずに廃棄流出路１４０へ送られ、この廃棄流出路１４０は、流入路１２０の平面外にあり、したがってＭＥＭＳチップソーター１０の製造面外にある。つまりこの場合、流れは流入路１２０から流出オリフィス１４０へと向かい、流出オリフィス１４０からは実質的に垂直方向に、つまり流入路１２０に対し直交して流れる。流出オリフィス１４０は平面外の流路へと導かれ、この流路を、図１を描いた紙面に対し垂直とすることができる。もっと一般的にいえば、廃棄流出路１４０は、流入路１２０または分別流路１２２の平面のうち少なくとも１つの平面に対し、あるいは可動部材１１０の製造面に対し、平行ではない。１つの実施形態によれば、分別流路と試料流路とを逆平行とすることができ、つまり分別流路中の流れは、流入する試料流路中の流れとは逆方向である。

したがってこの細胞分別システムは、以下のような細胞分別バルブ１０を含むことができる。すなわち細胞分別バルブ１０は、標的粒子を試料流路１２０からケイ素基板に形成された分別流路１２２へと向かわせ、さらに非標的物質を試料流路１２０からやはりケイ素基板に形成された廃棄流出路１４０へと向かわせる。細胞分別バルブ１０は、表面と平行な１つの平面内で移動することもでき、微細加工された細胞分別バルブ１０が第１のポジションにあるときに、標的粒子を試料流路１２０から廃棄流路１４０へと向かわせることもでき、さらに第２ポジションにあるときに、他の粒子を分別流路１２２へ向かわせることもできる。この場合、分別流路１２２と廃棄流路１４０は実質的に逆平行であり、かつ試料流路１２０と廃棄流路１４０は実質的に直交している。廃棄流出路１４０はオリフィスを有することができ、このオリフィスを、製造基板または製造基板に接合されたカバー基板に形成された孔とすることができる。さらに可動部材１１０は、湾曲した転流面１１２を有することができ、これによって到来流の流れを分別送出流へと方向転換することができる。転流面１１２の輪郭を、一方のポジションでは試料流が流入路１２０から分別流路１２２へ方向転換されるようにし、他方のポジションでは試料流を廃棄流出路１４０へ流すことができるようなものとすることができる。したがって、図１に示されているように可動部材１１０が非作動の廃棄ポジションにある場合、転流面１１２が流入路１２０とオーバラップすることによって、廃棄流出路１４０へ直接流される到来流のルートが存在する。この場合、廃棄流出路１４０が廃棄貯蔵器４０に至るようにすることができ、この廃棄貯蔵器４０は非標的物質を収集することができる。可動部材１１０上にインレイ加工された透磁性材料１１６によって、このような動きを生じさせることができ、次にこれについて図２を参照しながら説明する。

図２は、ＭＥＭＳチップソーター１０を作動ポジションで示す平面図である。このポジションにおいて可動部材１１０またはバルブ１０は、図２に示されたポジションへと上に向かって向きを変える。湾曲した転流面１１２は分別を行う輪郭となっており、この輪郭によって流入路１２０の流れが分別流出路１２２へと方向転換される。流出路１２２を流入路１２０と実質的に同じ平面に位置させることができ、これによって分別流路１２２内の流れも流入路１２０内の流れと実質的に同じ平面に位置するようになる。この場合、流入路１２０と分別流路１２２との間に所定の角度をもたせることができる。この角度を、約９０度までの任意の角度とすることができる。図２に概略的に示されている力発生装置４００からの力によって、可動部材１１０を作動させることができる。いくつかの実施形態によれば、力発生装置４００を上述のように電磁石とすることができる。ただし、力発生装置を静電式または圧電式にしてもよいし、あるいは可動部材１１０に力を及ぼすことで可動部材を第１のポジション（図１）から第２のポジション（図２）に移動させる他の何らかの手段としてもよい、ということを理解されたい。分別流路１２２が分別貯蔵器２２に至るようにすることができ、図２に示されたポジションにおいて分別貯蔵器２２は、分別された標的粒子を流出液として可動バルブから収集する。流入路１２０は試料液を、図１に示されているように試料貯蔵器２０から廃棄流路１４０さらには廃棄貯蔵器４０へと導くことができるし、または、図２に示されているように分別流路１２２さらには分別貯蔵器２２へ導くこともできる。

いくつかの実施形態によれば力発生装置４００は、可動部材１１０と相互に作用する磁場を発生するコイルを含むことができる。可動部材１１０がこのような電磁力に応答できるようにするため、可動部材１１０は、この可動バルブ１１０にインレイ加工された透磁性材料を有することができる。インレイ加工されたこの磁性材料１１６の範囲を、図１および図２の破線で示されているような可動部材１１０の外形線のエッジのちょうど内側になるようにすることができる。

ここで透磁性材料とは、この材料内で磁場の形成を維持可能な任意の材料を意味する、と理解されたい。換言すれば、材料の透磁率は、印加される磁場に応答して材料が得る磁化の度合いである。

ここで用いられる用語「透磁性材料」または「高透磁率材料」とは、空気または真空の透磁率と比較して大きい透磁率を有する材料である、と理解されたい。つまり、透磁性材料または高透磁率材料は、（空気または真空と比較して）少なくとも約１００の比透磁率を有する材料であり、つまり約１．２６×１０^−６Ｈ・ｍ^−１である空気または真空の透磁率の１００倍の透磁率を有する材料である。透磁性材料には多数の例があり、それらにはクロム（Ｃｒ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）および鉄（Ｆｅ）の合金が含まれる。１つの一般的な透磁性材料はパーマロイとして知られており、その組成は、約６０％〜約９０％のニッケルと約４０％〜約１０％の鉄である。最も一般的な組成は、８０％のニッケルと２０％の鉄であり、この場合には約８，０００の比透磁率を有する。したがって可動部材１１０はパーマロイ材料１１６を有することができ、この材料１１６は可動部材１１０にインレイ加工され、ついでこの材料が平坦化されて、可動バルブの断面が平坦なままになるようにする。この種の透磁性構造部材の製造についてのさらに詳細な点は、’095特許出願を参照されたい。

静磁気学からよく知られているとおり、磁束に対し透磁性材料により形成される経路の磁気抵抗が低減されるように、透磁性材料は磁束線が集中している領域に引き込まれる。したがって、インレイ加工された透磁性材料１１６が設けられていることから、磁場中の勾配により、高い磁束集中度を有する領域へ向かって可動部材１１０の動きが促進される。つまり、インレイ加工された透磁性材料１１６を備えた可動部材１１０は、磁束の正の勾配の方向へ引き込まれることになる。あとで図１２ａ〜図１２ｃを参照しながら、可動部材１１０に関する制御を最適化する目的で、極めて特定の領域に磁束線を集中させる新規のコアデザインについて説明する。

ただし、ここで説明する静磁気による実施形態は、細胞分別バルブまたはチップソーター１０を動かすために使用できる多数の作動メカニズムのうちの１つにすぎないことを理解されたい。もっと一般的にいえば、細胞分別バルブ１０が第１のポジションにあるときに、試料流路１２０と廃棄流路１４０との間に通路が形成されるように、この細胞分別システムを細胞分別バルブ１０によって構成することができる。細胞分別バルブ１０が第２のポジションにあれば、試料流路１２０と分別流路１２２との間に通路が形成される。細胞分別バルブ１０は、力の印加に応答して第１のポジションから第２のポジションに移動可能であり、この力を機械的、静電的、静磁気的、圧電的、および電磁的な力のうちの少なくとも１つとすることができる。静磁気的な実施形態の場合、透磁性材料は、微細加工された細胞分別バルブ１０の可動部材にインレイ加工され、さらに磁束４００の発生源が設けられる。磁束は、インレイ加工された透磁性材料１１６と相互作用し、微細加工された細胞分別バルブ１０を動かす。これによれば、磁束４００の発生源がアクティブにされると、微細加工された細胞分別バルブが第１のポジションから第２のポジションへ移動する。

細胞検出
図３は細胞分別システム１の概略図であり、このシステムは、マイクロ流体通路、使い捨てカートリッジ１０００内に収容されたＭＥＭＳチップソーター１０、および磁束発生装置４００を使用することができる。以下では、このシステムの他のいくつかのコンポーネントについて、およびそれらのコンポーネントがＭＥＭＳチップソーター１０とどのように相互作用するのかについて述べる。特に図３では、インタロゲーション領域２００に対するインタロゲーションレーザーの光路と、流路１２０〜１４０内の液流の制御と、ＭＥＭＳチップソーター１０の制御について説明する。システムレベルの説明をした後で、マイクロ流体システム１を高精度かつ高い信頼性で予期されるとおりに動作させることのできるシステム１の独特の特徴について論じることにする。

図３に示されているように、微細加工されたＭＥＭＳチップソーター１０を、使い捨てカートリッジ１０００内に収容することができる。この場合、カートリッジ１０００を、可動ステージにロード可能であって、細胞分別システム１内において検出光学系２１００およびインタロゲーションレーザー２４００に対して配向することができる。この場合、あとで図４〜図９を参照しながら説明するように一連の通路を介して、やはり使い捨てカートリッジ１０００内に収容された液体貯蔵器からＭＥＭＳチップソーター１０を通って、液体が流れる。

システム１の通常の動作において標的粒子を、蛍光マーカーで標識された特定の細胞たとえば幹細胞または癌細胞とすることができる。このマーカーは、予め定められた波長で動作するレーザー２４００により照射されると、特定のエネルギーを有する光子を発生する。したがってこの細胞分別システムの場合、レーザー光源２４００を偏向ミラー２２５０により、図１および図２に示したレーザーインタロゲーション領域２００に向けて、検出／集光光学系２１００を介して配向することができる。検出／集光光学系２１００およびレーザー光源２４００の光軸を、光路の少なくとも一部分にわたり共線とすることができる。したがって、この光軸に沿ったレーザーの照射および光学的検出の配向を、基板製造平面に対し垂直にすることができ、または基板製造平面に直交させることができ、可動バルブ１１０の運動平面に直交させて、検出領域を通過する試料液の流れに直交させることができる。

照射された粒子から発する蛍光を、検出／集光光学系２１００により成形することができ、ダイクロイックミラー２２００により分離して、複数の光検出器２３００から成るバンクへ向かわせることができる。複数の光検出器によって、放射光の複数の波長をマルチパラメトリック検出のために適合させることができる。光検出器２３００により出力された信号は、レーザーインタロゲーション領域２００に標的粒子が存在しているか否かを表す。この信号をコントローラー２９００に供給することができ、コントローラー２９００は、粒子分別システム１におけるコンポーネント相互間のタイミングを管理し、かつデータを収集する。コントローラー２９００を、汎用コンピューターまたは専用回路またはＡＳＩＣとすることができる。標的粒子が検出されると、コントローラー２９００は、力発生装置または磁束発生装置４００を励起する信号を発生する。コントローラー２９００は、１つまたは複数の空気圧式の、液圧式の、ピストンベースの、または機械的な力をベースとするメカニズムを介して、ＭＥＭＳチップソーター１０に対し流体制御を提供することもでき、それらのメカニズムは全体として流体制御手段２５００として表されている。流体制御手段２５００を保守管理可能なコントローラー２９００によって、粒子が検出されるレートを監視することができる。

力発生装置４００は、可動部材１１０自体に力を生じさせる装置であり、これによって可動部材の運動が引き起こされる。この力発生装置４００は、図３に破線で表されているように、ＭＥＭＳ粒子操作装置１０と直接機械的に結合されていなくてもよい。たとえば力発生装置４００を、すでに述べたように細胞分別バルブ１０のＭＥＭＳ可動部材１１０にインレイ加工された透磁性材料１１６に静磁気力を生じさせる磁束発生源とすることができる。したがって磁束発生装置４００を、磁気コアと巻線とを備えた電磁石とすることができる。この力によって、可動部材１１０を力発生装置４００に向かって引き寄せることができ、図１および図２に示したように、これによって分別流路１２２を開放し、廃棄流路１４０を閉鎖することができる。ここで重要であるのは、力発生装置４００をＭＥＭＳチップソーター１０内ではなく、粒子分別システム１内に配置できることである。すでに述べたようにこのようにすることで、ＭＥＭＳチップソーター１０のコストと複雑さを低減することができ、その際、ＭＥＭＳチップソーター１０を、システム１の使い捨て部分１０００内に収容することができる。図３に示したコンパクトなシステムにおいて重要であるのは、力発生装置４００が過剰な熱を生じさせないことである。既述のように、ＭＥＭＳチップソーター１０のサイズは極めて小さいことから、狭い領域に集中させた磁束線を力発生装置４００によって発生させる必要性もあるかもしれない。このような適用事例に適したものとすることができる新規な磁束発生装置４００の設計に関する詳細については、あとで図１２ａ〜図１２ｃを参照しながら述べる。

また、細胞分別システム１内に第２の光路を設けるために、オプションとしてさらに別のレーザー２４１０が含まれるようにしてもよい。

既述のように、レーザーインタロゲーション領域２００は、マイクロ流体経路の一部分であり、標的粒子を液体試料の他の成分と区別するために、この領域においてレーザー２４００が標的粒子に向けられる。

検出領域２００の通過に応答して、インタロゲーション領域２００内に標的粒子が存在していることを表す信号が、検出器２３００によって発せられる。既知の遅延後、検出された標的粒子を液流中の他の成分から分離する目的で、分別ゲートすなわち細胞分別バルブ１０の可動部材１１０の開放を指示する信号が、コントローラー２９００によって発せられる。ＭＥＭＳバルブ１０の可動部材１１０は、既述のように透磁性材料１１６を有することができ、それによって磁場が存在するときにそこに磁力を生じさせることができる。コントローラー２９００によって信号が発せられると、埋め込まれた透磁性材料１１６において力が引き起こされて、この力によって、可動バルブ１１０が力発生装置４００に向かって引き寄せられる。この動きにより廃棄流路１４０を閉鎖し、標的粒子を分別流路１２２に向けて方向転換させることができる。分別された試料は、その後、分別流路１２２の終端に配置され分別試料を保持する分別貯蔵器から収集される。既述のようにコントローラー２９００は、分別イベントが記録されるレートに基づき、流量を制御することもできる。

フィードバックループ
流体制御手段２５００は、ＭＥＭＳチップ細胞分別バルブ１０の流路中を通過して流れる液体の方向と速度を制御することができる。以下で説明する複数の判定基準に基づき、流体制御手段２５００を制御することができる。流体制御手段２５００は、空気圧バルブ、液圧バルブ、および／または一方向バルブを含むことができ、および／またはピストンまたはポンプおよび対応する流体通路を含むことができる。通常動作中、コントローラー２９００を含むフィードバックループにおいて流体制御手段２５００により、たとえば細胞速度、流体圧力、または事象率などが一定に維持されるように、流れを制御することができる。

さらに別の実施形態によれば、本発明による方法において用いられる細胞分別システム１は、細胞または液体中に懸濁している他の固体物質による流路の目詰まりを阻止するためのフィードバックループを含むことができる。生体細胞は特に、通路の表面、縁部または段壁に付着する傾向にあり、それによってシステムを通る液体の流れが減少し、および／または細胞分別全体のパフォーマンスが低下する。フィードバックループを少なくとも、ポンプなどのような流体制御手段２５００とコントローラー２９００とによって構成することができる。

コントローラー２９００は、システム内の液圧および／または細胞速度を監視することによって、差し迫った目詰まりを検出することができる。液圧および／または細胞速度が予め定められた閾値よりも低くなったならば、差し迫った目詰まりが発生している可能性がある。この場合、コントローラー２９００は、液圧および／または細胞速度が再び閾値に到達するまで、ポンプレートを上昇させることができる。適切な検出器により液圧を監視することができ、光路中の事象率の監視により細胞速度を導出することができる。好ましくは、細胞速度を０．２〜１０ｍ／ｓにすることができ、±０．２ｍ／ｓの範囲内で一定にすることができる。したがってフィードバックループを起動させる閾値を、約０．２ｍ／ｓの細胞速度の低下またはこれと等価の圧力損失とすることができる。なお、ここで詳述した点は具体例にすぎず、このような動作パラメーターの選定は適用事例の仕様に左右されることを理解されたい。

分別オペレーションの最後に、分別すべき試料ボリュームがほとんどなくなったならば、コントローラー２９００は流体制御手段２５００と共働して、マイクロ流路中の液体の流れを反転させることができ、２０１４年１月２９日出願の米国特許出願第14/167,566号明細書に記載されているように、これによって通路が湿った状態に維持される。さらにシステム１は、２０１３年１２月１２日出願の米国特許出願第13/104,084号明細書に記載されているように、レーザーインタロゲーション領域２００を通過する流れの反転によって、分別処理の効果を評価する手段も有することができる。

したがって本発明において用いられる細胞分別システム１は、レーザー誘起蛍光システムにおけるレーザーを含むインタロゲーション手段２００を有することができ、この場合、標的粒子に蛍光標識が付着され、この標識はレーザーにより照射されると蛍光信号を発生する。さらにこのシステムは、ポジショニング可能なステージ上で細胞分別システム１に受け入れられるように構成された使い捨てカートリッジ１０００を含むことができ、ステージ上でこの使い捨てカートリッジ１０００を、少なくとも１つのレーザー光源２４００と少なくとも１つの光検出器２３００とに合わせて、ポジショニングすることができる。細胞分別システム１はさらに、コンピューター２９００を含むことができる。このコンピューター２９００は、標的粒子を非標的物質から分離するために、少なくとも１つのレーザー光源２４００、少なくとも１つの光源２１００、および細胞分別バルブ１０と通信を行う。

次に、本発明による方法において用いられるＭＥＭＳ細胞分別システム１の実施可能な態様について説明する。特に、液体をＭＥＭＳチップソーター１０へ、およびＭＥＭＳチップソーター１０から、再現可能かつ信頼性のあるやり方で流すことができるようにした態様、肉眼で見える貯蔵器からＭＥＭＳチップソーター１０へ流すことができるようにした態様、さらには著しく小さいＭＥＭＳチップソーター１０を制御できるようにした態様、について説明する。

試料貯蔵器としての使い捨てカートリッジ
図４は、図３に示した粒子分別システムにおいて使用することのできる、使い捨てカートリッジ１０００の一例を示す分解斜視図である。使い捨てカートリッジ１０００は、天板１１３５および基部１１３０などのような複数の組立部品を含むことができる。

使い捨てカートリッジ１０００は、ＭＥＭＳチップソーター１０を収容することができ、液体貯蔵器内に貯蔵させることができる。したがって使い捨てカートリッジ１０００の基部１１３０は、そこに形成された複数の空間または区画を有することができ、それらに試料貯蔵器２０、分別貯蔵器２２および廃棄貯蔵器４０が収容される。あとで説明するように、分別すべき試料を試料貯蔵器２０に格納することができ、分別流出液を分別貯蔵器２２に、さらに廃棄流出液を廃棄貯蔵器４０に格納することができる。これらの空間の間の液体通路をすべて、インターポーザー１４００内および／またはＭＥＭＳチップソーター１０内に配置することができる。したがってインターポーザー１４００は、使い捨てカートリッジにおける分別貯蔵器２２とケイ素基板における分別流路１２２との間の分別液経路と、使い捨てカートリッジにおける廃棄貯蔵器４０と廃棄流路１４０との間の廃棄液経路と、試料流路１２０と試料貯蔵器２０との間の試料液経路とを形成することができる。

ここで用語「分別」液、「分別」試料、または「分別」貯蔵器は、標的粒子の収集物に適用できる、と理解されたい。さらに「廃棄」液、「廃棄」試料、または「廃棄」貯蔵器は、液流中の非標的物質の収集物に適用できる。これらと等価の他の用語は、分別試料を指す「ポジティブな断片」と、非標的物質を指す「ネガティブな断片」である。よって以下の記載では、「分別」の部分を「ポジティブな断片」と等価とすることができ、標的粒子の収集物に適用することができ、「廃棄」はネガティブな断片に、および非標的物質の収集物に適用することができる。

天板１１３５と基部１１３０との間に、試料を汚染物または破片から保護する複数のフィルター１１８０を配置することができる。これらのフィルター１１８０を、たとえば０．２０μｍの滅菌フィルターとすることができる。フィルター１１８０を、種々の液体貯蔵器２０，２２，４０のすぐ上に配置することができる。液中の破片を捕捉するためのインラインフィルターを液体流路内に設けてもよく、それらのフィルターの孔のサイズを約２０μｍとすることができる。

試料貯蔵器２０と分別貯蔵器２２と廃棄貯蔵器４０は、漏斗状構造部材も含むことができ、この部材によって少量の液体を扱うことができる。分別貯蔵器２２は、サイフォン状の構造物を含むことができ、これについてはその詳細を描いた図７を参照しながらあとで説明する。ただし、試料貯蔵器２０と廃棄貯蔵器４０は、少量の処理をアシストする部材も含むことができる。この構造部材を、起伏のある表面とすることができる。漏斗状構造部材とは、貯蔵器の壁を流れ落ちる少量の液体を収集するように形成された全体的に円錐の構造物のことである、と理解されたい。試料貯蔵器２０と廃棄貯蔵器４０の双方が、このような漏斗状構造部材２１および４１をそれぞれ含むことができる。したがって、ここで説明する細胞分別システム１は、以下のような試料貯蔵器２０と廃棄貯蔵器４０を含むことができる。すなわち試料貯蔵器２０はさらに、試料貯蔵器２０の壁に形成された漏斗状構造部材２１を有しており、この構造部材は、試料貯蔵器２０の液体総量の約１０％よりも少ない少量の試料液を収集する。同様に廃棄貯蔵器４０はさらに、廃棄貯蔵器４０の壁に形成された漏斗状構造部材４１を有することができ、この構造部材は、廃棄貯蔵器４０の液体総量の約１０％よりも少ない少量の廃棄液を収集する。

磁化されたプロペラ
試料貯蔵器２０内において、天板１１３５と基部１１３０との間に、磁化されたプロペラ１１５０と、磁化されたプロペラ１１５０のためのシャフトとして動作可能なニードル１１６０とを封入することができる。循環する磁場に晒されると、磁化されたプロペラ１１５０はシャフト１１６０において回転することができ、それによって試料貯蔵器２０の内容物が混合または均質化される。最終的に、０．２０μｍのフィルター１１７０を分別貯蔵器２２の上に配置することができ、これによって分別された内容物が周囲環境の汚染物から保護される。別の選択肢として、プロペラ１１５０を小型モータと機械的に結合することによりダイレクトに駆動することもでき、この小型モータによってプロペラ１１５０の回転を生じさせることができ、つまりは試料貯蔵器２０の内容物を混合することができる。混合器の構造の詳細は、図６にさらに詳しく示されており、あとでこの図面を参照しながら説明する。

ピペットまたはシリンジおよびプランジャー（図示せず）を用い、図示のアクセスポート１１１１を介して、試料液を試料貯蔵器２０に導入することができ、その後、カートリッジ１０００を雄型のルアーロック式封止部材１１１０によって封止することができる。この場合、蝶ねじなどのような択一的な封止技術を使用してもよい。別の選択肢として、カートリッジ１０００を、すでにそこに配置された試料液とともに供給することができる。

図５ａは、組み立てられた使い捨てカートリッジ１０００の側面図であり、この図には試料貯蔵器２０と分別貯蔵器２２と廃棄貯蔵器４０とが示されている。ここでは、ＭＥＭＳチップソーター１０およびインターポーザー１４００とカートリッジ基部１１３０との相対的な配置が、組み立てられた状態で示されている。なお、図５ａは図４とは逆に描かれており、図４ではカートリッジの左側に示されていた試料貯蔵器２０が、図５ａになると右側に配置されており、対応する流路、撹拌器等も同様である。

インターポーザー
ＭＥＭＳチップの狭い通路を、それよりもかなり大きい肉眼で見える構造部材に整合させなければならず、また、特に希少細胞を分別する場合には、少量の液体を扱えるようにしなければならない。

ＭＥＭＳチップソーター１０の微細加工された著しく細かい構造部材と、それよりもかなり多い液量の貯蔵器２０，２２，４０との間に、移行領域を用意するために、インターポーザー１４００が設けられている。インターポーザー１４００を、たとえば射出成形などによってプラスチックから形成することができ、これには±１０ｍｍのオーダーの中間の許容差をもたせることができる。インターポーザー１４００の１つの特徴は、ＭＥＭＳデバイス１０の著しく小さい構造と、カートリッジ１０００および貯蔵器２０，２２，４０の肉眼で見える大きい構造との間の移行部分を提供することである。したがってここで述べる細胞分別システム１は、ケイ素基板の表面に微細加工された細胞分別バルブ１０と、使い捨てカートリッジ１０００と、インターポーザー１４００とを含むことができる。細胞分別バルブ１０は、そこから導かれた微細加工流路を備えており、標的粒子を非標的物質から分離する。使い捨てカートリッジ１０００には、試料貯蔵器２０と分別貯蔵器２２と廃棄貯蔵器４０とが含まれている。さらにインターポーザー１４００によって、ケイ素基板に微細加工された流路と、使い捨てカートリッジの貯蔵器との間で液体が連通状態にされる。

インターポーザー１４００は、適度に微細な許容範囲（±１０ｍｍ）で製造することができるので、流路への開口部が約３００μｍのオーダーであれば、インターポーザー１４００内の通路をＭＥＭＳチップ内の通路と整列させることができる。可動バルブ１１０に至る、および可動バルブ１１０から到来する流路の幅を、１５０μｍのオーダーで実質的にさらに小さくすることができる一方、液体を流路へ案内する開口部を、このスケール付近で形成することができる。図６には開口部が示されている。

図６の挿入図に示されているように、インターポーザー１４００における１４２０のようなスルーホールをテーパー形状にすることができ、その直径は頂部において３００μｍのオーダーである。この開口部を、底部では約１５０μｍの直径になるまでテーパー形状にすることができ、この底部において開口部は、ＭＥＭＳチップソーター１０の分別流路２０の対応する開口部に接する。

図６にはさらに混合メカニズムの詳細も描かれており、この混合メカニズムは、回転シャフト１１６０に取り付けられたプロペラ１１５０を含むことができる。シャフトを、カートリッジの天板表面１１３５から、シャフトを自由に回転させることのできるベアリング構造を通して、延在させることができる。プロペラ１１５０が磁気成分を含んでいるならば、カートリッジ１０００の外部の回転磁場によって、混合動作を達成することができる。印加される磁場ｍｙによってプロペラの運動が駆動され、それによりシャフト１１６０においてプロペラが回転させられる。別の選択肢として、機械的な結合部をモータと係合させることができ、この場合にはモータによってシャフト１１６０が回転させられる。このように本発明において用いられる細胞分別システム１は、以下のような使い捨てカートリッジ１０００を含むことができる。すなわちこの使い捨てカートリッジ１０００はさらに、シャフトに取り付けられたプロペラを含むことができ、この場合、プロペラ１１５０は試料貯蔵器２０内に配置される。プロペラ１１５０は磁気材料を含むことができ、可変の磁場と相互作用をし、さらにこの可変の磁場がプロペラ１１５０をシャフト１１６０上で回転させ、それによって試料貯蔵器２０の内容物が混合される。択一的に、細胞分別システム１は、シャフト１１６０を回転させる機械的結合部によって回転させられるプロペラ１１５０を含むこともでき、これはモータによって駆動される。

インターポーザー１４００は、そこに形成された通路を有することができ、これは図７において１１２０，１１２２および１１４０として示されており、これらの通路を、図１および図２に示した流路１２０，１２２および１４０と対応させることができる。つまり通路１１２０を、ＭＥＭＳチップソーター１０における通路１２０と連通させることができ、これによって試料貯蔵器２０からＭＥＭＳチップソーター１０への液体通路が形成される。ＭＥＭＳチップソーター１０の下流において、インターポーザー１４００は、可動バルブ１１０から（チップにおける）分別流路１２２および（インターポーザーにおける）分別流路１１２２を介して、（カートリッジにおける）分別貯蔵器２２に至る液体通路を形成することができる。同様にインターポーザー１４００は、可動バルブ１１０から（チップにおける）廃棄流路１４０および（インターポーザーにおける）１１４０を介して、（カートリッジにおける）廃棄貯蔵器４０に至る液体通路を形成することができる。換言すれば、インターポーザー１４００は、使い捨てカートリッジ１０００における分別貯蔵器２２とケイ素基板における分別流路１２２との間の分別液経路と、使い捨てカートリッジ１０００における廃棄貯蔵器４０と廃棄流路１４０との間の廃棄液経路と、試料流路１２０と試料貯蔵器２０との間の試料液経路と、を形成することができる。

インターポーザー１４００の他の目的は、場合によっては少量の分別された物質のための収集領域を提供することである。たとえば、標的細胞は幹細胞などのように希少である可能性があることから、分別貯蔵器２２内に収集される液量も、試料中の標的細胞の頻度に比例して、かなり少量となる可能性がある。したがって、数マイクロリットルのようなごく少量も予想することができる。小さいピペットを用いて簡単に収集できるように、インターポーザー１４００によって、分別流出液がサイフォンを通る領域を形成することもできる。図７には、このサイフォン領域１４５０が示されている。

特にここで述べておきたいのは、サイフォン領域１４５０の床面は分別流路１１２２の底面よりも高さが低い、ということである。したがって、サイフォン動作およびＭＥＭＳチップソーター１０から分別貯蔵器２２へのメニスカス力によってアシストされるようにして液体を流すことができ、分別貯蔵器２２から、皮下注射針またはマイクロピペットにより液体を取り出すことができる。このようなサイフォン動作によって、著しく小さい流路内の少量の流れから発生する可能性のある毛管力を弱めるのを補助することができる。したがって分別貯蔵器２２はさらに、分別貯蔵器２２内の少量の分別液量を収集するサイフォン構造を有することができ、この場合、上述の少量の分別液量は、分別貯蔵器２２の液体総量の約１０％よりも少ない。

ここで重要であるのは、分別流路１１２２を、試料流路１１２０および廃棄流路１１４０よりも相対的に短く形成できることであり、それによってたとえば流路壁への付着に起因する物質の損失量が最小限に抑えられるようになる。

図７の詳細図には接着剤止め１４６０も示されており、次にこれについてカートリッジの組み立てと関連させて説明する。

図７に示されているように試料流路１１２０は、試料貯蔵器２０の一番下から物質を引き出すことができる。このことは、所定量の試料から取り出される物質の収量または割合を最大化するにあたり、重要なことであるといえる。これとは対照的に廃棄流路１１４０は、廃棄空間または廃棄貯蔵器４０の壁の斜面上の一点に、非標的物質を供給することができる。

インターポーザー１４００を、ポリカーボネートポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、またはシクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）から、射出成形、型押し、レーザー加工、または３Ｄプリンティングによって形成することができる。インターポーザー１４００において図６に示した通路１４２０における許容範囲を、約１００〜４００μｍの直径全体に対し、おおよそ±１０μｍとすることができる。ＭＥＭＳチップソーター１０の対応する通路２０を、約５０〜１５０μｍとすることができる。そしてこれらの通路２０および１４２０を、図６の挿入図に示したように、約１０μｍ内で整列させることができる。インターポーザー１４００は、グルー、エポキシ、セメントなど任意の適切な接着剤によって、ケイ素基板に取り付けられる。ＭＥＭＳチップソーター１０を最初に、図９に示されているチップキャビティ１４７０に載置することによって、インターポーザーと接着することができる。ＭＥＭＳチップソーター１０における通路がインターポーザー１４００における通路とほぼオーバラップするように、キャビティ１４７０を十分な精度で形成することができる。許容される不整合を約２０μｍまでとすることができ、これは容易に達成可能である。プリント回路基板製造においてよく知られているピック＆プレースマシンを、このタスクに適したものとすることができる。ＭＥＭＳチップソーター１０を、キャビティ１４７０内で所定の位置に接着することができる。もちろん、ここで述べた材料および方法は具体例にすぎない。他のプラスチックなど他の材料および他の相応の方法も使用することができる。

インターポーザー１４００を、カートリッジ基部１１３０にグルーまたはセメントを用いて取り付けることができ、その際、インターポーザー１４００の位置決め孔１４１０を、カートリッジボディ１０００の対応するポストに対向させて配置する。このグルーまたはセメントは水密でなければならないが、通路１１２０，１１２２または１１４０を妨害しないようにする必要があることから、図７および図８に示されているようにこれらの通路の周囲に、接着剤止め１４６０としていくつかの構造部材を形成することができる。それらの接着剤止め１４６０を、まだ硬化していない液状の接着剤が小さい流路１１２０，１１２２および１１４０に侵入しないようにするために用いることができる。これらの構造部材１４６０を、プラスチック材料から成る***したリッジとすることができ、このリッジによって、流路または他の凹部へ液体が侵入するのが阻止される。特に接着剤を、インターポーザー１４００とカートリッジボディ１０００の他の部分とのインターフェースへのアクセスを可能にするポート中に、注入することができる。接着剤は毛管作用でこの領域の周囲に滲出するが、図７および図８ａの斜視図に示されているように、マイクロ流体通路１１２０，１１４０および１１２２を取り囲む接着剤止め１４６０によって、接着剤をそれらの通路の外側に保持することができる。これらの接着剤止めによって、インターポーザー１４００とカートリッジボディ１０００の残りの部分との間のインターフェースの厚さが、約５〜５０μｍから０．２〜２μｍに低減され、これによって接着剤止めを越えてマイクロ流体通路中に接着剤が流れ込むのを阻止する毛管作用が生じる。なお、これらの寸法は具体例にすぎず、このような詳細な点は適用事例の仕様に左右されることを理解されたい。使用する接着剤の種類に応じて、液状の接着剤をたとえば熱、圧力または紫外線照射によって硬化させることができる。

図９は、インターポーザー１４００の表側を簡略化して示す斜視図である。この面には、ＭＥＭＳチップソーター１０のための載置領域１４７０が含まれている。ＭＥＭＳチップソーター１０を、グルーまたはさもなければボンドにより、載置領域１４７０の構造部材に接着することができる。

インターポーザーの寸法の具体例は、長さ１６ｍｍ、幅６ｍｍ、高さ１ｍｍである。廃棄貯蔵器および試料貯蔵器を、直径２ｍｍとすることができる。また、試料流路１１２０、分別流路１１２２および廃棄流路１１４０を、それぞれ３００μｍの幅とすることができる。さらに接着剤止めの高さを、約２０μｍとすることができる。

したがってカートリッジ１０００の製造方法は、以下のステップを含むことができる。すなわち、
１）ＭＥＭＳチップソーター１０をインターポーザー１４００に接着するステップ、
２）インターポーザー１４００をカートリッジ１０００の位置決めピンに配置するステップ、
３）インターポーザー１４００を押圧するステップ、
４）インターポーザー１４００とカートリッジ１０００との間のギャップに接着剤を導入するステップ、
５）紫外線により接着剤を硬化するステップ、
６）カートリッジ基部１１３０を、たとえばグルー、セメント、または超音波溶接などによって、カートリッジ天板１１３５に取り付けるステップ。

なお、自明のとおり、ステップ１〜６をここに示した順序で実行しなくてもよい。たとえば、カートリッジ基部１１３０をカートリッジ天板１１３５に取り付けてから、ＭＥＭＳチップ１０またはインターポーザー１４００を取り付けてもよい。

細胞分別方法の別の実施形態によれば、使い捨てカートリッジおよび／またはインターポーザーはさらに、インタロゲーション手段を較正する少なくとも１つの較正領域を有する。

図１０は、較正領域を含むインターポーザー１４００の概略図である。インターポーザー１４００は、較正プロセスに用いられる領域１４８０を有することができる。これらの領域１４８０は、事前に規定された特定の光学特性または蛍光特性を有することができ、これらの特性が光学系の較正または補償調整に用いられる。このため領域１４８０を、１つまたは複数の蛍光物質によって形成することができ、あるいは１つまたは複数の蛍光物質がこれらの表面に付加（印刷）される。別の選択肢として、マイクロ流体構造を利用して、１つまたは複数の蛍光液をこれらの較正領域に案内して蓄積させることができる。このためそれらの蛍光液を、インターポーザー上の様々なポジションに塗布することができる。図１１は、較正領域１４８０を備えたインターポーザー１４００の上述のような変形実施形態を示す断面図である。このインターポーザーは、上述のような試料流路１１２０を有することができ、この流路によって試料液がＭＥＭＳチップソーター１０へ運ばれる。ついで試料液を、較正領域１４８０内に送ることができる。

ここで較正とは、等価の蛍光染色を有する懸濁物質が複数の機器に関して時間が経過する中で首尾一貫して検出されるようにする、ということである。このことは、既知の蛍光性を有する物質の強度を測定することにより達成される。この場合、異なる実行時の較正粒子を用いるのではなく、カートリッジ内のインターポーザー上またはインターポーザー内の較正領域からの蛍光体を照射して検出することによって、このことが行われる。システムパフォーマンスを制御または維持するために、較正を任意の時間に実行することができ、たとえば分別処理を開始する前にシステムにカートリッジを挿入した後に、または分別処理中に、実行することができる。

既知の蛍光物質に対し較正を行うことによって、予め規定された標的強度を本発明のシステムによって調整することができる。１つの反復プロセス中に複数回、較正を実行することができ、さらにシステムパフォーマンスの特性決定および検証に利用することができる。

較正領域のために用いられる蛍光物質は、以下のように選定される。すなわち、それらの蛍光物質を、システムで用いられる少なくとも１つの蛍光検出流路において、最もよいのはすべての蛍光検出流路において、検出できるようにし、さらにそれらの蛍光強度（絶対輝度）が、処理対象物質の蛍光強度（絶対輝度）と少なくとも同じオーダーの大きさであるようにする。較正領域のための蛍光物質として特に適しているのは、クマリン６、ナイルレッド、および／またはボディピー６５０である。

本発明の別の実施形態によれば、細胞物質の気泡および凝集が捕捉されないように、インターポーザーの液体流路のジオメトリーが設計されている。したがって液体の特性に関して、流路のジオメトリーを最適化することができる。これには、デッドボリュームの最小化、アンダーカットおよびラウンドコーナーの回避を含めることができる。さらに、チップとの、および／またはカートリッジのメインボディとのインターフェースにおける流路のジオメトリーを、流路直径が流れ方向で常に増加していくように設計することができる。このような設計要素によって、液体流路内部における細胞物質の凝集を回避することもできる。

さらに、インターポーザー内の流路において主流路の底部に小さい流路（「流路内の流路」）を設けることによって、気泡の捕捉の回避を達成することができる。小さい流路の深さと幅を、この流路が配置される流路の５〜２０％とすることができる。図８ｂには具体例として、流路１１２２および１１４０といったインターポーザーの流路の底部に設けられた小さい流路１４９０が示されている。主流路を塞ぐ気泡は、表面張力に起因して小さい流路には入ることができず、小さい流路は液流のために開放状態に維持される。図８ｃには、気泡の捕捉を回避する他の変形実施形態が示されており、これによればサイフォンへと向かう流路１１２２が、サイフォン内へと導かれる傾斜部分のような形状に形成されており、これによって鋭いエッジが回避される。

このようにインターポーザーは、少なくとも１つの流路の底部に配置された付加的な小さい流路を備えることができ、この場合、小さい流路の深さと幅は、この少なくとも１つの流路の約５〜２０％である。

磁気アクチュエータ
図１、図２および図３を参照しながら説明したシステムのさらに別の観点は、小さいＭＥＭＳチップソーター１０を作動させる、厳密に局在化された磁場の必要性である。

すでに述べたように、図３に示したシステムの作動メカニズムを電磁的なものとすることができる。可動バルブ１１０は著しく小さいことから、磁束発生構造が精密かつローパワーであり、しかも効率的でなければならない、ということが重要である。図１２ａ、１２ｂおよび１２ｃには、この種の構造が示されている。

外部の磁力線（磁束）発生源を、図２および図３に示したように、ＭＥＭＳチップソーター１０の外側に設けることができる。この発生源を電磁石４００とすることができる。電磁石４００は透磁性コア４７０を含むことができ、その周囲にコイル４６０が巻回されている。コイル４６０とコア４７０によって磁場が発生し、この磁場は先端部４５０における磁極から出て発散し、初歩的な電気磁気学から周知のように、反対の磁極に向かって戻る。一般的に言えるのは、放熱の効果を上げるにはコイル４６０の層を少なくし、あるいは磁束を増やすには（アンペア×ターン）、つまりは力を増やし速度を上げるには層を多くする、というトレードオフがある、ということである。１つの実施形態によれば、コイル４６０は１つの層を有するが、磁石ボディは複数のコイル４６０による最大で３つの層を有することが多い。電磁石４００が可動バルブ１１０に近づけられて、コイル４６０が励起されると、コイル４６０とコア４７０は磁束線を発生し、それらの磁束線は先端部４５０から速やかに発散する。このようにして可動部材１１０は一般的には、図１２ａに示されているような電磁石４００の先端部４５０に向かって引き寄せられる。その理由は、透磁性材料は磁束密度が増加している領域に引き入れられるからである。

図１２ａに示されているように、磁石４７０をテーパー形状にすることができ、この形状は、磁束を先端部４５０の周囲領域にさらに集中させるのに役立たせることができる。テーパー角をたとえば、垂直から約０度と約３０度との間とすることができる。この場合、アスペクト比（テーパーの長さ：テーパーの平均幅）を、たとえば約２：１とすることができるが、幅広い形状範囲で設計することができる。ただし、先端部４５０に磁束を集束させるために有利なものとすることができるのは、先端部の直径をテーパー形状における基部の直径よりも小さくすることである。図１２ｂは、電磁石４００の先端部の拡大図であり、これによれば先端部のテーパー形状が正面から示されている。図１２ｃは、テーパー形状部分４５０、コイル４６０および磁石ボディ４７０の斜視図である。

磁気的なモデリングによって示唆されるのは、ほぼ同じオーダーの大きさの高さであれば、ＭＥＭＳチップソーター１０における透磁性部材１１６と近似した幅の電磁石先端部が最適である、ということである。この場合、基部のサイズはテーパー角によって定まる。１つの実施形態によればテーパー形状の基部を、２〜５ｍｍの長さおよび０．５〜２ｍｍの幅とすることができる。テーパー形状の先端部を基部よりも小さくすることができ、約１．０ｍｍ×０．７ｍｍまたは少なくとも約０．４ｍｍ×０．２ｍｍの長方形の寸法とすることができる。なお、これらの寸法は具体例にすぎず、このような詳細な点は適用事例の仕様に左右されることを理解されたい。

カチオン非依存性ヌクレアーゼを製造するためのプロセス
図１３には、カチオン非依存性ヌクレアーゼのための適切な製造方法が示されている。ステップＳ１００でプロセスを開始する。ステップＳ２００において、ＤＮＡ分解タンパク質（ヌクレアーゼ）のためのコード配列を、誘導性プロモーターの制御のもとでプラスミドベクターにクローニングした。ステップＳ３００において、組換えベクターを大腸菌細胞に形質転換した。ステップ４００において、ヌクレアーゼを発現するクローンを選択し、それらから細胞バンクを生成した。組換え大腸菌細胞が液体の複合培地において成長し、組換え遺伝子の発現が誘導されると（ステップＳ５００）、ステップＳ６００において、細胞が細胞のサイトゾル内にヌクレアーゼを発現する。標準的な条件のもとでヌクレアーゼは、いわゆる封入体として不溶性かつ非活性の配座で発現される。温度、誘導時点、発現期間など特定の培養パラメーターを調整することにより、ヌクレアーゼの５０％までを可溶型として１つのステップで発現させることができる。特別に費やされた所定の時間で培養を中止し、沈殿によって細胞を液体媒体から分離する（ステップＳ７００）。分離された細胞を高圧で分断し（ステップＳ８００）、細胞断片および不可溶性タンパク質を、ステップＳ９００において沈殿によって可溶性断片から分離する。可溶性断片（上澄み）を収集し、さらにステップＳ１０００における分取クロマトグラフィーステップにより精製する。その後、ステップＳ１１００において製剤を行い、ステップＳ１２００においてプロセスを終了する。なお、すべてのステップＳ１００〜ステップＳ１２００を必須としなくてもよく、また、これらのステップを必ずしも図示の順序で実行しなくてもよい、ということを理解されたい。

適している可能性のある候補酵素には、たとえば以下が含まれる。すなわち、
・Nuc（サルモネラ由来、複数のＮｕｃ同族体は大腸菌、シトロバクター、ナウチリア（Nautilia）、プロテウスなど他のバクテリア内に存在する）
・GBSV1-NSN（好熱性のバクテリオファージGBSV1由来）
・Bfi I特にＮ末端触媒サブドメイン（バシラス属の制限酵素）
・PC1タンパク質（鶏痘ウィルス由来）
・WSSV-NSN（シュリンプ白斑症ウィルス由来）

これらの酵素は、上述の要求を満たすことができる。これらの酵素をさらにテストするために、これらをクローニングし、組換えにより発現させ、精製して分析することができる。

１）大腸菌におけるヌクレアーゼの組換えによる発現
図１４には、組換え大腸菌細胞の培養および組換えヌクレアーゼ発現後のタンパク質について、ゲル電気泳動法（SDS-PAGE）による分析が示されている。標的タンパク質は矢印でマークされている。活性型は、約４０ｋＤａのホモダイマーであり、モノマーは約２０ｋＤａのサイズである。二量体タンパク質の約５０％が、可溶性断片として検出された。
・レーン１：規定サイズのマーカータンパク質
・レーン２：可溶性断片
・レーン３：不可溶性断片

２）組換えヌクレアーゼの精製
図１５には、精製後のヌクレアーゼについてゲル電気泳動法（SDS-PAGE）による分析が示されている。活性型は、約４０ｋＤａのホモダイマーであり、モノマーは約２０ｋＤａのサイズである。
・レーン１：規定サイズのマーカータンパク質
・レーン２：精製されたヌクレアーゼ

３）組換えヌクレアーゼの特性決定
精製されたヌクレアーゼの特性を、複数の条件のもとでヌクレアーゼアッセイにおいて決定した。２６０ｎｍの吸光度によって、ヌクレアーゼの活性を測定することができる。ＤＮＡがいっそう小さい断片に分解されると、２６０ｎｍの吸光度が増加する（Kunitz 1950）。したがってOD260値の増加は、ヌクレアーゼの活性と相関する。

製造されたヌクレアーゼは、Mg2+および他の二価のカチオンとの非依存性を示した。その理由は、このヌクレアーゼの活性は、EDTAが存在するときに減少しないことによる。ｐＨ＜６．６の酸性条件のもとで温度＞２１℃のときに、最高度の活性が見られた。

図１６には、組換えヌクレアーゼの活性が、市販のカチオン依存性ヌクレアーゼであるベンゾナーゼおよびＤＮアーゼＩと、ｐＨ５．５のMgSO4を含む酢酸塩緩衝液中で対比されて示されている。

図１７には、Mg2+を含まずｐＨ５．５のEDTAを含む酢酸塩緩衝液において、組換えヌクレアーゼの活性が市販のカチオン依存性ヌクレアーゼであるベンゾナーゼと対比されて示されている。

図１８には、組換えヌクレアーゼの活性の温度依存性が示されている。

図１９には、組換えヌクレアーゼの活性のｐＨ依存性が示されている。

４）結果
微細加工された分別バルブを介してポンピングされた溶解血液を用いたテストによって示されたのは、分別処理中のＭＥＭＳチップの目詰まりを阻止するには、MgCl₂が存在するときに１０Ｕ／ｍＬよりも低いベンゾナーゼの濃度で十分なことである。１００Ｕ／ｍＬよりも高いベンゾナーゼの濃度であっても、それ以上の利点は示されなかった。ベンゾナーゼが存在しないときに実施された同じテストによれば、装置が目詰まりする結果となった。

１ｍｍｏｌ／ｌのEDTAが存在するときに、ベンゾナーゼの代わりに上述のように製造された組換えヌクレアーゼを用いた同じテストによっても、同じ結果が得られた。つまりカチオン非依存性のヌクレアーゼによって、微細加工された分別バルブの目詰まりが首尾よく阻止された。

したがって、カチオン依存性のＤＮアーゼまたはEDTA適合性のＤＮアーゼのようなヌクレアーゼによって、細胞ＤＮＡに起因する粘度が低減され、それによってマイクロ流体スケールの装置を妨害なく作動させることができる。さらにEDTA適合性のＤＮアーゼを用いることによって、EDTAを含有する緩衝剤を利用できるようになる。マイクロ流体スケールであると、カチオンが引き起こす細胞の目詰まりによって、細胞の分別が阻止され、または少なくとも妨害される。よって、カチオンに起因する細胞の目詰まりを阻止するために、EDTAを含有する緩衝剤が有利である。

以上、これまで概要を述べてきた実施形態と関連させて、種々の詳細な点について説明してきたけれども、既に知られたことであっても、または現時点では予見できないこと、あるいは予見できないであろうことであっても、既述の開示内容を参酌すれば、種々の代替案、修正、変更、改善、および／または、実質的に等価の内容を見出すことができる。さらに特定の方法に関する詳細、寸法、物質の使用、形状、製造技術等は、例示を意図して挙げたにすぎず、本発明はそれらの実施形態に限定されるものではない。なお、システムおよび方法を任意の配向で実施できることは自明であるから、頂部、底部、左、右、前、後といった語句は、任意の事項である。したがって、これまで述べてきた実施形態は、例示を意図したものであって、それらに限定されるものではない。

Claims (15)

1. ケイ素基板表面に微細加工された細胞分別バルブにより、前記細胞分別バルブから導かれている微細加工流路と、使い捨てカートリッジと、を用いて、試料から標的細胞と非標的細胞とを分別する方法であって、
   前記細胞分別バルブは、標的細胞である標的粒子を、非標的細胞を含む非標的物質から分離し、
   前記使い捨てカートリッジは、試料貯蔵器と分別貯蔵器と廃棄貯蔵器とを含み、
   前記試料を、ヌクレアーゼを含む緩衝剤において供給する、
   方法。
2. 前記ヌクレアーゼは、カチオン非依存性である、
   請求項１記載の方法。
3. 前記ヌクレアーゼは、カチオン非依存性であり、前記緩衝剤は、カチオンとの錯体を生成可能なキレート剤を含有する、
   請求項１または２記載の方法。
4. 前記ヌクレアーゼは、カチオン依存性である、
   請求項１記載の方法。
5. 前記ヌクレアーゼは、ＤＮアーゼである、
   請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
6. 前記ヌクレアーゼは、非特異性である、
   請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
7. 前記ケイ素基板の前記微細加工流路と前記使い捨てカートリッジの前記貯蔵器との間の流体連通を、インターポーザーによって形成する、
   請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
8. 前記使い捨てカートリッジの前記分別貯蔵器と前記ケイ素基板の分別流路との間の分別流体経路と、前記使い捨てカートリッジの前記廃棄貯蔵器と廃棄流路との間の廃棄流体経路と、試料流路と前記試料貯蔵器との間の試料流体経路とを、前記インターポーザーによって形成する、
   請求項７記載の方法。
9. 前記インターポーザーの流路の底部に付加的な小さい流路を設け、前記付加的な小さい流路は、前記付加的な小さい流路が配置される前記流路の深さおよび幅の５〜２０％である、
   請求項７または８記載の方法。
10. 前記細胞分別バルブは、前記標的粒子を前記試料流路から前記ケイ素基板に形成された前記分別流路へと向かわせ、前記非標的物質を前記試料流路からやはり前記ケイ素基板に形成された前記廃棄流路へと向かわせる、
    請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
11. 前記分別貯蔵器は、さらにサイフォン構造を有しており、前記サイフォン構造は、前記分別貯蔵器の前記サイフォン構造内の少量の分別流体を収集し、前記少量の分別流体は、前記分別貯蔵器の流体総量の約１０％よりも少ない、
    請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
12. 前記試料貯蔵器はさらに、前記試料貯蔵器の壁に形成された漏斗状構造部材を有しており、前記漏斗状構造部材は少量の試料流体を収集し、前記少量の試料流体は、前記試料貯蔵器の流体総量の約１０％よりも少ない、
    請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
13. 前記廃棄貯蔵器はさらに、前記廃棄貯蔵器の壁に形成された漏斗状構造部材を有しており、前記漏斗状構造部材は少量の廃棄流体を収集し、前記少量の廃棄流体は、前記廃棄貯蔵器の流体総量の約１０％よりも少ない、
    請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
14. 前記試料流路は、インタロゲーション手段を含み、前記インタロゲーション手段は、前記試料流路において前記標的粒子を前記非標的物質から区別する、
    請求項１から１３までのいずれか１項記載の方法。
15. 前記インタロゲーション手段は、レーザー誘起蛍光システムのレーザーを含み、標的粒子に蛍光標識を付着し、前記蛍光標識は前記レーザーにより照射されると蛍光信号を発生する、
    請求項１４記載の方法。

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