JP6731668B2

JP6731668B2 - 顕微鏡観察方法及び顕微鏡観察補助装置

Info

Publication number: JP6731668B2
Application number: JP2016155245A
Authority: JP
Inventors: 佐藤　主税; 主税佐藤
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2016-08-08
Filing date: 2016-08-08
Publication date: 2020-07-29
Anticipated expiration: 2036-08-08
Also published as: JP2018026197A

Description

本発明は、顕微鏡のステージ上で溶液中の試料を観察する方法及びその補助装置に関し、特に、試料の位置を安定させて高い分解能での顕微鏡観察を与える方法及びその顕微鏡観察補助装置に関する。

正立型に対して倒立型の光学顕微鏡が知られている。これはステージの下側に対物レンズが上向きに取り付けられており、例えば、生物試料のような溶液中に浮いた有機物試料であっても、ステージ上に置かれたシャーレの中に試料を入れて下から観察できる。このとき、対物レンズと試料との間にシャーレ底の薄いガラス層だけでなく溶液も存在するため、対物レンズ-試料間距離を小さく出来ず分解能が出ない。そこで、シャーレの底に試料だけを何らかの方法で沈降させ密着させることで高分解能観察することも行われている。

ところで、電子線を下から上に向けて発射する倒立型の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）も提案されている。しかしながら、電子銃からの電子線の経路を一定以上の高い真空状態に維持する必要があって光学顕微鏡に比べて構造が複雑となる。

例えば、非特許文献１では、このような倒立型ＳＥＭとして、開放型の試料室を有する大気圧ＳＥＭについて述べられている。上側の光学顕微鏡部と下側のＳＥＭ部とを試料を挟んで同軸に配置して、同一視野で光学顕微鏡観察とＳＥＭ観察とを同時に与えることができるとしている。光学顕微鏡部とＳＥＭ部とを隔てる隔壁には電子線の通過する貫通穴が設けられており、電子線の透過可能な程度に非常に薄い膜がこれを閉塞している。この薄い膜は試料ステージを構成しており、この上に試料が配置される。つまり、試料は光学顕微鏡部側に配置されて大気圧下にあるため、試料に関わりなくＳＥＭ部側を真空引きできて、電子線の安定性に優れるから高分解能なＳＥＭ観察が可能となる。

一方で、上記した倒立型大気圧ＳＥＭでは、光学顕微鏡部側とＳＥＭ部側とを隔てる電子線透過膜を介して電子線が試料に照射されるため、かかる電子線透過膜の電子線透過性を高めるように薄く形成する必要がある。一方で、膜両側の気圧差に耐えるだけの機械強度を有することも必要となる。

そこで、例えば、特許文献１では、機械強度が高く薄くともこのような気圧差に耐え得るＳｉＮ膜を用いたディッシュが開示されている。これによれば、倒立型ＳＥＭを用いてディッシュ上の生物試料等を高分解能でＳＥＭ観察できる。

特開２００８−２６７８８９号公報

小椋ら；大気圧電子顕微鏡ＡＳＥＭによる水中観察法の開発；シンセシオロジー、第８巻、Ｎｏ．３、第１１６〜１２６頁

上記したような倒立型大気圧ＳＥＭにおいて生物試料のような溶液中の有機物試料を観察するとき、試料がディッシュの電子線透過膜から浮き上がってしまうと、電子線が急激に減衰して分解能を低下させてしまう。そこで、試料の位置を電子線透過膜の上で安定させて観察する必要がある。

本発明は、上記したような状況に鑑みてなされたものであって、その目的とするところは、顕微鏡での観察において、生物試料のような溶液中の有機物試料の位置を安定させて高い分解能での顕微鏡観察を与え得る方法及びその顕微鏡観察補助装置に関する。

本発明による観察方法は、顕微鏡のステージ上で溶液中の試料を観察する方法であって、前記ステージ上に前記試料を含む前記溶液を滴下し、これを前記ステージ上で覆うように弾性フィルムを載せ、前記ステージ及び前記フィルムの間を脱気しつつ前記溶液を排出せしめて前記試料を前記ステージに押し付けることを特徴とする。

かかる発明によれば、溶液中の試料の位置を電子線透過膜のようなステージ上に安定させるように溶液を排出させつつ押圧して、高い分解能の顕微鏡観察を与え得るのである。

上記した発明において、前記顕微鏡は、走査型電子顕微鏡であることを特徴としてもよく、前記走査型電子顕微鏡は倒立型であることを特徴としてもよい。また、前記弾性フィルムはこれを間に介して前記試料を光学顕微鏡観察できる光透過性を有することを特徴としてもよい。かかる発明によれば、光学顕微鏡観察をも合わせて行うことができ、ＳＥＭによる観察の補助を与え得るのである。

上記した発明において、前記弾性フィルムはシリコンゴムであることを特徴としてもよい。また、前記弾性フィルムは風船体であって、前記風船体を前記溶液の上に載せた上で、前記風船体を覆うように前記ステージ上に与えたカップの内部を減圧することを特徴としてもよい。かかる発明によれば、試料を痛めることなく溶液を効率よく排出できて、試料の位置を電子線透過膜のようなステージ上に安定させて、高い分解能の顕微鏡観察を与え得るのである。

上記した発明において、前記風船体は前記カップの外部と通じる管路を有しその内部圧力を制御されることを特徴としてもよい。かかる発明によれば、より溶液を効率よく排出できて、試料の位置を電子線透過膜のようなステージ上に安定させて、より高い分解能の顕微鏡観察を与え得るのである。

本発明による観察補助装置は、顕微鏡のステージ上で溶液中の試料を観察するための補助装置であって、前記ステージ上に滴下された前記試料を含む前記溶液を前記ステージ上で覆うように与えられる弾性フィルムと、前記ステージ及び前記フィルムの間を脱気する脱気手段と、とからなり、前記溶液を排出せしめて前記試料を前記ステージに押し付け可能とすることを特徴とする。

上記した発明において、前記弾性フィルムはシリコンゴムであることを特徴としてもよい。また、前記弾性フィルムは風船体であって、前記風船体を前記溶液の上に載せた上で、前記風船体を覆うように前記ステージ上に与えられるカップと、前記カップの内部を減圧する減圧手段とを含むことを特徴としてもよい。かかる発明によれば、試料を痛めることなく溶液を効率よく排出できて、試料の位置を電子線透過膜のようなステージ上に安定させて、高い分解能の顕微鏡観察を与え得るのである。

上記した発明において、前記風船体は前記カップの外部と通じる管路を有しその内部圧力を制御可能としていることを特徴としてもよい。かかる発明によれば、より溶液を効率よく排出できて、試料の位置を電子線透過膜のようなステージ上に安定させて、より高い分解能の顕微鏡観察を与え得るのである。

上記した発明において、前記カップは前記ステージに吸着する吸盤体であることを特徴としてもよい。かかる発明によれば、より溶液を効率よく排出できて、試料の位置を電子線透過膜のようなステージ上に安定させて、より高い分解能の顕微鏡観察を与え得るのである。

倒立顕微鏡の構造を示す図である。本発明の動作原理を示す図である。図２の要部の断面図である。本発明の実施例を示す図である。比較例としての生体試料の走査電子顕微鏡写真である。図４の装置を用いて観察した図５と同様の生体試料の走査電子顕微鏡写真である。

以下に、本発明による１つの実施例である倒立型走査電子顕微鏡のステージ上で溶液中の試料、特に、生物試料のような溶液中の有機物試料の観察方法について、図１乃至図３を参照しつつ、説明する。

図１に示すように、顕微鏡１は、大気圧走査電子顕微鏡（ＡＳＥＭ：Atmospheric Scanning Electron Microscope）とも称され、試料室を低真空もしくは大気圧に解放しているものである。このことから、真空中に配置するには前処理を必要とするような試料、例えば、生物試料のような溶液中の有機物試料の観察に適している。

顕微鏡１は、上部の光学顕微鏡部Ａと、下部の真空チャンバ２１を含む走査電子顕微鏡部Ｂと、からなる。

真空チャンバ２１の上面には、駆動機構を図示していないが可動ステージ１０が取り付けられ、この上には、ディッシュ１２が配置されて水平面内を移動自在である。ディッシュ１２の中央部には窓１５が設けられて、電子線透過膜１４がこれを閉塞している。電子線透過膜１４は電子線を透過可能な程度に一部又は全体が薄く形成された薄膜体である一方、真空チャンバ２１内部の真空引きによる負圧によっても破壊しない程度の強度を有する薄膜である。このような薄膜としては、無機材料系薄膜、例えば、ＳｉＮからなる薄膜などが知られている。

光学顕微鏡部Ａでは、ディッシュ１２の電子線透過膜１４の上に試料２が配置されて、その上方から、対物レンズ３が上下左右動して光学顕微鏡観察を与える。なお、接眼レンズ等については図示しない。

走査電子顕微鏡部Ｂでは、真空チャンバ２１は真空ポンプを含む真空手段２１ａによってその内部を真空引き可能となっており、制御部２２ａからの制御に基づいて電子銃２２から電子線が上方に向けて発射される。電子銃２２からの電子線は、電子線透過膜１４を透過して試料２に照射される。試料２からの反射電子線等は、電子検出器２３で検出され、適宜、画像表示手段２３ａで走査電子顕微鏡観察を与える。

ここで、図２（ａ）に示すように、試料２は、溶液２ａ中にあって液滴Ｓｐとして電子線透過膜１４上にある。このとき、溶液２ａ中で試料２は浮遊し得るから、その位置が安定せず高い分解能を持って電子顕微鏡得観察することができない。そこで、試料２を観察ステージとなる電子線透過膜１４上に押圧してその位置を安定させることが必要となる。

図２（ｂ）に示すように、空気等でわずかに膨らませたシリコンゴムのような弾性フィルムからなる風船体３２を入れたカップ３０を液滴Ｓｐの上にかぶせ、カップ３０の内部を図示しない減圧手段により脱気、減圧する。風船体３２は内圧によって膨らむとともに、カップ３０の内周に沿って形状が規制され、液滴Ｓｐに浮遊する試料２を電子線透過膜１４に押圧させるのである。このとき、試料２を破壊しない程度に風船体３２の内圧とカップ３０の脱気・減圧状態を制御することが好ましい。

減圧手段によるカップ３０の内部の脱気、減圧は、走査電子顕微鏡部Ｂの真空チャンバ２１のような減圧とは程度において全く異なることは言うまでも無い。なお、風船体３２の膨らむ状態によってカップ３０内の空間が小さくなって液滴Ｓｐの溶液２ａだけがカップ３０の外部に排出されるようにすることが好ましい。

更に、図３には、液滴Ｓｐ中の試料２が電子線透過膜１４に押圧される様子をより詳細に示した。

図３（ａ）に示すように、カップ３０内の脱気前もしくは脱気初期には、風船体３２の弾性フィルムが液滴Ｓｐを電子線透過膜１４の上で軽く包囲するように、つまり、これに「のっかる」ように存在することが好ましい。これには、シリコンゴムのような弾性フィルムの可撓性と内圧が調整されることになる。

図３（ｂ）に示すように、カップ３０内を脱気していくと、溶液２ａが外へ向けて排出され、試料２が電子線透過膜１４に押圧される。このとき、試料２を風船体３２の弾性フィルムが包み込むようにすることで試料２の電子線透過膜１４上での位置がより安定するとともに、溶液２ａが試料２と電子線透過膜１４との間に介在せず、電子線の透過をより良好にする。つまり、より高分解能な走査電子顕微鏡観察を可能にするのである。

また、風船体３２の弾性フィルムが光透過性をも有する素材であれば、これを間に介して試料２を上方から光学顕微鏡観察も出来て、走査電子顕微鏡観察の観察補助を与えるのである。

以上述べてきた実施例によれば、溶液２ａ中の試料２の位置を電子線透過膜１４のようなステージ上に安定させるように溶液２ａを排出させて押圧し、走査電子顕微鏡による高い分解能の観察を与え得るのである。

次に、上記した実施例の更に他の実施例による走査電子顕微鏡観察の様子について述べる。

図４（ａ）に示すように、顕微鏡観察補助装置５０は、電子線透過膜１４を含むステージに吸い付く蛇腹状の吸盤４０ｂを有するカップ４０と、その内部のシリコンゴムからなる風船体３２とからなる。

カップ４０の吸盤４０ｂには、ドイツシュマルツ社製のＦＳＧＡ２２包装機械向けＰＶＣ製吸着パッドを用いた。これにシリコンチューブ４０ａを接続し、ポンプ（図示せず）に接続した。また、風船体３２には、株式会社高研社製の後鼻腔用バルーンＢタイプ＃３２０４を用い、これにシリコンチューブ３２ａを接続し、カップ４０のシリコンチューブ４０ａの内部を通って途中の穴から外部に引き出した。なお、穴の周囲はシリコン用接着剤で密封し、空気が漏れないようにした。

まず、水２ａ中に試料２（マウスから肺を取り出して厚切り切片とした。肺組織には転移した乳ガン細胞を含む。）を与えた液滴Ｓｐを電子線透過膜１４上に滴下する。そして、液滴Ｓｐを覆うようにして吸盤４０ｂを被せた。風船体３２のシリコンチューブ３２ａを閉じて、吸盤４０ｂの内部をシリコンチューブ４０ａから脱気、減圧して行くと、風船体３２を電子線透過膜１４に押し付けるようにしつつ、吸盤４０ｂの高さが減じられていく。このとき、風船体３２の弾性フィルムが内圧によって吸盤４０ｂの内面に沿って膨らむとともに、吸盤４０ｂの収縮と釣り合って停止する。また、吸盤４０ｂの先端部４０ｂ’がめくれ上がるようにして、水２ａを外部に排出しつつ、試料２を電子線透過膜１４上に押圧する。

なお、風船体３２のシリコンチューブ３２ａから空気を出し入れすることで、試料２の電子線透過膜１４上への押圧力を調整できる。

図５及び図６には、それぞれ上記した顕微鏡観察補助装置５０を用いていないとき、及び用いたときの走査電子顕微鏡観察における写真を示している。図６では、視野全体にフォーカスが合っており広範囲に観察が可能である。図６（ｂ）の白矢印で示される小さな核は正常肺胞細胞の核であり、図６（ｃ）の白矢印は転移してきた乳がん細胞の大きな核を表している。一方、図５では、左下の一部以外は暗くなっており、ジャストフォーカスの範囲が非常に狭い。これは水２ａ中で試料２が浮遊しており、試料２を電子線透過膜１４上に押圧出来ていないためである。

このように、顕微鏡観察補助装置５０を用いることで容易に高分解能の走査電子顕微鏡観察を行うことが出来るようになるのである。なお、顕微鏡観察補助装置５０は、電子線透過膜１４上に下方から試料２を押圧するような場合であっても、これを上方に向けて設置することで対応できる。

ここで、例えば、走査電子顕微鏡だけでなく、高分解能光学顕微鏡や超解像光学顕微鏡などの各種顕微鏡であっても、薄膜ガラス越しに反ってくる蛍光からの像を形成するものであれば同様に観察を行うことが出来る。また、光学システムが上下逆転して全体として正立している高分解能光学顕微鏡でも、本装置は同様に用い得るであろう。

以上、本発明による実施例及びこれに基づく変形例を説明したが、本発明は必ずしもこれに限定されるものではなく、当業者であれば、本発明の主旨又は添付した特許請求の範囲を逸脱することなく、様々な代替実施例及び改変例を見出すことができるであろう。

１顕微鏡
２試料
２ａ溶液
３対物レンズ
１０可動ステージ
１２ディッシュ
１４電子線透過膜
１５窓
２１真空チャンバ
２２電子銃
２３電子検出器
２３ａ画像表示手段
３０、４０カップ
３２風船体
４０ｂ吸盤
５０顕微鏡観察補助装置
Ａ光学顕微鏡部
Ｂ走査電子顕微鏡部

Claims

倒立型走査電子顕微鏡のステージ上で溶液中の試料を観察する方法であって、
前記ステージ上の電子線透過膜に前記試料を含む前記溶液を滴下し、弾性フィルムからなる風船体を入れたカップを前記ステージ上で前記溶液の上にかぶせ、前記カップ及び前記ステージの内部を脱気し前記風船体を膨らませ、前記溶液を前記カップの外部へと排出せしめつつ前記試料を前記電子線透過膜に押し付け、前記電子線透過膜を介して電子線を前記試料に照射して観察を行うことを特徴とする顕微鏡観察方法。
前記弾性フィルムはこれを間に介して前記試料を光学顕微鏡観察できる光透過性を有することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡観察方法。
前記弾性フィルムはシリコンゴムであることを特徴とする請求項１又は２に記載の顕微鏡観察方法。
前記風船体は前記カップの外部と通じる管路を有しその内部圧力を制御されることを特徴とする請求項１乃至３のうちの１つに記載の顕微鏡観察方法。
倒立型走査電子顕微鏡のステージ上で溶液中の試料を観察するための補助装置であって、
弾性フィルムからなる風船体を入れられ前記ステージ上の電子線透過膜に滴下される前記試料を含む前記溶液の上にかぶせられるカップと、前記カップ及び前記ステージの内部を脱気する脱気手段と、とからなり、前記カップを前記ステージ上で前記溶液の上にかぶせ、前記カップ及び前記ステージの内部を脱気し前記風船体を膨らませ、前記溶液を前記カップの外部へと排出せしめつつ前記試料を前記電子線透過膜に押し付け可能とすることを特徴とする顕微鏡観察補助装置。
前記弾性フィルムはこれを間に介して前記試料を光学顕微鏡観察できる光透過性を有することを特徴とする請求項５記載の顕微鏡補助装置。
前記弾性フィルムはシリコンゴムであることを特徴とする請求項５又は６に記載の顕微鏡補助装置。
前記風船体は前記カップの外部と通じる管路を有しその内部圧力を制御可能としていることを特徴とする請求項５乃至７のうちの１つに記載の顕微鏡観察補助装置。
前記カップは前記ステージに吸着する吸盤体であることを特徴とする請求項８記載の顕微鏡補助装置。