JP6729963B2 - ピペコリン酸4位水酸化酵素およびそれを利用した4−ヒドロキシアミノ酸の製造法 - Google Patents
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Description
配列番号2、4、6、8、10または12に記載のアミノ酸配列はそれぞれ、フザリウム オキシスポラム(Fusarium oxysporum)Fo5176、アスペルギルス オリザ(Aspergillus oryzae)RIB40株、ペニシリウム クリソゲヌム(Penicillium chrysogenum) Wisconsin 54-1255株、ギベレラ ゼアエ(Gibberella zeae:別名Fusarium graminearum) PH-1株、コレトトリクム グロエオスポリオイデス(Colletotrichum gloeosporioides) Nara gc5株、アスペルギルス ニデュランス(Aspergillus nidulans:別名Emericella nidulans) FGSC A4株のゲノム配列情報に基づき、タンパク質をコードすると予測されたDNA配列の翻訳アミノ酸配列GenBank accession No. EGU81245、XP_001827566、XP_002558179、XP_383389、ELA34460およびXP_659994と同一である。いずれのタンパク質もカビ由来であるため、存在する場合は発現後糖鎖修飾を受けた状態である可能性が高いが、実際に単離するなどして存在を確認した報告例は無く、これらの機能についても全く不明であった。
しかしながら、これらの手法はそれぞれ、原料が高価で工程数が多い、適用できる化合物種が少ない、精製の負荷が大きいなどの問題を抱えており、より効率的な合成法が求められていた。
[1]2−オキソグルタル酸および2価鉄イオンの存在下、L−ピペコリン酸に作用してtrans−4−ヒドロキシ−L−ピペコリン酸を生成する活性を有するピペコリン酸4位水
酸化酵素タンパク質。
[2]以下の(A)、(B)および(C)からなる群より選択される[1]のピペコリン酸4位水
酸化酵素タンパク質:
(A) 配列番号2、4、6、8、10、12、16または18で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(B) 配列番号2、4、6、8、10、12、16または18で表されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列を有し、ピペコリン酸4位水酸化酵素活性を有するポリペプチド;または
(C) 配列番号2、4、6、8、10、12、16または18で表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ピペコリン酸4位水酸化酵素活性を有するポリペプチド。
[3]糖鎖付加能を持たない宿主により組換えタンパク質として製造された[2]に記載のピペコリン酸4位水酸化酵素タンパク質。
[4]α−アミノ酸に、[1]〜[3]のいずれかに記載のピペコリン酸4位水酸化酵素タンパク質またはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られた培養液を作用させて、4−ヒドロキシアミノ酸を生成させることを特徴とする、4−ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
[5]前記α−アミノ酸が下記一般式(I)で表され、前記4−ヒドロキシアミノ酸が下記
一般式(II)で表される、[4]に記載の4−ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
を示し、R2はR5もしくはアミノ基の窒素原子と結合して環構造を形成してもよい。
を示し、R2はR5もしくはアミノ基の窒素原子と結合して環構造を形成してもよい。
[6]前記α−アミノ酸がピペコリン酸であり、前記4−ヒドロキシアミノ酸が4−ヒドロキシ−L−ピペコリン酸である、[4]に記載の4−ヒドロキシアミノ酸の製造方法。[7]前記ピペコリン酸4位水酸化酵素を含む細胞が、ピペコリン酸4位水酸化酵素タンパク質をコードするDNAで形質転換された細胞である、[4]〜[6]のいずれかに記載
の4−ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
[8]前記ピペコリン酸4位水酸化酵素タンパク質をコードするDNAは、以下の(D)、(E)
および(F)からなる群より選択される、[7]に記載の4−ヒドロキシアミノ酸の製造
方法:
(D) 配列番号1、3、5、7、9、11、15または17で表される塩基配列を有するDNA;
(E) 配列番号1、3、5、7、9、11、15または17で表される塩基配列において1または数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列を含み、かつピペコリン酸4位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA;
(F) 配列番号1、3、5、7、9、11、15または17で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつピペコリン酸4位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
[9]以下の(D)、(E)および(F)からなる群より選択されるピペコリン酸4位水酸化酵
素タンパク質をコードするDNAで形質転換された微生物:
(D) 配列番号1、3、5、7、9、11、15または17で表される塩基配列を有するDNA;
(E) 配列番号1、3、5、7、9、11、15または17で表される塩基配列において1または数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列を含み、かつピペコリン酸4位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA;
(F) 配列番号1、3、5、7、9、11、15または17で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつピペコリン酸4位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
[10]エシェリヒア属、バチルス属、シュードモナス属およびコリネバクテリウム属から選択される、[9]に記載の微生物。
<ピペコリン酸4位水酸化酵素およびそれを用いた4−ヒドロキシアミノ酸の製造方法>
本発明のピペコリン酸4位水酸化酵素は、配列番号2、4、6、8、10、12、16または18に記載のアミノ酸配列を有するもの、または該アミノ酸配列のホモログであってピペコリン酸4位水酸化酵素活性を有するものである。
配列番号2、4、6、8、10または12に記載のアミノ酸配列はそれぞれ、フザリウム オキシスポラム(Fusarium oxysporum)c8D株、アスペルギルス オリザ(Aspergillus oryzae) RIB40株、ペニシリウム クリソゲヌム(Penicillium chrysogenum) Wisconsin 54-1255株、ギベレラ ゼアエ(Gibberella zeae:別名Fusarium graminearum) PH-1株、コレトトリクム グロエオスポリオイデス(Colletotrichum gloeosporioides) Nara gc5株、アスペルギルス ニデュランス(Aspergillus nidulans:別名Emericella nidulans) FGSC A4株由来であり、本発明においてピペコリン酸4位水酸化酵素であると同定されたタンパク質のアミノ酸配列である。配列番号16または18に記載のアミノ酸配列は日本国内の土壌サンプル中から直接回収されたDNAの解析から得られた配列であり、本発明においてピペコリン酸4位水酸化酵素であると同定されたタンパク質のアミノ酸配列である。配列番号16に記載のアミノ酸配列はVariovorax paradoxus EPS由来の機能未知タンパク質(GenBank accession No. YP_004156498)と97%の相同性を示すが、機能が確認された報告例はない。また、配列番号18に記載のアミノ酸配列はBurkholderia sp A1由来の機能未知タンパク質(GenBank accession No. WP_029951026)と50%の相同性を示すが、機能が確認された報告例はない。
いずれの配列も配列情報のみからはピペコリン酸の水酸化酵素と推測することは困難であり、本発明において初めてピペコリン酸4位水酸化酵素であると同定されたものである。
なお、ピペコリン酸4位水酸化酵素は複数用いてもよい。
また、ピペコリン酸4位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号1、3、5、7、9、11、15または17の塩基配列を含むDNAのホモログでもよい。このようなホモログとしては、例えば、配列番号1、3、5、7、9、11、15または17の塩基配列において1または数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列を含むものが挙げられる。
ここでいう1または数個の塩基とは、例えば、1〜300個、好ましくは1〜150個、より好ましくは1〜60個、さらに好ましくは1〜30個、特に好ましくは1〜15個、の塩基である。
ピペコリン酸4位水酸化酵素を含む細胞としては、もともとピペコリン酸4位水酸化酵素を有する微生物などの細胞を用いてもよいが、ピペコリン酸4位水酸化酵素をコードする遺伝子で形質転換された細胞を用いることが好ましい。
ピペコリン酸4位水酸化酵素を含む細胞の調製物としては、例えば、該細胞をアセトン、ジメチルスルホキシド(DMSO)、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の細胞調製物、細胞中の酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を用いることができる。
ンディダ(Candida)属などに属する宿主ベクター系の確立されている酵母。
上記の微生物の中で特に好ましい微生物として、糖鎖付加能を持たないエシェリヒア属、バチルス属、シュードモナス属およびコリネバクテリウム属の微生物が挙げられる。
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が確立されており、特に蚕を用いた昆虫などの動物中(Nature 315, 592-594 (1985))や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系、および大腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽などの無細胞タンパク質合成系を用いた系が確立されており、好適に利用できる。
ここで、反応基質であるα−アミノ酸は4位において水酸基に置換し得る水素原子を有するものであれば特に制限されないが、以下の一般式(I)で表される化合物が例示される。また、4−ヒドロキシアミノ酸としては、以下の一般式(II)で表される化合物が例示される。なお、α−アミノ酸および4−ヒドロキシアミノ酸はL体またはD体であることが好ましいが、ラセミ体であってもよい。
一般式(I)および(II)においては、R1、R2、およびR5はそれぞれ水素原子または炭素数1〜3のアルキル基を示し、R3およびR4はそれぞれ水素原子、炭素数1〜3のアルキル基、またはヒドロキシル基を示す。R2はR5またはアミノ基の窒素原子と結合して環構造を形成してもよい。
水性媒体としては、水または緩衝液が挙げられる。ここで、緩衝液としては、ピペコリン酸4位水酸化酵素の活性を阻害しない緩衝液であれば特に制限されないが、例えば、リン酸緩衝液、MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid)緩衝液などが例示される。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、1−プロパノール、2−プロパノール、1−ブタノール、tert−ブタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等、反応基質の溶解度が高い物を使用することができる。有機溶媒としてはまた、反応副産物の除去等に効果のある酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、n−ヘキサン等を使用することもできる。
反応に必要な2−オキソグルタル酸は、通常、基質と等モルまたはそれ以上、好ましくは等モル〜1.2倍モルの範囲で添加する。2−オキソグルタル酸は、反応開始時に一括して添加してもよいが、酵素への阻害作用があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。または2−オキソグルタル酸の代わりにグルコースやL−グルタミン酸等の宿主が代謝可能な安価な化合物を添加し、宿主に代謝させ、その過程で生じる2−オキソグルタル酸を反応に使用させることも可能である。
反応に必要な2価鉄イオンは通常、0.01mmol/L〜100mmol/L、好ましくは0.1mmol/L〜10mmol/Lの範囲で用いられる。2価鉄イオンは通常、反応開始時に一括して添加して使用するが、反応中に3価鉄イオンに酸化されたり、沈殿を形成して減少した場合は追添加することも効果的である。また、ピペコリン酸4位水酸化酵素、該酵素を含む細胞、該細胞の調製物または培養液に既に十分な2価鉄イオンが含まれている場合は添加しなくてもよい。
反応は、通常4℃〜60℃、好ましくは10℃〜45℃の反応温度で、通常pH3〜11、好ましくはpH5〜8で行われる。反応時間は通常、1時間〜72時間程度である。
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
(1)遺伝子のクローニング
フザリウム オキシスポラム(Fusarium oxysporum)Fo5176由来hypothetical protein FOXB_08233をコードする遺伝子配列を元に、hypothetical protein FOXB_08233相同遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーBOF1およびBOR1を設計、合成した。それぞれの塩基配列を、配列表の配列番号13および14に示す。
フザリウム オキシスポラム(Fusarium oxysporum)c8DをPotato dextrose液体培地(日本BD社製)で一晩培養して得られた菌体より、DNeasy Blood & Tissue Kit (キアゲン社製)を用いて、染色体DNAを調製した。
調製した各菌株由来の染色体DNAを鋳型とし、配列番号13および14のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、それぞれ約1kbpのDNA断片を増幅した。PCRは、Tks Gflex DNA polymerase(タカラバイオ社製)を使用し、添付の取扱説明書の条件に従って反応を実施した。温度プログラムは、95℃で1分間保持した後、(98℃、10秒;56.5℃、15秒;68℃、40秒)を35サイクル繰り返し、72℃で3分間保持して終了した。得られたDNA配列を解析した結果を配列番号1に、また、本DNA配列がコードするアミノ酸配列を配列番号2に示す。
上記(1)で得られたDNA断片を、制限酵素BamHIとHindIIIで消化し、Ligation-Convenience Kit(ニッポンジーン社製)を用いて、制限酵素BamHIとHindIIIで消化されたプラスミドベクターpQE80L(キアゲン社製)に導入した。以下、得られたプラスミドをpFoPA4Hと称する。また、配列番号3、5、7、9および11のDNA配列をDNA2.0社にて合成し、同社にて発現プラスミドpJexpress411に挿入した。以下、得られたプラスミドをそれぞれpAoPA4H、pPcPA4H、GzPA4H、pCgPA4HおよびpEnPA4Hと称する。
実施例1で得られた6種のプラスミド、pFoPA4H、pAoPA4H、pPcPA4H、GzPA4H、pCgPA4HおよびpEnPA4Hを用い、大腸菌(Escherichia coli) Rosetta 2 (DE3)(メルクミリポア社製)を常法に従い形質転換した。得られた組換え大腸菌それぞれをカナマイシン50mg/L、クロラムフェニコール 15mg/L、IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) 1mmol/Lを含む液体LB培地を用いて30℃で振盪培養し、培養20時間目に集菌した。
得られた菌体を用いて、2−オキソグルタル酸15mmol/L、アスコルビン酸5mmol/L、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩 5mmol/L、FeSO4・7H2O 0.5mmol/L、クエン酸3mmol/L、各種基質化合物10mmol/Lを含む50mmol/L MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid)緩衝液中で、20℃、pH6の条件で21時間反応させた。
反応後の反応液を下記条件の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分析した。
カラム: CHIRALPAK AD-3(4.6×250 mm、ダイセル化学社製)
溶離液: ヘキサン : エタノール : トリフルオロ酢酸 = 95 : 5 : 0.1
流速: 0.8 ml/min
温度: 30℃
検出: UV 210 nm
実施例2で得られた反応液はウォーターズ社 AccQ・Tagメソッドを用いて誘導体化した後、下記条件の高速液体クロマトグラフ質量分析計(LC-MS)にて分離分析することにより、アミノ酸の反応生成物を測定した。
カラム: XBridge C18 5μm(2.1×150 mm、ウォーターズ社製)
溶離液A:酢酸アンモニウム(10 mmol/L、pH 5)
溶離液B:メタノール(0〜0.5 min. (0 %→1 %), 0.5〜18 min. (1 %→5 %), 18〜19 min.(5 %→9 %), 19〜29.5 min. (9 %→17 %), 29.5〜40 min. (17 %→60 %), 40〜43 min. (60 %))
流速: 0.3 ml/min
温度: 30℃
検出:質量分析計
にて形質転換した大腸菌を用いた時も同様であった。
カラム: TSKgel Amide80(7.8×300 mm、東ソー社製)
溶離液: 酢酸アンモニウム(10 mmol/L、pH 5) : アセトニトリル = 15 : 85
流速: 2.3 ml/min
温度: 40℃
検出: UV 210 nm
1H-NMR(図6)、13C-NMR(図7)解析の結果得られた化学シフト値、およびHH-COSY、CH-HMQC解析の結果得られた相関、さらに文献情報(Molnar, T.ら、2008, Bioorg. Med. Chem. Lett., 18, 6290)から、本反応生成物はtrans−4−ヒドロキシ−L−ピペコリン酸であると同定された。
pFoPA4Hにて形質転換した大腸菌とL−ピペコリン酸を含む反応液のLC-MS分析結果を図3に示した。反応生成物であるtrans−4−ヒドロキシ−L−ピペコリン酸のピークは、10.9分に溶出した。この結果はpAoPA4H、pPcPA4H、GzPA4H、pCgPA4HまたはpEnPA4Hにて形質転換した大腸菌を用いた時も同様であった。
同じ保持時間を示したことから、本反応生成物はcis-4−ヒドロキシ−D−プロリンであることが推定された。
実施例2で得られた菌体から得た無細胞抽出液を用いて、2−オキソグルタル酸15mmol/L、アスコルビン酸5mmol/L、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩5mmol/L、FeSO4・7H2O 0.5mmol/L、クエン酸3mmol/L、各種基質化合物10mmol/Lを含む50mmol/L MES緩衝液中で、20℃、pH6の条件で21時間反応させた。反応後の反応液は実施例2に記載の条件の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分析した。
2種の無細胞抽出液を用いた反応液に関して、LC-MS分析において新規ピークの出現が確認された基質のヒドロキシアミノ酸を表2に示した。これら新規反応生成物の分子量は、基質から16増加したものであると確認されたことから、すべてヒドロキシアミノ酸に酸素原子が付加したジヒドロキシアミノ酸であると考えられる。
土壌サンプル中から直接回収されたDNAの配列解析の結果から、アミノ酸水酸化酵素の遺伝子である可能性が考えられる配列番号15および17が見出された。それぞれにコードされるアミノ酸配列は配列番号16および18に示した。
PCRによりそれぞれ約1kbpのDNA断片を増幅した。得られた断片について実施例1に記載の手法に従いpQE80L (キアゲン社製)に導入した。以下、得られたプラスミドをそれぞれpVsPA4H、およびpBsPA4Hと称する。
実施例5で得られた2種のプラスミド、pVsPA4HおよびpBsPA4Hを用い、大腸菌(Escherichia coli) Rosetta 2 (DE3)(メルクミリポア社製)を常法に従い形質転換した。得られた組換え大腸菌それぞれをアンピシリン50mg/L、クロラムフェニコール15mg/L、 IPTG 1mmol/Lを含む液体LB培地を用いて30℃で振盪培養し、培養20時間目に集菌した。得られた菌体から得た無細胞抽出液を用いて、2−オキソグルタル酸15mmol/L、アスコルビン酸5mmol/L、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩 5mmol/L、FeSO4・7H2O 0.5mmol/L、クエン酸3mmol/L、基質化合物(L−ピペコリン酸)10mmol/Lを含む50mmol/L MES緩衝液中で、20℃、pH6の条件で21時間反応させた。
反応後の反応液を前述の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分析した。その結果いずれの反応液からもtrans-4−ヒドロキシ−L−ピペコリン酸の分子量に一致する化合物を確認した。
Claims (7)
- L-ピペコリン酸を含むα-アミノ酸に、以下に記載のピペコリン酸4位水酸化酵素タンパク質またはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られた培養液を作用させて、4-ヒドロキシアミノ酸を生成させることを特徴とする、4-ヒドロキシ-L-ピペコリン酸の製造方法:
2-オキソグルタル酸および2価鉄イオンの存在下、L-ピペコリン酸に作用してtrans-4-ヒドロキシ-L-ピペコリン酸を生成する活性を有するピペコリン酸4位水酸化酵素タンパク質であって、以下の(A)、(B)および(C)からなる群より選択され、かつ、糖鎖が付加されていない組換えタンパク質である、ピペコリン酸4位水酸化酵素タンパク質:
(A) 配列番号2、4、6、8、10または12で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(B) 配列番号2、4、6、8、10または12で表されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列を有し、ピペコリン酸4位水酸化酵素活性を有するポリペプチド;または
(C) 配列番号2、4、6、8、10または12で表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ピペコリン酸4位水酸化酵素活性を有するポリペプチド。 - 前記ピペコリン酸4位水酸化酵素を含む細胞が、糖鎖付加能を持たない細胞である、請求項1に記載の4-ヒドロキシ-L-ピペコリン酸の製造方法。
- 前記ピペコリン酸4位水酸化酵素を含む細胞が、ピペコリン酸4位水酸化酵素タンパク質をコードするDNAで形質転換された細胞である、請求項1または2に記載の4-ヒドロキシ-L-ピペコリン酸の製造方法。
- 前記ピペコリン酸4位水酸化酵素タンパク質をコードするDNAは、以下の(D)、(E)および(F)からなる群より選択される、請求項3に記載の4-ヒドロキシ-L-ピペコリン酸の製造方法:
(D) 配列番号1、3、5、7、9または11で表される塩基配列を有するDNA;
(E) 配列番号1、3、5、7、9または11で表される塩基配列において1〜30個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列を含み、かつピペコリン酸4位水酸化酵素
活性を有するポリペプチドをコードするDNA;
(F) 配列番号1、3、5、7、9または11で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつピペコリン酸4位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA。 - 前記(E)において、塩基の置換、欠失もしくは付加が1〜15個である、請求項4に記載の4-ヒドロキシ-L-ピペコリン酸の製造方法。
- 以下の(D)、(E)および(F)からなる群より選択される、以下の(A)、(B)および(C)からなる群より選択されるピペコリン酸4位水酸化酵素タンパク質をコードするDNAで形質転換された糖鎖付加能を持たない微生物:
(A) 配列番号2、4、6、8、10または12で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(B) 配列番号2、4、6、8、10または12で表されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列を有し、ピペコリン酸4位水酸化酵素活性を有するポリペプチド;または
(C) 配列番号2、4、6、8、10または12で表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ピペコリン酸4位水酸化酵素活性を有するポリペプチド;
(D) 配列番号1、3、5、7、9または11で表される塩基配列を有するDNA;
(E) 配列番号1、3、5、7、9または11で表される塩基配列において1〜30の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列を含み、かつピペコリン酸4位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA;
(F) 配列番号1、3、5、7、9または11で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつピペコリン酸4位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA。 - エシェリヒア属、バチルス属、シュードモナス属およびコリネバクテリウム属から選択される、請求項6に記載の微生物。
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