JP6727137B2 - サンプル中の複数の核酸を検出するための方法 - Google Patents
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Description
(a)所定量の第1の核酸;
所定量の第2の核酸;
第1の核酸の領域に特異的な結合部分と、複合体を形成していない状態では、第1の検出可能な特徴を有し、複合体を形成した状態では、第1の検出可能な特徴とは異なる第2の検出可能な特徴を有する第1の検出可能な標識とを含み、第1の核酸と複合体を形成することができる所定量のFRET化合物、
それぞれが第2の核酸の領域に特異的な結合部分と、第2の検出可能な標識とを含み、第2の核酸と複合体を形成することができる所定量のレポーター化合物、および
レポーター化合物を捕捉することが可能な結合部材を提供すること、
ここで、第2の核酸とレポーター化合物との複合体の形成により、結合部材によるレポーター化合物の捕捉が阻害される、
(b)第1の核酸およびFRET化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
(c)所定量のレポーター化合物の一部と第2の核酸との複合体を形成すること、
(d)前記所定量のレポーター化合物のうち、第2の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること、
(e)FRET化合物によって捕捉された第1の核酸の存在および/または量の指標となる値を決定すること、および
(f)結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および/または量の指標となる値を決定することとを含む。
第1の核酸および/または第2の核酸を増幅させること、
第1の核酸およびFRET化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
所定量のレポーター化合物の一部と第2の核酸との複合体を形成すること、
前記所定量のレポーター化合物のうち、第2の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること、
FRET化合物によって捕捉された第1の核酸の存在および/または量の指標となる値を決定すること、および
結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および/または量の指標となる値を決定することとを含む。
第1の核酸および/または第2の核酸を等温増幅(例えば、等温NEAR)させること、
第1の核酸およびFRET化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
所定量のレポーター化合物の一部と第2の核酸との複合体を形成すること、
前記所定量のレポーター化合物のうち、第2の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること、
FRET化合物によって捕捉された第1の核酸の存在および/または量の指標となる値を決定すること、
結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および/または量の指標となる値を決定することとを含んでいてもよく、
任意選択により、(i)第1の核酸およびFRET化合物をそれぞれ含む複合体を形成する工程、(ii)所定量のレポーター化合物の一部と、所定量の第2の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程、(iii)所定量のレポーター化合物のうち、第2の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉する工程、(iv)第1の核酸および/または第2の核酸を増幅させる工程が、同時に行われてもよい。
第1の核酸および/または第2の核酸に周期的な増幅(例えば、PCR)を行うことと;
第1の核酸およびFRET化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
所定量のレポーター化合物の一部と第2の核酸との複合体を形成すること、
前記所定量のレポーター化合物のうち、第2の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること、
FRET化合物によって捕捉された第1の核酸の存在および/または量の指標となる値を決定すること、
結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および/または量の指標となる値を決定することとを含み、
任意選択により、第1の核酸および第2の核酸の増幅は、所定量のレポーター化合物の一部と、所定量の第2の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程の前に開始される。
第1の核酸および/または第2の核酸を増幅(例えば、等温増幅または周期的な増幅)させること、
第1の核酸およびFRET化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
所定量のレポーター化合物の一部と第2の核酸との複合体を形成すること、
前記所定量のレポーター化合物のうち、第2の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉することと、
溶液中でFRET化合物によって捕捉された第1の核酸の存在および/または量の指標となる値を決定すること、および
結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および/または量の指標となる値を決定し、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および/または量の指標となる値を基準として、第2の核酸の存在および/または量の指標となる値を決定することとを含む。
第1の核酸および/または第2の核酸を増幅(例えば、等温増幅または周期的な増幅)させること、
第1の核酸およびFRET化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
所定量のレポーター化合物の一部と第2の核酸との複合体を形成すること、
前記所定量のレポーター化合物のうち、第2の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること、
緩和された状態の内容積を有する反応チャンバー中、FRET化合物によって捕捉された第1の核酸の存在および/または量の指標となる値を決定すること、
圧縮された状態の内容積を有する反応チャンバー中、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および/または量の指標となる値を決定し、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および/または量の指標となる値を基準として、第2の核酸の存在および/または量の指標となる値を決定することとを含む。
第1の核酸および/または第2の核酸を増幅(例えば、等温増幅または周期的な増幅)させること、
第1の核酸およびFRET化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
所定量のレポーター化合物の一部と第2の核酸との複合体を形成すること、
前記所定量のレポーター化合物のうち、第2の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること、
緩和された状態の内容積を有する反応チャンバー中、溶液中でFRET化合物によって捕捉された第1の核酸の存在および/または量の指標となる値を決定すること、
圧縮された状態の内容積を有する反応チャンバー中、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および/または量の指標となる値を決定し、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および/または量の指標となる値を基準として、第2の核酸の存在および/または量の指標となる値を決定することとを含む。
第1の核酸および/または第2の核酸を増幅(例えば、等温増幅または周期的な増幅)させること、
第1の核酸およびFRET化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
所定量のレポーター化合物の一部と第2の核酸との複合体を形成すること、
前記所定量のレポーター化合物のうち、第2の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること、
緩和された状態の内容積を有する反応チャンバー中、溶液中でFRET化合物によって捕捉された第1の核酸の存在および/または量の指標となる値を決定すること、
圧縮された状態の内容積を有する反応チャンバー中、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および/または量の指標となる値を決定し、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および/または量の指標となる値を基準として、第2の核酸の存在および/または量の指標となる値を決定することとを含む。
(a)所定量の第1の核酸;
所定量の第2の核酸;
第1の核酸の領域に特異的な結合部分と、複合体を形成していない状態では、第1の検出可能な特徴を有し、複合体を形成した状態では、第2の検出可能な特徴を有する第1の検出可能な標識とを含み、第1の核酸と複合体を形成することができる所定量のFRET化合物;
それぞれが第2の核酸の領域に特異的な結合部分と、第2の検出可能な標識とを含み、第2の核酸と複合体を形成することができる所定量のレポーター化合物;および
レポーター化合物を捕捉することが可能な結合部材を提供し、
ここで、第2の核酸とレポーター化合物との複合体の形成により、結合部材によるレポーター化合物の捕捉が阻害される、
(b)第1の核酸およびFRET化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
(c)所定量のレポーター化合物の一部と第2の核酸との複合体を形成すること、
(d)前記所定量のレポーター化合物のうち、第2の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること、
(e)FRET化合物によって捕捉された第1の核酸の存在および/または量の指標となる値を決定すること、
(f)結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および/または量の指標となる値を決定することとを含む方法である。
圧縮可能な反応チャンバーと、レポーター化合物を捕捉することができる結合部材としてアレイを備える図1および図2に記載される試験デバイス中、等温NEARを用いることによって、結核DNAを増幅した。このサンプルは、プライマー(逆プライマー:Tb_DR_R25c 5’−AGACTCCATATGGAGTCTCATCTTTCCGTCCCC−3’、順プライマー:Tb_DR_F16 5’−CGACTCCATATGGAGTCGTCGTCAGACCCAAAA−3’);分子ビーコンMB_P2_7(5’−TCGGGGCAGACCCAAAACCCCGA−3’);レポーター化合物Anti_Tb_Target_CMA(5’−CCCAAAACCCCGAGAGG−3’);酵素(ニッキング酵素およびストランド置換酵素)および標的DNAを含んでいた。コントロール反応として、標的DNAを用いずに、即ち、テンプレートコントロールを用いずに増幅を行った。増幅を56℃で600秒間行った。画像を15秒ごとに撮った。結果を図5(a)および図5(b)に示す。
内部陽性コントロール(IPC)および陽性ハイブリダイゼーションコントロール(PHC)の存在下、結核DNAの検出
圧縮可能な反応チャンバーと、レポーター化合物を捕捉することができる結合部材としてアレイを備える図1および図2に記載される試験デバイス中、等温NEARを用いることによって、結核DNA(標的DNA)および内部陽性コントロールDNA(IPC)を増幅した。標的検体とIPCのテンプレートは、プライマー結合部位に同じ配列を有していたが、レポーター化合物とFRET化合物(ここでは分子ビーコン)のための結合部位の配列はそれぞれ異なっていた。従って、両アンプリコンは、同じプライマーによって増幅させることができ、異なるプローブによって互いに独立して検出することができた。
標的 IPC 500 GE
順プライマーの濃度 750nm
逆プライマーの濃度 50nm
レポーターIPCの濃度:10nm
レポーターPHCの濃度:10nm
分子ビーコンの濃度 200nM
増幅を56℃で約600秒間行った。画像を15秒ごとに撮った。結果を図6および図7に示す。
サンプル中の核酸の存在および/または量を決定するための方法であって、
(a)
所定量の第1の核酸;
所定量の第2の核酸;
第1の核酸の領域に特異的な結合部分と、複合体を形成していない状態では、第1の検出可能な特徴を有し、複合体を形成した状態では、第2の検出可能な特徴を有する第1の検出可能な標識とを含み、第1の核酸と複合体を形成することができる所定量のFRET化合物、
それぞれが第2の核酸の領域に特異的な結合部分と、第2の検出可能な標識とを含み、第2の核酸と複合体を形成することができる所定量のレポーター化合物;および
レポーター化合物を捕捉することが可能な結合部材を提供すること、
ここで、第2の核酸とレポーター化合物との複合体の形成により、結合部材によるレポーター化合物の捕捉が阻害される、
(b)第1の核酸およびFRET化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
(c)所定量のレポーター化合物の一部と第2の核酸との複合体を形成すること、
(d)前記所定量のレポーター化合物のうち、第2の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること、
(e)FRET化合物によって捕捉された第1の核酸の存在および/または量の指標となる値を決定すること、
(f)結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および/または量の指標となる値を決定することとを含む、方法。
結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および/または量の指標となる値を基準として、第2の核酸の存在および/または量の指標となる値を決定することをさらに含む、実施形態1に記載の方法。
第1の検出可能な標識が蛍光標識である、実施形態1または2に記載の方法。
第2の検出可能な標識が蛍光標識である、実施形態1から3のいずれか1項に記載の方法。
第1の検出可能な標識および第2の検出可能な標識が両方とも蛍光標識である、実施形態1から4のいずれか1項に記載の方法。
第1の検出可能な標識および第2の検出可能な標識が両方とも300nmから850nmの範囲の波長で発光する、実施形態5に記載の方法。
第1の検出可能な標識と第2の検出可能な標識が同じである、実施形態5または6に記載の方法。
FRET化合物によって捕捉された第1の核酸の存在および/または量の指標となる値が、複合体を形成した状態のFRET化合物で決定される、実施形態1から7のいずれか1項に記載の方法。
第1の核酸が検体である、実施形態1から8のいずれか1項に記載の方法。
第2の核酸が、第2の検体およびコントロール核酸からなる群から選択される、実施形態1から9のいずれか1項に記載の方法。
第1の核酸が、サンプルあたり100コピー数に満たない量で存在する、実施形態1から10のいずれか1項に記載の方法。
第2の核酸が、サンプルあたり100コピー数以上の量で存在する、実施形態1から11のいずれか1項に記載の方法。
(i)第1の核酸およびFRET化合物をそれぞれ含む複合体を形成する工程、(ii)所定量のレポーター化合物の一部と、所定量の第2の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程、(iii)所定量のレポーター化合物のうち、第2の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉する工程が、同時に行われる、実施形態1から12のいずれか1項に記載の方法。
第1の核酸および第2の核酸を増幅させることをさらに含み、任意選択により、第1の核酸および第2の核酸の増幅が、所定量のレポーター化合物の一部と、所定量の第2の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程の前に開始される、実施形態1から13のいずれか1項に記載の方法。
(i)第1の核酸およびFRET化合物をそれぞれ含む複合体を形成する工程、(ii)所定量のレポーター化合物の一部と、所定量の第2の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程、(iii)所定量のレポーター化合物のうち、第2の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉する工程、および(iv)第1の核酸および/または第2の核酸を増幅させる工程が、同時に行われる、実施形態14に記載の方法。
第2の核酸が、陽性増幅コントロールおよび陰性増幅コントロールからなる群から選択される、実施形態14または15に記載の方法。
結合部材は、レポーター化合物を結合部材に捕捉することができる、1つ以上の異なるレポーターに特異的な捕捉化合物を含む、実施形態1から16のいずれか1項に記載の方法。
レポーターに特異的な捕捉化合物がオリゴヌクレオチドである、実施形態17に記載の方法。
異なるレポーターに特異的な捕捉化合物が、結合部材に対して異なる位置に配置されている、実施形態17または18に記載の方法。
レポーターに特異的な捕捉化合物との複合体を形成することによって、レポーター化合物が結合部材に捕捉される、実施形態17から19のいずれか1項に記載の方法。
第2の核酸と複合体を形成することができるレポーター化合物の相互作用部位の少なくとも一部が、レポーターに特異的な捕捉化合物との複合体を形成することもできる、実施形態17から20のいずれか1項に記載の方法。
レポーターに特異的な捕捉化合物と第2の核酸が、レポーター化合物との複合体の形成について競合する、実施形態17から21のいずれか1項に記載の方法。
FRET化合物によって捕捉された第1の核酸の存在および/または量の指標となる値および/または結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および/または量の指標となる値が、結合部材とカバー要素とを備える反応チャンバー中で決定される、実施形態1から22のいずれか1項に記載の方法。
反応チャンバーが緩和された状態の内容積と圧縮された状態の内容積を有するように、カバー要素は、少なくとも部分的に変形可能なように構成されている、実施形態23に記載の方法。
FRET化合物によって捕捉された第1の核酸の存在および/または量の指標となる値が、緩和された状態の内容積を有する反応チャンバー中で決定される、実施形態24に記載の方法。
結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および/または量の指標となる値が、圧縮された状態の内容積を有する反応チャンバー中で決定される、実施形態23から25のいずれか1項に記載の方法。
FRET化合物によって捕捉された第1の核酸の存在および/または量の指標となる値と、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および/または量の指標となる値が、連続して、または同時に決定される、実施形態1から26のいずれか1項に記載の方法。
レポーター化合物がオリゴヌクレオチドである、実施形態1から27のいずれか1項に記載の方法。
第1の核酸および/または第2の核酸を増幅させる前に、第1の核酸および/または第2の核酸を逆転写させることをさらに含む、実施形態1から28のいずれか1項に記載の方法。
増幅が、二本鎖の核酸を変性する工程を含み、この二本鎖の核酸は、レポーター化合物と第2の核酸との複合体、レポーター化合物とレポーターに特異的な捕捉化合物との複合体、レポーター化合物の二本鎖および第1の核酸および/または第2の核酸の二本鎖を含み、および/または増幅は、プライマー化合物を第1の核酸および/または第2の核酸にアニーリングする工程を含み、任意選択により、アニーリングする工程は、所定量のレポーター化合物の一部と、第2の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程、および/または所定量のレポーター化合物のうち、第2の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉する工程と同時に行われる、実施形態14から29のいずれか1項に記載の方法。
増幅は、等温増幅法であり、等温増幅法は、任意選択により、等温NEARである、実施形態14から30のいずれか1項に記載の方法。
増幅は、周期的な増幅であり、周期的な増幅は、任意選択により、PCRであり、PCRを行うことは、任意選択により、エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いることを含み、任意選択により、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および/または量の指標となる値は、周期的な増幅の少なくとも1つの周期の後に決定され、任意選択により、周期的な増幅のそれぞれの周期の後に、任意選択により、第1の核酸および/または第2の核酸の存在および/または量の指標となる値が、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および/または量の指標となる値を決定した後に、それぞれの時間で決定される、実施形態14から30のいずれか1項に記載の方法。
第2の核酸の存在および/または量の指標となる値が、レポーター化合物の存在および/または量の指標となる値と、第2の核酸の存在および/または量の指標となる値との相関関係を示す検量曲線に基づいて決定される、実施形態2から32のいずれか1項に記載の方法。
サンプル中の核酸の存在および/または量を決定する方法であって、
所定量の第1の核酸;所定量の第2の核酸;第1の核酸の領域に特異的な結合部分と、複合体を形成していない状態で第1の検出可能な特徴を有し、複合体を形成した状態で第2の検出可能な特徴を有する第1の検出可能な標識とを含み、第1の核酸と複合体を形成することができる所定量のFRET化合物を提供すること、第2の核酸の領域に特異的な結合部分と、第2の検出可能な標識とを含み、第2の核酸と複合体を形成することができる所定量のレポーター化合物を反応チャンバー中に提供すること;反応チャンバーは、レポーター化合物を捕捉することが可能な結合部材と、反応チャンバーが緩和された状態の内容積と圧縮された状態の内容積を有するように少なくとも部分的に変形可能なように構成されるカバー要素とを備え、第2の核酸とレポーター化合物との複合体の形成により、結合部材によるレポーター化合物の捕捉が阻害されること、
第1の核酸および/または第2の核酸を増幅させること、
第1の核酸およびFRET化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
所定量のレポーター化合物の一部と第2の核酸との複合体を形成すること、
所定量のレポーター化合物のうち、第2の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉すること、
緩和された状態の内容積を有する反応チャンバー中で、溶液中におけるFRET化合物によって捕捉された第1の核酸の存在および/または量の指標となる値を決定すること、
圧縮された状態の内容積を有する反応チャンバー中で、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および/または量の指標となる値を決定し、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在および/または量の指標となる値を基準として、第2の核酸の存在および/または量の指標となる値を決定することとを含む、方法。
Claims (22)
- サンプル中の核酸の存在及び/又は量を決定する方法であって、
(a)所定量の第1の核酸;
所定量の第2の核酸;
前記第1の核酸と複合体を形成することができる所定量のFRET化合物、ここで、前記FRET化合物は、複合体を形成していない状態では第1の検出可能な特徴を有し、複合体を形成した状態では第2の検出可能な特徴を有する第1の検出可能な標識と、前記第1の核酸の領域に特異的な結合部分とを含む;
前記第2の核酸と複合体を形成することができる所定量のレポーター化合物、ここで、各レポーター化合物は、前記第2の核酸の領域に特異的な結合部分と、第2の検出可能な標識とを含み、ここで、第1の検出可能な標識と前記第2の検出可能な標識の両者は同一である、
を反応チャンバーに導入すること、
ここで、前記反応チャンバーは、レポーター化合物を捕捉することが可能な結合部材と、前記反応チャンバーが緩和された状態の内容積と圧縮された状態の内容積を有するように、少なくとも部分的に変形可能なように構成されたカバー要素とを備え、前記結合部材は、前記カバー要素の上に配置されるか又は前記カバー要素と対抗する表面に配置され、
ここで、前記第2の核酸と前記レポーター化合物との複合体の形成により、前記結合部材による前記レポーター化合物の捕捉が阻害される、
(b)前記第1の核酸及び/又は前記第2の核酸を増幅させること、
(c)第1の核酸及びFRET化合物をそれぞれ含む複合体を形成すること、
(d)所定量のレポーター化合物の一部と第2の核酸との複合体を形成すること、
(e)前記所定量のレポーター化合物のうち、第2の核酸と複合体になっていない残りの部分を前記結合部材に捕捉すること、
(f)緩和された状態の内容積を有する前記反応チャンバー内の溶液中におけるFRET化合物と複合した第1の核酸の存在及び/又は量の指標となるシグナル強度を決定すること、及び
(g)圧縮された状態の内容積を有する前記反応チャンバー内の前記結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在及び/又は量の指標となるシグナル強度を決定すること
を含み、
圧縮された状態において、反応チャンバーは、結合部材と、少なくとも部分的に変形可能なように構成されたカバー要素との間に溶液が存在しなくなるまで反応チャンバーが圧縮される、方法。 - 上記(b)において、第1の核酸及び/又は第2の核酸を増幅の前に逆転写させる、請求項1に記載の方法。
- 結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在及び/又は量の指標となるシグナル強度を基準として、第2の核酸の存在及び/又は量の指標となるシグナル強度を決定することをさらに含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 第1の検出可能な標識及び第2の検出可能な標識が両方とも蛍光標識である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 第1の検出可能な標識及び第2の検出可能な標識が両方とも、300nm〜850nmの範囲の波長で発光する、請求項4に記載の方法。
- FRET化合物によって捕捉された第1の核酸の存在及び/又は量の指標となるシグナル強度が、複合体を形成した状態のFRET化合物で決定される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 第1の核酸が検体であり、及び/又は
第2の核酸が、第2の検体及びコントロール核酸からなる群から選択され、及び/又は
第1の核酸が、サンプルあたり100コピー数に満たない量で存在し、及び/又は
第2の核酸が、サンプルあたり100コピー数以上の量で存在する、
請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。 - (c)第1の核酸及びFRET化合物をそれぞれ含む複合体を形成する工程、(d)所定量のレポーター化合物の一部と、所定量の第2の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程、及び(e)所定量のレポーター化合物のうち、第2の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉する工程が、同時に行われる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 第1の核酸及び第2の核酸の増幅が、工程(d)の前に開始されるか、又は工程(c)、(d)及び(e)と同時に行われる、請求項8に記載の方法。
- 第2の核酸が、陽性増幅コントロール及び陰性増幅コントロールからなる群から選択される、請求項8又は9に記載の方法。
- 結合部材は、レポーター化合物を結合部材に捕捉することができる、1つ以上の異なるレポーターに特異的な捕捉化合物を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- レポーターに特異的な捕捉化合物が、オリゴヌクレオチドであり、及び/又は
異なるレポーターに特異的な捕捉化合物が、結合部材に対して異なる位置に配置されており、及び/又は
レポーターに特異的な捕捉化合物との複合体を形成することによって、レポーター化合物が結合部材に捕捉され、及び/又は
第2の核酸と複合体を形成することができるレポーター化合物の相互作用部位の少なくとも一部が、レポーターに特異的な捕捉化合物との複合体を形成することもでき、及び/又は
レポーターに特異的な捕捉化合物と第2の核酸が、レポーター化合物との複合体の形成について競合する、
請求項11に記載の方法。 - FRET化合物によって捕捉された第1の核酸の存在及び/又は量の指標となるシグナル強度と、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在及び/又は量の指標となるシグナル強度とが、連続して、又は同時に決定される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- レポーター化合物がオリゴヌクレオチドである、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 増幅が、二本鎖の核酸を変性する工程を含み、ここで、前記二本鎖の核酸は、レポーター化合物と第2の核酸との複合体、レポーター化合物とレポーターに特異的な捕捉化合物との複合体、レポーター化合物の二本鎖及び第1の核酸及び/又は第2の核酸の二本鎖を含み、及び/又は、増幅は、プライマー化合物を第1の核酸及び/又は第2の核酸にアニーリングする工程を含む、請求項8〜14のいずれか1項に記載の方法。
- アニーリングする工程は、所定量のレポーター化合物の一部と、第2の核酸の少なくとも一部との複合体を形成する工程、及び/又は所定量のレポーター化合物のうち、第2の核酸と複合体になっていない残りの部分を結合部材に捕捉する工程と同時に行われる、請求項15に記載の方法。
- 増幅は、等温増幅法である、又は、周期的増幅である、請求項8〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 等温増幅法は、等温NEARである、請求項17に記載の方法。
- 周期的増幅は、PCRであり、PCRを行うことはエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いることを含む、請求項17に記載の方法。
- 結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在及び/又は量の指標となるシグナル強度は、周期的増幅の少なくとも1つの周期の後に、及び/又は、周期的増幅のそれぞれの周期の後に決定される、請求項17〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 第1の核酸及び/又は第2の核酸の存在及び/又は量の指標となるシグナル強度が、結合部材に捕捉されたレポーター化合物の存在及び/又は量の指標となるシグナル強度を決定した後に、それぞれの時間で決定される、請求項17〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 第2の核酸の存在及び/又は量の指標となるシグナル強度が、レポーター化合物の存在及び/又は量の指標となるシグナル強度と、第2の核酸の存在及び/又は量の指標となるシグナル強度との相関関係を示す検量曲線に基づいて決定される、請求項3〜21のいずれか1項に記載の方法。
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