JP6720260B2 - 癌を患うリスクのある被検体を診断するための方法およびキット - Google Patents
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Description
この出願は、2011年12月19日付で提出の米国仮出願第61/577,441号
に基づく優先権を主張する。出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ
る。
本発明は、特に膵臓癌における、癌のハイリスクスクリーニング、早期発見および監視
のための方法および試薬に関する。
悪性新生物としても知られている癌は、無秩序な細胞増殖を伴う疾患を意味する。癌に
おいて、細胞は***および制御不能に成長し、悪性腫瘍を形成し、身体の近くの部分に侵
入する。癌は、リンパ系や血流を介して身体の遠い部分に広がりうる。治療薬および診断
薬の大幅な進歩にもかかわらず、癌は米国における罹患率および死亡率の主要な原因のま
まである。いくつかの癌に対して、これらの進歩にもかかわらず、発生率が増加している
。
Cancer statistics CA Cancer J Clin. 2009
;59:225−249)。日本からの最近の知見によると、小さい腫瘍および非局所浸
潤では、生存率を20%超に向上させることができる(Tanaka et al. P
ancreas 2004;28(3):268−72)。生存率は早期診断の方がより
良い。残念なことに、膵臓癌患者の大部分(85%)は、末期に診断され、早期の膵臓癌
の診断は、早期診断に適切なバイオマーカーの不足を含むいくつかのチャレンジに臨んで
おり、早期診断を複雑にする非癌性の膵臓疾患にも関わっている。異なるクラスからの多
数の分子は、潜在的な早期診断マーカーとして調査されているが、成功していない。
めの方法および試薬は、相変わらず必要である。
本発明は、特に膵臓癌における、癌のハイリスクスクリーニング、早期発見および監視
のための方法および試薬に関する。
殖性疾患を発症するリスクを有しているかを診断するための方法、またはかような被検体
からデータもしくは情報を獲得する方法に特徴を有する。当該方法は、前記被検体からサ
ンプルを得ること;およびインビトロで前記サンプルにおいて、マイクロRNAの発現レ
ベルを決定することを含み、前記マイクロRNAは、(i)アップレギュレートされた(
up−regulated)マイクロRNAsの第1のパネルまたは(ii)ダウンレギ
ュレートされた(down−regulated)マイクロRNAsの第2のパネルから
選択される。(a)前記第1のパネルから選択されたマイクロRNAの発現レベルが第1
の所定の基準値を超える、または(b)前記第2のパネルから選択されたマイクロRNA
の発現レベルが第2の所定の基準値未満であると、前記被検体またはサンプルは、膵臓癌
のような疾患を患っているかもしくは発症するリスクを有していると分類または同定され
る。前記第1および第2のパネルのマイクロRNAsの例として、表2に列挙したものが
挙げられる。第1のパネルの追加的な例は、miR−18a、miR−22、miR−4
86、miR−642b、miR−7およびmiR−885−5pを含む
一好適な実施形態において、前記方法は、前記被検体からサンプルを得る工程;および
前記サンプルにおいて、第1のマイクロRNAの発現レベルを決定する工程を含む。前記
第1のマイクロRNAは、miR−18a、miR−22、miR−486、miR−6
42b、miR−7およびmiR−885−5pからなるアップレギュレートされたマイ
クロRNAsのパネルから選択される。前記サンプルにおいて、前記第1のマイクロRN
Aの発現レベルが所定の基準値を超えると、前記被検体またはサンプルは、細胞増殖性疾
患を患っているかもしくは細胞増殖性疾患を発症するリスクを有していると分類または同
定される。
、癌または腫瘍性疾患のような非悪性および悪性の増殖疾患を含む。細胞増殖性疾患の例
として、膵臓癌(pancreatic cancer)、結腸癌(colon can
cer)、乳癌(breast cancer)、前立腺癌(prostate can
cer)、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)、黒色腫(
melanoma)、肺癌(lung cancer)、グリア芽腫(glioblas
toma)、脳腫瘍(brain tumor)、造血器腫瘍(hematopoiet
ic malignancies)、網膜芽腫(retinoblastoma)、腎細
胞癌(renal cell carcinoma)、頭頸部癌(head and n
eck cancer)、子宮頸癌(cervical cancer)、食道癌(es
ophageal cancer)、および扁平上皮癌(squamous cell
carcinoma)が挙げられる。一実施形態において、前記疾患は膵臓癌である。前
記方法において、前記所定の基準値は、前記疾患を患っていないコントロール被検体から
得ることができ、前記被検体は、前記疾患を発症するリスクの高いものでありうる。前記
サンプルは、体液サンプルのような任意の適切なサンプルでありうる。前記体液の例とし
て、血液、血清、および血漿が挙げられる。一実施例において、前記サンプルは、膵臓組
織、膵臓腫瘍、膵臓細胞、または膵液を含む。前記方法は、前記サンプルにおいて、第2
のマイクロRNAの発現レベルを決定することをさらに含む。
ユニーク場所、および(i)少なくとも一つの、アップレギュレートされたマイクロRN
Asの第1のパネルから選択されたマイクロRNAに相補的な配列を有する核酸、または
(ii)少なくとも一つの、ダウンレギュレートされたマイクロRNAの第2のパネルか
ら選択されたマイクロRNAsに相補的な配列を有する核酸の、任意の組み合わせを有す
る担体を含み、この際、各核酸は前記担体のユニーク場所に固定されている。一好適な実
施形態において、前記アレイは、複数のユニーク場所、および少なくとも一つの、アップ
レギュレートされたマイクロRNAsの第1のパネルから選択されたマイクロRNAに相
補的な配列を有する核酸の任意の組み合わせを有する担体を含み、ここで、各核酸は前記
担体のユニーク場所に固定されている。前記パネルは、miR−18a、miR−22、
miR−486、miR−642b、miR−7、およびmiR−885−5pを含みう
る。一実施例において、前記核酸は、配列番号:1〜6からなる群より選択された配列に
相補的である。その他の例示的なマイクロRNAsとしては、下記表2に列挙したものが
挙げられ、ここで、116個のmiRNAが膵臓癌と健康コントロールとの間またはハイ
リスクグループと健康コントロールとの間の倍率変化(Fold Change)におけ
る有意性に基づきランク付けされている。これらの116個の有意なmi−RNAにおい
て、少なくとも上位30のmiRNAsは約2倍以上の変化(アップまたはダウン)を示
した。表2に示されるように、前記マイクロRNAsは、それらの「膵臓癌と健康コント
ロールとの間の倍率変化」の値に基づき、2つのパネルにグループ化することができる。
具体的には、前記第1のパネルにおけるマイクロRNAsは、膵臓癌患者においてアップ
レギュレートされたものであり、それらの「膵臓癌および健康コントロールの倍率変化」
の値が1.0超であり;第2のパネルにおけるマイクロRNAsは、膵臓癌患者において
ダウンレギュレートされたものであり、それらの「膵臓癌および健康コントロールの倍率
変化」の値が1.0未満である。
第1のパネルもしくは(ii)ダウンレギュレートされたマイクロRNAsの第2のパネ
ルから選択されたマイクロRNAの配列に相補的である、または前記マイクロRNAを増
幅するための一対のPCRプライマーである核酸配列を有するプローブを含むキットを提
供する。一好適な実施形態において、前記核酸配列は、アップレギュレートされたマイク
ロRNAsの第1のパネルから選択されたマイクロRNAの配列に相補的であり、または
前記マイクロRNAを増幅するための一対のPCRプライマーである。前記パネルは、m
iR−18a、miR−22、miR−486、miR−642b、miR−7、および
miR−885−5pを含みうる。一実施例において、前記プローブは、配列番号:1〜
6からなる群より選択された配列に相補的である。前記キットは、ハイブリダイゼーショ
ンを行うための試薬、PCRを行うための試薬、または前記開示されたアレイをさらに含
む。
患を患っているか、または細胞増殖性疾患を発症するリスクを有しているかを診断するた
めの方法、および(ii)実質的に本明細書に図示および説明されたアレイまたはキット
に特徴を有する。
達、サンプルまたは被検体が疾患を患っているかもしくは疾患を発症する理数を有してい
るかを特定するためのレポート、または予後方法のための治療下の被検体がよいもしくは
悪い予後を有するレポートをさらに含むことができる。上述した方法において、前記サン
プルは、外科的または内視鏡的に切除された膵臓組織サンプルでありうる。前記サンプル
の例として、膵臓組織、膵臓腫瘍、膵臓細胞、膵嚢胞液、または膵液が挙げられる。前記
サンプルは、体液サンプル(例えば、膵臓からの血液、血清、および血漿)でありうる。
一好適態様において、前記サンプルは、血液、血清、血漿、膵嚢胞液、および膵液からな
る群より選択される。
徴、目的、および利点は、明細書および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
本発明は、多くの、膵臓癌のような癌を有する被検体から得られた生物学的サンプルに
おいて、コントロールサンプルに比べて発現レベルが変化されたマイクロRNA遺伝子産
物の予期せぬ発見に、少なくともその一部に基づいている。これらの遺伝子は、被検体が
細胞増殖性疾患を患っているか、または細胞増殖性疾患を発症するリスクを有しているか
を診断する、またはかような疾患を患っている患者の予後もしくは監視を診断するための
、バイオマーカーとして用いることができる。
を発症するリスクを有しているかを診断する方法を含む。「腫瘍性疾患」という用語は、
任意の種類や起源の癌およびその前駆体段階を意味する。「腫瘍性疾患」という用語は、
用語「新生組織形成(neoplasia)」、「新生物(neoplasm)」、「癌
」、「前癌状態」、または「腫瘍」によって識別された対象を含む。腫瘍性疾患は、特定
の細胞集団の異常レベルをもたらす異常な細胞***によって、一般的に現れる。腫瘍性疾
患の基礎にある異常な細胞***は、一般的に、細胞に内在し、感染や炎症に対する正常な
生理学的応答ではない。いくつかの実施形態において、本発明によって提供された方法を
用いて診断のための腫瘍性疾患は癌腫(carcinoma)を含む。「癌腫」は、良性
または悪性の上皮腫瘍を意味し、肝細胞癌、乳癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、結腸癌、C
NS癌、黒色腫、卵巣癌、または腎癌を含むが、これらに限定されない。典型的な腫瘍性
士官は、膵臓癌であり、腺癌および神経内分泌腫瘍を含む。
る被検体をスクリーニングする方法を提供する。また、癌を抑制するための治療規制の有
効性を診断する方法、および抗癌剤を確認するための方法も提供される。本発明はまた、
上述した方法を実施するのに適した様々なキットを含む。
本明細書に開示されるように、多数のマイクロRNA遺伝子は、癌患者と健康被検体に
おけるそれらの変化した発現パターンに基づき同定された。本明細書で同義的に使用され
るように、「マイクロRNA」、「miR」、または「miRNA」は、miRNA遺伝
子からの未処理もしくは処理済のRNA転写産物を意味する。未処理のmiRNA遺伝子
転写産物はまた、「miRNA前駆体」と呼ばれ、典型的に長さ約70〜100ヌクレオ
チドのRNA転写産物を含む。miRNA前駆体は、活性的な18〜25ヌクレオチドR
NA分子にRNAse(例えば、ダイサー、アルゴノート、またはRNAse III)
で消化することによって処理することができる。この活性的な18〜25ヌクレオチドR
NA分子は、「処理済」のmiRNA遺伝子転写産物または「成熟」のmiRNAとも呼
ばれる。
形態において、患者からの試験サンプルにおけるmiR遺伝子産物のレベルは、コントロ
ールサンプルにおける対応のmiR遺伝子産物のレベルよりも高い(すなわち、miR遺
伝子産物の発現は、「アップレギュレートされた」または「過剰発現(over−exp
ressed)」である)。本明細書に用いられるように、miR遺伝子産物の発現は、
被検体由来の試験サンプルにおけるmiR遺伝子産物の量がコントロールサンプルにおけ
る同様な遺伝子産物の量よりも多い時に、アップレギュレートされたものである。これら
のアップレギュレートされたマイクロRNAsの例として、下記表1に列挙された配列番
号:1〜6が挙げられる。
その他の用いられうるアップレギュレートされたマイクロRNAsとしては、Ho et
al., Transl Oncol. 2010;3:109−113; Wang
et al. Cancer Prev Res (Phila). 2009 Se
p;2(9):807−13; Lee et al. Int. J. Cancer
. 2007, 120(5):1046−1054;および米国出願第 201101
71646号明細書に開示されたものが挙げられる。本明細書で引用されたこれらの参考
文献の全ては、その全体が本明細書に組み込まれる。コントロールサンプルにおける相対
的なmiR遺伝子発現は、一以上のRNA発現標準に対して決定することができる。前記
標準は、例えば、事前に正常コントロール群から入手したmiR遺伝子発現の平均レベル
を含みうる。
トロールサンプルにおける対応のmiR遺伝子産物のレベルよりも低い(すなわち、mi
R遺伝子産物の発現は、「ダウンレギュレートされた」または「過少発現(under−
expressed)」である)。本明細書に用いられるように、miR遺伝子産物の発
現は、被検体由来の試験サンプルにおけるmiR遺伝子産物の量がコントロールサンプル
における同様な遺伝子産物の量よりも少ない時に、ダウンレギュレートされたものである
。
上述した遺伝子、関連のキットまたはアレイは、被検体が細胞増殖性疾患を患っている
かまたは細胞増殖性疾患を発症するリスクを有しているかを診断するのに使用することが
できる。また、それらは、被検体におけるかような疾患の予後を診断するのに使用するこ
とができる。
一態様において、本発明は、被検体が制御されない自律的細胞増殖によって特徴付けら
れた疾患(例えば、癌)を患っているかまたは前記疾患にかかりやすいかを診断するため
の定量的および定性的な情報を提供する。細胞増殖性疾患を患っているまたはそれにかか
りやすい被検体は、当該被検体からの試験サンプルにおける上述した遺伝子またはそれら
の産物(マイクロRNA)の発現レベル、パターン、またはプロファイルに基づいて診断
されうる。言い換えると、前記産物は、疾患の存在または不存在を示すマーカーとして用
いられうる。本発明の診断または予後アッセイは、産物の発現レベルを評価するための方
法を含む。前記方法およびキットは、癌のような細胞増殖性疾患を検出することができる
。例えば、一以上のアップレギュレートされた遺伝子の発現レベルにおける相対的な増加
は、疾患存在の指標である。逆に、より低い発現レベルまたは発現不足は、疾患不存在の
指標である。
体から試験サンプルを得ることおよび前記試験サンプルを、核酸を検出できる化合物また
は試薬(例えば、RNAまたはDNAプローブ)と接触させることによって判断されうる
。前記「試験サンプル」は、被検体に存在する組織、細胞および体液、並びに被検体から
単離された組織、細胞、および生体液を含む。目的の遺伝子(遺伝子ら)の発現レベルは
、遺伝子によりコードされたRNAを測定することを含む様々な方法で測定することがで
きる。
することができる。例えば、生物サンプルは、必要に応じて、RNAを安定化するための
付加的成分を含む、グアニジンベースの溶解バッファ中に溶解させることができる。いく
つかの実施形態において、前記溶解バッファは、細胞培養物からのRNAの回収および安
定性を観察するためのコントロールとして、精製されたRNAsを含むことができる。か
ような精製されたRNAの例として、プロメガ社(Madison, WI)からのKa
namycin Positive Control RNA、およびライフテクノロジ
ーズ社(Rockville, MD)からの7.5kbPoly(A)−Tailed
RNAが挙げられる。溶解物は、直ちに使用されてもよく、または例えば−80℃で凍
結保存されてもよい。
, Valencia, CA)のようなオートメーション互換性の96−ウェルフォー
マットで、シリカベース単離を用いて、細胞溶解物(またはサンプルのその他のタイプ)
から精製することができる。その他のRNA単離方法としては、例えばシリカ被覆ビーズ
またはグアニジンでの抽出などが考えられる。RNA単離および調製のさらなる方法は、
当業者によって考案することができる。
血漿、または細胞溶解物)を用いて行うことができる。RNAse阻害剤は、必要に応じ
て前記粗製サンプルに添加される。粗製の細胞溶解物を用いるときに、ゲノムDNAは、
サンプルに依存して、例えば遺伝子のような標的配列の1以上のコピーに寄与できること
に留意すべきである。前記標的配列が1つ以上の高度に発現された遺伝子から誘導される
場合、ゲノムDNAから生じるシグナルは、重要ではないかもしれない。しかし、低いレ
ベルで発現された遺伝子にとって、バックグラウンドは、DNAseで前記サンプルを処
理するか、またはcDNAまたは増幅産物の継続のプライミングのためのスプライス部位
を対象とするプライマーを用いるかによって、除去することができる。
決定することができる。試験サンプルから単離されたRNAは、ハイブリダイゼーション
、またはサザンもしくはノザン解析、PCR解析、およびプローブアレイを含む増幅分析
に用いることができる。RNAレベルの検出のための好ましい診断方法は、単離されたR
NAを遺伝子によってコートされたRNAにハイブリダイズできる核酸プローブと接触さ
せることを含む。前記プローブは、完全長核酸またはその一部であってもよく、例えば、
ストリンジェントな条件下でRNAにハイブリダイズするのに十分である、長さが少なく
とも10ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであることができる。
記RNAをニトロセルロースのような膜に転写するによって、RNA(またはそれによっ
て調製されたcDNA)を表面に固定されプローブに接触させる。他の構成では、例えば
、遺伝子チップアレイにおいて、プローブを表面に固定され、RNA(またはcDNA)
を前記プローブに接触させる。当業者は、RNAのレベルを検出するための既知のRNA
検出法に適合させることができる。
よって調製されたcDNA)のレベルは、例えば、標準PCR(米国特許第4,683,
202号)、RT−PCR(Bustin S. J Mol Endocrinol.
25:169−93, 2000)、定量的PCR(Ong Y. et al.,
Hematology. 7:59−67, 2002)、リアルタイムPCR(Gin
zinger D. Exp Hematol. 30:503−12, 2002)
、およびインサイチュPCR(Thaker V. Methods Mol Bio
l. 115:379−402, 1999)などの核酸増幅、または当該分野で公知技
術を用いて増幅された分子の検出に続く、任意のあの核酸増幅方法を用いて評価すること
ができる。
出できる化合物または試薬に接触させること、および前記コントロールサンプルにおける
RNAの存在を試験サンプルにおけるRNAの存在と比較することをさらに含む。
体のリスクを評価するのに使用することができる。特に、本発明は、早期検出に重要な洞
察を得るように、既に一定のリスクを持っている人のハイリスクコホートのものにも適用
することができる。例えば、約10%の膵臓癌の起源は遺伝性であり(Klein et
al. Cancer J 2001;7:266−73; Bartsch et
al. Int J Cancer 2004;110:902−6;およびHemm
inki et al. Int J Cancer 2003;103:525−3
0)、並びにいくつかの個体における膵臓癌の生涯リスクは約50%であり(Rulya
k et al. Pancreatology 2001;1(5):477−85)
、スクリーニングおよび監視のためのマイクロRNAシグネチャーは、重要になりうる。
つ以上満たす個体を含む。
2.早い年齢(50歳未満)で膵臓癌と診断された第一度近親者を有する個体;
3.2人以上の早い年齢(60歳未満)で膵臓癌を発症した第二度近親者を有する個体
;
4.BRCA IおよびBRCA II変異によって影響された家族のメンバー;
5.家族性非定型マルチモルメラノーマ(FAMM)症候群を有する家族のメンバー;
6.遺伝性膵炎を持つこと;
7.HNPCC症候群を持つこと;
8.家族性大腸腺腫症(FAP)症候群を持つこと;
9.ポイツ−イエーガー(Peutz−Jeghers)症候群を持つこと;および
10.従来の方法でのルーチン検査によって、異常な超音波検査または膵臓のCT撮影
が発見されている患者。
質転換もしくは腫瘍性表現型の発症の前にまたはその初期段階で、検出することができる
。したがって、本発明はまた、膵臓癌を発症するリスクを有する被検体をスクリーニング
をするための方法を提供し、被検体の膵臓から得られた生体サンプルにおいて、膵臓癌に
関連した、少なくとも一つのmiR遺伝子産物またはmiR遺伝子産物の組み合わせのレ
ベルを評価することを含む。したがって、コントロールサンプルにおける対応のmiR遺
伝子産物のレベルに比べて、前記生体サンプルにおけるmiR遺伝子産物またはmiR遺
伝子産物の組み合わせのレベルにおける変化は、膵臓癌を発症するリスクを有する被検体
の指標である。かようなスクリーニングに使用された前記生体サンプルは、正常のまたは
前癌性であると疑われる膵臓組織のいずれかを含みうる。膵臓癌に関連した1つ以上のm
iR遺伝子産物のレベルの変化を有する被検体は、さらなる監視および試験のための候補
者である。かようなさらなる試験は、組織サンプルの組織学的検査、または当業者の範囲
内での他の技術を含みうる。
疾患もしくは障害の段階もしくは程度を決定することを意味する。通常、疾患または障害
の診断は、1つ以上の因子および/または疾患の指標となる症候の評価に基づいている。
つまり、診断は、疾患または症状の存在または非存在の指標である因子の、存在、非存在
または量に基づいて行うことができる。特定の疾患の診断のための指標と考えられている
各因子または症候は、排他的に当該特定の疾患に関連する必要がない;すなわち、診断の
因子または症候から推測できる差動診断(differential diagnose
s)があってもよい。同様に、特定の疾患の指標である因子または症候が、前記特定の疾
患を有していない個体中に存在する場合もありうる。前記診断方法は、単独で、または特
定の疾患または障害(例えば、膵臓癌)のための、医療分野に知られている他の診断およ
び/または病期診断方法と組み合わせて使用することができる。
上述した診断方法は、細胞増殖疾患を患っているかまたは細胞増殖疾患を発症するリス
ク有している被検体を同定することができる。加えて、例えば、末梢血サンプルなどの生
体サンプルにおける発現レベルにおける変化および/または上述した遺伝子(またはその
サブセット)の動向は、回復またはその不足の早期兆候を提供することができる。例えば
、さらなる増加(もしくは減少)または規制されていない(unregulated)遺
伝子(またはダウンレギュレートされた遺伝子)の継続的に改変された遺伝子発現レベル
は、予後不良、すなわち、改善または健康衰退の欠如を示す。このため、これらの遺伝子
は、癌の治療後の回復を評価させることができる。遺伝子もしくはそのサブセットのこの
選抜グループの分析は、当該状態の結果を示す。
連した疾患を治療するための薬剤(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣
物、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、または他の薬剤候補)と一緒に投与されるの
に適しているか否かを決定するために用いることができる。例えば、かようなアッセイは
、被検体が化学治療剤と共に投与されることができるか否かを決定するのに用いられる。
て提供される。この目的のために、本発明に開示された遺伝子の遺伝子発現レベルは、治
療を受ける前、受ける最中、または受けた後に、被検体からの試験サンプルについて決定
することができる。ベースラインレベルに比べて当該レベルにおける変化の大きさはその
後評価される。治療後の変化の大きさの減少は、当該被検体が同様な治療によって更なる
治療されることができることを示す。例えば、1つ以上のアップレギュレートされた遺伝
子の発現レベルにおける相対的な減少は、疾患からの回復の指標である。逆に、1つ以上
のアップレギュレートされた遺伝子のさらなる増加または継続的な高い発現レベルは、改
善または健康衰退の欠如の指標である。
る他の有害状態の予測、識別進行、並びに臨床管理に有用である。好ましい実施形態にお
いて、上記の診断アッセイは、制御されない、自律的な細胞増殖によって特徴付けられる
状況の予測、識別進行、並びに臨床管理に有用な情報を提供する。前記情報は、より具体
的に、苦しめられた被検体、ヒトの体からのかような状況を根絶するための化学療法また
は他の治療法の設計において、臨床医を支援する。
び転帰の予測を意味する。予後は、通常、疾患の良好なもしくは不利な経過または転帰の
指標となる疾患の因子もしくは症候を評価することによって行われる。本明細書で用いら
れる「予後を決定すること」という語句は、当業者が、患者の症状の経過または転帰を予
測することができるプロセスを指す。「予後」という用語は、100%の精度を持つ状態
の経過や結果を予測する能力を指すものではなく、当業者は、用語「予後」は、一定の経
過または転帰が起こる、向上した確率を意味することであると理解するだろう;つまり、
これは、経過または転帰は、状態を表さない個体に比べる際に、所定の条件を示す患者で
発生する可能性が高いことである。
ない予後」および「ネガティブ予後」は、症状または疾患の可能な経過および/または起
こりそうな結果を予測するための相対的な用語である。好ましいまたはポジティブ予後は
、好ましくないまたはネガティブ予後よりも、状態のより良い結果を予測する。一般的な
意味では、「好ましい予後」は、特定の状態と関連することができる他の多くの可能な予
後よりも比較的に良い結果であり、一方、好ましくない予後は、定の状態と関連すること
ができる他の多くの可能な予測よりも比較的に悪い結果を予測する。好ましくまたはポジ
ティブ予後の典型的な例として、平均治癒率よりも良く、転移のより低い傾向、期待され
た平均余命よりも長く、癌プロセスから良性のプロセスの差別化等が挙げられる。例えば
、ポジティブ予後は、患者が治療後に特定の癌の治癒された確率が50%であるものを指
し、その一方で、同じ癌を有する平均的な患者が治療後に特定の癌の治癒された確率がわ
ずか25%である。
および定性的測定の両方を含み、特徴、特性、または機能が存在するかどうかを決定する
ことを含む。評価は、相対的または絶対的でありうる。標的の「存在を評価すること」は
、標的の存在量を決定することだけではなく、それが存在しているかどうかを決定するこ
とを含む。
本発明において、バイオチップまたはアレイも提供される。前記バイオチップ/アレイ
は、取り付けられたプローブもしくは複数の本明細書に記載されたプローブを有する固体
または半固体基板を含むことができる。前記プローブは、ストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件下で、標的配列にハイブリダイズすることができる。前記プローブは、
基板上の空間的に規定されたアドレスに取り付けられてもよい。標的配列ごとに1つ以上
のプローブは、重複のプローブ、または特定の標的配列の異なる部分に対応するプローブ
とともに使用することができる。前記プローブは、当業者によって認識された単一の疾患
に関連する標的配列にハイブリダイズすることが可能である。前記プローブは、バイオチ
ップの後の付着と共に最初に合成されてもよく、またはバイオチップ上に直接合成されて
もよい。
mmobilized)」は、核酸(例えば、プローブ)および固相担体が、前記プロー
ブと前記固相担体との間の結合が結合、洗浄、分析、および除去の条件下で十分に安定で
きることを意味し得ることを指す。前記結合は、共有結合であってもよく、非共有結合で
あってもよい。共有結合は、プローブと固相担体との間に直接形成されてもよく、架橋剤
によって、または固相担体かプローブかもしくは両方の分子において特定な反応基の介在
によって形成されてもよい。非共有結合は、1つ以上の静電性、親水性、および疎水性相
互作用であってもよい。担体への例えばストレプトアビジンのような分子の共有結合およ
び前記ストレプトアビジンへのビオチン化されたプローブの非共有結合は、非共有結合に
含まれる。固定化は、共有結合および非共有結合性相互作用の組み合わせも含みうる。
なくとも1つの検出方法に適していることができる材料であることができる。かような基
板の例として、ガラスおよび修飾しくは機能化されたガラス、プラスチック(アクリル、
ポリスチレン及びスチレンとその他の材料との共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン
、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン(登録商標)などを含む)、多糖類、ナイロン
またはニトロセルロース、樹脂、シリカまたはシリカ系材料(シリコンおよび修飾された
シリコンを含む)、カーボン、金属、無機ガラスおよびプラスチックが挙げられる。基板
は、感知できるほどの蛍光なしで光学検出を可能にすることができる。
プローブは、流水式(flow−through)のサンプル分析のために、サンプルの
体積を最小限にするように、チューブの内表面に配置されることができる。同様に、基板
は、特にプラスチック製の独立気泡発泡体を含め、軟質フォームのような柔軟なものであ
ってもよい。
で誘導体化されてもよい。例えば、バイオチップは、アミノ基、カルボキシル基、オキソ
基またはチオール基等を含むがこれらに限定されてない化学的官能基で誘導体化されるこ
とができる。これらの官能基を用いて、プローブは、当該プローブ上に直接的にもしくは
リンカーを用いて間接的に、官能基を用いて付着することができる。プローブは、5’末
端、3’末端、または内部のヌクレオチド経由によって、固相担体に付着することができ
る。プローブはまた、非共有結合によって固相担体に付着することができる。例えば、ス
トレプトアビジンで共有結合的に被覆された表面に結合できるビオチン化されたオリゴヌ
クレオチドを準備することができ、その結果、付着につながる。また、光重合およびフォ
トリソグラフィーなどの技術を用いて、前記表面にプローブを合成することができる。固
相担体に核酸を結合させるための方法の詳細な論議は、例えば、米国特許第583783
2号、第6087112号、第5215882号、第5707807号、第580752
2号、第5958342号、第5994076号、第6004755号、第604869
5号、第6060240号、第6090556号および第6040138号から見出すこ
とができる。
イクロRNA遺伝子の転写産物)は、核酸アレイに表される。このような実施形態におい
て、結合部位のセットは、発現された転写産物の異なる配列セグメントに相補的な異なる
核酸を持つプローブを含みうる。かような核酸の例としては、長さ15〜200塩基、2
0〜100塩基、25〜50塩基、40〜60塩基であるものが挙げられる。各プローブ
配列は、その標的配列に相補的な配列に加えて、1つ以上のリンカー配列を含むこともで
きる。リンカー配列は、その標的配列に相補的な配列と、担体の表面との間にある配列で
ある。例えば、本発明の核酸アレイは、各標的マイクロRNA遺伝子に特異的な1つのプ
ローブを有することができる。なお、所望があれば、核酸アレイは、いくつかの発現され
た転写産物(例えば、本明細書に記載されたマイクロRNA遺伝子の転写産物、例えば、
配列番号:1〜6)に特異的な少なくとも5、10、100、200、300、400、
500以上のプローブを含むことができる。
他の態様において、本発明は、本発明に記載されたマイクロRNA遺伝子発現解析のた
めの方法、組成物およびシステムを具現化するキットを提供する。
みうる:アッセイ試薬、バッファ、プローブおよび/またはプライマー、および滅菌生理
食塩水またはその他の製薬上許容できるエマルションおよびサスペンションベース。さら
に、キットは、本明細書に記載の方法を実施するための指示(例えば、プロトコール)を
含む教材を含んでもよい。例えば、キットは、標的マイクロRNA配列の増幅、検出、同
定または定量するためのキットであってもよい。そのために、キットは、適切なプライマ
ー(例えば、ヘアピンプライマー)、順方向プライマー、逆方向プライマー、およびプロ
ーブを含んでもよい。
に対応する)が配置されている、1つ以上のマイクロアレイスライド(または代替のマイ
クロアレイフォーマット)を含む。キットは、複数の標識されたプローブを含むこともで
きる。また、キットは、プローブとして適している複数のポリヌクレオチド配列、および
前記含まれたポリヌクレオチド配列、または当業者の裁量によるその他のポリヌクレオチ
ド配列をカスタマイズするのに適している標識の選択を含みうる。通常、少なくとも1つ
の含まれたポリヌクレオチド配列は、例えば標準化遺伝子などのコントロール配列に相当
する。例示的な標識は、核酸プライマーに連結し、フルオロフォア、染料、放射性標識、
酵素タグなどを含むがこれらに限定されない。
いるキットが提供される。かようなキットは、本明細書に記載の任意の増幅方法に用いる
のに適している試薬およびプライマーを含む。またもしくはさらに、キットは、プローブ
と標的核酸サンプル(例えば、マイクロアレイ上に配置された)との間のハイブリダイゼ
ーションに対応するシグナルを増幅するのに適している。
よび/または試薬は、必要に応じて前記キットに含まれる。さらに、核酸を増幅するのに
適しており、様々なポリメラーゼ(RT、Taq、など)を含む1つ以上の酵素、1つ以
上のデオキシヌクレオチド、およびバッファは、任意に前記キットに含まれ、増幅のため
の必要な反応混合物を提供する。
ターンを分析するために使用される。前記mRNAテンプレートは、全細胞RNAまたは
単離されたマイクロRNAのいずれかとして表現されてもよく、サンプルの両方のタイプ
が類似な結果を生み出す。他の実施形態において、本発明に記載の方法およびキットは、
tRNA、rRNA、または他の転写産物を含む遺伝子発現のその他の製品の定量化を可
能にする。
ベースへのアクセスを容易にするためのソフトウェアをさらに含む。前記ソフトウェアは
、論理演算命令、命令セット、またはデータの収集、保管及び/又は分析に用いることが
できる適切なコンピュータプログラムを含む。データの比較および相関解析は、提供され
たソフトウェアを用いて実行できる。
を含む。各成分は、一般的にそれぞれの容器に等分されることに適しているであろう。前
記キットの容器は、任意に少なくとも1つのバイアル、アンプル、または試験管を含む。
フラスコ、ボトルおよびその中に試薬が配置および/または当分されるその他の容器装置
も適用できる。キットの個別な容器は、市販のために厳重管理されることが好ましい。適
当な大きな容器は、注射または所望のバイアルが保持されるブロー成形プラスチック容器
を含むことができる。本発明のキットの使用を詳細に記載する指示書またはビデオテープ
に録画された実物説明等の説明書は、必要に応じてキット中に提供される。
用、本明細書に記載の任意の方法またはアッセイの実施、および/または本明細書に記載
の任意のアッセイまたは方法を実施するための任意の装置またはキットの使用を提供する
。
椎動物が挙げられ、例えば、人間以外の哺乳類、人間以外の霊長類(特に、高等霊長類)
、イヌ、齧歯動物(例えば、マウスまたはラット)、モルモット、ネコ、およびラビット
などの哺乳動物、並びに鳥類、両生類、爬虫類などの非哺乳類が挙げられる。一実施形態
において、前記被検体は、ヒトである。他の実施形態において、前記被検体は、実験的な
、疾患モデルとして適した非ヒト動物または動物である。
織または体液のサンプルを意味する。かようなサンプルは、動物から単離された組織また
は体液を含むが、これらに限定されない。生体サンプルは、生検および剖検サンプルのよ
うな組織の切片、組織学的目的のために採取された凍結切片、血液、血漿、血清、痰、便
、涙、粘液、尿、胸水、羊水、腹水、毛髪、及び皮膚も含みうる。生体サンプルはまた、
患者に由来する外植片および初代のおよび/または形質転換された細胞培養物を含む。生
体サンプルは、動物から細胞のサンプルを除去することによって提供されることができる
が、事前に単離された細胞(例えば、別の時間で、および/または別の目的で、別の人に
よって単離された)を用いることによっても達成することができ、またはインビボで本明
細書に記載の方法を行なうことによって提供されうる。そのような処置または転帰履歴を
有するもののような保管組織(Archival tissues)を使用してもよい。
は、動物の体からの任意の液体を意味する。体液の例として、血漿、血清、血液、リンパ
液、脳脊髄液、滑液、尿、唾液、粘液、痰(phlegm)および痰(sputum)が
挙げられるが、これらに限定されない。任意の適切な方法によって体液を集めることがで
きる。体液サンプルは、直ちに使用されてもよく、その後の使用のために保存されてもよ
い。当技術分野で公知の任意の適切な方法は、体液サンプルを保存するために使用できる
:例えば、約−20℃から約−70℃でサンプルを凍結することができる。適切な体液の
無細胞流体(acellular fluid)である。「無細胞」流体は、中に細胞が
存在しないまたは決定されたmiRNAのレベルが細胞の一部分というよりもむしろサン
プルの液体部分においてそのレベルを反映するような低い量で存在する体液サンプルを含
む。かような無細胞体液は、一般的に細胞含有体液を処理することによって製造すること
ができ、例えば細胞除去するために遠心分離または濾過によって行うことができる。一般
的に、無細胞体液は、無傷の細胞を含まないが、細胞片または細胞残屑を含みうる。無細
胞流体の例として、血漿もしくは血清、または細胞が除去された体液が挙げられる。
/または翻訳調節配列および/またはコード領域および/または非翻訳配列(例えば、イ
ントロン、5’−および3’−非翻訳配列)を含む合成的な遺伝子を意味する。遺伝子の
コード領域は、アミノ酸配列またはtRNA、rRNA、触媒RNA、siRNA、mi
RNAもしくはアンチセンスRNAのような機能性RNAにコードするためのヌクレオチ
ド配列であることができる。遺伝子は、必要に応じて、それに連結する5’−または3’
−非翻訳配列を含むコード領域(例えば、エクソンおよびmiRNA)に対応するmRN
AまたはcDNAであってもよい。遺伝子はまた、コード領域および/またはそれに連結
する5’−もしくは3’−非翻訳配列の全てまたは一部を含み、インビトロで生成され増
幅された核酸分子であってもよい。当該用語は、タンパクをコードする能力を失っている
または細胞内に更なる発現ができないことが知られている遺伝子の機能不全の類似物であ
る、偽遺伝子(pseudogenes)も含む。
発現プロファイルを意味する。核酸配列のレベルを決定するための任意の便利な手段によ
って生成することができ、例えば、マイクロRNA、cRNAなどの定量的なハイブリダ
イゼーション、定量的PCR、定量化のためのELISA等によって生成でき、2つのサ
ンプル間で異なる遺伝子発現解析を可能にすることができる。被検体または患者サンプル
、例えば、細胞または組織などのそのコレクション、はアッセイされる。試料は、当技術
分野で公知の任意の簡便な方法によって回収される。目的の核酸配列は、予測できる核酸
配列であり、本発明に記載の核酸配列を含み、そこで、発現プロファイルは、列挙された
核酸配列の全てを含み、5、10、20、25、50、100またはそれ以上の発現デー
タを含むことができる。用語「発現プロファイル」はまた、測定サンプル中の核酸配列の
存在量を測定することを意味することができる。
細胞の遺伝子発現パターンにおける定量的または定性的な差を意味する。このため、示差
的に発現された遺伝子は、正常対疾患組織において活性化または不活性化を含み、定性的
にその変化された発現を有することができる。遺伝子は、特定な状態下でスイッチオン(
turned on)またはスイッチオフ(turned off)されることができ、
他の状態と比較すると2以上の状態の比較を可能にすることができる。定性的にレギュレ
ートされた遺伝子は、標準的な技術により検出可能な状態または細胞型内において、発現
パターンを示すことになる。いくつかの遺伝子は、1つの状態または細胞型内において発
現されるが、両方ではできない。また、発現における差は、定量的であることができ、例
えば、調節された、転写産物の量の増加をもたらすアップレギュレート、または転写産物
の量の減少をもたらすダウンレギュレートの発現がある。異なる発現に対する度合いは、
発現アレイ、定量的逆転写酵素PCR、ノザン解析、およびRNase保護などの標準的
な特性評価技術を介して、定量化するのに十分な大きさのみが必要とされている。
ド」は、少なくとも2つのヌクレオチドが互いに共有結合されたものを意味する。一本鎖
の説明は、その相補鎖の配列も定義する。このため、核酸は、描写された一本鎖の相補鎖
も含む。核酸の様々な変異体は、所定の核酸と同じ目的で使用されうる。このため、核酸
は、実質的に同一の核酸およびその相補体も含む。一本鎖は、ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズし得るプローブを提供する。したが
って、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする
プローブも含む。
の一部であってもよい。核酸は、DNA、ゲノムおよびcDNAの両方、RNA、または
核酸がデオキシリボ−およびリボ−ヌクレオチドの組み合わせ、並びにウラシル、アデニ
ン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシ
ンおよびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含みうるハイブリッドでありうる。化学
的な合成法または組換え法によって核酸を得ることができる。
かつ核酸ポリメラーゼによって伸長することができるフリーの3’ヒドロキシ末端を提供
する任意の核酸を意味する。本明細書に用いられる増幅プライマーは、遺伝子の5’また
は3’領域にアニールすることができ(それぞれプラスおよびマイナスストランド、逆も
また同じ)、その間に短い領域を含む一対の核酸分子である。適切な条件下でおよび適切
な試薬を用いて、かようなプライマーは、当該プライマーに隣接するヌクレオチド配列を
有する核酸の増幅を可能にする。本来の方法(in situ methods)では、
細胞または組織サンプルを準備し、スライドガラスのような担体上に固定し、その後RN
Aへハイブリダイズできるプローブと接触させることができる。発現されたRNAサンプ
ルに対応する核酸を増幅するための代替の方法としては、例えば米国特許第7,897,
750号に開示されたものが挙げられる。
補的な塩基対を介して、通常水素結合を介して、相補配列の標的核酸に結合できるオリゴ
ヌクレオチドを意味する。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシ
ーに応じて、プローブ配列との完全な相補性を欠く標的配列を結合することができる。本
明細書に記載の標的配列と一本鎖核酸との間のハイブリダイゼーションを妨害する、任意
の数のミスマッチ塩基対が存在してもよい。しかし、少なくともストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件下においてもハイブリダイゼーションが起こらないほど変異の数
が大きい場合は、当該配列は、相補的な標的配列ではない。プローブは、一本鎖または部
分的な一本鎖および部分的な二本鎖であってもよい。プローブの鎖数は、標的配列の構造
、組成、および特性によって決定される。プローブは、直接的に標識されてもよく、例え
ばその後に結合できるストレプトアビジン複合体にビオチンで間接的に標識されてもよい
。
ヌクレオチドアナログの間にワトソン−クリック(例えば、A−T/UおよびC−G)ま
たはフーグスティーン塩基対を形成できる核酸を意味する。完全な相補体また完全に相補
的は、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの間で100%の相補的な塩
基対を形成することを意味する。
、核酸の複合混合物中において、第1の核酸配列(例えば、プローブ)が第2の核酸配列
(例えば、標的)にハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配
列依存であり、異なる環境下で異なり、当業者によって適宜に選択することができる。ス
トリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびpHにおいて、特定の配列に対す
る熱的溶解温度(Tm)よりも約5〜10℃低くなるように選択することができる。前記
Tmは、(規定されたイオン強度、pHおよび核酸濃度下で)標的に相補的なプローブの
50%が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度でありうる(標的配列が過剰に存
在するため、Tmでは、プローブの50%が平衡状態で占有される)。ストリンジェント
な条件は、塩濃度が約1.0Mナトリウムイオン未満であり、例えば、pH7.0〜8.
3で、約0.01〜1.0Mナトリウムイオン濃度(またはその他の塩)であり、温度が
、短いプローブ(例えば、約10〜50ヌクレオチド)に対して少なくとも約30℃であ
り、長いプローブ(例えば、約50ヌクレオチドよりも長い)に対して少なくとも60℃
である条件でありうる。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤
の添加によって達成され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションについて、
陽性シグナルは少なくとも2〜10倍のバックグラウンドハイブリダイゼーションであろ
う。典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下のようである:50
%のホルムアミド、5xSSC、および1%のSDS、42°Cでインキュベート、また
は、5xSSC、1%のSDS,65°Cでインキュベート、65°Cで0.2xSSC
および0.1%のSDS中に洗浄。しかし、温度以外のいくつかの因子(例えば、塩濃度
)はハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与えることができ、当業者は
、適宜に因子を選択し、類似のストリンジェンシーを達成することができる。
の転帰と相関する値を意味する。好ましい実施形態において、基準値は、マイクロRNA
の発現を既知の臨床転帰と比較する研究の統計分析から決定される。基準値は、閾値スコ
ア値またはカットオフスコア値であってもよい。通常、基準値は、閾値より高い(または
低い)値でありうり、この場合は1つの結果がより確かであり、低い場合は代替の閾値が
より確かである。
られたサンプルからの循環(circulating)miRNAのレベルの平均値とし
て、1つ以上の発現された循環miRNAのレベルでありうる。他の実施態様において、
基準レベルは、例えば、本発明のアッセイの前に、異なる期間の同じ被検体におけるレベ
ルであることができ、例えば被検体が疾患を患う前または治療開始前に決定されたレベル
である。一般的に、サンプルは、共通因子によって標準化される。例えば、無細胞体液サ
ンプルは、体積体液によって標準化され、細胞含有サンプルは、タンパク質含有量または
細胞数によって標準化される。核酸サンプルも内部コントロール核酸に対して標準化され
うる。
はその段階の指標である。語句「レベルの差」は、特定のマーカーの(例えば、サンプル
においてコントロールまた基準レベルと比較する核酸)量の差を意味する。例えば、特定
のバイオマーカーの量は、基準レベルと比較して、腫瘍性疾患を有する患者のサンプル中
に上昇した量でまたは減少量で存在してもよい。一実施形態において、「レベルの差」は
、コントロール(例えば、基準値)と比較して、少なくとも約1%、2%、3%、5%、
10%の、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、75%
、80%、100%、150%、200%、またはそれ以上である、サンプルに存在する
特定のバイオマーカーの量の間の差であることができる。一実施形態において、「レベル
の差」は、コントロールと比較して、サンプル中に存在するバイオマーカーの量の間の統
計的に有意な差であってもよい。例えば、バイオマーカーの測定レベルが、任意のコント
ロールまたは基準群の平均の約1.0標準偏差、約1.5標準偏差、約2.0標準偏差、
または約2.5標準偏差の外にある場合では、差は統計学的に有意である。miRNAの
測定に関して、前記レベルは、Ct値としてリアルタイムPCRから測定することができ
、以下の実施例に記載されるようにΔCt値に標準化することができる。
この実施例において、マイクロRNAマイクロアレイスクリーニングは、発現レベルが
変化した膵臓癌患者のマイクロRNAを同定するために行われた。
能な現在のmiRNA配列情報、サンガーmiRBaseリリース16(http://www.mir
base.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?org=hsa)をサンプリングするように設計されたマ
イクロアレイを用いて、グロバールmiRNAプロファイリングを行った。当該マイクロ
アレイは、ほぼ1000個のヒトmiRNA配列を検出するように設計された。当該血清
サンプルは、10人の健康被検体、10人の膵臓癌患者(ステージ2A/2Bの膵臓癌を
有する9人および神経内分泌腫瘍を有する1人を含む)、および10人のハイリスク被検
体に由来した。
血清miRNAが高い強度を示し、カットオフ閾値を満たしたことが分かった。これらの
うち、116個のmiRNAsは、膵臓癌血漿のための重要なマイクロRNAシグネチャ
ーとして同定された。下記の表2を参照すると、116個のmiRNAは、膵臓癌と健康
コントロールとの間またはハイリスクグループと健康コントロールとの間の倍率変化(F
old Change)における有意性に基づきランク付けされた。これらの116個の
有意なmi−RNAにおいて、少なくとも上位30のmiRNAsは約2倍以上の変化(
アップまたはダウン)を示した。
ールとの間の倍率変化」の値に基づき、2つのパネルにグループ化することができる。具
体的には、第1のパネルにおけるマイクロRNAsは、膵臓癌患者においてアップレギュ
レートされたものであり、それらの「膵臓癌および健康コントロールの倍率変化」の値が
1.0超であり;第2のパネルにおけるマイクロRNAsは、膵臓癌患者においてダウン
レギュレートされたものであり、それらの「膵臓癌および健康コントロールの倍率変化」
の値が1.0未満である。
タリングは、大部分(8/9)膵臓癌被検体が健康被検体から分離されたことを示した。
図1参照。単独の膵臓神経内分泌腫瘍は健康被検体のクラスタ内で分離されたことも分か
った。
被検体を区別できることが確認された。このシグネチャーは、健康被検体と比較して膵臓
癌被検体において、後述の基準をもとに同定された:(i)アップレギュレートされた>
3.1倍、(ii)p−値<0.005、(iii)感度:>77%(癌被検体を検出す
るために)、および(iv)感度:>70(予備受信者動作特性(ROC)分析に基づい
て検討被検体を検出するために)。この12個体のmiRNAsの候補miRNAシグネ
チャーは、従来Bloomston et al., JAMA 2007;297:1
901−8; Szafranska et al., Oncogene 2007;
26:4442−52; Szafranska et al., Clin Chem
. 2008;54:1716−24;およびLee et al., Int J C
ancer. 2007;120:1046−54に報告されたmiRNAsと異なる。
前記論文に開示されたこれらのmiRNAsは、miRBaseの早期リリースに基いた
より少量のマイクロRNAsを検出するために設計されたプローブを用いて、末期被検体
の膵臓癌生体検査のマイクロアレイ分析から同定された。
上述したマイクロアレイデータは、事実上定性的である。その結果を、RTqPCRの
ような定量的な照合に導入することが重要である。このため、この実施例において、血液
ベースのマイクロRNAバイオマーカーとしてシグネチャーマイクロRNAを同定すると
いう目標を達成するように、独立した方法により、上述した12個のマイクロRNAsを
確認するために、アッセイを行った。
ムズ、フォスターシティ、CA)を、拡張したサンプルプールにおけるマイクロRNAを
検証するために使用した。以下に概説される研究サンプルを拡張させること(Expan
ding)は、より検証およびデータ分析のための新たなコホートのために許される。具
体的に、30のステージ2A/2B膵臓癌、10のハイリスク被検体、10の無関係の悪
性腫瘍、5つの膵臓の良性嚢胞性腫瘍、5つの慢性膵炎、および5つの健康ボランティア
を含む追加の65人の被検体からの血液の分析である。
ための重要な有用性を有する。約10%の膵臓癌の起源は遺伝性であり(Klein e
t al. Cancer J 2001;7:266−73; Bartsch et
al. Int J Cancer 2004;110:902−6;およびHem
minki et al. Int J Cancer 2003;103:525−
30)、いくつかの個体における膵臓癌の生涯リスクは約50%であるため、スクリーニ
ングおよび監視のためのマイクロRNAシグネチャーは、重要になりうる。
iRNA発現分析のためにリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(リアルタイムqP
CR)が実行された。上述したmiRsのレベルは、TaqManマイクロRNAアッセ
イプロトコール(アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、CA)に従い、遺伝
子特異的なTaqMan(商標)マイナーグルーブ結合(MGB)プライマーを用いて、
ステムループリアルタイムqPCRによって決定した。
ォルトの閾値設定は、閾値サイクル(CT)を決定するために用いられた。miRNA発
現の相対的な定量化のために比較CT法(2−ΔCT)を用いた。MiR−3196のm
iRNAが最小限の変動を示したため、MiR−3196をレファレンス(normal
izer)として用いた。各miRNAの相対的な発現レベルは、前記レファレンスと比
較して、式2−ΔCTを用いて計算した。この際、ΔCTは各標的遺伝子と前記レファレ
ンスとの差を表す(前記標的の平均CT−(マイナス)miR−3196の平均CT)。
データ処理の手順は以下に示される:
1.RT−PCRプレートの384ウェルおよび96ウェルの生CT値は、RQマネー
ジャー1.2.1からエクスポートされ、「生」の値を得て、これらは「qPCR_mi
R*」タブに示された。
引くために用いられた。
ェルおよび96ウェルデータの相関を算出した。
とによって計算され、「ND」は、「平均CTs」値を得るために、最小の検出されたC
T値(CT――>40)と置き換えられた。
は、標準化コントロールmiRNAとして選ばれた。
算した。
ントロール(miR−3196)の平均CTを差し引いた。
トロールの総平均(grand mean)を差し引いた。
miRNA平均の「ΔCT」値を差し引いた。
された「ΔΔCT」値を用いて、計算された。
れた。
ケージに基づいて用いられた。各miRNAについて、anovaは、3つ異なる群(癌
、健康コントロールおよびハイリスク)をわたってテストした。RTQ−PCRおよびマ
イクロアレイの両方からの標準化データセットは、「RTQPCR−マイクロアレイ−比
較」のために用いられた。「ΔCT」値は、RQPCRのための標準化されたデータセッ
トとして用いられた。結果は下記表3に示される。表に示されたように、miR−18a
、miR−22、miR−486、miR−642b、miR−7、およびmiR−88
5−5pは、健康コントロールよりも癌患者において、より高い発現レベルを示した。
許請求の範囲によって規定されると受け止められるべきである。容易に認識されるように
、上記の態様の多くの変更および組み合わせが、特許請求の範囲に記載される本発明から
逸脱しない限り利用できる。このような変更は本発明の範囲および概念から逸脱しないも
のとみなされ、すべてのこのような変更は下記特許請求の範囲の範囲に含まれると解され
る。引用されるすべての参考文献は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
Claims (20)
- 被検体が膵臓癌を患っているか、または膵臓癌を発症するリスクを有しているかが判定されるための方法であって、前記被験体から得たサンプルにおいて、miR−22である第1のマイクロRNAの発現レベルを決定することを含み、
前記パネルから選択された第1のマイクロRNAの発現レベルが所定の基準値を超えると、前記被検体が、前記膵臓癌を患っているか、または前記膵臓癌を発症するリスクを有していると判定される、方法。 - 前記所定の基準値が、前記膵臓癌を患っていないコントロール被検体から得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記被検体が、前記膵臓癌を発症するリスクの高いものである、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルが、体液サンプルである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サンプルが、血液、血清、および血漿からなる群より選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記サンプルが、血液サンプルである、請求項5に記載の方法。
- 前記サンプルが、膵臓組織、膵臓腫瘍、膵臓細胞、または膵液を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サンプルにおいて、第2のマイクロRNAの発現レベルを決定することをさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2のマイクロRNAが、miR−18a、miR−486、miR−642b、miR−7、またはmiR−885−5pである、請求項8に記載の方法。
- 被検体が膵臓癌を患っているか、または膵臓癌を発症するリスクを有しているかが判断されるためのアレイであって、
複数のユニーク場所、ならびに
(i)アップレギュレートされたマイクロRNAsの第1のパネルから選択された第1のマイクロRNAに相補的な配列を有する第1の核酸、この際前記第1のマイクロRNAがmiR−22である;および、
(ii)少なくとも一つの、ダウンレギュレートされたマイクロRNAsの第2のパネルから選択されたマイクロRNAに相補的な配列を有する核酸の、
任意の組み合わせを有する担体を含み、
各核酸は、前記担体のユニーク場所に固定されている、アレイ。 - 前記アップレギュレートされたマイクロRNAsの第1のパネルから選択された第2の異なるマイクロRNAに相補的な配列を有する第2の核酸をさらに含み、前記第1のパネルが、miR−18a、miR−22、miR−486、miR−642b、miR−7、およびmiR−885−5pを含む、請求項10に記載のアレイ。
- 前記ダウンレギュレートされたマイクロRNAsの第2のパネルが、表2に列挙したものから選択される、請求項10または11に記載のアレイ。
- 前記第1または第2の核酸が、配列番号:1〜6からなる群より選択された配列に相補的である、請求項10〜12のいずれか1項に記載のアレイ。
- 被検体が膵臓癌を患っているか、または膵臓癌を発症するリスクを有しているかが判断されるためのキットであって、
miR−22の配列に相補的である核酸配列を有するプローブ、または
miR−22を増幅するための一対のPCRプライマー、を含む、キット。 - アップレギュレートされたマイクロRNAの第1のパネルから選択された第1のマイクロRNAに相補的な核酸配列を有する第1のプローブ、または前記第1のマイクロRNAを増幅するためのPCRプライマーの第1のペアをさらに含み、前記第1のパネルが、miR−18a、miR−22、miR−486、miR−642b、miR−7、およびmiR−885−5pを含む、請求項14に記載のキット。
- ダウンレギュレートされたマイクロRNAの第2のパネルから選択された第2のマイクロRNAに相補的な核酸配列を有する第2のプローブ、または前記第2のマイクロRNAを増幅するためのPCRプライマーの第2のペアをさらに含む、請求項14または15に記載のキット。
- ハイブリダイゼーションを行うための試薬をさらに含む、請求項14〜16のいずれか1項に記載のキット。
- PCRを行うための試薬をさらに含む、請求項14〜17のいずれか1項に記載のキット。
- 前記プローブが、配列番号:1〜6からなる群より選択された配列に相補的である、請求項14〜18のいずれか1項に記載のキット。
- 前記キットが、請求項10〜13のいずれか1項に記載のアレイを含む、請求項14〜19のいずれか1項に記載のキット。
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