JP6709541B2 - 大腸癌に対する薬物療法の感受性を予測する方法 - Google Patents
大腸癌に対する薬物療法の感受性を予測する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6709541B2 JP6709541B2 JP2016554153A JP2016554153A JP6709541B2 JP 6709541 B2 JP6709541 B2 JP 6709541B2 JP 2016554153 A JP2016554153 A JP 2016554153A JP 2016554153 A JP2016554153 A JP 2016554153A JP 6709541 B2 JP6709541 B2 JP 6709541B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- genes
- methylation
- colorectal cancer
- treatment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 title claims description 92
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 title claims description 83
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 74
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 title claims description 36
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 title claims description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 114
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 107
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims description 87
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims description 87
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 38
- 239000003560 cancer drug Substances 0.000 claims description 36
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 33
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 claims description 29
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 claims description 22
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 claims description 20
- 230000006607 hypermethylation Effects 0.000 claims description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 102000014837 CACNA1G Human genes 0.000 claims description 13
- 102100027118 Engulfment and cell motility protein 1 Human genes 0.000 claims description 13
- 102100023855 Heart- and neural crest derivatives-expressed protein 1 Human genes 0.000 claims description 13
- 101001057862 Homo sapiens Engulfment and cell motility protein 1 Proteins 0.000 claims description 13
- 101000905239 Homo sapiens Heart- and neural crest derivatives-expressed protein 1 Proteins 0.000 claims description 13
- 101000763314 Homo sapiens Thrombomodulin Proteins 0.000 claims description 13
- 101000867850 Homo sapiens Voltage-dependent T-type calcium channel subunit alpha-1G Proteins 0.000 claims description 13
- 101710159002 L-lactate oxidase Proteins 0.000 claims description 13
- 102100026858 Protein-lysine 6-oxidase Human genes 0.000 claims description 13
- 108091006558 SLC30A10 Proteins 0.000 claims description 13
- 102100026966 Thrombomodulin Human genes 0.000 claims description 13
- 102100034987 Zinc transporter 10 Human genes 0.000 claims description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 13
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 claims description 2
- 101150094083 24 gene Proteins 0.000 claims 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 98
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 55
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 47
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 39
- DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L oxaliplatin Chemical compound O1C(=O)C(=O)O[Pt]11N[C@@H]2CCCC[C@H]2N1 DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L 0.000 description 36
- 229960001756 oxaliplatin Drugs 0.000 description 36
- UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N irinotecan Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N(CC1)CCC1N1CCCCC1 UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N 0.000 description 31
- 229960004768 irinotecan Drugs 0.000 description 31
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 30
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 27
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 21
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 14
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 14
- 230000004044 response Effects 0.000 description 13
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 11
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 11
- 102100030708 GTPase KRas Human genes 0.000 description 10
- 101000584612 Homo sapiens GTPase KRas Proteins 0.000 description 10
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000011519 second-line treatment Methods 0.000 description 10
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 9
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 7
- -1 IBN2 Proteins 0.000 description 6
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000007417 hierarchical cluster analysis Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 238000007637 random forest analysis Methods 0.000 description 5
- 102100039788 GTPase NRas Human genes 0.000 description 4
- 101000744505 Homo sapiens GTPase NRas Proteins 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 206010069755 K-ras gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 101150105104 Kras gene Proteins 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000491 multivariate analysis Methods 0.000 description 2
- 229960001972 panitumumab Drugs 0.000 description 2
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical group N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102100031510 Fibrillin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101000846890 Homo sapiens Fibrillin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000605639 Homo sapiens Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform Proteins 0.000 description 1
- 101000984753 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase B-raf Proteins 0.000 description 1
- 101100193693 Kirsten murine sarcoma virus K-RAS gene Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102100038332 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform Human genes 0.000 description 1
- 102100027103 Serine/threonine-protein kinase B-raf Human genes 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 210000002255 anal canal Anatomy 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 238000009104 chemotherapy regimen Methods 0.000 description 1
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 1
- 238000009093 first-line therapy Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000007855 methylation-specific PCR Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 238000011369 optimal treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000009094 second-line therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
〔関連出願〕
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１４−２１２５０３号（２０１４年１０月１７日出願）の明細書に記載された内容を包含する。本発明は、大腸癌に対するがん薬物療法に対する応答性を予測する方法に関する。より詳細には、大腸癌患者の大腸癌組織、大腸癌細胞、又は大腸癌細胞由来のＤＮＡを含む検体中のＤＮＡメチル化プロファイルを指標として、大腸癌に対するがん薬物療法に対する感受性を予測する方法に関する。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１４−２１２５０３号（２０１４年１０月１７日出願）の明細書に記載された内容を包含する。本発明は、大腸癌に対するがん薬物療法に対する応答性を予測する方法に関する。より詳細には、大腸癌患者の大腸癌組織、大腸癌細胞、又は大腸癌細胞由来のＤＮＡを含む検体中のＤＮＡメチル化プロファイルを指標として、大腸癌に対するがん薬物療法に対する感受性を予測する方法に関する。
大腸癌は全悪性腫瘍の中で、罹患者数では、男性で第２位、女性で１位を占める疾患である。死亡者数では第３位（２００４年約４０，０００人）を占め、２０１５年にはさらに増加（約６６，０００人）すると予測される。大腸癌の治療成績を改善させることは、総死亡の３０％を占めるがん死亡数を低下させることに大きく寄与するものと考えられる。
現在治癒切除不能な進行性再発大腸癌の化学療法では、イリノテカンベースとオキサリプラチンベースの化学療法がおこなわれているが、その併用における適用順序については、これまで特に検討されていない。
一方、分子標的薬、特に抗ＥＧＦＲ抗体薬（セツキシマブ、パニツムマブ）と抗ＶＥＧＦ抗体薬（ベバシズマブ）の導入により、進行・再発大腸癌の治療成績（無増悪生存期間と全生存期間）は着実に向上した。しかし、分子標的薬は高額であり、従来の化学療法薬やその他のがんに用いられる分子標的薬と比べて現時点では費用対効果が劣る。無駄な医療費となる無効患者の副作用回避の視点から、より有効な対象に選択的に治療を適応する必要がある。
進行・再発大腸癌の抗ＥＧＦＲ抗体薬に対する治療感受性を予測するバイオマーカーとしては、２００８年にＫＲＡＳのエクソン２に変異を有する症例では抗ＥＧＦＲ抗体薬による治療効果の上乗せを認めないことが報告されている。また、近年の臨床研究ではＫＲＡＳのエクソン２に加えエクソン３、４、ＮＲＡＳのエクソン２、３、４に変異を持たないＲＡＳ野生型の症例で、抗ＥＧＦＲ抗体薬の効果がより高くなることが報告されている。その他、治療効果予測因子としてＰＩＫ３ＣＡの変異が有望視されており、また予後予測因子としてのＢＲＡＦ変異がこれまで報告されている。
しかしながら、現在広く用いられているバイオマーカーであるＫＲＡＳのエクソン２が野生型である症例において、抗ＥＧＦＲ抗体薬の使用による奏効率の上乗せは３０％程度であり、十分なものとは言えない。上述した他の遺伝子変異を考慮しても、遺伝子変異に基づく解析のみでは真の感受性群を同定することは困難と言える。
これに対し、油谷らは、生体試料から抽出したＤＮＡにおけるマーカー遺伝子のメチル化状態を解析し、その結果に基づいて生体試料中のがん細胞の存否または大腸癌患者の予後を判定する方法が報告している（特許文献１）。さらに、八木らは、第１の遺伝子群のメチル化状態に基づいて（ＨＭＥ（高メチル化群）を抽出し、さらに第２の遺伝子群のメチル化状態に基づいてＩＭＥ（中メチル化群）とＬＭＥ（低メチル化群）を抽出することにより、大腸癌患者群を３つのサブタイプに分類すると、ＩＭＥ（ＫＲＡＳ遺伝子変異を含む）の生存期間が最も短いことを報告している（非特許文献１）。
石岡らは、大腸癌の選択的治療を可能にするための方法として、大腸癌組織の遺伝子発現量を網羅的に解析し、予め分類された４グループのいずれかに帰属させることによって大腸癌患者の抗ＥＧＦＲ抗体に対する応答性を予測する方法を報告している（特許文献２）。
札幌医大のグループは、大腸癌患者においてＬＩＮＥ−１ メチル化レベルとｍｉｃｒｏＲＮＡ−３１の発現レベルが正の相関を示すこと、抗ＥＧＦＲ抗体薬投与例における無憎悪生存期間において、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−３１高発現群は低発現群に比べて優位に短いことを報告している（非特許文献２）。
また、ＬｅｅらはＣｐＧアイランドのＤＮＡメチル化はがんの生物学的特性に関与し、抗ＥＧＦＲ抗体感受性はＤＮＡのメチル化状態に影響を受けるとの仮説を提案している（非特許文献３）。
Ｙａｇｉ Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１０ Ｊａｎ １；１６（１）：２１−３３
能正勝彦 大和証券ヘルス財団平成２４年度（第３９回）調査研究助成報告書
Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓａｎｇｍｉｎ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ＡＳＣＯ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ２０１４，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ３５３３（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｅｔｉｎｇｌｉｂｒａｒｙ．ａｓｃｏ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１３４３５９−１４４）
進行・再発大腸癌の治療薬として用いられる抗ＥＧＦＲ抗体の投与指針においては、ＫＲＡＳ遺伝子野生型患者のみ本抗体を投与する方法が推奨されているが、野生型患者であっても抗ＥＧＦＲ抗体に抵抗性を示す症例が少なくない。そのため、抗ＥＧＦＲ抗体抵抗性患者に対する高額な本抗体の投与は患者の経済的・身体的負担が大きく、より費用対効果の高い投与指針が望まれる。
本発明は、上記のような事情に鑑みてなされたものであり、大腸癌のがん薬物療法に対する応答性を高精度で予測し、患者の経済的・身体的負担を低減し、より費用対効果の高い投与指針を提供することにすることを課題とする。
発明者らは、大腸癌患者組織のＤＮＡメチル化レベルを網羅的に解析した結果、低メチル化群が高メチル化群に比べてがん薬物療法による治療成績が有意に高いことを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１４］を提供する。
［１］ 大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を予測する方法であって、被験者の大腸癌組織、大腸癌細胞、又は大腸癌細胞由来のＤＮＡを含む検体におけるＤＮＡメチル化レベルを解析し、前記ＤＮＡメチル化レベルに基づき前記被験者のがん薬物療法応答性を判定することを特徴とする方法；
［２］ 以下の工程を含む上記［１］に記載の方法：
（１）被験者の大腸癌組織、大腸癌細胞、又は大腸癌細胞由来のＤＮＡを含む検体中のＤＮＡメチル化レベルを測定する工程、
（２）β値が０．５以上の遺伝子をメチル化陽性とし、メチル化陽性の遺伝子の割合が６０％以上の場合に当該被験者を高メチル化群に、６０％未満である場合に低メチル化群に分類する工程、及び
（３）低メチル化群に分類された場合に前記被験者をがん薬物療法感受性と判定し、高メチル化群に分類された場合に前記被験者をがん薬物療法抵抗性と判定する工程；
［３］ 高メチル化群と低メチル化群でβ値に有意な差がある遺伝子群から選ばれる少なくとも４以上のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする、上記［１］又は［２］記載の方法；
［４］ 表７記載の遺伝子群又は表８記載の遺伝子群から選ばれる少なくとも４以上のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする、上記［１］又は［２］記載の方法、例えば、表８記載の遺伝子群を対象として解析を行うことを特徴とする、上記［１］又は［２］記載の方法；
［５］ 表７記載の遺伝子群又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４〜２０のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする、上記［１］又は［２］記載の方法；
［６］ 表７記載の遺伝子群又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４〜１０のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする、上記［１］又は［２］記載の方法；
［７］ マーカー遺伝子が表８記載の２４遺伝子又はＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤから選ばれる少なくとも１以上を含む、上記［４］〜［６］のいずれかに記載の方法；
［８］ がん薬物療法が化学療法である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法；
［９］ がん薬物療法が分子標的薬を用いた治療法である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法；
［１０］ 分子標的薬が抗ＥＧＦＲ抗体である、上記［９］に記載の方法；
［１１］ 複数のがん薬物療法の適用順序の適否を判定しうる、上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法；
［１２］ 大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を予測するためのプローブセットであって、
表７記載の遺伝子群又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４以上のマーカー遺伝子、例えば表８記載の遺伝子群すべてについて、その少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む領域と相補的な配列を含み、前記ＣｐＧ部位のメチル化の有無を検出可能なプローブを含むプローブセット；
［１３］ マーカー遺伝子が、表８記載の遺伝子群ＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤから選ばれる１以上の遺伝子を含む、上記［１２］記載のプローブセット；
［１４］ 大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を予測するためのキットであって、
（ａ）表７記載の遺伝子群又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４以上の遺伝子、例えば表８記載の遺伝子群すべてについて、その少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む領域と相補的な配列を含み、前記ＣｐＧ部位のメチル化の有無を検出可能なプローブ、及び
（ｂ）表７記載の遺伝子群又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４以上の遺伝子、例えば表８記載の遺伝子群すべてについて、その少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む領域に結合し、前記ＣｐＧ領域を含む領域を増幅可能なプライマーペア、を含むキット；
［１５］ マーカー遺伝子が、表８記載の２４遺伝子又はＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤから選ばれる１以上の遺伝子を含む、上記［１４］記載のキット。
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１４］を提供する。
［１］ 大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を予測する方法であって、被験者の大腸癌組織、大腸癌細胞、又は大腸癌細胞由来のＤＮＡを含む検体におけるＤＮＡメチル化レベルを解析し、前記ＤＮＡメチル化レベルに基づき前記被験者のがん薬物療法応答性を判定することを特徴とする方法；
［２］ 以下の工程を含む上記［１］に記載の方法：
（１）被験者の大腸癌組織、大腸癌細胞、又は大腸癌細胞由来のＤＮＡを含む検体中のＤＮＡメチル化レベルを測定する工程、
（２）β値が０．５以上の遺伝子をメチル化陽性とし、メチル化陽性の遺伝子の割合が６０％以上の場合に当該被験者を高メチル化群に、６０％未満である場合に低メチル化群に分類する工程、及び
（３）低メチル化群に分類された場合に前記被験者をがん薬物療法感受性と判定し、高メチル化群に分類された場合に前記被験者をがん薬物療法抵抗性と判定する工程；
［３］ 高メチル化群と低メチル化群でβ値に有意な差がある遺伝子群から選ばれる少なくとも４以上のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする、上記［１］又は［２］記載の方法；
［４］ 表７記載の遺伝子群又は表８記載の遺伝子群から選ばれる少なくとも４以上のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする、上記［１］又は［２］記載の方法、例えば、表８記載の遺伝子群を対象として解析を行うことを特徴とする、上記［１］又は［２］記載の方法；
［５］ 表７記載の遺伝子群又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４〜２０のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする、上記［１］又は［２］記載の方法；
［６］ 表７記載の遺伝子群又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４〜１０のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする、上記［１］又は［２］記載の方法；
［７］ マーカー遺伝子が表８記載の２４遺伝子又はＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤから選ばれる少なくとも１以上を含む、上記［４］〜［６］のいずれかに記載の方法；
［８］ がん薬物療法が化学療法である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法；
［９］ がん薬物療法が分子標的薬を用いた治療法である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法；
［１０］ 分子標的薬が抗ＥＧＦＲ抗体である、上記［９］に記載の方法；
［１１］ 複数のがん薬物療法の適用順序の適否を判定しうる、上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法；
［１２］ 大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を予測するためのプローブセットであって、
表７記載の遺伝子群又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４以上のマーカー遺伝子、例えば表８記載の遺伝子群すべてについて、その少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む領域と相補的な配列を含み、前記ＣｐＧ部位のメチル化の有無を検出可能なプローブを含むプローブセット；
［１３］ マーカー遺伝子が、表８記載の遺伝子群ＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤから選ばれる１以上の遺伝子を含む、上記［１２］記載のプローブセット；
［１４］ 大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を予測するためのキットであって、
（ａ）表７記載の遺伝子群又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４以上の遺伝子、例えば表８記載の遺伝子群すべてについて、その少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む領域と相補的な配列を含み、前記ＣｐＧ部位のメチル化の有無を検出可能なプローブ、及び
（ｂ）表７記載の遺伝子群又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４以上の遺伝子、例えば表８記載の遺伝子群すべてについて、その少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む領域に結合し、前記ＣｐＧ領域を含む領域を増幅可能なプライマーペア、を含むキット；
［１５］ マーカー遺伝子が、表８記載の２４遺伝子又はＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤから選ばれる１以上の遺伝子を含む、上記［１４］記載のキット。
これまで、大腸癌や他のいくつかのがんにおいて、ＣＩＭＰに代表されるメチル化プロファイルに基づくｐｈｅｎｏｔｙｐｅ分類が報告されているが、薬剤感受性とメチル化との関連が示された例はなく、既報からメチル化プロファイルと薬剤感受性との関連が存在するかを予想することは容易ではない。すなわち、本発明は、メチル化プロファイルから薬剤感受性が予測可能であることの初の報告である。
本発明によれば、メチル化状態の相違に基づき、大腸癌、とくに治癒切除不能進行再発大腸癌における、化学療法の治療選択が可能となる。すなわち、１次治療を開始する際に、現在ではいずれでも良いとされるイリノテカンベースとオキザリプラチンベースの化学療法のレジメンを、患者の検体由来のＤＮＡメチル化状態に基づき、その適用順序を選択することができる。
また、本発明によれば、ＫＲＡＳ野生型であっても抗ＥＧＦＲ抗体薬に抵抗性を示す症例群を抽出することができる。さらには、近年報告のあるＫＲＡＳのエクソン２に加えエクソン３、４、ＮＲＡＳのエクソン２、３、４に変異を持たないＲＡＳ野生型の症例であっても治療抵抗性群に含まれる症例を抽出することができる。すなわち、本発明の方法は、従来の報告では治療感受性群に分類される症例の中から実際は抵抗性である症例を抽出することが可能であり、より精度の高い治療効果予測法であると言える。
遺伝子の変異はがんの発生・進行において順次蓄積するものであり、様々な遺伝子変異プロファイルをもつｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎが腫瘍内に存在する（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）。大腸癌は腫瘍の発生・進行における遺伝子変異の蓄積傾向が強く、ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙに富む腫瘍である点から、遺伝子変異を調べる際には治療経過のいつの時点で、どの部位から、どの程度の範囲で採取した腫瘍からＤＮＡを抽出したかの影響を強く受ける。
これに対し、メチル化プロファイルはがん発生初期に決定すると考えられており腫瘍内では比較的均一であると言える。つまり、遺伝子変異による診断に比べ、先述の検体採取条件による結果のばらつきが抑えられることに加え、原発巣切除の際に採取した検体であっても、分子標的薬使用開始時点の腫瘍におけるメチル化プロファイルをより正確に反映していることが期待される。すなわち、本発明の方法は、がんの進行状態や検体の採取条件にかかわらず、がん薬物療法に対する治療効果を正確に判定することができる。
また、本発明の方法では、遺伝子発現に基づく従来の方法に比べて、抗ＥＧＦＲ抗体による効果が高い群を濃縮して検出可能であるため、分子標的薬を用いた治療法においても、従来より高精度の判定を行うことができる。
１．定義
本発明は、大腸癌患者のがん薬物療法応答性を判定する方法に関する。以下、本発明及び本明細書中で使用される用語の意味について説明する。
本発明は、大腸癌患者のがん薬物療法応答性を判定する方法に関する。以下、本発明及び本明細書中で使用される用語の意味について説明する。
本発明において、「大腸癌」とは、大腸（盲腸、結腸、直腸）に発生するがん腫であって、肛門管に発生するがん腫も含む。「大腸癌患者」は、大腸癌に罹患している対象に加えて、罹患の疑いがあり、がん薬物療法応答性を調べる必要のある対象を含む。
「がん薬物療法」は特に限定されず、例えば、オキサリプラチン、イリノテカン等を用いた化学療法と、抗ＥＧＦＲ抗体等の分子標的薬を用いた治療法の両方が含まれる。
本発明において、「抗ＥＧＦＲ抗体」とは、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）に特異的な抗体又はその免疫学的に活性な断片であって、既に市販されているＩｇＧ１サブクラスのヒト・マウスキメラ抗体であるセツキシマブ、ＩｇＧ２サブクラスの完全ヒト型抗体であるパニツムマブのほか、がんの分子標的薬として有用なすべての抗ＥＧＦＲ抗体を含む。
転移・再発大腸癌の約８０％程度はＥＧＦＲを発現しており、シグナル伝達の最上流に位置するＥＧＦＲを抗体で阻害することによりがん細胞の増殖が抑制される。しかし、ＥＧＦＲを抗体でブロックしてもシグナル伝達が阻害されない症例がある。例えば、前述のように、増殖シグナル伝達経路の下流にあるＫ−ＲＡＳに変異がある患者では、ＥＧＦＲをブロックしてもシグナル伝達は阻害されないことが知られている。
本発明において、「がん薬物療法に対する応答性」とは、上記したような、がん薬物療法に対する患者の応答性を意味し、がん薬物療法が奏功する場合を「感受性」、奏功しない場合を「抵抗性」と表現する。
本発明で用いられる「検体」は、被験者から単離された被疑病変部位、すなわち大腸癌組織、大腸癌細胞等、大腸癌細胞由来のＤＮＡ（血漿中の腫瘍由来のＤＮＡなど）を含むものであれば特に限定されない。
「ＤＮＡメチル化」は、ＤＮＡを構成するシトシンのピリミジン環の５位炭素原子あるいはアデニンのプリン環の６位窒素原子で起こりうるが、通常哺乳動物成体の体細胞組織ではＣｐＧ部位（シトシンとグアニンが隣り合ったジヌクレオチド部位）で生じる。がんにおいては、ＣｐＧ部位、特にプロモーター領域のＣｐＧアイランドで過剰メチル化が見られることが多いが、低メチル化もまたがんの進展と関連する。
本発明にかかる「ＤＮＡメチル化」とは、ＣｐＧ部位のメチル化に限定されず、例えば、ヒト幹細胞で公知の非ＣｐＧサイトのメチル化領域、公知の正常細胞とがん細胞間で異なるメチル化を示す領域等、非ＣｐＧ部位のメチル化も含む。
本発明にかかる「ＤＮＡメチル化レベル」とは、メチル化の割合（メチル化／メチル化＋非メチル化）であって、例えばβ値によって示される。なお、β値は、以下の式により算出される。
β値＝（メチル検出用プローブの蛍光値の最大値）／（非メチル検出用プローブの蛍光値の最大値＋メチル検出用プローブの蛍光値の最大値＋１００）
β値＝（メチル検出用プローブの蛍光値の最大値）／（非メチル検出用プローブの蛍光値の最大値＋メチル検出用プローブの蛍光値の最大値＋１００）
ＤＮＡメチル化レベルを測定する「マーカー遺伝子」は特に限定されず、検体中のすべての遺伝子を対象として網羅的に解析してもよいし、特定の遺伝子に限定して解析してもよい。好ましくは、マーカー遺伝子は高メチル化群と低メチル化群でβ値に有意な差がある遺伝子群から選ばれる４以上の遺伝子であり、具体的には、表７に示される１０５３の遺伝子群又は表８に示される２４の遺伝子群から選ばれる。例えば、マーカー遺伝子は遺伝子シンボルＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤで示される７遺伝子、あるいは表８記載の染色体番号と位置情報で特定される２４遺伝子から選ばれる遺伝子を含む。
２．がん薬物療法に対する応答性判定方法
本発明は、大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を、前記患者の大腸癌組織又は大腸癌細胞を含む検体におけるＤＮＡメチル化レベルに基づいて判定するものである。
本発明は、大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を、前記患者の大腸癌組織又は大腸癌細胞を含む検体におけるＤＮＡメチル化レベルに基づいて判定するものである。
本発明の方法は、例えば、以下の工程を含む。
（１）被験者の大腸癌組織、大腸癌細胞、又は大腸癌細胞由来のＤＮＡを含む検体中のＤＮＡメチル化レベルを測定する工程（測定工程）、
（２）β値が０．５以上の遺伝子をメチル化陽性とし、メチル化陽性の遺伝子の割合が６０％以上の場合に当該被験者を高メチル化群に、６０％未満である場合に低メチル化群に分類する工程（解析・分類工程）、
（３）低メチル化群に分類された場合に前記被験者をがん薬物療法感受性と判定し、高メチル化群に分類された場合に前記被験者をがん薬物療法抵抗性と判定する工程（判定工程）。
（１）被験者の大腸癌組織、大腸癌細胞、又は大腸癌細胞由来のＤＮＡを含む検体中のＤＮＡメチル化レベルを測定する工程（測定工程）、
（２）β値が０．５以上の遺伝子をメチル化陽性とし、メチル化陽性の遺伝子の割合が６０％以上の場合に当該被験者を高メチル化群に、６０％未満である場合に低メチル化群に分類する工程（解析・分類工程）、
（３）低メチル化群に分類された場合に前記被験者をがん薬物療法感受性と判定し、高メチル化群に分類された場合に前記被験者をがん薬物療法抵抗性と判定する工程（判定工程）。
２．１ 測定工程
（１）ＤＮＡの抽出
まず、被験者から単離した検体よりゲノムＤＮＡを抽出する。ＤＮＡの抽出は、当該分野で公知の方法にしたがって実施すればよく、例えば市販のキット（ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＲ Ｔｉｓｓｕｅ（ＴＡＫＡＲＡ）等）を用いて実施することができる。
（１）ＤＮＡの抽出
まず、被験者から単離した検体よりゲノムＤＮＡを抽出する。ＤＮＡの抽出は、当該分野で公知の方法にしたがって実施すればよく、例えば市販のキット（ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＲ Ｔｉｓｓｕｅ（ＴＡＫＡＲＡ）等）を用いて実施することができる。
（２）ＤＮＡメチル化レベルの測定
ＤＮＡメチル化レベルの測定は、特に限定されず、（Ａ）バイサルファイト処理してシーケンスする解析方法、（Ｂ）メチル化ＤＮＡを断片化、濃縮してメチル化ＤＮＡを解析する方法、（Ｃ）メチル化感受性の制限酵素を利用した解析方法、（Ｄ）メチル化特異的ＰＣＲ法を利用した解析方法等があり、そのいずれを利用してもよい。
ＤＮＡメチル化レベルの測定は、特に限定されず、（Ａ）バイサルファイト処理してシーケンスする解析方法、（Ｂ）メチル化ＤＮＡを断片化、濃縮してメチル化ＤＮＡを解析する方法、（Ｃ）メチル化感受性の制限酵素を利用した解析方法、（Ｄ）メチル化特異的ＰＣＲ法を利用した解析方法等があり、そのいずれを利用してもよい。
好適な一例として、イルミナ社のビーズアレイ（Ｉｎｆｉｎｉｕｍ（登録商標）ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ ＢｅａｄＣｈｉｐ）を用いた方法を挙げることができる。この方法では、バイサルファイト処理によりＤＮＡ中のメチル化されていないシトシン（非メチル化シトシン）をウラシルに変換することで、メチル化シトシンを非メチル化シトシンを区別する。そして、サイトごとに特異的な、メチル化用プローブ（Ｍタイプ）と非メチル化用プローブ（Ｕタイプ）の２つのビーズに固定化されたプローブをハイブリダイゼーション後、ラベル化ｄｄＮＴＰを使った１塩基伸長反応を行い、この蛍光強度シグナルから、メチル化と非メチル化の割合を計算する。これにより、網羅的なＤＮＡメチル化分析を簡便に行うことができる。
別な一例として、シーケノム社のＭａｓｓＡＲＲＡＹ法を挙げることができる。この方法では、解析したい領域の塩基配列の違いによる質量の違いを利用してＤＮＡメチル化分析を行う。具体的には、ＤＮＡをバイサルファイト処理により非メチル化シトシンをウラシルに変換し（メチル化シトシンはそのまま）、その相補鎖の塩基ＧとＡの質量差からメチル化の有無を解析する。これにより、大量のサンプルを定量的に短時間に解析することができる。
ＤＮＡメチル化レベルは、検体中のすべての遺伝子について測定してもよいが、特定の遺伝子のメチル化レベルを測定することでがん薬物療法の応答性を判定できることを発明者らは見出した。そのような特定の遺伝子としては、高メチル化群と低メチル化群でβ値に有意な差がある遺伝子群から選ばれる４以上の遺伝子であり、具体的には、表７に示される１０５３の遺伝子群又は表８に示される２４の遺伝子群から選ばれる。例えば、マーカー遺伝子は遺伝子シンボルＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤで示される７遺伝子から選ばれる遺伝子を含む。あるいは、表８記載の染色体番号と位置情報で特定される２４遺伝子から選ばれる遺伝子を含む。
上記マーカー遺伝子のうち４以上の遺伝子、好ましくは４〜７遺伝子、より好ましくは４〜２０、さらに好ましくは４〜１０遺伝子のメチル化レベルを解析することにより、被験者のがん薬物療法に対する応答性を予測することができる。
２．２ 解析・分類工程
（１）ＤＮＡメチル化レベルの解析
次いで、前記測定結果を解析し、被験者を高メチル化群または低メチル化群のいずれかに分類する。ＤＮＡメチル化レベルは、例えば前述したβ値等により定量化することができる。このβ値を、全遺伝子あるいは前記した特定の遺伝子について算出・解析することで、被験者が高メチル化群か低メチル化群かに分類することができる。
（１）ＤＮＡメチル化レベルの解析
次いで、前記測定結果を解析し、被験者を高メチル化群または低メチル化群のいずれかに分類する。ＤＮＡメチル化レベルは、例えば前述したβ値等により定量化することができる。このβ値を、全遺伝子あるいは前記した特定の遺伝子について算出・解析することで、被験者が高メチル化群か低メチル化群かに分類することができる。
（２）高メチル化群と低メチル化群の分類
高メチル化群か低メチル化群かの分類は、あらかじめ取得された大腸癌患者の検体におけるＤＮＡメチル化レベルのプロファイルと比較解析することにより行ってもよいし、データの蓄積により経験的に設定された一定のカットオフ値に基づいて分類してもよい。
発明者らは、本願実施例に示すとおり、前述のマーカー遺伝子について、β値が０．５以上の遺伝子をメチル化陽性とし、メチル化陽性の遺伝子の割合が６０％以上の場合に当該被験者を高メチル化群に、６０％未満である場合に低メチル化群に分類することができることを見出した。この方法によれば、少なくとも４つのマーカー遺伝子のメチル化レベルに基づき、簡便に被験者を高メチル化群か低メチル化群に分類することができる。
高メチル化群か低メチル化群かの分類は、あらかじめ取得された大腸癌患者の検体におけるＤＮＡメチル化レベルのプロファイルと比較解析することにより行ってもよいし、データの蓄積により経験的に設定された一定のカットオフ値に基づいて分類してもよい。
発明者らは、本願実施例に示すとおり、前述のマーカー遺伝子について、β値が０．５以上の遺伝子をメチル化陽性とし、メチル化陽性の遺伝子の割合が６０％以上の場合に当該被験者を高メチル化群に、６０％未満である場合に低メチル化群に分類することができることを見出した。この方法によれば、少なくとも４つのマーカー遺伝子のメチル化レベルに基づき、簡便に被験者を高メチル化群か低メチル化群に分類することができる。
２．３ 判定工程
上記の分類結果により、被験者が低メチル化群に分類された場合に前記被験者をがん薬物療法感受性と判定し、高メチル化群に分類された場合にがん薬物療法抵抗性と判定する。
上記の分類結果により、被験者が低メチル化群に分類された場合に前記被験者をがん薬物療法感受性と判定し、高メチル化群に分類された場合にがん薬物療法抵抗性と判定する。
２．４ 治療選択への応用
本発明の方法は、メチル化状態の相違に基づき、大腸癌、とくに治癒切除不能進行再発大腸癌における、化学療法の治療選択に応用できる。すなわち、１次治療を開始する際に、現在ではいずれでも良いとされるイリノテカンベースとオキザリプラチンベースの化学療法のレジメンを、高メチル化群の患者に関してはイリノテカンベースを使うべきと診断でき、また高メチル化群の患者では、イリノテカンベースで化学療法を開始した場合には、２次治療ではオキサリプラチンベースを用いるべきと診断することができる。一方、低メチル化群の患者では、イリノテカンベースとオキザリプラチンベースの化学療法は、いずれを先に行ってもよいと診断することができる。
本発明の方法は、メチル化状態の相違に基づき、大腸癌、とくに治癒切除不能進行再発大腸癌における、化学療法の治療選択に応用できる。すなわち、１次治療を開始する際に、現在ではいずれでも良いとされるイリノテカンベースとオキザリプラチンベースの化学療法のレジメンを、高メチル化群の患者に関してはイリノテカンベースを使うべきと診断でき、また高メチル化群の患者では、イリノテカンベースで化学療法を開始した場合には、２次治療ではオキサリプラチンベースを用いるべきと診断することができる。一方、低メチル化群の患者では、イリノテカンベースとオキザリプラチンベースの化学療法は、いずれを先に行ってもよいと診断することができる。
本発明の方法では、従来の報告では治療感受性群に分類される症例の中から実際は抵抗性である症例を抽出することができ、より精度の高い治療効果の予測が可能となる。また、がんの進行状態や検体の採取条件にかかわらず、化学療法のみならず、抗ＥＧＦＲ抗体を用いた分子標的薬を用いた治療法についても、治療効果を正確に判定することができる。
また、本発明の方法では、発現アレイに基づく分類に比べ、治療感受性群と治療抵抗性群との間でより低いｐ値を認めており、治療効果が高い群に濃縮することが可能であり、より高精度の判定を行うことができる。
さらに、後述する実施例に示されるとおり、本発明の方法では、独立した２つの症例群において抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時の奏効率、無増悪生存期間（ＰＦＳ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−Ｆｒｅｅ Ｓｕｒｖｉｖａｌ）、全生存期間（ＯＳ：Ｏｖｅｒａｌｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ）に有意差を持つ２群を抽出することに成功しており、再現性に優れることも示されている。
進行・再発大腸癌の治療薬として用いられる抗ＥＧＦＲ抗体の投与指針においては、ＫＲＡＳ遺伝子野生型患者のみ本抗体を投与する方法が推奨されている。本発明の方法は、従来のｇｅｎｅｔｉｃな方法とは異なるｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃな方法に基づくものであり、現在の投与指針で本抗体感受性に分類される患者群の中から、本抗体抵抗性の患者を抽出することを可能とするという点で、従来の方法とは根本的に異なる。
３．がん薬物療法に対する応答性予測キット・プローブセット
本発明はまた、大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を予測するためのプローブセット及びキットを提供する。
本発明はまた、大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を予測するためのプローブセット及びキットを提供する。
本発明のプローブセットは、表７又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４以上のマーカー遺伝子について、その少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む領域と相補的な配列を含み、前記ＣｐＧ部位のメチル化の有無を検出可能なプローブを含む。ここで、メチル化の有無とは、バイサルファイトシーケンシングの場合であれば、メチル化部位のシトシンと非メチル化部位のウラシルを検出可能なプローブを意味する。なお、上記マーカー遺伝子は、好ましくは、ＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤから選ばれる１以上の遺伝子を含む。
本発明のキットは、
（ａ）表７又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４以上のマーカー遺伝子について、その少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む領域と相補的な配列を含み、前記ＣｐＧ部位のメチル化の有無を検出可能なプローブ、及び
（ｂ）表７又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４以上のマーカー遺伝子について、その少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む領域に結合し、前記ＣｐＧ領域を含む領域を増幅可能なプライマーペア、を含む。
なお、上記マーカー遺伝子は、好ましくは、遺伝子シンボルＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤから選ばれる１以上の遺伝子を含む。あるいは、好ましくは、表８記載の染色体番号と位置情報で特定される２４遺伝子から選ばれる遺伝子を含む。
（ａ）表７又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４以上のマーカー遺伝子について、その少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む領域と相補的な配列を含み、前記ＣｐＧ部位のメチル化の有無を検出可能なプローブ、及び
（ｂ）表７又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４以上のマーカー遺伝子について、その少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む領域に結合し、前記ＣｐＧ領域を含む領域を増幅可能なプライマーペア、を含む。
なお、上記マーカー遺伝子は、好ましくは、遺伝子シンボルＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤから選ばれる１以上の遺伝子を含む。あるいは、好ましくは、表８記載の染色体番号と位置情報で特定される２４遺伝子から選ばれる遺伝子を含む。
本発明のプローブセットあるいはキットを用いることにより、大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を簡便かつ高精度に予測することができる。
後述する実施例に示されるとおり、発現アレイに基づく方法と本発明の方法は、いずれも網羅的データを用いて教師なし階層クラスター解析を行うことにより、薬剤感受性の異なるサブブループを同定しているが、メチル化解析に基づく本発明の方法では、薬剤感受性が有意に異なる２群を抽出可能である数個のプローブセットを同定することに成功しているという点で、より実用化に即した発明と言える。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：大腸癌４５例を用いた網羅的ＤＮＡメチル化解析
抗ＥＧＦＲ抗体薬使用歴を有する大腸癌４５例より外科的に切除された大腸癌腫瘍組織のホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥ検体）を用いてＩｎｆｉｎｉｕｍ ４５０Ｋ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）による網羅的ＤＮＡメチル化解析を行った。なお、対象症例はＳａｎｇｅｒ法にてＫＲＡＳエクソン２に変異を認めない症例とした。
抗ＥＧＦＲ抗体薬使用歴を有する大腸癌４５例より外科的に切除された大腸癌腫瘍組織のホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥ検体）を用いてＩｎｆｉｎｉｕｍ ４５０Ｋ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）による網羅的ＤＮＡメチル化解析を行った。なお、対象症例はＳａｎｇｅｒ法にてＫＲＡＳエクソン２に変異を認めない症例とした。
各プローブについてβ値（メチル化されているプローブ／メチル化されているプロープ＋メチル化されていないプローブ）を算出し、β値の分布の標準偏差が０．２５を超える３，１６３のプローブを用いて教師なし階層クラスター解析を行った（図１）。
上記の結果、解析対象症症例はメチル化レベルの高いＨｉｇｈｌｙ−Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ（ＨＭＣＣ）群（１７例）と、メチル化レベルの低いＬｏｗ−Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ（ＬＭＣＣ）群（２８例）の２群に分類された。
上記２群（ＨＭＣＣ群とＬＭＣＣ群）間での高ＥＧＦＲ抗体薬の奏効率を比較した（表１）。抗ＥＧＦＲ抗体薬の奏効率に着目した場合、ＬＭＣＣ群では３６％（１０例）であるのに対し、ＨＭＣＣ群では６％（１例）であり、有意にＬＭＣＣ群が高かった（ｐ＝０．０３）。
抗ＥＧＦＲ抗体薬による無増悪生存期間（ＰＦＳ）に着目した場合、ＬＭＣＣ群では中央値が１９７日、ＨＭＣＣ群では中央値が７２日であり、有意にＬＭＣＣ群で延長していた（ｐ≦０．００１，ＨＲ＝０．２７：図２Ａ）
抗ＥＧＦＲ抗体薬初回投与後の全生存期間（ＯＳ）の比較では、ＬＭＣＣ群では中央値が２４．９か月、ＨＭＣＣ群では中央値が５．６か月であり、有意にＬＭＣＣ群で延長していた（ｐ≦０．００１，ＨＲ＝０．１９：図２Ｂ）。
以上の結果より、網羅的ＤＮＡメチル化解析により分類された２群間では抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時の奏効率、ＰＦＳ、ＯＳのいずれにおいても有意差を認めており、治療効果予測が可能であることが強く示された。
実施例２：独立した大腸癌５２例による検証
実施例１における４５例とは独立した抗ＥＧＦＲ抗体薬使用歴を有する大腸癌５２例を用いてＩｎｆｉｎｉｕｍ ４５０Ｋによる網羅的ＤＮＡメチル化解析を行った。実施例１と同様に、対象症例はＳａｎｇｅｒ法にてＫＲＡＳエクソン２に変異を認めない症例とした。
実施例１における４５例とは独立した抗ＥＧＦＲ抗体薬使用歴を有する大腸癌５２例を用いてＩｎｆｉｎｉｕｍ ４５０Ｋによる網羅的ＤＮＡメチル化解析を行った。実施例１と同様に、対象症例はＳａｎｇｅｒ法にてＫＲＡＳエクソン２に変異を認めない症例とした。
実施例１と同様に、各プローブについてβ値（メチル化されているプローブ／メチル化されているプローブ＋メチル化されていないプローブ）を算出し、β値の分布の標準偏差が０．２５を超える２，５７７のプローブを用いて教師なし階層クラスター解析を行った（図３）。
上記の結果、解析対象症症例はメチル化レベルの高いＨＭＣＣ群１７例と、メチル化レベルの低いＬＭＣＣ群３５例の２群に分類された。
上記２群（ＨＭＣＣ群とＬＭＣＣ群）間での高ＥＧＦＲ抗体薬の奏効率を比較した（表２）。抗ＥＧＦＲ抗体薬の奏効率に着目した場合、ＬＭＣＣ群では３４％（１２例）であるのに対し、ＨＭＣＣ群では６％（１例）であり、有意にＬＭＣＣ群が高かった（ｐ＝０．０３）。
抗ＥＧＦＲ抗体薬による無増悪生存期間（ＰＦＳ）に着目した場合、ＬＭＣＣ群では中央値が１９１日、ＨＭＣＣ群では中央値が７０日であり、有意にＬＭＣＣ群で延長していた（ｐ＝＜０．００１，ＨＲ＝０．２２：図４Ａ）。
抗ＥＧＦＲ抗体薬初回投与後の全生存期間（ＯＳ）の比較では、ＬＭＣＣ群では中央値が１４．１か月、ＨＭＣＣ群では中央値が９．３か月であり、有意にＬＭＣＣ群で延長していた（ｐ＝０．０３，ＨＲ＝０．３５：図４Ｂ）。
以上の結果より、メチル化状態により分類された２群間では抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時の奏効率、ＰＦＳ、ＯＳのいずれにおいても有意差を認めており、実施例１で示された網羅的なメチル化状態の、抗ＥＧＦＲ抗体薬の治療効果予測因子としての役割が再現された。
実施例３：既存のバイオマーカーとの比較
先述の通り、近年ではＫＲＡＳエクソン２に加え、ＫＲＡＳエクソン２，３，４およびＮＲＡＳエクソン２，３，４に変異を有する症例では抗ＥＧＦＲ抗体薬の治療効果に乏しいことが報告され、バイオマーカーとして本邦でも臨床応用されつつある。
先述の通り、近年ではＫＲＡＳエクソン２に加え、ＫＲＡＳエクソン２，３，４およびＮＲＡＳエクソン２，３，４に変異を有する症例では抗ＥＧＦＲ抗体薬の治療効果に乏しいことが報告され、バイオマーカーとして本邦でも臨床応用されつつある。
本研究における解析対象９７例のうち、４９例は全エクソン解析を併せて行っていることから、抗ＥＧＦＲ抗体薬の治療効果予測に関し、メチル化に基づく本分類と既存のバイオマーカー（上記ＫＲＡＳとＮＲＡＳを併せてＲＡＳ遺伝子型）による分類とで比較を行った（表３）。
初めに抗ＥＧＦＲ抗体薬の奏効率について比較を行った。治療抵抗性群であるＨＭＣＣ群とＲＡＳ変異群における奏効率はいずれも７．７％であり、治療感受性群であるＬＭＣＣ群とＲＡＳ野生群の奏効率はいずれも３３．３％であった。以上の結果より、本分類は抗ＥＧＦＲ抗体薬による奏効率において、ＲＡＳ遺伝子型による分類と同等の関連性を示すことが示された。
続いて、抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時の無憎悪生存期間（ＰＦＳ）について比較を行った（図５）。いずれの分類においても治療感受性群（ＬＭＣＣ群、ＲＡＳ野生群）で有意にＰＦＳが延長していた。ハザード比（ＨＲ）はそれぞれ０．２６（ＬＭＣＣ群ｖｓ．ＨＭＣＣ群）、０．３２（ＲＡＳ野生群ｖｓ．変異群）であった。以上の結果より、本分類は抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時のＰＦＳにおいて、ＲＡＳ遺伝子型による分類と同等の関連性を示した。
抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時の無憎悪生存期間（ＰＦＳ）に影響を与えうる因子を用いて多変量解析を行った（表４）。メチル化状態による本分類とＲＡＳ遺伝子型による分類でｐ値が０．０５を下回ったハザード比（ＨＲ）は本分類とＲＡＳ遺伝子型による分類とで同等であった。以上の結果より、本分類が抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時のＰＦＳの独立した規定因子であることが示され、ハザード比はＲＡＳ遺伝子型による分類と同等であることが示された。
抗ＥＧＦＲ抗体薬初回投与後の全生存期間（ＯＳ）について比較を行った（図６）。いずれの分類においても治療感受性群（ＬＭＣＣ群、ＲＡＳ野生群）でＯＳが延長する傾向を認めた。ハザード比（ＨＲ）はそれぞれ０．４２（ＬＭＣＣ群ｖｓ．ＨＭＣＣ群）、０．３９（ＲＡＳ野生群ｖｓ．変異群）であった。いずれの分類法でも２群間で有意差は認めなかったが、本分類は抗ＥＧＦＲ抗体薬初回投与後のＯＳにおいても、ＲＡＳ遺伝子型による分類と同等の関連性を示した。
以上より、抗ＥＧＦＲ抗体薬の奏効率、抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時のＰＦＳおよび抗ＥＧＦＲ抗体薬初回投与後のＯＳのいずれにおいても本分類はＲＡＳ遺伝子型による分類と同等の関連性を示した。また、多変量解析の結果から、抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時のＰＦＳにおいて本分類はＲＡＳ遺伝子型とは独立した規定因子であることが示された。
実施例４：既知のサブタイプ分類との比較
Ｙａｇｉらは７つの遺伝子のメチル化状態を調べることにより、大腸癌を３つのサブタイプに分類（（ＨＭＥ（高メチル化群）、ＩＭＥ（中メチル化群）、ＬＭＥ（低メチル化群））し、ＩＭＥにはＫＲＡＳ変異を有する症例が濃縮されることを示している（前掲：Ｙａｇｉ Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１０ Ｊａｎ １；１６（１）：２１−３３）。また、ＩＭＥかつＫＲＡＳ変異を有する症例は全生存期間が他の症例群に比べ有意に短縮していることを示している。
Ｙａｇｉらは７つの遺伝子のメチル化状態を調べることにより、大腸癌を３つのサブタイプに分類（（ＨＭＥ（高メチル化群）、ＩＭＥ（中メチル化群）、ＬＭＥ（低メチル化群））し、ＩＭＥにはＫＲＡＳ変異を有する症例が濃縮されることを示している（前掲：Ｙａｇｉ Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１０ Ｊａｎ １；１６（１）：２１−３３）。また、ＩＭＥかつＫＲＡＳ変異を有する症例は全生存期間が他の症例群に比べ有意に短縮していることを示している。
この７つの遺伝子について我々の症例群におけるメチル化状態を評価し、上記論文で述べられている方法に従って３群に分類した。
サブタイプ分類に使用される７つの遺伝子のうち６つは、Ｙａｇｉらが解析した領域に含まれるプローブが抽出されたが、残り１つの遺伝子（ＦＢＮ２）は、Ｙａｇｉらが評価した領域に含まれるプローブがデザインされていないため、ＵＣＳＣのブラウザを用いて同じＣｐＧアイランドに含まれるプローブのなかでＹａｇｉらが評価した領域に近いプローブを抽出した。
各マーカーにつき複数のプローブが抽出されたため、例えば３つプローブがある場合は過半数（２つ以上）のプローブでメチル化を認める（β値≧０．５）場合にそのマーカーはメチル化陽性であると判断した。
上記の結果、実施例１、実施例２を併せた計９７例は、ＨＭＥ（７例）、ＩＭＥ（１６例）、ＬＭＥ（７４例）の３群に分類された（表５）。
抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時の無増悪生存期間（ＰＦＳ）の中央値はＨＭＥで８５日、ＩＭＥで６７日、ＬＭＥで１６８であり、ＬＭＥはＨＭＥ、ＩＭＥの両群に比べ有意に無増悪生存期間（ＰＦＳ）が延長する結果であった（ｖｓ．ＨＭＥ ｐ＝０．００４，ｖｓ．ＩＭＥ ｐ＝１．１４Ｅ−０６，ｖｓ．ＨＭＥ＋ＩＭＥ ｐ＝３．２１Ｅ−０７：図７Ｂ）。
以上の結果より、メチル化プロファイルによる抗ＥＧＦＲ抗体薬の治療効果予測は数個のプローブに絞ることでも十分に可能であることが示され、実用化に向け現在の網羅的解析に基づく診断法から、限定した領域のメチル化を検出するより簡便な診断法に移行することが可能であることが示された。
また、ＨＭＥとＩＭＥに含まれた２３例は実施例１と２において全て高メチル化群に含まれる症例であった。
本実施例により、本発明の分類法は、既存のメチル化に基づくサブタイプ分類に比較して、多くのメチル化症例を抽出することが可能であり、また既存のサブタイプ分類では抽出されなかった高メチル化症例も抗ＥＧＦＲ抗体薬に抵抗性であることが示された。すなわち、本発明の方法によれば、既存のサブタイプ分類に比べて、抗ＥＧＦＲ抗体薬による治療感受性をより高い確度で予測できる。
実施例１と２における薬剤抵抗性群である高メチル化群の症例は合計３４例であり、実施例３で用いた７つの遺伝子に関するマーカーにさらにいくつかのマーカーを追加することにより、ＬＭＥに含まれる薬剤抵抗性症例と考えらえる１１例を抽出することが可能になると考えられた。
実施例５：限定されたプローブ数による分類方法の検討
実施例１及び実施例２に含まれる９７例を用いて限定されたプローブ数による分類方法を検討した。実施例１及び２はそれぞれ抽出された３，１６３、２，５７７のプローブを解析に使用し、教師なしクラスター解析により対象症例を分類したものである。各々の実施例で解析に使用されたプローブのうち、１７４４のプローブが両実施例で共通していた。このうち、ＨＭＣＣ群に分類された症例群とＬＭＣＣ群に分類された症例群の間で、β値に差のある１０５３のプローブを抽出した（表７：実施例の最後に記載する）。
実施例１及び実施例２に含まれる９７例を用いて限定されたプローブ数による分類方法を検討した。実施例１及び２はそれぞれ抽出された３，１６３、２，５７７のプローブを解析に使用し、教師なしクラスター解析により対象症例を分類したものである。各々の実施例で解析に使用されたプローブのうち、１７４４のプローブが両実施例で共通していた。このうち、ＨＭＣＣ群に分類された症例群とＬＭＣＣ群に分類された症例群の間で、β値に差のある１０５３のプローブを抽出した（表７：実施例の最後に記載する）。
抽出された１０５３のプローブのうち、４から１０個のプローブをランダムに抽出し、抽出されたプローブのメチル化状態に従って症例をＨＭＣＣ群もしくはＬＭＣＣ群に分類した。各プローブのメチル化判定は、β値が０．５以上であった場合をメチル化陽性と判定し、０．５を下回った場合はメチル化陰性と判定した。
解析に用いたプローブのうち、６０％以上のプローブがメチル化陽性であった場合にその症例はＨＭＣＣ群に分類された（例えば、４つのプローブを使用した場合は３個以上、６個のプローブを使用した場合は４個以上でメチル化が陽性であればＨＭＣＣ群と分類する）。
上記の方法で分類された結果について、実施例１及び２における各症例の分類結果を正解として感度及び特異度を計算した。すなわち、感度は実施例１及び２でＨＭＣＣ群と判定された合計３４例のうち、本実施例における方法でもＨＭＣＣ群と判定された症例の割合を示す。一方、特異度は実施例１及び２でＬＭＣＣ群と判定された合計６３例のうち、実施例５における方法でもＬＭＣＣ群と判定された症例の割合を示す。
抽出するプローブの数を５種類設定した（４個、５個、６個、７個、１０個）。任意のプローブ抽出と症例の分類及び感度特異度の算出を１セットとし、それぞれの条件でこれを５セット繰り返し、その平均値を各条件での感度特異度とした。各条件で算出された感度特異度を表に示す。
この結果から、今回抽出された１０５３のプローブリストのうち、少なくとも４個のプローブをランダムに抽出することで８３．５％の感度、９３．７％の特異度で症例群を分類可能であることが示された。
上記の結果から、表７の１０５３のプローブリストから選ばれる数個のプローブのメチル化状態を評価することで、実用化に十分な感度及び特異度で、より簡便に抗ＥＧＦＲ抗体薬の治療効果を予測可能なことが示された。
実施例６：進行性再発大腸癌における治療成績とメチル化分類の相関
１）１次治療成績とメチル化分類の相関
進行再発大腸癌９４例について、実施例１にしたがって網羅的メチル化解析を行い、ＨＭＣＣ群（３４例）とＬＭＣＣ群（６０例）に分類し、それぞれの群で１次治療の無増悪生存期間を比較した。
１）１次治療成績とメチル化分類の相関
進行再発大腸癌９４例について、実施例１にしたがって網羅的メチル化解析を行い、ＨＭＣＣ群（３４例）とＬＭＣＣ群（６０例）に分類し、それぞれの群で１次治療の無増悪生存期間を比較した。
その結果、ＨＭＣＣ群では、オキサリプラチンを含む併用療法（実線）がイリノテカンを含む併用療法（破線）に比べ、無増悪生存期間が短い傾向を認めたが、ＬＭＣＣ群では両治療法の間で無増悪生存期間の差を認めなかった（図８）。従って、本発明のメチル化分類は進行再発大腸癌の１次治療における治療選択のためのバイオマーカーとして有用と考えられた。
２）２次治療成績とメチル化分類の相関
進行再発大腸癌８４例について、網羅的メチル化解析を行い、ＨＭＣＣ群（３１例）とＬＭＣＣ群（５３例）に分類し、それぞれの群で２次治療の無増悪生存期間を比較した。
進行再発大腸癌８４例について、網羅的メチル化解析を行い、ＨＭＣＣ群（３１例）とＬＭＣＣ群（５３例）に分類し、それぞれの群で２次治療の無増悪生存期間を比較した。
その結果、ＨＭＣＣ群では、イリノテカンを含む併用療法（破線）がオキサリプラチンを含む併用療法（実線）に比べ、無増悪生存期間が短い傾向を認めたが、ＬＭＣＣ群ではオキサリプラチンを含む併用療法（実線）がイリノテカンを含む併用療法（破線）に比べ、無増悪生存期間が短い傾向を認めた（図９）。以上より、本発明のメチル化分類は進行再発大腸癌の２次治療における治療選択のためのバイオマーカーとして有用と考えられた。
３）１次、２次治療成績とメチル化分類の相関
進行再発大腸癌８４例について、網羅的メチル化解析を行い、ＨＭＣＣ群（３１例）とＬＭＣＣ群（５３例）に分類し、それぞれの群で１次、２次治療におけるオキサリプラチンあるいはイリノテカンを含む併用療法の治療成績及び全生存期間を比較した。
進行再発大腸癌８４例について、網羅的メチル化解析を行い、ＨＭＣＣ群（３１例）とＬＭＣＣ群（５３例）に分類し、それぞれの群で１次、２次治療におけるオキサリプラチンあるいはイリノテカンを含む併用療法の治療成績及び全生存期間を比較した。
その結果、ＨＭＣＣ群では、１次治療にオキサリプラチンを含む併用療法、続く２次治療にイリノテカンを含む併用療法を行った群（実線）が、その逆の順番で行った群（破線）よりも無増悪生存期間が短い傾向を認めた（図１０Ａ）。一方、ＬＭＣＣ群では両治療法の間で無増悪生存期間の差を認めなかった（図１０Ｂ）。
また、ＨＭＣＣ群では、１次治療にオキサリプラチンを含む併用療法、続く２次治療にイリノテカンを含む併用療法を行った群（実線）が、その逆の順番で行った群（破線）よりも全生存期間が有意に短縮していた（図１１Ａ）。一方、ＬＭＣＣ群では両治療法の間で全生存期間の差を認めなかった（図１１Ｂ）。
以上より、メチル化分類は進行再発大腸癌の１次治療及び２次治療における治療選択のみならず、１次治療、２次治療の順番を選択するためのバイオマーカーとしても有用と考えられた。
実施例７：進行性再発大腸癌における治療成績とＣＩＭＰ分類の相関
１）１次治療成績とＣＩＭＰ分類の相関
進行再発大腸癌１０８例について、公知の方法にしたがいＣＩＭＰ解析を行い、ＣＩＭＰ陽性（２４例）とＣＩＭＰ陰性（８４例）に分類し、それぞれの群で１次治療の無増悪生存期間を比較した。
１）１次治療成績とＣＩＭＰ分類の相関
進行再発大腸癌１０８例について、公知の方法にしたがいＣＩＭＰ解析を行い、ＣＩＭＰ陽性（２４例）とＣＩＭＰ陰性（８４例）に分類し、それぞれの群で１次治療の無増悪生存期間を比較した。
ＣＩＭＰ陽性では、オキサリプラチンを含む併用療法（実線）がイリノテカンを含む併用療法（破線）に比べ、無増悪生存期間が短い傾向を認めたが、ＣＩＭＰ陰性群では両治療法の間で無増悪生存期間の差を認めなかった（図１２）。従って、ＣＩＭＰ分類は進行再発大腸癌の１次治療における治療選択のためのバイオマーカーとして有用と考えられた。
２）２次治療成績とＣＩＭＰ分類の相関
進行再発大腸癌７８例について、ＣＩＭＰ解析を行い、ＣＩＭＰ陽性（１７例）とＣＩＭＰ陰性（６１例）に分類し、それぞれの群で２次治療の無増悪生存期間を比較した。
進行再発大腸癌７８例について、ＣＩＭＰ解析を行い、ＣＩＭＰ陽性（１７例）とＣＩＭＰ陰性（６１例）に分類し、それぞれの群で２次治療の無増悪生存期間を比較した。
その結果、ＣＩＭＰ陽性では、イリノテカンを含む併用療法（実線）がオキサリプラチンを含む併用療法（破線）に比べ、無増悪生存期間が短い傾向を認めた（図１３Ａ）。一方、ＣＩＭＰ陰性群では両治療法の間で無増悪生存期間の差を認めなかった（図１３Ｂ）。従って、ＣＩＭＰ分類は進行再発大腸癌の２次治療における治療選択のためのバイオマーカーとして有用と考えられた。
３）１次、２次治療成績とＣＩＭＰ分類の相関
進行再発大腸癌（７８例）について、ＣＩＭＰ解析を行い、ＣＩＭＰ陽性（１７例）とＣＩＭＰ陰性（６１例）に分類し、それぞれの群で１次、２次治療におけるオキサリプラチンあるいはイリノテカンを含む併用療法の治療成績を比較した。
進行再発大腸癌（７８例）について、ＣＩＭＰ解析を行い、ＣＩＭＰ陽性（１７例）とＣＩＭＰ陰性（６１例）に分類し、それぞれの群で１次、２次治療におけるオキサリプラチンあるいはイリノテカンを含む併用療法の治療成績を比較した。
その結果、ＣＩＭＰ陽性では、１次治療にオキサリプラチンを含む併用療法、続く２次治療にイリノテカンを含む併用療法を行った群（実線）が、その逆の順番で行った群（破線）よりも、有意に無増悪生存期間が短かった（図１４Ａ）。ＣＩＭＰ陰性群では両治療法の間で無増悪生存期間の差を認めなかった（図１４Ｂ）。
進行再発大腸癌において１次治療を行った１０８例、及び２次治療に進んだ７８例について、ＣＩＭＰ解析を行い、それぞれＣＩＭＰ陽性（２４例）とＣＩＭＰ陰性（８４例）、ＣＩＭＰ陽性（１７例）とＣＩＭＰ陰性（６１例）に分類した。
ＣＩＭＰ陽性の症例では、１次治療にオキサリプラチンを含む併用療法、２次治療ではイリノテカンを含む併用療法の無増悪生存期間が短い傾向があった（図１５Ａ、Ｃ）。一方、１次から２次治療を継続して解析すると、１次治療にオキサリプラチンを含む併用療法、続く２次治療にイリノテカンを含む併用療法を行った群が、その逆の順番で行った群よりも、有意に無増悪生存期間が短かった（図１５Ｅ）。ＣＩＭＰ陰性群では両治療法の間で無増悪生存期間の差を認めなかった（図１５Ｂ、Ｄ、Ｆ）。
以上より、ＣＩＭＰ分類は進行再発大腸癌の１次治療及び２次治療における治療選択のみならず、１次治療、２次治療の順番を選択するためのバイオマーカーとしても有用と考えられた。
実施例８：２つのコホートにおけるプローブの絞り込みと検証
実施例１及び２の患者群をそれぞれ第１コホート（Ｃ１）及び第２コホート（Ｃ２）として、以下の手順で、解析に使用するプローブの絞り込みと検証を行った（図１６）。
１）まず、Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔというアルゴリズムを用いて、ＨＭＣＣとＬＭＣＣの分類に関する予測モデルを作成した。
２）第１コホート抽出された３，１６３プローブ及び第２コホートで抽出された２，５７７プローブのうち、共通する１７４４のプローブを抽出した。
３）抽出した１７４４のプローブを用いて、Ｒａｎｄｏｍ ＦｏｒｅｓｔによりＣ１でモデルを作り、Ｃ２の分類結果を予測した。
４）抽出した１７４４のプローブを用いて、Ｒａｎｄｏｍ ＦｏｒｅｓｔによりＣ２でモデルを作り、Ｃ１の分類結果を予測した。
５）上記３）及び４）においてＲａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓがモデルを作る時の変数の重要性を確認し、０．００２以上で変数を絞り込んだ。
６）上記５）の結果、Ｃ１モデルから１４０プローブ、Ｃ２モデルから１２８プローブが抽出された。
７）上記６）において、共通プローブを抽出すると２４プローブが残った。
８）この２４プローブを用いて３）、４）の予測を行った。
８−１）Ｃ１でモデルを作り、Ｃ２の分類結果を予測した場合は正解率が９８．１％であった（１例のみ正解と異なっていた）。
８−２）Ｃ２でモデルを作り、Ｃ１の分類結果を予測した場合は正解率が１００％であった。
実施例１及び２の患者群をそれぞれ第１コホート（Ｃ１）及び第２コホート（Ｃ２）として、以下の手順で、解析に使用するプローブの絞り込みと検証を行った（図１６）。
１）まず、Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔというアルゴリズムを用いて、ＨＭＣＣとＬＭＣＣの分類に関する予測モデルを作成した。
２）第１コホート抽出された３，１６３プローブ及び第２コホートで抽出された２，５７７プローブのうち、共通する１７４４のプローブを抽出した。
３）抽出した１７４４のプローブを用いて、Ｒａｎｄｏｍ ＦｏｒｅｓｔによりＣ１でモデルを作り、Ｃ２の分類結果を予測した。
４）抽出した１７４４のプローブを用いて、Ｒａｎｄｏｍ ＦｏｒｅｓｔによりＣ２でモデルを作り、Ｃ１の分類結果を予測した。
５）上記３）及び４）においてＲａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓがモデルを作る時の変数の重要性を確認し、０．００２以上で変数を絞り込んだ。
６）上記５）の結果、Ｃ１モデルから１４０プローブ、Ｃ２モデルから１２８プローブが抽出された。
７）上記６）において、共通プローブを抽出すると２４プローブが残った。
８）この２４プローブを用いて３）、４）の予測を行った。
８−１）Ｃ１でモデルを作り、Ｃ２の分類結果を予測した場合は正解率が９８．１％であった（１例のみ正解と異なっていた）。
８−２）Ｃ２でモデルを作り、Ｃ１の分類結果を予測した場合は正解率が１００％であった。
抽出された２４プローブを表８に示す。２４のプローブを用いて、スライドに示した条件を設定し、解析に用いた９７症例を分類しなおした結果を図１７に示す。本分類では、各プローブにおいて、β値が０．５以上である場合にメチル化陽性とした。また、２４のプローブのうち、メチル化陽性のプローブが１６個以上である場合ＨＭＣＣ群、メチル化陽性のプローブが１５個以下の場合ＬＭＣＣ群とした。
例えば、染色体番号が３、位置情報が１５０８０２９９７と記載されている場合は、３番染色体の１５０８０２９９７に存在する特定の１塩基がメチル化されているということを表わす。本分類で述べているメチル化とは、「ヒトゲノム上に存在するある特定の箇所の１塩基がメチル化されている」ことを意味する。
互いのコホートで作成したモデルを用いて、もう一方のコホートを分類した結果、いずれにおいても正解率が９割以上であったことから、各コホートにおける分類の再現性は高く、また両コホートの分類に効いている変数（プローブ）は同様の傾向を示すものから構成されていると考えられた。さらに、互いのコホートで作成したモデルに使用されたプローブのうち、共通する２４個のプローブを用いて再度それぞれのコホートでランダムフォレストを用いてモデルを作成し、もう一方のコホートを分類した結果、１例を除いて全ての症例が正確に分類された。
以上の結果から、抽出された２４プローブを用いることで、３１４４もしくは２５７７のプローブを用いた場合とほぼ同等の精度でＨＭＣＣもしくはＬＭＣＣの分類が可能となることが示された。
すなわち、臨床応用に向けたより簡便な検出系への移行が可能であることが示された。
すなわち、臨床応用に向けたより簡便な検出系への移行が可能であることが示された。
本発明の方法は、検体採取条件による結果のばらつきが少なく、原発巣切除の際に採取した検体であっても、治療開始時点の腫瘍におけるメチル化プロファイルと同等の結果が得られる。また、本発明の方法は、併用療法における１次治療及び２次治療の選択のみならず、その適用順序の適否も判定できるため、患者や疾患の状態に応じた最適な治療計画を提供することができる。すなわち、本発明によれば、がん薬物療法に対する応答性を高精度で予測し、患者の経済的・身体的負担を低減し、より費用対効果の高い投与指針を提供することができる。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
Claims (9)
- 大腸癌患者の抗EGFR抗体を用いたがん薬物療法に対する応答性を予測する方法であって：
(1)被験者の大腸癌組織、大腸癌細胞、又は大腸癌細胞由来のDNAを含む検体中のDNAメチル化レベルを測定する工程、
(2)β値が０．５以上の遺伝子をメチル化陽性とし、メチル化陽性の遺伝子の割合が６０％以上の場合に当該被験者を高メチル化群に、６０％未満である場合に低メチル化群に分類する工程、及び
(3)低メチル化群に分類された場合に前記被験者を抗EGFR抗体感受性と判定し、高メチル化群に分類された場合に前記被験者を抗EGFR抗体抵抗性と判定する工程、を含み、
下記表８記載の染色体番号及び位置情報によって特定される２４遺伝子並びにCACNA1G、LOX、SLC30A10、ELMO1、HAND1、IBN2、及びTHBDから選ばれる少なくとも４以上のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする方法。
［表８］
- 表８記載の２４遺伝子並びにCACNA1G、LOX、SLC30A10、ELMO1、HAND1、IBN2、及びTHBDから選ばれる４〜２０のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする、請求項１記載の方法。
- 表８記載の２４遺伝子並びにCACNA1G、LOX、SLC30A10、ELMO1、HAND1、IBN2、及びTHBDの遺伝子群から選ばれる４〜１０のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする、請求項１記載の方法。
- マーカー遺伝子が表８記載の２４遺伝子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 複数のがん薬物療法の適用順序の適否を判定できることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を予測するためのプローブセットであって、
下記表８記載の染色体番号及び位置情報によって特定される２４遺伝子並びにCACNA1G、LOX、SLC30A10、ELMO1、HAND1、IBN2、及びTHBDから選ばれる４以上のマーカー遺伝子について、その少なくとも１つのCpG部位を含む領域と相補的な配列を含み、前記CpG部位のメチル化の有無を検出可能なプローブを含むプローブセット。
［表８］
- マーカー遺伝子が表８記載の２４遺伝子である、請求項６記載のプローブセット。
- 大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を予測するためのキットであって、
(a)下記表８記載の染色体番号及び位置情報によって特定される２４遺伝子並びにCACNA1G、LOX、SLC30A10、ELMO1、HAND1、IBN2、及びTHBDから選ばれる４以上のマーカー遺伝子について、その少なくとも１つのCpG部位を含む領域と相補的な配列を含み、前記CpG部位のメチル化の有無を検出可能なプローブ、及び
(b)下記表８記載の染色体番号及び位置情報によって特定される２４遺伝子並びにCACNA1G、LOX、SLC30A10、ELMO1、HAND1、IBN2、及びTHBDから選ばれる４以上のマーカー遺伝子について、その少なくとも１つのCpG部位を含む領域に結合し、前記CpG領域を含む領域を増幅可能なプライマーペア、を含むキット。
［表８］
- マーカー遺伝子が表８記載の２４遺伝子である、請求項８記載のキット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2014212503 | 2014-10-17 | ||
| JP2014212503 | 2014-10-17 | ||
| PCT/JP2015/079909 WO2016060278A1 (ja) | 2014-10-17 | 2015-10-16 | 大腸癌に対する薬物療法の感受性を予測する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2016060278A1 JPWO2016060278A1 (ja) | 2017-08-31 |
| JP6709541B2 true JP6709541B2 (ja) | 2020-06-17 |
Family
ID=55746807
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2016554153A Active JP6709541B2 (ja) | 2014-10-17 | 2015-10-16 | 大腸癌に対する薬物療法の感受性を予測する方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20170356051A1 (ja) |
| JP (1) | JP6709541B2 (ja) |
| WO (1) | WO2016060278A1 (ja) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018202666A1 (en) * | 2017-05-03 | 2018-11-08 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Cpg-site methylation markers in colorectal cancer |
| CN111850115B (zh) * | 2019-04-25 | 2024-03-05 | 罗俊航 | 用于预测晚期肾癌应用tki类药物敏感性的分子诊断模型 |
| EP3978016A4 (en) | 2019-05-31 | 2023-10-04 | Tohoku University | METHOD FOR TESTING THE SENSITIVITY OF CHEMOTHERAPY IN COLORECTAL CARCINOMA |
| US11396679B2 (en) | 2019-05-31 | 2022-07-26 | Universal Diagnostics, S.L. | Detection of colorectal cancer |
| CN110423814A (zh) * | 2019-07-19 | 2019-11-08 | 江苏元丞生物科技有限公司 | Elmo1基因甲基化检测试剂盒及其应用 |
| CN110317874A (zh) * | 2019-07-19 | 2019-10-11 | 江苏元丞生物科技有限公司 | Vav3基因甲基化检测试剂盒及其应用 |
| US11898199B2 (en) | 2019-11-11 | 2024-02-13 | Universal Diagnostics, S.A. | Detection of colorectal cancer and/or advanced adenomas |
| US20230257821A1 (en) * | 2020-01-17 | 2023-08-17 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for diagnosing hepatocellular carcinoma |
| US11530453B2 (en) * | 2020-06-30 | 2022-12-20 | Universal Diagnostics, S.L. | Systems and methods for detection of multiple cancer types |
| CN112430657B (zh) * | 2020-10-27 | 2022-09-09 | 哈尔滨医科大学 | 结直肠癌相关的甲基化标志物以及用于检测结直肠癌的试剂盒 |
| CN114507740B (zh) * | 2022-04-19 | 2022-07-29 | 广州滴纳生物科技有限公司 | 用于胃肠癌诊断的生物标志物、核酸产品和试剂盒 |
| CN116042820B (zh) * | 2022-09-07 | 2023-09-29 | 浙江大学 | 一组结肠癌dna甲基化分子标志物及其在制备用于结肠癌早期诊断试剂盒中的应用 |
| CN116597902B (zh) * | 2023-04-24 | 2023-12-01 | 浙江大学 | 基于药物敏感性数据的多组学生物标志物筛选方法和装置 |
| CN117551762B (zh) * | 2023-10-19 | 2024-05-10 | 嘉兴允英医学检验有限公司 | 作为结直肠肿瘤标志物的dna甲基化位点组合及其应用 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US1000438A (en) * | 1910-06-02 | 1911-08-15 | Int Harvester Co | Hay-rake. |
| US6783933B1 (en) * | 1999-09-15 | 2004-08-31 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | CACNA1G polynucleotide, polypeptide and methods of use therefor |
| PL1826279T3 (pl) * | 2006-02-28 | 2011-11-30 | Univ Berlin Charite | Wykrywanie i kontrola jakości regulatorowych limfocytów T dzięki analizie metylacji DNA genu FoxP3 |
| JP5602355B2 (ja) * | 2008-10-11 | 2014-10-08 | 和之 川上 | 癌患者の外科的手術後の治療選択方法及び予後診断 |
| WO2011002029A1 (ja) * | 2009-07-03 | 2011-01-06 | 国立大学法人東京大学 | 癌細胞の存否を判定する方法および癌患者の予後を判定する方法 |
| JPWO2011024999A1 (ja) * | 2009-08-28 | 2013-01-31 | 北海道公立大学法人 札幌医科大学 | 浸潤性大腸腫瘍検出用の検体 |
| JP2011097833A (ja) * | 2009-11-04 | 2011-05-19 | Takeshi Zama | 特定の遺伝子のメチル化の頻度を、頭頸部腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法 |
| JP2011160711A (ja) * | 2010-02-09 | 2011-08-25 | Keio Gijuku | 特定の遺伝子のメチル化の頻度を、婦人科がんのバイオマーカーとして使用する方法 |
| WO2012167145A2 (en) * | 2011-06-01 | 2012-12-06 | University Of Southern California | Genome-scale analysis of aberrant dna methylation in colorectal cancer |
| SG11201400996SA (en) * | 2011-09-30 | 2014-04-28 | Genentech Inc | Diagnostic methylation markers of epithelial or mesenchymal phenotype and response to egfr kinase inhibitor in tumours or tumour cells |
| KR102082098B1 (ko) * | 2012-05-11 | 2020-02-26 | 국립연구개발법인 고쿠리츠간켄큐센터 | 신장 세포암의 예후 예측방법 |
| AU2012388616A1 (en) * | 2012-08-31 | 2015-04-02 | National Defense Medical Center | Method for screening cancer |
-
2015
- 2015-10-16 JP JP2016554153A patent/JP6709541B2/ja active Active
- 2015-10-16 WO PCT/JP2015/079909 patent/WO2016060278A1/ja active Application Filing
- 2015-10-16 US US15/518,305 patent/US20170356051A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2016060278A1 (ja) | 2016-04-21 |
| US20170356051A1 (en) | 2017-12-14 |
| JPWO2016060278A1 (ja) | 2017-08-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6709541B2 (ja) | 大腸癌に対する薬物療法の感受性を予測する方法 | |
| AU2020223754B2 (en) | Methods and materials for assessing loss of heterozygosity | |
| Buono et al. | Circulating tumor DNA analysis in breast cancer: Is it ready for prime-time? | |
| Sinicrope et al. | Molecular markers identify subtypes of stage III colon cancer associated with patient outcomes | |
| US20220010385A1 (en) | Methods for detecting inactivation of the homologous recombination pathway (brca1/2) in human tumors | |
| US20230117133A1 (en) | Methods and materials for assessing homologous recombination deficiency | |
| Zhu et al. | Potential clinical utility of liquid biopsies in ovarian cancer | |
| Jover et al. | 5-Fluorouracil adjuvant chemotherapy does not increase survival in patients with CpG island methylator phenotype colorectal cancer | |
| Kalia | Biomarkers for personalized oncology: recent advances and future challenges | |
| Rimbert et al. | Association between clinicopathological characteristics and RAS mutation in colorectal cancer | |
| Cankovic et al. | The role of MGMT testing in clinical practice: a report of the association for molecular pathology | |
| CN106715723B (zh) | 测定样品中pik3ca突变状态的方法 | |
| CA2802882C (en) | Methods and materials for assessing loss of heterozygosity | |
| JP5955557B2 (ja) | 膵臓腫瘍形成の根底にある経路および遺伝性の膵癌遺伝子 | |
| Jones et al. | Circulating tumour DNA as a biomarker in resectable and irresectable stage IV colorectal cancer; a systematic review and meta-analysis | |
| US10585100B2 (en) | Method of predicting effect of treatment by PD-1/PD-L1 blockade using abnormality of PD-L1 (CD274) as index | |
| JP2015512630A5 (ja) | ||
| EP3888093A1 (en) | Differential methylation | |
| Oakley III et al. | Higher dosage of the epidermal growth factor receptor mutant allele in lung adenocarcinoma correlates with younger age, stage IV at presentation, and poorer survival | |
| US20140242583A1 (en) | Assays, methods and compositions for diagnosing cancer | |
| CN102732516A (zh) | 一种多重巢式甲基化特异性pcr扩增引物及其使用方法与应用 | |
| Shu et al. | Identification of a DNA-methylome-based signature for prognosis prediction in driver gene-negative lung adenocarcinoma | |
| Berner | The Molecular Basis of Exceptional Survivorship in Stage 4 Colorectal Cancer | |
| JP2022548993A (ja) | Ｄｎａメチル化異常を用いた免疫抗癌治療反応性予測方法 | |
| JP5967699B2 (ja) | 遺伝子発現解析による大腸がんの病型分類に基づく抗癌剤応答性及び予後の予測方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170327 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170412 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20181015 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181109 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190917 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191114 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200407 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200507 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6709541 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |