JP6697394B2 - 異常折り畳みタンパク質を検出するための方法および組成物 - Google Patents
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Description
本願は、その全体において本明細中で参照により援用される2014年4月10日に出願された米国仮特許出願番号61/978,158の35U.S.C. §119(e)の利益を主張する。
本開示の局面は、診断および予後の分野に関する。
子癇前症(PE)は、妊娠特異的過敏性障害であり、世界的に、母性および周産期の罹病率ならびに死亡についての第1の原因である。世界保健機関(WHO)は、世界的な母性死亡率の16%(1年間に約63,000の母体死亡)がPE単独によると推定している。米国において、全妊婦の5〜8%、すなわち270,000人の女性が子癇前症に罹患し、子癇前症は毎年の母体死亡の18%を占め、発現は増加している。幼児もまたリスクが高く、米国では毎年10,500人の赤ん坊が子癇前症のために死亡している。子癇前症は、観察された症状に基づいて診断される。子癇前症のための正確な診断製品はない。
子癇前症は、ヒトの妊婦に特有の高血圧性蛋白尿症候群である。子癇前症の診断に伴う1つの問題は、高血圧も蛋白尿もいずれも、特に典型的でない胎位を有する女性において感受性または特異的ではないということである。子癇前症の女性の尿は異常折り畳みタンパク質(misfolded protein)に非常に富んでいる。異常折り畳みタンパク質が豊富であるために、異常折り畳みタンパク質に親和性を有する色素を使用した単純な色素試験を、子癇前症の診断的ツールおよび臨床的予後ツールとして使用し得る。かかる色素試験の一例は、異常折り畳みタンパク質に親和性を有する(例えば結合能力を有する)アゾ色素、コンゴーレッドの使用を含むコンゴーレッドドット試験である。
子癇前症(PE)診断、高血圧および蛋白尿の基礎は、子癇前症を示すが特異的ではない血圧(BP)および尿タンパク質の定量的な測定に依拠するということは、大きな問題である。さらに、これらの測定は低供給源設定では達成することが困難である。また、子癇前症の診断は、子癇前症が慢性高血圧(crHTN)(例えばspPEとして公知の事例)または慢性腎疾患と共に存在する場合、高い供給源設定であっても、母子医学の専門家に難題を与え続ける。しばしば高血圧または蛋白尿の最小量または非存在を示す単発的な神経学的症状、右上四円分の痛み、肝臓酵素の上昇および尿量減少などの「典型的でない」臨床症状発現によって他の課題が提起される。高供給源設定において、これらの女性は、第三次レベルの病院に入院して、連続的な血圧および胎児のモニタリングに沿って4〜6時間ごとに多くの血液および尿の実験室精密検査を受ける。多くの低供給源設定および発展途上国において、これは実際に達成可能ではない。
この実施例に示される実験は、例えば尿中の異常折り畳みタンパク質の迅速かつ正確な同定のための簡易な診断方法および組成物(例えばキット)の開発に関するものであった。妊娠女性において、尿中の異常折り畳みタンパク質の存在は、子癇前症の指標として使用し得る。既存のコンゴーレッドドット試験は、子癇前症のための診断および予後ツールとして使用し得る有効な試験である。しかしながら、ニトロセルロースおよびアルコール洗浄などの比較的高価な試薬を典型的に使用するコンゴーレッドドット試験は、完了するのに約5時間かかる。この試験の目的の1つは、例えばケアの点で、例えば健康管理提供者による妊娠健康診断において実行され得、また低供給源設定に適する、簡易化され、低コストでかつ効果的な診断方法および組成物を生成することであった。この目的に対して、いくつかの態様において、低コストで半定量的な結果を例えば2分以内、定量的な結果を例えば7分以内に提供する簡易化された紙ベースの方法および組成物が本明細書において提供される。
50種類の異なる紙を分析した後、部分的に、粘着性の裏張りを有する特定の紙を使用して得られた結果は、試験した他の種類の紙と比べて、湿った際にしわになることがないためにより矛盾がなかったので、粘着性の裏張りを有する特定の種類を選択した。重度の子癇前症(sPE)を有する妊娠女性由来(図1、「試料」、症例1)、子癇前症を有する妊娠女性由来(図1、「試料」、症例2)、および子癇前症を有さない妊娠女性由来(図1、「試料」、症例3、対照)の尿試料を、最初にコンゴーレッドと混合して通常の紙に適用した。対照としてコンゴーレッドと混合した水を使用した(図1、「ブランク」、症例1〜3)。水の試料(図1、「ブランク」、症例3)および非子癇前症対照試料(図1、「試料」、症例3)において、コンゴーレッドは適用点の周囲で密に中心に集まったままであったが、透明な液体がゆっくり外側に広がった。子癇前症を有する女性由来の試料(図1、「試料」、症例2)において、コンゴーレッドは透明な液体に沿って広がり、中心の可視的な適用点を取り囲むピンク色の拡大した円光を生じた(図1、「試料」、症例2)。重度の子癇前症を有する女性由来の試料(例えば「高度に陽性」の試料)(図1、「試料、症例1)において、コンゴーレッドおよび試料は最初の試料適用スポットを超えて広がる均一な強度のピンク色の拡大されたスポットを形成した。実験(n=78)において、コンゴーレッドと3レベル視覚的スコア(P<0.001)の間に重大な相関が示された。この例の結果は、通常の紙との相互作用に関して、コンゴーレッド処理子癇前症尿と、コンゴーレッド処理非子癇前症尿の間の化学的性質において著しい差を示した。
子癇前症を有さない妊娠女性由来の尿試料のほとんどは、通常の紙などのセルロース性表面に適用した場合、乾燥して透明(またはほとんど透明)になるので、かかる表面上で試料がどのくらい遠くまで広がったかは測定されない。この問題に取り組むために、赤色および青色色素を使用する二重色素混合物を有するコンゴーレッドドット定量キットを設計した。RGB(赤緑青)カラー空間において、コンゴーレッドの色と相補的なものとして青色を選択した。RGBカラーモデルは、ヒトの目および脳の生理学に関連し、比色的に規定された色には関連しない。これは、携帯電話(例えばスマートフォン)のカメラの典型的な出力でもある。試験したいくつかの青色色素の中で、エリオグラウシン(FD&C blue 1、非毒性色素、McCormick & Co.)を、画像解析によるコンゴーレッドの広がり/遅延の定量化のために選択し、子癇前症の症例と非子癇前症の症例を区別した。青色色素は、最大広がり領域を示す水相と共に移動する(例えば図2、「正常」、上列参照)。二重色素の最適組成は、5%コンゴーレッド:10%エリオグラウシンの2:1混合であることを決定し、100μl体積の尿当たり3μlの二重色素混合物を添加した。
重度の子癇前症(sPE)を有する女性はアミロイド様凝集体のスペクトル特徴を有する尿コンゴーレッド好性を示す
実行性および変動性の相を含んだ厳密な試験設計を使用した(図5)。原理の最初のプルーフ(実行性)として、正確な臨床的分類および公知の結果を有する妊娠女性(n=80)由来の尿試料を試験した:40名の重度の子癇前症(sPE)女性は、医学的に適応された子癇前症のための分娩(MIDPE)を必要とし、40名の合併症を伴わない妊娠を有する健常妊娠対照(P-CRL)女性は出産予定日に分娩した。それらの臨床的な特徴を表1に含める。
妊娠の際の尿コンゴーレッド好性の臨床的な有意さをさらに理解するために、さらに582名の女性由来の尿試料を試験したが、この時間は登録カテゴリーに関して選択されたものではなかった(図5、変動性相)。横断面的(cross-sectional)(n=526)および長さ的(longitudinal)(n=56)コホートを設計した。横断面的コホート中の女性は、単一の尿試料に関係した。結果は、試料回収および妊娠結果(MIDPEまたはその他)における臨床的分類に基づいてグループ分けして分析した。横断面コホートに含まれる女性の臨床的特徴を表2に示す。長さ的コホートの女性は、試験開始の時点ではPEについて無症候性であり、妊娠を通して長さ方向に続いた。
妊娠結果を知っている検証コホート(追跡を消失していない横断面的コホート被験体:n=508 + 追跡を消失していない長さ的コホート被験体:n=55)に含まれる妊娠女性由来の登録尿試料(n=563)のROC分析により、CRR単独(≧15%のカットオフ)は、MIDPEを必要とするPEの予測において、85.9%の感度[95%CI: 81.1-89.9]、85.0%の特異性[95%CI: 80.4-88.8]、5.7の陽性尤度比(LR)[95%CI: 4.4-7.5]および0.17の陰性LR[95%CI: 0.1-0.2]を有することが決定された(表3)。
以前に検証された3つの4要素からなる構造である抗体を、公知のアミロイド原性(amyloidgenic)タンパク質の相互に排他的なエピトープを同定するために使用した。A11ポリクローナル抗体は、βバレルおよびβシリンドリン(cylindrin)を含む逆行性βシート構造であると思われる細胞傷害性前線維状オリゴマー(PFO)上の一般的な配列独立型立体構造エピトープを検出する。αAPFポリクローナル抗体は、βバレルであるように思われかつより成熟しており一般的なPFOよりも細胞傷害性が低い管状プロト原線維(APF)立体構造上の一般的な配列独立型エピトープを認識する。OC抗体は、成熟原線維および可溶性線維状オリゴマーの平行性登録(in-register)原線維立体構造を検出する。P-CRL(n=57)、crHTN(n=16)、mPE(n=33)およびsPE(n=128)の女性由来の234連続尿検体の部分集合に対してタンパク質標準化ドットブロットを行った。P-CRLおよびcrHTN女性と比較して、sPEにおいてより高いA11免疫反応性が見られた(P<0.001、図8A)。P-CRLおよびcrHTNと比較して、sPEおよびmPEの女性の両方は、登録時にαAPFについて有意に上昇した尿免疫反応性を有した(図8B)。図8Cに示すように、A11およびαAPF免疫反応性において有意な不均一性が見られ、いくつかの検体は両方の抗体に対して同等に反応し(S3)、他のものは一方に優先的に反応した(S2)。これらの結果は、APF形成の前駆体としてのPFOの役割を示唆する、最近の結果に照らして説明され得る。OC抗体では有意な反応性は見られなかった。集合的に、これらの結果は、PEを有する女性の尿において、線維状オリゴマーまたは成熟原線維ではなくPFOおよびAPFの存在を示した。しかしながら、尿コンゴーレッド好性を有する全てのsPE女性が検出可能なAPFまたはPFO免疫反応性を示したわけではなかった。図8Dは、本発明者らの分析に含まれるそれぞれの尿検体についてのコンゴーレッド好性レベルに沿ったA11およびαAPF免疫反応性の3Dプロットを示す。ほとんどの非MIDPE試料(n=73、緑色の円)は一緒に集中してグラフの原点に近づいたが、MIDPE検体(n=161、赤色の正方形)は3つの軸に沿って実質的に散らばり、尿PFO、APFおよびコンゴーレッド好性の間の大きな不均一性を示した。MIDPE群において、CRRは、APF免疫反応性(r=0.128、P=0.106)ではなく、PFOと有意に相関した(r=0.268、P<0.001)。顕著なことに、尿PFO免疫反応性を有さない女性と比較すると、陽性であると試験された患者は、有意に高い心収縮期(P=0.002)および心拡張期(P=0.020)の血圧、ならびに高血圧症候群のより重度な臨床的症状発現(P<0.001)を有した。全ての分析は、GAおよび総蛋白尿についての補正後、有意なままであった(尿P/C比)。
尿試料のCR補助沈殿のためのプロトコルを開発して、PEのコンゴーレッド好性をさらに特徴付けた。局所顕微鏡法によりsPE沈殿物を視覚化した際に(図9A)、緑色の複屈折性の丸いかまたは細長い粒子(挿入図を参照)が観察された。透過電子顕微鏡(TEM、図9B、9C)では、まるい構造の大きさは30〜300nmで変化し、線維状の立体構造は、より大きく電気的に緻密な(electrodense)新規の構造中で、より長く、樹枝状でかつ一緒になってもつれていた。これらの構造は、並行して処理および画像化したP-CRL検体中には存在しなかった(図9D)。陰性染色TEM(図9E、9F)により、直径約50〜60nmの滑らかな丸い末端を有する細長いフィラメントとして単一原線維が示された(アステリスク)。より厚い直径以外は、sPE尿由来のコンゴーレッド好性沈殿物のこの全体的な顕微鏡的な外観は、CRにより染色されたアミロイド積載組織から抽出された原線維について従来から報告されるものに似ていた。
用語「異常折り畳み体(misfoldome)」は、異常折り畳みタンパク質の任意の回収物を記載する。UPSスコアの識別バイオマーカーは、SERPINA1およびアルブミンの非ランダム切断断片を示す。SERPINA1の凝集する性質およびPEにおけるタンパク質の異常折り畳みに基づいて、次の工程は、尿コンゴーレッド好性物質中のSERPINA1およびアルブミンの痕跡(footprint)を調べることであった。図9G(左パネル)は、2つのsPE尿試料の代表的なSERPINA1ウエスタンブロット(レーンU1〜U2)およびそれらの対応するCR沈殿物(レーンP1〜P2)を示す。示されるように、CRペレットは、完全な前駆体(約57kDa、黒色矢印)上のSERPINA1断片の占有を示すはしご状パターンを有するSERPINA1免疫反応性において顕著に富化されていた。同じ試料の非特異的クーマシー染色(図9G、右パネル)は、CR補助沈殿のプロセスにより、バンド形成パターンが変化することを示し、sPE尿中のいくつかのペプチドのみがCR親和性を有し、SERPINA1断片がこのファミリーの一部であることが示唆される。図9H(左パネル)は、CR補助沈殿の前(U1)および後(P1)のsPE尿試料を示すアルブミンについての代表的なウエスタンブロットである。示されるように、完全なアルブミン前駆体(約66kDa、黒色の矢印)および高分子量凝集物は、アルブミン断片に対して優勢であるように思われた。還元後にゲル中を自由に移動するCR色素の位置を赤い矢印で記す。これらの実験により、sPE尿由来のCR沈殿物は、不均一であるがランダムではないように思われるタンパク質成分を含むことが確認された。該タンパク質成分を、抗アルブミン(図9I)および抗SERPINA1(図9J)抗体を用いたTEM免疫標識でさらに検証した。二重免疫TEMで観察されたパターンは、CR沈殿物中SERPINA1がアルブミンと共に存在することを示し、不均一な共凝集の考えを支持するものであった。
線維状アミロイドタンパク質は、トリプシンによるタンパク質分解に抵抗性である。このことは、本発明者らに、トリプシン切断ペプチドのフィンガープリントに頼るプロテオミクスアプローチでは、尿コンゴーレッド好性物質中の重要なタンパク質同定物が消失し得るという可能性を考えさせた。1つの候補はAPPであった。APPの細胞性プロセッシングは、アルツハイマー病に関連するよく知られた病態生理学的現象である。
胎盤はPEの病態生理学の中心である。APPの細胞性プロセッシングは酵素切断の良く特徴付けられた配列であるので、本発明者らは、総APPおよび原型APPプロセッシング酵素:α-セクレターゼ(ADAM10、ADAM17)、β-セクレターゼ(BACE1、BACE2)およびγ-セクレターゼ(PSEN1、PSEN2)の胎盤mRNA発現を調べた。定量的リアルタイムRT-PCRにより、本発明者らは、ヒト胎盤が、APP、ならびにα、βおよびγ-セクレターゼのmRNAを発現し、APP、ADAM10、ADAM17、BACE2、PSEN1およびPSEN2について、出産予定日に対して出産予定日前(preterm)に、より高い発現を有することを測定した(図11A、11B)。α-セクレターゼADAM10の相対的な豊富さは、出産予定日前(P=0.001)および出産予定日(P=0.009)の両方でADAM17の豊富さよりも有意に高かった。β-セクレターゼBACE1についての増幅シグナルのみが、出産予定日前および出産予定日の両方の胎盤において弱く検出された。これは、特に出産予定日前の胎盤で有意に高いレベルで発現されたBACE2とは対照的であった(出産予定日に対してP<0.00)。α-およびβ-セクレターゼと比較して、γ-セクレターゼは、全体的に低いmRNAレベルを有した。PSEN1のmRNAは、出産予定日前のPSEN2と比較して有意に高かったが(P<0.001)、両方のγ-セクレターゼが低いレベルで発現される出産予定日の胎盤(P=0.209)では高くなかった。ADAM10(P<0.001)およびBACE2(P<0.001)の絨毛栄養膜mRNAレベルは、特発性の早産(iPTB)を有する女性のGA-適合胎盤組織と比較して、sPEにおいて有意に高かった(図11C)。同じ群の間の比較により、sPEにおけるBACE1 mRNAレベルの低下が示された(P=0.021、図11C)。ADAM17、PSEN1、PSEN2またはAPPについてはmRNA発現の有意な変化は見られなかった(全てについてP>0.05)。
iPTB胎盤の基底板および絨毛膜絨毛において強い22C11(N末端)APP免疫反応性が確認された(図12A)。脱落膜細胞は、外絨毛(extravillous)栄養膜よりも強く染色され、胎盤絨毛においては内皮細胞および細胞栄養膜が、ストロマの周囲と比較して、より顕著に染色された(図12A、挿入図)。sPEおよびiPTBの胎盤の間で、22C11染色パターンの顕著な違いが見られた。sPEにおいて、脱落膜細胞は、iPTBと比較してほぼ同じ強度で陽性に染色されたが、22C11脱落細胞膜の分布は、より散らばっており、ゆがんだ形態を有した(図12B)。母性絨毛間空間において無細胞線維状凝集物の強い染色が観察され、sPE切片上の数が有意に増加した、図12B挿入図、矢じり)。
iPTB胎盤と比較して、sPE胎盤は、より多くのADAM10(P=0.017、図12I、12J)およびBACE2(P=0.007、図12K、12L)を発現した。sPEにおいて、絨毛ADAM10免疫反応性は、主に栄養膜細胞層(図8J)に局在し、β-セクレターゼBACE2は、絨毛栄養膜細胞層、合胞体層および絨毛ストロマ細胞を含む胎盤細胞集団の間でより偏在的に発現された(図8L)。ヒト胎盤は、BACE1について陽性の免疫染色を示すことが見出された。iPTB胎盤脱落膜細胞および栄養膜細胞層は、ほとんどが陽性染色を示した(図8M)。絨毛の縁の周りにあるような合胞体層における顕著なBACE1の存在を有するsPE絨毛において、BACE1発現パターンの変化が観察された(図8N)。注目すべきことに、sPE胎盤は、BACE1染色強度の領域的な違いを示した(図18A〜18J)。胎盤梗塞の近位の領域は、最も著しい合胞体層染色を有することが観察された。γ-セクレターゼPSEN1に関して、iPTB胎盤は、絨毛栄養膜または合胞体層において事実上染色がなかった(図12O、挿入図)。逆に、sPE合胞体層は、顕著なPSEN1染色を示し(P=0.038、図12P、挿入図)、これはBACE1と一緒になってアミロイド原性経路を介したAPPプロセッシングに関与する2つの重要な酵素を示す。
妊娠女性は、2004年3月から2010年12月まで、Yale-New Haven Hospital (New Haven, CT)で登録した。妊娠していない蛋白尿の女性は、Fletcher Allen Health Care Hospital (Burlington, VT)で登録した。研究プロトコルは、Yale UniversityおよびUniversity of Vermont Human Research Protection Programの両方に承認された。
PEは、異なる病因および種々のリスク因子を有する不均一な臨床的症状発現により特徴付けられる症候群である。妊娠中のPEおよび高血圧障害の定義はしばしば自由裁量である。種々の定義の妥当性を支持するデータがない場合、PEの診断は人が考え得るほどに容易ではない。特にPEまたはPEの種々の模倣を有する女性において、不都合な妊娠結果のリスクを有する患者の同定には大きな困難がある。結果的に、疾患の経過および医師の両方により異なり得る臨床的な診断カテゴリーに加えて、真の疾患の良好な反映として、介入に基づいた目標に近いが不十分な(near-miss)事象、MIDPEが選択された。このアプローチは、本発明者らの以前の尿プロテオミクス発見試験の間に成功裡に適用された。簡潔に、これは、MIDPEについての適応は臨床チームに属するものであり、全ての他の治療戦略が失敗した場合にその結果が最終となる最後の管理手段であり、取り消すことができないために被験体を偏らせることが少ないためであった。PEを有する患者(妊娠している人 対 出産した人)の臨床管理は診断時の在胎齢(GA)に基づいて変化し得るので、結果は出産時のGAに従って分析された。34週未満、34〜366/7週および37週より長いGAカットオフを使用した。MIDPEまたは上記のGA分布に基づいた他の原因について出産した患者の数を、横断面的(cross-sectional)コホートおよび長さ的(longitudinal)コホートの両方について図5ならびに表1および2に示す。
尿試料を回収した。簡潔に、「ストレートキャッチ」または「クリーンキャッチ」滅菌技術を使用して滅菌容器の標準的な使用によりランダムな尿試料(5〜10mL)を回収した。sPE女性は、尿出力の正確なモニタリングを可能にするために設置されたフォーリーカテーテルを有した。出産予定日前のPE女性の70%は、発作予防剤(硫酸マグネシウム)およびステロイドの前に登録された。長さ的コホートに登録された女性は、時間連続的な様式で連続の試料を提供した。尿回収の際に、横断面的コホート由来の女性(n=141)の部分集団において、静脈穿刺により血液試料を採取した。血液を凝固させた。血清および尿試料を4℃で20分間、3,000gで遠心して、分析したかまたはアリコート中-80℃で保管した。sPEを有する女性(n=8、GA:31±1週;成長パーセンテージ(growth percentile):24±7%)から、出産の直後に胎盤組織を回収した。GA適合自発性特発性早産(n=8、羊水穿刺による羊膜内感染がないことに基づく診断、組織学的絨毛羊膜炎なし、GA:31±1週;成長パーセンテージ:31%±7%)および分娩なしで出産予定日に予定された帝王切開により出産した健常な女性(n=5、GA:39±1週、成長パーセンテージ:36±10%)を対照として使用した。組織は液体窒素中で凍結したかまたはホルマリン中で固定した。
尿コンゴーレッド好性についての評価は、クロイツフェルト-ヤーコプ(プリオン)病にかかった患者の尿におけるこの性質を調べたHalimiらによるプロトコルに基づいてなされた。このプロトコルを、最終的な結果がCRD試験である膜アレイ形式におけるPE尿のために最適化した。技術的な詳細を以下に示す。簡潔に100μlの尿上清を、2μlの5mg/mL CRの溶液と混合した。1時間後、5μlの上清を、ニトロセルロース膜上に二重にスポットして、風乾させた。膜を連続的に水、次いで増加濃度のメタノールで洗浄した。洗浄後、遊離CR(MW約700g/mol)を除去しながら、CR染色凝集物を膜中に保持した。PE女性の尿試料はタンパク質濃度において広範な変動性を有するので、試験の最初部分で総タンパク質/CR比の標準化を行った。試験アウトプットは、%CR保持(Retention)[(CRR)、添加した色素の量に対する洗浄後に残った色素を測定]および%CR取り込み(Incorporation)[(CRI)、それぞれに試料に添加した色素を測定し、内部対照とした]と表示した。
アミロイドへのCRの結合により、可視光における色素吸光度スペクトルの変化が生じ(橙色-赤色からバラ色-マゼンタ)、この深色団シフトは、インビトロにおけるβアミロイドオリゴマー化(凝集)のレベルを評価するために以前に使用されている(22、100)。実行性段階で使用される全てのsPEおよびP-CRL尿試料を、CDR試験と同様に処理した。尿-CR混合物を10倍に希釈し、CR誘導性スペクトルシフトについて分光測光法により調べた(下記参照)。それぞれの尿試料中のアミロイド様タンパク質の理論的濃度は、Klunkの式を使用して、403、504および541nmの吸光度の値から導いた。固有の吸光度および光散乱の標準化は、CRなしの試料中で得られた値を差し引いて行った。スペクトルシフトにより決定されたアミロイド様タンパク質の濃度を、被験体のCRR試験結果と相関させた。
元は血清について記載されたプロトコルの後に、ThT蛍光を測定した。簡潔に、スピンした尿試料(30μl)を、100mMリン酸緩衝化食塩水(PBS)pH7.4中の80μM ThTと混合した。それぞれ、444/485nmの励起/放射波長設定を有する分光蛍光計(Clariostar, BMG Labtech, Cary NC)において蛍光測定値を得た。ThTの非存在下の値を差し引いて固有の尿蛍光についての標準化を行った。
可溶性アミロイドオリゴマーは、細胞傷害性であり、細胞死の有力な誘導体である。いくつかの免疫学的に明確な構造変形物:前線維状オリゴマー(PFO)、線維状オリゴマー(FO)および管状プロト原線維(protofibrils)(APF)が記載される。それぞれPFO、FOおよびAPFを認識する以下の一次抗体、A11、OCおよび抗APFを用いたドットブロット技術を使用した、4群の女性(P-CRL、n=57;crHTN、n=16;mPE、n=33;sPE、n=128)の尿中の可溶性アミロイドオリゴマーの存在(14〜16)。技術的な詳細は補足方法に示す。
異なる臨床カテゴリー(P-CRL、n=13;crHTN、n=5;mPE、n=5;sPE、n=51;spPE、n=9;非PE蛋白尿症状、n=8)中の91名の妊娠女性由来の尿試料を、補足方法に記載されるようにCR補助沈殿のために処理した。CR沈殿は、P-CRL、crHTNまたは非PE蛋白尿被験体(CR沈殿陰性)のいずれかではなく、PE試料の90%において微小遠心チューブ(microfuge)の底で、可視的に同定した。
下記のように、sPE尿(n=5)由来のCR沈殿を、水に再懸濁し、顕微鏡スライド上で乾燥させ、特徴的な緑色CR複屈折のための偏光顕微鏡法により可視化した。代替的に、懸濁は、2%酢酸ウラニルでの陽性または陰性染色後、200メッシュのホルムバール(formvar)/炭素被覆ニッケルグリッド上に配置した。CR沈殿P-CRL女性(n=4)の調製を試みたチューブ由来の検体も試験した。
CR沈殿を、sPEを有する女性(n=4、GA:28±2週)から単離し、還元Laemelliバッファ(BioRad)に再懸濁し、10分間煮沸した。試料を10% SDS-PAGEゲルに充填し、これをクーマシーブルーで染色した。目に見えるバンドを切り出し、トリプシン消化およびタンデム質量分析のために処理した(下記参照)。53より高いMOWSEスコア(matrixscience.com)に基づいて、タンパク質同一性を確立した。SERPINA1、アルブミン、κFLC、セルロプラスミンおよびインターフェロン誘導性タンパク質6-16(G1P3)は、60名の他の症例から単離されたCR沈殿物においてウエスタンブロッティングによる検証のために示され、選択されることが見出された。G1P3の凝集性質は、http://bioinf.uab.es/aggrescan/のウェブサーバー上で走らせたAGGRESCANアルゴリズムを使用して決定した(以下に詳細)。
sPE症例の例示的なコンゴーレッド好性物質(n=38)および尿(n=16)に対してウエスタンブロッティングを使用した。GA適合症例のP-CRL尿(n=8)は参照のために使用した。血清および尿中の可溶性APP(sAPP)の免疫反応性およびADAM-10免疫反応性を、ELISA(下記のプロトコル)により調べた。
APPならびに以下のAPP切断酵素:α-セクレターゼ(ADAM10、ADAM17)、β-セクレターゼ(BACE1、BACE2)およびγ-セクレターゼ[プレセニリン-1(PSEN1)、プレセニリン-2(PSEN2)]についてTaqMan化学(Applied Biosystems)および有効なプライマー/プローブを使用して、胎盤および羊膜絨毛膜mRNAに対してリアルタイムPCRを行った。胎盤絨毛中の染色強度は、0(非存在)〜+5(強い)のスケールで半定量的に評価した。栄養膜およびマクロファージそれぞれの細胞性マーカーとしてサイトケラチン-7およびCD163に対する抗体を使用した。技術的な詳細を以下に示す。
アミロイドの異常な堆積が、原型タンパク質異常折り畳み障害であるアルツハイマーの特徴である。病理学的証拠により、ペプチドAβの原線維がアミロイドの基本的な成分であることが示された。アルツハイマー病を有する患者の脳内の斑に存在することが知られるAβエピトープの検出のためにパラフィン包埋スライドを処理した。2つの良く特徴付けられたモノクローナル(抗ALZ90およびDE2B4)を使用した。アリザリンS染色により、共に堆積するカルシウムを同定した。技術的な詳細を以下に示す。
タンパク質-対-クレアチニン(P:C比)、可溶性fms様チロシンキナーゼ-1(sFlt-1) 対 胎盤成長因子(PlGF)の比(uFP)および尿プロテオミクススコア(UPSbおよびUPSr)などの(使用または提唱される)PE代理マーカーについて全ての尿試料を分析した。技術的な詳細を以下に示す。
(正規分布したデータについて)標準誤差(SEM)を有する平均または(非正規分布したデータについて)四分位数間領域を有する平均としてデータを報告した。データセットは、適切なように、スチューデントt検定、マン-ホイットニー検定、一元配置、二元配置またはクラスカル-ウォリスANOVAを用いて比較した。ピアソンまたはスピアマンの順位相関関数を使用して相関分析を行った。フィッシャーの正確検定またはχ二乗検定により割合を比較した。一緒に、長さ的コホートの最初の試料と共に実行性および横断面的コホートに登録された妊娠女性の尿試料は、登録に関して不偏の女性の連続コホートについて代表的であるので、受信者動作特性曲線(ROC)に適した。MedCalc(Broekstraat, Belgium)統計学的ソフトウェアを使用して、受信者動作特性ROCプロットに対して試験正確性(正確に分類された症例/症例の総数)、感度、特異性、陽性および陰性予測値、および尤度比(LR)を測定した。ブートストラップ法を使用して信頼区間(CI)を計算した。依存型ROC曲線下面積(同じ症例由来)の間の差の統計的な有意さをを決定するためにノンパラメトリック法を使用するDe Long法を使用してROC曲線の比較を行った。
・在胎齢(GA)は、全ての例において、最後の月経期間の日に相関する良く確立された超音波検査基準を用いて確立された。
蛋白尿非存在の妊娠性高血圧、および以下の事項:子癇前症の症状(上胃部の疼痛、重度の頭痛、尿量過少、肺水腫)、溶血、血小板減少(<100,000/mm3)、肝臓酵素の上昇(アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼまたはアラニンアミノトランスフェラーゼについて通常の値の上限の2倍)の1つ以上
妊娠性高血圧非存在の妊娠性蛋白尿、および以下の事項:子癇前症の症状、溶血、血小板減少、肝臓酵素の上昇の1つ以上
の設定において診断された。
・試料調製:尿を4℃で15分、15,000gで遠心した。標準としてアルブミンを用いるPierce BCAキット(Thermo Scientific, Rockford, IL)を使用して総タンパク質/濃度を測定した。全ての尿試料を蒸留水で標準化して、BCAアッセイにおいて6.6mg/mL総タンパク質/濃度を測定した。CRおよびタンパク質/濃度の関数としてBCAアッセイの直線性を調べた以前の実験に基づいてこの値を選択した。実施の関連性のために、BCAアッセイにおいて>6.6mg/mLと測定された試料を水で希釈し、<6.6mg/mLと測定された試料をSpeedVac(Thermo Scientific)中乾燥まで濃縮し、上記の濃度まで水で再懸濁した。
溶液中のCR誘導スペクトルシフトのための分光測光法分析を、Aβ結合について以前に記載されたように実行した。CRD試験について記載されるように尿試料を標準化してCRと混合した。200μlの10倍希釈CR尿混合物を、CRなしの尿の同じ希釈物と共に、96ウェルプレート上に二重で適用した。ブランク試料はCRありおよびなしのPBSであった。SOFTmax Pro 4.0ソフトウェアを備えたSpectramaxプレートリーダー(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)中でプレートを読んだ。測定値は、最初に波長走査モード(300〜700nm)、次いで403nm(等吸収(isobestic)点)、504nm(遊離CRの最大吸光の点)および541nm(遊離およびアミロイド結合CRの間の最大の差の点)での終点読み込みにより取得した。CRなしの同じ尿試料からOD読み込みを引いて、固有の光散乱の補正を行った。それぞれの尿試料中のアミロイド様タンパク質の理論濃度は、Klunkの式および被験体のCRD試験結果と相関した結果を使用して吸光値から導いた。
・尿タンパク質/濃度は、アルブミン標準に対して、ビシンコニン酸/硫酸銅試薬(BCAキット、Pierce、Rockford、IL)を用いて測定した。ほとんどの尿試料に対して12倍希釈力価を使用した。標準曲線より下または上のそれぞれで測定した試料に対して未希釈または50倍希釈試料の反復測定を行った。
可溶性オリゴマーの免疫検出に使用される一次抗体を、本発明のメンバーまたは本発明のチームのメンバーによる以前の公開公報において、開発して特徴付けた。以下の一次ポリクローナル抗体:アミロイド原性タンパク質により形成される特異的な四次構造エピトープを認識するA11、OCおよび抗APFを使用した。
A11は前線維状オリゴマー(PFO)を認識する
OCは成熟原線維を検出する
抗APFは管状プロト原線維(αAPF)と反応する。
準安定ポリペプチド結合についての自己集合特性および親和性を考慮して、CRは、水溶液中のアミロイドオリゴマー成長および凝集を誘導することが知られる。CR結合凝集物が成長するにつれて、該凝集物は溶液外で沈殿し、遠心分離により単離し得る。それらの原理に基づいて、発明者らは、尿試料のCR補助沈殿のためのプロトコルを開発し、PEのコンゴーレッド好性および異常折り畳み体をさらに特徴付けた。10mL体積の尿を最初に15,000gで4℃、15分間遠心した。上清を200μl CRストック溶液と混合し、CRD試験について1時間ボルテックスにかけ、再度遠心分離し、次いでコンゴーレッド好性凝集タンパク質をペレット化した。ペレットを水に再懸濁して、遠心分離により3回再回収して、未結合CRを除去した。最後のCR沈殿を50μlの水に再懸濁し、すぐに画像化したか、またはその後の分析のために-80℃で凍結保存した。ペレットが見られない場合、検体をCR沈殿陰性とみなしたが、CR沈殿陽性試料と同様に微小遠心分離を処理した。
CR沈殿物を水に再懸濁し、顕微鏡スライド上で乾燥させ、Olympus OLY-200デジタルカメラを備えたOlympus U-STP顕微鏡(Olympus, Melville, NY)を使用して、偏光下で画像化した。代替的に、懸濁物を、2%酢酸ウラニルで陽性または陰性染色した後200メッシュホルムバール/炭素被覆ニッケルグリッド上に置いた。CR沈殿P-CRL女性の調製を試みたチューブ由来の検体も試験した。凍結TEMについて、CR沈殿を、0.9%塩化ナトリウムを有する10mM HEPES(pH7.4)中4%パラホルムアルデヒド/0.1%グルタルアルデヒド中で30分間固定してすすぎ、遠心して10%ゼラチンに再懸濁した。次いで試料を、以前記載された微細胞孔と同様に処理した。超薄凍結切片を、ウサギ抗SERPINA1(1:500, LabVision, Freemont, CA)またはヤギ抗ヒトアルブミン(1:500, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX)のいずれかで単一標識し、ウサギ抗ヤギ抗体(1:200, Jackson Immunoresearch)および10nmの金に連結されたプロテインA(Cell Microscopy Center, Utrecht, Netherlands)を使用して架橋した。二重標識グリッドは、一次ヤギ抗アルブミン1:500および5nmのプロテインA-金、次いでウサギ抗SERPINA1および10nmプロテインA-金を使用した。全ての試料は、MoradaデジタルカメラおよびOlympus画像化ソフトウェアを備えたTecnai 12 BioTWIN電子顕微鏡(FEI/Phillips, Hillsboro, Oregon)中で観察した。FEI Tencai Biotwin TEMは80Kvであった。Morada CCDおよびiTEM(Olympus)ソフトウェアを使用して画像を得た。
CR沈殿物を還元Laemelliバッファ(BioRad)に再懸濁し、10分間煮沸した。試料を10% SDS-PAGEに充填し、クーマシーブルーで染色した。可視のバンドを切り出し、Ettan TA Digester (GE Healthcare)でトリプシン消化について処理した。自動化MALDI-MS/MSスペクトルを4800 TOF/TOFプロテオミクス分析器(Applied Biosystems, Foster City, CA)上で取得した。得られたペプチド配列を、ウェブで利用可能なYale Protein Expression Database (YPED http://medicine.yale.edu/keck/proteomics/yped/index.aspx)にアップロードした。>53の確率Mowseスコアは過度の相同性を示すと思われた。以下のタンパク質:SERPINA1、アルブミン、セルロプラスミン、IgG κFLCおよびインターフェロン誘導性タンパク質6-16(IFI6-16、G1P3としても公知)が示されることが見出された。これらの同一性を、他の60の症例の尿から単離した沈殿物中でウエスタンブロットにより検証した。沈殿物をLaemelliバッファで還元し、4〜20% SDS-PAGEゲルで電気泳動し、PVDF膜に転写した。以下の一次抗体:ウサギ抗SERPINA1(1:1,000, LabVision,)、ヤギ抗アルブミン(1:1,000, Bethyl Laboratories)、マウス抗セルロプラスミン(クローン3B11、1:1,000 Thermo Scientific, Rockford, IL)、マウス抗κFLC(クローンMEN09、1:1,000 Novus Biologicals, Littleton, CO)、ウサギ抗G1P3(1:300, Proteintech, Chicago, IL)を使用した。適切なビオチニル化二次抗体(1:5,000、Jackson Immunoresearch)、次いでストレプトアビジン-HRP(1:8,000、GE Healthcare)およびECL化学発光(GE Healthcare)を使用してブロットを検出した。
凝集性質の計算および可視化のためにAGGRESCAN、ウェブベースアルゴリズムを使用して配列を分析した。このアルゴリズムは、いくつかの立体障害に含まれるタンパク質断片の凝集を予測することが示されている。これは種々のクラスのタンパク質をそれらの凝集および可溶化性質による識別することも示されている。天然に折り畳まれたタンパク質は、最も低い凝集性質を有することが予測された。AGGRESCAN出力において、最も高い予測凝集性質を有する配列強度は、プロフィールプロット中ピークとして現れる。1アミノ酸当たりホットスポット閾値(HST)よりも高い平均凝集性質値(a4v)を有する5以上の連続残基がある場合、ポリペプチド配列は「ホットスポット」であるとみなされる。AGGRESCAN パラメーターを表4に列挙する。
尿またはCR沈殿試料をLaemelliバッファで還元して、4〜20% SDS-PAGEゲルで電気泳動し、PVDF膜に転写した。以下:マウスモノクローナル抗APP(1:1,000、MAB348、クローン22C11;APPのN末端エピトープアミノ酸66〜81に対する、Millipore)、マウスモノクローナル抗APP(1:259、MAB5354、APPのKPIドメインに対して生成、Millipore)、マウスモノクローナル抗Alz90(1:250、MAB349、APPのアミノ酸511〜608に対応する合成ペプチドに対して生成、Millipore, Billerica, MA)およびマウスモノクローナルDE2B4(1;1,000、ヒトAβの残基1〜17に対して生成、Littleton, CO)の一次抗体を使用した。異なるブロットをそれぞれの抗体に曝露した(ブロットははがれず(stripped)、再プローブ化しなかった)。ヒトアルブミン(血漿から精製)または稲中で発現したリコンビナント(Sigma)を使用して、抗APP抗体の可能性のある非特異的交差反応性を除外した。アルツハイマーの脳組織溶解物(Novus, Littleton, CO)を陽性対照として使用した。ビオチニル化ヤギ抗マウス二次抗体(1:5,000, Jackson Immunoresearch)、次いでストレプトアビジン-HRP(1:8,000, GE Healthcare)およびECL化学発光(GE Healthcare)を用いてブロットを検出した。
sAPPを、ELISAにより尿中で測定し、血清試料と対にした(sAPP:IBL International, Hamburg, Germany)。適切に希釈した試料(尿2倍、血清50倍)をsAPP(αセクレターゼの分解産物)およびsAPPβ(βセクレターゼの分解産物)の両方に共通のエピトープに対する捕捉抗体で予め被覆した96ウェルプレートに入れた。ADAM10 ELISA(CosmoBio USA, Carlsbad, CA)について、母性の血清を3倍希釈した。製造業者に示されるとおりにインキュベーションおよび洗浄プロトコルを行い、次いで波長を補正して450nmで読み取った。SoftmaxソフトウェアPro 3.1.1(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を使用してデータを報告しプロットした。
RNAを抽出し、標準的な手順を使用して、ランダムヘキサマープライマーを用いてcDNAに逆転写した。10μLマスターミックス(TaqMan(登録商標) Fast Universal PCR 2x Master Mix)、8μLの水、1μLの標準化したcDNA鋳型および1μL PCRプローブセット(TaqMan(登録商標)Gene Expression Assays on Demand)で構成される20μLの反応中TaqMan(Applied Biosystems, Carlsbad, CA)化学を使用してRT-PCRを行った。分析に使用したプローブ(Applied Biosystems)は、以下:アミロイド前駆体タンパク質/プロテアーゼネキシン-II(APP、Hs01552282_m1)、A-ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ-10(ADAM10、Hs00153853_m1)、ADAM17(Hs01041915_m1)、BACE-1(Hs00201573_m1)、BACE-2(Hs00273238_m1)、プレセニリン-1(PSEN1、Hs00240518_m1)およびプレセニリン-2(PSEN2、Hs00240982_m1)であった。β2ミクログロブリン(B2M;Hs99999907_m1)およびリボソームタンパク質L30(RPL30、Hs00265497_m1)を内在性対照として使用した。これら2つの内在性対照mRNA(B2MおよびRPL30)の組合せを、TaqMan(登録商標) Human Endogenous Control Plate (Applied Biosystems)中で増幅したPEまたはCRL組織(胎盤または羊膜)いずれか由来のcDNAのプールを使用して予備実験において検証した。2つの参照遺伝子の選択は、6個のcDNAプール中で異ならない低サイクル閾値(Ct)に基づいた。それぞれの標的について、増幅は、2段階サイクル(変性、95℃、15秒;アニーリング/伸長、62℃、60秒)を40サイクルで、二重の反応で行った。StepOneソフトウェア(v2.1)を使用して処理後の計算を行った。得られた値を、dCt(ΔCt:標的のCt-内在性対照のCt平均)の計算を使用して内在性対照RNAの幾何学平均に対して標準化した。0のdCtは、標的とハウスキーピング遺伝子の間の1の比を示し、異なる標的間および異なる組織間の相対的な豊富さの指標として使用し得る。ddCt(個々の試料のdCt-参照試料中の同じ標的のdCt)の計算は、標的標準化内でさらなる考察を追加し、異なる生物学的グループの間の相対的mRNA豊富さの良好な推定である。ddCt計算について、本発明者らは全ての試料由来のRNAプールを使用した。
胎盤絨毛組織の5μmのパラフィン切片をキシレン中で脱パラフィン化して、段階的エタノール〜カリウムリン酸緩衝化食塩水溶液、pH7.2で再水和した。クエン酸バッファによる抗原回復後、切片を1%過酸化水素で15分前処理し、次いでブロッキングして、以下の一次抗体:マウスモノクローナル抗Alz90(1:250)、マウスモノクローナルDE2B4(1:1,000)、ヤギ抗ADAM10(1:200、R&D Systems, Minneapolis, MN)、ヤギ抗ADAM17(1:50 R&D Systems)、マウスモノクローナル抗BACE1(1:150、MO2、クローン2C13、Abnova, Taipei, Taiwan)、ウサギ抗BACE2(1:200、Novus, Littleton, CO)およびウサギモノクローナル抗PSEN1(1:100、Abcam, Cambridge, MA)およびウサギモノクローナル抗PSEN2(1:100、Abcam)と一晩(4℃)インキュベートした。栄養膜上皮細胞および胎盤マクロファージは、マウスモノクローナル抗サイトケラチン7(1:100、Zymed/Invitrogen, Carlsbad, CA)またはマウスモノクローナル抗CD163 Neomarkers, Fremont CA)抗体のそれぞれ(110, 111)を使用して、以前記載されたように選択切片上で同定した。適切なビオチニル化二次抗体(1:600, Jackson Immunochemicals)を用いて室温で1時間のインキュベーション後、色素原としてVector NovaRed(Vector Laboratories)および対比染色としてヘマトキシリンを用いて、アビジン-ビオチン染色(Vectastain Elite ABC, Vector Laboratories, Burlingame, CA)を使用して検出を行った。組織切片は、段階エタノール中で脱水して、透明化し、封入した。適切に、陰性対照スライドを、ウサギまたはマウスアイソタイプIgGとインキュベーションした。
試験設計および検体
CDR試験について2つのパートがある。「湿潤パート(wet part)」は、尿-コンゴーレッド混合物の調製、ニトロセルロースシート上のドットとしての混合物のスポット(CRDシートアレイ)、次いでスマートフォンによる2枚の写真の撮影および保存(Pix1:シートを洗浄する前に撮影およびPix2:疎水性洗浄後に撮影)を含む。「乾燥パート(dry part)」は、2つの画像の処理、次いでそれぞれのドットについて個々に、およびブランク試料(BLK、ヒト尿の代わりにリン酸緩衝食塩水[PBS])からコンゴーレッド保持(CRR)結果を引いた後のアレイ上の二重のドットの平均としてそれぞれの被験体についてのCRD試験結果[%コンゴーレッド保持(CRR)]の計算を含む。この試験は3段階で行い、それぞれでCRD試験の「湿潤パート」および「乾燥パート」の両方を相乗的に簡易化、高速化および向上することに努めた。
段階1のデータセットは、以前に取得された画像(洗浄の前および後、Nikon Coolpix 4500)に由来し、最初の試験の一部として手動で定量化された。このデータセットは、合計218名の被験体由来の18のアレイからなった。それぞれのアレイは、12〜15名の被験体由来の二重のスポットを維持した(図20A)。バックグラウンドシートに対する赤色ドットの顕著さにおける目的に基づいて、色素の色を理論的に増強し、赤色チャネルピクセル値を緑色チャネルで割り(比R/G、RおよびGは0〜255の範囲である)、バックグラウンドの色を低減することにより赤色の情報を増強する2つの可能性のあるアルゴリズムを試験した。同じ理由で、第2の計算は、緑色チャネルを引いた赤色チャネルの情報(R-Gの差)を使用した。緑色に対するヒトの視覚系の強調された感度に適合させるために、青色よりも緑色に対して高感度なデジタルカメラセンサーを作製するBayerパターンのために、青色チャネルに対して緑色チャネルを選択した。最後に、輝度変換等式を使用して、色情報自体を排除しながら色の強度を維持した(図20B)。輝度(L)アルゴリズムは、手動の処理ルーチンにより使用されたものと似ていた。本発明者らの出願のコマンドラインインターフェイス(Linux Ubuntuオペレーティングシステムを有するThinkPad T500上で走らせる処理ライブラリのコマンドラインバージョン)により実行された擬似計算により、R/G(図20C)およびL(図20D)の計算が、R-Gと比較して手動で誘導されたCRR(両方の比較についてz試験 P<0.001)と有意に良好に相関したCRR値に戻ったことが決定された(図20E)。比較正確性分析において(図20F)、手動で導かれたCRR[AUC=0.966; 95%CI [0.932-0.985])と、L返還を使用して自動で計算されたCRR(0.962 [0.927-0.983], P=0.579)との受信者動作曲線下面積(AUG)の間に差はなかった。しかしながら、手動の統合と比較して、CRRをR/Gとして計算した場合(0.962 [0.927-0.983], P=0.042)、AUCにおいて統計的に有意に異なる小さな低下が見られた。本発明者らは、この差は、L変換よりも有意にR/G比に影響を及ぼす選択された尿検体により発揮された(赤から紫への)微細な深色団シフトのためであると考えた。グレースケール画像に必要な一般的なより短い処理時間に加えて、このことは、その後の方法開発のために、本発明者らにLベースのアルゴリズムを選択させた。
完全に自動化されたルーチンについて、シートの自動検出および取得された画像上のドットの一致する位置は、段階1の際の必要性と同様に現れた。また、シートの寸法および方向が既知である必要があった。これを達成するために、CRDアレイのレイアウトを標準化して再訪した(revisited)。Pix1およびPix2を取得した様式も、以下のように標準化して再訪した:i)ニトロセルロースシートを、iPhoneの画面のサイズに比例する幅4.5インチ x 長さ6インチの標準的な大きさに切断する;ii)正方形のシートの四隅のうちの3箇所に、手で握るクラフト紙パンチを使用して穴を開ける;iii)鋳型に位置する試料(図21)を通常の紙のシート上にプリントし、次いでこれをプラスチック製シート保護器の中でニトロセルロースシートの下に置いた。鋳型を一定の大きさにするための現実(true)は、図24に示されるようにプリントアウトに含まれた。41名の被験体まで試料の位置を鋳型に記す(それぞれの検体は、2つのカラムの隣接細胞中で二重にスポットされる)。それぞれの細胞中の黒い中心点は、透明なものを通して可視であり、シート上の予測されるドットの位置決定を確実にするために試料の配置のためのガイドとして機能する。ブランク(BLKまたはPBS)に対応する試料のドットは、第1の左側の隅に配置される;iv)Pix1およびPix2画像の両方の取得は、黒い表面上に配置されたアレイシートにより行い、これにより、洗浄中にしみ出し得るインクまたはシートのコストを上げ得る他のマーカーを使用する必要なく、パンチで開けられた穴が、位置マーカーとして機能する。CRD試験アレイのこの標準化された形式は、QUICK RESPONSE(登録商標)(QR)コードの要素を取り入れ、つまりシートは既知の縦横比を有し、4つの隅のうちの3つが強調される。左上の隅の3つのマーカーの検出により、Pix2中のそれ自体と対応するPix1中のそれぞれ個々のドット(または色素が洗い流された位置)の回転、補正(de-skewing)および完全な重ね合わせが可能になる。この最後の特徴は、Pix1およびPix2を取得するために使用される同じスマートフォン(この場合iPhone 4)上のアプリケーションとして機能するようにカスタマイズされた画像処理シークエンスにより達成される。
該シークエンスは、7つの画像処理工程を、以下のようにつなげる:i)CRD試験の湿潤パートの画像部分の取得;ii)シート検出;iii)シート抽出;iv)細胞抽出;v)ドット検出;vi)ドット抽出およびvii)CRR計算。該処理ワークフローを図21に模式的に示す。
段階2において、iPhone 4および上述のシークエンスを走らせるアプリケーションで画像を取得して処理した。反復性について、取得のためにiPhoneカメラを使用したが、画像をコンピュータに移し、iPhoneシミュレーター中で処理を実施した。328の異なる尿検体を含む8個のCRDアレイを、段階2の一部として分析した。これらのアレイは、この試験に特異的に、-80℃で維持されたアリコートから調製した。検体は273名の異なる女性に由来した(妊娠後期に55個の検体を続けて回収)。全ての検体は、検体回収および保存に関して連続する。検体において、分析した段階1の一部のものと重複はなかった。段階2のデータセットにおける目的の結果の有病率(MIDPE)は、検体間(118/328)および被験体間(108/273)で40%であった。
処理時間を図示するiPhone appのスクリーンワークフローによるスクリーンが図23に含まれる(示される例において写真Pix1およびPix2は以前に取得され、スマートフォンの写真ライブラリに保存されていた)。本発明者らの画像処理ツールを利用することで、CRD試験アレイの「湿潤パート」の結論から結果までの時間は、スマートフォンを用いて約2分の処理時間に低減された。
本発明者らのアルゴリズムを実証し、本発明者らの試験の段階3における画像化プロトコルのエラー強さをさらに向上させるために、6個の標準化されたCRDアレイのさらなるデータセットを取得した。訓練を受けておらず、画像を取得するためまたは不均一な照度およびシェーディングを回避するためにスマートフォンをどのように設置するか(カメラの角度)についての指示も受けていない職員により実験を行った。このデータセットは、オペレーターにより誘導されるエラーの可能性のある原因を評価することを補助した。これらの取り扱いの問題を、一続きの画像処理およびアップデートされたバージョンで実施される補正における結果と共に表5に要約する。もっともしばしば観察される取扱いエラーは、Pix1およびPix2を取得した過剰な遠近法であった。問題の大部分は、問題を回避するためにどのように画像を再度取得するかの指示をユーザーにフィードバックすることで修正された。本発明者らの一連の画像化のエラー強さは、Pix1およびPix2上で許容される不均一な照度のレベルに限界を設定することによりさらに向上された。ユーザーは、シェーディングが変数の許容レベルを超えた場合(変数の係数>15%)、インターフェースを介して写真を撮り直すおよび光源から遠ざけることを思いついた。
以前に検証された2つの省略バージョンを有するCRD試験の「湿潤パート」を比較して、段階3の一部として、94尿試料の連続セットに対してさらなるアレイを実施した:一方は尿タンパク質標準化を省略し、他方はタンパク質標準化およびコンゴーレッドとの1時間の撹拌の両方を省略した。尿標準化および撹拌(コンゴーレッドと混合された試料はすぐにシート上に配置された)の両方を省略することにより、本来のプロトコルで許容可能な一致(Linのρ=0.914 [0.873-0.942])が生じた。多変量線形回帰において、偏りの程度は、CRRレベルのみで決定され、シート上の位置、オペレーターの熟練度または尿タンパク質濃度によっては決定されなかった。精度(accuracy)(Cb=0.997)は正確性(precision)(ピアソンのρ=0.916)を超え、数はわずかに変化し得るが、標準化を省略することで疾患分類に大きく影響を及ぼすことはないということが示唆された。メタノール洗浄を手順および廃棄がより簡単な代替法で置き換えるための他の実験を行った。試行錯誤により、本発明者らは、医薬等級イソプロパノール(90%)がメタノールよりも効果的であり、洗浄時間(ブランクの脱色の完了までを測定)が7分まで短縮されることを決定した。医薬等級エタノール(70%)は、メタノールの代用としては適さなかった。変性剤(すなわちアセトン、米国において添加、飲料不可)は、ニトロセルロースシートの孔径に影響を及ぼし、陽性試料に対して許容できないシグナルの消失を生じた。
他に特定されなければ、MedCalcソフトウェア(v 12.5 Ostend, Belgium)を統計学的補助として使用した。ピアソンの生成物モーメント相関関数を使用して相関を試験して、一方でLinの一致係数および合意のMcBride図形描写スケーリングを使用して同意を決定した。TOST/XLSTAT add-ins手順を使用して、Microsoft Excelにおいて同等性/非劣性試験を行った。多変数段階的線形回帰を使用して、偏りの程度(手動方法を使用して得られた結果と湿潤プロトコルにおける工程の系統的排除の後の結果の差)に対する複数の変数の影響を決定した。該モデルにおいて、P<0.05の場合に変数を入力し、P>0.1の場合に変数を除去した。全ての手順について、統計的な有意さを示すためにP<0.05を使用した。
本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
[1]妊娠女性由来の尿試料が異常折り畳みタンパク質(misfolded protein)を含むかまたは含まないことを決定する方法であって、
(a) 妊娠女性由来の尿試料と、異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する色素を合わせて、それにより尿および色素の溶液を生成する工程;
(b) 色素が異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する条件下で、該溶液を、セルロースを含む表面に適用し、それにより該表面上にスポットを生成する工程;
(c) 異常折り畳みタンパク質および色素を含む尿の溶液の拡散が起こる条件下で、該表面上のスポットを維持する工程;ならびに
(d) 色素が該表面上のスポットから目に見える程度に放射状に拡散する場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むことを決定するか、または色素が該表面上のスポットから目に見える程度に放射状に拡散しない場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないことを決定する工程
を含む、方法。
[2]該色素がコンゴーレッドである、[1]記載の方法。
[3]該溶液中の色素の濃度が0.05%〜0.2%である、[1]または[2]記載の方法。
[4]該溶液中の色素の濃度が0.1%である、[3]記載の方法。
[5]セルロースを含む該表面が紙表面である、[1]〜[4]いずれか記載の方法。
[6]セルロースを含む該表面が、粘着性の裏張りをさらに含む、[1]〜[5]いずれか記載の方法。
[7]該尿および色素の溶液が、該表面上のスポットから放射状に拡散する程度と陽性対照を比較する工程、ならびに該尿および色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度が、陽性対照と同等である場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むことを決定する工程をさらに含む、[1]〜[6]いずれか記載の方法。
[8]該尿および色素の溶液が、該表面上のスポットから放射状に拡散する程度と陰性対照を比較する工程、ならびに該尿および色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度が、陰性対照と同等である場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないことを決定する工程をさらに含む、[1]〜[7]いずれか記載の方法。
[9](e) 妊娠女性由来のさらなる尿試料を希釈して、希釈尿試料を生成する工程;
(f) 該希釈尿試料と、異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する色素を合わせて、尿および色素の溶液を生成する工程;
(g) 工程(f)の溶液を、該色素が異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する条件下で、セルロースを含む表面に適用して、表面上のスポットを生成する工程;
(h) 異常折り畳みタンパク質および色素を含む尿の溶液の拡散が起こる条件下で、工程(g)の表面上のスポットを維持する工程;ならびに
(i) 該色素が工程(h)の表面上のスポットから放射状に拡散する場合、該希釈尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むことを決定するか、または該色素が工程(h)の表面上のスポットから放射状に拡散しない場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないことを決定する工程
をさらに含む、[1]〜[8]いずれか記載の方法。
[10]該さらなる尿試料が5倍〜15倍に希釈される、[9]記載の方法。
[11]該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含む場合に妊娠女性が子癇前症を有するかまたは子癇前症を発症する可能性があると診断する工程をさらに含む、[1]〜[10]いずれか記載の方法。
[12]妊娠女性由来の尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定するためのキットであって、
(a) 異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する色素;
(b) セルロースを含む表面;ならびに
(c) 塗布器
を含む、キット。
[13]該色素がコンゴーレッドである、[12]記載のキット。
[14]セルロースを含む該表面が紙表面である、[12]または[13]記載のキット。
[15]セルロースを含む該表面が、粘着性の裏張りをさらに含む、[12]〜[14]いずれか記載のキット。
[16]セルロースを含む該表面が、さらなる表面に固定される、[15]記載のキット。
[17]該色素が水溶液である、[12]〜[16]いずれか記載のキット。
[18]該水溶液中の色素の濃度が0.2%〜1.0%である、[17]記載のキット。
[19]該水溶液中の色素の濃度が0.5%である、[18]記載のキット。
[20]該水溶液の体積が1μl〜10μlである、[18]または[19]記載のキット。
[21]該水溶液の体積が5μlである、[19]記載のキット。
[22]該塗布器に色素が予め充填される、[12]〜[21]いずれか記載のキット。
[23]該塗布器がピペットである、[12]〜[22]いずれか記載のキット。
[24]該ピペットが使い捨てピペットである、[23]記載のキット。
[25]陽性対照をさらに含む、[12]〜[24]いずれか記載のキット。
[26]陰性試料をさらに含む、[12]〜[25]いずれか記載のキット。
[27]妊娠女性由来の尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定する方法であって、
(a) 妊娠女性由来の尿試料と、異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する第1の色素、ならびに第1の色素とは色が異なりかつ異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合しない第2の色素を合わせて、尿および2つの色素の溶液を生成する工程;
(b) 該溶液を、第1の色素が異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する条件下で、セルロースを含む表面に適用して、表面上のスポットを生成する工程;
(c) 異常折り畳みタンパク質および色素を含む尿の溶液の拡散が起こる条件下で、該表面上のスポットを維持する工程;ならびに
(d) 第1の色素および第2の色素が該表面上のスポットから目に見える程度に放射状に拡散する場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むことを決定するか、または第1の色素ではなく第2の色素が該表面上のスポットから目に見える程度に放射状に拡散する場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないことを決定する工程
を含む、方法。
[28]尿および2つの色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度と陽性対照を比較する工程、ならびに尿および2つの色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度が陽性対照と同等である場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むことを決定する工程をさらに含む、[27]記載の方法。
[29]尿および2つの色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度と陰性対照を比較する工程、ならびに尿および2つの色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度が陰性対照と同等である場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないことを決定する工程をさらに含む、[27]または[28]記載の方法。
[30]該表面上のスポットの画像を取得する工程をさらに含む、[27]〜[29]いずれか記載の方法。
[31]該画像が、携帯電話を使用して取得される、[30]記載の方法。
[32]該表面上のスポットから第1の色素が放射状に拡散する程度と該表面上のスポットから第2の色素が放射状に拡散する程度の間の差を定量する工程をさらに含む、[27]〜[31]いずれか記載の方法。
[33]該表面上のスポットから第1の色素が放射状に拡散する程度と該表面上のスポットから第2の色素が放射状に拡散する程度の間の相関係数を計算する工程をさらに含む、[32]記載の方法。
[34]アルゴリズムを使用して該相関係数を計算する、[33]記載の方法。
[35]第1の色素がコンゴーレッドである、[27]〜[34]いずれか記載の方法。
[36]第2の色素がエリオグラウシンである、[27]〜[35]いずれか記載の方法。
[37]該溶液中の第1の色素の濃度が0.05%〜0.2%である、[27]〜[36]いずれか記載の方法。
[38]該溶液中の第1の色素の濃度が0.1%である、[37]記載の方法。
[39]該溶液中の第2の色素の濃度が0.05%〜0.2%である、[27]〜[38]いずれか記載の方法。
[40]該溶液中の第2の色素の濃度が0.1%である、[39]記載の方法。
[41]セルロースを含む該表面が紙表面である、[27]〜[40]いずれか記載の方法。
[42]セルロースを含む該表面が、粘着性の裏張りをさらに含む、[27]〜[41]いずれか記載の方法。
[43](e) 妊娠女性由来のさらなる尿試料を希釈して、希釈尿試料を生成する工程;
(f) 該尿試料と、異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する第1の色素ならびに第1の色素とは異なりかつ異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合しない第2の色素を合わせて、尿および2つの色素の溶液を生成する工程;
(g) 工程(f)の溶液を、第1の色素が異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する条件下でセルロースを含む表面に適用して、表面上のスポットを生成する工程;
(h) 異常折り畳みタンパク質および色素を含む尿の溶液の拡散が起こる条件下で、工程(g)の表面上のスポットを維持する工程;ならびに
(i) 工程(h)の表面上のスポットから第1の色素および第2の色素が放射状に拡散する場合、該希釈尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むことを決定するか、または第1の色素ではなく第2の色素が工程(h)の表面上のスポットから放射状に拡散する場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないことを決定する工程
をさらに含む、[27]〜[42]いずれか記載の方法。
[44]さらなる尿試料が5倍〜15倍に希釈される、[43]記載の方法。
[45]該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含む場合、妊娠女性が子癇前症を有するか、または子癇前症を発症する可能性があると診断する工程をさらに含む、[27]〜[44]いずれか記載の方法。
[46]妊娠女性由来の尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定するためのキットであって、
(a) 異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する第1の色素;
(b) 第1の色素とは色が異なりかつ異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合しない第2の色素;
(c) セルロースを含む表面;ならびに
(d) 塗布器
を含む、キット。
[47]第1の色素がコンゴーレッドである、[46]記載のキット。
[48]第2の色素がエリオグラウシンである、[46]記載のキット。
[49]セルロースを含む該表面が紙表面である、[46]〜[48]いずれか記載のキット。
[50]セルロースを含む該表面が、粘着性の裏張りをさらに含む、[46]〜[49]いずれか記載のキット。
[51]セルロースを含む該表面が、さらなる表面に固定される、[50]記載のキット。
[52]第1の色素および第2の色素を水溶液中で合わせて、2つの色素の水溶液を生成する、[46]〜[51]記載のキット。
[53]該水溶液中の2つの色素の濃度が2%〜10%である、[52]記載のキット。
[54]該水溶液中の2つの色素の濃度が5%である、[53]記載のキット。
[55]該水溶液の体積が1μl〜10μlである、[52]〜[54]いずれか記載のキット。
[56]該水溶液の体積が7.5μlである、[55]記載のキット。
[57]該塗布器に、2つの色素の水溶液が予め充填される、[52]〜[56]いずれか記載のキット。
[58]該塗布器がピペットである、[46]〜[57]いずれか記載のキット。
[59]該ピペットが使い捨てピペットである、[58]記載のキット。
[60]陽性対照をさらに含む、[46]〜[59]いずれか記載のキット。
[61]陰性対照をさらに含む、[46]〜[60]いずれか記載のキット。
[62]妊娠女性由来の尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定する方法であって、
(a) 妊娠女性由来の尿試料と、異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する色素を合わせて、尿および色素の溶液を生成する工程;
(b) 該色素が異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する条件下で、該溶液を、セルロースを含む表面に適用して、表面上のスポットを生成する工程;
(c) 異常折り畳みタンパク質および色素を含む尿の溶液の拡散が起こる条件下で、該表面上のスポットを維持する工程;ならびに
(d) 該表面を通過する溶液が着色される場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むことを決定するか、または該表面を通過する溶液が無色である場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないことを決定する工程
を含む、方法。
[63]妊娠女性から得られた尿、異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する色素、ならびにセルロースを含む表面を含む組成物。
[64][12]〜[26]および[46]〜[61]いずれか一項に記載のキットならびに妊娠女性由来の尿試料を含む装置。
[65]妊娠女性が子癇前症を有するかまたは子癇前症のリスクを有するかどうかを決定する方法であって、
(a) 妊娠女性由来の尿試料とコンゴーレッドを合わせて、尿およびコンゴーレッドの溶液を生成する工程;
(b) 該溶液を、セルロースを含む表面に適用して、表面上のスポットを生成する工程;
(c) 該表面上のスポットを、色素を含む尿の溶液の拡散が起こる条件下で維持する工程;ならびに
(d) コンゴーレッドが該表面上のスポットから目に見える程度に拡散する場合、該妊娠女性が子癇前症を有するかまたは子癇前症のリスクを有することを決定する工程
を含む、方法。
Claims (46)
- 妊娠女性由来の尿試料が異常折り畳みタンパク質(misfolded protein)を含むかまたは含まないことを決定する方法であって、
(a) 妊娠女性由来の尿試料と、異常折り畳みタンパク質およびセルロースにインターカレーションにより結合する色素を合わせて、それにより尿および色素の溶液を生成する工程;
(b) 該溶液を、セルロースを含む表面に適用し、それにより該表面上にスポットを生成する工程;
(c) 異常折り畳みタンパク質および色素を含む尿の溶液の拡散が起こるように、該表面上のスポットを維持する工程;ならびに
(d) 色素が該表面上のスポットから目に見える程度に放射状に拡散する場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むと決定するか、または色素が該表面上のスポットから目に見える程度に放射状に拡散しない場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないと決定する工程
を含み、該異常折り畳みタンパク質が、SERPINA1、アルブミン、κFLC、セルロプラスミン、インターフェロン誘導性タンパク質6-16(IFI6)およびアミロイド前駆体タンパク質(APP)からなる群より選択されるものを含む、方法。 - 該色素がコンゴーレッドである、請求項1記載の方法。
- 該溶液中の色素の濃度が0.05%〜0.2%である、請求項1または2記載の方法。
- セルロースを含む該表面が紙表面である、請求項1〜3いずれか記載の方法。
- 該尿および色素の溶液が、該表面上のスポットから放射状に拡散する程度と陽性対照を比較する工程、ならびに該尿および色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度が、陽性対照と同等である場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むと決定する工程をさらに含む、請求項1〜4いずれか記載の方法。
- 該尿および色素の溶液が、該表面上のスポットから放射状に拡散する程度と陰性対照を比較する工程、ならびに該尿および色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度が、陰性対照と同等である場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないと決定する工程をさらに含む、請求項1〜5いずれか記載の方法。
- 該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含む場合、妊娠女性が子癇前症を有するかまたは子癇前症を発症する可能性がある、請求項1〜6いずれか記載の方法。
- 妊娠女性由来の尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定するためのキットであって、
(a) 異常折り畳みタンパク質およびセルロースにインターカレーションにより結合する色素;
(b) セルロースを含む表面;ならびに
(c) 塗布器
を含み、該異常折り畳みタンパク質が、SERPINA1、アルブミン、κFLC、セルロプラスミン、インターフェロン誘導性タンパク質6-16(IFI6)およびアミロイド前駆体タンパク質(APP)からなる群より選択されるものを含む、キット。 - 該色素がコンゴーレッドである、請求項8記載のキット。
- セルロースを含む該表面が紙表面である、請求項8または9記載のキット。
- 該色素が水溶液中にある、請求項8〜10いずれか記載のキット。
- 該水溶液中の色素の濃度が0.2%〜1.0%である、請求項11記載のキット。
- 該水溶液の体積が1μl〜10μlである、請求項12記載のキット。
- 該塗布器に色素が予め充填される、請求項8〜13いずれか記載のキット。
- 該塗布器がピペットである、請求項8〜14いずれか記載のキット。
- 陽性対照をさらに含む、請求項8〜15いずれか記載のキット。
- 陰性試料をさらに含む、請求項8〜16いずれか記載のキット。
- 妊娠女性由来の尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定する方法であって、
(a) 妊娠女性由来の尿試料と、異常折り畳みタンパク質およびセルロースにインターカレーションにより結合する第1の色素、ならびに第1の色素とは色が異なりかつ異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合しない第2の色素を合わせて、それにより、尿および2つの色素の溶液を生成する工程;
(b) 該溶液を、セルロースを含む表面に適用して、それにより、表面上のスポットを生成する工程;
(c) 異常折り畳みタンパク質および色素を含む尿の溶液の拡散が起こるように、該表面上のスポットを維持する工程;ならびに
(d) 第1の色素および第2の色素が該表面上のスポットから目に見える程度に放射状に拡散する場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むと決定するか、または第1の色素ではなく第2の色素が該表面上のスポットから目に見える程度に放射状に拡散する場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないと決定する工程
を含み、該異常折り畳みタンパク質が、SERPINA1、アルブミン、κFLC、セルロプラスミン、インターフェロン誘導性タンパク質6-16(IFI6)およびアミロイド前駆体タンパク質(APP)からなる群より選択されるものを含む、方法。 - 尿および2つの色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度と陽性対照を比較する工程、ならびに尿および2つの色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度が陽性対照と同等である場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むと決定する工程をさらに含む、請求項18記載の方法。
- 尿および2つの色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度と陰性対照を比較する工程、ならびに尿および2つの色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度が陰性対照と同等である場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないと決定する工程をさらに含む、請求項18または19記載の方法。
- 該表面上のスポットの画像を取得する工程をさらに含む、請求項18〜20いずれか記載の方法。
- 該画像が、携帯電話を使用して取得される、請求項21記載の方法。
- 該表面上のスポットから第1の色素が放射状に拡散する程度と該表面上のスポットから第2の色素が放射状に拡散する程度の間の差を定量する工程をさらに含む、請求項18〜22いずれか記載の方法。
- 該表面上のスポットから第1の色素が放射状に拡散する程度と該表面上のスポットから第2の色素が放射状に拡散する程度の間の相関係数を計算する工程をさらに含む、請求項23記載の方法。
- アルゴリズムを使用して該相関係数を計算する、請求項24記載の方法。
- 第1の色素がコンゴーレッドである、請求項18〜25いずれか記載の方法。
- 第2の色素がエリオグラウシンである、請求項18〜26いずれか記載の方法。
- 該溶液中の第1の色素の濃度が0.05%〜0.2%である、請求項18〜27いずれか記載の方法。
- 該溶液中の第2の色素の濃度が0.05%〜0.2%である、請求項18〜28いずれか記載の方法。
- セルロースを含む該表面が紙表面である、請求項18〜29いずれか記載の方法。
- 該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含む場合、妊娠女性が子癇前症を有するか、または子癇前症を発症する可能性がある、請求項18〜30いずれか記載の方法。
- 妊娠女性由来の尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定するためのキットであって、
(a) 異常折り畳みタンパク質およびセルロースにインターカレーションにより結合する第1の色素;
(b) 第1の色素とは色が異なりかつ異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合しない第2の色素;
(c) セルロースを含む表面;ならびに
(d) 塗布器
を含み、該異常折り畳みタンパク質が、SERPINA1、アルブミン、κFLC、セルロプラスミン、インターフェロン誘導性タンパク質6-16(IFI6)およびアミロイド前駆体タンパク質(APP)からなる群より選択されるものを含む、キット。 - 第1の色素がコンゴーレッドである、請求項32記載のキット。
- 第2の色素がエリオグラウシンである、請求項32記載のキット。
- セルロースを含む該表面が紙表面である、請求項32〜34いずれか記載のキット。
- 第1の色素および第2の色素を水溶液中で合わせて、それにより、2つの色素の水溶液を生成する、請求項32〜35いずれか記載のキット。
- 該水溶液中の2つの色素の濃度が2%〜10%である、請求項36記載のキット。
- 該水溶液の体積が1μl〜10μlである、請求項36または37記載のキット。
- 該塗布器に、2つの色素の水溶液が予め充填される、請求項36〜38いずれか記載のキット。
- 該塗布器がピペットである、請求項32〜39いずれか記載のキット。
- 陽性対照をさらに含む、請求項32〜40いずれか記載のキット。
- 陰性対照をさらに含む、請求項32〜41いずれか記載のキット。
- 妊娠女性由来の尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定する方法であって、
(a) 妊娠女性由来の尿試料と、異常折り畳みタンパク質およびセルロースにインターカレーションにより結合する色素を合わせて、それにより、尿および色素の溶液を生成する工程;
(b) 該溶液を、セルロースを含む表面に適用して、それにより、表面上のスポットを生成する工程;
(c) 異常折り畳みタンパク質および色素を含む尿の溶液の拡散が起こるように、該表面上のスポットを維持する工程;ならびに
(d) 該表面を通過する溶液が着色されている場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むと決定するか、または該表面を通過する溶液が無色である場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないと決定する工程
を含み、該異常折り畳みタンパク質が、SERPINA1、アルブミン、κFLC、セルロプラスミン、インターフェロン誘導性タンパク質6-16(IFI6)およびアミロイド前駆体タンパク質(APP)からなる群より選択されるものを含む、方法。 - 妊娠女性由来の尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定するためのキットであって、
(a) 異常折り畳みタンパク質およびセルロースにインターカレーションにより結合する色素;ならびに
(b) セルロースを含む表面
を含み、該異常折り畳みタンパク質が、SERPINA1、アルブミン、κFLC、セルロプラスミン、インターフェロン誘導性タンパク質6-16(IFI6)およびアミロイド前駆体タンパク質(APP)からなる群より選択されるものを含む、キット。 - 請求項8〜17、32〜42および44のいずれか一項に記載のキットならびに妊娠女性由来の尿試料を含む装置。
- 妊娠女性について子癇前症またはそのリスクを検出する方法であって、
(a) 妊娠女性由来の尿試料とコンゴーレッドを合わせて、それにより、尿およびコンゴーレッドの溶液を生成する工程;
(b) 該溶液を、セルロースを含む表面に適用して、それにより、表面上のスポットを生成する工程;ならびに
(c) コンゴーレッドを含む尿の溶液の拡散が起こるように、該表面上のスポットを維持する工程
を含み、コンゴーレッドが該表面上のスポットから目に見える程度に拡散する場合、該妊娠女性が子癇前症を有するかまたは子癇前症のリスクを有する、方法。
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