JP6695899B2 - 標準物質として外部生体分子を用いた生体分子分析方法およびそのキット - Google Patents

Description

本発明は、核酸分析を用いた生体分子分析方法およびそのキットに関する。

生体分子は、生体試料を構成する数多くのタンパク質、核酸、脂質および炭水化物などの物質である。これらの生体分子を分析する技術、および生体試料における生体分子の量的な状態を総合化した情報、すなわち生体分子の多重検査情報を生産する技術は、物理学、生化学および生物情報学の発達により広く開発されたが、従来の方法または機器の使用および維持費、容易さ、正確度、感度、検査時間およびプロセス自動化などに関する問題により、効率的な新規方法および機器への必要性が非常に高い。

生体分子の分析および多重検査技術は、それ自体が最終的な目標ではなく、目標を達成するための一つの手段であるが、微生物、細胞、組織などに有用に使用することができるため、医療、獣医学、環境工学、食品工学、農業などに広範囲に応用されている。

生体試料である組織、細胞塊、細胞および微生物などを構成するタンパク質および有機物質などを含む生体分子の分析およびプロファイルは、物理・化学的な性質を用いて様々な方法で作られている。

生体試料にある生体分子の分析、および該分析結果を利用して生物学的意味の分析を行うための臨床意思決定支援システム（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｓｙｓｔｅｍ）は、患者の診療で医師が診断と治療に関する意思決定（Ｄｅｃｉｓｉｏｎ Ｍａｋｉｎｇ）を行う過程を支援するシステムである。臨床意思決定支援システムは、事例ベースの機械学習推論システム（Ｃａｓｅ Ｂａｓｅｄ Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ）とエキスパートシステム（Ｅｘｐｅｒｔ Ｓｙｓｔｅｍ）に大別される。事例ベースの機械学習推論システムは、疾患が判定された患者の臨床情報（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）および生物学的情報、すなわち生体分子分析結果データを収集した後、機械学習を利用して、与えられた臨床情報と生物学的情報などから疾患を推論または判別し得るようにするシステムである。エキスパートシステムは、医学の専門家によって事前に定められたルール（Ｒｕｌｅ）に基づいて疾病を診断するシステムである。

また、最近では、生体分子を多重検査する代表的な技術であるプロテオームに対するハイスループットスクリーニング（Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）技法でタンパク質チップ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ）或いはアプタマーチップ（Ａｐｔａｍｅｒ ｃｈｉｐ））（非特許文献１及び２）が開発されて使用されている。このようなハイスループットスクリーニングに使用される支持体としては、ガラススライド、バイオセンサーの検知表面、ビーズ、ナノ粒子などがある。

また、多重検査を分析して有用な生体分子を決定し、これを分離した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ Ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ）などによってこれらの構成成分を確認する方法などが行われている。最近では、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（Ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）によってタンパク質プロファイルに関する多くの研究が行われている（非特許文献３〜５）。別の接近方法として、ＤＮＡと核酸ポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いて信号を増幅する技術であるｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）方法が開発されている（非特許文献６）。

上述のように、生体分子分析方法は、検出感度の向上および多重分析能の向上において発展を重ねてきたが、依然として、精度管理および測定用標準物質、分析費用の節減、分析時間の短縮、感度の向上および再現性の増大などに関する技術的課題に直面している。

Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ， １１−１８． ２００３ ＭｃＣａｕｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， ３１９（２）， ２４４−２５０． ２００３ Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ６２， ３６０９−３６１４． ２００２ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４８， １２９６−１３０４． ２００２ Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ， ３５９，５７２−５７７． ２００２ Ｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８， １２０−１２２． １９９２

上述した従来の生体分子を分析する技術の問題点を克服して、生体分子をより改善された効率性および感度で実時間にて分析することができる技術を開発するために研究した結果、外部生体分子を標準物質として用いて核酸分析によって一つ以上の生体分子を一度の検査で定量的に分析することができる方法を開発することにより、本発明の目的を達成しようとする。

上記目的を達成するために、一態様において、本発明は、核酸分析に基づく生体分子分析方法を提供する。

本発明の核酸分析を用いた生体分子分析方法は、（ａ）標的生体分子が一つ以上存在する生体試料またはその加工試料を準備する段階と、（ｂ）前記標的生体分子に特異的に結合するリガンドと設計核酸との連結構造体を添加して、生体分子とその特異的連結構造体との複合体を形成する段階と、（ｃ）前記複合体を分離する段階と、（ｄ）前記複合体の設計核酸を増幅する段階と、（ｅ）その増幅産物を分析して標的生体分子に対する定性的または定量的情報を得る段階とを含んでなり、前記設計核酸は、順方向プライマーが結合する領域、逆方向プライマーが結合する領域、およびこれらの領域の間にリガンドが特異的に結合する分子を指し示してその分子の識別を可能にする領域を持つ設計核酸であることを特徴とする。

前記設計核酸は、それが連結されたリガンドが特異的に結合する分子を指し示す（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ）領域を含んでいるため、その設計核酸増幅物の存否および／または存在量（すなわち、増幅量）を決定することにより（正確には、リガンドが特異的に結合する分子を指し示す領域の増幅物の存否および／または存在量（すなわち、増幅量）を決定することにより）、その設計核酸に連結されたリガンドが特異的に結合する分子を定性的に分析し（すなわち、存否を確認し）或いは定量的に分析することができる（すなわち、存在量を相対的または絶対的に確認することができる）。

ここで、リガンドが特異的に結合する分子を指し示す領域は、リガンドが特異的に結合する分子が異なる場合、それに応じて異なって設計される領域のことをいう。このような設計は、その相違を検出することができる限り、どのように設計されても構わないが、一般的には塩基配列またはその長さを異にして行われる。

本発明の方法は、分析しようとする生体分子が２つ以上である場合でも、それに応じてそのそれぞれに特異的に結合することができるリガンドと設計核酸との連結構造体を添加し、一つの順方向プライマーおよび逆方向プライマーセットを用いてリアルタイムマルチフレックスポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ）などで増幅させる場合、一度の増幅過程で（すなわち、１回の検査で或いは一つのチューブで）前記２つ以上の標的生体分子を同時に定性的および／または定量的に分析することができる。ここで、設計核酸は、それが結合されたリガンドが異なり、それに応じてそのリガンドがそれぞれ異なる生体分子を認知して結合しても、その順方向プライマーが結合する領域およびその逆方向プライマーが結合する領域がすべてのリガンドと設計核酸との連結構造体の間で共通した配列を有するように設計されるため、すべての連結構造体の設計核酸は、一つの順方向プライマーおよび逆方向プライマーセットによって増幅できる。

本発明の方法において、リガンドと設計核酸との連結構造体は、リガンドと設計核酸とを共有的または非共有的に結合させて得られる。このような結合には、当業分野における公知の任意の方法を使用することができる。例えば、本発明の実施例に示すように、設計核酸の５’末端にアミン基を導入して共有的にリガンド（タンパク質である抗体）に結合させるか、或いはビオチンとアビジンを媒介として（リガンドにはビオチンを結合させ、設計核酸にはアビジンを結合させて）非共有的に結合させることもできる。

本発明の方法において、前記生体試料の加工試料は、例えば、生体試料が血液である場合にはそれを加工して得られた血漿または血清のことをいい、標的生体分子がタンパク質である場合には総タンパク質抽出試薬などを用いて生体試料から得られた総タンパク質試料のことをいう。

本発明の方法において、相対的および／または絶対的定量分析のための標準物質を使用することができ、そのような標準物質として、分析しようとする試料には存在しない外部生体分子（外部標準物質）を使用することができる。

このような外部標準物質は、分析しようとする試料には存在しない物質であれば、任意の物質、例えば、分析しようとする試料がヒト由来の生体試料であり、標的生体分子がタンパク質である場合には、以下の実施例で使用した、大腸菌由来のタンパク質であるエノイル−ＡＣＰリダクターゼ（Ｅｎｏｙｌ−ＡＣＰ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）などを挙げることができる。

外部生体分子を標準物質として用いる場合、その標準物質に特異的に結合するリガンドと設計核酸との連結構造体を、標的生体分子に特異的に結合するリガンドと設計核酸との連結構造体と一緒に添加して複合体を形成し、その形成されたすべての複合体（一つ以上の生体分子との複合体および標準物質との複合体の両方とも）を分離した後、その複合体の設計核酸を一つの順方向プライマーおよび逆方向プライマーセットで増幅させ、外部生体分子に対する増幅物を標的生体分子に対する増幅物と定量して比較することにより、生体分子の相対的または絶対的定量を可能にすることができる。ここで、外部生体分子を標準物質として使用する場合、その外部生体分子を定量して、予め（複合体の形成前に）分析しようとする生体試料またはその加工試料に添加する必要がある。このように定量された外部生体分子を標準物質として用いる場合、その標準物質に対して生体分子の分析とは別個の分析によって検量線を作成しなくても、標的生体分子を絶対的に定量することが可能となる。

外部生体分子を標準物質として用いる場合、前記標的生体分子とそれに対する連結構造体の結合親和度と、前記外部生体分子とそれに対する連結構造体の結合親和度との差が発生する場合、前記定量結果が標的生体分子の試料中の量（または濃度）を正確に反映することができないことがある。

したがって、外部生体分子を標準物質として用いる場合、前記標的生体分子とそれに対する連結構造体の結合親和度と、前記外部生体分子とそれに対する連結構造体の結合親和度との差を反映して前記定量結果を補正することが好ましい。

このような差を反映することは、（ｉ）前記標的生体分子と前記外部生体分子を定量して、同じ濃度で含む対照試料を準備する段階と、（ｉｉ）前記対照試料の標的生体分子または外部生体分子に特異的に結合し、本発明の分析方法に使用した連結構造体と同じ連結構造体を添加して、前記標的生体分子とその特異的連結構造体との複合体、および前記外部生体分子とその特異的連結構造体との複合体を形成する段階と、（ｉｉｉ）前記複合体を分離する段階と、（ｉｖ）前記複合体の設計核酸を増幅する段階と、（ｖ）前記標的生体分子に対する増幅物と前記外部生体分子に対する増幅物との量的な差異を求める段階と、（ｖｉ）前記差異を前記標的生体分子の定量結果に反映する段階とによって行われ得る。

前記標的生体分子は、タンパク質、ペプチド、多糖類、脂質およびこれらの組み合わせで形成された分子（糖タンパク質、糖脂質、脂質、タンパク質、脂質多糖体）など、それを認知して結合することが可能なリガンドを製造することができる限り、特別な制限がない。

また、前記設計核酸は、二本鎖核酸（ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＲＮＡ）または一本鎖核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）であることもでき、以下の実施例の如く、リガンドである抗体との結合を容易にするための目的などでアミン基が５’末端に導入されるなど、化学的に修飾された核酸であることもできる。

本発明の方法において、増幅産物の分析は、増幅がリアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ）、リアルタイムマルチプレックス逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ−ＰＣＲ）などで行われる場合、Ｔａｑｍａｎプローブなどの適正検出用物質を増幅の際に使用して行われ得る。また、前記設計核酸の増幅物（具体的には指示領域の増幅物）を捕捉することが可能なプローブ（一般的には、前記増幅物に相補的な塩基配列を有する一本鎖のオリゴヌクレオチドである）が固着されたマイクロアレイを用いて行われることもでき、以下の実施例の如くキャピラリー電気泳動を実施して行われることもできる。このような増幅産物の分析は、標的生体分子に対する定性的および／または定量的情報を提供するであろう。

他の態様において、標準物質として外部生体分子を用いた生体分子分析キットを提供する。

このような分析キットは、標的生体分子に特異的に結合するリガンドと設計核酸との連結構造体を一つ以上含んで構成できる。

好適な態様において、前記分析キットは、１種以上の標的生体分子それぞれに特異的に結合するリガンドと設計核酸との連結構造体を１種以上含み、さらに、標準物質として前記標的生体分子が存在する生体試料には存在しない１種以上の外部生体分子それぞれに特異的に結合するリガンドと設計核酸との連結構造体を１種以上含んで構成される。

ここで、前記設計核酸は、前述したように、順方向プライマーが結合する領域、逆方向プライマーが結合する領域、およびこれらの領域の間にリガンドが特異的に結合する分子を指し示してその分子の識別を可能にする領域を持つ設計核酸であり、前記設計核酸の順方向プライマーが結合する領域と逆方向プライマーが結合する領域は、一つの順方向プライマーおよび逆方向プライマーセットですべての設計核酸を増幅することができるようにすべての設計核酸で共通した塩基配列を有する。

好適な態様において、前記分析キットは、前記標的生体分子とそれに対する前記連結構造体の結合親和度と、標準物質である前記外部生体分子とそれに対する連結構造体の結合親和度との差を決定するために、対照試料に使用する前記１種以上の標的生体分子と前記１種以上の外部生体分子をさらに含むことができる。

また、好適な態様において、前記キットはそのキットの使用説明書をさらに含み、その使用説明書は、生体分子の分析方法として、前述したような本発明の分析方法をプロトコル（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）に従って教示することができる。

また、好適な態様において、前記キットに含まれる説明書は、標的生体分子の定量情報に、前記標的生体分子とそれに対する連結構造体の結合親和度と、前記外部生体分子とそれに対する連結構造体の結合親和度との差を反映することをさらに教示することができる。

また、好適な態様において、前記キットに含まれる説明書は、前記結合親和度の差の反映に対する方法として、前述したような方法をさらに教示することができる。

本発明は、リガンドＰＣＲを用いて二つまたはそれ以上の生体分子を分析することにより、試料における生体分子の生物学的意味を確認することができ、生体分子存在信号を、ＰＣＲ法による増幅および蛍光的に高い感度で検出することができる。しかも、一度の検査で様々な生体分子を分析し、その分析した結果からソフトウェアを用いて試料における生体分子の変化、疾病に対する感受性、疾病の診断、疾病に対する感受性、および治療薬剤に対する反応の差など、個人間の差を効率よく決定する方法を提供する。

リガンド−核酸分析方法の概念図である。 リガンド−核酸分析方法の設計核酸増幅および分析の概念図である。 Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲで前記ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎされた標準物質をリガンド−核酸分析で分析した結果から複合体の設計核酸増幅産物をＴａｑｍａｎプローブで分析した結果である。 キャピラリー電気泳動方法で、前記標準物質および標的生体分子を指し示す設計核酸の増幅産物の長さを分析した結果である。 生物学的意味決定システムの論理アーキテクチャである。 生物学的意味決定システムの構造である。 生物学的意味決定ソフトウェアの構造である。 生物学的意味決定ソフトウェアにおける統合管理ツールＡＣＳの役割を示すものである。 生物学的意味決定のデータ分析モジュールである。 リガンド−核酸分析方法で生産された前記標的生体分子の分析結果に基づいて、急性心筋梗塞患者または敗血症患者の生物学的意味を決定するフローチャートである。 生産された分析結果を疾患群別に構成したデータベースおよび人工ニューラルネットワークを利用したプログラムで特定のヒトの血液試料に対して生体分子分析結果を生産する臨床意思決定支援システムによって疾病を診断するフローチャートである。 生物学的意味を決定する臨床意思決定支援システムによって前記リガンド−核酸分析で生産された標的生体分子の結果を分析して患者の診断を実施した例である。

以下、本発明を詳細に説明する。

生体分子は、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質（ｌｉｐｉｄ）、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、病原体、有害物質、基質、代謝産物、遷移状態類似体（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ａｎａｌｏｇ）、補助因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）、阻害剤、薬、染料、栄養分、成長因子、細胞、組織などが例示され、制限はなく、殆どすべての化学的または生物学的エフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）になり、いずれのサイズの分子でも使用できる標的分子などを意味する。

生体試料において、前記生体分子を分析して体の中の変化を知ることができ、生命体の正常または病理学的な状態、薬物に対する反応程度などを客観的に測定することが可能な生物学的意味を決定することができる。

リガンドは、生体分子と結合する物質であって、代表的に抗体、アプタマーおよびペプチドなどであり、抗体は、生体分子と特異的に結合する物質であって、抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）と特異的結合をして抗原−抗体反応を起こすタンパク質である。アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）は、低分子化合物からタンパク質まで、様々な種類のレセプターに高い親和度と特異性で結合することができる特性を有する小さな（２０〜６０ヌクレオチド）一本鎖核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）断片を意味する。

標準物質は、精度管理および測定用の物質であって、分析しようとする試料に常に一定量で存在する内部物質であるか、或いは前記試料を構成する生体分子と共に生物学的分析方法による反応性のないリガンドに結合する外部生体分子である。

好ましくは、一般的に、生体分子分析の場合、各種試験、検査の際に、比較のために、分析しようとする生体試料に含まれている生体分子を用いて内部精度管理を行う。前記精度管理用物質は、分析しようとする試料に常に一定量で存在する物質が理想的であるが、そうでない場合、試料に含まれない物質である外来物質を使用することができ、好ましくは、分析しようとする試料が生体試料である場合、前記生体試料に含まれない外来生体分子から構成できる。精度管理は、管理用試料のような外的基準を使用せずに、毎回の測定で得られる一群の検査結果を分析して測定値の精密度を管理していく内部精度管理を意味する。

好ましくは、本発明において精度管理および測定用標準物質を用いてヒト由来の生体試料を分析する場合、ヒト由来の生体試料に含まれない生体分子として植物特異生体分子を使用することができる。現在、ヒト、大腸菌、および植物の一種であるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）などのゲノムプロジェクトが完了して種特異的タンパク質が報告されている。本発明では、ヒト由来の生体試料を分析するために、標準物質として大腸菌や植物などの特異タンパク質を使用することができる。

生体分子の濃度を測定して評価する方法は、精密度、正確度、再現性の面で信頼することができなければならない。生体分子を分析する上で正確度が重要視される理由は、試料はタンパク質を含む様々な種類の物質などの非常に複雑な組成で構成されており、それらのうち、分析しようとする対象生体分子は少量存在するため、微量成分の分析のために精度管理および測定用標準物質の必要性が非常に高い。

試料に存在する分析妨害物質の影響と微量分析という点から、分析値の実験室間の偏差が生じるおそれがある。実験室間の偏差を減らすために、分析しようとする試料に同じ濃度の生体分子が均質に含有されている精度管理および測定用標準物質が必要になった。このような標準物質を用いて複数の実験室で分析した分析値を比較し、分析機器の条件などを検討して正確な分析条件を導出するのである。また、分析しようとする試料に前記標準物質を均質に分布させて試料ごとの偏差を最小限に抑え且つ分析の信頼性を高めることができる生体分子分析方法が必要である。

したがって、本発明は、図１に示すような概念で標的生体分子と精度管理および測定用の標準物質を核酸分析技術で一緒に分析する技術であるリガンド−核酸分析方法（仮称）を提供することにより、生体分子分析の検査限界、精密度、正確度および再現性の面を改善しようとする。

本発明において、一つまたはそれ以上の生体分子を分析するために、精度管理および測定用の標準物質は、分析しようとする試料に常に一定量で存在する内部物質であるか、或いは前記試料を構成する生体分子と共に前記リガンド−核酸分析方法による結合反応性がないリガンドに結合する外部生体分子である。

前記標準物質および標的核酸分子を指し示す設計核酸の塩基配列および核酸長さを用いて分析することを特徴とするリガンド−核酸分析方法、キットおよび装置を提供する。

設計核酸は、分析が可能となるようにヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）からなる核酸であって、前記標準物質および分析しようとする特定の生体分子（仮称、標的生体分子）を塩基配列または塩基配列の長さで指し示し、前記標準物質および標的生体分子に結合するリガンドに結合して標準物質および生体分子の存在に対する信号を核酸増幅方法で増幅し、増幅産物を分析することができるようにする役割を果たす。

前記標準物質および標的生体分子を指し示す設計核酸は、前記標準物質と標的生体分子をそれぞれ指し示す設計核酸同士の間には生物学的分析方法の一種である混成化反応性がないか、或いはその長さが異なり、核酸分析技術によって分析可能でなければならない。好ましくは、設計核酸を分析する同じ方法で分析ができるようにし、設計核酸の増幅に使用するＰＣＲプライマー対を使用することができる。

特定の生体分子に相応するリガンドに前記設計核酸が連結された構造体を分析リガンドと称し、標準物質に相応するリガンドに設計核酸が連結された構造体を標準分析リガンドと称する。

前記設計核酸を分析するために設計核酸存在信号を増幅する方法である「増幅反応（ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ））」または「ＰＣＲ」は、ターゲット核酸分子を増幅する反応を意味する。様々な増幅反応が当該分野において報告されている。これらは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同第４，８００，１５９号）、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（２００１））の方法、マルチプレックスＰＣＲ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｍｏｌｌｅｒ， ２０００）、リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＬＣＲ）（Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｗ．Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｇｅｎｅ， １６４， ４９−５３； Ｃａｒｌｓｏｎ， Ｂ．， ２００８， Ｇｅｎｅｔ Ｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ Ｎ， ２８， １２−１２）、Ｇａｐ−ＬＣＲ（ＷＯ９０／０１０６９）、修復連鎖反応（ｒｅｐａｉｒ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＥＰ４３９，１８２）、転写媒介増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＴＭＡ）（ＳａｎｔａＬｕｃｉａ， Ｊ．， １９９８， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ９５， １４６０−１４６５．）、自家持続配列複製（ｓｅｌｆ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、標的ポリヌクレオチド塩基序列の選択的増幅（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）（米国特許第６，４１０，２７６号）、コンセンサス配列プライムポリメラーゼ連鎖反応（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｒｉｍｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＣＰＰＣＲ）（米国特許第４，４３７，９７５号）、任意的プライムポリメラーゼ連鎖反応（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ ｐｒｉｍｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＡＰ−ＰＣＲ）（米国特許第５，４１３，９０９号および同第５，８６１，２４５号）、核酸塩基序列ベース増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＮＡＳＢＡ）（米国特許第５，１３０，２３８号、同第５，４０９，８１８号、同第５，５５４，５１７号、および同第６，０６３，６０３号）、および鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含むが、これに限定されない。

本発明は、標的生体分子の検査限界を高めるために設計された設計核酸を使用し、存在信号を一次的に核酸増幅技術で増幅し、二次的に蛍光物質で増幅した。ＰＣＲによる核酸の増幅は解像力を高めることができる。

好ましくは、前記設計核酸存在信号を増幅するＰＣＲ方法を実現するために、分析リガンドおよび標準分析リガンド構造体における特定のリガンドに連結される設計核酸の構成は、次の一般式（Ｉ）で表される。

５’−Ｐ１−Ｎ_Ｖ−Ｐ３−３’ （Ｉ）

前記一般式（Ｉ）において、Ｐ１領域とＰ３領域は、それぞれ順方向プライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）と逆方向プライマーが結合する領域であり、Ｎ_Ｖ領域は、特定の塩基配列またはその長さで特定の生体分子に結合するリガンドを指し示す部分（すなわち、特定の生体分子を指し示す領域）であって、特定の生体分子を定性および定量的に分析することができるようにする役割を果たす。このＮ_Ｖ領域は、好ましく１０〜２００ヌクレオチドの長さを有する。

また、好ましくは、リガンドへの結合を容易にするために、５’末端に反応性基としてのアミン基が存在することもでき、順方向プライマーが結合する領域の上位（ｕｐｓｔｒｅａｍ）には約１０個のヌクレオチドからなるスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）が存在することもできる。

好ましくは、前記順方向プライマーと逆方向プライマーはユニバーサルプライマー対を使用することができる。

前記ＰＣＲプライマー対において、順方向プライマーは、設計核酸の塩基配列に完全に相補的に結合する塩基序列から構成でき、逆方向プライマーは、設計核酸の塩基配列と同一であることができる。好ましくは、前記ＰＣＲプライマーはユニバーサルＰＣＲプライマー対である。

ユニバーサルＰＣＲプライマーは、一般的に、塩基配列決定やＰＣＲなどに多く使用される塩基配列であるオリゴヌクレオチドであって、商業的なクローニングベクターなどに多く使用される。前記ユニバーサルＰＣＲプライマーは、１４マー（ｍｅｒ）〜４０マーのオリゴヌクレオチドを意味するもので、鋳型に相補的なプライマー延長産物の合成が誘導される条件、すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼの存在、そして適切な温度およびｐＨの条件で合成の開始点として作用することができる。

「増幅産物」は、ポリヌクレオチド増幅反応の産物を意味する。すなわち、これは一般的に二本鎖であり、一つ以上の出発配列から複製されるポリヌクレオチド集団である。一つ以上の出発配列は、同一配列の一つ以上のコピーであってもよく、相異なる配列の混合物であってもよい。増幅産物は様々な増幅反応によって生成できるが、前記増幅反応の産物は一つ以上の標的核酸の多数の複製物である。本発明では、前記設計核酸の増幅産物を核酸分析技術で分析して試料から標的生体分子を分析することができる。

本発明によって、設計核酸のＰ１部分にある反応性基Ｎとリガンドの反応性基Ｎとを結合させる段階を含み、前記結合が前記設計核酸の少なくとも一つの標的生体分子を指し示すことを特徴とする、前記設計核酸の少なくとも一つの標的生体分子を指し示す方法が提供される。

前記設計核酸とリガンドとの連結は、様々な方法で行うことができる。好ましくは、設計核酸およびリガンドそれぞれに反応性基を結合させて化学的な反応で分析リガンドを製造する。本発明によって、分析リガンドが提供される。本発明に係る分析リガンドは、リガンドに位置する反応性基Ｎに、一つ以上の設計核酸が結合されている。

好ましくは、前記設計核酸は、標的生体分子を指し示し、核酸分析技術によって分析することができる能力を保有するか、或いは存在信号を増幅することができるように結合されている。

好ましくは、前記反応性基Ｎは、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルキル、アルケニル、アルキニル、オキソアルキル、オキソアルケニル、オキソアルキニル、アミノアルキル、アミノアルケニル、アミノアルキニル、スルホアルキル、スルホアルケニル、スルホアルキニル基、ホスホアルキル、ホスホアルケニル、およびホスホアルキニルの中から選ばれた一つ以上の基を含む。

本発明によって、標的生体分子に特異的に結合するリガンドを効果的に指し示すことを特徴とする、前記標的生体分子を含む細胞、組織または流体を含むオブジェクト内の疾患または状態を分析するための設計核酸を提供する。

生体分子とリガンドの複合体を収穫する方法は、大きく２種に分けることができる。一つの方法は、分析しようとする試料の生体分子を非特異的に固体支持体に結合させる方法であって、好ましくは、前記固体支持体は、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）方法で使用するプレート（ｐｌａｔｅ）またはニトロセルロース膜（Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）であり、もう一つの方法は、前記標準物質および標的生体分子のリガンドを固体支持体に結合させる方法であって、好ましくは、前記固体支持体は磁性ビーズである。

本発明では、前記標的生体分子とリガンドの複合体を収穫することができるようにする構造体を収穫リガンドと称し、前記標準物質とリガンドの複合体を収穫することができるようにする構造体を標準収穫リガンドと称した。

図２に示すように、濃度を知っている標準物質が存在する分析しようとする試料において一つまたはそれ以上の標的生体分子を分析するために、前記標準物質および標的生体分子に対する設計核酸の塩基配列または核酸長さを用いて、設計核酸を増幅して得られた増幅産物を核酸分析技術で分析することにより、前記標的生体分子を分析することができる。好ましくは、前記標的生体分子を分析した結果は、標的生体分子の存在量または存在量の比率であるか、標準物質と標的生体分子別の比率である。

前記標的生体分子および標準物質に応じて前記設計核酸の塩基配列を決定して指し示すようにすることにより、前記設計核酸の塩基配列を決定する方法を用いて、相応する標的生体分子を分析することができ、好ましくは、前記標的生体分子および標準物質に相応する設計核酸増幅産物の塩基配列を用いて一つまたはそれ以上の前記標的生体分子の定性および定量分析を同時に行うことができる。

好ましくは、前記増幅産物の塩基配列は、混成化をベースにしたＦＲＥＴプローブとリアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を使用する方法、または捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）プローブと混成化方法を利用した方法であるビーズアレイもしくはマイクロアレイを使用して決定した後、前記標的生体分子の存否および存在量を分析することができる。

一つまたはそれ以上の種の設計核酸を増幅した後のアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）検出は、難しくて多くの時間がかかる。ＰＣＲ過程の間に増幅をモニタリングするために実施する方法がある。特定の核酸１種を分析するために使用する理想的な方法は、通常、新しく合成されたＤＮＡにアニーリングする蛍光標識プローブである。

一つのチューブで濃度を知っている標的物質が在る試料において前記標準物質と一つまたはそれ以上の標的生体分子を同時に分析するためには、これらに相応する塩基配列が異なる設計核酸を製作し、これらを標的生体分子と結合するリガンドに結合させて分析リガンドを準備した後、分析しようとする試料と反応させて収穫した分析リガンド−生体分子−収穫リガンド複合体、および標準分析リガンド−標準物質−標準収穫リガンド複合体の設計核酸を鋳型としてユニバーサルＰＣＲプライマー対でＰＣＲを実行すると、増幅産物を合成することができる。

前記標準物質を含む一つまたはそれ以上の標的生体分子のリガンドおよび設計核酸を分析するために、設計核酸の塩基配列に相補的に結合することができるプローブを含むＦＲＥＴプローブを製造することができる。

前記ＦＲＥＴプローブは、一般に、ドナー発光（ｄｏｎｏｒ ｅｍｉｓｓｉｏｎ）が二つの発色団間のＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）によって標的の不在の際にクエンチングされるように設計される。ドナー発色団とアクセプター発色団のペアが隣接して位置した場合、励起状態にあるドナー発色団（ｄｏｎｏｒ ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）は、アクセプター発色団にエネルギーを伝達することができる。この伝達は、常に非放射的（ｎｏｎ−ｒａｄｉａｔｉｖｅ）であり、双極子−双極子カップリング（ｄｉｐｏｌｅ−ｄｉｐｏｌｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）によって起こることができる。前記発色団間の距離を十分に増加させる場合、ＦＲＥＴ効率が低下し、ドナー発色団の発光が放射的に検出できる。ドナー発色団の例は、ＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＴＡＭＲＡ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄを含む。アクセプター発色団の励起スペクトルは、ドナー発色団の発光スペクトルと重なるように選択される。そのようなペアの例はＦＡＭ−ＴＡＭＲＡである。また、広い範囲のドナーをクエンチング（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）する非蛍光アクセプター（ｎｏｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｃｃｅｐｔｏｒ）が存在する。ドナー−アクセプターＦＲＥＴペアの他の例は当該分野において知られている。

ＰＣＲのリアルタイム検出のために用いられるＦＲＥＴプローブの一般的な例は、分子ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ）（例えば、米国特許第５，９２５，５１７号）、ＴａｑＭａｎプローブ（例えば、米国特許第５，２１０，０１５号および同第５，４８７，９７２号）、およびＣＡＴＡＣＬＥＡＶＥプローブ（ｐｒｏｂｅｓ）（例えば、米国特許第５，７６３，１８１号）を含む。

前記分子ビーコンは、未結合状態でプローブがドナー発色団とアクセプター発色団とが隣接するように存在し、ドナー発光が減少するものである二次構造を形成するように設計された一本鎖オリゴヌクレオチドである。適切な反応温度で、前記ビーコンはアンフォールドされ（ｕｎｆｏｌｄ）、アンプリコンに特異的に結合する。アンフォールドされると、ドナー発色団とアクセプター発色団間の距離が増加してＦＲＥＴが逆転され、特化された装置を用いて、ドナー発光がモニタリングできる。ＴａｑＭａｎおよびＣＡＴＡＣＬＥＡＶＥ技術は、用いられるＦＲＥＴプローブが切断され、ドナー発色団とアクセプター発色団とがＦＲＥＴを逆転させることができるように十分に互いに分離されるという点で、分子ビーコンとは異なる。

ＴａｑＭａｎ技術は、５’末端でドナー発色団によって標識され、３’末端でアクセプター発色団によって標識された一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを使用する。増幅のために用いられるＤＮＡポリメラーゼは、５’，３’エキソヌクレアーゼ活性を含まなければならない。ＴａｑＭａｎプローブは、プライマーが結合するのと同時に、アンプリコンの一本鎖に結合する。ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを延長しながら、前記ポリメラーゼは究極的に結合されたＴａｑＭａｎプローブと出会うだろう。この際、前記ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は、５’末端から開始して順次ＴａｑＭａｎプローブを分解するだろう。前記プローブが消化されながら、前記プローブを含むモノヌクレオチドが反応バッファ内に放出される。ドナーは、アクセプターから遠く拡散し、ＦＲＥＴが逆転される。プローブの切断を確認するために、ドナーからの発光がモニタリングされる。ＴａｑＭａｎが作用する方式のため、ＰＣＲのサイクルごとに１回のみ特定のアンプリコンが検出できる。

ＴａｑＭａｎ標的部位を通じたプライマーの伸長は、次のＰＣＲサイクルでアンプリコンが変性されるまでＴａｑＭａｎプローブの追加結合を防ぐ二本鎖産物を生成する。

その内容が参照により本明細書に含まれている米国特許第５，７６３，１８１号は、別のリアルタイム検出方法（「ＣＡＴＡＣＬＥＡＶＥ」という）を記述する。ＣＡＴＡＣＬＥＡＶＥ技術は、プローブの切断がポリメラーゼ活性を持たない第２酵素によって行われるという点で、ＴａｑＭａｎとは異なる。ＣＡＴＡＣＬＥＡＶＥプローブはエンドヌクレアーゼ、例えば、制限酵素またはＲＮａｓｅの標的である分子内の配列を有する。一例において、ＣＡＴＡＣＬＥＡＶＥプローブは前記プローブの５’および３’末端がＤＮＡからなり、切断部位はＲＮＡを含むものであるキメラ構造を持つ。

本発明の別の実施例において、前記Ｔａｑｍａｎプローブは、５’末端に蛍光発色剤（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｄｙｅ）が標識され、３’末端には消光剤（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が前記設計核酸に相補的に結合することができる配列を有するものである。

ＴａｑＭａｎプローブに結合されている前記レポーター分子およびクエンチャー分子は、蛍光性物質および非蛍光性物質を含む。

本発明に用いられる蛍光性レポーター分子およびクエンチャー分子は、当該分野における公知のいずれのものも使用することができ、その例は次のとおりである（括弧内の数値は、ナノメートル単位で表示した発光最大波長である）：Ｃｙ２^ＴＭ（５０６）、ＹＯＰＲＯ^ＴＭ−１（５０９）、ＹＯＹＯ^ＴＭ−１（５０９）、Ｃａｌｃｅｉｎ（５１７）、ＦＩＴＣ（５１８）、ＦｌｕｏｒＸ^ＴＭ（５１９）、Ａｌｅｘａ^ＴＭ（５２０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １１０（５２０）、５−ＦＡＭ（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ５００（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ４８８（５２４）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ^ＴＭ（５２５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ（５２７）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３（５２９）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ（５３１）、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ（５３３）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５３３）、ＴＯＴＯ１（５３３）、ＪＯＥ（５４８）、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０（５５０）、Ｄｉｌ（５６５）、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０（５７０）、Ｃｙ３^ＴＭ（５７０）、Ａｌｅｘａ^ＴＭ５４６（５７０）、ＴＲＩＴＣ（５７２）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ^ＴＭ（５７５）、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｒ＆Ｂ（５７５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（５７５）、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ^ＴＭ（５７６）、Ｐｙｒｏｎｉｎ Ｙ（５８０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ（５８０）、ＴＡＭＲＡ（５８２）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ^ＴＭ（５９０）、Ｃｙ３．５^ＴＭ（５９６）、ＲＯＸ（６０８）、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｃｒｉｍｓｏｎ^ＴＭ（６１５）、Ａｌｅｘａ^ＴＭ５９４（６１５）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（６１５）、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ（６２８）、ＹＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−３（６３１）、ＹＯＹＯＴＭ−３（６３１）、Ｒ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４２）、ＣＰｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４８）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６６０）、ＴＯＴＯ３（６６０）、ＤｉＤ ＤｉｌＣ（５）（６６５）、Ｃｙ５^ＴＭ（６７０）、Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ（６７１）、Ｃｙ５．５（６９４）、ＨＥＸ（５５６）、ＴＥＴ（５３６）、ＶＩＣ（５４６）、ＢＨＱ−１（５３４）、ＢＨＱ−２（５７９）、ＢＨＱ−３（６７２）、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｂｌｕｅ（４４７）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｇｏｌｄ ５４０（５４４）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５６０（５５９）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ５９０（５９１）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０（６１０）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６３５（６３７）、ＦＡＭ（５２０）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（５２０）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｃ３（５２０）、Ｐｕｌｓａｒ ６５０（５６６）、Ｑｕａｓａｒ ５７０（６６７）、Ｑｕａｓａｒ ６７０（７０５）およびＱｕａｓａｒ ７０５（６１０）。括弧内の数値は、ナノメートル単位で表示した発光最大波長である。本発明のある実施形態によれば、レポーター分子およびクエンチャー分子はＣｙ５、ＲＯＸ、ＨＥＸ、ＦＡＭ、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２またはＣｙ５．５ベースの標識を含む。

適切なレポーター−クエンチャーペア（ｐａｉｒｓ）は多くの文献に開示されている：Ｐｅｓｃｅ ｅｔ ａｌ．、ｅｄｉｔｏｒｓ、ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７１）；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．、ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７０）；Ｂｅｒｌｍａｎ、ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＡ ＯＦ ＡＲＯＭＡＴＩＣ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ、２^ｎｄ ＥＤＩＴＩＯＮ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、ＣＯＬＯＵＲ ＡＮＤ ＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＧＡＮＩＣ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７６）；Ｂｉｓｈｏｐ、ｅｄｉｔｏｒ、ＩＮＤＩＣＡＴＯＲＳ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９７２）；Ｈａｕｇｌａｎｄ、ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、１９９２）；Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ、ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＨＯＳＰＨＯＲＥＳＣＥＮＣＥ（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９４９）；Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｒ．Ｐ．、ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ、Ｓｉｘｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．、１９９６；ＵＳ Ｐａｔ．Ｎｏｓ．３，９９６，３４５ ａｎｄ ４，３５１，７６０。

本発明のある実施形態によれば、本発明のプローブの５’末端はＣｙ５、ＲＯＸ、ＨＥＸ、ＦＡＭおよびＣｙ５．５よりなる群から選ばれる１種の蛍光物質（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）で標識され、３’末端はＢＨＱ−１およびＢＨＱ−２よりなる群から選ばれた１種のクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）に変形できるが、これに限定されるものではない。

本発明は、前記ＦＲＥＴプローブを用いて、前記標準物質を含めて５種以上の標的生体分子を分析することを特徴とする、リガンド−核酸分析方法、キットおよび装置を提供する。

ＴＯＣＥ（Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）は、多数（５個以上の）の目標遺伝物質の検出と遺伝的変異を確認することを可能にする技術である（Ｌｅｅ， Ｄ． Ｈ． ＴＯＣＥ： Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ． Ｓｅｅｇｅｎｅ ｂｕｌｌｅｔｉｎ １， ５１０ （２０１２））。

本発明では、濃度を知っている分析試料において前記一つまたはそれ以上の生体分子を分析するために、前記設計核酸にＤＰＯプライマー技術とＰｉｔｃｈｅｒ＆Ｃａｔｃｈｅｒ技術を実現することができるように製作する方法を提供する。

設計核酸構造［一般式Ｉ］において、前記Ｐ１領域は、ＤＰＯ順方向プライマーと相補的な結合をする一部または全体として構成し、前記Ｐ３領域は、ＤＰＯ逆方向プライマーと同じ塩基配列を一部または全体として構成し、前記Ｎｖ領域は、Ｔａｇｇｉｎｇ ｐｏｒｔｉｏｎのあるＰｉｔｃｈｅｒプライマーと相補的な結合をする部位を一部または全体として構成する。

本発明は、好ましくは、前記Ｔａｇｇｉｎｇ ｐｏｒｔｉｏｎが相補的に結合する部分と、信号を発生することができるＦＲＥＴプローブをなすｔｅｍｐｌａｔｅ部分を一部または全部として構成したＣａｔｃｈｅｒオリゴマーを提供する。

本発明は、前記設計核酸を前記ＤＰＯ順方向プライマーと前記ＤＰＯ逆方向プライマーで増幅する過程で、前記ＰｉｔｃｈｅｒプライマーのＴａｇｇｉｎｇ ｐｏｒｔｉｏｎが放出され、前記Ｃａｔｃｈｅｒオリゴマーに相補的に結合して伸長しながら信号を発生するようにすることを特徴とする、リガンド−核酸分析方法、キットおよび装置を提供する。

ＴＯＣＥ技術は、一つのチャネルで複数の核酸に対する同時確認が可能である。蛍光シグナル（ｓｉｇｎａｌ）は、リアルタイムで確認することもでき、Ｃａｔｃｈｅｒの融解温度（Ｃａｔｃｈｅｒ−Ｔｍ）を分析してターゲット（Ｔａｒｇｅｔ）の存否を確認することもできる。蛍光分子が付いているＡｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｔｅｍｐｌａｔｅであるＣａｔｃｈｅｒは、各ターゲット（Ｔａｒｇｅｔ）に該当する蛍光シグナル（ｓｉｇｎａｌ）を生成する。Ｃａｔｃｈｅｒ−Ｔｍ値は、Ｃａｔｃｈｅｒの長さまたは塩基配列を変化させて調節することができる。ＴＯＣＥ反応の適合化のために、Ｃａｔｃｈｅｒ−Ｔｍ値はターゲット（Ｔａｒｇｅｔ）の塩基配列とは関係なく簡単に変えることができる。

現在使われているプローブ（ｐｒｏｂｅ）方式のＴｍ分析技法は、目標核酸ＤＮＡに直接結合するのに対し、ＴＯＣＥ方式は、ｃａｔｃｈｅｒを用いて蛍光シグナル（ｓｉｇｎａｌ）を生成するので、Ｃａｔｃｈｅｒの長さまたは塩基配列の変化を調節してＴｍ値を自由に調節することができる。また、従来の方式は、核酸の塩基配列の変化が生じる場合にＴｍ値に差を持つが、ＴＯＣＥ方式は、塩基配列の変化が生じないため一定のＴｍ値を維持する。

このようなユニークなＰｉｔｃｈｅｒ＆Ｃａｔｃｈｅｒ方式によって、単一のチャネル内で多数の核酸検査（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）が正確に行われる。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ過程中にｃｙｃｌｉｃ−ＣＭＴＡ ｐｏｉｎｔを設定して核酸の存否だけでなく、定量的な分析結果を同時に確認することができる。ｃｙｃｌｉｃ−ＣＭＴＡ ｐｏｉｎｔは、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ過程中に３０、４０、５０サイクル（ｃｙｃｌｅ）に設定することができ、結果分析の際に、存在する核酸の量による融解点（ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｅａｋ）の様相に基づいて定量的分析を行うことができる。

Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲで増幅産物の量を測定する方法には、絶対定量（ａｂｓｏｌｕｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）と相対定量（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）がある。絶対定量は、濃度を知っている標準物質を使用して標準曲線を作成し、これを用いて、測定しようとする標的遺伝子の濃度を算出する方法であって、標的遺伝子と標準物質のＰＣＲ効率が同じであるという仮定の下で行われ、より正確な定量のために、標的遺伝子と濃度を知っている内部対照物質とを同時に増幅させて定量する。

一方、特定の標的遺伝子発現の変化を確認するためのｍＲＮＡの定量には、参照遺伝子（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ）と標的遺伝子を使用してそれぞれの標準曲線（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ）を作り、これを用いてそれらの増幅程度を濃度として算出した後、ＰＣＲ間の変異を補償するために参照遺伝子に対する標的遺伝子の比率（標的遺伝子の濃度／参照遺伝子の濃度）を計算する相対定量が用いられる。相対定量が絶対定量に比べてより容易で経済的であるうえ、信頼性のある方法であると思われるが、依然として標準曲線の調製や保管などによる誤りのリスクを内包している。

本発明では、一つのチューブで一つまたはそれ以上の標的生体分子と精度管理および測定用標準物質とを同時に反応させて収穫した複合体にある設計核酸をマルチプレックスリアルタイムＰＣＲ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ）で分析して確保したＣｔ値を用いて、絶対定量と相対定量を行う。

ＰＣＲでは、１サイクルごとにＤＮＡが指数的に増幅してからｐｌａｔｅａｕに達する。この増幅の様子をリアルタイムでモニタリングした図が増幅曲線である。ＰＣＲ増幅産物量が、蛍光で検出可能な量に到達すると、増幅曲線が起こり始め、指数的にシグナル（ｓｉｇｎａｌ）が上昇してからｐｌａｔｅａｕに達する。

初期ＤＮＡ量が多いほど増幅産物量が検出可能な量に達するサイクル数が少なくなるので、増幅曲線が早く現れる。したがって、段階的に希釈した標準試料を用いてリアルタイムＰＣＲ反応を行うと、初期ＤＮＡ量が多い順に同じ間隔で並んだ増幅曲線が得られる。ここで、適切な位置にｔｈｒｅｓｈｏｌｄを設定すると、ｔｈｒｅｓｈｏｌｄと増幅曲線とが交差する位置であるＣｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）が算出される。

Ｃｔ値と初期鋳型量との間には直線的な関係がある検量線を作成することができる。未知の試料についても標準試料と同様にＣｔ値を算出し、この検量線と対照すると、初期鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）量を求めることができる。

本発明において、設計核酸であるアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）の構造が前記一般式（Ｉ）に提示したように同じ構造と同じＰＣＲプライマー対で増幅して、一つまたはそれ以上の標的生体分子と精度管理および測定用標準物質を指し示す設計核酸の増幅効率がすべて同一である（資料未提示）。

本発明では、一つのチューブで一つまたはそれ以上の標的生体分子と精度管理および測定用標準物質とを同時に反応させて収穫した複合体にある設計核酸をマルチプレックスリアルタイムＰＣＲ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ）で分析して確保したＣｔ値を用いて、絶対定量および相対定量を行った。

本発明において、設計核酸であるアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）の構造が前記一般式（Ｉ）に提示したように同じ構造と同じＰＣＲプライマー対で増幅して、前記標的生体分子と精度管理および測定用標準物質を指し示す設計核酸の増幅効率がすべて同一である。

本発明の以下の実施例では、精度管理および測定用の標準物質が人為的に添加された、分析しようとする試料にある標的生体分子によって形成された複合体の設計核酸の存在量は、実施例で得られたＣｔ（ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）値を用いて２^−Ｃｔ法（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｃｔ ｍｅｔｈｏｄ）によって分析した（Ｌｉｖａｋ ＫＪ． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｃｔ Ｍｅｔｈｏｄ． ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ． ２． Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， １９９７．）

本Ｃｔ法では、検量線を作成することなく、定量を行うことができる。但し、測定するすべての生体分子に対してＰＣＲ増幅効率がほぼ一定であることが前提である。

標準物質が添加された分析しようとする試料から分析された標的生体分子の複合体の設計核酸のＣｔ値を標準物質複合体の設計核酸のＣｔ値に正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）（Ｃｔ_{標的生体分子}−Ｃｔ_{外部標準物質}）し、これを△Ｃｔ−ｎとすると、標準物質が添加された分析しようとする試料中の標的生体分子の濃度は、次のとおり算出される：
外部標準物質の濃度×２^{−△Ｃｔ−ｎ}

外部標準物質とその特異的リガンドの結合力と、標的生体分子とその特異的リガンドの結合力との間に差がある場合、前記決定された標的生体分子の濃度は、その試料中の濃度をまともに反映することができないこともある。よって、その結合力の差で補正することが好ましい。

このような補正のために、まず、標的生体分子と標的外部標準物質を定量して、これらを同じ濃度で含む対照試料を一つ以上準備し、この対照試料（ら）を用いて標的生体分子に対する複合体の設計核酸の増幅物から算出されたＣｔ値（または対照試料が２以上である場合、それらの値の平均）と外部標準物質複合体の設計核酸の増幅物から算出されたＣｔ値（または対照試料が２つ以上である場合、それらの値の平均）を求め、その差異値（Ｃｔ_{対照試料の標的生体分子}−Ｃｔ_{対照試料の外部標準物質}）である△Ｃｔ−ｃを求める。次に、この値に前記△Ｃｔ−ｎをキャリブレーション（Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）した△Ｃｔ−ｃａｌ（△Ｃｔ−ｎ−△Ｃｔ−ｃ）を求め、△Ｃｔ−ｃａｌで次の式のように外部標準物質の濃度から標的生体分子の濃度を求めると、前記結合力の差が反映された結果を得ることができる。
外部標準物質の濃度×２^{−△Ｃｔ−ｃａｌ}

よって、分析しようとする試料中の標的生体分子は、外部標準物質の濃度よりも２^{−△Ｃｔ−ｃａｌ}倍高い濃度で存在するといえる。

また、前記標的生体分子に応じて前記設計核酸の長さを決定して前記標的生体分子を設計核酸の長さで指し示すようにすることにより、前記設計核酸の長さを決定する方法を用いて、相応する標的生体分子を分析することができ、好ましくは、前記設計核酸増幅産物の長さで一つまたはそれ以上の前記標的生体分子の定性および定量分析を同時に行うことができる。

濃度を知っている標準物質を含む分析しようとする試料において標準物質および一つまたはそれ以上の標的生体分子を分析するために、これらに相応する長さが異なる設計核酸を製作し、これらを標準物質および標的生体分子と結合するリガンドに結合させて分析リガンドを準備した後、分析しようとする試料と分析リガンドとを反応させ、収穫した標準物質および標的生体分子複合体の設計核酸を鋳型としてユニバーサルＰＣＲプライマー対でＰＣＲを行うと、増幅産物を合成することができる。前記増幅産物の長さの分析結果から、標準物質の設計核酸の分析結果を用いて、増幅産物の長さに相応する一つまたはそれ以上の標的生体分子の存否および存在量を決定することができる。

好ましくは、複合体の設計核酸のＰＣＲに使用するプライマー対は、ユニバーサルプライマー対であり、そのうちのいずれか一つのプライマーに標識物質たる蛍光物質で標識して増幅産物を標識する。

本発明において、前記標識物質は、ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）、Ｃｙ２、ＧＦＰ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯＹＯ−１、Ｃａｌｃｅｉｎ、ＦＩＴＣ、ＦｌｏｕｒＸ、ＡＬＥＸＡ ４８８、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １１０、ＡＢＩ ５−ＦＡＭ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５００、Ｏｒｅｇｏｎ ｇｒｅｅｎ ４８８、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯＴＯ−１、ＡＢＩ ＪＯＥ、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、Ｄｉｌ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、Ａｌｅｘａ ５４６、ＴＲＩＴＣ、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｒ＆Ｂ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ、Ｐｙｒｏｎｉｎ Ｙ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ、ＡＢＩ ＴＡＭＲＡ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ、Ｃｙ３．５、ＡＢＩ ＲＯＸ、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｃｒｉｍｓｏｎ、Ａｌｅｘａ ５９４、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯＹＯ−３、Ｒ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、Ｃ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯＴＯ−３、ＤｉＤ ＤｉｌＣ（５）、Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｉｎｉｅ、Ｃｙ５．５、Ｃｙ５およびＣｙ３の中から選ばれる蛍光色素を使用することができる。

好ましくは、前記増幅産物の大きさをゲル電気泳動もしくはキャピラリー電気泳動（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）方法を用いて決定した後、前記標的生体分子の存否および存在量を分析することができる。

本発明は、設計核酸および標準物質を用いて分析しようとする試料から一つまたはそれ以上の標的生体分子を分析するために、前記標準物質の種類および前記生体分子−リガンド複合体の収穫方法を考慮して構成したリガンド−核酸分析方法、キットおよび装置を提供する。

好ましくは、本発明は、前記標的生体分子を、生体分子からなる試料から精度管理および測定用の標準物質を用いて核酸の分析技術によって分析するために、前記試料から前記標的生体分子を分析する分析試料を製造する段階と、前記標準物質または標的生体分子のリガンドおよび設計核酸を製造する段階と、一つのチューブで前記リガンドおよび設計核酸と前記分析試料とを反応させて形成された前記標準物質または標的生体分子複合体を収穫する段階と、前記収穫された標準物質または標的生体分子複合体の設計核酸を増幅して、増幅産物の塩基配列または長さを分析する段階と、前記増幅産物の分析結果から前記標的生体分子を分析する段階とを含むことを特徴とする、リガンド−核酸分析方法、キットおよび装置を提供する。

本発明の生体分子分析方法をより効率よく行うために、分析しようとする試料を準備する試料処理装置と、前記試料と前記分析リガンド、前記収穫リガンドおよび前記標準物質とを反応させて形成された分析リガンド−生体分子−収穫リガンド複合体および標準物質を製造し、複合体に含まれている設計核酸および標準物質を増幅するモジュールと、前記増幅産物を分析するモジュールなどとを含む、リガンドＰＣＲを用いた生体分子分析装置において、本発明の装置およびシステムは、混合チャンバー、溶解チャンバーおよび反応チャンバーからなる試料処理装置、および増幅装置から構成され、これらが統合されて運営されることも可能である。

リガンド−核酸分析方法を用いた生体分子分析装置およびシステムは、核酸増幅および分析技術を利用した設計核酸を分析する方法によって実施することを特徴とし、前記標的生体分子を含む試料から生体分子を準備する試料処理装置と、前記試料と前記分析リガンド、前記収穫リガンド、前記標準分析リガンドおよび前記標準収穫リガンドとを反応させて形成された分析リガンド−生体分子−収穫リガンド複合体および標準分析リガンド−標準物質−標準収穫リガンド複合体を製造し、洗浄した後、これらの複合体の設計核酸を増幅するモジュールと、前記増幅産物を分析するモジュールとを含んでなるリガンド−核酸分析装置およびシステムである。

関心対象の生体分子を分析しようとする試料の分析は、一連の試料準備段階を伴い、混合チャンバーと溶解チャンバーから構成される試料処理装置で行われる。これらの段階は、濾過、細胞溶解、核酸および試薬との混合を含むことができる。

本発明の好適な実施形態によれば、好ましくは、細胞からなる生体試料で細胞を可溶化させて生体分子を製造し、追加の段階を公知の方法で行うことができる。

好ましくは、ＥＬＩＳＡで使用する、プレートを用いて製造された分析リガンド−生体分子複合体および標準分析リガンド−標準物質の分離方法は、まず、前記試料における標的生体分子および標準物質を支持体に結合させた後、分析リガンドを反応させて生体分子−分析リガンド複合体を製造し、洗浄段階を行って未結合分析リガンドを除去することにより、精製された複合体を準備することができる。

前記分析試料、分析リガンド、収穫リガンド、標準分析リガンドおよび標準収穫リガンドを反応させて分析リガンド−生体分子−収穫リガンド複合体および標準分析リガンド−標準物質−標準収穫リガンド複合体を製造し、様々な方法で製造された複合体を収穫リガンドおよび標準収穫リガンドの磁性を利用して磁石によって収穫し、洗浄段階を行って未結合分析リガンドおよび標準分析リガンドを除去することにより、精製された複合体を準備することができる。

前記分離された標準分析リガンド−標準物質−標準収穫リガンド複合体および分析リガンド−生体分子−収穫リガンド複合体の設計核酸に対して、一般的な核酸分析方法で核酸の定量分析を行うことができる。そして、分析された結果から、標的生体分子が含まれている生体試料における標的生体分子の生物学的意味を決定することもできる。

試料は、例えば、培養された細胞、タンパク質、核酸またはこれを含む生物学的医薬剤、または細胞、胞子、微生物およびウイルスからなる群、または精巣（ｔｅｓｔｉｓ）から得た組織（ｔｉｓｓｕｅ）、血液（ｂｌｏｏｄ）、血漿（ｐｌａｓｍａ）、血清（ｓｅｒｕｍ）、尿液（ｕｒｉｎｅ）、唾液（ｓａｌｉｖａ）、汗（ｓｗｅａｔ）、***（ｓｅｍｅｎ）または粘液（ｍｕｃｕｓ）などの体液（ｂｏｄｙ ｆｌｕｉｄ）であり、これに限定されるものではなく、選択される標的生体分子を含有するものである。この標的試料は、少なくとも二つまたはそれ以上の標的生体分子を含む。上記の方法は、試料と試料調製対照群とを混合する混合チャンバーを有する装置内に試料を導入する段階を含む。試料調製対照群はタンパク質、細胞、胞子、微生物およびウイルスよりなる群から選択され、この試料調製対照群は精度管理物質を含む。前記装置は、また、溶解チャンバーと反応チャンバーを備える。試料は混合チャンバーで試料調製対照群と混合される。

増幅装置の反応容器の反応チャンバー内の反応混合物は、設計核酸増幅条件に晒される。反応を用いたＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型の増幅は公知になっている［米国特許第４，６８３，１９５号；米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ． ａｌ．， １９９０）］。ＤＮＡの核酸増幅は、ＤＮＡを熱変性させる段階、増幅されるＤＮＡ断片に側接する配列に２つのオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングする段階、アニーリングされたプライマーをＤＮＡポリメラーゼによって延長させる段階からなるサイクルの繰り返しを伴う。プライマーは、標的配列の対向する鎖（ｓｔｒａｎｄ）に交配される一方で、ポリメラーゼによるＤＮＡ合成がプライマー間の領域にわたって行われるように配向されることで、ＤＮＡ断片の量を効果的に倍増する。また、拡張生成物は、補完的であり、プライマーを結合することができるため、個々の連続的なサイクルは、以前サイクルで合成されたＤＮＡの量を実質的に倍増する。これは、サイクルあたり２ｎ（ここで、ｎはサイクル数）の比率で特定の標的断片の指数的蓄積をもたらす。増幅反応およびリガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＬＣＲ）などの方法が直接標的ＤＮＡ配列の核酸配列を直接増幅させることに使用できる。等温増幅反応がまた公知になっており、本発明の方法に基づいて使用できる。

設計核酸増幅反応は、好ましくは、反応容器内の反応混合物を増幅反応に必要な温度に加熱および／または冷却させる熱処理装備を用いて行う。このような熱処理装備は、また、試料調製対照群の標準物質核酸配列、および試料でテストするための一つ以上の標準物質核酸配列を検出する一つ以上の検出機構を含むことができる。反応容器内の核酸配列を増幅および検出するための光学検出器が内蔵された好ましい熱処理装備（米国特許第６，３６９，８９３号；米国特許第６，３９１，５４１号）を使用することができる。また、反応混合物の温度を制御し、この反応混合物から核酸配列を検出するために、本発明に適した多くのその他の公知の方法がある。

増幅生成物の検出のための他の好ましい方法として、蛍光プローブは、蛍光レポーター色素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｄｙｅ）すべてによって標識化されたオリゴヌクレオチドからなる。捕捉プローブの***は、レポーター色素の蛍光強度の増加を発生させる。

流体制御装置は、所望のプロトコルに従ってコンピュータによって制御できる。単一のバルブを使用すると、唯一つの失敗要因により高い製造歩留まりを生成することができる。流体制御および処理構成部材の統合は、コンパクトな装置（例えば、小型カートリッジ形態）を得ることができ、成形および組立の自動化を容易にする。前述したように、このようなシステムは、有利には、希釈および混合能力、中間洗浄能力および確かな加圧機能を含むことができる。システム内の流体経路は、システム内の流体の汚染を最小限に抑え且つそのような流体の収容および制御を容易にするために、通常閉鎖される。反応容器は、取り外しおよび交換可能であり、いくつかの実施形態では廃棄可能である。

生体試料である血液を用いて、癌を始めとする慢性疾患を検診している。特に癌検診の検査は、患者モニタリング用生体分子を５〜６個検査し、結果のｃｕｔ−ｏｆｆ値のみを参照するので、診断には限界がある。慢性疾患は、様々な遺伝子の変異により生成される疾病であり、その代表的な例が癌であるが、一つのマーカーで癌の効果的な検診には限界があるので、実際に、既存の血液検査では癌患者の３０〜４０％程度を見つける程度に過ぎない。

複数の標的生体分子を定量検査し、その結果に基づいて、健常者集団と癌集団との関数関係を定量的に分析して診断することができる方法である体外診断多指標検査（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ Ｉｎｄｅｘ Ａｓｓａｙｓ；ＩＶＤＭＩＡ）は、生物学的意味の疾病や異なる状態を診断、治療、緩和、処置および予防する目的で解釈関数を用いて患者の特異的結果から分類、評価、指数などを算出するための複数の結果の結合装置を使用する。

本発明において、前記リガンド−核酸分析方法で生産された生体分子分析情報を利用した生物的な意味を決定する臨床意思決定支援システムは、例示的に診断および疾病に対する高危険群選定であるが、これに限定されるものではない。

本発明が解決しようとする技術的課題を達成するために、リガンド−核酸分析方法による前記標準物質と前記標的生体分子分析結果を用いて、試料、または試料を採取した患者から標的生体分子生物学的意味を決定する方法において、（Ａ）前記試料から前記リガンド−核酸方法で前記標準物質を用いた精度管理をしながら測定用の標準物質で前記標的生体分子分析結果を生成する段階と、（Ｂ）前記生体分子分析結果を、意思決定木を利用したアンサンブル技法のｐａｒｔｉａｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ ｐｌｏｔないしはｐａｒｔｉａｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ関数関係を用いて変換し、変換された生体分子分析結果を生成する段階と、（Ｃ）前記変換された生体分子分析結果を、予め設定された生物学的意味決定モデルに入力して、前記試料別生物学的意味情報を生成する段階とを含むことを特徴とする、生物学的意味を決定するリガンド−核酸分析を利用した生物学的意味を決定する臨床意思決定支援システムを提示する。

前記生物学的意味決定モデルはロジスティック回帰モデルであることが好ましい。

前記ロジスティック回帰モデルはリッジペナルティ（Ｒｉｄｇｅ Ｐｅｎａｌｔｙ）を使用したことが好ましい。

前記アンサンブル技法は、ＢｏｏｓｔｉｎｇおよびＲａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔのいずれかの方法であることが好ましい。

前記生物学的意味決定情報は、標的生体分子別の生物学的意味決定寄与度についての情報をさらに生成するものであり、前記標的生体分子別の生物学的意味決定寄与度は、前記生物学的意味決定モデルに含まれている少なくとも一つの個別標的生体分子に対してロジスティックモデルで求めた、所定の判別関数を用いて生物学的意味に及ぼす影響の程度を提供することが好ましい。

前記標的生体分子別の疾病生物学的意味決定寄与度はｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｌｏｔの形で提示されることが好ましい。

前記標的生体分子抗体を含む生物学的意味分析キットにおいて、前記標的生体分子別分析情報を生成する第３システムで実施されるか、或いは前記第３システムと有線または無線ネットワークで接続され、前記第３システムから前記標的生体分子別分析情報の伝送を受ける生物学的意味決定システムで実施されることが好ましい。

本発明が解決しようとする技術的課題を達成するために、前記標的生体分子を活用して前記生物学的意味決定モデルを生成する方法において、（Ａ）複数の患者と複数の健常者から構成される対象者を対象に、対象者の血液、血漿、血清またはその他の対象者の身体から分離した採取物質から複数の標的生体分子別分析情報を生成し、前記生成された分析情報に対して所定の変換を行う段階と、（Ｂ）前記対象者の中から選択された一部の対象者をモデル生成対象者群にして、前記変換された標的生体分子別分析情報として意思決定木を活用して複数の分類器（ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）を生成し、前記生成された複数の分類器を接合して、少なくとも一つの標的生体分子が参加する複数の生物学的意味決定モデル候補を生成する段階と、（Ｃ）前記対象者のうち、モデル生成対象者群に含まれていない対象者をモデル検証対象者群にして、モデル検証対象者の変換が行われた前記標的生体分子別分析情報として前記生物学的意味決定モデル候補に入力し、前記モデル検証対象者別生物学的意味決定情報を生成する段階と、（Ｄ）前記生物学的意味決定情報に対する所定の評価を行い、所定の評価指標を満たす生物学的意味決定モデルを選別する段階とを含むことを特徴とする、変換された標的生体分子別分析情報を使用する前記標的生体分子を活用した生物学的意味決定モデルを生成する方法を提示する。

前記分析情報には、少なくとも一対の標的生体分子別分析結果比率情報がさらに含まれることが好ましい。

前記所定の変換を行うことは、前記分析情報を、意思決定木を用いたアンサンブル方法のｐａｒｔｉａｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ ｐｌｏｔないしはｐａｒｔｉａｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ関数関係を用いて変換することであることが好ましい。

前記生物学的意味決定モデルはロジスティック回帰モデルであることが好ましい。

前記所定の評価指標は、精確度、特異度、感度、およびＲＯＣカーブの面積のうちの少なくとも一つであることが好ましい。

前記アンサンブル技法は、ＢｏｏｓｔｉｎｇおよびＲａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔのうちのいずれかの方法であることが好ましい。

前記生物学的意味決定情報は、標的生体分子別生物学的意味決定寄与度についての情報をさらに生成するものであり、前記標的生体分子別生物学的意味決定寄与度は、前記生物学的意味決定モデルに含まれている少なくとも一つの個別標的生体分子に対してロジスティックモデルで求めた所定の判別関数を使用して癌への影響の程度を提供するものであることが好ましい。

本発明が解決しようとする技術的課題を達成するために、分析キットを直接用いて、或いは前記分析キットから得られる分析情報を用いて、生物学的意味決定予測を行う生物学的意味決定予測システムにおいて、（Ａ）対象者の血液、血漿、血清、または対象者の身体から分離したその他の採取試料から測定された前記標的生体分子の組み合わせを構成する標的生体分子別に分析情報または分析結果比率情報を入手する情報入手モジュール、（Ｂ）前記分析情報または分析結果比率情報に対して所定の少なくとも一つ以上の変換モジュール、および前記入手された前記分析情報または分析結果比率情報を所定の生物学的意味決定予測モデルで処理する生物学的意味決定予測モジュール、および（Ｃ）前記生物学的意味決定予測モジュールから少なくとも一つの生物学的意味決定予測情報を生成する生物学的意味決定予測情報生成モジュールを含み、前記変換モジュールは、前記分析情報に対する分析結果変換情報または前記分析結果比率情報に対する分析結果比率変換情報をまず生成するものであり、前記生物学的意味決定予測モデルは、前記生成された分析結果変換情報または前記分析結果比率変換情報を入力値として受けることを特徴とする、生物学的意味決定予測を行う生物学的意味を決定する臨床意思決定支援システムを提示する。

前記情報入手モジュールが前記標的生体分子別に分析情報または分析結果比率情報を入手する方法は、（Ａ）前記生物学的意味予測システムが前記生物学的意味分析キットから直接入手する方法、（Ｂ）前記生物学的意味決定予測システムと有線または無線ネットワークを介して接続された前記分析キットの前記標的生体分子別分析情報を生産することができる第３システムから伝送される方式で入手する方法、および（Ｃ）前記生物学的意味決定予測システムと有線または無線ネットワークで接続された前記標的生体分子別分析情報を入手する者のコンピュータから伝送される方式で入手する方法のうちの少なくとも一つの方法が実施されることが好ましい。

前記変換モジュールは、ｔｒｅｅを用いたアンサンブル技法のｐａｒｔｉａｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｐｌｏｔまたはｐａｒｔｉａｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ関数関係を利用して、分析結果変換情報または分析結果比率変換情報を生成することが好ましい。

前記生物学的意味決定予測モデルは、ロジスティックモデルであり、前記ロジスティックモデルは、前記分析結果変換情報または前記分析結果比率変換情報の入力を受け、癌として分類される確率値を推定する所定の関数式であることが好ましい。

前記生物学的意味決定予測情報生成モジュールは、標的生体分子別疾病分析寄与度についての情報をさらに生成するものであり、前記標的生体分子別疾病分析寄与度は、前記標的生体分子の組み合わせに含まれている標的生体分子に対してロジスティックモデルで求めた所定の判別関数を使用して癌への影響の程度をｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｌｏｔの形で提示されることが好ましい。

本発明が解決しようとする技術的課題を達成するために、生物学的意味決定のための少なくとも２つの標的生体分子を含む前記標的生体分子情報を処理する生物学的情報決定統計モデルに関連する標的生体分子別変数値処理方法において、（Ａ）少なくとも２つの試料に対して各試料ごとに前記標的生体分子別オリジナル変数値を入手する段階と、（Ｂ）前記標的生体分子別オリジナル入力変数値で所定の処理を行い、前記標的生体分子別ｐａｒｔｉａｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｐｌｏｔまたはｐａｒｔｉａｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ関数関係を構成する段階と、（Ｃ）前記標的生体分子別ｐａｒｔｉａｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｐｌｏｔまたはｐａｒｔｉａｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ関数関係を利用して前記標的生体分子別オリジナル変数値に対する前記標的生体分子別変換変数値を生成する段階と、（Ｄ）前記標的生体分子別変換変数値を所定の生物学的意味決定統計モデルの生成または生物学的意味決定統計モデルの実行に使用する段階とを含むものであり、前記ｐａｒｔｉａｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｐｌｏｔまたはｐａｒｔｉａｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ関数関係は、アンサンブル技法を活用したものであり、前記アンサンブル技法は、Ｂｏｏｓｔｉｎｇアルゴリズム技法およびＲａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔアルゴリズム技法のうちの少なくとも一つの技法であることを特徴とする、標的生体分子別変数値処理方法を提示する。

前記標的生体分子別ｐａｒｔｉａｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｐｌｏｔまたはｐａｒｔｉａｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ関数関係を構成することは、前記標的生体分子を構成する標的生体分子のうち、前記標的生体分子を除いた他の標的生体分子に対するオリジナル変数値に対して平均を取る方式で構成することであることが好ましい。

前記オリジナル変数値は、前記標的生体分子別分析情報または２つ以上の標的生体分子の分析結果比率程度のうちの少なくとも一つであることが好ましい。

本発明が解決しようとする技術的課題を達成するために、生物学的意味決定のための少なくとも２つの標的生体分子を含む前記標的生体分子情報を処理する生物学的意味決定統計モデルに関連した標的生体分子別影響力情報処理方法において、（Ａ）前記標的生体分子を構成する個別標的生体分子別に影響力情報を生成する段階と、（Ｂ）前記標的生体分子を構成する個別標的生体分子別に影響力情報を個別標的生体分子別に視覚化する情報を生成する段階とを含み、前記個別標的生体分子別の影響力は、ロジスティックモデルから求めた判別関数で決定されるものであり、前記判別関数は下記［一般式２］で表されるものであり、前記ロジスティックモデルは０と１の間の値を有し、前記ロジスティックモデルに含まれている回帰係数の推定はｒｉｄｇｅ関数を使用することであることを特徴とする、前記標的生体分子に対する影響力情報処理方法を提示する。

［一般式２］

前記ｇ（ｘ）は、ｐａｒｔｉａｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｐｌｏｔまたはｐａｒｔｉａｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ関数関係を利用して前記標的生体分子別オリジナル変数値に対する前記標的生体分子別変換変数値を使用するものであることが好ましい。

前記視覚化は、２次元平面のチャートまたはグラフで表示されることであることが好ましい。

また、本発明では、リガンド−核酸分析方法で生産された前記生体分子分析情報を用いた生物的な意味分析のためのシステムの構成は、（Ａ）対照群の臨床情報を標準として前記生体分子分析結果の入力を受け、データベースを構築するモジュール、（Ｂ）前記入力された生体分子分析結果を用いて分析システムで前処理を行うモジュール、前記前処理された結果から患者のモデルを生成するモジュール、（Ｃ）前記生成されたモデルをロードし、来院した患者に適用してブラインドテスト（Ｂｌｉｎｄ ｔｅｓｔ）による診断を行うモジュール、および（Ｄ）交差検定によってシステムの性能を評価するモジュールを含むことを特徴とする、生物学的意味を決定する方法および臨床意思決定支援システムを提供する。

本発明で生成される多くの生体分子の分析結果は、高次元の特性を有する膨大な量の情報から細胞、組織または疾病に関連した様々な情報を生産することができる。前記入力されたデータを用いて分析システムで前処理を行うモジュールは、患者の状態に影響を及ぼす特徴を見つけ、分類性能を向上させるための多変量分析方法は、正確な治療と診断のために重要変数を見つけて次元を縮小するか、或いは特性の変形によって主要特質を見つける特徴抽出（Ｆｅａｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）手続きである。

特質抽出は、細部的にクラス情報を学習に使用するかどうかによって、無監督学習（Ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ Ｌｅａｒｎｉｎｇ）方式または監督学習（Ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ Ｌｅａｒｎｉｎｇ）方式がある。無監督学習方式に主に活用されているＰＣＡ（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）またはＩＣＡ（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）は、変数の特性を考慮して特質を抽出することができる。監督方式は、クラス情報と変数間の統計的な有意性、または変数間の相関関係を活用して変数を選択する方式である。この方式は、与えられた特質集合に対して、前方向（Ｆｏｒｗａｒｄ）または後方向（Ｂａｃｋｗａｒｄ）に特質を順次追加または除去しながら、分類器に適用させた性能によって主要特質を算出することができる。

前記前処理された結果をもって学習を行うことで患者のモデルを生成するモジュールは、選択された特質を適切な分類器（Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）によって各クラス別に分類するための手続きである。

本発明で人工ニューラルネットワーク（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ）を使用したが、入力と出力に基づいて行動を決定する特性のために、パターン認識、関数近似、分類技法などの様々な分野で応用されている。人工ニューラルネットワークの構造は、複数の層（ｌａｙｅｒｓ）、ノード（ｎｏｄｅｓ）、ニューラルネットワーク間の接続重みから構成される。本発明で使用するニューラルネットワーク層間の接続方式はフィードフォワード（Ｆｅｅｄ−ｆｏｒｗａｒｄ）方式である。入力パターンに応じて各ノードに対するニューラルネットワークの接続重みと活性化関数を用いて出力値を算出した。生成された結合情報を用いてあるタスクを処理したときに推定した値と実際の結果値とが異なる場合には、算出された値を実際の結果値と比較して誤差を減らす過程を繰返し行って見つける方式である。

前記患者のモデルを生成する方法は、線形モデル（ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅｌｓ）、サポートベクターマシン（ｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｃｔｏｒ ｍａｃｈｉｎｅｓ）、ニューラルネットワーク（ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ）、分類および回帰ツリー（ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｔｒｅｅｓ）、アンサンブル学習法（ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｌｅａｒｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ）、判別式分析（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）、最近傍法（ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｅｔｈｏｄ）、ベイジアンネットワーク（Ｂａｙｅｓｉａｎ ｎｅｔｗｏｒｋｓ）、および独立成分分析（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｎａｌｙｓｉｓ）よりなる群から選択されることを特徴とする、生体分子分析方法および装置を提供する。

正確かつ総合的なメカニズム（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）が明らかにされていない大多数の疾患については、事例をベースとする診断の重要性が非常に大きいといえる。しかし、特定の機械学習技法に局限して考案された既存の事例ベースの機械学習推論システムは、正確度が低いため、改善されたシステムの開発が継続的に求められている。また、従来のシステムは、学習された臨床検査項目をすべて利用した疾患判別機としてのみ考案されており、各疾患別臨床検査項目の重要度や優先順位を活用することができる方法を提供していない。

本発明は、医師の正確な疾患診断を支援するための事例ベースの機械学習推論を利用した疾患診断および検査項目選定システムに関するもので、患者の事例データベース（Ｄａｔａｂａｓｅ）を介して訓練された人工ニューラルネットワーク（Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ）から構成した機械学習器である疾患判別器によって新規患者の検査情報を分析して疾患を判別し、予備診断による各疾患の最終判別のための最小の重要検査項目を選定して提供するシステムに関するものである。機械学習推論を利用した疾患診断技法は、機械学習技法を個別に適用して構成している。前記患者のモデルを生成する方法は、線形モデル（ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅｌｓ）、サポートベクターマシン（ｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｃｔｏｒ ｍａｃｈｉｎｅｓ）、ニューラルネットワーク（ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ）、分類および回帰ツリー（ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｔｒｅｅｓ）、アンサンブル学習法（ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｌｅａｒｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ）、判別式分析（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）、最近傍法（ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｅｔｈｏｄ）、ベイジアンネットワーク（Ｂａｙｅｓｉａｎ ｎｅｔｗｏｒｋｓ）、独立成分分析（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｎａｌｙｓｉｓ）などがある。

本システムの構成および実務における応用は、２つに分けて構成することができるが、診断のみのための独立した（ｓｔａｎｄ ａｌｏｎｅ）形態の診断システムと既存の病院情報システム、すなわちＯＣＳ、ＰＡＣＳ、ＬＩＳなどと連携した統合システムから構成することができる。統合システムとの連動のためには、ＨＬ７およびＤＩＣＯＭ規約に基づいてシステムを構成しなければならない。本システムは、初期モデルであって、ＰＭＳ（Ｐａｔｉｅｎｔ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）と連動して診断の正確度を高めた。また、ＰＭＳだけでなく、ＯＣＳ、ＥＭＲ、ＰＡＣＳなどの様々な医療情報システムと連動したシステムとして開発し、様々な疾患因子を含んでいるより正確な診断システムとして開発することができる。

本発明において、前記生体試料は、細菌、真菌類、ウイルス、細胞株および組織よりなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法および装置を提供する。

以下、添付図面と実施例を参照して、本発明に係る精度管理および測定用の標準物質および設計核酸の製造方法、およびこれらを用いた一つまたはそれ以上の生体分子から構成された試料にある生体分子リガンドＰＣＲ分析方法を詳細に説明する。以下の具体例は、本発明を例示的に説明するものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１．標的生体分子と精度管理および測定用外部標準物質
患者の急性心筋梗塞を正確に診断し、迅速な診断のための特異性と感度の高い診断用バイオマーカー、すなわち、急性心筋梗塞特異マーカーの発掘が求められている。

これまで患者の血液から急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の診断のために使用される公知のＡＭＩ診断マーカーとしては、ミオグロビン（ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ）、ＣＫ−ＭＢ、トロポニンＩ（ＴｒｏｐｏｎｉｎＩ）、トロポニンＴ（ＴｒｏｐｏｎｉｎＴ）などがある。心筋梗塞、特に急性心筋梗塞は、胸痛の発生後６時間以内に処置をしなければ死亡につながるので、迅速な診断が非常に重要である。

敗血症は、様々な臓器不全を伴う重症敗血症に進む可能性があり、ひどい場合、難治性低血圧を示す敗血症ショックにつながるので、致命的な結果をもたらすことができる。よって、敗血症の診断、重症度判定および経過観察には速く、鋭敏で、特異的なマーカーが求められる。感染や組織損傷などにより現れる炎症反応は、時間経過に伴う一連の過程であって、局所的に開始して、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）−６をはじめとするサイトカインが分泌され、肝から急性期反応物質が生成される。炎症または感染の診断には、臨床的な症状や兆候だけでなく、客観的なマーカーの役割が重要であるが、現在までに知られているマーカーとしては白血球数（好中球や未成熟画分を含む）、Ｃ反応性タンパク（Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＲＰ）、プロカルシトニン（ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ、ＰＣＴ）、およびＩＬ−６、ＩＬ−１０やＴＮＦ−αなどが挙げられる。

本発明で使用した標的生体分子は、急性心筋梗塞の指標であるミオグロビン（ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ；Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）、ＣＫ−ＭＢ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）、トロポニンＩ（ＴｒｏｐｏｎｉｎＩ；Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）、トロポニンＴ（ＴｒｏｐｏｎｉｎＴ；Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）、および敗血症の指標であるＣ反応性タンパク（Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＲＰ；Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）、プロカルシトニン（ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ、ＰＣＴ；Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）、ＩＬ−６（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）、およびＩＬ−１０（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）などのタンパク質である。

また、精度管理および測定用の標準物質は、大腸菌タンパク質であるＥ．ｃｏｌｉ Ｅｎｏｙｌ−ＡＣＰ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、中国）と植物タンパク質であるＰｈｏｔｏｔｒｏｐｉｎ２（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ Ｃｏ． Ｌｔｄ．、日本）である。

実施例２．設計核酸およびＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅの準備
精度管理および測定用の標準物質がある試料における一つまたはそれ以上の標的生体分子を、これらに相応するリガンドおよび設計核酸を用いるリガンド−核酸分析方法で分析するために、本発明で提案する設計核酸の基本構成は、次の一般式（Ｉ）で表されることを特徴とする方法：

５’−Ｎ−Ｐ１α−Ｎ_Ｖ−Ｐ３β−３’ （Ｉ）

前記一般式（Ｉ）において、Ｐ１領域は、順方向プライマーと完全に相補的に結合する部分であり、５’末端の反応性基Ｎは、アミン基があって、標的生体分子と結合する物質であるリガンドに連結される部分がある。好ましくは、設計核酸は、順方向プライマーが結合する塩基配列部分の上位（ｕｐｓｔｒｅａｍ）に、約１０個のヌクレオチドからなるスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）があり得る。このスペーサーは、一般式（Ｉ）の構造体に結合したリガンドの立体的な効果により、順方向プライマーとＰ１領域との結合が妨げられることを防止する機能を有する。このスペーサーの塩基配列は５’−ＴＧＡＴＴＧＡＡＴＴ−３’である。

Ｎ_Ｖ領域は、特定の塩基配列またはその長さを用いてリガンドが結合する特定の生体分子（または内部標準物質、外部標準物質）を指し示すことができる塩基配列であって、リガンドに結合する特定の生体分子を検出・分析することができるようにする。好ましくは、その長さは１０〜２００のヌクレオチドである。

Ｐ３領域は、逆方向プライマーが結合する部分である。

αおよびβはヌクレオチドの数を示し、αおよびβは８〜３０の整数である。

好ましくは、前記順方向プライマーと逆方向プライマーは、すべての設計核酸で共通した塩基配列を有するユニバーサルプライマー対を使用することができる。

本実施例で使用するプライマー対を、表１に提示する。

一般式（Ｉ）に提示したように、反応性基、スペーサーおよびユニバーサルプライマー対を考慮して設計された設計核酸は、塩基配列（Ｉ）のとおりである。

５’−ＮＨ_２−ＴＧＡＴＴＧＡＡＴＴ−ＣＧＧＡＡＧＣＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣ Ｎ_Ｖ ＣＡＴＡＡＣＣＣＡＧＡＧＧＴＣＧＡ−３’［（塩基配列（Ｉ）］
ここで、ＣＧＧＡＡＧＣＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣは配列番号１、ＣＡＴＡＡＣＣＣＡＧＡＧＧＴＣＧＡは配列番号２でそれぞれ特定される。

標的生体分子、外部標準物質（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｅｎｏｙｌ−ＡＣＰ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を特定塩基配列で指し示す設計核酸のＮ_Ｖ領域の塩基配列を表２に提示する。

前記外部標準物質および標的生体分子を分析するために、前記設計核酸Ｎ_Ｖ領域を認知して信号を発生させる役割を果たすＴａｑｍａｎプローブの構造および塩基配列は、表３に提示する。

標的生体分子、外部標準物質（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｅｎｏｙｌ−ＡＣＰ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を核酸長さで指し示す設計核酸のＮ_Ｖ領域の塩基配列と長さを、表４に提示する。

実施例３．分析リガンド、収穫リガンド、標準分析リガンドおよび標準収穫リガンドの準備
標的生体分子のそれぞれ異なるエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）に対する２種の単クローン抗体または標的生体分子に結合する多クローン抗体を２つのグループに分け、一つのグループは設計核酸を、もう一つのグループは磁性物質を結合させて、前者は分析リガンドと命名し、後者は収穫リガンドと命名した。また、標準物質の抗体である場合は、設計核酸が結合された抗体を標準分析リガンドと命名し、また磁性物質が結合された抗体を標準収穫リガンドと命名した。

本発明で使用した標的生体分子に対する抗体は、急性心筋梗塞の指標である抗ミオグロビン多クローン抗体（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）、抗ＣＫ−ＭＢ多クローン抗体（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）、抗トロポニンＩ多クローン抗体（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）、抗トロポニンＴ多クローン抗体（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）、および敗血症の指標である抗Ｃ反応性タンパク多クローン抗体（Ｌｉｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）、抗プロカルシトニン多クローン抗体（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）、抗ＩＬ−６多クローン抗体（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）、および抗ＩＬ−１０多クローン抗体（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）などである。

本発明に使用した精度管理および測定用の外部標準物質に対する抗体は、多クローンＥ． ｃｏｌｉ Ｅｎｏｙｌ−ＡＣＰ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ抗体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、中国）および多クローンフォトトロピン１抗体（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ Ｃｏ． Ｌｔｄ．、日本）である。

設計核酸は、実施例２の一般式（Ｉ）および塩基配列（Ｉ）によって提示された塩基配列で注文してオリゴマーを製作した（バイオニア社、韓国）。

Ｔａｑｍａｎプローブを用いて設計核酸の増幅産物を分析するために、実施例２で提示した設計核酸で、アミン基が付いている９種のオリゴマーを注文製作し、それらのいずれか１種のオリゴマーは精度管理および測定用の外部標準物質を指し示し、８種のオリゴマーはそれぞれ８種の標的生体分子を指し示し、その内容は表２のとおりである。

設計核酸の長さを用いて設計核酸の増幅産物を分析するために、実施例２で提示した設計核酸で、アミン基が付いている９種のオリゴマーを注文製作し、それらのいずれか１種のオリゴマーは精度管理および測定用の外部標準物質を指し示し、８種のオリゴマーはそれぞれ８種の標的生体分子を指し示し、その内容は表４のとおりである。

各設計核酸を、各標的生体分子の特異的リガンド（抗体）または精度管理および測定用の外部標準物質の特異的リガンド（抗体）に、Ｔｈｕｎｄｅｒ−Ｌｉｎｋ ｏｌｉｇｏ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｎｏｖａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．、英国）を用いてそのプロトコルに従って結合させた。

１００μＬの６０〜１００Ｍで製作されたオリゴマーをＯｌｉｇｏ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔチューブに添加し、さらに１００μＬの１ｍｇ／ｍｌの抗体をＡｎｔｉｂｏｄｙ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔチューブに添加した後、室温で１時間反応させて活性化させた。前記活性化された反応溶液を、準備されたカラムを用いて脱塩させた後、前記脱塩した設計核酸と抗体を適切な割合で混合して室温で１２〜２４時間反応させた。Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ Ｒｅａｇｅｎｔを前記設計核酸−抗体反応溶液に添加して１０分間反応させ、１５，０００ｇで５分間遠心分離して収穫された設計核酸−抗体構造体にＣｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ Ｒｅａｇｅｎｔを添加した後、再度遠心分離することにより、精製された前記設計核酸−抗体構造体を収穫した。

こうして収穫された１８種の設計核酸−抗体構造体は、抗体が標的生体分子の抗体である場合には分析リガンドとし、精度管理および測定用の標準物質の抗体である場合には標準分析リガンドとする。

Ｔａｑｍａｎプローブを用いて設計核酸の増幅産物を分析するために、磁性物質と８種の標的生体分子の抗体と１種の精度管理および測定用標準物質の抗体との結合は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）を用いてプロトコルに従って実施した。

前記抗体と磁性ビーズとしてのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｅｐｏｘｙを３７℃で１２〜２４時間反応させた後、磁石を用いて収穫した。キットに含まれている洗浄溶液を添加し、再懸濁させ、再び磁石で収穫する方式で洗浄を行って未結合抗体を除去する過程によって、精製されたＤｙｎａｂｅａｄ−抗体構造体を収穫した。収穫されたＤｙｎａｂｅａｄ−抗体構造体において、抗体が標的生体分子の抗体である場合には収穫リガンドであり、精度管理および測定用の外部標準物質の抗体である場合には標準収穫リガンドである。

実施例４．分析用生体試料の準備
精度管理および測定用の標準物質であるＥ． ｃｏｌｉ Ｅｎｏｙｌ−ＡＣＰ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅと標的生体分子は、ＴＢＳ［Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；１５０ｍＭ ＮａＣＩ、２０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＣＩ（ｐＨ７．５）、および０．０２％ＮａＮ_３］中で最終濃度１０ｎｇ／ｍｌにてＰＣＲチューブに準備した。

分析試料は、標準物質と標的生体分子をｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ方法によって様々な量（１ｎｇ／ｍｌ〜１ａｇ／ｍｌ）でＰＣＲチューブに準備した。

実施例５．複合体の形成および磁石を用いた複合体の収穫
４５μＬの前記準備された分析試料溶液をマイクタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ ３９１１；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のウェルに入れた。前記分析試料溶液に５０μＬの０．４５％ ｎｏｎｆａｔ ｄｒｉｅｄ ｍｉｌｋとｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）のあるＴＥＴＢＳ（０．１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０の含まれたＴＢＳ）を添加した。

実施例３で製造された８種の分析リガンド、８種の収穫リガンド、１種の標準分析リガンド、１種の標準収穫リガンドを同量で混合した１０μＬのＴＥＴＢＳを、前記準備された分析試料に添加して、室温で３０分間反応させた。

２５０μＬのＴＥＴＢＳを添加し、磁石を用いて得られた生体分子複合体と標準物質複合体を複数回洗浄した後、最終的に収穫した。収穫した複合体の設計核酸の核酸分析は、実施例７で行った。

実施例６．複合体の形成とＥＬＩＳＡ方法を用いた複合体の収穫
４５μＬの前記で準備された分析試料をマイクタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ ３９１１；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のウェルに入れた。分析試料のあるプレートを４℃で約１５時間処理して生体分子をプレートのウェル（ｗｅｌｌ）の表面に固定させる。２５０μＬのＴＢＳでプレートのウェルを３回洗浄した。

２００μＬの４．５％ ｎｏｎｆａｔ ｄｒｉｅｄ ｍｉｌｋおよびｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を含むＥＴＢＳ（０．１ｍＭ ＥＤＴＡの含まれたＴＢＳ）をそれぞれウェルに添加して、３７℃で８０分間反応させた。各ウェルに１５０μＬのＴＥＴＢＳを添加して５分間反応させる過程を７回繰り返し行った。

前記準備されたウェルに、８種の分析リガンド、標準分析リガンド、０．４５％ ｎｏｎｆａｔ ｄｒｉｅｄ ｍｉｌｋおよびｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）が含まれた５０μＬのＴＥＴＢＳを添加して、室温で４５分間反応させた。各ウェルに２５０μＬのＴＥＴＢＳを添加して１０分間反応させる過程を１５回行って未結合リガンドを除去した。各ウェルをＮａＮ_３のないＴＢＳで３回洗浄することにより、精製された複合体を確保した。確保した複合体の設計核酸の核酸分析は、実施例８で行った。

実施例７．設計核酸の塩基配列を用いた生体分子の分析
設計核酸の塩基配列を用いた精度管理および測定用標準物質の添加された試料における、一つまたはそれ以上の標的生体分子の分析は、設計核酸の塩基配列に相応するＴａｑｍａｎプローブを用いたマルチプレックスリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ）で行った。

マルチプレックスリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応は、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ^ＴＭ（Ｒｏｃｈｅ、スイス）ＰＣＲおよびＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲ ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ、スイス）を使用した。

ＰＣＲ反応液は、２．４μＬの２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２μＬの５ｐｍｏｌｅ／ｌの順方向プライマー、５ｐｍｏｌｅ／ｌの逆方向プライマー、および２．５ｐｍｏｌｅ／ｌのプローブからなるプライマー−プローブ混合物（ｐｒｉｍｅｒ−ｐｒｏｂｅｓ ｍｉｘ）、２μＬのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＤＮＡ ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｍｉｘに滅菌蒸留水を加えて１８μＬを作ってよく混合した後、ガラスキャピラリー（ｃａｐｉｌｌａｒｙ）に移し、収穫した複合体（標準曲線）２μＬを分注した。重合連鎖反応を行う反応物の総体積が２５μＬであるので、標的生体分子と精度管理および測定用の標準物質を検出するプライマーおよびプローブの濃度は、それぞれ０．４μＭ（１２．５ｐｍｏｌｅｓ／２５μＬ）および０．２μＭ（６２．５ｐｍｏｌｅ／２５μＬ）であった。

前記複合体精製および収穫段階を行った後、ＰＣＲを次の条件で行った：（ａ）前変性（ｐｒｅ−ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）段階、９５℃で５分、および（ｂ）４０℃でサイクル、９５℃で１５秒（変性段階）および５６℃で１５秒（アニーリングおよび伸長段階）からなる１サイクル。このとき、マルチプレックスリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を行う反応物の組成は、前記表５に提示されている。

前記マルチプレックスリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応方法は、ＤＮＡポリメラーゼと蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）の原理によってリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応の周期ごとにリアルタイムで施行される蛍光を検出し、定量する方法である。リアルタイムモニター上でＦＡＭ^ＴＭが発色する場合には緑色チャネル（５１０±５ｎｍ）、Ｈｅｘ^ＴＭが発色する場合には黄色チャネル（５５５±５ｎｍ）、Ｃｙ５^ＴＭが発色する場合には赤色チャネル（６６０±１０ｎｍ）、ＲＯＸ^ＴＭが発色する場合にはオレンジ色チャネル（６１０±５ｎｍ）、およびＣｙ５．５^ＴＭが発色する場合には真紅色チャネル（７１２ｌｏｇ ｐａｓｓ）で表示するように指定した。緑色チャネル、黄色チャネル、赤色チャネル、オレンジ色チャネルおよび真紅色チャネルで蛍光を観察した。

各チューブにおける真紅色チャネルの閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）は０．０４と指定し、残りのチャネルの閾値は０．０３と指定した後、Ｃｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）値を確認する。Ｃｔ値が３６未満でピーク（ｐｅａｋ）が観察されると、陽性として判読する。

１０ｎｇｍｌの精度管理および測定用標準物質であるＥ．ｃｏｌｉ Ｅｎｏｙｌ−ＡＣＰ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅを１０倍数ずつ段階的に希釈した。こうして製造した標準物質試料に対して本発明のプライマーおよびプローブを適用してリアルタイムＰＣＲを行い、検出限界を確認した。その結果は図３に示した。

前記リアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ）の結果と比較するために、同一の標準物質を１０倍数ずつ段階的に希釈した後、本発明のプライマーおよびプローブを適用してｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲによって検出限界を確認した。ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲでは、希釈倍数１０^５まで検出限界を示したが、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲでは希釈倍数１０^７まで検出限界を示した。したがって、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲが１０^２だけさらに優れた検出限界を示すことが分かった。図３にはＭｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲの結果を示した。

一つのチューブで精度管理および測定用の標準物質を含む試料における８種の標的生体分子を分析する過程で形成されるこれらの複合体を磁石で収穫した場合、またはＥＬＩＳＡ方法で収穫した場合の両方とも、形成された標準物質複合体の設計核酸をＲｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲして得たカーブを分析した結果に基づいて、本発明によるリガンドＰＣＲで分析しようとする試料において標準物質および標的生体分子の分析が正常に行われることが分かる。

また、上述のように形成され、磁石によって収穫した場合またはＥＬＩＳＡ方法で収穫した場合の両方とも、収穫された標的生体分子複合体の設計核酸をＲｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲして得たカーブと、精度管理および測定用の標準物質に相応するカーブとを比較分析して標的生体分子を定量するか、或いは標準物質／標的生体分子の量的比率を計算することができる。

一つのチューブで８種の急性心筋梗塞に対する標的生体分子複合体と精度管理および測定用の標準物質複合体とを磁石で収穫した場合、およびＥＬＩＳＡ方法で収穫した場合の両方とも、これらに対するプライマー対およびプローブを含む多重生体分子の分析のためのＲｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲは、該当蛍光チャネルで標的生体分子を特異的に確認させた。

標準曲線の精密度評価のために精製されたＰＣＲ産物を１０倍ずつ連続的に希釈して（１０^−４〜１０^−９）、検査内（ｗｉｔｈｉｎ−ｒｕｎ）変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ、ＣＶ）と検査間（ｂｅｔｗｅｅｎ−ｒｕｎ）変動係数を測定した。

検査内変動係数は、一度のｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲの間に各濃度の連続希釈した標的生体分子であるミオグロブリン（Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ）と標準物質であるＡＣＴ１ ＰＣＲ産物をそれぞれ３つに分けて繰り返し測定した。検査間変動係数は、標準物質、Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ、Ｃｒｅａｔｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ＭＢ、Ｃａｒｄｉａｃ ＴｒｏｐｏｎｉｎＩ、Ｃａｒｄｉａｃ ＴｒｏｐｏｎｉｎＴ、ＩＬ１０、ＩＬ６、ＣＲＰ、およびＰＣＴに対するｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ測定によって分析した。

標準曲線は、Ｌｉｇｈｔ−Ｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）自体で連続希釈された初期鋳型濃度のｌｏｇ値（ｙ軸）に対するＣｐ値（ｘ軸）を表示して描かれる。このとき、傾き（ｓｌｏｐｅ）とエラー（ｅｒｒｏｒ）値が与えられ、傾きを用いてＰＣＲの効率（ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ、Ｅ＝１０^{−１／ｓｌｏｐｅ}）を計算した。

標準曲線のＣｔ値を用いた急性心筋梗塞モニタリング用ミオグロブリン（Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ）と標準物質複合体の設計核酸に対する検査内変動係数はそれぞれ０．１２〜０．８４％と０．２０〜１．０５％であり、平均標準偏差（ＳＤ）は０．０９周期であった（表６）。

前記急性心筋梗塞モニタリング用の４種の標的生体分子、すなわち、Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ、Ｃｒｅａｔｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ＭＢ、Ｃａｒｄｉａｃ ＴｒｏｐｏｎｉｎＩ、Ｃａｒｄｉａｃ ＴｒｏｐｏｎｉｎＴおよび標準物質複合体の設計核酸に対する検査間変動係数はそれぞれ０．０７〜０．９２％、０．１２〜０．５５％、０．２５〜０．８１％、０．１２〜０．４４％、０．２６〜０．４９％、０．０５〜０．２９％であり、平均標準偏差は０．９７周期であった。各標的生体分子および設計核酸複合体の設計核酸に対するＰＣＲ効率は、１．９０（Ｒａｎｇｅ、１．６０〜２．１４）、１．７８（Ｒａｎｇｅ、１．６５〜１．８８）、１．７８（Ｒａｎｇｅ、１．６５〜１．８８）、１．８２（Ｒａｎｇｅ、１．６７〜２．００）、１．８０（Ｒａｎｇｅ、１．５０〜２．０３）を示し、分析した複合体の設計核酸間には有意な差を示さなかった（表７）。

前記敗血症モニタリング用の４種の標的生体分子ＩＬ１０、ＩＬ６、ＣＲＰ、ＰＣＴおよび標準物質複合体の設計核酸に対する検査間変動係数はそれぞれ０．２５〜０．４８％、０．３２〜０．５２％、０．２９〜０．４６％、０．２２〜０．４５％、０．０５〜０．２９％であり、平均標準偏差は０．９７周期であった。各標的生体分子および標準物質複合体の設計核酸に対するＰＣＲ効率は１．７２（Ｒａｎｇｅ、１．５４〜２．０７）、１．８３（Ｒａｎｇｅ、１．６２〜２．２７）、１．８２（Ｒａｎｇｅ、１．５９〜２．０５）、１．７９（Ｒａｎｇｅ、１．５２〜２．２７）、１．８０（Ｒａｎｇｅ、１．６０〜２．１５）を示し、分析した複合体の設計核酸間には有意な差を示さなかった（表８）。

本発明では、一つのチューブで一つまたはそれ以上の標的生体分子と精度管理および測定用標準物質とを同時に反応させて収穫した複合体にある設計核酸をＭｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲで分析して確保したＣｔ値を用いて、絶対定量および相対定量を行った。

本発明において、設計核酸であるアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）は、前記一般式（Ｉ）に提示したのと同じ構造であり、同じＰＣＲプライマー対によって増幅する。よって、前記標的生体分子と精度管理および測定用標準物質を指し示す設計核酸の増幅効率がいずれも同一である。

本発明では、精度管理および測定用の標準物質が人為的に添加された分析しようとする試料にある標的生体分子によって形成された複合体設計核酸の存在量は、分析して前記実施例で得られたＣｔ（ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）値を用いて２^−Ｃｔ法（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｃｔ ｍｅｔｈｏｄ）によって分析した（Ｌｉｖａｋ ＫＪ． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｃｔ Ｍｅｔｈｏｄ． ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ． ２． Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， １９９７．）。

本Ｃｔ法では、検量線を作成することなく、定量を行うことができる。但し、測定するすべての生体分子に対してＰＣＲ増幅効率がほぼ一定であることが前提である。

標準物質が添加された分析しようとする試料から分析された標的生体分子の複合体設計核酸のＣｔ値を標準物質複合体の設計核酸のＣｔ値に正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）（Ｃｔ_{標的生体分子}−Ｃｔ_{外部標準物質}）し、これを△Ｃｔ−ｎとすれば、標準物質が添加された分析しようとする試料における標的生体分子の濃度は、次のとおり算出される：
外部標準物質の濃度×２^{−△Ｃｔ−ｎ}

外部標準物質とその特異的リガンドの結合力と、標的生体分子とその特異的リガンドの結合力との間に差がある場合、前記決定された標的生体分子の濃度は、その試料中の濃度をまともに反映することができないこともある。よって、その結合力の差で補正することが好ましい。

このような補正のために、標的生体分子と標的外部標準物質を定量して、これらを同じ濃度で含む対照試料を一つ以上準備し、この対照試料を用いて標的生体分子に対する複合体の設計核酸の増幅物から算出されたＣｔ値（または対照試料が２つ以上である場合、それらの値の平均）と外部標準物質複合体の設計核酸の増幅物から算出されたＣｔ値（または対照試料が２つ以上である場合、それらの値の平均）を求め、その差異値（Ｃｔ_{対照試料の標的生体分子}−Ｃｔ_{対照試料の外部標準物質}）である△Ｃｔ−ｃを求める。次に、この値で前記△Ｃｔ−ｎをキャリブレーション（Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）した△Ｃｔ−ｃａｌ（△Ｃｔ−ｎ−△Ｃｔ−ｃ）を求め、△Ｃｔ−ｃａｌで次の式でのように外部標準物質の濃度から標的生体分子の濃度を求めると、前記結合力の差が反映された結果を得ることができる。
外部標準物質の濃度×２^{−△Ｃｔ−ｃａｌ}

したがって、分析しようとする試料中の標的生体分子は、外部標準物質の濃度よりも２^{−△Ｃｔ−ｃａｌ}倍高い濃度で存在するといえる。

実施例８．設計核酸の長さを用いた生体分子分析
設計核酸の長さを用いた、精度管理および測定用標準物質が添加された試料における一つまたはそれ以上の標的生体分子の分析は、設計核酸の長さを分析することができるキャピララリー電気泳動で行った。

前記実施例において一つのチューブで形成された精度管理および測定用の標準物質複合体と８種の標的生体分子複合体を磁石で収穫した場合、またはＥＬＩＳＡ方法で収穫した場合の両方とも、ＰＣＲを行って増幅産物を確保した。

前記収穫された複合体に、２０μＭのＣｙ５が標識されたユニバーサルＰＣＲ順方向プライマー（５’−Ｃｙ５−ＣＧＧＡＡＧＣＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣ−３）、１０μＭのユニバーサルＰＣＲ逆方向プライマー（５’−ＴＣＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＴＴＡＴＧ−３’）を添加し、３次蒸留水を用いて反応体積を２０μＬに調節した混合液をｐｆｕ−ＰＣＲプレミックス（バイオニア、韓国）を用いて９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒を３５サイクル繰り返し行い、完全な二本鎖核酸を増幅させた。

複合体の設計核酸の増幅産物を核酸長さで分析するために、前記増幅産物に対してキャピラリー電気泳動を行った。キャピラリー電気泳動は、ＡＢＩ ３１３０ＸＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（３６−ｃｍ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ａｒｒａｙおよびＰＯＰ７ ｐｏｌｙｍｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）を用いて、提供されたプロトコルに従って行った。１．０μＬの前記ＰＣＲ反応物を９ＬのＨｉ−Ｄｉ ｆｏｒｍａｍｉｄｅと混合し、８０℃で２分間反応させた後、氷に入れた。試料をキャピラリーに注入し、１．６ｋＶの電圧で１５秒間適用した後、１０ｋＶの電気泳動電圧および６０℃の温度でキャピラリー電気泳動した。

図４は本発明の一実施例による収穫した８種の生体分子と精度管理および測定用の標準物質複合体を磁石で収穫した場合、およびＥＬＩＳＡ方法で収穫した場合には、これらの複合体の設計核酸をＰＣＲして得た増幅産物を、キャピラリー電気泳動を用いて分析した結果を示す図である。

一つのチューブで精度管理および測定用の標準物質を含む試料における８種の標的生体分子を分析する過程で形成されるそれらの複合体を磁石で収穫した場合、またはＥＬＩＳＡ方法で収穫した場合の両方とも、形成された標準物質複合体の設計核酸をＰＣＲして得た増幅産物をキャピラリー電気泳動で分析した結果から、本発明によるリガンドＰＣＲで分析しようとする試料における精度管理および測定用の標準物質および標的生体分子の分析が正常に行われることが分かる。

また、上述のように形成され、磁石によって収穫した場合、またはＥＬＩＳＡ方法で収穫した場合の両方とも、収穫された標準物質および標的生体分子複合体の設計核酸をＰＣＲして得た増幅産物をキャピラリー電気泳動して得た結果を確保した後、前記標的生体分子の分析結果を前記標準物質の分析結果と比較分析して究極的に前記標的生体分子を定量するか、或いは標準物質／標的生体分子または標的生体分子間の量的比率を計算することができる。

キャピラリー電気泳動の図４の結果（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）において、各ピークは長さに応じた各増幅物を示し、その面積は増幅物の量を示す。したがって、一定の濃度の外部標準物質を使用したので、標的生体分子のピーク面積を外部標準物質のピーク面積と比較して計算することにより、試料中の標的生体分子の濃度を得ることができる。また、Ｃｔ法でのように標的生体分子と外部標準物質を同一濃度で含む対照試料を用いてキャピラリー電気泳動を行い、その各リガンドとの結合力の差を反映することもできる。このような結合力の差が反映される場合、試料中の標的生体分子の濃度をより正確に算出することができる。

実施例９．生物学的意味の分析
生体試料である血液を用いて急性心筋梗塞または敗血症などの慢性疾患を検診しており、特に、一般的に、患者モニタリング用生体分子を３〜４個検査し、結果のｃｕｔ−ｏｆｆ値のみを参考することで診断を行っている。

複数の標的生体分子を定量検査し、その結果に基づいて、健常者集団と患者集団との関数関係を定量的に分析して診断することができる方法である体外診断多指標検査（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ Ｉｎｄｅｘ Ａｓｓａｙｓ；ＩＶＤＭＩＡ）は、生物学的意味の疾病または異なる状態を診断、治療、緩和、処置、予防を目的に、解釈関数を用いて標的生体分子の複数の結果を結合させて患者の特異的結果によって分類し、点数、指数などを算出する装置または技術である。

本発明の生物学的意味を決定する臨床意思決定支援システム（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｓｙｓｔｅｍ）は、増幅産物分析装置（核酸の塩基配列を確認することができる装置であるＲｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ、または核酸長さを確認することができる装置であるキャピラリー電気泳動装置など）によって生産された標準物質および標的生体分子とリガンド複合体にある設計核酸の増幅産物分析結果を補正したデータとＯＣＳ（ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｙｓｔｅｍ）システムの患者情報を入力とする。出力は、臨床医が分析結果を入力および確認する画面、診断医が危険性と分類を患者に説明することができる画面、および診断医が患者に可視的に説明することができる画面を持つ。生物学的意味分析システムは、増幅産物分析装置、ＯＣＳおよびインターフェース（Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）を持ってなければならず、データマイニング（Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ）によって得られた結果をＤＢに格納することができなければならない。ＨＬ７に定義されたＸＭＬデータを処理するためにＸＭＬ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙを持っている。データマイニングを行うときに必要な項目を設定し、マイニングエンジンを制御することができる。

図４に示すように、前記臨床意思決定支援システムの学習エンジンモジュールは、前記標的生体分子を指し示す設計核酸の増幅産物分析結果を用いて疾患を判断するために必要な人工知能学習エンジンモジュールである。

生物学的意味分析システムはＨＬ７を支援する。これは、生物学的意味分析システムの内部でデータを処理するとき、ＨＬ７に定義されたスキーマ（Ｓｃｈｅｍａ）を含むようにデータ構造を設計することを意味する。ＸＭＬ文書のスキーマ情報を保存して使用するために、ＸＭＬ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ ＭｏｄｕｌｅとＸＭＬ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ Ｃｌｉｅｎｔを持つ。

標的生体分子を指し示す設計核酸の増幅産物を分析することができる増幅産物分析装置との連動のために、増幅産物分析結果Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｍｏｄｕｌｅを持つ。増幅産物分析結果からＳＤＫ（ｓｏｆｔｗａｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｋｉｔ）を提供する場合には、ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）を開発することを原則とする。ＯＣＳ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｍｏｄｕｌｅは、ＯＣＳから患者情報を読み取ってデータマイニングに必要な情報を提供する。また、データマイニングによって分析された疾患情報をＯＣＳ（ＬＩＳ）に保存する。

図５に示されているように、前記臨床意思決定支援システムの生物学的意味分析は、大きく４つの部分システムから構成されており、生物学的意味決定エンジンであるデータ分析／予測モデル生成モジュールと診断クライアントモジュール、そしてアプタマーチップデータを生成する増幅産物分析装置との連動モジュールである増幅産物分析装置インターフェース、他のモジュール間の通信とデータ保存を担当する通信サーバーが有機的に結合されたシステムである。システムの駆動は大きくシステム構築段階とシステム適用段階に区分される。

システム構築段階は、疾病の特性をよく反映するように構成された健常者／患者試料集合を構成して、当該試料集合に対する精度管理および測定用の標準物質を活用した標的生体分子をリガンド−核酸分析し、標的生体分子−リガンド複合体および標準物質リガンド複合体の設計核酸情報を増幅産物分析装置インターフェースモジュールを介してシステムに入力し、データ分析／予測モデル生成モジュールで基本的な前処理を施して人工ニューラルネットワークアルゴリズムの学習データを生成し、人工ニューラルネットワークアルゴリズムで学習データを用いて生物学的意味分析モデルを生成し、生成された生物学的意味分析モデルをコンピュータに保存する過程を経る。

図６に示されているように、システム適用段階は、ＤＢに格納された生物学的意味分析モデルを生物学的意味分析クライアントに装着し、生物学的意味分析クライアントを駆動し、生物学的意味分析対象者のリガンド−核酸分析および増幅産物分析装置を用いて分析結果情報を生成し、増幅産物分析装置インターフェースを介してデータを入力し、生物学的意味分析クライアントで生物学的意味分析および結果可視化を行い、生物学的意味分析結果ＤＢに格納する過程から構成される。

図７に示されているように、システムの入力データは、患者の血液試料標的生体分子情報、およびプロフィールや他の診療結果などの臨床情報である。リガンド−核酸分析方法は、試料にある標準物質−リガンド複合体の設計核酸を活用して、標的生体分子−リガンド複合体にある設計核酸の分析結果を測定するための分析技術であって、このリガンド−核酸分析方法で患者の血液試料から疾病と関連の深い標的生体分子の分布様相を把握することができる。正常（ｎｏｒｍａｌ）試料と患者試料はすべての実験で同じ標的生体分子から得られた情報のみを学習とテストに使用する。標的生体分子セット分析結果情報は、一次的に標的生体分子を指し示す設計核酸の増幅産物分析によって得られ、増幅産物分析装置であるＲｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲによる増幅産物Ｃｔ（ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）分析段階を経て数値化される。

図７に示されているように、標的生体分子分析結果データの各Ｃｔ値は、標的生体分子の様態程度を示すものである。数値データは、増幅産物のＣｔデータから得られたもので、それぞれの値は一つの標的生体分子の値を意味し、数値は各標的生体分子に対する様態の程度を意味するといえる。

標的生体分子情報と一緒にシステムに入力されたものは、各患者に対する臨床情報である。各患者に対する年齢、性別、血圧、家計上の疾病履歴、喫煙有無などの各患者に対する臨床情報も入力として受ける。これらの資料はすべてデータベースに格納される。システム構築のために使用される臨床データの提供は基本的に協力医療機関から受けるものとし、標的生体分子の様態データは標的生体分子−リガンド複合体の設計核酸分析実験データを用いるものとする。

入力として受けるＣｔデータは、一つまたはそれ以上の標的生体分子をリガンド−核酸分析方法で分析して得た、標的生体分子に相応するＣｔ値情報を利用する。

図８に示されているように、リガンド−核酸分析実験結果は、増幅産物分析装置によって数値データに変換される。疾患生物学的意味決定システムでこのデータを直接利用するためには、標的生体分子を指し示す設計核酸の増幅産物のＣｔデータを読み取ることが可能な増幅産物分析装置と、生物学的意味決定システムとを連動させることが必要である。よって、ＳＤＫを提供する増幅産物分析装置を使用することを基本とし、生物学的意味を決定する臨床意思決定支援システムとの連動のためのゲートウェイ（ｇａｔｅｗａｙ）を開発する。

一方、生物学的意味決定のための臨床データは、ＯＣＳシステムから入力された患者情報を利用する。ＯＣＳから患者情報をＯＣＳインターフェースモジュールを介して読み取り、データマイニングに必要な情報をシステムエンジンに提供する。

図８に示されているように、疾病に対する生物学的意味決定に対する指標予測は、データベース内の情報に基づいて行われる。格納されている情報を用いて様々な機械学習（ｍａｃｈｉｎｅ ｌｅａｒｎｉｎｇ）方法を適用すると、疾病に対する指標分析が可能である。人工ニューラルネットワーク（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ）、決定木（ｄｅｃｉｓｉｏｎ ｔｒｅｅ）、ベイジアンネットワーク（Ｂａｙｅｓｉａｎ ｎｅｔｗｏｒｋ）、サポートベクターマシン（ｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｃｔｏｒ ｍａｃｈｉｎｅ、ＳＶＭ）などの代表的な機械学習方法が分析のための核心アルゴリズムとして使用される。一般的に、これらの方法は、ベクター形式の数値データが入力として入ってくると、これを学習して新しいデータに対する予測を可能にする。人工ニューラルネットワークとサポートベクターマシンは、データを分類する上で優れた性能を示すため、機械学習分野の研究で最も多く使用される分類アルゴリズムである。また、決定木とベイジアンネットワークは結果をヒトが理解しやすいように可視化することができるという利点を持つ。本生物学的意味決定システムは、人工ニューラルネットワークアルゴリズムを用いて持続的なテストを経て学習モデルを最適化（ｏｐｔｉｍｉｚｅ）し、これにより優れた疾患指標予測性能が得られるようにする。

精度管理および測定用の標準物質を用いた新規患者に対する一つまたはそれ以上の標的生体分子からリガンド−核酸分析方法によって生産されたＣｔの分析結果情報と臨床情報が入力されると、分析システムでは、様々な形態で特定の疾病に対する指標を始めとする分析結果を示す。医療スタッフが疾病に関する意思決定を行う上で役立てられる情報を示すものである。Ｃｌｉｅｎｔでは、疾病指標に対する単純な数値情報だけでなく、生物学的ネットワークなどを介してより可視的に疾病指標程度を示すことができるようにする。特定の疾病に対する分析結果は、医療スタッフだけでなく、患者が自分の疾病に関連する指標とその原因などについてより容易に理解するのに役立てられるようにする。

通信サーバーは、生物学的意味を決定する臨床意思決定支援システムの通信を制御する。増幅産物分析装置インターフェース、生物学的意味決定エンジン、生物学的意味決定クライアント、データベースサーバーなどのデータが行き来するすべての部分を制御する。すなわち、患者の実験情報をＤＢに入力し、生物学的意味決定エンジンは、患者の実験情報を受け取って診断し、生物学的意味決定結果をＤＢに格納し、生物学的意味決定結果を生物学的意味決定クライアントの画面に送り出すなど、データを管理するすべての部分を担当する。そして、データベースサーバーは、患者の検査情報、患者の実験情報、生物学的意味決定に必要な学習情報、生物学的意味決定エンジンモデル情報、システム設定情報、システムログ情報、生物学的意味決定結果情報など、様々なデータを格納する。通信サーバーとデータベースは、相互密接な関係を有し、各モジュール別のデータ転送を管理する。

図９に示すように、前記精度管理および測定用の標準物質が添加された血液試料をリガンド−核酸分析方法で分析し、血液試料から前記標準物質の分析結果に基づいて前記標的生体分子の分析結果を確認することができ、また、急性心筋梗塞の患者または敗血症患者の血清生体分子の分析結果が異なることを確認して生物学的意味を決定することができる。

図１０は生産された分析結果を疾患群別に構成したデータベースおよび人工ニューラルネットワークを用いた臨床意思決定支援システムであって、特定のヒトの血液試料について、生体分子分析結果を生産して疾病を診断するフローチャートである。図１１に示すように、多くの生体試料から生成される分析結果で構築されたデータベースをバイオインフォマティクス技術で分析して得られた有用な情報で生物学的意味を決定することができる。

以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業分野における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単に一実施例に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではないことは明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は添付された請求の範囲とその等価物によって定義されると理解すべきである。

本発明のリガンド核酸分析方法を用いて、試料にある標的生体分子を一度の検査で分析することにより、試料における標的生体分子の生物学的意味を確認することができ、ＰＣＲおよび蛍光的に存在信号を増幅して高感度で検出することができる。したがって、本発明は、内部精度管理を行いながら一度の検査で標的生体分子を分析することにより、試料における疾病のスクリーニング、疾病の診断、疾病への感受性および治療薬剤への反応の差など、個人間の差を効率よく決定する方法を提供することが可能なので、ヒトの疾病の克服に大きく寄与し、経済的な観点から医療産業上非常に有用な効果がある。

Claims (7)

1. （ａ）標的タンパク質が１種以上存在する試料を準備する段階と、
   （ｂ）前記試料に、外部標準物質として、その試料に存在しない一つ以上のタンパク質を定量して一定の濃度で添加する段階と、
   （ｃ）前記外部標準物質が添加された試料に、その試料中の標的タンパク質と前記外部標準物質にそれぞれ特異的に結合するリガンドと設計核酸との連結構造体を添加して、前記標的タンパク質とその特異的連結構造体との複合体および前記外部標準物質とその特異的連結構造体との複合体を形成する段階と、
   （ｄ）前記複合体を分離する段階と、
   （ｅ）前記複合体の設計核酸を同時に増幅する段階と、
   （ｆ）前記標的タンパク質に対する複合体の設計核酸の増幅物と前記外部標準物質に対する複合体の設計核酸の増幅物を定量し比較して前記標的タンパク質に対する定量情報を得る段階と、
   （ｇ）前記（ｆ）段階の標的タンパク質の定量情報に、前記標的タンパク質とそれに対する連結構造体の結合親和度と、前記外部標準物質とそれに対する連結構造体の結合親和度との差を反映する段階とを含んでなり、
   前記反映段階が以下の（ｉ）乃至（ｖｉ）段階を含み、
   （ｉ）前記標的タンパク質と前記外部標準物質を定量して、同じ濃度で含む対照試料を準備する段階、
   （ｉｉ）前記対照試料の定量された標的タンパク質または定量された外部標準物質に特異的に結合し、前記（ｃ）段階で使用した連結構造体と同じ連結構造体を添加して、前記標的タンパク質とその特異的連結構造体との複合体、および前記外部標準物質とその特異的連結構造体との複合体を形成する段階、
   （ｉｉｉ）前記複合体を分離する段階、
   （ｉｖ）前記複合体の設計核酸を同時に増幅する段階、
   （ｖ）前記標的タンパク質に対する増幅物と前記外部標準物質に対する増幅物との差異を求める段階、および
   （ｖｉ）前記差異を前記（ｆ）段階の標的タンパク質の定量情報に反映する段階；
   前記設計核酸は、順方向プライマーが結合する領域、逆方向プライマーが結合する領域、およびこれらの領域の間にリガンドが特異的に結合するタンパク質を指し示してそのタンパク質を識別することを可能にする領域を持つ設計核酸であり、
   前記設計核酸の順方向プライマーが結合する領域と逆方向プライマーが結合する領域は、一つの順方向プライマーおよび逆方向プライマーセットですべての設計核酸を増幅することができるようにすべての設計核酸で共通した塩基配列を有する、外部標準物質を用いた試料中のタンパク質分析方法。
2. 前記すべての増幅は、その増幅物をリアルタイムで検出することができるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応で行われ、
   その増幅物の量がＣｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）値で算出され、
   前記（ｆ）段階の定量し比較した結果が△Ｃｔ−ｎ（Ｃｔ _{標的タンパク質} −Ｃｔ _{外部標準物質} ）で算出され、
   前記（ｆ）段階の標的タンパク質に対する定量情報が前記（ｂ）段階の外部標準物質の濃度×２ ^{−△Ｃｔ−ｎ} で算出され、
   前記（ｖ）段階の差異が△Ｃｔ−ｃ（Ｃｔ _{対照試料の標的タンパク質} −Ｃｔ _{対照試料の外部標準物質} ）で算出されることにより、
   前記（ｖｉ）段階が、前記△Ｃｔ−ｎと△Ｃｔ−ｃとの差異値である△Ｃｔ−ｃａｌ（△Ｃｔ−ｎ−△Ｃｔ−ｃ）を反映して、前記（ｆ）段階の標的タンパク質の定量情報が前記（ｂ）段階の外部標準物質の濃度×２ ^{−△Ｃｔ−ｃａｌ} で決定されるように行われる、請求項１に記載の方法。
3. 前記試料中の標的タンパク質は２種以上であり、
   これにより、その標的タンパク質に特異的なリガンドと設計核酸との連結構造体も２種以上であり、
   前記２種以上の連結構造体の設計核酸における、その順方向プライマーが結合する領域とその逆方向プライマーが結合する領域は、その種類を問わず、すべての連結構造体の設計核酸の間で共通した塩基配列を有する、請求項１に記載の方法。
4. 前記リガンドは抗体である、請求項１に記載の方法。
5. 前記設計核酸は一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡであり、
   前記リガンドが特異的に結合するタンパク質を指し示す領域は塩基配列またはその長さで指し示す領域である、請求項１に記載の方法。
6. 前記（ｅ）段階の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ）、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ）、リアルタイムマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ）およびマルチプレックス逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ−ＰＣＲ）のうちのいずれか一つのポリメラーゼ連鎖反応によって行われる、請求項１に記載の方法。
7. 前記（ｅ）段階の増幅は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ）およびリアルタイムマルチプレックス逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ−ＰＣＲ）よりなる群から選ばれたポリメラーゼ連鎖反応によって行われ、
   前記増幅の際にＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ［Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ｐｒｏｂｅ］が添加され、そのＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブでその増幅物を定量することを特徴とする、請求項１に記載の方法。