JP6694780B2 - 脂肪細胞分化促進剤およびその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、脂肪細胞分化促進剤に関する。

脂肪細胞は、脂肪を蓄える機能の他に、インスリンの働きを向上させるアディポネクチンなどのアディポサイトカインを分泌する機能を有する。脂肪細胞が脂肪を多量に溜め込んだ場合、肥大化脂肪細胞となる。肥大化脂肪細胞では、正常な脂肪細胞と比べて、アディポネクチンの分泌量が減ること、また、インスリン抵抗性を惹起するＴＮＦ−αおよび遊離脂肪酸を分泌し始めることが知られている。よって、肥大化脂肪細胞は、糖尿病、高血圧および高脂血症などの生活習慣病の原因のひとつであると考えられている。

生活習慣病の予防および改善のためには、前駆脂肪細胞の分化を促進して正常な脂肪細胞を増やすことが重要である。前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を促進する作用を有する素材として、これまでに、テンチャ抽出物（特許文献１）、コウボク抽出物（特許文献２）、マティコ抽出物（特許文献３）などが報告されている。

ゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）は、ゴマ科ゴマ属に属する一年草である。カルシウムを補給するための食品として、ゴマ種皮を含むカルシウム補給食品（特許文献４）が知られている。しかし、ゴマ種皮から抽出された抽出物の脂肪細胞分化促進効果については、ほとんど知られていない。

特開２０１１−１５３０９３号公報 特開２０１０−２０２５３６号公報 特開２００６−０２８０４９号公報 特開２０００−４８３３号公報

本発明は、ゴマ種皮から抽出された抽出物を含有することを特徴とする脂肪細胞分化促進剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意研究した結果、ゴマ種皮から抽出された抽出物に脂肪細胞分化促進作用があることを見出した。

本発明の一形態によれば、脂肪細胞分化促進剤が提供される。この脂肪細胞分化促進剤は、ゴマ種皮から抽出された抽出物を含有することを特徴とする。

実験例１において培地に添加した各抽出物の構成を示す。 実験例１の試験結果を示す。 半定量ＲＴ−ＰＣＲによって検出されたバンドの結果を示す。 実験例２における各群の補正値を示す。 実験例３の試験結果を示す。 ＬＣ／ＭＳの分析条件を示した図である。 グラジエント条件を示した図である。 グラジエント条件を示した図である。 ＥＳＩ法で分析した結果のうちネガティブイオンについて示した図である。 ＥＳＩ法で分析した結果のうちポジティブイオンについて示した図である。

以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。本発明におけるゴマ種皮とは、ゴマ科ゴマ属に属する一年草の食用となりうる品種（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）の種子における種皮を指す。産地は特に限定されるものではなく、白ゴマ、黒ゴマ、金ゴマ、茶ゴマ等食用に供するものであれば特に限定されない。

抽出の手段としては、特に限定されないが、例えば、固液抽出、液液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌等が挙げられる。これらの抽出手段は、単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

抽出に使用される溶媒としては特に限定されないが、例えば、水、低級１価アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、エーテル類（エチルエーテル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。これらの溶媒は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。溶媒を混合して用いる場合、各溶媒の混合比は、溶媒の種類に応じて適宜調整すればよい。

ゴマ種皮の抽出物は、抽出した溶液のまま用いても良く、必要に応じて、濃縮、希釈、濾過、脱臭、エタノール沈殿等の処理をして用いても良い。さらには、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いても良い。

以下、実施例により本発明を詳細に説明する。

Ａ．製造例：
＜製造例１ ゴマ種皮のジエチルエーテル抽出画分＞
ゴマから選別されたゴマ種皮に１０倍量のジエチルエーテルを加えた。ジエチルエーテルを加えてから１０分間振とう抽出して遠心分離した後、上清のジエチルエーテルを回収した。上清のジエチルエーテルを回収されたゴマ種皮にジエチルエーテルを加えて、１０分間振とう抽出して遠心分離した後、上清のジエチルエーテルを回収した。上清のジエチルエーテルを回収されたゴマ種皮に再度ジエチルエーテルを加えて、１０分間振とう抽出して遠心分離した後、上清のジエチルエーテルを再度回収した。上記工程により回収された３回分のジエチルエーテルを合わせたものを濾過して減圧濃縮することによって、ゴマ種皮のジエチルエーテル抽出画分を得た。

＜製造例２ ゴマ種皮の熱水抽出画分＞
製造例１の製造工程において、３回分のジエチルエーテルが回収された後のゴマ種皮を、脱脂ゴマ種皮とする。この脱脂ゴマ種皮に２０倍量の水を加えて３０分間沸騰させた。３０分間沸騰させたものを吸引濾過して得られた抽出液を凍結乾燥することによって、ゴマ種皮の熱水抽出画分を得た。

＜製造例３ ゴマ種皮の８０％エタノール抽出画分＞
製造例１の製造工程において得られる脱脂ゴマ種皮に８０％エタノールを１０倍量加えて３時間振とう抽出を行った。３時間振とう抽出を行った溶液を濾過し、減圧濃縮および凍結乾燥することによって、ゴマ種皮の８０％エタノール抽出画分を得た。

＜製造例４ ゴマ種皮の素通り画分＞
ゴマ種皮の８０％エタノール抽出画分を３０％エタノールに溶解させたものを、Ｃ１８固相カラムに添加して通過させた。通過させた液を回収して減圧濃縮および凍結乾燥することによって、素通り画分を得た。

＜製造例５ ゴマ種皮の６０％メタノール溶出画分＞
製造例４の工程におけるゴマ種皮の８０％エタノール抽出画分を３０％エタノールに溶解させたものを通過させた後のＣ１８固相カラムに対して、６０％メタノールをＣ１８固相カラムに通過させた。６０％メタノールをＣ１８固相カラムに通過させて得られた溶出液を回収して減圧濃縮および凍結乾燥することによって、ゴマ種皮の６０％メタノール溶出画分を得た。

＜製造例６ ゴマ種皮の１００％メタノール溶出画分＞
製造例５の工程における６０％メタノールを通過させた後のＣ１８固相カラムに対して、１００％メタノールを通過させた。１００％メタノールをＣ１８固相カラムに通過させて得られた溶出液を回収して減圧濃縮および凍結乾燥することによって、ゴマ種皮の１００％メタノール溶出画分を得た。

次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。

Ｂ．実験例：
実験例１：脂肪細胞における脂肪滴の蓄積促進活性の評価
マウス前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）は、分化して脂肪細胞になると、細胞内に脂肪滴を蓄積する。よって、脂肪細胞内における脂肪滴の蓄積量を指標として、ゴマ種皮抽出物による前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化促進活性を評価した。

マウス前駆脂肪細胞を２４ウェルプレートに１×１０^５個ずつ播種し、ＤＭＥＭ培地にて５％ＣＯ_２存在下、３７℃で４８時間培養した。４８時間培養したのち、新鮮なＤＭＥＭ培地に交換した。

図１は、４８時間培養したのちの細胞を培養する培地に添加した各抽出物の構成について示した説明図である。図１における溶媒とは、試料を溶かすために用いた溶媒を示す。尚、以降の説明では、製造例３におけるゴマ種皮の８０％エタノール抽出画分を試料１とし、製造例２におけるゴマ種皮の熱水抽出画分を試料２とし、製造例４におけるゴマ種皮の素通り画分を試料３とし、製造例５におけるゴマ種皮の６０％メタノール溶出画分を試料４とし、製造例６におけるゴマ種皮の１００％メタノール溶出画分を試料５とし、製造例１におけるゴマ種皮のジエチルエーテル抽出画分を試料６とする。

図１に示した濃度および溶媒にて製造例１〜６のゴマ種皮抽出物をそのＤＭＥＭ培地にそれぞれ添加した。ゴマ種皮抽出物を含むＤＭＥＭ培地を２，３日おきに交換して７日間培養した。７日間培養したのち、細胞内に蓄積した脂肪滴をオイルレッドＯによって染色した。染色した細胞にイソプロパノールを加えてオイルレッドＯを溶出させて吸光度測定のサンプルとした。吸光度測定のサンプルの４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。

図２は、実験例１の試験結果を示す。図２のグラフ右側におけるＤＭＥＭは、７日間の培養期間中、ゴマ種皮抽出物を添加されていないＤＭＥＭ培地で培養された群を示す。図２のグラフ右側におけるＤＭＳＯは、７日間の培養期間中、試料１、３〜６のゴマ種皮抽出物がＤＭＥＭ培地に添加される際に使用されたＤＭＳＯの量と等量のＤＭＳＯ（ゴマ種皮抽出物不含）が添加されたＤＭＥＭ培地で培養された群を示す。

試料２が添加されて培養された群に対する対照群は、図２のグラフ右側におけるＤＭＥＭである。試料１、試料３、試料４、試料５および試料６が添加されて培養された群に対する対照群は、図２のグラフ右側におけるＤＭＳＯである。図２のグラフにおける縦軸は、対照群に対する相対吸光度である。なお、図２のグラフにおいて、＊はｔ検定においてｐ＜０．０５で対照群に対して有意差があることを示し、＊＊はｔ検定においてｐ＜０．０１で対照群に対して有意差があることを示す。図２の各試料番号の上にある数字（例えば、試料１の場合は１００，５０，２５）は、試料の添加濃度を示す（単位は、μｇ／ｍｌ）。

図２のグラフにおける結果より、ゴマ抽出物が添加されて培養された群の中では、特に、試料１、試料４、試料５および試料６をそれぞれ添加されて培養された群において、対照群と比べて脂肪滴の蓄積量が増加した。

実験例２：脂肪細胞におけるアディポネクチンの発現促進活性の評価
アディポネクチンは、分化した脂肪細胞から積極的に分泌される物質である。よって、脂肪細胞におけるアディポネクチンの発現量を指標として、ゴマ種皮抽出物による前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化促進活性を評価した。

実験例１の実験条件にて７日間培養した脂肪細胞から総ＲＮＡを抽出し、半定量ＲＴ−ＰＣＲによって得られたバンド強度を画像解析ソフトで数値化した。アディポネクチンのバンド強度の値を、内部標準である３６Ｂ４のバンド強度の値で割って補正した補正値を得た。

図３は、実験例２における半定量ＲＴ−ＰＣＲによって検出されたバンドの結果を示す。図４は、実験例２における各群の補正値を示す。図４の各試料番号の上にある数字（例えば、試料１の場合は１００）は、試料の添加濃度を示す（単位は、μｇ／ｍｌ）。図４のグラフにおける縦軸は、対照群に対する相対値である。なお、図４のグラフにおいて、＊はｔ検定においてｐ＜０．０５で対照群に対して有意差があることを示し、＊＊はｔ検定においてｐ＜０．０１で対照群に対して有意差があることを示す。

図４のグラフにおける結果より、試料１〜６の各ゴマ抽出物が添加されて培養された群の中では、特に、試料１、試料４および試料５をそれぞれ添加されて培養された群において、対照群と比べてアディポネクチンの発現量が増加した。

実験例３：セサミンとの比較
試料５のゴマ種皮抽出物とセサミンとの比較を行った。比較には、実験例１における試験方法と同様の方法を用いた。７日間の培養期間中に、セサミン（０．１μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭ）および試料５（５０μｇ／ｍｌ）をそれぞれ含むＤＭＥＭ培地を用いて、細胞の培養を行った。なお、試料５の濃度（５０μｇ／ｍｌ）におけるセサミン含有量は、ＨＰＬＣ分析における外部標準法によって、７．５μＭと定量された。

図５は、実験例３の試験結果を示す。図５のグラフ右側におけるＤＭＳＯは、７日間の培養期間中、セサミンおよび試料５がＤＭＥＭ培地に添加される際に使用されたＤＭＳＯの量と等量のＤＭＳＯが添加されたＤＭＥＭ培地で培養された対照群のことである。図５のグラフにおける縦軸は、対照群に対する相対吸光度である。なお、図５のグラフにおいて、＊はｔ検定においてｐ＜０．０５で対照群に対して有意差があることを示し、＊＊はｔ検定においてｐ＜０．０１で対照群に対して有意差があることを示す。

図５のグラフにおける結果より、試料５が添加されて培養された群では、対照群と比べて、脂肪滴の蓄積量が約１．９倍に増加した。また、試料５が添加されて培養された群は、各濃度でセサミンが添加されて培養された群と比べて、脂肪滴の蓄積量が大きく増加した。このため、ゴマ種皮抽出物における脂肪細胞分化促進作用を担う主成分は、セサミンとは異なる成分であると考えられる。

実験例４：ＬＣ／ＭＳによる分析
試料５のゴマ種皮抽出物について、ＬＣ／ＭＳ分析を行った。図６は、ＬＣ／ＭＳの分析条件を示した図である。図７は、移動相として、水およびメタノールを使用したときのグラジエント条件１を示した図である。図８は、移動相として、０．１％ギ酸およびメタノールを使用したときのグラジエント条件２を示した図である。

図９は、グラジエント条件１において、ＥＳＩ法で分析した結果のうちネガティブイオンについて示した図である。図１０は、グラジエント条件２において、ＥＳＩ法で分析した結果のうちポジティブイオンについて示した図である。図９および図１０における結果は、それぞれフラグメンタ電圧８０Ｖで分析したものである。図９および図１０における横軸は、時間（リテンションタイム）をとる。図９および図１０における縦軸は、強度をとる。

Claims (4)

1. 水、低級１価アルコール類、エーテル類のうちの少なくとも１種を含有する溶媒によって、ゴマ種皮から抽出された抽出物を含有することを特徴とする脂肪細胞分化促進剤。
2. 水、低級１価アルコール類、エーテル類のうちの少なくとも１種を含有する溶媒によって、ゴマ種皮から抽出された抽出物を含有することを特徴とする脂肪滴蓄積促進剤。
3. 水、低級１価アルコール類、エーテル類のうちの少なくとも１種を含有する溶媒によって、ゴマ種皮から抽出された抽出物を含有することを特徴とするアディポネクチン発現促進剤。
4. ゴマから選別されたゴマ種皮に水、エタノールおよびジエチルエーテルのうち少なくともひとつを含有する溶媒を用いて抽出処理を行い、前記抽出処理によって抽出された抽出物を含有させて、脂肪細胞分化促進剤を製造する製造方法。