JP6692905B2

JP6692905B2 - 栗皮抽出物の製造方法

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Description

本発明は、栗皮抽出物に関する。また本発明は、当該抽出物の製造方法（抽出方法）及び用途にも関する。

スフィンゴ脂質は、長鎖アミノアルコールであるスフィンゴイド塩基のアミノ基に長鎖脂肪酸が結合したセラミドを基本骨格とし、アルコール性ヒドロキシル基に糖及びリン酸などの極性基が結合した状態で細胞膜に存在する。なかでもスフィンゴ糖脂質であるグリコシルセラミドは、動植物、微生物に広く存在する成分でセレブロシドとも呼ばれ、近年、生体機能調節作用を有するとして注目されている機能性素材でもある。

グリコシルセラミドのなかでも植物及び真菌類に広く存在するグルコシルセラミド（グルコースがセラミドに結合したスフィンゴ糖脂質）は、俗に略して「セラミド」と呼ばれ多くの原料から素材化されている。とくにセラミドはヒト表皮の細胞間脂質の約５０％を占めることから、肌の健康との関連で注目され健康食品および機能性化粧品素材として市場を拡大している。加齢による角質セラミドの減少が知られており、外用セラミドの補給が重要であると考えられている。ヒトの角質層は様々な種類のセラミドが存在するが、中でもセラミドＮＳ、セラミドＮＰ、及びセラミドＡＰの存在割合が高く、特に加齢によるセラミドＡＰの含有割合の減少が顕著であり（非特許文献１）、よってセラミドＡＰの補給が特に重要である。

なお、セラミドの命名法の一つとして、セラミドを構成する脂肪酸とスフィンゴイド塩基がそれぞれ何かで名前が決定される方法があり、例えばセラミドＡＰは、α-ヒドロキシ脂肪酸（Ａ）とファイトスフィンゴシン（Ｐ）により構成されるセラミドである。このセラミドの命名方法の概要を図１に示す。

角質層細胞間脂質として存在するセラミドは遊離型のフリーセラミドであり、これはグルコシルセラミドとスフィンゴミエリンとが表皮特異的な分解酵素により分解されて変換されたものである。この皮膚におけるフリーセラミド産生は、陸上動物において表皮のバリア機能を維持するうえで重要な生命現象である。なお、グルコシルセラミドも、外用した場合において肌のセラミド合成を高める働きを有しているとも言われている。

一方、植物から抽出され所謂「セラミド」と称されている植物グルコシルセラミドは、グルコースがセラミドに結合しており、この点でヒト表皮のセラミド（フリーセラミド）とは構造が異なる。また、植物グルコシルセラミドを構成するスフィンゴイド塩基は、一般にヒトには含まれない４，８−スフィンガジエニンを主成分とし、よってセラミドの基本骨格の化学構造の点でもヒトとは異なる。各種セラミドのうち、動物及び植物によく見られるスフィンゴイド塩基について、図２に示す。

また、ヒト角質セラミドの脂肪酸については、その炭素鎖長が種々のものが存在するが、特に炭素数１６及び１８（Ｃ１６及びＣ１８）の比較的炭素鎖の短い脂肪酸を有するセラミドの含有割合が増加すると皮膚バリア機能が低下（ＴＥＷＬが上昇）し、一方で炭素数２０、２４、及び２６（Ｃ２０、Ｃ２４、及びＣ２６）という比較的炭素鎖の長い脂肪酸を有するセラミドの含有割合が増加すると皮膚バリア機能が亢進（ＴＥＷＬが低下）するということが知られている（非特許文献２）。よって、ヒトの肌に適用するセラミドとしては、その脂肪酸の炭素鎖が比較的長いものが好適であると考えられる。

以上のような事情を考慮して、従来、皮膚外用剤としてのセラミド素材には、植物由来セラミドではなく化学合成されたヒト型のセラミド（セラミドの基本骨格の化学構造がヒト型のセラミド）が主に用いられてきた。特にヒト型のフリーセラミドが好ましく用いられてきた。なお、ヒト型とはヒト角質層に含まれるセラミドと同じ構造という意味で、皮膚同一型とも言われる。

フリーセラミドはスフィンゴ脂質合成の中間体であるため自然界にも微量存在するが、その量はグルコシルセラミドの約１／１０とも言われる。一方、植物及び真菌類の細胞膜には、セラミドにリン酸が結合しそこにオリゴ糖が結合した酸性スフィンゴ脂質リン脂質群がグルコシルセラミドの数倍量含まれていることが明らかとなっている。この脂質は細胞膜の機能調節だけでなくシグナル伝達のセカンドメッセンジャーであるフリーセラミドを産生する基質としての役割も担っている。このように、自然界においては、スフィンゴ糖脂質及びスフィンゴリン脂質が多く産生され利用されているため、自然界に存在する素材からフリーセラミドを大量に得ることは容易ではなく、フリーセラミドの中でも基本骨格の化学構造がヒト型であるフリーセラミドを大量に得ることは、さらに難しい。

特に植物からのフリーセラミド生産については、自然界においても産業的にも、酸性スフィンゴ脂質がフリーセラミドへと変換されるために必要な自己消化状態を実現することが困難であることから、植物からの効率的なフリーセラミド生産技術はこれまでに存在しない。例えば、特許文献１には、紫芋のもろみを蒸留して得た蒸留粕のアルコール抽出物をアセトン又はヘキサンで抽出して残渣を回収することを含む、セラミド濃縮物の製造方法が記載されており、当該濃縮物はフリーセラミドを含むことも記載されているが、当該製造方法では、紫芋のもろみを蒸留して蒸留粕を得るという工程を経なければならない。

特開２０１５−１０５２７２

ＤｅｎｄａＭ，ｅｔａｌ．，ＡｒｃｈＤｅｒｍａｔｏｌＲｅｓ（１９９３）２８５：４１５−４１７ＪｏｏＫ，ｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ６０（２０１０）４０−５７

本発明は、フリーセラミド（特にヒト型フリーセラミド）を効率よく製造することを課題とする。

本発明者らは、栗の皮（鬼皮と渋皮）にフリーセラミドが蓄積していることを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。

本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
フリーセラミド及びグルコシルセラミドを含む栗皮抽出物。
項２．
含まれるフリーセラミド及びグルコシルセラミドの重量比（フリーセラミド／グルコシルセラミド）が、１〜１０である、項１に記載の抽出物。
項３．
含まれるフリーセラミドのうち、５０モル％以上が、スフィンゴイド塩基部分のヒドロキシル基数が３であるフリーセラミドである、項１又は２に記載の抽出物。
項４．
含まれるグルコシルセラミドのうち、５０モル％以上が、スフィンゴイド塩基部分のヒドロキシル基数が３であるグルコシルセラミドである、項１〜３のいずれかに記載の抽出物。
項５．
栗皮抽出物のフリーセラミド画分であって、
含まれるフリーセラミドのうち、５０モル％以上が、スフィンゴイド塩基部分のヒドロキシル基数が３であるフリーセラミドである、画分。
項６．
栗皮抽出物のグルコシルセラミド画分であって、
含まれるグルコシルセラミドのうち、５０モル％以上が、スフィンゴイド塩基部分のヒドロキシル基数が３であるグルコシルセラミドである、画分。
項７．
項１〜４のいずれかに記載の抽出物、あるいは項５又は６に記載の画分を含む、化粧品組成物、食品組成物、又は医薬品組成物。
項Ａ１．
フリーセラミド及びグルコシルセラミドを含む栗皮抽出物を、皮膚に適用する工程を含む、保湿、抗皮膚老化、又は皮膚バリア改善方法。
項Ａ２．
栗皮抽出物に含まれるフリーセラミド及びグルコシルセラミドの重量比（フリーセラミド／グルコシルセラミド）が、１〜１０である、項Ａ１に記載の方法。
項Ａ３．
栗皮抽出物に含まれるフリーセラミドのうち、５０モル％以上が、スフィンゴイド塩基部分のヒドロキシル基数が３であるフリーセラミドである、項Ａ１又はＡ２に記載の方法。
項Ａ４．
栗皮抽出物に含まれるグルコシルセラミドのうち、５０モル％以上が、スフィンゴイド塩基部分のヒドロキシル基数が３であるグルコシルセラミドである、項Ａ１〜Ａ３のいずれかに記載の方法。
項Ａ５．
栗皮抽出物のフリーセラミド画分であって、含まれるフリーセラミドのうち、５０モル％以上が、スフィンゴイド塩基部分のヒドロキシル基数が３であるフリーセラミドである、画分を、皮膚に適用する工程を含む、保湿、抗皮膚老化、又は皮膚バリア改善方法。
項Ａ６．
栗皮抽出物のグルコシルセラミド画分であって、含まれるグルコシルセラミドのうち、５０モル％以上が、スフィンゴイド塩基部分のヒドロキシル基数が３であるグルコシルセラミドである、画分を、皮膚に適用する工程を含む、保湿、抗皮膚老化、又は皮膚バリア改善方法。
項Ｂ１．
保湿、抗皮膚老化、又は皮膚バリア改善における使用のための、
フリーセラミド及びグルコシルセラミドを含む栗皮抽出物。
項Ｂ２．
栗皮抽出物に含まれるフリーセラミド及びグルコシルセラミドの重量比（フリーセラミド／グルコシルセラミド）が、１〜１０である、項Ｂ１に記載の栗皮抽出物。
項Ｂ３．
栗皮抽出物に含まれるフリーセラミドのうち、５０モル％以上が、スフィンゴイド塩基部分のヒドロキシル基数が３であるフリーセラミドである、項Ｂ１又はＢ２に記載の栗皮抽出物。
項Ｂ４．
栗皮抽出物に含まれるグルコシルセラミドのうち、５０モル％以上が、スフィンゴイド塩基部分のヒドロキシル基数が３であるグルコシルセラミドである、項Ｂ１〜Ｂ３のいずれかに記載の栗皮抽出物。
項Ｂ５．
保湿、抗皮膚老化、又は皮膚バリア改善における使用のための、栗皮抽出物のフリーセラミド画分であって、含まれるフリーセラミドのうち、５０モル％以上が、スフィンゴイド塩基部分のヒドロキシル基数が３であるフリーセラミドである、画分。
項Ｂ６．
保湿、抗皮膚老化、又は皮膚バリア改善における使用のための、栗皮抽出物のグルコシルセラミド画分であって、含まれるグルコシルセラミドのうち、５０モル％以上が、スフィンゴイド塩基部分のヒドロキシル基数が３であるグルコシルセラミドである、画分。
項Ｃ１．
保湿、抗皮膚老化、又は皮膚バリア改善のための化粧品又は医薬品の製造における、フリーセラミド及びグルコシルセラミドを含む栗皮抽出物の使用。
項Ｄ１．
栗皮アセトン抽出物を含む、抗紫外線組成物。
項Ｄ２．
栗皮アセトン抽出物が、栗皮エタノール抽出物のアセトン抽出物である、項Ｄ１に記載の抗紫外線組成物。
項Ｄ３．
抗紫外線組成物が、紫外線吸収組成物又は紫外線波長変換組成物（好ましくは紫外線の可視光への変換組成物）である、項Ｄ１又はＤ２に記載の抗紫外線組成物。
項Ｅ１．
項１〜４のいずれかに記載の抽出物、又は項５若しくは６に記載の画分と、
栗皮アセトン抽出物と、
を含む、化粧品組成物。
項Ｅ２．
化粧品組成物が、保湿、抗皮膚老化、皮膚バリア改善用、あるいは抗紫外線用である、項Ｅ１に記載の化粧品組成物。
項Ｅ３．
抗紫外線用が、紫外線吸収用又は紫外線波長変換用（好ましくは紫外線の可視光への変換用）である、項Ｅ１又はＥ２に記載の化粧品組成物。
項Ｅ４．
栗皮アセトン抽出物が、栗皮エタノール抽出物のアセトン抽出物である、項Ｅ１〜Ｅ３のいずれかに記載の化粧品組成物。

本発明の一実施形態に係る栗皮抽出物は、セラミドＡＰを多く含み、且つ脂肪酸の炭素鎖長が比較的長いセラミドを多く含むため、特に肌の機能改善、保湿、抗老化、バリア機能改善などに特に好適に用いることができる。

セラミドの命名方法の概要を示す。各種セラミドのうち、動物及び植物によく見られるスフィンゴイド塩基について、示す。栗皮（渋皮、鬼皮、又はその両方）から得られた全脂質中のスフィンゴ脂質をＴＬＣデンシトメトリー法により定量した結果を示す。栗皮エキスのスフィンゴ脂質について、ＬＣ−ＭＳにより構造解析を行った結果を示す。図４のＬＣ−ＭＳ解析のピークの分子種を表にして示す。栗子実から得られた全脂質中のスフィンゴ脂質をＴＬＣデンシトメトリー法により定量した結果を示す。アーモンド、ピスタチオおよびトチの実の各部位から得られた全脂質中のスフィンゴ脂質をＴＬＣデンシトメトリー法により定量した結果を示す。栗皮エキスを精製して得られた全脂質中のスフィンゴ脂質をＴＬＣデンシトメトリー法により定量した結果を示す。栗皮抽出物が皮膚に与える影響について検討した結果を示す。左側に角層水分量測定結果を、右側に経皮水分蒸散量測定結果を示す。＊は、群間で有意差あり（Ｐ＜０．０５）を示す。＃は、初期値（塗布前）に対して有意差あり（Ｐ＜０．０５）を示す。分光光度計による栗ＵＶＰの紫外線吸収能測定結果を示す。市販ＵＶＡ吸収剤溶液及び栗ＵＶＰ溶液へ、ＵＶ照射を行った際の写真を示す。栗皮抽出物の水分蒸発抑制効果を検討した結果を示す。

本発明の一実施形態に係る栗皮抽出物は、フリーセラミド及びグルコシルセラミドを含む。上記の通り、セラミドはスフィンゴイド塩基のアミノ基（−ＮＨ_２）に脂肪酸のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）が結合した構造（−ＮＨ−ＣＯ−）を有する化合物である。セラミドのスフィンゴイド塩基のアルコール性ヒドロキシル基（−ＯＨ）に、更に糖及びリン酸などの極性基が結合し、それぞれスフィンゴ糖脂質及びスフィンゴリン脂質となる。ここで、糖が結合したものを特にグリコシルセラミドと呼び、特に糖がグルコースである場合グルコシルセラミドと呼ぶ。本明細書では、セラミドに糖及びリン酸が結合していない場合を特にフリーセラミドと呼ぶ。また、以下、特に断らない限り、単に「セラミド」と標記した場合は、フリーセラミドとグルコシルセラミドとを包含する。

フリーセラミドを構成するスフィンゴイド塩基としては、特に制限はされないが、ヒドロキシル基を２又は３個有するものが好ましく、３個有するものがより好ましい。また、当該スフィンゴイド塩基は、炭素数１４〜２２であるものが好ましく、炭素数１６〜２０であるものがより好ましく、炭素数１８であるものがさらに好ましい。また、炭素間二重結合を０又は１有するものが好ましい。より具体的な好ましいスフィンゴイド塩基としては、例えばスフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン、６−ヒドロキシスフィンゴシン等が挙げられる。また例えば、図２に構造式を示したものが挙げられる。なお、スフィンゴシンとは２−アミノ−４−オクタデセン−１，３−ジオールのことである。

フリーセラミドを構成する脂肪酸としては、炭素数１６〜３０の脂肪酸が好ましく、炭素数１８〜２８の脂肪酸がより好ましく、炭素数２０〜２６の脂肪酸がさらに好ましく、炭素数２２〜２６の脂肪酸がよりさらに好ましい。また、炭素間二重結合を０又は１個有する脂肪酸が好ましく、０個有する脂肪酸（すなわち飽和脂肪酸）がより好ましい。また、ヒドロキシル基を０、１、又は２個有する脂肪酸が好ましく、１又は２個有する脂肪酸がより好ましい。ヒドロキシル基を有する場合、α−ヒドロキシル基であることが好ましい。

フリーセラミドにおいて、セラミド骨格の（スフィンゴイド塩基）−（脂肪酸）の組み合わせは、上記のスフィンゴイド塩基及び脂肪酸をどのように組み合わせたものであってもよい。中でも好ましい組み合わせとして、例えば、（ヒドロキシル基を２又は３（特に３）個有するスフィンゴイド塩基）−（ヒドロキシル基を有する（特にα−ヒドロキシル基を有する）脂肪酸）の組み合わせが挙げられる。当該脂肪酸のヒドロキシル基数は１又は２が好ましい。なお、セラミド骨格が（ファイトスフィンゴシン）−（α−ヒドロキシル基を有する脂肪酸）の組み合わせであるフリーセラミドを、本明細書では特にセラミドＡＰと呼ぶ（図１及び図２も参照）。なお、脂肪酸には、αヒドロキシル基以外にもヒドロキシル基をさらに有するものもあるが、その場合もαヒドロキシル基を有するものはセラミドＡＰに包含される。例えば、αヒドロキシル基及びβヒドロキシル基の２つのヒドロキシル基を有するセラミドは、セラミドＤＰと呼ばれるところ、本明細書ではセラミドＤＰもセラミドＡＰに包含される。セラミドＡＰのうち、ヒドロキシル基として、特にαヒドロキシル基のみを有するものを以下セラミドＡＰ１、αヒドロキシル基及びβヒドロキシル基のみを有するものを以下セラミドＡＰ２、と呼ぶことがある。セラミドＤＰはセラミドＡＰ２である。

セラミドのヒドロキシル基数が多いほど強い水素結合を形成し、より安定な膜構造を構築できるために、肌における保湿効果が高まると考えられていることから、ヒドロキシル基を多く有するセラミドが好ましい。また、別の好ましい組み合わせとして、例えば、（ヒドロキシル基を２又は３個有し、炭素数１８で、炭素間二重結合を０又は１個有するスフィンゴイド塩基）−（炭素数２０〜２６、炭素間二重結合が０、ヒドロキシル基を１又は２個有する（特にα−ヒドロキシル基を有する）脂肪酸）の組み合わせが挙げられる。

グルコシルセラミドを構成するスフィンゴイド塩基としては、特に制限はされないが、ヒドロキシル基を２又は３個有するものが好ましく、３個有するものがより好ましい。また、炭素数１４〜２２であるものが好ましく、炭素数１６〜２０であるものがより好ましく、炭素数１８であるものがさらに好ましい。また、炭素間二重結合を０、１又は２個有するものが好ましい。より具体的な好ましいスフィンゴイド塩基としては、例えばスフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン、４−ヒドロキシスフィンゲニン、４，８−スフィンガジエニン、６−ヒドロキシスフィンゴシン等が挙げられる。また例えば、図２に構造式を示したものが挙げられる。

グルコシルセラミドを構成する脂肪酸としては、炭素数１６〜３０の脂肪酸が好ましく、炭素数１８〜２８の脂肪酸がより好ましく、炭素数２０〜２６の脂肪酸がさらに好ましく、炭素数２２〜２６の脂肪酸がよりさらに好ましい。また、炭素間二重結合を０又は１個有する脂肪酸が好ましく、０個有する脂肪酸（すなわち飽和脂肪酸）がより好ましい。また、ヒドロキシル基を０、１又は２個有することが好ましく、１又は２個有することがより好ましい。ヒドロキシル基を有する場合、α−ヒドロキシル基を有することが好ましい。

グルコシルセラミドにおいて、セラミド骨格の（スフィンゴイド塩基）−（脂肪酸）の組み合わせは、上記のスフィンゴイド塩基及び脂肪酸をどのように組み合わせたものであってもよい。中でも好ましい組み合わせとして、例えば、（ヒドロキシル基を２又は３（特に３）個有するスフィンゴイド塩基）−（ヒドロキシル基を有する（特にα−ヒドロキシル基を有する）脂肪酸）の組み合わせが挙げられる。当該脂肪酸のヒドロキシル基数は１又は２が好ましい。セラミドのヒドロキシル基の数が多いほど強い水素結合を形成し、より安定な膜構造を構築できるために、肌における保湿効果が高まると考えられているため、ヒドロキシル基を多く有するものが好ましい。また、好ましい組み合わせとして、例えば、（ヒドロキシル基を２又は３個有し、炭素数１８で、炭素間二重結合を０又は１個有するスフィンゴイド塩基）−（炭素数２０〜２６、炭素間二重結合が０、ヒドロキシル基を１又は２個有する（特にα−ヒドロキシル基を有する）脂肪酸）の組み合わせが挙げられる。

なお、フリーセラミド及びグルコシルセラミドのいずれにおいても、脂肪酸がヒドロキシル基を２個有する場合には、α−ヒドロキシル基及びβヒドロキシル基の２個のヒドロキシル基を有する（すなわち、α、β−ジヒドロキシ脂肪酸である）ことが好ましい。また、フリーセラミド、グルコシルセラミドのいずれにおいても、そのセラミド骨格におけるスフィンゴイド塩基が炭素間二重結合を有する場合には、トランス型異性体であることが好ましく、また、そのセラミド骨格における脂肪酸が炭素間二重結合を有する場合には、トランス型異性体であることが好ましい。

上記の通り、フリーセラミド及びグルコシルセラミドは、その骨格を構成するスフィンゴイド塩基及び脂肪酸の種類によって多種多様な構造をとる（例えば図１及び図２参照）。本発明において、栗皮抽出物は、様々な構造を有する複数種のフリーセラミド及びグルコシルセラミドを含む。本明細書では、このような構造の異なる種々のフリーセラミドをフリーセラミド種とよぶことがある。また、このような構造の異なる種々のグルコシルセラミドをグルコシルセラミド種とよぶことがある。

栗皮抽出物に含まれるフリーセラミド種の種類数は特に制限はされないが、複数種含まれることが好ましく、例えば、５種類以上、６種類以上、７種類以上、８種類以上、９種類以上、又は１０種類以上含まれることが好ましい。含まれるフリーセラミドのうち、５０モル％以上が、スフィンゴイド塩基部分のヒドロキシル基数が３（トリヒドロキシスフィンゴイド塩基）であるフリーセラミド種であることが好ましく、６０モル％以上であることがより好ましく、７０モル％以上であることがさらに好ましく、８０モル％以上であることがよりさらに好ましい。またさらに、含まれるフリーセラミドのうち、５０モル％以上が、セラミドＡＰであることが好ましく、６０モル％以上であることがより好ましく、７０モル％以上であることがさらに好ましく、８０モル％以上であることがよりさらに好ましい。

また、含まれるフリーセラミド種のうち、セラミド骨格における脂肪酸鎖長がＣ２２以上のものが、含まれるフリーセラミドの６０モル％以上であることが好ましく、７０モル％以上であることがより好ましく、８０モル％以上であることがさらに好ましく、９０モル％以上であることがよりさらに好ましい。また、含まれるフリーセラミド種のうち、セラミド骨格における脂肪酸鎖長がＣ２６以上のものが、含まれるフリーセラミドの１０モル％以上であることが好ましく、１５モル％以上であることがより好ましく、２０モル％以上であることがさらに好ましい。

また、含まれるフリーセラミド種のうち、最も多く含まれるものが、セラミド骨格が（ヒドロキシル基を３個有し、炭素数１８で、炭素間二重結合を１個有するスフィンゴイド塩基）−（炭素数２２、炭素間二重結合が０、ヒドロキシル基を１個有する（α−ヒドロキシル基を有する）脂肪酸）の組み合わせであるフリーセラミド種（すなわち、ｔ１８：１−２２：０ｈ）、（ヒドロキシル基を３個有し、炭素数１８で、炭素間二重結合を１個有するスフィンゴイド塩基）−（炭素数２４、炭素間二重結合が０、ヒドロキシル基を１個有する（α−ヒドロキシル基を有する）脂肪酸）の組み合わせであるフリーセラミド種（すなわち、ｔ１８：１−２４：０ｈ）、（ヒドロキシル基を３個有し、炭素数１８で、炭素間二重結合を有さないスフィンゴイド塩基）−（炭素数２４、炭素間二重結合が０、ヒドロキシル基を１個有する（α−ヒドロキシル基を有する）脂肪酸）の組み合わせであるフリーセラミド種（すなわち、ｔ１８：０−２４：０ｈ）、並びに（ヒドロキシル基を３個有し、炭素数１８で、炭素間二重結合を１個有するスフィンゴイド塩基）−（炭素数２６、炭素間二重結合が０、ヒドロキシル基を１個有する（α−ヒドロキシル基を有する）脂肪酸）の組み合わせであるフリーセラミド種（すなわち、ｔ１８：１−２６：０ｈ）の４種のいずれかのフリーセラミド種であることが好ましい。また、含まれるフリーセラミド種のうち、最も多く含まれるものと２番目に多く含まれるものが、上記４種のフリーセラミドの中のいずれか２種であることがより好ましい。また、含まれるフリーセラミド種のうち、最も多く含まれるもの、２番目に多く含まれるもの、及び３番目に多く含まれるものが、上記４種のフリーセラミドの中のいずれか３種であることがさらに好ましい。また、含まれるフリーセラミド種のうち、最も多く含まれるもの、２番目に多く含まれるもの、３番目に多く含まれるもの、及び４番目に多く含まれるものが、上記４種のフリーセラミドから選択されることがよりさらに好ましい。特に、最も多く含まれるものがｔ１８：０−２４：０ｈであることが好ましい。また、最も多く含まれるものがｔ１８：０−２４：０ｈ、２番目に多く含まれるものがｔ１８：１−２４：０ｈであることがより好ましい。また、最も多く含まれるものがｔ１８：０−２４：０ｈ、２番目に多く含まれるものがｔ１８：１−２４：０ｈ、３番目に多く含まれるものがｔ１８：１−２２：０ｈであることがさらに好ましい。また、最も多く含まれるものがｔ１８：０−２４：０ｈ、２番目に多く含まれるものがｔ１８：１−２４：０ｈ、３番目に多く含まれるものがｔ１８：１−２２：０ｈ、４番目に多く含まれるものがｔ１８：１−２６：０ｈであることが、よりさらに好ましい。

栗皮抽出物に含まれるグルコシルセラミド種の種類数は特に制限はされないが、複数種含まれることが好ましく、例えば、３種類以上、４種類以上、又は５種類以上含まれることが好ましい。含まれるグルコシルセラミドのうち、５０モル％以上が、スフィンゴイド塩基部分のヒドロキシル基数が３（トリヒドロキシスフィンゴイド塩基）であるフリーセラミド種であることが好ましく、６０モル％以上であることがより好ましく、７０モル％以上であることがさらに好ましく、８０モル％以上であることがよりさらに好ましい。

また、含まれるグルコシルセラミド種のうち、最も多く含まれるものが、セラミド骨格が（ヒドロキシル基を３個有し、炭素数１８で、炭素間二重結合を１個有するスフィンゴイド塩基）−（炭素数２２、炭素間二重結合が０、ヒドロキシル基を１個有する（α−ヒドロキシル基を有する）脂肪酸）の組み合わせであるグルコシルセラミド種（すなわち、ｔ１８：１−２２：０ｈ）であることが好ましく、当該グルコシルセラミド種含有量が栗皮抽出物に含まれるグルコシルセラミドの３０モル％以上であることが好ましく、４０モル％以上であることがより好ましく、５０モル％以上であることがさらに好ましい。また、含まれるグルコシルセラミド種のうち、最も多く含まれるものがｔ１８：１−２２：０ｈであり、且つ２番目に多く含まれるもの及び３番目に多く含まれるものが、セラミド骨格が（ヒドロキシル基を３有し、炭素数１８で、炭素間二重結合を１有するスフィンゴイド塩基）−（炭素数２５、炭素間二重結合が０、ヒドロキシル基を１有する（α−ヒドロキシル基を有する）脂肪酸）の組み合わせであるグルコシルセラミド種（すなわち、ｔ１８：１−２５：０ｈ）、及び（ヒドロキシル基を３有し、炭素数１８で、炭素間二重結合を１有するスフィンゴイド塩基）−（炭素数２４、炭素間二重結合が０、ヒドロキシル基を１有する（α−ヒドロキシル基を有する）脂肪酸）の組み合わせであるグルコシルセラミド種（すなわち、ｔ１８：１−２４：０ｈ）から選択されることがより好ましい。特に、２番目に多く含まれるものがｔ１８：１−２５：０ｈ、３番目に多く含まれるものがｔ１８：１−２４：０ｈであることが好ましい。

また、栗皮抽出物に含まれるフリーセラミド及びグルコシルセラミド全量のうち、スフィンゴイド塩基部分のヒドロキシル基数が３であるセラミドが７０モル％以上であることが好ましく、８０モル％以上であることがさらに好ましい。

なお、ここでのフリーセラミド種の含有量（モル％）及びグルコシルセラミド種の含有量（モル％）は、栗皮抽出物の全脂質を精製した後、当該全脂質をＬＣ−ＭＳ解析によって得られる各フリーセラミド種又は各グルコシルセラミド種のピークの面積比から算出される値である。ＬＣ−ＭＳ解析は、フリーセラミド解析はネガティブイオンモード、グルコシルセラミド解析はポジティブイオンモードにより行う。

栗皮抽出物に含まれるフリーセラミド及びグルコシルセラミドの重量比（フリーセラミド／グルコシルセラミド）は、１〜１０であることが好ましく、１〜７であることがより好ましく、１〜５であることがさらに好ましく、１〜３であることがよりさらに好ましく、１〜２であることが特に好ましい。ここでの重量比は、栗皮抽出物の全脂質を精製した後、当該全脂質を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）デンシトメトリー法により定量して得た値の比である。

なお、上記の栗皮抽出物に含まれるフリーセラミド及びグルコシルセラミドに関する事項は、１又は複数を組み合わせることで、より好ましいものを規定することができる。

栗皮抽出物は、水、エタノール、又は水及びエタノールの混合液により栗皮から抽出されるものであることが好ましい。また、１，３−ブチレングリコール、アセトンも抽出溶媒として用いることができる。水及びエタノールの混合液を用いる場合、その混合容量比率は、特に制限はされないが、例えば水：エタノールが０．１〜３０：９９．９〜７０程度が好ましく、特に９５〜９９．９ｖ／ｖ％エタノールが好ましい。

抽出に用いる栗皮としては、鬼皮及び渋皮のいずれも用いることができ、これらを選別してから抽出に供してもよいし、特に選別せず栗皮として抽出に供してもよい。また、栗皮を得る栗の品種も特に制限はされない。好ましい品種の一例として、栗皮が種子部（可食部）から剥離しやすい「ぽろたん」が挙げられる。

本発明は、栗皮から上記抽出溶媒を用いて、上記栗皮抽出物を抽出する（製造する）方法も包含する。当該方法は、上記抽出溶媒により栗皮を抽出する工程を含む。さらに、抽出工程前に、栗皮乾燥工程及び／又は栗皮の破砕工程を、また、抽出工程後に濃縮乾固する工程、等を含んでもよい。

より具体的な抽出方法としては、例えば次の方法が好ましく挙げられる。まず栗皮を乾燥させ粉砕し、粉砕物を抽出溶媒（例えば９５ｖ／ｖ％エタノールの含水エタノール）に加え、３０〜５０℃程度で約１２〜２４時間静置又は撹拌して抽出を行う。その後、固液分離処理を行い、栗皮を除去して抽出液を回収する。固液分離処理は、例えば濾過、遠心分離、圧搾法（例えばフィルタープレス）などにより行うことができる。溶媒回収率に優れたフィルタープレス等の圧搾法が好ましい。得られた抽出液をそのまま栗皮抽出物として用いることもできるし、濃縮乾固して固形物（粉末状）として用いることもできる。濃縮乾固は、例えばロータリーエバポレーター等を用いて行うことができる。

上述した、栗皮抽出物の全脂質の精製は、次のようにして行う。抽出液を濃縮乾固して得た固形状抽出物（粉末エキス）を、Ｆｏｌｃｈ法にて水溶性画分と脂溶性画分とに分画し、下層（脂溶性画分）を回収して濃縮乾固する。より詳細には、粉末エキスをクロロホルム／メタノール（２：１，ｖ／ｖ）９容量部に溶解し、これに水２．２５容量部を添加してよく撹拌した後、遠心分離して脂溶性画分を回収して濃縮乾固する。

栗皮抽出物は、フリーセラミド及びグルコシルセラミド以外の、他の成分を含んでいてもよい。当該他の成分としては、例えば栗皮に含まれる成分、抽出操作に用いられる成分（特に抽出溶媒）等が挙げられる。より具体的には、例えばプロアントシアニジン（タンニン酸）、水、エタノール等が挙げられるが、特に限定はされない。また栗皮抽出物におけるフリーセラミド及びグルコシルセラミドの含有量も、特に制限はされず、適宜精製するなどして、設定することができる。例えば、０．０１〜５０重量％、０．１〜１０重量％、又は１〜５重量％などが例示できるが、特に限定はされない。またさらに、抽出物の精製条件によって、セラミドとしてフリーセラミドのみを含む抽出物（フリーセラミド画分）、あるいはセラミドとしてグルコシルセラミドのみを含む抽出物（グルコシルセラミド画分）を得ることもできる。本発明はこのようなフリーセラミド画分、グルコシルセラミド画分をも包含する。当該フリーセラミド画分に含まれるフリーセラミドについては、好ましくは上述した栗皮抽出物に含まれるフリーセラミドについての説明が同様にあてはまる。また、当該グルコシルセラミド画分に含まれるグルコシルセラミドについても、好ましくは上述した栗皮抽出物に含まれるグルコシルセラミドについての説明が同様にあてはまる。

なお、フリーセラミド画分及びグルコシルセラミド画分は、例えば、次のようにして得ることができる。すなわち、栗皮抽出物（好ましくは固形物、例えば粉末状）をアセトンで繰り返し抽出することにより、アセトン可溶のグルシルセラミドとアセトン不溶のフリーセラミドを分離精製することができる。このときの溶媒の温度は、例えば室温（１５℃〜３５℃、とくに２０〜３０℃）が好ましい。あるいは、含水エタノール（エタノールが５０〜９０ｖ／ｖ％、とくに５０〜７０ｖ／ｖ％）で繰り返し抽出することにより、親水性の高いグルコシルセラミドと疎水性の高いフリーセラミドとを分離精製することができる。

上述のように、ヒトの肌（特に角質層）の健康（抗老化）のためには、特にヒドロキシル基を比較的多く（特に３又は４個）有するフリーセラミド（中でも好ましくはセラミドＡＰ）の補給が重要と考えられており、またセラミドの脂肪酸の炭素鎖長が比較的長い（特にＣ２０以上、Ｃ２０、Ｃ２２、Ｃ２４、又はＣ２６など）ことが、皮膚バリア機能を亢進するために重要であると考えられている。本発明の一実施形態に係る栗皮抽出物及び各画分は、セラミドＡＰを多く含み、且つ脂肪酸の炭素鎖長が比較的長いセラミドを多く含むため、特に肌の機能改善、保湿、抗老化、バリア機能改善などに特に好適に用いることができる。より具体的には、例えば、皮膚の乾燥を防ぐ、肌のキメを整える、肌に潤いを与える、肌荒れを防ぐ、肌を滑らかにする、しわの改善、乾燥性小じわの改善、等のために有用である。特に角層水分量を増加させる、又は経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を減少させる、といった効果に優れており、このような用途に好適である。

また、本発明の別の実施形態に係る栗皮抽出物は、栗皮アセトン抽出物に係る。アセトン抽出に供される栗皮は、上記に同じものを好ましく用いることができる。また、アセトン抽出前に、予めアルコール（好ましくはエタノール）抽出を行い、得られた栗皮エタノール抽出物をアセトン抽出することがより好ましい。

好ましいアセトン抽出の一具体例としては、まず栗皮を乾燥させ粉砕し、粉砕物を抽出溶媒（例えばアルコール、より具体的には例えば９５ｖ／ｖ％エタノールの含水エタノール）に加え、３０〜５０℃程度で約１２〜２４時間静置又は撹拌してアルコール抽出を行い、さらに当該アルコール抽出物に対してアセトン抽出を行う方法が挙げられる。

栗皮アセトン抽出物は、優れた紫外線吸収効果及び／又は紫外線波長変換効果（より具体的には、例えば紫外線の可視光への変換効果）を示す。このため、当該栗皮アセトン抽出物及びこれを含む組成物は、紫外線吸収用又は紫外線波長変換用（好ましくは紫外線の可視光への変換用）として用いることができる。

またさらに、栗皮アセトン抽出物は、上記フリーセラミド及びグルコシルセラミドを含む栗皮抽出物と組み合わせて用いることにより、優れた水分蒸発抑制効果も示す。このため、これら２種の抽出物を含む組成物は、保湿、抗皮膚老化、皮膚バリア改善用、あるいは抗紫外線用として用いることができる。

上記各栗皮抽出物及び各画分は、化粧品分野において好適に用いることができる。本発明は、当該栗皮抽出物又は画分含む化粧品組成物を包含する。当該化粧品組成物としては、上記栗皮抽出物又は画分そのものであってもよいが、栗皮抽出物又は画分以外に担体などその他の成分等を含むものであってもよい。

化粧品分野にて用いられる、上記栗皮抽出物又は画分を含む化粧品組成物は、化粧品用として許容される媒体、基剤、担体、添加剤、さらに必要に応じてその他化粧品用として許容される成分及び材料を、上記栗皮抽出物又は画分に適宜配合して、常法に従って製造され得る。当該化粧品組成物の形態としては、例えば、乳液、化粧水、クリーム、美容液、ファンデーション、パック、日焼け止め等を挙げることができる。このような本発明に係る化粧品組成物は、例えば、保湿用、抗皮膚老化用（例えば乾燥肌、肌荒れ、肌のシワ・たるみ等の予防又は改善用）、皮膚バリア改善用として好ましく用いることができる。

またあるいは、当該栗皮抽出物及び各画分は、食品分野においても好適に用いることができる。本発明は、当該栗皮抽出物又は画分を含む食品組成物を包含する。当該食品組成物としては、上記栗皮抽出物又は画分そのものであってもよいが、栗皮抽出物又は画分以外に担体などその他の成分等を含むものであってもよい。

この場合、他の成分としては、食品衛生学上許容される基剤、担体、添加剤、さらに必要に応じてその他食品として利用され得る成分及び材料が例示できる。また、当該食品組成物の形態も特に制限されず、例えば加工食品、飲料、健康食品（栄養機能食品、特定保健用食品、機能性表示食品等）、サプリメント、病者用食品（病院食、病人食又は介護食等）等が例示できる。これらは常法により調製することができる。特に、健康食品（栄養機能食品、特定保健用食品、機能性表示食品等）、又はサプリメントとして、ケトン体産生促進食品組成物を調製する場合は、継続的な摂取が行いやすいように、例えば顆粒、カプセル、錠剤（チュアブル剤等を含む）、飲料（ドリンク剤）等の形態で調製することが好ましく、なかでもカプセル、タブレット、ドリンク剤等の形態が摂取の簡便さの点からは好ましいが、特にこれらに限定されるものではない。

なお、当該食品組成物には、食品添加物組成物も包含され、特に食品添加物組成物として用いられる場合には、その形態としては、例えば液状、粉末状、フレーク状、顆粒状、ペースト状のものが挙げられる。より具体的には、調味料（醤油、ソース、ケチャップ、ドレッシング等）、フレーク（ふりかけ）、焼き肉のたれ、スパイス、ルーペースト（カレールーペースト等）等が例示できる。

あるいはまた、当該栗皮抽出物及び各画分は、医薬品分野においても好適に用いることができる。本発明は、当該栗皮抽出物又は画分を含む医薬品組成物を包含する。当該医薬品組成物としては、上記栗皮抽出物又は画分そのものであってもよいが、栗皮抽出物又は画分以外に担体などその他の成分等を含むものであってもよい。

医薬品分野にて用いられる、上記栗皮抽出物又は画分を含む医薬品組成物は、医薬品用として許容される媒体、基剤、担体、添加剤、さらに必要に応じてその他医薬品用として許容される成分及び材料を、上記栗皮抽出物又は画分に適宜配合して、常法に従って製造され得る。当該医薬品組成物の形態としては、例えば、液剤、懸濁剤、乳剤、乳液剤、ジェル剤、クレーム剤、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等の製剤に調製することができる。特に、外用剤（外用組成物）又は経口剤（経口組成物）として用いることが好ましい。

上記化粧品組成物、食品組成物及び医薬品組成物における栗皮抽出物又は画分の含有量は、特に制限されず、適宜設定することができる。例えば、１００〜０．０１重量％、又は９９〜０．１重量％が例示できる。

上記化粧品組成物及び医薬品組成物の適用対象も特に制限はされないが、特に加齢により肌の衰え（たるみ、しわ、くすみ、肌荒れ等）が気になる方に好適である。例えば、２０歳以上、３０歳以上、４０歳以上、５０歳以上、又は６０歳以上の女性に好適である。

なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。

以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。なお、下記の例において、特に断らない場合、セラミドＡＰはセラミドＡＰ１のことを、セラミドＤＰはセミラドＡＰ２のことを示す。また、エタノールの％表記はエタノール水溶液におけるエタノール容量％を示す。例えば９５％エタノールは、９５ｖ／ｖ％エタノールのエタノール水溶液を示す。

栗皮の調製
栗皮が種子部（可食部）から剥離しやすい品種「ぽろたん」を検討に用いた。栗皮と種子の重量割合は約３０：７０であった。手作業で剥離した鬼皮と渋皮の平均水分率はそれぞれ約３０％であった。乾燥後の栗皮の鬼皮と渋皮の平均重量割合は６８：３２であった。

渋皮と鬼皮の分析
渋皮と鬼皮を粉砕し、各６０ｇに４倍容の９５％エタノールを添加し、４０℃に維持しながら１８時間撹拌して抽出した。吸引ろ過（アドバンテックＮｏ．１ろ紙）後、ろ液をロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。エキス収率は渋皮と鬼皮とでそれぞれ５．０％と０．８％であった。鬼皮についてはろ過残渣に再度９５％エタノールを８０ｍＬ添加し同様の操作を行った。この時のエキス収率は０．３％であった。渋皮エキスはプロアントシアニジン（タンニン酸）が主成分と推測される赤褐色粉末であった。

各エキスからＦｏｌｃｈ法にて水溶性画分と脂溶性画分とに分画した。すなわち、渋皮エキス０．４８ｇおよび鬼皮エキス０．４４ｇをそれぞれクロロホルム／メタノール（２：１，ｖ／ｖ）９ｍＬに溶解し、水２．２５ｍｌを添加してよく撹拌した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）した。下層を分取して濃縮乾固すると、渋皮エキスからの分画と鬼皮エキスからの分画とで、それぞれ１７ｍｇと１４２ｍｇの全脂質（ＴＬ）のサンプルが得られた。以下、このようにして得られた全脂質（サンプル）をＴＬと呼ぶことがある。エキスあたりのＴＬ収率はそれぞれ３．５％および３２．２％であった。

得られたＴＬをクロロホルム／メタノール／水（９０：１０：１，ｖ／ｖ／ｖ）を展開溶媒としてケイ酸薄層クロマトグラフィー（以下ＴＬＣ）にて分析した（図３）。検出は５０％硫酸塗布後に加熱して行った。渋皮ＴＬはレーン１、鬼皮ＴＬはレーン２に示す。レーン４のスポットはコーン由来グルコシルセラミドとαリグノセリル‐ファイトスフィンゴシン（セラミドＡＰ）である。両皮は共通した脂質パターンを示し、植物に一般的に含まれるステロール類（ステロール（Ｓ）、アシルステリルグルコシド（ＡＳＧ）、ステリルグルコシド（ＳＧ））、及びグルコシルセラミド（ＧＣ）が含まれていた。

さらに、アシルステリルグルコシドとステリルグルコシドのスポットの間に濃い二つのスポットが検出された。これらはフリーセラミド（Ｃｅｒ）で、上段はα（２）−ヒドロキシ脂肪酸‐ファイトスフィンゴシン（セラミドＡＰ〔セラミド６ＩＩともいう〕に相当）で、下段のフリーセラミドは２，３−ジヒドロキシ脂肪酸‐ファイトスフィンゴシン（セラミドＤＰ）と判断される。

栗皮の分析
栗の渋皮と鬼皮の両方にフリーセラミドとグルコシルセラミドが含まれることが確認されたため、栗皮全体から抽出試作を行った。乾燥栗皮１．０２ｋｇをミルサーで粉砕し、９５％エタノールを３．５Ｌ添加して５時間撹拌抽出を行った。その後、吸引ろ過（アドバンテックＮｏ．１ろ紙）し、ろ液をロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。乾固後に赤褐色の粉末エキスが３１．９ｇ（３．１％）得られた。エキス中のＴＬ含量は１２．９％であった。得られたＴＬを同様にＴＬＣ分析したところ、フリーセラミドとグルコシルセラミドのスポットが確認された（図３、レーン３）。

スフィンゴ脂質の定量
ＴＬ中の各スフィンゴ脂質の含量をＴＬＣデンシトメトリー法により定量した。標準試薬としてコーン由来グルコシルセラミドとα−リグノセリル−ファイトスフィンゴシン（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒｌｉｐｉｄｓ）を使用した。展開溶媒はクロロホルム／メタノール／水（９０：１０：１，ｖ／ｖ／ｖ）を用いた。栗皮のグルコシルセラミド含量はＴＬあたり１４０ｍｇ／ｇ、エキスあたり１８ｍｇ／ｇ、原料あたり０．５６ｍｇ／ｇであった。フリーセラミド含量はセラミドＡＰとセラミドＤＰの合計値として、ＴＬあたり２４２ｍｇ／ｇ（ＡＰ１１２ｍｇ，ＤＰ１３０ｍｇ）、エキスあたり３１．２ｍｇ／ｇ、原料あたり０．９７ｍｇ／ｇであった。

なお、他の植物のグルコシルセラミドの含量としては、桃１．７ｍｇ／ｇ、リンゴ搾汁残渣０．９ｍｇ／ｇ、米ぬか０．２ｍｇ／ｇなどが報告されている。

ＬＣ−ＭＳ分析
次にＬＣ−ＭＳによりスフィンゴ脂質の構造解析を行った。解析条件は次の通りである。
装置：島津Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ−ｉＬＣ−２０３０Ｃ；検出器：島津ＬＣＭＳ −２０２０ＥＳＩ、スキャンモードｍ／ｚ６５０ − ９００（グルコシルセラミド）、ｍ／ｚ５００−８００（フリーセラミド）、インターフェイス温度：３５０℃、ネブライザー流量１．５Ｌ／ｍｉｎ、ヒートブロック温度：２００℃、Ａ液：５ｍＭギ酸アンモニウム／メタノール、Ｂ液：５ｍＭギ酸アンモニウム、アイソクラティック条件（Ａ／Ｂ＝９８：２）、カラム：ＷａｔｅｒｓＳｕｎＦｉｒｅＴＭ（Ｃ１８，５ｕｍ，４．６×２５０ｍｍ）、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ

栗皮エキスのスフィンゴ脂質について、ＬＣ−ＭＳにより構造解析を行った。なお、ＬＣ−ＭＳ解析には、全脂質を用い、ＬＣ−ＭＳのモードを切り換えることでグルコシルセラミドとフリーセラミドの解析し分けた。（つまり、ポジティブモードならグルコシルセラミドがイオン化されやすく、ネガティブモードだとフリーセラミドがイオン化されやすいという点を利用して、グルコシルセラミドはポジティブイオンモード、フリーセラミドはネガティブイオンモードで分析した。）また、グルコシルセラミドとフリーセラミドではリテンションタイムも異なる点も加味して解析した。グルコシルセラミドとして７種のピークが、フリーセラミドとして１３種のピークが検出された（図４）。マススペクトル解析（とＥＣＮ〔ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｃａｒｂｏｎｎｕｍｂｅｒ〕および標準品との比較）の結果から判定した分子種を表にして図５に示す。なお、図５中の分子種に示した略語は、セラミド骨格のスフィンゴイド塩基−脂肪酸を示したもので、例えばｔ１８：１はトリヒドロキシ塩基／炭素数１８／二重結合１個を示しており、２６：０ｈは脂肪酸炭素数２６／二重結合０個／αヒドロキシ、を意味する。グルコシルセラミドの７種のピークのうち６種がフィトタイプといわれるトリヒドロキシ塩基であった。最大成分の４−ヒドロキシスフィンゲニン‐αヒドロキシベヘン酸（ｔ１８：１−２２：０ｈ）はトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）の面積割合から５２％であり、他にＣ２４〜Ｃ２６の超長鎖脂肪酸結合型も含まれていた。

フリーセラミドの１３種のピークからはマススペクトル解析により少なくとも１８種のセラミドが同定された（図５）。スフィンゴイド塩基はすべてトリヒドロキシ塩基で、飽和型と８−不飽和型が存在していた。不飽和型はほとんどトランス型であった。脂肪酸はＣ２２〜Ｃ２７の鎖長を有する超長鎖脂肪酸で構成されていた。Ｃ２６以上の鎖長をもつセラミドは５種確認され、全体の２０％以上を占めていた。

なお、スフィンゴイド塩基の炭素間二重結合に基づく構造異性体（シス型又はトランス型）については、次のようにしてＧＣ分析により確認した。セラミド５ｍｇを１ＭＨＣｌメタノール溶液２ｍｌにて７０℃、１８時間処理して総スフィンゴイド塩基を遊離させた。２ｍｌのヘキサンで脂肪酸を３回抽出除去し、６ＭＮａＯＨでｐＨ１０に調整した後、水２ｍｌを加えてスフィンゴイド塩基を２ｍｌのジエチルエーテルで３回抽出した。遊離のスフィンゴイド塩基はトリメチルシリルエーテル誘導体とし、ＧＣ分析に供した。トランス体はシス体よりも保持時間が早く検出される点を利用して、シス体及びトランス体を確認した。（解析条件、ＧＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ６８９０Ｎ，Ｃｏｌｕｍｎ：ＣＰ−Ｓｉｌ８８）

一般に植物グルコシルセラミドには４，８−スフィンガジエニン及び８−スフィンゲニンといったジヒドロキシ塩基が多く含まれ、且つ脂肪酸鎖長が２２以上はマイナー成分であることが知られているが、栗皮から得られたセラミドはトリヒドロキシスフィンゴイド塩基が多く含まれ、且つ炭素鎖長が２２以上の脂肪酸が多く含まれており、従来知られていた植物グルコシルセラミドの組成とは大きく異なることが明らかとなった。

化学合成セラミド（例えば化粧品原料として利用されている）は一般にＣ１８脂肪酸から構成されているが、ヒト角質セラミドにおいてＣ１８脂肪酸セラミドの割合が増加するとバリア機能が低下することが報告されている。一方、超長鎖脂肪酸の割合が増えるとバリア機能が上昇し、とくにＣ２６セラミドはバリア機能に重要な役割を担っていることも報告されている。従って、栗皮由来のセラミドは、肌のバリア機能向上又は改善のために有用であると考えられる。

また、特に肌機能のためには、セラミドにおける脂肪酸及びスフィンゴイド塩基が飽和型か、炭素間二重結合を有する場合にはトランス型が好ましいとされており、栗皮由来のセラミドにおいては、脂肪酸は飽和型が豊富である点、及びスフィンゴイド塩基は飽和型又はトランス型である点、からも、有用であると考えられる。

栗における部位間の違いの検討
次に、栗の子実（可食部）のスフィンゴ脂質の検出を行うために、上記と同様にＴＬを抽出し、アルカリ処理を行った。すなわち、２５ｍｇのＴＬをとり、０．４Ｍメタノール性ＫＯＨを３ｍＬ添加し、３７℃で４０分間処理した。室温に戻した後、クロロホルム６ｍＬと水２．２５ｍＬを添加して撹拌後、遠心分離して下層を回収した。下層からの回収液をロータリーエバポレーターで濃縮乾固してアルカリ処理物を調製した。ＴＬＣで検出すると、栗の子実にはグルコシルセラミドは微量検出されたが、フリーセラミドは全く検出されなかった（図６）。このことから、フリーセラミドは栗の皮（外皮：鬼皮及び渋皮）に特異的に含まれることが分かった。なお、アルカリ処理を行ったのは、モノグリコシルジグリセリド（ＭＧＤＧ）というグリセロ糖脂質が栗子実にふくまれており、ＴＬＣ上でちょうどＡＳＧとＳＧの間のフリーセラミドの位置に来ることになるため、これを分解しておくためである。

他の植物の分析
栗以外の植物種子の外皮等についても脂質分析を行った。アーモンド、ピスタチオおよびトチの実の各部位からクロロホルム／メタノール（２：１，ｖ／ｖ）を用いて常法によりＴＬを調製した。ＴＬをＴＬＣで検出すると、いずれにおいてもスフィンゴ脂質はほとんど検出されなかった。（図７）。

精製操作１
栗皮１ｋｇからエタノール抽出により得られたエキスから３ｇ分取し、それを水１０ｍＬによく懸濁し、遠心分離（４℃、１５分、５０００ｒｐｍ）した後、液層を除去した。この操作を３回行った。沈殿物を６６％エタノール１０ｍＬで撹拌し、同様に冷却して遠心分離した。この操作を３回行った。沈殿物をアセトン５ｍＬで撹拌し、同様に冷却して遠心分離した。この操作を２回行った。沈殿物を真空乾燥機で乾燥処理し、０．０６ｇの精製エキス〔１〕を得た。

なお、アセトンで撹拌し、遠心分離した後の上清（すなわち、アセトン可溶部）は回収し、下記の紫外線吸収組成物の調製に利用した。

精製操作２
栗皮１ｋｇからエタノール抽出により得られたエキスから３ｇ分取し、これを水１０ｍＬによく懸濁し、遠心分離（４℃、１５分、５０００ｒｐｍ）した後、液層を除去した。この操作を計３回行った。沈殿物に０．４ＭＮａＯＨ／水を１０ｍＬ添加し、３７℃で１時間処理した。その後、１５℃で遠心分離し、沈殿物を水１０ｍＬで３回洗った。沈殿物にアセトン５ｍＬを添加し、４℃で１５分間遠心分離し、液層を除去した。沈殿物を真空乾燥機で乾燥処理し、０．１９ｇの精製エキス〔２〕を得た。

得られた精製エキスのＴＬＣ分析を行った（図８）。精製エキス〔１〕と〔２〕ともに、グルコシルセラミドに加えてフリーセラミドのスポットが認められた。ＴＬＣデンシトメトリー法により定量すると、精製エキス〔１〕のグルコシルセラミド量は１５．８％、フリーセラミド量は２２．７％であった。

皮膚へ与える影響の検討
精製エキス〔１〕に、さらにエタノール及び活性炭を添加して、ろ過及び脱色した後、真空乾燥機で乾燥処理した。さらに得られた乾燥物を冷アセトンで洗浄したのち真空乾燥機で乾燥処理した。得られた乾燥物を粉砕し、篩過させ、得られた粉末を被験栗セラミドとした。

当該被験栗セラミドをＴＬＣデンシトメトリー法にて検査したところ、ヒト型セラミドが３０〜５０モル％、フィトステロールが３０〜６０モル％、グルコシルセラミドが１０〜３０モル％含まれていた。

当該被験栗セラミドを試験溶媒に溶解させ、被験栗セラミドを０．１質量％濃度含有する被験栗セラミド溶液とした。なお、試験溶液は、水及び１，３−ブチレングリコールの混合溶液（混合質量比率は７３：２５）であり、界面活性剤（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油）を２質量％含有する溶液を用いた。セラミドは難水溶性であるため、界面活性剤を用いて乳化する必要があるためである。

被験栗セラミド溶液を、８０μＬずつ、被験者１０人の前腕内側部に塗布した。そして、塗布前及び塗布１時間後に、皮膚（角層）水分量及び経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を測定した。

皮膚水分量測定はＣＯＲＮＥＯＭＥＴＥＲＣＭ８２５を用いて、経皮水分蒸散量測定はＴｅｗａｍｅｔｅｒＴＭ３００を用いて（いずれもCourage+Khazaka（ドイツ）社製）、それぞれ行った。なお、試験は環境調整室（温度22±2℃、湿度50±10％）で実施し、１部位につき測定部位を約５ｍｍずらして３回以上測定し、平均値を算出した。

また、被験溶媒をプラセボとして、また、被験栗セラミドの代わりに市販のセラミドＡＰを被験溶媒に溶解させたものを被験合成セラミドＡＰ溶液として、上記と同様の検討を行った。当該市販のセラミドＡＰは、純度９９％のセラミドＡＰ１（より詳細には、セラミド６ＩＩ）である。

検討結果を図９に示す。なお、図９における「塗布後」は塗布１時間後を示す。また、当該検討においては、市販セラミドＡＰ及び栗セラミドは、同質量用いた。より具体的には、いずれも、０．１質量％溶液を同量用いて検討した。（上記の通り、栗セラミドにはフィトステロールが含まれているため、結果的に栗セラミドに含まれるセラミド量は市販セラミドＡＰに含まれるセラミド量に比べて少ないと推測される。）

紫外線吸収組成物の調製
精製操作１の工程において、アセトンで撹拌し、遠心分離した遠心上清（すなわちアセトン可溶部）を回収して濃縮乾固し、濃縮乾固物０．１２ｇを得た。これをエタノール２ｍｌに懸濁し、Ｎｏ．１ろ紙で自然ろ過した。ろ液は冷蔵庫で冷却後、再度、Ｎｏ．１ろ紙で自然ろ過した。ろ紙内の固形部（エタノール不溶画分）を回収して合わせ、乾燥させることにより、１２ｍｇの固形部を得た。当該固形部をクロロホルム／メタノール（２：１）６ｍｌに懸濁し、水を１．５ｍｌを添加して撹拌後、遠心分離した。下層（クロロホルム層）を回収して濃縮乾固し、固形物８．４ｍｇを得た。当該固形部を「栗ＵＶＰ」とよぶことがある。

紫外線吸収試験
市販の紫外線Ａ波（ＵＶＡ）吸収剤及び紫外線Ｂ波（ＵＶＢ）吸収剤を、それぞれエタノールに溶解させ、対象として用いた。なお、当該エタノール溶液の各吸収剤濃度は、１０ｐｐｍ又は２０ｐｐｍとした。また、市販の紫外線Ａ波（ＵＶＡ）吸収剤としてジエチルアミノヒドロキシベンゾイル安息香酸ヘキシル（ＵｖｉｎｕｌＡＰｌｕｓＧｒａｎｕｌａｒ，ＢＡＳＦ社製）を、市販の紫外線Ｂ波（ＵＶＢ）吸収剤としてパラメトキシケイ皮酸２−エチルヘキシル（ＥＳＣＡＬＯＬ５５７，Ａｓｈｌａｎｄ社製）を、それぞれ用いた。

栗ＵＶＰの４０ｐｐｍエタノール溶液を調製し、これを被験サンプルとして用いた。

紫外線の吸光度測定は、分光光度計（Ｖ−６３０ＢＩＯ型、日本分光）を用いて、エタノールをブランクとしてスペクトル測定により行った。結果を図１０に示す。栗ＵＶＰの４０ｐｐｍエタノール溶液は、市販合成ＵＶＡ吸収剤約１２．５ｐｐｍに相当する紫外線吸収能を示した。

紫外線照射試験
市販ＵＶＡ吸収剤の２０ｐｐｍエタノール溶液と栗ＵＶＰの４０ｐｐｍエタノール溶液とに、暗所で２５４ｎｍ（１０１３μＷ／ｃｍ^２）又は３６５ｎｍ（１４０７μＷ／ｃｍ^２）の紫外線照射（ハンディーＵＶランプ、アズワン製）を行い、デジタル写真撮影を行った。結果を図１１に示す。図１１では、市販ＵＶＡ吸収剤の２０ｐｐｍエタノール溶液を「市販」と表記し、栗ＵＶＰの４０ｐｐｍエタノール溶液を「栗」と表記する。栗ＵＶＰエタノール溶液では、３６５ｎｍ波長のＵＶ照射により、可視光線が確認された。これにより、栗ＵＶＰは紫外光を可視光に変換することが示された。

限定的な解釈を望むものではないが、以上の結果から、栗ＵＶＰは紫外線で励起され、励起光より波長の長い可視光にシフトして蛍光としてエネルギーを放出できるものと推測される。

水分蒸発抑制試験
１５ｍｌ容口内径１４ｍｍのガラス容器に、ｖｅｈｉｃｌｅ、０．０５質量％栗セラミド溶液、０．０５質量％栗ＵＶＰ溶液、０．０５質量％栗セラミド＋０．０５質量％栗ＵＶＰ溶液、の４種を各５ｇ加え、電子天秤に静置（室温２３℃、湿度５０％）して水分の蒸発による重量の変化を測定し、１時間後の数値（コントロールを１とした相対値）を算出した。結果を図１２に示す。図１２では、前記栗セラミド溶液はＣｅｒ、前記栗ＵＶＰ溶液はＵＶＰ、と表記する。いずれの溶液も、溶媒組成は、界面活性剤（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油）３％、ブチレングリコール３０％、残り水、とした。なお、用いた栗セラミドは、上記「皮膚へ与える影響の検討」で調製した被験栗セラミドである。

ｖｅｈｉｃｌｅは評価成分無添加（すなわち、溶媒そのもの）とした。コントロール（すなわちｖｅｈｉｃｌｅ）の水分蒸発量を１としたとき、栗セラミド群では蒸発割合は０．８４（０．１６減）に、栗ＵＶＰ群では０．９２（０．０８減）に、栗セラミド＋栗ＵＶＰ混合群では０．５５（０．４５減）に低下した。混合群では、単一群の合算値よりも１．８７倍高い数値（０．４５／（０．１６＋０．０８））を示した。
［付記］
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
フリーセラミド及びグルコシルセラミドを含む栗皮抽出物。
［２］
含まれるフリーセラミド及びグルコシルセラミドの重量比（フリーセラミド／グルコシルセラミド）が、１〜１０である、［１］に記載の抽出物。
［３］
含まれるフリーセラミドのうち、５０モル％以上が、スフィンゴイド塩基部分のヒドロキシル基数が３であるフリーセラミドである、［１］又は［２］に記載の抽出物。
［４］
含まれるグルコシルセラミドのうち、５０モル％以上が、スフィンゴイド塩基部分のヒドロキシル基数が３であるグルコシルセラミドである、［１］〜［３］のいずれかに記載の抽出物。
［５］
栗皮抽出物のフリーセラミド画分であって、含まれるフリーセラミドのうち、５０モル％以上が、スフィンゴイド塩基部分のヒドロキシル基数が３であるフリーセラミドである、画分。
［６］
栗皮抽出物のグルコシルセラミド画分であって、含まれるグルコシルセラミドのうち、５０モル％以上が、スフィンゴイド塩基部分のヒドロキシル基数が３であるグルコシルセラミドである、画分。
［７］
［１］〜［４］のいずれかに記載の抽出物、あるいは［５］又は［６］に記載の画分を含む、化粧品組成物、食品組成物、又は医薬品組成物。

Claims

フリーセラミド及びグルコシルセラミドを含む栗皮抽出物の製造方法であって、
栗皮を、エタノールの容量比率が９５〜９９．９体積％のエタノール抽出溶媒で抽出することにより、フリーセラミドとグルコシルセラミドを含むエタノール抽出物を得ること、および、
前記エタノール抽出物をアセトン抽出で精製することにより、アセトン不溶画分とアセトン可溶画分とに分離し、前記アセトン不溶画分として、フリーセラミド及びグルコシルセラミドの重量比（フリーセラミド／グルコシルセラミド）が、１〜１０である栗皮抽出物を得ること
を含む製造方法。
前記アセトン抽出が繰り返して行われる、請求項１に記載の製造方法。
前記栗皮抽出物に含まれる前記フリーセラミドのうち、５０モル％以上が、スフィンゴイド塩基部分のヒドロキシル基数が３のフリーセラミドである、請求項１又は２に記載の製造方法。