JP6680671B2 - 再生可能資源から化合物を生成するための高収量経路 - Google Patents

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    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03002—Acid phosphatase (3.1.3.2)
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    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03008—3-Phytase (3.1.3.8)
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Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２０１３年９月１７日に出願された米国仮出願番号６１／８７８，９９６および２０１４年２月２７日に出願された同６１／９４５，７１５の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく利益を主張する。上述の両方の出願の全体が、参照により本明細書中に援用される。
（技術分野）
本開示は、概して、工業的に有用なアルコール、アミン、ラクトン、ラクタムおよび酸、７〜２５炭素長の直鎖脂肪酸および直鎖脂肪アルコール、６〜２４炭素長の直鎖アルカンおよび直鎖α−アルケンの組成物およびそれらを調製する方法に関する。
（背景）
本開示全体を通して、様々な刊行物、特許および公開特許明細書が、識別引用によって、またはアラビア数字を参照することによって、言及される。これらの刊行物、特許および公開特許明細書は、当該分野の状況をより十分に説明するために、参照によりそれらの全体が本開示に援用される。
アジピン酸（ＡＤＡ）は、２０１２年に推定２３０万メートルトンの需要がある、広く使用されている化学物質である（ＩＨＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｒｅｐｏｒｔ：Ｂｉｏ−Ｂａｓｅｄ Ａｄｉｐｉｃ Ａｃｉｄ（Ｄｅｃ．２０１２））。アジピン酸は、ヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤＡ）とともに、ナイロン６，６、ポリエステル樹脂、可塑剤、食品および他の材料の生産に使用される。したがって、再生可能資源を使用してアジピン酸およびＨＭＤＡを高収量で調製する方法が、非常に望まれている。
グルタル酸は、主に、ポリウレタンおよびポリエステルの主構成要素である１，５−ペンタンジオールの生産のために工業的に使用されている。１，６−ヘキサンジオールは、末端ヒドロキシル基を有する直鎖ジオールである。それは、工業塗料の用途のポリエステル、自動車用途の二成分ポリウレタン塗料において使用される。それは、寄木張り床および革コーティングのためのエラストマーおよびポリウレタン分散液において使用されるマクロジオール（ｍａｃｒｏｄｉｏｌｓ）、例えば、アジピン酸エステルおよびポリカーボネートジオールを生成するためにも使用される。
１−ブタノール、１−ペンタノールおよび１−ヘキサノールは、工業用溶媒として広く使用されている。また、これらは脱水されることにより、ポリエチレン用途のためのコモノマー使用される１−ブテン、１−ペンテン、１−ヘキセン（ｈｅｘｅｎｃｅ）を生成し得る。１−ブタノールは、優れたガソリン代替品でもある。１−ヘキサノールは、香料産業において（芳香として）、香味剤として、工業用溶媒として、流動点降下剤として、泡沫を崩壊する作用物質として、そのまま使用される。１−ヘキサノールは、化学工業における価値ある中間体でもある。
６−アミノ−ヘキサン酸（６−アミノ−カプロン酸またはε−アミノ−カプロン酸とも称される）は、環化によってε−カプロラクタムに変換され得る。ε−カプロラクタムは、多くの種々の産業において広く使用されるポリマーであるナイロン６を生成するために使用される。したがって、ε−カプロラクタム前駆体である６−アミノヘキサン酸をより効率的に生成するための方法は、産業上重要である。６−ヒドロキシヘキサン酸は、環化されることにより、ε−カプロラクトンを生成し得、次いで、そのε−カプロラクトンは、アミノ化されることにより、ε−カプロラクタムを生成し得る。
酪酸、ペンタン酸およびヘキサン酸は、食品、添加物およびプラスチック業界における用途を有するエステルを調製するために、工業的に（ｉｎｄｓｕｔｒｉａｌｌｙ）広く使用されている。
直鎖脂肪酸（Ｃ７−Ｃ２５）は、石油由来のディーゼル分子まで触媒的にあと１工程の分子クラスである。遊離脂肪酸は、酸によって触媒されるエステル化を介してバイオディーゼル油に組み込まれることに加えて、触媒的に脱炭酸されてディーゼル範囲の直鎖アルカンを生じ得る。脂肪酸は、界面活性剤として、例えば、洗剤および石鹸において、商業的に使用される。
１６個より多い炭素原子を有するアルカンおよびα−アルケンは、燃料油および潤滑油の重要な構成要素である。室温において固体である、さらにより長いアルカンは、例えば、パラフィンろうとして使用され得る。より長鎖のアルカン（例えば、５〜１６個の炭素）は、輸送燃料（例えば、ガソリン、ディーゼルまたは航空燃料）として使用される。
直鎖脂肪アルコール（Ｃ７−Ｃ２５）は、主に、洗剤および界面活性剤の生成において使用される。脂肪アルコールは、両親媒性の性質のおかげで、洗剤として有用な非イオン性界面活性剤として振る舞う。
直鎖脂肪二酸（Ｌｉｎｅａｒ ｆａｔｔｙ ｄｉａｃｉｄ）のセバシン酸は、可塑剤、潤滑剤、作動流体、化粧品、ろうそくなどにおいて使用され得る。セバシン酸は、香料、防腐薬および塗装材料に対する中間体としても使用される。ドデカン二酸は、接着剤、潤滑剤、ポリアミド繊維、樹脂、ポリエステル塗料および可塑剤を製造するために使用される。したがって、これらの化学物質を効率的に生成するための方法は、産業上重要である。
（要旨）
再生可能資源を使用して、１−ブタノール、酪酸、コハク酸、１，４−ブタンジオール、１−ペンタノール、ペンタン酸、グルタル酸、１，５−ペンタンジオール、１−ヘキサノール、ヘキサン酸、アジピン酸、１，６−ヘキサンジオール、６−ヒドロキシヘキサン酸、ε−カプロラクトン、６−アミノ−ヘキサン酸、ε−カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、７〜２５炭素長の直鎖脂肪酸および直鎖脂肪アルコール、６〜２４炭素長の直鎖アルカンおよび直鎖α−アルケン、セバシン酸ならびにドデカン二酸を高収量で調製するための新規の方法、組成物および天然に存在しない微生物生物が本明細書中に開示される。
一態様において、本開示は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩもしくはＩＶの化合物：
Figure 0006680671
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＮＨ２またはＣＯ２Ｈであり、
Ｒ２は、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＮＨ２またはＣＯ２Ｈであり、
Ｒ３は、ＣＨ２ＣＨ３またはＣＨ＝ＣＨ２であり、
ｒは、４であり；
ｓは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３であり、
ｔは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１である）
またはその塩あるいはその化合物またはその塩の溶媒和物を調製するための方法を提供し、この方法は、酵素的工程または酵素的工程と化学的工程との組み合わせを含む。
いくつかの態様において、上記方法は、（ａ）アルドール付加を介して、ＣＮアルデヒドおよびピルベートをＣＮ＋３β−ヒドロキシケトン中間体に変換し；次いで（ｂ）酵素的工程または酵素的工程と化学的工程との組み合わせを介して、そのＣＮ＋３β−ヒドロキシケトン中間体を式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩもしくはＩＶの化合物またはその塩あるいはその化合物またはその塩の溶媒和物に変換する条件下の溶液中でＣＮアルデヒドおよびピルベートを混和するかまたはインキュベートする工程を含むか、あるいはその工程から本質的になるか、またはなおもさらにその工程からなる。いくつかの態様において、Ｎは、ｓ−１であるか、またはＮ＝ｔ＋１であるか、またはＮ＝ｒ−１であり、ここで、Ｎは、１〜２２であり、好ましくは、Ｎは、１〜６であり、ｓは、２〜２３であり、好ましくは、ｓは、２〜７であり、ｔは、２〜２１、好ましくは（ｐｒｅｆｅｒｅａｂｌｙ）、ｔは、９〜１９である。ある特定の態様において、Ｎ＝ｓであるが、但し、ｓ＝３である。いくつかの態様において、Ｎは、ｓと等しくない。
いくつかの態様において、本開示は、１−ブタノール、酪酸、コハク酸、１，４−ブタンジオール、１−ペンタノール、ペンタン酸、グルタル酸、１，５−ペンタンジオール、１−ヘキサノール、ヘキサン酸、アジピン酸、１，６−ヘキサンジオール、６−ヒドロキシヘキサン酸、ε−カプロラクトン、６−アミノ−ヘキサン酸、ε−カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、７〜２５炭素長の直鎖脂肪酸および直鎖脂肪アルコール、６〜２４炭素長の直鎖アルカンおよび直鎖α−アルケン、セバシン酸もしくはドデカン二酸から選択される化合物またはそれらの混合物またはそれらの塩またはその化合物もしくはその塩の溶媒和物を調製するための方法を提供し、前記方法は、ａ）アルドール付加を介して、ＣＮアルデヒドおよびピルベートをＣＮ＋３β−ヒドロキシケトン中間体に変換する工程；およびｂ）酵素的工程または酵素的工程と化学的工程との組み合わせを介して、そのＣＮ＋３β−ヒドロキシケトン中間体を上記化合物に変換する工程を含むか、あるいはその工程から本質的になるか、またはなおもさらにその工程から成り、ここで、Ｎは、Ｍ−３であり、Ｍは、調製されている化合物における炭素の数であり、Ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２である。
上で述べた方法の一態様において、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの化合物、あるいは１−ブタノール、酪酸、コハク酸、１，４−ブタンジオール、１−ペンタノール、ペンタン酸、グルタル酸、１，５−ペンタンジオール、１−ヘキサノール、ヘキサン酸、アジピン酸、１，６−ヘキサンジオール、６−ヒドロキシヘキサン酸、ε−カプロラクトン、６−アミノ−ヘキサン酸、ε−カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、７〜２５炭素長の直鎖脂肪酸および直鎖脂肪アルコール、６〜２４炭素長の直鎖アルカンおよび直鎖α−アルケン、セバシン酸ならびにドデカン二酸から選択される化合物またはそれらの塩またはその化合物もしくはその塩の溶媒和物を調製するための宿主として微生物が使用される。本明細書中で使用されるとき、「宿主」とは、細胞または微生物の内側で（例えば、出発物質を取り込み、および必要に応じて、生成物を分泌することによって）または外側で（例えば、酵素を分泌することによって）反応を触媒することができる１つ以上の酵素を産生し得る、細胞または微生物のことを指す。
本開示の一態様は、１−ブタノール、酪酸、コハク酸、１，４−ブタンジオール、１−ペンタノール、ペンタン酸、グルタル酸、１，５−ペンタンジオール、１−ヘキサノール、ヘキサン酸、アジピン酸、１，６−ヘキサンジオール、６−ヒドロキシヘキサン酸、ε−カプロラクトン、６−アミノ−ヘキサン酸、ε−カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、７〜２５炭素長の直鎖脂肪酸および直鎖脂肪アルコール、６〜２４炭素長の直鎖アルカンおよび直鎖α−アルケン、セバシン酸ならびにドデカン二酸から選択される化合物またはそれらの混合物、またはそれらの塩、またはその化合物もしくはその塩の溶媒和物を調製するための方法を提供し、その方法は、（ａ）アルドール付加を介して、ＣＮアルデヒドおよびピルベートをＣＮ＋３β−ヒドロキシケトン中間体に変換し；次いで、（ｂ）酵素的工程を介して、そのＣＮ＋３β−ヒドロキシケトン中間体を上記化合物に変換する条件下の溶液中でＣＮアルデヒドおよびピルベートを混和するかまたはインキュベートする工程を含むか、あるいはその工程から本質的になるか、またはなおもさらにその工程から成り、ここで、Ｎは、Ｍ−３であり、Ｍは、調製されている化合物における炭素の数であり、Ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２である。
いくつかの態様において、上記方法は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの化合物、あるいは１−ブタノール、酪酸、コハク酸、１，４−ブタンジオール、１−ペンタノール、ペンタン酸、グルタル酸、１，５−ペンタンジオール、１−ヘキサノール、ヘキサン酸、アジピン酸、１，６−ヘキサンジオール、６−ヒドロキシヘキサン酸、ε−カプロラクトン、６−アミノ−ヘキサン酸、ε−カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、７〜２５炭素長の直鎖脂肪酸および直鎖脂肪アルコール、６〜２４炭素長の直鎖アルカンおよび直鎖α−アルケン、セバシン酸もしくはドデカン二酸またはそれらの塩またはその化合物もしくはその塩の溶媒和物を、溶液、培養液および／または宿主細胞から単離する工程をさらに含むか、あるいはその工程から本質的になるか、またはなおもさらにその工程からなる。
上記方法のいくつかの態様において、条件は、クラスＩ／ＩＩピルビン酸依存性アルドラーゼの存在を含むか、あるいはその存在から本質的になるか、またはなおもさらにその存在からなる。いくつかの態様において、条件は、デヒドラターゼ、レダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、第一級アルコールデヒドロゲナーゼ、第二級アルコールデヒドロゲナーゼ、ホスファターゼ、ケト酸デカルボキシラーゼ、キナーゼ、補酵素Ａトランスフェラーゼ、補酵素Ａシンターゼ、チオエステラーゼ、補酵素Ａ依存性オキシドレダクターゼ、カルボン酸レダクターゼ、トランスアミナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、アミンオキシダーゼ、ラクトナーゼ、ラクタマーゼ、脂肪酸デカルボキシラーゼ、アルデヒドデカルボニラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼおよびペプチドシンターゼからなる群より選択される１つ以上の酵素の存在下において反応体をインキュベートすることを含むか、あるいはそれから本質的になるか、またはなおもさらにそれからなる。
いくつかの態様において、上記方法の条件は、約１０〜約２００℃の温度、あるいは少なくとも（すべての温度（ｔｅｒｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ）は、摂氏度（ｄｅｇｒｅｅ Ｃｅｌｃｉｕｓ）で提供される）１０、１５、２０、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３７、３７、３８、３９、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０もしくは１９０℃の温度、または１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８もしくは２５℃より高くない温度（ここで、温度の下限は１０である）において、上記構成要素をインキュベートするかまたは接触させることを含むか、あるいはそれから本質的になるか、またはなおもさらにそれからなる。いくつかの態様において、条件は、あるいは、インキュベーション溶液のｐＨが約２〜約１２であることから本質的になるか、またはなおもさらにそれからなる。いくつかの態様において、ｐＨは、少なくとも（ａｔ ｌｅａｔ）２であるか、または約１２までの３、４、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８もしくは９である。いくつかの態様において、ｐＨは、１２、１１、１０、９、８、７．５、７、６．５、６、５．５または４より高くなく、そのｐＨの下限は、２より低くない。
いくつかの態様において、条件は、ピルベートおよびＣＮアルデヒドのモル濃度が、約０．１μモル濃度〜約５モル濃度の濃度に存在することを含むか、あるいはそれから本質的になるか、またはなおもさらにそれからなる。いくつかの態様において、その濃度は、少なくとも約０．１、０．５、１、１０、１００、５００μＭまたは１Ｍである。いくつかの態様において、その濃度は、約４Ｍ、３Ｍ、２Ｍ、１Ｍ、５００μＭ、２００μＭ、１００μＭまたは１０μＭより高くない。ピルベートおよびＣＮの濃度は、独立して、同じであり得るかまたは異なり得、他のインキュベーション条件に伴って変動し得る。
いくつかの態様において、条件は、クラスＩ／ＩＩピルビン酸依存性アルドラーゼ、デヒドラターゼ、レダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、第一級アルコールデヒドロゲナーゼ、第二級アルコールデヒドロゲナーゼ、ホスファターゼ、ケト酸デカルボキシラーゼ、キナーゼ、補酵素Ａトランスフェラーゼ、補酵素Ａシンターゼ、チオエステラーゼ、補酵素Ａ依存性オキシドレダクターゼ、カルボン酸レダクターゼ、トランスアミナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、アミンオキシダーゼ、ラクトナーゼ、ラクタマーゼ、脂肪酸デカルボキシラーゼ、アルデヒドデカルボニラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼおよびペプチドシンターゼからなる群より選択される１つ以上の酵素を産生する非天然の微生物の存在を含む。これらの酵素の各々は、反応特異的酵素であり得る。
いくつかの態様において、微生物または宿主は、上記酵素を過剰発現するように、または野生型対応物よりも多い量で酵素を発現するように遺伝的に操作される。酵素または発現産物の発現レベルを測定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、ＰＣＲによる方法である。
上記方法のいくつかの態様において、Ｃ３アルデヒドは、グリセルアルデヒドではない。
いくつかの態様において、酵素的工程または化学的工程は、エノイルまたはエノエートの還元、ケトンの還元、第一級アルコールの酸化、第二級アルコールの酸化、アルデヒドの酸化、アルデヒドの還元、脱水、脱炭酸、チオエステルの形成、チオエステルの加水分解、チオエステル交換反応、チオエステルの還元、リン酸エステルの加水分解、ラクトン化、ラクタムの形成、ラクタムの加水分解、ラクトンの加水分解、カルボン酸の還元、アミノ化、アルデヒドの脱カルボニル、第一級アミンのアシル化またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様において、Ｃ３アルデヒドは、３−オキソ−プロピオン酸、３−ヒドロキシプロパナール、３−アミノ−プロパナールまたはプロパナールを含む群あるいはそれらから本質的になる群またはなおもさらにそれらからなる群から選択される。いくつかの態様において、Ｃ２アルデヒドは、アセトアルデヒド、ヒドロキシルアセトアルデヒドまたはグリオキシレートからなる群より選択される。いくつかの態様において、ＣＮアルデヒドは、直鎖アルデヒドであり、ここで、Ｎは、そのアルデヒドの炭素鎖長に対応し、Ｎは、Ｍ−３であり、Ｍは、調製されている化合物における炭素の数であり、Ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２である。
いくつかの態様において、上記方法は、グリセロール、Ｃ５糖、Ｃ６糖、ホスホ−グリセレート、他の炭素源、解糖経路の中間体、プロパン酸代謝の中間体またはそれらの組み合わせからＣ３アルデヒドおよびピルベートを調製する工程をさらに含むか、あるいはその工程から本質的になるか、またはなおもさらにその工程からなる。
いくつかの態様において、Ｃ３アルデヒドは、一連の酵素的工程を介して得られ、ここで、その酵素的工程は、リン酸エステルの加水分解、アルコールの酸化、ジオールの脱水、アルデヒドの酸化、アルデヒドの還元、チオエステルの還元、チオエステル交換反応、脱炭酸、カルボン酸の還元、アミノ化、第一級アミンのアシル化またはそれらの組み合わせを含むか、あるいはそれから本質的になるか、またはなおもさらにそれからなる。
いくつかの態様において、Ｃ５糖は、キシロース、キシルロース、リブロース、アラビノース、リキソースおよびリボースのうちの１つ以上を含むか、あるいはそれらから本質的になるか、またはなおもさらにそれらからなる。
いくつかの態様において、Ｃ６糖は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、タロース、ガラクトース、フルクトース、プシコース、ソルボースおよびタガトースのうちの１つ以上を含むか、あるいはそれらから本質的になるか、またはなおもさらにそれらからなる。
いくつかの態様において、他の炭素源は、微生物に対する炭素源として適した供給原料であり、ここで、その供給原料は、アミノ酸、脂質、トウモロコシ茎葉（ｃｏｒｎ ｓｔｏｖｅｒ）、ススキ（ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）、都市廃棄物、砂糖黍（ｅｎｅｒｇｙ ｃａｎｅ）、サトウキビ（ｓｕｇａｒ ｃａｎｅ）、バガス、デンプン流、デキストロース流、メタノール、ホルメートまたはそれらの組み合わせを含むか、あるいはそれらから本質的になるか、またはなおもさらにそれらからなる。
上記方法のいくつかの態様において、１−ブタノール、酪酸、コハク酸、１，４−ブタンジオール、１−ペンタノール、ペンタン酸、グルタル酸、１，５−ペンタンジオール、１−ヘキサノール、ヘキサン酸、アジピン酸、１，６−ヘキサンジオール、６−ヒドロキシヘキサン酸、ε−カプロラクトン、６−アミノ−ヘキサン酸、ε−カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、７〜２５炭素長の直鎖脂肪酸および直鎖脂肪アルコール、６〜２４炭素長の直鎖アルカンおよび直鎖α−アルケン、セバシン酸またはドデカン二酸を調製するための宿主として微生物が使用される。
いくつかの態様において、微生物は、ＣＮアルデヒドおよびピルベートをＣＮ＋３β−ヒドロキシケトン中間体に変換する酵素的工程を触媒するのに必要な酵素を一過性にまたは永続的にコードする内在性遺伝子もしくは外から付加された遺伝子、および／またはそのＣＮ＋３β−ヒドロキシケトン中間体を１−ブタノール、酪酸、コハク酸、１，４−ブタンジオール、１−ペンタノール、ペンタン酸、グルタル酸、１，５−ペンタンジオール、１−ヘキサノール、ヘキサン酸、アジピン酸、１，６−ヘキサンジオール、６−ヒドロキシヘキサン酸、ε−カプロラクトン、６−アミノ−ヘキサン酸、ε−カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、７〜２５炭素長の直鎖脂肪酸および直鎖脂肪アルコール、６〜２４炭素長の直鎖アルカンおよび直鎖α−アルケン、セバシン酸またはドデカン二酸に変換する酵素的工程を触媒するのに必要な酵素を一過性にまたは永続的にコードする内在性遺伝子もしくは外から付加された遺伝子を含み、ここで、Ｎは、Ｍ−３であり、Ｍは、調製されている化合物における炭素の数であり、Ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２である。
いくつかの態様において、微生物は、Ｃ５糖、Ｃ６糖、グリセロール、他の炭素源またはそれらの組み合わせをピルベートに変換する能力を有する。
いくつかの態様において、微生物は、糖の取り込み、例えば、Ｃ５糖の取り込み、Ｃ６／Ｃ５糖の同時の取り込み、Ｃ６糖／グリセロールの同時の取り込み、Ｃ５糖／グリセロールの同時の取り込みまたはそれらの組み合わせが増大するように操作されている。
図１は、Ｃ６／Ｃ５糖および／またはグリセロールからＣ３アルデヒド、例えば、３−オキソ−プロピオン酸、３−ヒドロキシ−プロパナール、３−アミノ−プロパナールおよびプロパナールを合成するための様々な経路、ならびに／または酵素変換反応によるそれらの相互変換を示している。Ｃ３アルデヒドの合成における様々な工程を触媒し得る酵素が、括弧内に示されている。各工程の触媒に必要とされる補因子は、明確さを改善するために省略されている。本明細書中で使用されるとき、ＰＰ経路は、ペントースリン酸経路を表す。
図２は、ピルベートならびにＣ３アルデヒドである３−オキソ−プロピオン酸（Ｒ＝ＣＨ２ＣＯＯＨ）、３−ヒドロキシプロパナール（Ｒ＝ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）および３−アミノ−プロパナール（Ｒ＝ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）からアジピル−ＣｏＡ、６−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡおよび６−アミノアジピル−ＣｏＡを合成するための例示的な経路を示している。
図３は、ピルベートならびにＣ３アルデヒドである３−オキソ−プロピオン酸（Ｒ＝ＣＨ２ＣＯＯＨ）、３−ヒドロキシプロパナール（Ｒ＝ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）および３−アミノ−プロパナール（Ｒ＝ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）からアジピル−ＣｏＡ、６−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡおよび６−アミノアジピル−ＣｏＡを合成するための例示的な経路を示している。
図４は、図２および３における中間体からアジピン酸を合成するためのさらなる経路を示している。
図５は、前駆体である６−アミノ−ヘキサノエート、６−ヒドロキシヘキサノエート、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ、６−アミノ−ヘキサノイル−ＣｏＡ、６−オキソヘキサノエートおよび６−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡからの１，６−ヘキサンジオール、６−ヒドロキシヘキサノエート、ε−カプロラクトン、６−アミノ−ヘキサノエート、ε−カプロラクタムおよびヘキサメチレンジアミンの合成を示している。ピルベートおよびＣ３アルデヒド（３−オキソ−プロピオン酸、３−ヒドロキシ−プロパナールおよび３−アミノ−プロパナール）からのこれらの前駆体（ｐｒｃｕｒｓｏｒｓ）の合成は、図２〜４に示されている。
図６は、２−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡ中間体を介してピルベートおよび直鎖アルデヒドからアシル−ＣｏＡを合成するための循環的経路を示している。示されている工程は、以下の変換反応に対応する：工程１：アルドール付加（アルドラーゼによって触媒される）、工程２：脱水（デヒドラターゼによって触媒される）、工程３：還元（レダクターゼによって触媒される）、工程４：還元（第二級アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒される）、工程５：チオエステル形成（補酵素Ａトランスフェラーゼまたはリガーゼによって触媒される）、工程６：脱水（デヒドラターゼによって触媒される）、工程７：還元（エノイルレダクターゼによって触媒される）、工程８：随意の還元（レダクターゼによって触媒される）。各伸長サイクル（工程１〜７）によって、開始時の直鎖アルデヒドが３炭素伸長する。ＣＮアルデヒド（Ｎ＝炭素（ｃａｂｏｎｓ）数）から開始することにより、ＣＮ＋３ｘ炭素長（Ｎ＝開始時のアルデヒドにおける炭素の数およびｘ＝伸長サイクルの回数）であるアシル−ＣｏＡがもたらされる。触媒のために必要とされるいくつかの補因子は、明確さを改善するために省略されている。
図７は、図６に示されているように合成されたアシル−ＣｏＡからアルコール（脂肪アルコール）、酸（脂肪酸）、アルカンおよびα−アルケンへの変換を示している。各工程の触媒に必要とされる補因子は、明確さを改善するために省略されている。
（詳細な説明）
（定義）
本明細書中で使用されるとき、ある特定の用語は、以下の定義された意味を有し得る。本明細書中で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示していない限り、単数および複数の言及を含む。
本明細書中で使用されるとき、用語「〜を含む」は、組成物および方法が、列挙されるエレメントを含み、その他のものを排除しないことを意味すると意図されている。「〜から本質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用されるとき、その組成物または方法に対していかなる本質的に意義のあるものであっても他のエレメントを排除することを意味するものとする。「〜からなる」は、特許請求される組成物および実質的な方法工程に対して微量より多い他の成分エレメントを排除することを意味するものとする。これらの移行用語（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｔｅｒｍｓ）の各々によって定義される態様は、本発明の範囲内である。したがって、方法および組成物は、さらなる工程および構成要素を含み得るか（〜を含む）、あるいは重要でない工程および組成物を含み得るか（〜から本質的になる）、あるいは、述べられた方法工程または組成物だけを意図し得る（〜からなる）ことが、意図されている。
「野生型」とは、細胞、組成物、組織または他の生物学的材料が自然界に存在するときの、その細胞、組成物、組織または他の生物学的材料のことを定義する。
本明細書中で使用されるとき、用語「Ｃ３アルデヒド」とは、３つの炭素からなる任意の直鎖アルキル化合物のことを指し、ここで、一方の末端炭素は、アルデヒド官能基の一部である。本発明のすべての態様において、Ｃ３アルデヒドは、グリセルアルデヒドを含まない。いくつかの態様において、Ｃ３アルデヒドは、３−オキソプロピオン酸、３−ヒドロキシプロパナール、３−アミノプロパナールまたはプロパナールを含む群から選択されるから選択される。
本明細書中で使用されるとき、用語「ＣＮアルデヒド」とは、Ｎ個の炭素からなる任意の直鎖アルキル化合物のことを指し、ここで、一方の末端炭素は、アルデヒド官能基の一部であり、他方の末端炭素は、非置換であり得るか、またはカルボキシレート（ｃａｒｏｂｙｘｌａｔｅ）基の一部であり得るか、またはヒドロキシル、アミノもしくはアセトアミド基を有し得る。いくつかの態様において、Ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１もしくは２２またはこれらの数のうちの２つの間の任意の範囲（終点は含む）である。
本発明の一態様において、Ｃ３アルデヒドおよびピルベートは、グリセロール、Ｃ５糖、Ｃ６糖、ホスホ−グリセレート（ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｇｌｙｃｅｒａｔｅｓ）、他の炭素源、解糖経路の中間体、プロパン酸経路の中間体またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上から、一連の酵素的工程を介して調製され、ここで、それらの工程は、リン酸エステルの加水分解、アルコールの酸化、ジオールの脱水、アルデヒドの酸化、アルデヒドの還元、チオエステルの還元、チオエステル交換反応、脱炭酸、カルボン酸の還元、アミノ化、第一級アミンのアシル化およびそれらの組み合わせを含むか、あるいはそれらから本質的になるか、またはなおもさらにそれらからなる。別の態様において、Ｃ５糖は、キシロース、キシルロース、リブロース、アラビノース、リキソースおよびリボースのうちの１つ以上を含むか、あるいはそれらから本質的になるか、またはなおもさらにそれらから成り、Ｃ６糖は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、タロース、フルクトース、プシコース、ソルボースおよびタガトースを含むか、あるいはそれらから本質的になるか、またはなおもさらにそれらからなる。さらなる態様において、他の炭素源は、微生物に対する炭素源として適した供給原料であり、ここで、その供給原料は、アミノ酸、脂質、トウモロコシ茎葉、ススキ、都市廃棄物、砂糖黍、サトウキビ、バガス、デンプン流、デキストロース流、ホルメート、メタノールおよびそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含むか、あるいはそれらから本質的になるか、またはなおもさらにそれらからなる。
本明細書中で使用されるとき、用語「Ｃ５糖」とは、５つの炭素を含む糖分子のことを指す。
本明細書中で使用されるとき、用語「Ｃ６糖」とは、６つの炭素を含む糖分子のことを指す。
本明細書中で使用されるとき、用語「アルドール付加」とは、ピルベート分子が、ＣＮアルデヒドのアルデヒド官能基と反応して、ＣＮ＋３β−ヒドロキシケトン中間体を生成する、対応するエノールまたはエノレートイオンまたはシッフ塩基またはエナミンを形成する化学反応のことを指す。いくつかの態様において、ＣＮアルデヒドは、Ｃ３アルデヒドであり、ＣＮ＋３β−ヒドロキシケトン中間体は、Ｃ６β−ヒドロキシケトン中間体である。
本明細書中で使用されるとき、用語「ＣＮ＋３β−ヒドロキシケトン中間体」とは、ＣＮアルデヒドとピルベートとの間のアルドール付加の生成物であるＮ＋３個の炭素からなる直鎖アルキル化合物のことを指し、ここで、１つの末端炭素は、カルボン酸官能基の一部であり、隣接する炭素は、ケトン官能基の一部であり、ケトン炭素に対して２番目の炭素は、下記の式に示されているように、ヒドロキシル官能基に共有結合的に結合される：
Figure 0006680671

いくつかの態様において、ＣＮ＋３β−ヒドロキシケトン中間体は、６つの炭素を有するＣ６β−ヒドロキシケトン中間体である。
本発明の一態様において、ＣＮ＋３β−ヒドロキシケトン中間体は、酵素的工程または酵素的工程と化学的工程との組み合わせを介して、１−ブタノール、酪酸、コハク酸、１，４−ブタンジオール、１−ペンタノール、ペンタン酸、グルタル酸、１，５−ペンタンジオール、１−ヘキサノール、ヘキサン酸、アジピン酸、１，６−ヘキサンジオール、６−ヒドロキシヘキサン酸、ε−カプロラクトン、６−アミノ−ヘキサン酸、ε−カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、７〜２５炭素長の直鎖脂肪酸および直鎖脂肪アルコール、６〜２４炭素長の直鎖アルカンおよび直鎖α−アルケン、セバシン酸ならびにドデカン二酸のうちの１つ以上に変換される。別の態様において、酵素的工程または化学的工程は、エノイルまたはエノエートの還元、ケトンの還元、第一級アルコールの酸化、第二級アルコールの酸化、アルデヒドの酸化、アルデヒドの還元、脱水、脱炭酸、チオエステルの形成、チオエステルの加水分解、チオエステル交換反応、チオエステルの還元、リン酸エステルの加水分解、ラクトン化、ラクタムの形成、ラクタムの加水分解、ラクトンの加水分解、カルボン酸の還元、アミノ化、アルデヒドの脱カルボニル（ｄｅａｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ）、第一級アミンのアシル化、第一級アミンの脱アシル化およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含むか、あるいはそれらから本質的になるか、またはなおもさらにそれらからなる。
本明細書中で使用されるとき、以下の化合物は、以下の構造を有する。
Figure 0006680671
本明細書中で使用されるとき、用語「溶液」とは、溶媒および溶質、例えば、本明細書中に記載される方法において使用される出発物質を含む液体組成物のことを指す。一態様において、溶媒は、水である。別の態様において、溶媒は、有機溶媒である。
本明細書中で使用されるとき、用語「酵素的工程」または「酵素反応」とは、所望の酵素反応を促進するために選択された酵素によって触媒される分子反応のことを指す。酵素は、大きな生物学的分子であり、高度に選択的な触媒である。ほとんどの酵素は、タンパク質であるが、いくつかの触媒ＲＮＡ分子が同定されている。
本願全体を通して、酵素的工程は、「工程２Ａ」、「工程２Ｂ」などと表記され、これらの工程を特異的に触媒する酵素は、それぞれ「２Ａ」、「２Ｂ」などと表記される。そのような酵素は、「反応特異的酵素」とも称される。
本明細書中で使用されるとき、用語「ＣｏＡ」または「補酵素Ａ」は、その存在が、活性な酵素系を形成する多くの酵素の活性のために必要とされる、有機補因子または補欠分子族（酵素の非タンパク質部分）のことを意味すると意図されている。
本明細書中で使用されるとき、用語「実質的に嫌気性」は、培養または生育の条件に対する言及において使用されるとき、酸素の量が、液体培地中の溶存酸素に対して飽和の約１０％未満であることを意味すると意図されている。この用語は、約１％未満の酸素の雰囲気で維持された、液体培地または固形培地の密閉されたチャンバーを含むとも意図されている。
本明細書中で使用されるとき、用語「天然に存在しない」または「非天然の」は、本発明の微生物生物または微生物に対する言及において使用されるとき、その微生物生物が、言及されている種の天然に存在する株（言及されている種の野生型の株を含む）では通常見られない少なくとも１つの遺伝子変化を有することを意味すると意図されている。遺伝子変化としては、例えば、ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を導入する改変、他の核酸付加、核酸欠失および／またはその微生物生物の遺伝物質の他の機能的破壊が挙げられる。そのような改変としては、例えば、コード領域およびその機能的フラグメント、言及されている種に対する異種、同種または異種と同種の両方のポリペプチドが挙げられる。さらなる改変としては、例えば、改変によって遺伝子またはオペロンの発現が変化する非コード調節領域が挙げられる。例示的なポリペプチドとしては、本明細書中に記載される（ｄｅｓｃｓｒｉｂｅｄ）、１−ブタノール、酪酸、コハク酸、１，４−ブタンジオール、１−ペンタノール、ペンタン酸、グルタル酸、１，５−ペンタンジオール、１−ヘキサノール、ヘキサン酸、アジピン酸、１，６−ヘキサンジオール、６−ヒドロキシヘキサン酸、ε−カプロラクトン、６−アミノ−ヘキサン酸、ε−カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、７〜２５炭素長の直鎖脂肪酸および直鎖脂肪アルコール、６〜２４炭素長の直鎖アルカンおよび直鎖α−アルケン、セバシン酸ならびにドデカン二酸の合成経路の酵素またはタンパク質が挙げられる。
本明細書中で使用されるとき、「外来性」は、言及されている分子または言及されている活性が、宿主微生物生物に導入されることを意味すると意図されている。その分子は、例えば、コード核酸を宿主の遺伝物質に導入することによって、例えば、宿主の染色体にインテグレートすることによって、またはプラスミドなどの非染色体遺伝物質として、導入され得る。ゆえに、この用語は、コード核酸の発現に対する言及において使用されるとき、コード核酸を発現可能な形態で微生物生物に導入することを指す。この用語は、酵素活性に対する言及において使用されるとき、参照宿主生物に導入される活性のことを指す。その起源は、例えば、宿主微生物生物に導入された後、言及されている活性を発現する同種または異種のコード核酸であり得る。ゆえに、用語「内在性」とは、野生型宿主にもともと存在するかまたは天然に存在する、言及されている分子または活性のことを指す。同様に、この用語は、コード核酸の発現に対する言及において使用されるとき、野生型の微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｍｓ）に含まれるコード核酸の発現のことを指す。
用語「異種」とは、言及されている種以外の起源に由来する分子または活性のことを指すのに対し、「同種」は、この文脈において使用されるとき、宿主微生物生物に由来する分子または活性のことを指す。したがって、本発明のコード核酸の外来性発現は、異種または同種のコード核酸のいずれかまたは両方を利用し得る。
２つ以上の外来性核酸が、微生物生物に含められるとき、その２つ以上の外来性核酸は、上で論じたような、言及されているコード核酸または酵素活性のことを指すと理解される。本明細書中に開示されるとき、２つ以上の外来性核酸は、別々の核酸分子上に、ポリシストロニックな核酸分子上に、またはそれらの組み合わせで宿主微生物生物に導入され得るが、それらはなおも２つ以上の外来性核酸とみなされ得ることがさらに理解される。例えば、本明細書中に開示されるとき、微生物生物は、所望の経路酵素またはタンパク質をコードする２つ以上の外来性核酸を発現するように操作され得る。所望の活性をコードする２つの外来性核酸が、宿主微生物生物に導入される場合、それらの２つの外来性核酸は、単一の核酸として、例えば、単一のプラスミド上に導入され得、別個のプラスミド上に導入され得、宿主染色体の単一の部位または複数の部位にインテグレートされ得るが、なおも２つの外来性核酸とみなされ得ることが理解される。同様に、３つ以上の外来性核酸が、任意の所望の組み合わせで、例えば、単一のプラスミド上に、別個のプラスミド上に、宿主生物に導入され得、宿主染色体の単一の部位または複数の部位にインテグレートされ得るが、なおも２つ以上の外来性核酸、例えば、３つの外来性核酸として見なされ得ることが理解される。したがって、言及されている外来性核酸または酵素活性の数は、コード核酸の数または酵素活性の数のことを指すのであって、宿主生物に導入された別個の核酸の数のことを指すのではない。
特に有用な実施形態において、コード核酸の外来性発現が用いられる。外来性発現は、発現エレメントおよび／または調節エレメントをその宿主および用途に特別合わせることにより、ユーザーによってコントロールされる所望の発現レベルを達成する能力を与える。しかしながら、他の実施形態では、例えば、負の調節エフェクターを除去することによって、または遺伝子プロモーターが、誘導性プロモーターもしくは他の調節エレメントに連結されているとき、その遺伝子プロモーターを誘導することによって、内在性発現もまた用いることができる。したがって、天然に存在する誘導性プロモーターを有する内在性遺伝子は、適切な誘導剤を提供することによってアップレギュレートされ得るか、または内在性遺伝子の調節領域は、誘導性の調節エレメントを組み込むように操作されることにより、所望の時点において内在性遺伝子の発現増加の制御が可能になり得る。同様に、天然に存在しない微生物生物に導入された外来性遺伝子に対する調節エレメントとして、誘導性プロモーターが含められ得る。
当業者は、遺伝子変化が、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの好適な宿主生物およびそれらの対応する代謝反応または所望の生合成経路に対する遺伝子などの所望の遺伝物質に対する好適な起源生物に照らして記載されることを理解するだろう。しかしながら、多種多様の生物の全ゲノムシークエンシングおよびゲノミクスの領域における高レベルのスキルを所与とすれば、当業者は、本明細書中に提供される教示および指導を本質的にすべての他の生物に適用することが容易にできるだろう。例えば、本明細書中に例証されるＥ．コリの代謝の変更は、言及されている種以外の種由来の同じまたは同様のコード核酸を組み込むことによって、他の種に容易に適用され得る。そのような遺伝子変化としては、例えば、一般に、種ホモログの遺伝子変化、および特に、オルソログ、パラログまたは非オルソロガス遺伝子の置換が挙げられる。
コード核酸経路酵素の起源は、例えば、コードされた遺伝子産物が、言及されている反応を触媒することができる任意の種を含み得る。そのような種には、原核生物と真核生物の両方が含まれ、それらとしては、古細菌および真正細菌を含む細菌、ならびに酵母、植物、昆虫、動物およびヒトを含む哺乳動物を含む真核生物が挙げられるがこれらに限定されない。そのような起源に対する例示的な種としては、例えば、エシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス・ナックムッシ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｋｎａｃｋｍｕｓｓｉｉ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、セラチア・プロテアマキュランス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．２０６５、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、クロストリジウム・クルイベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、ラッツス・ノルベギクス（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ．ＡＤＰ１、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ユーバクテリウム・バーケリ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂａｒｋｅｒｉ）、ペプトストレプトコッカス・アサッカロリチカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・チロブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム・サーモアセチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ）（ムーレラ・サーモアセチカム（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ））、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、ムース・ムースクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、スース・スクロファ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ、アルスロバクター・アウレッセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）、マンヘミア・サクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、クロストリジウム・リュングダリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム・カルボキシディボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ）、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アクロモバクター・デニトリフィカンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、アシダミノコッカス・フェルメンタンス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、クロストリジウムｓｐ．Ｍ６２／１、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ならびに本明細書中に開示されるかまたは対応する遺伝子に対する起源生物として利用可能な他の例示的な種（実施例を参照のこと）が挙げられる。しかしながら、現在、４００種を超える微生物のゲノムならびに様々な酵母、真菌、植物および哺乳動物のゲノムに対して全ゲノム配列が入手可能であるので、必須の経路酵素をコードする遺伝子、近縁種または遠縁種における１つ以上の遺伝子（例えば、既知の遺伝子のホモログ、オルソログ、パラログおよび非オルソロガス遺伝子置換を含む）の同定および生物間での遺伝子変化の交換は、日常的なものであり、当該分野で周知である。
オルソログとは、共通祖先の遺伝子から種分化によって進化した、異なる種における遺伝子のことを指す。通常、オルソログは、進化の過程において同じ機能を保持する。オルソログの同定は、新たに配列決定されたゲノムにおける遺伝子機能の信頼できる予測に欠かせない。
パラログとは、ゲノム内の重複に関係する遺伝子のことを指す。オルソログが、一般に、進化の過程において同じ機能を保持する一方で、パラログは、元のものに関係していたとしても、これらは、新しい機能を発展させ得る。
非オルソロガス遺伝子置換は、異なる種における言及されている遺伝子機能の代わりになり得る、１つの種に由来する非オルソロガス遺伝子である。置換には、例えば、異なる種における言及されている機能と比べて、元の種における機能と実質的に同じまたは類似の機能を発揮することができることが含まれる。一般に、非オルソロガス遺伝子の置換は、言及されている機能をコードする既知の遺伝子に構造的に関係があるとき、同定可能であり得るが、それにもかかわらず、それほど構造的に関係がないが機能的に類似の遺伝子およびそれらの対応する遺伝子産物も、本明細書中で使用されるとき、その用語の意味の範囲内になおも入る。機能的類似性には、例えば、置換するために要求される機能をコードする遺伝子と比べて、非オルソロガス遺伝子産物の活性部位または結合領域において少なくともいくらかの構造的類似性が必要である。ゆえに、非オルソロガス遺伝子としては、例えば、パラログまたは無関係の遺伝子が挙げられる。
本明細書中で使用されるとき、用語「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」または「微生物生物」または「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの外来性核酸または組換え核酸の挿入を介して形質転換され得るかまたはトランスフェクトされ得る、生存している生物細胞および単離された原核細胞または真核細胞のことを指す。核酸配列で形質転換された後に生存可能なままである限り、任意の好適な原核生物または真核生物の微生物を本発明において使用してよい。本発明の好適な微生物は、上記方法における少なくとも１つの工程を触媒し得る１つ以上の組換えタンパク質をコードする１つ以上の核酸構築物を発現することができる微生物である。微生物は、細菌、酵母、真菌、カビおよび古細菌の群から選択され得る。これらは、商業的に入手可能である。
本明細書中で使用されるとき、「真菌」とは、真菌の界に分類される任意の真核生物のことを指す。真菌の界の中の門としては、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、コウマクノウキン門（Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、グロムス門（Ｇｌｏｍｅｒｏｍｙｃｏｔａ）、微胞子虫門（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）およびネオカリマスティクス門（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｇｏｍｙｃｏｔａ）が挙げられる。本明細書中で使用されるとき、「酵母」とは、単細胞の形態で成長する（例えば、出芽によって）真菌のことを指すのに対し、「カビ」とは、多細胞の菌糸または菌糸体でできた糸状構造で成長する真菌のことを指す（ＭｃＧｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ｒ．ａｎｄ Ｔｙｒｉｎｇ，Ｓ．Ｋ．“Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ．”Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．４ｔｈ ｅｄ．Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ：Ｕｎｉｖ．ｏｆ ＴＸ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｒａｎｃｈ ａｔ Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ，１９９６）。
いくつかの態様において、微生物は、酵母細胞である。いくつかの態様において、酵母細胞は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、イッサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、クルイヴェロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の種に由来する。
いくつかの態様において、微生物は、カビ細胞である。いくつかの態様において、カビ宿主細胞は、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）またはクライソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属の種に由来する。
いくつかの態様において、微生物は、古細菌である。いくつかの態様において、好適な古細菌は、アルカエオグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、アエロピラム（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ピュロバクルム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、スルフォロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノスパエラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ）、メタノピュルス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、メタノブレヴィバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）、メタノカルドコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ）またはメタノサルキナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）属の種に由来する。
用語「細菌」とは、原核生物の領域または界の中の任意の微生物のことを指す。細菌の領域または界の中の門としては、アシドバクテリア（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アナエロビオスピリルム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｒｕｌｕｍ）、アクウィフェクス（Ａｑｕｉｆｉｃａｅ）、アルマティモナデテス（Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ）、バクテロイデテス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、カルディセリカ（Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）、クロロビ（Ｃｈｌｏｒｏｂｉ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、クロロフレキシ（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ）、クリシオゲネテス（Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、デフェリバクター（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ）、デイノコッカス・サーマス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ−ｔｈｅｒｍｕｓ）、ディクチオグロミ（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルシミクロビア（Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ）、フィブロバクター（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ）、フィルミクテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、フソバクテリア（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ジオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ゲマティモナデテス（Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ハラナエロビウム（Ｈａｌａｎａｅｒｏｂｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、クライベラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、レンティスファエラ（Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｅ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ニトロスピラ（Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、プランクトマイセス（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、スピロヘータ（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シネルギステス（Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ）、テネリクテス（Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ）、サーモアナエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サーモデスルフォバクテリア（Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ）、テルモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ）、ウェルコミクロビア（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）、ゾベレラ（Ｚｏｂｅｌｌｅｌｌａ）およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が挙げられる。いくつかの態様において、細菌微生物は、Ｅ．コリ細胞である。いくつかの態様において、細菌微生物は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．細胞である。バチルス種の例としては、バチルス・サブチルス、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチルス・ミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）およびバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の方法によって調製されるカルボン酸化合物は、金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、例えば、ナトリウム、カリウム、アルカリ土類イオン、例えば、カルシウム、マグネシウムまたはアルミニウムイオンを含むがこれらに限定されない対イオンと塩を形成し得るか；または有機塩基、例えば、テトラアルキルアンモニウム、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トリメチルアミン、Ｎ−メチルグルカミンなどと配位する。その酸は、当該反応条件に存在する対イオンもしくは有機塩基と塩を形成し得るか、または無機塩基もしくは有機塩基と反応することによって塩に変換され得る。本明細書中のいずれのカルボン酸含有化合物も、酸または塩のいずれかとして言及され、それらは、その任意の塩の形態を含むその任意の中性の形態または電離型の化合物のことを指すために全体にわたって交換可能に使用される。具体的な形態はｐＨに依存することが、当業者に理解される。
本明細書中に記載される方法によって調製されるアミノ化合物は、塩、例えば、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩 メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、メタンスルホン酸塩およびラウリルスルホン酸塩などを形成し得る。上記酸は、当該反応条件に存在する対イオンもしくは酸と塩を形成し得るか、または無機酸もしく有機酸と反応することによって塩に変換され得る。
本明細書中のいずれのアミノ含有化合物も、遊離塩基または塩のいずれかとして言及され、それらは、その任意の塩の形態を含むその任意の中性の形態または電離型の化合物のことを指すために全体にわたって交換可能に使用される。具体的な形態はｐＨに依存することが、当業者に理解される。
化合物の溶媒和物は、結晶格子の内側に１つ未満、１つ、または１つより多い溶媒分子とともに結晶化する固体の形態の化合物である。薬学的に許容可能な溶媒和物などの溶媒和物を生成するために使用され得る溶媒のいくつかの例としては、水、Ｃ１−Ｃ６アルコール全般（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、および必要に応じて置換され得るもの）、テトラヒドロフラン、アセトン、エチレングリコール、プロピレングリコール、酢酸、ギ酸およびそれらの溶媒混合物が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容可能な溶媒和物の生成に役立ち得る他のそのような生体適合性の溶媒は、当該分野で周知である。さらに、様々な有機酸および無機酸ならびに有機塩基および無機塩基が、所望の溶媒和物を生成するために加えられ得る。そのような酸および塩基は、当該分野で公知である。溶媒が水であるとき、溶媒和物は、水和物と称され得る。いくつかの態様において、１分子の化合物が、０．１〜５分子の溶媒、例えば、０．５分子の溶媒（半溶媒和物（ｈｅｍｉｓｏｌｖａｔｅ）、例えば、半水和物）、１分子の溶媒（一溶媒和物（ｍｏｎｏｓｏｌｖａｔｅ）、例えば、一水和物）および２分子の溶媒（二溶媒和物（ｄｉｓｏｌｖａｔｅ）、例えば、二水和物）と溶媒和物を形成し得る。
各々の種に対して、その種に属する任意の細胞が、本発明の好適な微生物であると見なされる。任意の種の宿主細胞が、天然から単離されたように、または任意の数の遺伝子改変（例えば、遺伝子変異、遺伝子欠失または組換えポリヌクレオチド）を含み得るように、存在し得る。
用語「組換え核酸」または「組換えポリヌクレオチド」は、本明細書中で使用されるとき、以下の少なくとも１つが真である核酸のポリマーのことを指す：（ａ）当該核酸配列が、所与の微生物に対して外来性である（すなわち、その所与の微生物に天然に見られない）こと；（ｂ）当該配列が、所与の微生物に天然に見られることがあるが、非天然の量で（例えば、予想される量よりも多い量で）見出され得ること；または（ｃ）当該核酸配列が、２つ以上の部分配列を含み、その２つ以上の部分配列が、互いとの天然における関係性と同じ関係性で見出されないこと。例えば、場合（ｃ）に関して、組換え核酸配列は、新しい機能的核酸を形成するように配置された無関係な遺伝子に由来する２つ以上の配列を有し得る。
いくつかの態様において、本発明の組換えポリペプチドまたはタンパク質または酵素は、１つ以上の発現ベクターの一部としての遺伝物質によってコードされ得る。発現ベクターは、１つ以上のポリペプチドコード核酸を含み、発現ベクターは、核酸の発現をコントロールする任意の所望のエレメント、ならびに所与の宿主細胞内で発現ベクターの複製および維持を可能にする任意のエレメントをさらに含み得る。組換え核酸のすべてが、単一の発現ベクター上に存在してもよいし、複数の発現ベクターによってコードされてもよい。
発現ベクターは、宿主生物において機能的な発現調節配列に作動可能に連結された、本明細書中に例証されるような１つ以上の経路コード核酸を含むように構築され得る。提供される微生物宿主生物において使用するために適用可能な発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソームおよび人工染色体が挙げられ、それらは、宿主染色体への安定したインテグレーションのために作動可能なベクターおよび選択配列または選択マーカーを含む。さらに、発現ベクターは、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子および適切な発現調節配列を含み得る。例えば、抗生物質もしくはトキシンに対する抵抗性を提供するか、栄養要求性欠損を補完するか、または培養培地中に存在しない不可欠な栄養分を供給する選択可能なマーカー遺伝子もまた、含められ得る。発現調節配列には、当該分野で周知である、構成的および誘導性プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどが含まれ得る。２つ以上の外来性コード核酸が、共発現されるべきであるとき、その両方の核酸が、例えば、単一の発現ベクターまたは別個の発現ベクターに挿入され得る。単一のベクターの発現の場合、コード核酸は、１つの共通の発現調節配列に動作可能に連結され得るか、または異なる発現調節配列、例えば、１つの誘導性プロモーターおよび１つの構成的プロモーターに連結され得る。ポリヌクレオチドが作動可能に連結され得るプロモーターとクローニング部位の両方を含むベクターは、当該分野で周知である。そのようなベクターは、インビトロまたはインビボにおいてＲＮＡを転写することができ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）およびＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）などの供給源から商業的に入手可能である。発現および／またはインビトロ転写を最適化するために、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去するか、付加するか、または変更することにより、余分な潜在的に不適切な代替の翻訳開始コドンまたは転写レベルもしくは翻訳レベルで発現を干渉し得るかもしくは減少させ得る他の配列を排除することが必要であり得る。あるいは、発現を高めるために、コンセンサスリボソーム結合部位が、開始コドンのすぐ５’に挿入され得る。
本明細書中に記載される所望の化合物（ｃｏｍｐｕｎｄｓ）を合成するための経路に関わる外来性核酸配列が、コンジュゲーション、エレクトロポレーション、化学的形質転換、形質導入、トランスフェクションおよび超音波形質転換を含むがこれらに限定されない当該分野で周知の手法を用いて、宿主細胞に安定にまたは一過性に導入され得る。Ｅ．コリまたは他の原核細胞における外来性発現の場合、真核生物の核酸の遺伝子またはｃＤＮＡにおけるいくつかの核酸配列は、標的化シグナル、例えば、Ｎ末端ミトコンドリアシグナルまたは他の標的化シグナルをコードし得るが、それらは、所望であれば原核生物宿主細胞への形質転換の前に除去され得る。例えば、ミトコンドリアリーダー配列の除去は、Ｅ．コリにおいて高発現をもたらした（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：４３２９−４３３８（２００５））。酵母または他の真核細胞における外来性発現の場合、遺伝子は、リーダー配列の付加がないときは、サイトゾルにおいて発現され得るか、またはミトコンドリアもしくは他のオルガネラに標的化され得るか、または好適な標的化配列、例えば、宿主細胞に適したミトコンドリア標的化シグナルもしくは分泌シグナルを付加することによって、分泌するように標的化され得る。標的化配列を除去するためまたは含めるために核酸配列に対する適切な改変は、望ましい特性を付与する外来性核酸配列に組み込まれ得ると理解される。さらに、遺伝子は、当該分野で周知の手法を用いてコドン最適化に供されることにより、最適化されたタンパク質発現が達成され得る。
範囲を含むすべての数字による明示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度および分子量は、０．１だけ（＋）または（−）に変動する近似値である。必ずしも明示的に述べられるわけではないが、すべての数字による明示は、用語「約」が前に付くことが理解されるべきである。必ずしも明示的に述べられるわけではないが、本明細書中に記載される試薬は、単なる例示であること、およびそのような試薬の等価物は、当該分野で公知であることも理解されるべきである。
「作動可能に連結された」とは、エレメントが機能できる配置で並んでいることを指す。
用語「培養する」とは、様々な種類の培地（培養液）上または培地（培養液）中における、細胞または生物のインビトロでの増殖のことを指す。培養液中で生育された細胞の子孫は、親細胞と完全に（すなわち、形態学的に、遺伝的にまたは表現型的に）同一ではないことがあることが理解される。
「遺伝子」とは、転写されて翻訳された後に、特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドのことを指す。本明細書中に記載されるいずれのポリヌクレオチド配列も、それらが関連し得る遺伝子のより大きなフラグメントまたは完全長コード配列を同定するために使用され得る。より大きなフラグメント配列を単離する方法は、当業者に公知である。用語「発現する」とは、遺伝子産物の生成のことを指す。過剰発現という用語は、遺伝子から転写されたｍＲＮＡまたはその遺伝子によってコードされるタンパク質産物の生成が、通常の細胞またはコントロール細胞の生成よりも多いこと、例えば、コントロールサンプルまたは野生型細胞において検出される発現レベルよりも１．５倍あるいは２倍あるいは少なくとも２．５倍あるいは少なくとも３．０倍あるいは少なくとも３．５倍あるいは少なくとも４．０倍あるいは少なくとも５倍あるいは１０倍高いことを指す。
本明細書中で使用されるとき、「相同性」とは、参照配列と少なくとも第２の配列のフラグメントとの間の配列類似性のことを指す。ホモログは、当該分野で公知の任意の方法によって、好ましくは、単一の第２の配列または配列のフラグメントまたは配列のデータベースと参照配列を比較するＢＬＡＳＴツールを使用することによって、同定され得る。下記に記載されるように、ＢＬＡＳＴは、同一性パーセントおよび類似性パーセントに基づいて配列を比較する。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における用語「同一」または「同一性」パーセントは、同じである２つ以上の配列または部分配列のことを指す。２つの配列が、比較ウィンドウ、すなわち指定の領域にわたって比較され、一致が最大になるようにアラインメントされたとき、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つまたは手作業のアラインメントおよび目視検査を用いて測定されたとき、特定のパーセンテージの同じアミノ酸残基またはヌクレオチド（すなわち、特定の領域にわたって、または特定されないときは配列全体にわたって、２９％の同一性、必要に応じて、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％もしくは１００％の同一性）を有した場合、それらの２つの配列は、「実質的に同一」である。必要に応じて、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）長である領域にわたって、またはより好ましくは、１００〜５００または１０００以上のヌクレオチド（または２０、５０、２００以上のアミノ酸）長である領域にわたって存在する。
比較のために配列をアラインメントする方法は、当該分野で周知である。例えば、任意の２つの配列間の配列同一性パーセントの測定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。そのような数学的アルゴリズムの非限定的な例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム、ＣＡＢＩＯＳ ４：１１ １７（１９８８）；Ｓｍｉｔｈらのローカルホモロジーアルゴリズム、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのホモロジーアラインメントアルゴリズム、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３ ４５３（１９７０）；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索法（ｓｅａｒｃｈ−ｆｏｒ−ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ−ｍｅｔｈｏｄ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４ ２４４８（１９８８）；ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３ ５８７７（１９９３）である。
配列比較する場合、典型的には、１つの配列が、試験配列と比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用することもできるし、代替のパラメータを指定することもできる。次いで、それらのプログラムパラメータに基づいて、配列比較アルゴリズムが、参照配列と比較したときの試験配列に対する配列同一性パーセントを算出する。２つの配列を同一性について比較するとき、それらの配列は、連続している必要はないが、いずれのギャップも、全体的な同一性パーセントを低下させ得るペナルティをもたらし得る。ｂｌａｓｔｎの場合、デフォルトのパラメータは、ギャップオープニングペナルティ（Ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）＝５およびギャップ伸長ペナルティ＝２である。ｂｌａｓｔｐの場合、デフォルトのパラメータは、ギャップオープニングペナルティ＝１１およびギャップ伸長ペナルティ＝１である。
「比較ウィンドウ」は、本明細書中で使用されるとき、２０〜６００、通常、約５０〜約２００、より通常は、約１００〜約１５０を含むがこれらに限定されない連続した位置の数のいずれか１つのセグメントに対する言及を含み、そのセグメントにおいて、ある配列が、２つの配列が最適にアラインメントされた後に、同じ数の連続した位置の参照配列と比較され得る。比較のために配列をアラインメントする方法は、当該分野で周知である。比較するための配列の最適なアラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズム（１９８１）、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのホモロジーアラインメントアルゴリズム、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８（３）：４４３−４５３（１９７０）、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索法、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５（８）：２４４４−２４４８（１９８８）、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）または手作業のアラインメントおよび目視検査［例えば、Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ，（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｎｇｂｏｕ Ｅｄ）を参照のこと］によって、行われ得る。
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを測定するのに適したアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５（１７）：３３８９−３４０２（１９９７）および Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５（３）−４０３−４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、クエリー配列における長さＷの短いワード（ｗｏｒｄｓ）を同定することによって高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含み、このＨＳＰは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントされたときに、ある正の値の閾値スコアＴにマッチするかまたはそれを満たすかのいずれかである。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，前出）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけ出すための検索を開始するためのシードとして働く。このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメータＭ（マッチした残基対に対する報酬（ｒｅｗａｒｄ）スコア；常に＞０）およびＮ（マッチしない残基に対するペナルティースコア；常に＜０）を用いて算出される。アミノ酸配列の場合、スコア行列を用いて、累積スコアが算出される。各方向におけるワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアが、達成した最大値から量Ｘだけ低下したとき；１つ以上の負のスコアの残基のアラインメントの累積に起因して、累積スコアがゼロ以下になるとき；または、いずれかの配列の末端に到達したときに、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸが、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、１１というワード長（Ｗ）、期待値（Ｅ）または１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に対して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３というワード長および１０という期待値（Ｅ）およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９（２２）：１０９１５−１０９１９（１９９２）を参照のこと）、５０というアラインメント（Ｂ）、１０という期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を使用する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列の間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０（１２）：５８７３−５８７７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の尺度の１つは、最小合計確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間または２つのアミノ酸配列間のマッチが偶然に生じる確率を示す。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が、約０．２未満、より好ましくは、約０．０１未満、最も好ましくは、約０．００１未満である場合、ある核酸は、参照配列と類似であると見なされる。
上で述べられた配列同一性のパーセンテージ以外に、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという別の指摘は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応性であるというものである。したがって、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、あるポリペプチドは、典型的には、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指摘は、それらの２つの分子またはそれらの相補鎖が、ストリンジェントな条件下において互いにハイブリダイズするというものである。２つの核酸配列が実質的に同一であるというさらに別の指摘は、同じプライマーを使用して、その配列を増幅することができるというものである。
用語「機能的に等価なタンパク質」とは、例証されるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ標準的なまたはコントロールの生物学的活性と比べて、インビボにおいて類似のまたは高い生物学的活性、例えば、１２０％超あるいは１１０％超あるいは１００％超あるいは９０％超あるいは８５％超あるいは８０％超の生物学的活性を示すタンパク質またはポリヌクレオチドのことを指す。本発明の範囲内のさらなる実施形態は、８０％を超えるか、あるいは８５％を超えるか、あるいは９０％を超えるか、あるいは９５％を超えるか、あるいは９７％を超えるか、あるいは９８または９９％を超える配列相同性を有することによって特定される。パーセンテージ相同性は、適切な条件下でのＢＬＡＳＴなどの配列比較プログラムの実行によって測定され得る。一態様において、そのプログラムは、デフォルトのパラメータにおいて実行される。いくつかの態様において、ある特定の酵素またはタンパク質に対する言及は、その機能的に等価な酵素またはタンパク質を含む。
酵素が、酵素クラス（ＥＣ）に照らして述べられるとき、その酵素クラスは、その酵素が、Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙによって提供される酵素命名法に基づいて分類されるかまたは分類され得るクラスである。まだ特定のクラスに分類されていないがそのように分類され得る他の好適な酵素も含められる。
（天然に存在しない微生物生物）
本明細書中に提供される天然に存在しない微生物生物は、１−ブタノール、酪酸、コハク酸、１，４−ブタンジオール、１−ペンタノール、ペンタン酸、グルタル酸、１，５−ペンタンジオール、１−ヘキサノール、ヘキサン酸、アジピン酸、１，６−ヘキサンジオール、６−ヒドロキシヘキサン酸、ε−カプロラクトン、６−アミノ−ヘキサン酸、ε−カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、７〜２５炭素長の直鎖脂肪酸および直鎖脂肪アルコール、６〜２４炭素長の直鎖アルカンおよび直鎖α−アルケン、セバシン酸またはドデカン二酸などの化合物を生成するのに十分な量で本明細書中に記載される生合成経路において使用される酵素またはタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を外因的に発現させる、本明細書中に例証されるような当該分野で周知の方法を用いて構築される。それらの微生物生物は、１−ブタノール、酪酸、コハク酸、１，４−ブタンジオール、１−ペンタノール、ペンタン酸、グルタル酸、１，５−ペンタンジオール、１−ヘキサノール、ヘキサン酸、アジピン酸、１，６−ヘキサンジオール、６−ヒドロキシヘキサン酸、ε−カプロラクトン、６−アミノ−ヘキサン酸、ε−カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、７〜２５炭素長の直鎖脂肪酸および直鎖脂肪アルコール、６〜２４炭素長の直鎖アルカンおよび直鎖α−アルケン、セバシン酸またはドデカン二酸を生成するのに十分な条件下で培養されることが理解される。
本明細書中に記載される所望の生成物を生成することができる微生物宿主の操作の成功には、その経路における様々な工程を触媒するための十分な活性および特異性にとって適切な一連の酵素、例えば、アジペートを生成するための表Ａに記載されているもの、ならびに本明細書中の実施例および文献に記載されているものを同定することが必要である。また、外来性ＤＮＡ配列からの個別の酵素またはタンパク質の活性は、当該分野で周知の方法を用いてアッセイされ得る。さらに、これらの酵素は、所望の基質特異性を達成するため、立体選択性をコントロールしてエナンチオピュアな生成物またはラセミ生成物を合成するため、半減期、熱安定性、阻害剤／生成物耐性を改善することならびに所望の最適な微生物生産宿主における酵素の発現および溶解性を改善することによって、厳しい工業プロセス条件に耐えるように酵素を安定化するために、現代のタンパク質工学アプローチ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｈａｎｄｂｏｏｋ；Ｌｕｔｚ Ｓ．，＆ Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ Ｕ．Ｔ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧａＡ：２００８；Ｖｏｌ．１＆２）、例えば、定向進化、合理的な突然変異誘発、コンピュータによるデザイン（Ｚａｎｇｈｅｌｌｉｎｉ，Ａ ｅｔ ａｌ，２００８）またはそれらの組み合わせを用いて操作され得る。いったん、その経路の各工程を触媒し得る所望の酵素が特徴づけられたら、これらの酵素をコードする遺伝子が、最適な微生物にクローニングされ得、発酵条件が最適化され得、発酵後の生成物の形成が、モニターされ得る。それらの酵素が同定された後、それらの酵素のうちの１つ以上に対応する遺伝子が、微生物宿主にクローニングされる。いくつかの態様では、本明細書中に記載される特定の経路の各酵素をコードする遺伝子が、微生物宿主にクローニングされる。
組換え／外来性核酸／タンパク質を微生物に導入する方法およびこの目的に適したベクターは、当該分野で周知である。例えば、様々な手法が、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８および年四回の改訂）に例証されている。発現ベクターを微生物宿主細胞に移すための方法は、当該分野で周知である。具体的な方法およびベクターは、所望の微生物宿主の種に応じて異なり得る。例えば、細菌宿主細胞は、熱ショック、塩化カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポソームまたはファージ感染によって形質転換され得る。酵母宿主細胞は、酢酸リチウム処理（キャリアＤＮＡおよびＰＥＧ処理をさらに含み得る）またはエレクトロポレーションによって形質転換され得る。これらの方法は、例証的な目的のために含められるものであって、決して、限定または包括的であると意図されていない。当該分野で周知の手段による日常的な実験が、特定の発現ベクターまたは形質転換方法が所与の微生物宿主にふさわしいか否かを判定するために使用され得る。さらに、多くの異なる微生物宿主に適した試薬およびベクターは、商業的に入手可能であり、当該分野で周知である。
酵素の構築、発現または過剰発現のための方法、および天然に存在しない微生物宿主における発現レベルを試験するための方法は、当該分野で周知である（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｒｅｎｄｓ，Ｂａｎｅｙｘ Ｆ．ｅｄｓ．Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＵＫ；およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９９））。
微生物の発酵を行うための方法は、当該分野で周知である。例えば、様々な手法が、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ，１９９７，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）に例証されている。発酵のための具体的な方法は、所望の微生物宿主の種に応じて異なり得る。典型的には、微生物を、バッチモードまたは連続発酵モードで炭素源とともに適切な培地中で生育する。カタボライトリプレッションまたは酵素活性を調節すると知られている作用物質を用いることにより、アジピン酸またはグルタル酸の生成が増大し得る。発酵にとって好適なｐＨは、３〜１０である。発酵は、微生物の要求に基づいて、好気条件、嫌気条件または無酸素条件下で行われ得る。発酵は、バッチ、フェドバッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）または連続様式で行われ得る。発酵は、所望であれば、２段階でも行われ得る。例えば、第１段階は、高成長ゆえに高い生産力を可能にするために好気であり得、その後、高カプロラクトン収量の嫌気段階が続く。
炭素源には、例えば、天然に存在しない微生物に炭素源を供給し得る任意の炭水化物源が含まれ得る。そのような供給源としては、例えば、糖、例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、スクロースおよびデンプンが挙げられる。他の炭水化物源としては、例えば、再生可能な供給原料およびバイオマスが挙げられる。本発明の方法において供給原料として使用され得る例示的なバイオマスのタイプとしては、セルロース系バイオマス、ヘミセルロース系バイオマスおよびリグニン供給原料または供給原料の一部が挙げられる。そのようなバイオマス供給原料は、例えば、炭素源として有用な炭水化物基質、例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトースおよびデンプンを含む。本明細書中に提供される教示および指導を所与として、当業者は、再生可能な供給原料および上で例証されたもの以外のバイオマスもまた、所望の化合物を生成するために、本発明の微生物生物を培養するために使用され得ることを理解するだろう。
本明細書中に記載される反応は、モニターすることができ、発酵培地中の出発物質、生成物または中間体は、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）解析、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−質量分析）およびＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）または当該分野で周知の日常的な手順を用いる他の好適な分析方法を用いて、その培地を分析することによって同定され（ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）得る。
例えば、グリセロールおよび／または他の炭素源、例えば、グルコースの溶液に、図１におけるような本明細書中に記載される経路において使用される酵素を共に産生する１種以上の微生物を加える。その混合物を、１８℃〜７０℃の温度で１〜３０日間にわたって維持する。その反応を停止し、当該分野で広く公知の方法、例えば、下に記載される方法に従って、生成物を単離する。あるいは、生成物を連続的に分離しつつ、反応を継続する。
本明細書中に記載されるいずれの天然に存在しない微生物生物も、培養されることにより、本発明の生成物を産生することおよび／または分泌することができる。
本明細書中に記載される方法によって調製された化合物は、生合成または発酵によって調製された有機化合物を単離するための当該分野で広く公知の方法によって単離され得る。例えば、１−ブタノール、酪酸、コハク酸、１，４−ブタンジオール、１−ペンタノール、ペンタン酸、グルタル酸、１，５−ペンタンジオール、１−ヘキサノール、ヘキサン酸、アジピン酸、１，６−ヘキサンジオール、６−ヒドロキシヘキサン酸、ε−カプロラクトン、６−アミノ−ヘキサン酸、ε−カプロラクタムおよびヘキサメチレンジアミンが、結晶化、塩形成、パーベーパレーション、反応抽出、抽出（液体−液体および２段階）、吸着、イオン交換、透析、蒸留、ガスストリッピングおよび膜による分離によって溶液から単離され得る（Ｒｏｆｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ ２：１２９−１３６（１９８４））。１−ヘキサノールおよび１，５−ペンタンジオールは、蒸留、抽出（液体−液体および２段階）、パーベーパレーションおよび膜による分離を用いて溶液から単離され得る（Ｒｏｆｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ ２：１２９−１３６（１９８４））。７〜２５炭素長の直鎖脂肪酸および直鎖脂肪アルコール、６〜２４炭素長の直鎖アルカンおよび直鎖α−アルケン、セバシン酸ならびにドデカン二酸は、水相から相分離し得る。
本明細書中に提供される教示および指導に従って、天然に存在しない微生物生物は、化合物、例えば、１−ブタノール、酪酸、コハク酸、１，４−ブタンジオール、１−ペンタノール、ペンタン酸、グルタル酸、１，５−ペンタンジオール、１−ヘキサノール、ヘキサン酸、アジピン酸、１，６−ヘキサンジオール、６−ヒドロキシヘキサン酸、ε−カプロラクトン、６−アミノ−ヘキサン酸、ε−カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、７〜２５炭素長の直鎖脂肪酸および直鎖脂肪アルコール、６〜２４炭素長の直鎖アルカンおよび直鎖α−アルケン、セバシン酸ならびにドデカン二酸の合成を達成することができ、約０．１〜５００ｍＭまたはそれ以上の細胞内濃度または細胞外濃度がもたらされる。一般に、１−ブタノール、酪酸、コハク酸、１，４−ブタンジオール、１−ペンタノール、ペンタン酸、グルタル酸、１，５−ペンタンジオール、１−ヘキサノール、ヘキサン酸、アジピン酸、１，６−ヘキサンジオール、６−ヒドロキシヘキサン酸、ε−カプロラクトン、６−アミノ−ヘキサン酸、ε−カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、７〜２５炭素長の直鎖脂肪酸および直鎖脂肪アルコール、６〜２４炭素長の直鎖アルカンおよび直鎖α−アルケン、セバシン酸ならびにドデカン二酸の細胞内濃度または細胞外濃度は、約３〜１５０ｍＭ、特に、約５〜１２５ｍＭ、より詳細には、約１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、８０ｍＭまたはそれ以上を含む約８〜１００ｍＭである。これらの例示的な各範囲の間のおよび各範囲を超える細胞内濃度または細胞外濃度もまた、本明細書中に提供される天然に存在しない微生物生物から達成され得る。
培養条件は、例えば、液体培養の手順、ならびに発酵および他の大量培養の手順を含み得る。本明細書中に記載されるように、本発明の生合成産物の特に有用な収量は、嫌気培養条件下または実質的に嫌気性の培養条件下において得ることができる。
本明細書中に記載されるように、所望の生成物の生合成を達成するための１つの例示的な生育条件は、嫌気培養または発酵条件を含む。ある特定の実施形態において、本発明の天然に存在しない微生物生物は、嫌気条件下または実質的に嫌気性の条件下において維持され得るか、培養され得るか、または発酵され得る。簡潔には、嫌気条件とは、酸素を欠く環境のことを指す。実質的に嫌気性の条件としては、例えば、培地中の溶存酸素濃度が飽和の０〜１０％のままであるような、培養、バッチ発酵または連続発酵が挙げられる。実質的に嫌気性の条件には、１％未満の酸素の雰囲気で維持された密閉チャンバー内部の液体培地中または固形寒天上の増殖細胞または休止細胞も含まれる。酸素のパーセントは、例えば、培養物にＮ２／ＣＯ２混合物または他の好適な非酸素ガスを散布することによって、維持され得る。
本明細書中に記載される培養条件は、生成物を製造するために、スケールアップされ得、連続的に拡大され得る。例示的な生育手順としては、例えば、フェドバッチ発酵およびバッチ分離；フェドバッチ発酵および連続分離または連続発酵および連続分離が挙げられる。これらのプロセスのすべてが、当該分野で周知である。発酵手順は、商業的な量での生合成生産にとって特に有用である。一般に、非連続培養手順と同様に、アジペート、６−アミノカプロン酸、カプロラクタム、６−ヒドロキシヘキサノエート、カプロラクトン、１，６−ヘキサンジオール、１−ヘキサノールおよびＨＭＤＡの連続生産および／またはほぼ連続的な生産は、成長を対数期で持続するおよび／またはおおよそ持続するのに十分な栄養分および培地中で、アジペート、６−アミノカプロン酸、カプロラクタム、６−ヒドロキシヘキサノエート、カプロラクトン、１，６−ヘキサンジオール、１−ヘキサノールまたはＨＭＤＡを産生する本発明の天然に存在しない生物を培養する工程を含み得る。そのような条件下での連続培養は、例えば、１、２、３、４、５、６もしくは７日間またはそれ以上を含み得る。さらに、連続培養は、１、２、３、４もしくは５週間またはそれ以上かつ数ヶ月間までを含み得る。あるいは、本発明の生物は、特定の用途に適する場合、数時間にわたって培養され得る。連続培養および／またはほぼ連続的な培養の条件は、これらの例示的な期間の間のすべての時間間隔も含み得ることが理解されるべきである。本発明の微生物生物を培養する時間は、所望の目的にとって十分な量の生成物を生成するのに十分な時間であることがさらに理解される。発酵手順は、当該分野で周知である。バッチ発酵手順および連続発酵手順の例は、当該分野で周知である。用語「十分な量で発現される経路酵素」は、その酵素が、所望の経路の生成物の検出を可能にするのに十分な量で発現されることを暗示する。その酵素は、一部である（ａｐａｒｔ ｏｆ）。
いくつかの異性体（例えば、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ異性体、ならびにＲおよびＳ異性体、またはそれらの組み合わせ）が存在する化合物について言及するとき、その化合物は、原則として、本発明の方法において使用され得る存在し得るすべてのその化合物のエナンチオマー、ジアステレオマーおよびｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性体を含む。
本発明の一態様において、１−ブタノール、酪酸、コハク酸、１，４−ブタンジオール、１−ペンタノール、ペンタン酸、グルタル酸、１，５−ペンタンジオール、１−ヘキサノール、ヘキサン酸、アジピン酸、１，６−ヘキサンジオール、６−ヒドロキシヘキサン酸、ε−カプロラクトン、６−アミノ−ヘキサン酸、ε−カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、７〜２５炭素長の直鎖脂肪酸および直鎖脂肪アルコール、６〜２４炭素長の直鎖アルカンおよび直鎖α−アルケン、セバシン酸またはドデカン二酸を調製するための宿主として微生物が働く。別の態様において、その微生物は、ＣＮ＋３β−ヒドロキシケトン中間体を１−ブタノール、酪酸、コハク酸、１，４−ブタンジオール、１−ペンタノール、ペンタン酸、グルタル酸、１，５−ペンタンジオール、１−ヘキサノール、ヘキサン酸、アジピン酸、１，６−ヘキサンジオール、６−ヒドロキシヘキサン酸、ε−カプロラクトン、６−アミノ−ヘキサン酸、ε−カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、７〜２５炭素長の直鎖脂肪酸および直鎖脂肪アルコール、６〜２４炭素長の直鎖アルカンおよび直鎖α−アルケン、セバシン酸またはドデカン二酸に変換する酵素的工程を触媒するのに必要な酵素をコードする１つ以上の遺伝子を含む。さらなる態様において、その微生物は、Ｃ５糖、Ｃ６糖、グリセロール、他の炭素源またはそれらの組み合わせをピルベートに変換する能力を有する。さらなる態様において、その微生物は、Ｃ５糖の取り込み、Ｃ６／Ｃ５糖の同時の取り込み、Ｃ６糖／グリセロールの同時の取り込み、Ｃ５糖／グリセロールの同時の取り込みおよびそれらの組み合わせを含む糖の取り込みが増大するように操作されている。
一態様において、本発明は、１−ブタノール、酪酸、コハク酸、１，４−ブタンジオール、１−ペンタノール、ペンタン酸、グルタル酸、１，５−ペンタンジオール、１−ヘキサノール、ヘキサン酸、アジピン酸、１，６−ヘキサンジオール、６−ヒドロキシヘキサン酸、ε−カプロラクトン、６−アミノ−ヘキサン酸、ε−カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、７〜２５炭素長の直鎖脂肪酸および直鎖脂肪アルコール、６〜２４炭素長の直鎖アルカンおよび直鎖α−アルケン、セバシン酸またはドデカン二酸に対する生産能力を有する微生物生物のデザインおよび作製に関する。エシェリヒア・コリおよび他の細胞または生物においてこれらの化合物の生合成の達成を可能にする代謝経路が、本明細書中に記載される。これらの化合物の生合成生産は、デザインされた代謝経路を有する株を構築することによって確かめることができる。
一態様において、アジペートを生成するのに十分な量で発現されるアジピン酸（ＡＤＡ）経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸を含む天然に存在しない微生物生物が提供され、ここで、前記アジピン酸経路は、表Ａから選択される経路を含む：
Figure 0006680671
Figure 0006680671
Figure 0006680671
Figure 0006680671
Figure 0006680671
ここで、２Ａは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸アルドラーゼ、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸アルドラーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸アルドラーゼであり、２Ｂは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸デヒドラターゼ、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドラターゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸デヒドラターゼであり、３Ｂ１は、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸２−レダクターゼ、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸２−レダクターゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸２−レダクターゼであり、３Ｂ２は、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸４−デヒドロゲナーゼ、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼであり、２Ｃは、３，４−デヒドロ−２−オキソ−アジピン酸３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−３，４−デヒドロ−２−オキソヘキサン酸３−レダクターゼまたは６−アミノ−３，４−デヒドロ−２−オキソヘキサン酸３−レダクターゼであり、３Ｇ１は、２，４−ジヒドロキシアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２，４−ジヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼ、２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼまたは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｃ２は、２，４−ジヒドロキシアジピン酸４−デヒドロゲナーゼ、２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼまたは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼであり、３Ｃ３は、２，４−ジオキソアジピン酸２−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，４−ジオキソヘキサン酸２−レダクターゼまたは６−アミノ−２，４−ジオキソヘキサン酸２−レダクターゼであり、２Ｊは、４，５−デヒドロ−２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、２Ｇは、２，３−デヒドロ−アジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、３Ｅ１は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、３Ｅ２は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピン酸２，３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸２，３−レダクターゼであり、４Ｅ３は、４，５−デヒドロアジピル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、４Ｅ４は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、３Ｋ２は、２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシアジピン酸２，３−レダクターゼ、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサン酸２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシヘキサン酸２，３−レダクターゼであり、３Ｋ１は、２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼ、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、４Ｆ４は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサン酸４，５−レダクターゼであり、３Ｎは、２−オキソアジピル−ＣｏＡ２−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−レダクターゼまたは６−アミノ−２−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−レダクターゼであり、２Ｄは、２−オキソアジピン酸２−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２オキソヘキサン酸２−レダクターゼまたは６−アミノ−２−オキソヘキサン酸２−レダクターゼであり、３Ｌ２は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピン酸４−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼであり、３Ｌ１は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピル−ＣｏＡ４−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼであり、３Ｆ２は、４−オキソアジピン酸４−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼまたは６−アミノ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼであり、３Ｆ１は、４−オキソアジピル−ＣｏＡ３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼまたは６−アミノ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼであり、４Ａ１は、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ２は、４，６−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ３は、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ４は、６−ヒドロキシヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ５は、４，６−ジヒドロキシヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼであり、３Ｃ１は、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドロゲナーゼ、２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドロゲナーゼまたは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ１は、４−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ４は、４−ヒドロキシ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ５は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ６は、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ７は、６−オキソヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｆ１は、アジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アジピル−ＣｏＡヒドロラーゼまたはアジピル−ＣｏＡリガーゼであり、４Ｆ２は、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼであり、４Ｆ３は、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼ、４Ｆ５ ６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼ、２Ｅは、２−ヒドロキシ−アジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは２−ヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼ、２，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは２，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼ、６−アミノ−２−ヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｇ２は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸−ＣｏＡリガーゼ、２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｇ５は、４−ヒドロキシアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは４−ヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼ、４，６−ジヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは４，６−ジヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、２Ｉは、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、３Ｍは、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）、２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）または６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）であり、３Ｈは、４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（ｄｅｈｄｙｒａｔａｓｅ）（２，３−デヒドロ形成）、４，６−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）または６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）であり、２Ｆは、２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼ、２，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、３Ｄ３は、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼ、２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼまたは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、３Ｄ２は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸２−デヒドラターゼ、２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸２−デヒドラターゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサン酸２−デヒドラターゼであり、３Ｄ１は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼ、２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、４Ｄ３は、４−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、４Ｄ４は、４−ヒドロキシ−６オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、４Ｄ５ ４−ヒドロキシ−６オキソヘキサン酸４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）、４Ｇ１は、６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡトランスアミナーゼまたは６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（脱アミノ化）であり、４Ｇ２は、６−アミノヘキサン酸トランスアミナーゼまたは６−アミノヘキサン酸デヒドロゲナーゼ（脱アミノ化）であり、４Ｇ３は、６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡトランスアミナーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（脱アミノ化）であり、４Ｇ４は、６−アミノ−４−ヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル（ｄｅｈｄｙｒｏｈｅｘａｎｏｙｌ）−ＣｏＡトランスアミナーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（脱アミノ化）であり、４Ｇ５は、６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサン酸トランスアミナーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ（脱アミノ化）である。
別の態様において、特に、アジピン酸合成経路が、ＡＤＡ１〜ＡＤＡ２５から選択されるとき、２Ａは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸アルドラーゼであり、２Ｂは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸デヒドラターゼであり、３Ｂ１は、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸２−レダクターゼであり、３Ｂ２は、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸４−デヒドロゲナーゼであり、２Ｃは、３，４−デヒドロ−２−オキソ−アジピン酸３−レダクターゼであり、３Ｇ１は、２，４−ジヒドロキシアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは２，４−ジヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｃ２は、２，４−ジヒドロキシアジピン酸４−デヒドロゲナーゼであり、３Ｃ３は、２，４−ジオキソアジピン酸２−レダクターゼであり、２Ｊは、４，５−デヒドロ−２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、２Ｇは、２，３−デヒドロ−アジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、３Ｅ１は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、３Ｅ２は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピン酸２，３−レダクターゼであり、４Ｅ３は、４，５−デヒドロアジピル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、３Ｋ２は、２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシアジピン酸２，３−レダクターゼであり、３Ｋ１は、２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、３Ｎは、２−オキソアジピル−ＣｏＡ２−レダクターゼであり、２Ｄは、２−オキソアジピン酸２−レダクターゼであり、３Ｌ２は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピン酸４−レダクターゼであり、３Ｌ１は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピル−ＣｏＡ４−レダクターゼであり、３Ｆ２は、４−オキソアジピン酸４−レダクターゼであり、３Ｆ１は、４−オキソアジピル−ＣｏＡ３−レダクターゼであり、３Ｃ１は、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドロゲナーゼであり、４Ｆ１は、アジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アジピル−ＣｏＡヒドロラーゼまたはアジピル−ＣｏＡリガーゼであり、２Ｅは、２−ヒドロキシ−アジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは２−ヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｇ２は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｇ５は、４−ヒドロキシアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは４−ヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼであり、２Ｉは、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、３Ｍは、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）であり、３Ｈは、４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）であり、２Ｆは、２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、３Ｄ３は、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、３Ｄ２は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸２−デヒドラターゼであり、３Ｄ１は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、４Ｄ３は、４−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）である。
別の態様において、特に、アジピン酸合成経路が、ＡＤＡ２６〜ＡＤＡ８３から選択されるとき、２Ａは、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸アルドラーゼであり、２Ｂは、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドラターゼであり、３Ｂ１は、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸２−レダクターゼであり、３Ｂ２は、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼであり、２Ｃは、６−ヒドロキシ−３，４−デヒドロ−２−オキソヘキサン酸３−レダクターゼであり、３Ｇ１は、２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｃ２は、２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼであり、３Ｃ３は、６−ヒドロキシ−２，４−ジオキソヘキサン酸２−レダクターゼであり、２Ｇは、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、３Ｅ１は、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、３Ｅ２は、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸２，３−レダクターゼであり、４Ｅ４は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、３Ｋ２は、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサン酸２，３−レダクターゼであり、３Ｋ１は、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、４Ｆ４は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサン酸４，５−レダクターゼであり、３Ｎは、６−ヒドロキシ−２−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−レダクターゼであり、２Ｄは、６−ヒドロキシ−２オキソヘキサン酸２−レダクターゼであり、３Ｌ２は、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼであり、３Ｌ１は、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼであり、３Ｆ２は、６−ヒドロキシ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼであり、３Ｆ１は、６−ヒドロキシ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼであり、４Ａ１は、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ２は、４，６−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ３は、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ４は、６−ヒドロキシヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ５は、４，６−ジヒドロキシヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼであり、３Ｃ１は、２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ１は、４−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ４は、４−ヒドロキシ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ５は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ６は、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ７は、６−オキソヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｆ１は、アジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アジピル−ＣｏＡヒドロラーゼまたはアジピル−ＣｏＡリガーゼであり、４Ｆ２は、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼであり、４Ｆ３は、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼであり、２Ｅは、２，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは２，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｇ２は、２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｇ５は、４，６−ジヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは４，６−ジヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｍは、２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）であり、３Ｈは、４，６−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）であり、２Ｆは、２，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、３Ｄ３は、２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、３Ｄ２は、２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸２−デヒドラターゼであり、３Ｄ１は、２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、４Ｄ３は、４−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、４Ｄ４は、４−ヒドロキシ−６オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、４Ｄ５ ４−ヒドロキシ−６オキソヘキサン酸４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）、４Ｅ３は、４，５−デヒドロアジピル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼである。
別の態様において、特に、アジピン酸合成経路が、ＡＤＡ８４〜ＡＤＡ１４１から選択されるとき、２Ａは、６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸アルドラーゼであり、２Ｂは、６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸デヒドラターゼであり、３Ｂ１は、６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸２−レダクターゼであり、３Ｂ２は、６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼであり、２Ｃは、６−アミノ−３，４−デヒドロ−２−オキソヘキサン酸３−レダクターゼであり、３Ｇ１は、６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｃ２は、６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼであり、３Ｃ３は、６−アミノ−２，４−ジオキソヘキサン酸２−レダクターゼであり、２Ｇは、６−アミノ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、３Ｅ１は、６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、３Ｅ２は、６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸２，３−レダクターゼであり、４Ｅ３は、４，５−デヒドロアジピル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、４Ｅ４は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、３Ｋ２は、６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシヘキサン酸２，３−レダクターゼであり、３Ｋ１は、６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、４Ｆ４は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサン酸４，５−レダクターゼであり、３Ｎは、６−アミノ−２−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−レダクターゼであり、２Ｄは、６−アミノ−２−オキソヘキサン酸２−レダクターゼであり、３Ｌ２は、６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼであり、３Ｌ１は、６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼであり、３Ｆ２は、６−アミノ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼであり、３Ｆ１は、６−アミノ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼであり、３Ｃ１は、６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ１は、４−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ４は、４−ヒドロキシ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ５は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ６は、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ７は、６−オキソヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｆ１は、アジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アジピル−ＣｏＡヒドロラーゼまたはアジピル−ＣｏＡリガーゼであり、４Ｆ２は、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼであり、４Ｆ５ ６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼ、２Ｅは、６−アミノ−２−ヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｇ２は、６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｇ５は、６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｍは、６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）であり、３Ｈは、６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）であり、２Ｆは、６−アミノ−２−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、３Ｄ３は、６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、３Ｄ２は、６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサン酸２−デヒドラターゼであり、３Ｄ１は、６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、４Ｄ３は、４−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、４Ｄ４は、４−ヒドロキシ−６オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、４Ｄ５ ４−ヒドロキシ−６オキソヘキサン酸４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）、４Ｇ１は、６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡトランスアミナーゼまたは６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（脱アミノ化）であり、４Ｇ２は、６−アミノヘキサン酸トランスアミナーゼまたは６−アミノヘキサン酸デヒドロゲナーゼ（脱アミノ化）であり、４Ｇ３は、６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡトランスアミナーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（脱アミノ化）であり、４Ｇ４は、６−アミノ−４−ヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡトランスアミナーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（脱アミノ化）であり、４Ｇ５は、６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサン酸トランスアミナーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ（脱アミノ化）である。
別の態様において、特に、アジピン酸合成経路が、ＡＤＡ８４〜ＡＤＡ１４１から選択されるとき、天然に存在しない微生物生物は、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼおよび／またはＮ−デアセチラーゼをさらに含む（ｃｏｍｐｒｓｉｓｅｓ）。
一態様において、本明細書中に記載されるような天然に存在しない微生物生物が提供され、ここで、その微生物生物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の外来性核酸を含み、その各々は、アジピン酸経路酵素をコードする。例えば、その微生物生物は、上に記載されたようなＡＤＡ１〜ＡＤＡ１４１から選択される少なくとも１つの経路の各酵素をコードする外来性核酸を含み得る。
一態様において、微生物生物内に含められている少なくとも１つの外来性核酸は、異種核酸である。別の態様において、本明細書中に開示されるような天然に存在しない微生物生物は、実質的に嫌気性の培養液中に存在する。
一態様において、６−アミノヘキサノエートを生成するのに十分な量で発現される６−アミノヘキサン酸（ＡＨＡ）経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸を含む天然に存在しない微生物生物が提供され、ここで、前記６−アミノヘキサン酸経路は、表Ｂから選択される経路を含む：
Figure 0006680671
Figure 0006680671
表Ｂにおいて、２Ａ、２Ｂ、３Ｂ１、３Ｂ２、２Ｃ、３Ｇ１、３Ｃ２、３Ｃ３、２Ｊ、２Ｇ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ３、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１、４Ｆ４、３Ｎ、２Ｄ、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２、３Ｆ１、４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ４、４Ａ５、３Ｃ１、４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｆ２、４Ｆ３、４Ｆ５、２Ｅ、３Ｇ２、３Ｇ５、２Ｉ、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、４Ｄ３、４Ｄ４、４Ｄ５は、上記と同じであり、５Ｊは、６−オキソヘキサン酸トランスアミナーゼ（アミノ化）または６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ（アミノ化）であり、５Ｉは、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡトランスアミナーゼ（アミノ化）または６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（アミノ化）であり、５Ｇは、アジピル−ＣｏＡ１−レダクターゼである。
一態様において、特に、６−アミノヘキサン酸合成経路が、ＡＨＡ１〜ＡＨＡ２から選択されるとき、２Ａ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、４Ｆ５．３Ｂ１、３Ｇ１、３Ｍおよび３Ｎは、選択されるアジピン酸経路がＡＤＡ８４〜ＡＤＡ１４１のいずれか１つであるときと同じであり、５Ｊ、５Ｉおよび５Ｃは、上で定義されたものである。
別の態様において、特に、６−アミノヘキサン酸合成経路が、ＡＨＡ３〜ＡＨＡ３４から選択されるとき、２Ａ、２Ｂ、３Ｂ１、３Ｂ２、２Ｃ、３Ｇ１、３Ｃ２、３Ｃ３、２Ｇ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ３、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１、４Ｆ４、３Ｎ、２Ｄ、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２、３Ｆ１、４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ４、４Ａ５、３Ｃ１、４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｆ２、４Ｆ３、４Ｆ５、２Ｅ、３Ｇ２、３Ｇ５、２Ｉ、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、４Ｄ３、４Ｄ４および４Ｄ５は、選択されるアジピン酸経路がＡＤＡ２６〜ＡＤＡ８３のいずれか１つであるときと同じであり、５Ｊ、５Ｉおよび５Ｃは、上で定義されたものである。
別の態様において、特に、６−アミノヘキサン酸合成経路が、ＡＨＡ３５〜ＡＨＡ５９から選択されるとき、２Ａ、２Ｂ、３Ｂ１、３Ｂ２、２Ｃ、３Ｇ１、３Ｃ２、３Ｃ３、２Ｇ、２Ｊ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ３、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１、４Ｆ４、３Ｎ、２Ｄ、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２、３Ｆ１、４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ４、４Ａ５、３Ｃ１、４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｆ２、４Ｆ３、４Ｆ５、２Ｅ、３Ｇ２、３Ｇ５、２Ｉ、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、４Ｄ３、４Ｄ４および４Ｄ５は、選択されるアジピン酸経路がＡＤＡ１〜ＡＤＡ２５のいずれか１つであるときと同じであり、５Ｊ、５Ｉおよび５Ｃは、上で定義されたものである。
別の態様において、特に、６−アミノヘキサン酸合成経路が、ＡＨＡ１〜ＡＨＡ２から選択されるとき、天然に存在しない微生物生物は、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼおよび／またはＮ−デアセチラーゼをさらに含む。
一態様において、本明細書中に記載されるような天然に存在しない微生物生物が提供され、ここで、その微生物生物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の外来性核酸を含み、その各々は、６−アミノヘキサン酸経路酵素をコードする。
例えば、その微生物生物は、上に記載されたようなＡＨＡ１〜ＡＨＡ５９から選択される少なくとも１つの経路の各酵素をコードする外来性核酸を含み得る。
一態様において、微生物生物内に含められている少なくとも１つの外来性核酸は、異種核酸である。別の態様において、本明細書中に開示されるような天然に存在しない微生物生物は、実質的に嫌気性の培養液中に存在する。
一態様において、カプロラクタム（ＣＰＬ）を生成するのに十分な量で発現されるカプロラクタム経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸を含む天然に存在しない微生物生物が提供され、ここで、前記カプロラクタム経路は、表Ｃから選択される経路を含む：
Figure 0006680671
Figure 0006680671
Figure 0006680671
Figure 0006680671
ここで、２Ａ、２Ｂ、３Ｂ１、３Ｂ２、２Ｃ、３Ｇ１、３Ｃ２、３Ｃ３、２Ｊ、２Ｇ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ３、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１、４Ｆ４、３Ｎ、２Ｄ、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２、３Ｆ１、４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ４、４Ａ５、３Ｃ１、４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｆ２、４Ｆ３、２Ｅ、３Ｇ２、３Ｇ５、２Ｉ、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、４Ｄ３、４Ｄ４および４Ｄ５は、選択されるアジピン酸経路がＡＤＡ１〜ＡＤＡ１４１のいずれか１つであるときと同じであり、５Ｊは、６−オキソヘキサン酸トランスアミナーゼ（アミノ化）または６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ（アミノ化）であり、５Ｉは、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡトランスアミナーゼ（アミノ化）または６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（アミノ化）であり、５Ｇは、アジピル−ＣｏＡ１−レダクターゼであり、５Ｃは、６−アミノヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは６−アミノヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、５Ａは、自発的環化またはアミドヒドロラーゼである。
一態様において、特に、ＣＰＬ合成経路が、ＣＰＬ１〜２から選択されるとき、２Ａ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、３Ｂ１、３Ｇ１、３Ｍおよび３Ｎは、選択されるＡＨＡ経路がＡＨＡ１〜ＡＨＡ２のいずれか１つであるときと同じである。
別の態様において、特に、ＣＰＬ経路が、ＣＰＬ３〜４２、６８〜９４から選択されるとき、２Ａ、２Ｂ、３Ｂ１、３Ｂ２、２Ｃ、３Ｇ１、３Ｃ２、３Ｃ３、２Ｇ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ３、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１、４Ｆ４、３Ｎ、２Ｄ、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２、３Ｆ１、４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ４、４Ａ５、３Ｃ１、４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｆ２、４Ｆ３、２Ｅ、３Ｇ２、３Ｇ５、２Ｉ、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、４Ｄ３、４Ｄ４、４Ｄ５は、選択されるＡＤＡ経路がＡＤＡ２６〜ＡＤＡ８３のうちの１つであるときと同じであり、５Ｊ、５Ｉ、５Ｇ、５Ａおよび５Ｃは、上で定義されたものである。
別の態様において、特に、ＣＰＬ経路が、ＣＰＬ４３〜６７、９５〜１１９から選択されるとき、２Ａ、２Ｂ、３Ｂ１、３Ｂ２、２Ｃ、３Ｇ１、３Ｃ２、３Ｃ３、２Ｇ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ３、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１、４Ｆ４、３Ｎ、２Ｄ、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２、３Ｆ１、４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ４、４Ａ５、３Ｃ１、４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｆ２、４Ｆ３、２Ｅ、３Ｇ２、３Ｇ５、２Ｉ、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、４Ｄ３、４Ｄ４、４Ｄ５は、選択されるＡＤＡ経路がＡＤＡ１〜ＡＤＡ２５のうちの１つであるときと同じであり、５Ｊ、５Ｉ、５Ｇ、５Ａおよび５Ｃは、上で定義されたものである。
別の態様において、特に、ＣＰＬ経路が、ＣＰＬ１〜２から選択されるとき、天然に存在しない微生物生物は、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼおよび／またはＮ−デアセチラーゼをさらに含む。
一態様において、本明細書中に記載されるような天然に存在しない微生物生物が提供され、ここで、その微生物生物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個の外来性核酸を含み、その各々は、ＣＰＬ経路酵素をコードする。
例えば、その微生物生物は、上に記載されたようなＣＰＬ１〜ＣＰＬ１１９から選択される少なくとも１つの経路の各酵素をコードする外来性核酸を含み得る。
一態様において、微生物生物内に含められている少なくとも１つの外来性核酸は、異種核酸である。別の態様において、本明細書中に開示されるような天然に存在しない微生物生物は、実質的に嫌気性の培養液中に存在する。
一態様において、６−ヒドロキシヘキサノエートを生成するのに十分な量で発現される６−ヒドロキシヘキサン酸（ＨＨＡ）経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸を含む天然に存在しない微生物生物が提供され、ここで、前記６−ヒドロキシヘキサン酸経路は、表Ｄから選択される経路を含む：
Figure 0006680671
Figure 0006680671
Figure 0006680671
ここで、２Ａ、２Ｂ、３Ｂ１、３Ｂ２、２Ｃ、３Ｇ１、３Ｃ２、３Ｃ３、２Ｊ、２Ｇ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ３、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１、４Ｆ４、３Ｎ、２Ｄ、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２、３Ｆ１、４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ５、３Ｃ１、４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｆ２、４Ｆ３、２Ｅ、３Ｇ２、３Ｇ５、２Ｉ、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、４Ｄ３、４Ｄ４および４Ｄ５は、選択されるアジピン酸経路がＡＤＡ１〜ＡＤＡ８３のいずれか１つであるときと同じであり、５Ｌは、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−レダクターゼであり、５Ｇは、アジピル−ＣｏＡ１−レダクターゼであり、５Ｋは、６−オキソヘキサン酸６−レダクターゼである。
一態様において、特に、６−ヒドロキシヘキサン酸合成経路が、ＨＨＡ１〜４３から選択されるとき、２Ａ、２Ｂ、３Ｂ１、３Ｂ２、２Ｃ、３Ｇ１、３Ｃ２、３Ｃ３、２Ｇ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ３、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１、４Ｆ４、３Ｎ、２Ｄ、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２、３Ｆ１、４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ５、３Ｃ１、４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｆ２、４Ｆ３、２Ｅ、３Ｇ２、３Ｇ５、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、４Ｄ３、４Ｄ４および４Ｄ５は、選択されるＡＤＡ経路がＡＤＡ２６〜ＡＤＡ８３のうちの１つであるときと同じであり、５Ｌ、５Ｇおよび５Ｋは、上で定義されたものである。
別の態様において、特に、６−ヒドロキシヘキサン酸合成経路が、ＨＨＡ４４〜６６から選択されるとき、２Ａ、２Ｂ、３Ｂ１、３Ｂ２、２Ｃ、３Ｇ１、３Ｃ２、３Ｃ３、２Ｊ、２Ｇ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ３、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１、４Ｆ４、３Ｎ、２Ｄ、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２、３Ｆ１、４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ５、３Ｃ１、４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｆ２、４Ｆ３、２Ｅ、３Ｇ２、３Ｇ５、２Ｉ、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、４Ｄ３、４Ｄ４および４Ｄ５は、選択されるＡＤＡ経路がＡＤＡ１〜ＡＤＡ２５のうちの１つであるときと同じであり、５Ｌ、５Ｇおよび５Ｋは、上で定義されたものである。
別の態様において、特に、６−ヒドロキシヘキサン酸合成経路が、ＨＨＡ１〜６６から選択されるとき、天然に存在しない微生物生物は、ラクトナーゼをさらに含む。
一態様において、本明細書中に記載されるような天然に存在しない微生物生物が提供され、ここで、その微生物生物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の外来性核酸を含み、その各々は、６−ヒドロキシヘキサン酸経路酵素をコードする。
例えば、その微生物生物は、上に記載されたようなＨＨＡ１〜ＨＨＡ６６から選択される少なくとも１つの経路の各酵素をコードする外来性核酸を含み得る。
一態様において、微生物生物内に含められている少なくとも１つの外来性核酸は、異種核酸である。別の態様において、本明細書中に開示されるような天然に存在しない微生物生物は、実質的に嫌気性の培養液中に存在する。
一態様において、カプロラクトンを生成するのに十分な量で発現されるカプロラクトン（ＣＬＯ）経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸を含む天然に存在しない微生物生物が提供され、ここで、前記カプロラクトン（ｃａｒｐｏｌａｃｔｏｎｅ）経路は、表Ｆから選択される経路を含む：
Figure 0006680671
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ここで、２Ａ、２Ｂ、３Ｂ１、３Ｂ２、２Ｃ、３Ｇ１、３Ｃ２、３Ｃ３、２Ｇ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１、４Ｆ４、３Ｎ、２Ｄ、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２、３Ｆ１、４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ５、３Ｃ１、４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｂ６、４Ｆ２、２Ｅ、３Ｇ２、３Ｇ５、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、４Ｄ４および４Ｄ５は、選択されるＡＤＡ経路がＡＤＡ２６〜ＡＤＡ８３のうちの１つであるときと同じであり、５Ｌ、５Ｋは、上記と同じであり、５Ｍは、６−ヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは６−ヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、５Ｐは、自発的環化または６−ヒドロキシヘキサン酸シクラーゼであり、５Ｑは、自発的環化または６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡシクラーゼである。
一態様において、本明細書中に記載されるような天然に存在しない微生物生物が提供され、ここで、その微生物生物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の酵素外来性核酸を含み、その各々は、カプロラクトン経路酵素をコードする。
例えば、その微生物生物は、上に記載されたようなＣＰＯ１〜ＣＰＯ６９から選択される少なくとも１つの経路の各酵素をコードする外来性核酸を含み得る。
一態様において、微生物生物内に含められている少なくとも１つの外来性核酸は、異種核酸である。別の態様において、本明細書中に開示されるような天然に存在しない微生物生物は、実質的に嫌気性の培養液中に存在する。
一態様において、１，６−ヘキサンジオールを生成するのに十分な量で発現される１，６−ヘキサンジオール（ＨＤＯ）経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸を含む天然に存在しない微生物生物が提供され、ここで、前記１，６−ヘキサンジオール経路は、表Ｅから選択される経路を含む：
Figure 0006680671
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ここで、２Ａ、２Ｂ、３Ｂ１、３Ｂ２、２Ｃ、３Ｇ１、３Ｃ２、３Ｃ３、２Ｊ、２Ｇ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ３、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１、４Ｆ４、３Ｎ、２Ｄ、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２、３Ｆ１、４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ５、３Ｃ１、４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｂ６、４Ｆ２、２Ｅ、３Ｇ２、３Ｇ５、２Ｉ、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、４Ｄ３、４Ｄ４および４Ｄ５は、選択されるＡＤＡ経路がＡＤＡ１〜ＡＤＡ８３のうちの１つであるときと同じであり、５Ｍ、５Ｌ、５Ｇおよび５Ｋは、上記と同じであり、５Ｏは、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ１−レダクターゼであり、５Ｒは、６−ヒドロキシヘキサン酸１−レダクターゼであり、５Ｓは、６−ヒドロキシヘキサナール１−レダクターゼである。
一態様において、特に、１，６−ヘキサンジオール合成経路が、ＨＤＯ３１〜５２から選択されるとき、２Ａ、２Ｂ、３Ｂ１、３Ｂ２、２Ｃ、３Ｇ１、３Ｃ２、３Ｃ３、２Ｊ、２Ｇ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ３、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１、４Ｆ４、３Ｎ、２Ｄ、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２、３Ｆ１、４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ５、３Ｃ１、４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｂ６、４Ｆ２、２Ｅ、３Ｇ２、３Ｇ５、２Ｉ、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、４Ｄ３、４Ｄ４および４Ｄ５は、選択されるＡＤＡ経路がＡＤＡ１〜ＡＤＡ２５のうちの１つであるときと同じであり、５Ｍ、５Ｌ、５Ｇ、５Ｋ、５Ｏ、５Ｒおよび５Ｓは、上で定義されたものである。
別の態様において、特に、１，６−ヘキサンジオール合成経路が、ＨＤＯ１〜３１、５３〜６９から選択されるとき、２Ａ、２Ｂ、３Ｂ１、３Ｂ２、２Ｃ、３Ｇ１、３Ｃ２、３Ｃ３、２Ｇ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ３、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１、４Ｆ４、３Ｎ、２Ｄ、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２、３Ｆ１、４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ５、３Ｃ１、４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｂ６、４Ｆ２、２Ｅ、３Ｇ２、３Ｇ５、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、４Ｄ３、４Ｄ４および４Ｄ５は、選択されるＡＤＡ経路がＡＤＡ２６〜ＡＤＡ８３のうちの１つであるときと同じであり、５Ｍ、５Ｌ、５Ｇ、５Ｋ、５Ｏ、５Ｒおよび５Ｓは、上で定義されたものである。
一態様において、本明細書中に記載されるような天然に存在しない微生物生物が提供され、ここで、その微生物生物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の外来性核酸を含み、その各々は、１，６−ヘキサンジオール経路酵素をコードする。例えば、その微生物生物は、上に記載されたようなＨＤＯ１〜ＨＤＯ１６９から選択される少なくとも１つの経路の各酵素をコードする外来性核酸を含み得る。
一態様において、微生物生物内に含められている少なくとも１つの外来性核酸は、異種核酸である。別の態様において、本明細書中に開示されるような天然に存在しない微生物生物は、実質的に嫌気性の培養液中に存在する。
一態様において、ＨＭＤＡを生成するのに十分な量で発現されるＨＭＤＡ経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸を含む天然に存在しない微生物生物が提供され、ここで、前記ＨＭＤＡ経路は、表Ｇから選択される経路を含む：
Figure 0006680671
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ここで、２Ａ、２Ｂ、３Ｂ１、３Ｂ２、２Ｃ、３Ｇ１、３Ｃ２、３Ｃ３、２Ｊ、２Ｇ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ３、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１、４Ｆ４、３Ｎ、２Ｄ、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２、３Ｆ１、４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ４、４Ａ５、３Ｃ１、４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｂ６、４Ｂ７、４Ｆ１、４Ｆ２、４Ｆ３、４Ｆ５、２Ｅ、３Ｇ２、３Ｇ５、２Ｉ、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、４Ｄ３、４Ｄ４、４Ｄ５、４Ｇ１、４Ｇ２、４Ｇ３、４Ｇ４および４Ｇ５は、選択されるＡＤＡ経路がＡＤＡ１〜ＡＤＡ１４１のうちの１つであるときと同じであり、５Ｊ、５Ｉ、５Ｇ、５Ｈ、５Ｋ、５Ｌ、５Ｍ、５Ｏおよび５Ｒは、上記と同じであり、５Ｔは、６−ヒドロキシヘキサナールアミノトランスフェラーゼまたは６−ヒドロキシヘキサナールデヒドロゲナーゼ（アミノ化）であり、５Ｕは、６−ヒドロキシヘキシルアミン１−デヒドロゲナーゼであり、５Ｖは、６−アミノヘキサン酸１−レダクターゼであり、５Ｗ ６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡ１−レダクターゼ、５Ｘは、６−アミノヘキサナールトランスアミナーゼまたは６−アミノヘキサナール１−デヒドロゲナーゼ（ｄｅｈｙｄｅｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（アミノ化）である。
一態様において、特に、ＨＭＤＡ合成経路が、ＨＭＤＡ１〜２から選択されるとき、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、３Ｂ１、３Ｇ１、３Ｍ、３Ｎ、２Ｆ、２Ｇおよび４Ｆ５は、選択されるＡＤＡ経路がＡＤＡ８４〜１４１のうちの１つであるときと同じであり、５Ｖ、５Ｘは、上記と同じである。
別の態様において、特に、ＨＭＤＡ合成経路が、ＨＭＤＡ３〜２１、４７〜７６、９９〜１４２から選択されるとき、２Ａ、２Ｂ、３Ｂ１、３Ｂ２、２Ｃ、３Ｇ１、３Ｃ２、３Ｃ３、２Ｇ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ３、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１、４Ｆ４、３Ｎ、２Ｄ、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２、３Ｆ１、４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ４、４Ａ５、３Ｃ１、４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｂ６、４Ｂ７、４Ｆ１、４Ｆ２、４Ｆ３、４Ｆ５、２Ｅ、３Ｇ２、３Ｇ５、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、４Ｄ３、４Ｄ４、４Ｄ５、４Ｇ１、４Ｇ２、４Ｇ３、４Ｇ４および４Ｇ５は、選択されるＡＤＡ経路がＡＤＡ２６〜ＡＤＡ８３のうちの１つであるときと同じであり、５Ｊ、５Ｉ、５Ｇ、５Ｈ、５Ｋ、５Ｌ、５Ｍ、５Ｏ、５Ｒ、５Ｔ、５Ｕ、５Ｖおよび５Ｘは、上記と同じである。
別の態様において、特に、ＨＭＤＡ合成経路が、ＨＭＤＡ２２〜４６、７７〜９８、１４３〜１６７から選択されるとき、２Ａ、２Ｂ、３Ｂ１、３Ｂ２、２Ｃ、３Ｇ１、３Ｃ２、３Ｃ３、２Ｇ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ３、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１、４Ｆ４、３Ｎ、２Ｄ、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２、３Ｆ１、４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ４、４Ａ５、３Ｃ１、４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｂ６、４Ｂ７、４Ｆ１、４Ｆ２、４Ｆ３、４Ｆ５、２Ｅ、３Ｇ２、３Ｇ５、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、２Ｊ、２Ｉ、４Ｄ３、４Ｄ４、４Ｄ５、４Ｇ１、４Ｇ２、４Ｇ３、４Ｇ４および４Ｇ５は、選択されるＡＤＡ経路がＡＤＡ１〜ＡＤＡ２５のうちの１つであるときと同じであり、５Ｊ、５Ｉ、５Ｇ、５Ｈ、５Ｋ、５Ｌ、５Ｍ、５Ｏ、５Ｒ、５Ｔ、５Ｕ、５Ｖおよび５Ｘは、上記と同じである。
別の態様において、特に、ＨＭＤＡ合成経路が、ＨＭＤＡ１〜１６７から選択されるとき、天然に存在しない微生物生物は、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼおよび／またはＮ−デアセチラーゼをさらに含む。
一態様において、本明細書中に記載されるような天然に存在しない微生物生物が提供され、ここで、その微生物生物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２（ｔｗｅｌｅｖｅ）、１３、１４、１５（ｆｉｆｔｅｅｍ）、１６または１７個の酵素外来性核酸を含み、その各々は、ＨＭＤＡ経路酵素をコードする。
例えば、その微生物生物は、上に記載されたようなＨＭＤＡ１〜ＨＭＤＡ１６７から選択される少なくとも１つの経路の各酵素をコードする外来性核酸を含み得る。
一態様において、微生物生物内に含められている少なくとも１つの外来性核酸は、異種核酸である。別の態様において、本明細書中に開示されるような天然に存在しない微生物生物は、実質的に嫌気性の培養液中に存在する。
別の態様において、天然に存在しない微生物生物は、３−オキソ−プロピオン酸経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸を含むＣ３アルデヒド経路をさらに含み、ここで、その３−オキソ−プロピオン酸経路は、ｉ）マロニル−ＣｏＡレダクターゼ、ｉｉ）グリセリン酸デヒドラターゼ（ｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｄｅｈｙｒａｔａｓｅ）および２／３−ホスホグリセリン酸ホスファターゼ、ｉｉｉ）オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ、ｉｖ）３−アミノプロピオン酸オキシドレダクターゼもしくはトランスアミナーゼ（脱アミノ化）、ならびに／またはｖ）３−ホスホグリセルアルデヒドホスファターゼ、グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびグリセロールデヒドラターゼから選択される。
別の態様において、天然に存在しない微生物生物は、３−ヒドロキシプロパナール経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸を含むＣ３アルデヒド経路をさらに含み、ここで、その３−ヒドロキシプロパナール経路は、
ａ．グリセロールデヒドラターゼ
ｂ．３−ホスホグリセルアルデヒドホスファターゼ、グリセルアルデヒド１−レダクターゼおよびグリセロールデヒドラターゼ
から選択される。
別の態様において、天然に存在しない微生物生物は、３−アミノ−プロパナール経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸を含むＣ３アルデヒド経路をさらに含み、ここで、その３−アミノ−プロパナール経路は、３−アミノプロピオニル−ＣｏＡレダクターゼを含む。
一態様において、１−ヘキサノールを生成するのに十分な量で発現される１−ヘキサノール経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸を含む天然に存在しない微生物生物が提供され、ここで、前記１−ヘキサノール経路は、２−オキソ−４−ヒドロキシ−ヘキサン酸アルドラーゼ、２−オキソ−４−ヒドロキシ−ヘキサン酸デヒドラターゼ、２−オキソ−３−ヘキサン酸（ｈｅｘｅｎｏａｔｅ）３−レダクターゼ、２オキソヘキサン酸−２−レダクターゼ、２−ヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは２−ヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼ、２−ヒドロキシヘキサノイル（ｈｄｙｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ）−ＣｏＡ２，３−デヒドラターゼ、ヘキセノイル−ＣｏＡ２−レダクターゼ、ヘキサノイル−ＣｏＡ１−レダクターゼおよびヘキサノールデヒドロゲナーゼを含む。
一態様において、本明細書中に記載されるような天然に存在しない微生物生物が提供され、ここで、その微生物生物は、２、３、４、５、６、７、８または９個の外来性核酸を含み、その各々は、１−ヘキサノール経路酵素をコードする。
例えば、その微生物生物は、上に記載されたような１−ヘキサノールから選択される少なくとも１つの経路の各酵素をコードする外来性核酸を含み得る。
一態様において、微生物生物内に含められている少なくとも１つの外来性核酸は、異種核酸である。別の態様において、本明細書中に開示されるような天然に存在しない微生物生物は、実質的に嫌気性の培養液中に存在する。
本発明は、アジピン酸経路を含む微生物生物として本明細書中で広く説明されるが、アジピン酸経路の中間体を生成するのに十分な量で発現されるアジピン酸経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸を含む天然に存在しない微生物生物をさらに提供することが理解される。例えば、本明細書中に開示されるように、アジピン酸経路は、図２〜４に例証され、表Ａに列挙されている。ゆえに、アジペートを生成するアジピン酸経路を含む微生物生物に加えて、本発明は、アジピン酸経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸を含む天然に存在しない微生物生物をさらに提供し、ここで、その微生物生物は、アジピン酸経路の中間体、例えば、６−ヒドロキシヘキサノエート（実施例ＶＩＩ）、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ、６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡ、６−アミノヘキサノエート（実施例Ｖ）、ε−カプロラクタム（実施例ＶＩ）、ε−カプロラクトン（実施例ＶＩＩＩ）、６−オキソヘキサノエート（ｏｘｏｈｅｘｎｏａｔｅ）および６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡを生成する。実施例に記載され、図面に例証されているような、本明細書中に開示される任意の経路が、所望であるとき、任意の経路の中間体または生成物を生成する天然に存在しない微生物生物を作製するために利用され得ることが理解される。本明細書中に開示されるように、中間体を生成するそのような微生物生物は、所望の生成物を生成する下流の経路酵素を発現する別の微生物生物と組み合わせて使用され得る。しかしながら、アジピン酸経路の中間体を生成する天然に存在しない微生物生物は、その中間体を所望の生成物として生成するために利用され得ることが理解される。本発明は、反応、その反応体もしくは生成物に広く照らして本明細書中に記載されるか、あるいは言及されている反応、反応体もしくは生成物に関連する酵素もしくはそれらを触媒する酵素またはそれらに関連するタンパク質をコードする１つ以上の核酸または遺伝子に具体的に照らして本明細書中に記載される。別段本明細書中に明確に述べられない限り、当業者は、反応に対する言及が、その反応の反応体および生成物に対する言及も構成していることを理解するだろう。同様に、別段本明細書中に明確に述べられない限り、反応体または生成物に対する言及は、その反応のことも言及しており、これらのいずれかに対する言及は、言及されている反応、反応体もしくは生成物を触媒する酵素またはそれらに関わるタンパク質をコードする遺伝子のことも言及している。同様に、代謝生化学、酵素学およびゲノミクスの周知の分野を所与として、遺伝子またはコード核酸に対する本明細書中の言及は、対応するコードされる酵素およびそれが触媒する反応、またはその反応に関連するタンパク質、ならびにその反応の反応体および生成物に対する言及も構成している。
上記生物および方法は、反応、その反応体もしくは生成物に広く照らして本明細書中に記載されるか、あるいは言及されている反応、反応体もしくは生成物に関連する酵素もしくはそれらを触媒する酵素またはそれらに関連するタンパク質をコードする１つ以上の核酸または遺伝子に具体的に照らして本明細書中に記載される。別段本明細書中に明確に述べられない限り、当業者は、反応に対する言及が、その反応の反応体および生成物に対する言及も構成していることを理解するだろう。同様に、別段本明細書中に明確に述べられない限り、反応体または生成物に対する言及は、その反応のことも言及しており、これらのいずれかに対する言及は、言及されている反応、反応体もしくは生成物を触媒する酵素またはそれらに関わるタンパク質をコードする遺伝子のことも言及している。同様に、代謝生化学、酵素学およびゲノミクスの周知の分野を所与として、遺伝子またはコード核酸に対する本明細書中の言及は、対応するコードされる酵素およびそれが触媒する反応、またはその反応に関連するタンパク質、ならびにその反応の反応体および生成物に対する言及も構成している。逆の場合も同様に、反応特異的酵素に対する言及は、それが触媒する対応する反応、ならびにその反応の反応体および生成物に対する言及も構成している。
宿主微生物生物は、本明細書中に記載される合成経路の前駆体を、天然に生成される分子として、または所望の前駆体の新規の生成を提供するかもしくはその宿主微生物生物によって天然に生成される前駆体の生成の増加を提供する操作された生成物として、生成するように選択され得る。宿主生物は、本明細書中に開示されるように、前駆体の生成が増加するように操作され得る。さらに、所望の前駆体を生成するように操作された微生物生物は、最終生成物、例えば、本明細書中に記載される１−ブタノール、酪酸、コハク酸、１，４−ブタンジオール、１−ペンタノール、ペンタン酸、グルタル酸、１，５−ペンタンジオール、１−ヘキサノール、ヘキサン酸、アジピン酸、１，６−ヘキサンジオール、６−ヒドロキシヘキサン酸、ε−カプロラクトン、６−アミノ−ヘキサン酸、ε−カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、７〜２５炭素長の直鎖脂肪酸および直鎖脂肪アルコール、６〜２４炭素長の直鎖アルカンおよび直鎖α−アルケン、セバシン酸ならびにドデカン二酸を合成するための宿主生物として使用され得る。
いくつかの態様において、以下が提供される：
態様１．アジピン酸経路酵素、６−アミノヘキサン酸経路酵素、ε−カプロラクタム経路酵素、６−ヒドロキシヘキサン酸経路酵素、カプロラクトン経路酵素、１，６−ヘキサンジオール経路酵素、ＨＭＤＡ経路酵素、１−ヘキサノール経路酵素または３−オキソ−プロピオン酸経路酵素の群からの酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸を含む天然に存在しない微生物生物。
態様２．２Ａから選択される酵素を少なくとも含む微生物生物であって、ここで、２Ａは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸アルドラーゼ、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸アルドラーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸アルドラーゼである、微生物生物。
態様３．２Ａ、および２Ｂ、３Ｂ１、３Ｂ２のうちの１つ以上から選択されるアジピン酸経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸を含む天然に存在しない微生物生物であって、ここで、２Ａは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸アルドラーゼ、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸アルドラーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸アルドラーゼであり、２Ｂは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸デヒドラターゼ、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドラターゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸デヒドラターゼであり、３Ｂ１は、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸２−レダクターゼ、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸２−レダクターゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸２−レダクターゼであり、３Ｂ２は、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸４−デヒドロゲナーゼ、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼである、天然に存在しない微生物生物。
態様４．２Ｃ、３Ｇ１、３Ｃ２、３Ｃ３のうちの１つ以上から選択されるアジピン酸経路酵素をさらに含み、ここで、２Ｃは、３，４−デヒドロ−２−オキソ−アジピン酸３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−３，４−デヒドロ−２−オキソヘキサン酸３−レダクターゼまたは６−アミノ−３，４−デヒドロ−２−オキソヘキサン酸３−レダクターゼであり、３Ｇ１は、２，４−ジヒドロキシアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２，４−ジヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼ、２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼまたは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｃ２は、２，４−ジヒドロキシアジピン酸４−デヒドロゲナーゼ、２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼまたは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼであり、３Ｃ３は、２，４−ジオキソアジピン酸２−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，４−ジオキソヘキサン酸２−レダクターゼまたは６−アミノ−２，４−ジオキソヘキサン酸２−レダクターゼである、態様１〜３のいずれか１つに記載の生物。
態様５．２Ｊ、２Ｇ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ３、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１、４Ｆ４、３Ｎ、２Ｄ、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２、３Ｆ１、４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ４、４Ａ５、３Ｃ１、４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｂ６、４Ｂ７、４Ｆ１、４Ｆ２、４Ｆ３、４Ｆ５、２Ｅ、３Ｇ２、３Ｇ５、２Ｉ、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、４Ｄ３、４Ｄ４、４Ｄ５、４Ｇ１、４Ｇ２、４Ｇ３、４Ｇ４および４Ｇ５のうちの１つ以上あるいは２つ以上あるいは３つ以上あるいは４つ以上あるいは５つ以上あるいは６つ以上あるいは７つ以上あるいは８つ以上あるいは９つ以上をさらに含み、ここで、２Ｊは、４，５−デヒドロ−２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、２Ｇは、２，３−デヒドロ−アジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、３Ｅ１は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、３Ｅ２は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピン酸２，３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸２，３−レダクターゼであり、４Ｅ３は、４，５−デヒドロアジピル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、４Ｅ４は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、３Ｋ２は、２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシアジピン酸２，３−レダクターゼ、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサン酸２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシヘキサン酸２，３−レダクターゼであり、３Ｋ１は、２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼ、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、４Ｆ４は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサン酸４，５−レダクターゼであり、３Ｎは、２−オキソアジピル−ＣｏＡ２−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−レダクターゼまたは６−アミノ−２−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−レダクターゼであり、２Ｄは、２−オキソアジピン酸２−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２オキソヘキサン酸２−レダクターゼまたは６−アミノ−２−オキソヘキサン酸２−レダクターゼであり、３Ｌ２は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピン酸４−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼであり、３Ｌ１は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピル−ＣｏＡ４−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼであり、３Ｆ２は、４−オキソアジピン酸４−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼまたは６−アミノ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼであり、３Ｆ１は、４−オキソアジピル−ＣｏＡ３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼまたは６−アミノ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼであり、４Ａ１は、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ２は、４，６−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ３は、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ４は、６−ヒドロキシヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ５は、４，６−ジヒドロキシヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼであり、３Ｃ１は、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドロゲナーゼ、２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドロゲナーゼまたは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ１は、４−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ４は、４−ヒドロキシ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ５は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ６は、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ７は、６−オキソヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｆ１は、アジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アジピル−ＣｏＡヒドロラーゼまたはアジピル−ＣｏＡリガーゼであり、４Ｆ２は、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼであり、４Ｆ３は、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼ、４Ｆ５ ６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼ、２Ｅは、２−ヒドロキシ−アジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは２−ヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼ、２，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは２，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼ、６−アミノ−２−ヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｇ２は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸−ＣｏＡリガーゼ、２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｇ５は、４−ヒドロキシアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは４−ヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼ、４，６−ジヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは４，６−ジヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、２Ｉは、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、３Ｍは、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）、２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）または６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）であり、３Ｈは、４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）、４，６−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）または６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）であり、２Ｆは、２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼ、２，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、３Ｄ３は、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼ、２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼまたは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、３Ｄ２は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸２−デヒドラターゼ、２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸２−デヒドラターゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサン酸２−デヒドラターゼであり、３Ｄ１は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼ、２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、４Ｄ３は、４−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、４Ｄ４は、４−ヒドロキシ−６オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、４Ｄ５ ４−ヒドロキシ−６オキソヘキサン酸４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）、４Ｇ１は、６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡトランスアミナーゼまたは６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（脱アミノ化）であり、４Ｇ２は、６−アミノヘキサン酸トランスアミナーゼまたは６−アミノヘキサン酸デヒドロゲナーゼ（脱アミノ化）であり、４Ｇ３は、６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡトランスアミナーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（脱アミノ化）であり、４Ｇ４は、６−アミノ−４−ヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡトランスアミナーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（脱アミノ化）であり、４Ｇ５は、６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサン酸トランスアミナーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ（脱アミノ化）である、態様３または４に記載の生物。
態様６．アジピン酸経路内の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の酵素をコードする１つ以上の外来性核酸を含む（ｃｏｍｐｒｓｉｎｇ）、天然に存在しない微生物生物。
態様７．アジペートを生成するための方法であって、その方法は、態様３〜６のいずれか１つに記載の天然に存在しない微生物生物を、グリセロールまたはＣ５もしくはＣ６糖あるいはそれらの組み合わせを含む培養液中で培養する工程、および必要に応じて、その生物またはその生物を含む培養液からその生物によって生成されたアジペートを分離する工程を含む、方法。
態様８．２Ａ、および２Ｂ、３Ｂ１、３Ｂ２のうちの１つ以上から選択される６−アミノヘキサン酸経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸を含む、天然に存在しない微生物生物であって、ここで、２Ａは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸アルドラーゼ、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸アルドラーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸アルドラーゼであり、２Ｂは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸デヒドラターゼ、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドラターゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸デヒドラターゼであり、３Ｂ１は、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸２−レダクターゼ、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸２−レダクターゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸２−レダクターゼであり、３Ｂ２は、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸４−デヒドロゲナーゼ、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼである、天然に存在しない微生物生物。
態様９．２Ｃ、３Ｇ１、３Ｃ２、３Ｃ３のうちの１つ以上をさらに含み、ここで、２Ｃは、３，４−デヒドロ−２−オキソ−アジピン酸３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−３，４−デヒドロ−２−オキソヘキサン酸３−レダクターゼまたは６−アミノ−３，４−デヒドロ−２−オキソヘキサン酸３−レダクターゼであり、３Ｇ１は、２，４−ジヒドロキシアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２，４−ジヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼ、２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼまたは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｃ２は、２，４−ジヒドロキシアジピン酸４−デヒドロゲナーゼ、２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼまたは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼであり、３Ｃ３は、２，４−ジオキソアジピン酸２−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，４−ジオキソヘキサン酸２−レダクターゼまたは６−アミノ−２，４−ジオキソヘキサン酸２−レダクターゼである、態様８に記載の生物。
態様１０．２Ｊ、２Ｇ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ３、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１、４Ｆ４、３Ｎ、２Ｄ、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２、３Ｆ１、４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ４、４Ａ５、３Ｃ１、４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｆ２、４Ｆ３、４Ｆ５、２Ｅ、３Ｇ２、３Ｇ５、２Ｉ、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、４Ｄ３、４Ｄ４、４Ｄ５、５Ｊ、５Ｉおよび５Ｇのうちの１つ以上あるいは２つ以上あるいは３つ以上あるいは４つ以上あるいは５つ以上あるいは６つ以上あるいは７つ以上あるいは８つ以上あるいは９つ以上あるいは１０個以上あるいは１１個以上をさらに含み、ここで、２Ｊは、４，５−デヒドロ−２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、２Ｇは、２，３−デヒドロ−アジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、３Ｅ１は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、３Ｅ２は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピン酸２，３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸２，３−レダクターゼであり、４Ｅ３は、４，５−デヒドロアジピル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、４Ｅ４は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、３Ｋ２は、２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシアジピン酸２，３−レダクターゼ、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサン酸２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシヘキサン酸２，３−レダクターゼであり、３Ｋ１は、２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼ、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、４Ｆ４は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサン酸４，５−レダクターゼであり、３Ｎは、２−オキソアジピル−ＣｏＡ２−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−レダクターゼまたは６−アミノ−２−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−レダクターゼであり、２Ｄは、２−オキソアジピン酸２−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２オキソヘキサン酸２−レダクターゼまたは６−アミノ−２−オキソヘキサン酸２−レダクターゼであり、３Ｌ２は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピン酸４−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼであり、３Ｌ１は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピル−ＣｏＡ４−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼであり、３Ｆ２は、４−オキソアジピン酸４−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼまたは６−アミノ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼであり、３Ｆ１は、４−オキソアジピル−ＣｏＡ３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼまたは６−アミノ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼであり、４Ａ１は、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ２は、４，６−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ３は、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ４は、６−ヒドロキシヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ５は、４，６−ジヒドロキシヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼであり、３Ｃ１は、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドロゲナーゼ、２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドロゲナーゼまたは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ１は、４−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ４は、４−ヒドロキシ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ５は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｆ２は、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼであり、４Ｆ３は、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼであり、４Ｆ５は、６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼであり、２Ｅは、２−ヒドロキシ−アジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは２−ヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼ、２，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは２，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼ、６−アミノ−２−ヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｇ２は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸−ＣｏＡリガーゼ、２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｇ５は、４−ヒドロキシアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは４−ヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼ、４，６−ジヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは４，６−ジヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、２Ｉは、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、３Ｍは、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）、２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）または６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）であり、３Ｈは、４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）、４，６−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）または６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）であり、２Ｆは、２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼ、２，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、３Ｄ３は、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼ、２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼまたは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、３Ｄ２は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸２−デヒドラターゼ、２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸２−デヒドラターゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサン酸２−デヒドラターゼであり、３Ｄ１は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼ、２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、４Ｄ３は、４−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、４Ｄ４は、４−ヒドロキシ−６オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、４Ｄ５ ４−ヒドロキシ−６オキソヘキサン酸４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）、５Ｊは、６−オキソヘキサン酸トランスアミナーゼ（アミノ化）または６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ（アミノ化）であり、５Ｉは、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡトランスアミナーゼ（アミノ化）または６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（アミノ化）であり、５Ｇは、アジピル−ＣｏＡ１−レダクターゼである、態様８または９に記載の生物。
態様１１．６−アミノヘキサン酸経路内の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の酵素をコードする１つ以上の外来性核酸を含む、天然に存在しない微生物生物。
態様１２．６−アミノヘキサノエートを生成するための方法であって、その方法は、態様８〜１１のいずれか１つに記載の天然に存在しない微生物生物を、グリセロールまたはＣ５もしくはＣ６糖あるいはそれらの組み合わせを含む培養液中で培養する工程、および必要に応じて、その生物またはその生物を含む培養液からその生物によって生成された６−アミノヘキサノエートを分離する工程を含む、方法。
態様１３．２Ａ、および２Ｂ、３Ｂ１、３Ｂ２のうちの１つ以上から選択されるカプロラクタム経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸を含む天然に存在しない微生物生物であって、ここで、２Ａは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸アルドラーゼ、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸アルドラーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸アルドラーゼであり、２Ｂは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸デヒドラターゼ、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドラターゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸デヒドラターゼであり、３Ｂ１は、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸２−レダクターゼ、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸２−レダクターゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸２−レダクターゼであり、３Ｂ２は、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸４−デヒドロゲナーゼ、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼである、天然に存在しない微生物生物。
態様１４．２Ｃ、３Ｇ１、３Ｃ２、３Ｃ３のうちの１つ以上から選択されるε−カプロラクタム経路酵素をさらに含み、ここで、２Ｃは、３，４−デヒドロ−２−オキソ−アジピン酸３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−３，４−デヒドロ−２−オキソヘキサン酸３−レダクターゼまたは６−アミノ−３，４−デヒドロ−２−オキソヘキサン酸３−レダクターゼであり、３Ｇ１は、２，４−ジヒドロキシアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２，４−ジヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼ、２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼまたは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｃ２は、２，４−ジヒドロキシアジピン酸４−デヒドロゲナーゼ、２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼまたは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼであり、３Ｃ３は、２，４−ジオキソアジピン酸２−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，４−ジオキソヘキサン酸２−レダクターゼまたは６−アミノ−２，４−ジオキソヘキサン酸２−レダクターゼである、態様１３に記載の生物。
態様１５．２Ｊ、２Ｇ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ３、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１、４Ｆ４、３Ｎ、２Ｄ、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２、３Ｆ１、４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ４、４Ａ５、３Ｃ１、４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｆ２、４Ｆ３、２Ｅ、３Ｇ２、３Ｇ５、２Ｉ、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、４Ｄ３、４Ｄ４、４Ｄ５、５Ｊ、５Ｉ、５Ｇ、５Ａ、５Ｃのうちの１つ以上あるいは２つ以上あるいは３つ以上あるいは４つ以上あるいは５つ以上あるいは６つ以上あるいは７つ以上あるいは８つ以上あるいは９つ以上あるいは１０個以上あるいは１１個以上あるいは１２個以上をさらに含み、ここで、２Ｊは、４，５−デヒドロ−２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、２Ｇは、２，３−デヒドロ−アジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、３Ｅ１は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、３Ｅ２は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピン酸２，３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸２，３−レダクターゼであり、４Ｅ３は、４，５−デヒドロアジピル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、４Ｅ４は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、３Ｋ２は、２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシアジピン酸２，３−レダクターゼ、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサン酸２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシヘキサン酸２，３−レダクターゼであり、３Ｋ１は、２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼ、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、４Ｆ４は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサン酸４，５−レダクターゼであり、３Ｎは、２−オキソアジピル−ＣｏＡ２−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−レダクターゼまたは６−アミノ−２−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−レダクターゼであり、２Ｄは、２−オキソアジピン酸２−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２オキソヘキサン酸２−レダクターゼまたは６−アミノ−２−オキソヘキサン酸２−レダクターゼであり、３Ｌ２は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピン酸４−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼであり、３Ｌ１は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピル−ＣｏＡ４−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼであり、３Ｆ２は、４−オキソアジピン酸４−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼまたは６−アミノ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼであり、３Ｆ１は、４−オキソアジピル−ＣｏＡ３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼまたは６−アミノ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼであり、４Ａ１は、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ２は、４，６−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ３は、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ４は、６−ヒドロキシヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ５は、４，６−ジヒドロキシヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼであり、３Ｃ１は、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドロゲナーゼ、２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドロゲナーゼまたは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ１は、４−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ４は、４−ヒドロキシ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ５は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｆ２は、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼであり、４Ｆ３は、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼ、６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼであり、２Ｅは、２−ヒドロキシ−アジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは２−ヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼ、２，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは２，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼ、６−アミノ−２−ヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｇ２は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸−ＣｏＡリガーゼ、２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｇ５は、４−ヒドロキシアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは４−ヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼ、４，６−ジヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは４，６−ジヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、２Ｉは、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、３Ｍは、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）、２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）または６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）であり、３Ｈは、４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）、４，６−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）または６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）であり、２Ｆは、２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼ、２，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、３Ｄ３は、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼ、２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼまたは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、３Ｄ２は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸２−デヒドラターゼ、２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸２−デヒドラターゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサン酸２−デヒドラターゼであり、３Ｄ１は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼ、２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、４Ｄ３は、４−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、４Ｄ４は、４−ヒドロキシ−６オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、４Ｄ５ ４−ヒドロキシ−６オキソヘキサン酸４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）、５Ｊは、６−オキソヘキサン酸トランスアミナーゼ（アミノ化）または６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ（アミノ化）、５Ｉは、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡトランスアミナーゼ（アミノ化）または６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（アミノ化）であり、５Ｇは、アジピル−ＣｏＡ１−レダクターゼであり、５Ｃは、６−アミノヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは６−アミノヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、５Ａは、自発的環化またはアミドヒドロラーゼである、態様１３または１４に記載の生物。
態様１６．各々がカプロラクタム経路酵素をコードする２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個の外来性核酸を含む、天然に存在しない微生物生物。
態様１７．カプロラクタムを生成するための方法であって、その方法は、態様１３〜１６のいずれか１つに記載の天然に存在しない微生物生物を、グリセロールまたはＣ５もしくはＣ６糖あるいはそれらの組み合わせを含む培養液中で培養する工程、および必要に応じて、その生物またはその生物を含む培養液からその生物によって生成されたカプロラクタムを分離する工程を含む、方法。
態様１８．２Ａ、および２Ｂ、３Ｂ１、３Ｂ２のうちの１つ以上から選択される６−ヒドロキシヘキサン酸経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸を含む天然に存在しない微生物生物であって、ここで、２Ａは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸アルドラーゼまたは４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸アルドラーゼであり、２Ｂは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸デヒドラターゼまたは４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドラターゼであり、３Ｂ１は、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸２−レダクターゼまたは４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸２−レダクターゼであり、３Ｂ２は、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸４−デヒドロゲナーゼまたは４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼである、天然に存在しない微生物生物。
態様１９．２Ｃ、３Ｇ１、３Ｃ２、３Ｃ３のうちの１つ以上から選択される６−ヒドロキシヘキサン酸経路酵素をさらに含み、ここで、２Ｃは、３，４−デヒドロ−２−オキソ−アジピン酸３−レダクターゼまたは６−ヒドロキシ−３，４−デヒドロ−２−オキソヘキサン酸３−レダクターゼであり、３Ｇ１は、２，４−ジヒドロキシアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２，４−ジヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼまたは２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｃ２は、２，４−ジヒドロキシアジピン酸４−デヒドロゲナーゼまたは２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼであり、３Ｃ３は、２，４−ジオキソアジピン酸２−レダクターゼまたは６−ヒドロキシ−２，４−ジオキソヘキサン酸２−レダクターゼである、態様１８に記載の生物。
態様２０．２Ｊ、２Ｇ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ３、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１、４Ｆ４、３Ｎ、２Ｄ、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２、３Ｆ１、４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ５、３Ｃ１、４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｆ２、４Ｆ３、２Ｅ、３Ｇ２、３Ｇ５、２Ｉ、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、４Ｄ３、４Ｄ４、４Ｄ５、５Ｇ、５Ｌおよび５Ｋのうちの１つ以上あるいは２つ以上あるいは３つ以上あるいは４つ以上あるいは５つ以上あるいは６つ以上あるいは７つ以上あるいは８つ以上あるいは９つ以上あるいは１０個以上あるいは１１個以上あるいは１２個以上をさらに含み、ここで、２Ｊは、４，５−デヒドロ−２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、２Ｇは、２，３−デヒドロ−アジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼまたは６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、３Ｅ１は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼまたは６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、３Ｅ２は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピン酸２，３−レダクターゼまたは６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸２，３−レダクターゼであり、４Ｅ３は、４，５−デヒドロアジピル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、４Ｅ４は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、３Ｋ２は、２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシアジピン酸２，３−レダクターゼまたは４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサン酸２，３−レダクターゼであり、３Ｋ１は、２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼまたは４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、４Ｆ４は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサン酸４，５−レダクターゼであり、３Ｎは、２−オキソアジピル−ＣｏＡ２−レダクターゼまたは６−ヒドロキシ−２−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−レダクターゼであり、２Ｄは、２−オキソアジピン酸２−レダクターゼまたは６−ヒドロキシ−２オキソヘキサン酸２−レダクターゼであり、３Ｌ２は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピン酸４−レダクターゼまたは６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼであり、３Ｌ１は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピル−ＣｏＡ４−レダクターゼまたは６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼであり、３Ｆ２は、４−オキソアジピン酸４−レダクターゼまたは６−ヒドロキシ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼであり、３Ｆ１は、４−オキソアジピル−ＣｏＡ３−レダクターゼまたは６−ヒドロキシ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼであり、４Ａ１は、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ２は、４，６−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ４は、６−ヒドロキシヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ５は、４，６−ジヒドロキシヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼであり、３Ｃ１は、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドロゲナーゼまたは２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ１は、４−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ４は、４−ヒドロキシ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ５は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｆ２は、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼであり、４Ｆ３は、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼであり、２Ｅは、２−ヒドロキシ−アジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは２−ヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼまたは２，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは２，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｇ２は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸−ＣｏＡリガーゼまたは２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｇ５は、４−ヒドロキシアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは４−ヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼまたは４，６−ジヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは４，６−ジヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、２Ｉは、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、３Ｍは、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）または２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）であり、３Ｈは、４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）または４，６−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）であり、２Ｆは、２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼまたは２，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、３Ｄ３は、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼまたは２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、３Ｄ２は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸２−デヒドラターゼまたは２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸２−デヒドラターゼであり、３Ｄ１は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼまたは２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、４Ｄ３は、４−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、４Ｄ４は、４−ヒドロキシ−６オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、４Ｄ５ ４−ヒドロキシ−６オキソヘキサン酸４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）、５Ｇは、アジピル−ＣｏＡ１−レダクターゼであり、５Ｌは、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−レダクターゼであり、５Ｋは、６−オキソヘキサン酸６−レダクターゼである、態様１８または１９に記載の生物。
態様２１．６−ヒドロキシヘキサン酸経路内の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の酵素をコードする１つ以上の外来性核酸を含む、天然に存在しない微生物生物。
態様２２．６−ヒドロキシヘキサノエートを生成するための方法であって、その方法は、態様１８〜２１のいずれか１つに記載の天然に存在しない微生物生物を、グリセロールまたはＣ５もしくはＣ６糖あるいはそれらの組み合わせを含む培養液中で培養する工程、および必要に応じて、その生物またはその生物を含む培養液からその生物によって生成された６−ヒドロキシヘキサノエートを分離する工程を含む、方法。
態様２３．２Ａ、および２Ｂ、３Ｂ１、３Ｂ２のうちの１つ以上から選択されるカプロラクトン経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸を含む、天然に存在しない微生物生物であって、ここで、２Ａは、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸アルドラーゼであり、２Ｂは、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドラターゼであり、３Ｂ１は、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸２−レダクターゼであり、３Ｂ２は、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼである、天然に存在しない微生物生物。
態様２４．２Ｃ、３Ｇ１、３Ｃ２、３Ｃ３のうちの１つ以上から選択されるカプロラクトン経路酵素をさらに含み、ここで、２Ｃは、６−ヒドロキシ−３，４−デヒドロ−２−オキソヘキサン酸３−レダクターゼであり、３Ｇ１は、２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｃ２は、２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼであり、３Ｃ３は、６−ヒドロキシ−２，４−ジオキソヘキサン酸２−レダクターゼである、態様２３に記載の生物。
態様２５．２Ｇ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１、４Ｆ４、３Ｎ、２Ｄ、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２、３Ｆ１、４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ５、３Ｃ１、４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｂ６、４Ｆ２、２Ｅ、３Ｇ２、３Ｇ５、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、４Ｄ４、４Ｄ５、５Ｌ、５Ｋ、５Ｍ、５Ｐおよび５Ｑのうちの１つ以上あるいは２つ以上あるいは３つ以上あるいは４つ以上あるいは５つ以上あるいは６つ以上あるいは７つ以上あるいは８つ以上あるいは９つ以上をさらに含み、ここで、２Ｇは、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、３Ｅ１は、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、３Ｅ２は、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸２，３−レダクターゼであり、４Ｅ４は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、３Ｋ２は、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサン酸２，３−レダクターゼであり、３Ｋ１は、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、４Ｆ４は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサン酸４，５−レダクターゼであり、３Ｎは、６−ヒドロキシ−２−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−レダクターゼであり、２Ｄは、６−ヒドロキシ−２オキソヘキサン酸２−レダクターゼであり、３Ｌ２は、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼであり、３Ｌ１は、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼであり、３Ｆ２は、６−ヒドロキシ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼであり、３Ｆ１は、６−ヒドロキシ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼであり、４Ａ１は、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ２は、４，６−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ４は、６−ヒドロキシヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ５は、４，６−ジヒドロキシヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼであり、３Ｃ１は、２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ１は、４−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ４は、４−ヒドロキシ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ５は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｆ２は、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼであり、４Ｆ３は、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼであり、２Ｅは、２，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは２，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｇ２は、２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｇ５は、４，６−ジヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは４，６−ジヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｍは、２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）であり、３Ｈは、４，６−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）であり、２Ｆは、２，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、３Ｄ３は、２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、３Ｄ２は、２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸２−デヒドラターゼであり、３Ｄ１は、２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、４Ｄ４は、４−ヒドロキシ−６オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、４Ｄ５ ４−ヒドロキシ−６オキソヘキサン酸４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）、５Ｌは、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−レダクターゼであり、５Ｋは、６−オキソヘキサン酸６−レダクターゼであり、５Ｍは、６−ヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは６−ヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、５Ｐは、自発的環化または６−ヒドロキシヘキサン酸シクラーゼであり、５Ｑは、自発的環化または６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡシクラーゼである、態様２３または２４に記載の生物。
態様２６．カプロラクトン経路内の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の酵素をコードする１つ以上の外来性核酸を含む、天然に存在しない微生物生物。
態様２７．カプロラクトンを生成するための方法であって、その方法は、態様２３〜２６のいずれか１つに記載の天然に存在しない微生物生物を、グリセロールまたはＣ５もしくはＣ６糖あるいはそれらの組み合わせを含む培養液中で培養する工程、および必要に応じて、その生物またはその生物を含む培養液からその生物によって生成されたカプロラクトンを分離する工程を含む、方法。
態様２８．２Ａ、および２Ｂ、３Ｂ１、３Ｂ２のうちの１つ以上から選択される１，６−ヘキサンジオール経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸を含む天然に存在しない微生物生物であって、ここで、２Ａは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸アルドラーゼまたは４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸アルドラーゼであり、２Ｂは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸デヒドラターゼまたは４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドラターゼであり、３Ｂ１は、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸２−レダクターゼまたは４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸２−レダクターゼであり、３Ｂ２は、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸４−デヒドロゲナーゼまたは４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼである、天然に存在しない微生物生物。
態様２９．２Ｃ、３Ｇ１、３Ｃ２、３Ｃ３のうちの１つ以上から選択される１，６−ヘキサンジオール経路酵素をさらに含み、ここで、２Ｃは、３，４−デヒドロ−２−オキソ−アジピン酸３−レダクターゼまたは６−ヒドロキシ−３，４−デヒドロ−２−オキソヘキサン酸３−レダクターゼであり、３Ｇ１は、２，４−ジヒドロキシアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２，４−ジヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼまたは２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｃ２は、２，４−ジヒドロキシアジピン酸４−デヒドロゲナーゼまたは２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼであり、３Ｃ３は、２，４−ジオキソアジピン酸２−レダクターゼまたは６−ヒドロキシ−２，４−ジオキソヘキサン酸２−レダクターゼである、態様２８に記載の生物。
態様３０．２Ｊ、２Ｇ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ３、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１、４Ｆ４、３Ｎ、２Ｄ、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２、３Ｆ１、４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ５、３Ｃ１、４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｂ６、４Ｆ２、２Ｅ、３Ｇ２、３Ｇ５、２Ｉ、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、４Ｄ３、４Ｄ４、４Ｄ５、５Ｌ、５Ｋ、５Ｍ、５Ｒ、５Ｓおよび５Ｏのうちの１つ以上あるいは２つ以上あるいは３つ以上あるいは４つ以上あるいは５つ以上あるいは６つ以上あるいは７つ以上あるいは８つ以上あるいは９つ以上をさらに含み、ここで、２Ｊは、４，５−デヒドロ−２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、２Ｇは、２，３−デヒドロ−アジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼまたは６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、３Ｅ１は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼまたは６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、３Ｅ２は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピン酸２，３−レダクターゼまたは６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸２，３−レダクターゼであり、４Ｅ３は、４，５−デヒドロアジピル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、４Ｅ４は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、３Ｋ２は、２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシアジピン酸２，３−レダクターゼまたは４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサン酸２，３−レダクターゼであり、３Ｋ１は、２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼまたは４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、４Ｆ４は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサン酸４，５−レダクターゼであり、３Ｎは、２−オキソアジピル−ＣｏＡ２−レダクターゼまたは６−ヒドロキシ−２−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−レダクターゼであり、２Ｄは、２−オキソアジピン酸２−レダクターゼまたは６−ヒドロキシ−２オキソヘキサン酸２−レダクターゼであり、３Ｌ２は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピン酸４−レダクターゼまたは６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼであり、３Ｌ１は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピル−ＣｏＡ４−レダクターゼまたは６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼであり、３Ｆ２は、４−オキソアジピン酸４−レダクターゼまたは６−ヒドロキシ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼであり、３Ｆ１は、４−オキソアジピル−ＣｏＡ３−レダクターゼまたは６−ヒドロキシ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼであり、４Ａ１は、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ２は、４，６−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ４は、６−ヒドロキシヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ５は、４，６−ジヒドロキシヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼであり、３Ｃ１は、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドロゲナーゼまたは２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ１は、４−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ４は、４−ヒドロキシ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ５は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ６は、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｆ２は、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼであり、２Ｅは、２−ヒドロキシ−アジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは２−ヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼ、２，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは２，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｇ２は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸−ＣｏＡリガーゼまたは２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｇ５は、４−ヒドロキシアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは４−ヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼまたは４，６−ジヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは４，６−ジヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、２Ｉは、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、３Ｍは、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）または２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）であり、３Ｈは、４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）または４，６−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）であり、２Ｆは、２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼまたは２，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、３Ｄ３は、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼまたは２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、３Ｄ２は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸２−デヒドラターゼまたは２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸２−デヒドラターゼであり、３Ｄ１は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼまたは２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、４Ｄ３は、４−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、４Ｄ４は、４−ヒドロキシ−６オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、４Ｄ５は、４−ヒドロキシ−６オキソヘキサン酸４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、５Ｌは、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−レダクターゼであり、５Ｋは、６−オキソヘキサン酸６−レダクターゼであり、５Ｍは、６−ヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは６−ヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、５Ｌは、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−レダクターゼであり、５Ｋは、６−オキソヘキサン酸６−レダクターゼであり、５Ｍは、６−ヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは６−ヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、５Ｏは、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ１−レダクターゼであり、５Ｒは、６−ヒドロキシヘキサン酸１−レダクターゼであり、５Ｓは、６−ヒドロキシヘキサナール１−レダクターゼである、態様２８または２９に記載の生物。
態様３１．１，６−ヘキサンジオール経路内の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の酵素をコードする１つ以上の外来性核酸を含む、天然に存在しない微生物生物。
態様３２．１，６−ヘキサンジオールを生成するための方法であって、その方法は、態様２８〜３１のいずれか１つに記載の天然に存在しない微生物生物を、グリセロールまたはＣ５もしくはＣ６糖あるいはそれらの組み合わせを含む培養液中で培養する工程、および必要に応じて、その生物またはその生物を含む培養液からその生物によって生成された１，６−ヘキサンジオールを分離する工程を含む、方法。
３３．２Ａ、および２Ｂ、３Ｂ１、３Ｂ２のうちの１つ以上から選択されるＨＭＤＡ経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸を含む、天然に存在しない微生物生物であって、ここで、２Ａは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸アルドラーゼ、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸アルドラーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸アルドラーゼであり、２Ｂは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸デヒドラターゼ、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドラターゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸デヒドラターゼであり、３Ｂ１は、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸２−レダクターゼ、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸２−レダクターゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸２−レダクターゼであり、３Ｂ２は、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸４−デヒドロゲナーゼ、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼである、天然に存在しない微生物生物。
態様３４．２Ｃ、３Ｇ１、３Ｃ２、３Ｃ３のうちの１つ以上から選択されるＨＭＤＡ経路酵素をさらに含み、ここで、２Ｃは、３，４−デヒドロ−２−オキソ−アジピン酸３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−３，４−デヒドロ−２−オキソヘキサン酸３−レダクターゼまたは６−アミノ−３，４−デヒドロ−２−オキソヘキサン酸３−レダクターゼであり、３Ｇ１は、２，４−ジヒドロキシアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２，４−ジヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼ、２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼまたは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｃ２は、２，４−ジヒドロキシアジピン酸４−デヒドロゲナーゼ、２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼまたは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサン酸４−デヒドロゲナーゼであり、３Ｃ３は、２，４−ジオキソアジピン酸２−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，４−ジオキソヘキサン酸２−レダクターゼまたは６−アミノ−２，４−ジオキソヘキサン酸２−レダクターゼである、態様３３に記載の生物。
態様３５．２Ｊ、２Ｇ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ３、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１、４Ｆ４、３Ｎ、２Ｄ、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２、３Ｆ１、４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ４、４Ａ５、３Ｃ１、４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｂ６、４Ｂ７、４Ｆ１、４Ｆ２、４Ｆ３、４Ｆ５、２Ｅ、３Ｇ２、３Ｇ５、２Ｉ、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、４Ｄ３、４Ｄ４、４Ｄ５、４Ｇ１、４Ｇ２、４Ｇ３、４Ｇ４、４Ｇ５、５Ｊ、５Ｉ、５Ｇ、５Ｈ、５Ｋ、５Ｌ、５Ｍ、５Ｏ、５Ｒ、５Ｔ、５Ｕ、５Ｖ、５Ｗおよび５Ｘのうちの１つ以上あるいは２つ以上あるいは３つ以上あるいは４つ以上あるいは５つ以上あるいは６つ以上あるいは７つ以上あるいは８つ以上あるいは９つ以上あるいは１０個以上あるいは１１個以上あるいは１２個以上をさらに含み、ここで、２Ｊは、４，５−デヒドロ−２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、２Ｇは、２，３−デヒドロ−アジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、３Ｅ１は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、３Ｅ２は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピン酸２，３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸２，３−レダクターゼであり、４Ｅ３は、４，５−デヒドロアジピル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、４Ｅ４は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４，５−レダクターゼであり、３Ｋ２は、２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシアジピン酸２，３−レダクターゼ、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサン酸２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシヘキサン酸２，３−レダクターゼであり、３Ｋ１は、２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼ、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼであり、４Ｆ４は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサン酸４，５−レダクターゼであり、３Ｎは、２−オキソアジピル−ＣｏＡ２−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−レダクターゼまたは６−アミノ−２−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−レダクターゼであり、２Ｄは、２−オキソアジピン酸２−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２オキソヘキサン酸２−レダクターゼまたは６−アミノ−２−オキソヘキサン酸２−レダクターゼであり、３Ｌ２は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピン酸４−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼであり、３Ｌ１は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピル−ＣｏＡ４−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼまたは６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼであり、３Ｆ２は、４−オキソアジピン酸４−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼまたは６−アミノ−４−オキソヘキサン酸４−レダクターゼであり、３Ｆ１は、４−オキソアジピル−ＣｏＡ３−レダクターゼ、６−ヒドロキシ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼまたは６−アミノ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−レダクターゼであり、４Ａ１は、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ２は、４，６−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ３は、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ４は、６−ヒドロキシヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼであり、４Ａ５は、４，６−ジヒドロキシヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼであり、３Ｃ１は、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドロゲナーゼ、２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドロゲナーゼまたは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ１は、４−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ４は、４−ヒドロキシ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｂ５は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼであり、４Ｆ２は、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼであり、４Ｆ３は、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼ、６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼであり、２Ｅは、２−ヒドロキシ−アジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは２−ヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼ、２，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは２，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼ、６−アミノ−２−ヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｇ２は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸−ＣｏＡリガーゼ、２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、３Ｇ５は、４−ヒドロキシアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは４−ヒドロキシアジピン酸−ＣｏＡリガーゼ、４，６−ジヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは４，６−ジヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼもしくは６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、２Ｉは、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、３Ｍは、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）、２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）または６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）であり、３Ｈは、４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）、４，６−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）または６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（２，３−デヒドロ形成）であり、２Ｆは、２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼ、２，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、３Ｄ３は、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼ、２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼまたは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、３Ｄ２は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸２−デヒドラターゼ、２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸２−デヒドラターゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサン酸２−デヒドラターゼであり、３Ｄ１は、２−ヒドロキシ−４オキソアジピル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼ、２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼであり、４Ｄ３は、４−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、４Ｄ４は、４−ヒドロキシ−６オキソヘキサノイル−ＣｏＡ４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）であり、４Ｄ５ ４−ヒドロキシ−６オキソヘキサン酸４−デヒドラターゼ（４，５−デヒドロ形成）、５Ｊは、６−オキソヘキサン酸トランスアミナーゼ（アミノ化）または６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ（アミノ化）であり、５Ｉは、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡトランスアミナーゼ（アミノ化）または６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（アミノ化）であり、５Ｇは、アジピル−ＣｏＡ１−レダクターゼであり、５Ｋは、６−オキソヘキサン酸６−レダクターゼであり、５Ｍは、６−ヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは６−ヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、５Ｏは、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ１−レダクターゼであり、５Ｒは、６−ヒドロキシヘキサン酸１−レダクターゼであり、５Ｔは、６−ヒドロキシヘキサナールアミノトランスフェラーゼまたは６−ヒドロキシヘキサナールデヒドロゲナーゼ（アミノ化）であり、５Ｕは、６−ヒドロキシヘキシルアミン１−デヒドロゲナーゼであり、５Ｖは、６−アミノヘキサン酸１−レダクターゼであり、５Ｗ ６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡ１−レダクターゼ、５Ｘは、６−アミノヘキサナールトランスアミナーゼまたは６−アミノヘキサナール１−デヒドロゲナーゼ（アミノ化）である、態様３３または３４に記載の生物。
態様３６．ＨＭＤＡ経路内の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個の酵素をコードする１つ以上の外来性核酸を含む、天然に存在しない微生物生物。
態様３７．ＨＭＤＡを生成するための方法であって、その方法は、態様３３〜３６に記載の天然に存在しない微生物生物を、ＨＭＤＡを産生する条件下において、ＨＭＤＡを産生するのに十分な時間にわたって培養する工程、および必要に応じて、その生物またはその生物を含む培養液からその生物によって生成されたＨＭＤＡを分離する工程を含む、方法。
態様３８．２−オキソ−４−ヒドロキシ−ヘキサン酸アルドラーゼ、２−オキソ−４−ヒドロキシ−ヘキサン酸デヒドラターゼ、２−オキソ−３−ヘキサン酸３−レダクターゼ、２オキソヘキサン酸−２−レダクターゼ、２−ヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは２−ヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼ、２−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−デヒドラターゼ、ヘキセノイル−ＣｏＡ２−レダクターゼ、ヘキサノイル−ＣｏＡ１−レダクターゼおよびヘキサノールデヒドロゲナーゼから選択される１−ヘキサノール経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸を含む、天然に存在しない微生物生物。
態様３９．１−ヘキサノール経路内の２、３、４、５、６、７、８または９個の酵素をコードする１つ以上の外来性核酸を含む、天然に存在しない微生物生物。
態様４０．１−ヘキサノールを生成するための方法であって、その方法は、態様３８または３９に記載の天然に存在しない微生物生物を、グリセロールまたはＣ５もしくはＣ６糖あるいはそれらの組み合わせを含む培養液中で培養する工程、および必要に応じて、その生物またはその生物を含む培養液からその生物によって生成された１−ヘキサノールを分離する工程を含む、方法。
態様４１．３−オキソ−プロピオン酸経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸をさらに含み、ここで、その３−オキソ−プロピオン酸経路は、
ａ）マロニル−ＣｏＡレダクターゼ
ｂ）グリセリン酸デヒドラターゼおよび２／３−ホスホグリセリン酸ホスファターゼ
ｃ）オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ
ｄ）３−アミノプロピオン酸オキシドレダクターゼまたはトランスアミナーゼ（脱アミノ化）
ｅ）３−ホスホグリセルアルデヒドホスファターゼ、グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびグリセロールデヒドラターゼ
から選択される、態様１〜６、８〜１１、１３〜１６、１８〜２１、２８〜３１および３３〜３６のいずれか１つに記載の生物。
態様４２．３−ヒドロキシプロパナール経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸をさらに含み、ここで、その３−ヒドロキシプロパナール経路は、
ａ．グリセロールデヒドラターゼ
ｂ．３−ホスホグリセルアルデヒドホスファターゼ、グリセルアルデヒド１−レダクターゼおよびグリセロールデヒドラターゼ
から選択される、態様１〜６、８〜１１、１３〜１６、１８〜２１、２３〜２６、２８〜３１および３３〜３６のいずれか１つに記載の生物。
態様４３．３−アミノ−プロパナール経路酵素をコードする少なくとも１つの外来性核酸をさらに含み、ここで、その３−アミノ−プロパナール経路は、３−アミノプロピオニル−ＣｏＡレダクターゼを含む、態様１〜６、８〜１１、１３〜１６および３３〜３６のいずれか１つに記載の生物。
本願全体を通して、様々な刊行物が参照される。これらの刊行物におけるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を含むこれらの刊行物の開示の全体が、本発明が属する分野の状況をより十分に説明するために、本願において参照により本明細書中に援用される。本発明は、上に提供された例に照らして説明されてきたが、本発明の精神から逸脱することなく、様々な改変が行われ得ることが理解されるべきである。本発明の様々な実施形態の活性に実質的に影響しない改変もまた、本明細書中に提供される本発明の定義の範囲内に含められることが理解される。したがって、以下の実施例は、本発明を例証するものであって限定するものではないと意図されている。
（一般的な合成方法）
本発明の１つの実施形態は、本明細書中に記載される（ｄｅｃｒｉｂｅｄ）ような式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩもしくはＩＶの化合物、または１−ブタノール、酪酸、コハク酸、１，４−ブタンジオール、１−ペンタノール、ペンタン酸、グルタル酸、１，５−ペンタンジオール、１−ヘキサノール、ヘキサン酸、アジピン酸、１，６−ヘキサンジオール、６−ヒドロキシヘキサン酸、ε−カプロラクトン、６−アミノ−ヘキサン酸、ε−カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、７〜２５炭素長の直鎖脂肪酸および直鎖脂肪アルコール、６〜２４炭素長の直鎖アルカンおよび直鎖α−アルケン、セバシン酸もしくはドデカン二酸を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）アルドール付加を介して、ＣＮアルデヒドおよびピルベートをＣＮ＋３β−ヒドロキシケトン中間体に変換する工程；およびｂ）酵素的工程または酵素的工程と化学的工程との組み合わせを介して、そのＣＮ＋３β−ヒドロキシケトン中間体を本明細書中に記載されるような式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩもしくはＩＶの化合物、または１−ブタノール、酪酸、コハク酸、１，４−ブタンジオール、１−ペンタノール、ペンタン酸、グルタル酸、１，５−ペンタンジオール、１−ヘキサノール、ヘキサン酸、アジピン酸、１，６−ヘキサンジオール、６−ヒドロキシヘキサン酸、ε−カプロラクトン、６−アミノ−ヘキサン酸、ε−カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、７〜２５炭素長の直鎖脂肪酸および直鎖脂肪アルコール、６〜２４炭素長の直鎖アルカンおよび直鎖α−アルケン、セバシン酸およびドデカン二酸に変換する工程を含むか、あるいはそれらの工程からなるか、またはなおもさらにそれらの工程から成り、ここで、Ｎは、Ｍ−３であり、Ｍは、調製されている化合物における炭素の数であり、Ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２である。本発明のすべての態様において、Ｃ３アルデヒドは、グリセルアルデヒドではない。
本発明の一態様は、ＣＮ＋３β−ヒドロキシケトン中間体を本明細書中に記載されるような式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩもしくはＩＶの化合物、または１−ブタノール、酪酸、コハク酸、１，４−ブタンジオール、１−ペンタノール、ペンタン酸、グルタル酸、１，５−ペンタンジオール、１−ヘキサノール、ヘキサン酸、アジピン酸、１，６−ヘキサンジオール、６−ヒドロキシヘキサン酸、ε−カプロラクトン、６−アミノ−ヘキサン酸、ε−カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、７〜２５炭素長の直鎖脂肪酸および直鎖脂肪アルコール、６〜２４炭素長の直鎖アルカンおよび直鎖α−アルケン、セバシン酸もしくはドデカン二酸に変換するための酵素的工程または酵素的工程と化学的工程との組み合わせが、エノイルまたはエノエートの還元、ケトンの還元、第一級アルコールの酸化、第二級アルコールの酸化、アルデヒドの酸化、アルデヒドの還元、脱水、脱炭酸、チオエステルの形成、チオエステルの加水分解、チオエステル交換反応、チオエステルの還元、ラクトン化、ラクタムの形成、ラクタムの加水分解、ラクトンの加水分解、カルボン酸の還元、アミノ化、アルデヒドの脱カルボニル、第一級アミンのアシル化、第一級アミンの脱アシル化またはそれらの組み合わせを含むことを提供し、ここで、Ｎは、Ｍ−３であり、Ｍは、調製されている化合物における炭素の数であり、Ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２である。
別の態様において、ＣＮアルデヒドは、Ｃ３アルデヒドである。いくつかの態様において、Ｃ３アルデヒドは、３−オキソ−プロピオン酸、３−ヒドロキシプロパナール、３−アミノプロパナールまたはプロパナールを含む群から選択されるから選択される。さらなる態様において、Ｃ３アルデヒドおよびピルベートは、グリセロール、Ｃ５糖、Ｃ６糖、ホスホ−グリセレート、他の炭素源、解糖経路の中間体、プロパノール経路の中間体またはそれらの組み合わせから得られる。さらなる態様において、Ｃ５糖は、キシロース、キシルロース、リブロース、アラビノース、リキソースおよびリボースを含み、Ｃ６糖は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、タロース、ガラクトース、フルクトース、プシコース、ソルボースおよび／またはタガトースを含む。別の態様において、他の炭素源は、微生物に対する炭素源として適した供給原料であり、ここで、その供給原料は、アミノ酸、脂質、トウモロコシ茎葉、ススキ、都市廃棄物、砂糖黍、サトウキビ、バガス、デンプン流、デキストロース流、ホルメート、メタノールまたはそれらの組み合わせを含む。
別の態様において、ＣＮアルデヒドまたはＣ３アルデヒドは、一連の酵素的工程を介して得られ、ここで、その酵素的工程は、リン酸エステルの加水分解、アルコールの酸化、ジオールの脱水、アルデヒドの酸化、アルデヒドの還元、チオエステルの還元、チオエステル交換反応、脱炭酸、カルボン酸の還元、アミノ化、第一級アミンのアシル化またはそれらの組み合わせを含む。
別の態様において、本明細書中に記載されるような式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの化合物を調製するための宿主として微生物が使用される。さらなる態様において、微生物は、本明細書中に記載されるような式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの化合物へのＣＮ＋３β−ヒドロキシケトン中間体の酵素的変換を触媒するのに必要な１、２、３、４、５、６、７、８つまたはすべての酵素をコードする遺伝子を含む。
別の態様において、１−ブタノール、酪酸、コハク酸、１，４−ブタンジオール、１−ペンタノール、ペンタン酸、グルタル酸、１，５−ペンタンジオール、１−ヘキサノール、ヘキサン酸、アジピン酸、１，６−ヘキサンジオール、６−ヒドロキシヘキサン酸、ε−カプロラクトン、６−アミノ−ヘキサン酸、ε−カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミン、７〜２５炭素長の直鎖脂肪酸および直鎖脂肪アルコール、６〜２４炭素長の直鎖アルカンおよび直鎖α−アルケン、セバシン酸またはドデカン二酸から選択される化合物を調製するための宿主として微生物が使用される。さらなる態様において、微生物は、上記化合物へのＣＮ＋３β−ヒドロキシケトン中間体の酵素的変換を触媒するのに必要な１、２、３、４、５、６、７、８つまたはすべての酵素をコードする遺伝子を含む。
さらなる態様において、微生物は、Ｃ５糖、Ｃ６糖、グリセロール、他の炭素源またはそれらの組み合わせをピルベートに変換する能力を有する。さらに追加の態様において、微生物は、Ｃ５糖の取り込み、Ｃ６／Ｃ５糖の同時の取り込み、Ｃ６糖／グリセロールの同時の取り込み、Ｃ５糖／グリセロールの同時の取り込みおよびそれらの組み合わせを含む糖の取り込みが増大するように操作されている。
いくつかの態様において、本明細書中に記載されるような式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの化合物の合成は、図１〜４に示されるスキームにおける経路を介して、またはこれらのスキームの中の中間体から先行する。
以下の実施例は、開示される主題に係る方法および結果を例証するために、下記に示される。これらの実施例は、本明細書中に開示される主題のすべての態様を包含すると意図されておらず、むしろ、代表的な方法および結果を例証すると意図されている。これらの実施例は、当業者に明らかである本明細書中に記載される主題の等価物およびバリエーションを排除すると意図されていない。実施例全体を通じて、酵素またはタンパク質の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤまたはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号として言及される）によって特定される。
（１．Ｃ３アルデヒドの合成）
３−オキソプロピオネートの合成は、図１に示されているようないくつかの異なる経路によって達成され得る。各経路は、当該分野で周知の代謝前駆体またはグリセロール（微生物生物が生育するための代謝産物または炭素源でもある）から開始する。
ホスホ−グリセレートからの３−オキソ−プロピオン酸の合成
３−オキソ−プロピオン酸合成のための１つの例示的な経路は、解糖経路の報酬期の中間体である３−ホスホ−グリセレートおよび２−ホスホ−グリセレートの加水分解によるグリセリン酸の合成（図１）に続く、グリセレートのジオール脱水を含み、それにより、３−オキソ−プロピオン酸が得られる。この変換反応を行うことができるホスファターゼ酵素は、Ｅ．Ｃ．３．１．３に属する。特に、３−ホスホ−グリセレート基質および／または２−ホスホ−グリセレート基質を用いてリン酸エステルの加水分解反応を触媒すると知られているホスファターゼ酵素のいくつかの例を下記に示す。下記のＥ．Ｃ．に属する他のホスファターゼ酵素（表１）またはこれらの配列の同種の酵素もまた、この工程を行うために使用することができる。さらに、グリセレートのリン酸化を触媒するキナーゼ酵素もまた、脱リン酸化のために使用することができる（逆方向で）。特に、Ｅ．Ｃ．２．７．１．３１およびＥ．Ｃ．２．７．１．１６５に属するグリセリン酸キナーゼ酵素（表２）は、グリセレートおよび種々のリン酸供与体を使用して、３−ホスホ−グリセレートおよび２−ホスホ−グリセレート生成物を形成すると知られている。３−ホスホ−グリセレートおよび２−ホスホ−グリセレートを脱リン酸化して、グリセリン酸を得るために使用され得るグリセリン酸キナーゼ酵素のいくつかの例を下記に示す。下記に列挙されるＥ．Ｃ．群に属する他のグリセリン酸キナーゼ酵素またはこれらの配列の同種の酵素もまた、この工程を行うために使用することができる。
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３−オキソ−プロピオン酸をもたらすグリセレートのジオール脱水は、Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８およびＥ．Ｃ．４．２．１．３０にそれぞれ属するジオールデヒドラターゼおよびグリセロールデヒドラターゼによって触媒され得る。グリセロールデヒドラターゼおよびジオールデヒドラターゼは、再活性化タンパク質の存在下において補酵素Ｂ１２依存的様式または補酵素Ｂ１２非依存的様式でその脱水を触媒し得る。補酵素Ｂ１２依存性デヒドラターゼは、３つのサブユニット：大サブユニットまたは「α」サブユニット、中サブユニットまたは「β」サブユニットおよび小サブユニットまたは「γ」サブユニットから構成される。これらのサブユニットは、α２β２γ２構造に集合して、アポ酵素を形成する。補酵素Ｂ１２（活性な補因子種）が、そのアポ酵素に結合して、触媒的に活性なホロ酵素を形成する。補酵素Ｂ１２は、それが、触媒が生じるラジカル機構に関わるとき、触媒活性に必要である。生化学的には、補酵素Ｂ１２依存性グリセロールデヒドラターゼと補酵素Ｂ１２依存性ジオールデヒドラターゼの両方が、グリセロールおよび他の基質による、機構に基づく自殺不活性化に供されると知られている（Ｄａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２２：５５３−５６６（１９９９）；Ｓｅｉｆｅｒｔ，ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：２３６９−２３７８（２００１））。不活性化は、デヒドラターゼ活性を復活させるデヒドラターゼ再活性化因子に依存することによって、克服され得る（Ｔｏｒａｙａ ａｎｄ Ｍｏｒｉ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３３７２（１９９９）；およびＴｏｂｉｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａ １８１：４１１０（１９９９））。デヒドラターゼの再活性化と補酵素Ｂ１２再生プロセスの両方が、ＡＴＰを必要とする。グリセロールデヒドラターゼ、ジオールデヒドラターゼおよび再活性化因子のいくつかの例を下記に示す。当業者は、シトロバクター・フレウンディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クロストリジウム・パステリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、Ｋ．ニューモニエまたはそれらの菌株のグリセロールデヒドラターゼ；サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）またはＫ．ニューモニエのジオールデヒドラターゼ；および下記に列挙されるＥ．Ｃ．群に属する他のデヒドラターゼ酵素またはこれらの配列の同種の酵素もまた、この工程を行うために使用できることを認識するだろう。これらの酵素の変異体（米国特許公報第８４４５６５９Ｂ２号および第７４１０７５４号）もまた、そのプロセスの効率を高めるために本明細書中で使用され得る。特に、補酵素Ｂ１２非依存性デヒドラターゼ（Ｒａｙｎａｕｄ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，５０１０−５０１５（２００３））が、ビタミンＢ１２の高コストに起因して、工業プロセスにとって好ましい。
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３−ホスホ−グリセルアルデヒドからの３−オキソ−プロピオン酸の合成
工程Ａ：グリセルアルデヒドは、解糖経路およびペントースリン酸経路の中間体ならびにまたグリセロールの発酵における中間体である（Ｃｌｏｍｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（１）：２０−２８（２０１３））３−ホスホ−グリセルアルデヒドの、ホスファターゼによって触媒される加水分解によって合成され得る（図１）。この変換反応を行うことができるホスファターゼ酵素は、Ｅ．Ｃ．３．１．３に属する。特に、それらの野生型で、または現代タンパク質工学アプローチを使用してそれらを操作した後に（Ｗｙｓｓ ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：１９０７−１９１３（２００２）；Ｍｕｌｌａｎｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１２：１７９−１８４（２００３））、３−ホスホ−グリセルアルデヒド基質を用いてリン酸エステルの加水分解反応を触媒するために使用され得るホスファターゼ酵素のいくつかの例が、上記の表１に示されている。表１に列挙されたＥ．Ｃ．群に属する他のホスファターゼ酵素またはこれらの配列の同種の酵素もまた、この工程を行うために使用することができる。さらに、グリセルアルデヒドのリン酸化を触媒し得るキナーゼ酵素もまた、脱リン酸化のために使用することができる（逆方向で）。それらの野生型で、または現代タンパク質工学アプローチを使用してそれらを操作した後に、３−ホスホ−グリセルアルデヒドを脱リン酸化するために使用され得るこれらの酵素のいくつかの例が、表２に示されている。表２に列挙されたＥ．Ｃ．群に属する他のキナーゼ酵素またはこれらの配列の同種の酵素もまた、この工程を行うために使用することができる。
工程Ｂ：グリセルアルデヒドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼを使用してグリセリン酸に酸化され得る。この酸化工程は、Ｅ．Ｃ１．２．１．３、Ｅ．Ｃ．１．２．１．４、Ｅ．Ｃ．１．２．１．５、Ｅ．Ｃ．１．２．１．８、Ｅ．Ｃ１．２．１．１０、Ｅ．Ｃ．１．２．１．２４、Ｅ．Ｃ．１．２．１．３６、Ｅ．Ｃ．１．２．３．１、Ｅ．Ｃ．１．２．７．５、Ｅ．Ｃ．１．２．９９．３、Ｅ．Ｃ１．２．９９．６およびＥ．Ｃ１．２．９９．７に属する任意のアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドオキシドレダクターゼを使用することによって、酵素的に行われ得る（Ｈｅｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２（１１）：１８９０−１９００（１９９３）；Ｓｏｐｈｏｓ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍｉｃｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ １４３：５−２２（２００３）；ＭｃＩｎｔｉｒｅ ＷＳ，Ｆａｓｅｂ Ｊｏｕｒｎａｌ ８（８）：５１３−５２１（１９９４）；Ｇａｒａｔｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ６５（７−８）：１０１９−１０４８（２００８））。典型的には、キノン依存性デヒドロゲナーゼ、フェリシトクロム依存性デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）依存性デヒドロゲナーゼ、ＦＭＮ依存性デヒドロゲナーゼ、ＦＡＤ依存性デヒドロゲナーゼが、グリセルアルデヒドをグリセレートに酸化するために使用され得る。
工程Ｃ：第３の工程は、上で論じたグリセリン酸から３−オキソ−プロピオン酸への変換を含む。
オキサロアセテートからの３−オキソ−プロピオン酸の合成
ＴＣＡ（トリカルボン酸）サイクルの中間体であるオキサロアセテートは、脱炭酸されることにより、３−オキソ−プロピオン酸をもたらし得る。Ｅ．Ｃ．群４．１．１．２に属するオキサロ酢酸デカルボキシラーゼまたはこれらの配列の同種の酵素もまた、この工程を行うために使用することができる。
β−アラニンからの３−オキソ−プロピオン酸の合成
プロパン酸代謝の一部として、β−アラニン（３−アミノ−プロピオン酸）は、Ｅ．Ｃ．２．６．１．１９（４−アミノブチレート−２−オキソグルタル酸トランスアミナーゼ）またはＥ．Ｃ．２．６．１．１８（β−アラニン−ピルビン酸トランスフェラーゼ）に属するトランスアミナーゼを使用して、３−オキソ−プロピオン酸に変換される。このクラスの例示的なタンパク質は、実施例ＩＶでさらに論じられる。
マロニル−ＣｏＡからの３−オキソ−プロピオン酸の合成
プロパン酸代謝の一部として、マロニル−ＣｏＡは、Ｅ．Ｃ．１．２．１．１８に属するオキシドレダクターゼ（マロニルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）を使用して、３−オキソ−プロピオン酸に変換される。そのようなタンパク質は、様々な古細菌（ａｒｃｈｅａｅ）において見出されており、生化学的に特徴づけられている［１−４］。
３−ホスホ−グリセルアルデヒドからの３−ヒドロキシ−プロパナールの合成（経路１）
工程Ａ：グリセルアルデヒドは、上に記載されたような３−ホスホ−グリセルアルデヒドの、ホスファターゼによって触媒される加水分解（図１）によって合成され得る。
工程Ｂ：グリセルアルデヒドは、アルコールデヒドロゲナーゼによってグリセロールに変換され得る。グリセロールからグリセルアルデヒドへの酸化（可逆的）を触媒し得る先に記載された第一級アルコールデヒドロゲナーゼは、還元型補因子、例えば、キノン（ＱＨ２）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ＦＡＤＨ２ＦＭＮＨ２および還元型フェリシトクロムを使用して、グリセルアルデヒドからグリセロールへの還元も触媒し得る。
工程Ｃ：３−ヒドロキシ−プロパナールは、上に記載されたようなジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼを使用して、グリセロールから合成され得る。
グリセロールからの３−ヒドロキシ−プロパナールの合成
３−ヒドロキシ−プロパナールは、上に記載されたようなジオール−デヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼ（図１）を使用して、グリセロールから合成され得る。
プロパノイル−ＣｏＡからのプロパナールの合成
プロパン酸代謝の一部として、プロパノイル−ＣｏＡは、ピルベートから開始する複数の経路から形成される。プロパノイル−ＣｏＡは、補酵素Ａ依存性（ｄｅｐｄｅｎｄｅｎｔ）アルデヒドデヒドロゲナーゼによってプロパナールに変換され得る。サルモネラ由来のｐｄｕＰ［５］ならびにＢｐｈＪをはじめとした、多くのそのようなＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼが知られている。
３−アミノ−プロパノイル−ＣｏＡからの３−アミノ−プロパナールの合成
３−アミノ−プロパノイル−ＣｏＡ（またはβ−アラニル−ＣｏＡ）は、プロピオン酸代謝の一部であり、補酵素Ａおよびパントテネートの生合成において使用される。３−アミノ−プロパノイル−ＣｏＡは、補酵素Ａ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼまたはオキシドレダクターゼを使用して、３−アミノ−プロパナールに変換され得る。３−アミノ−プロパノイル−ＣｏＡの自発的な環状ラクタム形成の傾向に起因して、必要であれば（ｉｆ ｎｅｃｃｅｓａｒｙ）、上で述べたような還元を行う前に、この環化（ｃｙｌｉｃｉｚａｔｉｏｎ）を回避するために、アミノ基をアミド（アセトアミド）としてマスクすることができる。アセチルまたはスクシニル官能基を使用することによる、前駆体である３−アミノ−プロパノイル−ＣｏＡの第一級アミンの保護は、そのような環化を妨げ得る。保護基は、Ｃ３アルデヒドである３−アミノプロパナールを使用した最終産物の合成が完了した後に除去され得る。これにより、Ｃ３アルデヒドとして３−アミノプロパナールを使用する任意の経路において、それぞれアセチラーゼおよびデアセチラーゼ（ｄｅａｃｅｔｌｙａｓｅｓ）を使用したそのような保護基の付加および除去を含み得る２つのさらなる工程が追加される。これらの変換反応を行う例示的なタンパク質については、実施例ＩＶを参照されたい。
（２．ホルムアルデヒドおよびＣ２アルデヒドの合成）
ホルミル−ＣｏＡからのホルムアルデヒドの合成（経路１および２）
ホルムアルデヒドは、補酵素Ａ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼまたはオキシドレダクターゼを使用して、ホルミル−ＣｏＡから合成され得る。ホルミル−ＣｏＡは、オキサリル−ＣｏＡ（グリオキシル酸代謝（ｍｅｔａｂｏｌｓｉｍｓ）およびジカルボン酸代謝の中間体）の脱炭酸によって合成され得る。
メタノールからのホルムアルデヒドの合成（経路３）
ホルムアルデヒドは、第一級アルコールデヒドロゲナーゼを使用することによるメタノールの酸化によっても合成され得る。
ホルメート還元によるホルムアルデヒドの合成（経路４）
ホルムアルデヒドは、カルボン酸レダクターゼを使用するホルメートの還元によっても合成され得る。Ｅ．Ｃ．１．２．９９．６に属するカルボン酸レダクターゼが、その還元を行うために使用され得る。表１７に列挙されるＥ．Ｃ．群に属する他のカルボン酸レダクターゼまたはこれらの配列の同種の酵素もまた、この工程を行うために使用することができる。
アセチル−ＣｏＡからのアセトアルデヒドの合成（経路１）
アセトアルデヒドは、補酵素Ａ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼまたはオキシドレダクターゼを使用して、中央代謝のユビキタス分子であるアセチル−ＣｏＡから合成される。
ピルベートからのアセトアルデヒドの合成（経路２）
アセトアルデヒドは、ピルビン酸デカルボキシラーゼを使用して、ピルベートからも合成され得る。Ｅ．Ｃ．４．１．１．１に属するデカルボキシラーゼ酵素が、この反応を行うために使用される。
グリオキシレートの合成（経路１）
グリオキシレートは、天然に遍在するＴＣＡサイクルのグリオキシル酸シャントの生成物である。グリオキシル酸サイクルは、生物が、唯一の炭素源としてアセチル−ＣｏＡのレベルで中央炭素代謝に入る基質を使用することを可能にする一連の補充反応（生合成のための代謝中間体を形成する反応）である。そのような基質としては、脂肪酸、アルコールおよびエステル（しばしば発酵の生成物）、ならびにろう、アルケンおよびメチル化された化合物が挙げられる。その経路は、脊椎動物には存在せず、植物ならびにある特定の細菌、真菌および無脊椎動物において見られる。グリオキシル酸シャントを可能にする２つのさらなる酵素は、イソクエン酸リアーゼおよびリンゴ酸シンターゼであり、これらは、イソシトレートをスクシネートに変換するか、またはグリオキシレートを介してマレートに変換する。
グリコアルデヒドまたはヒドロキシアセトアルデヒドの合成
グリコールアルデヒドは、アミノ酸であるグリシンを含む多くの前駆体から形成する。グリコールアルデヒドは、代わりの解糖経路におけるフルクトース１，６−二リン酸に対するケトラーゼの作用によって形成し得る。グリコールアルデヒドは、プリン異化、ビタミンＢ６代謝、葉酸生合成、Ｌ−アラビノース分解、Ｄ−アラビノース分解およびキシロース分解の一部としても形成される（ｂｉｏｃｙｃ．ｏｒｇから）。
（３．ピルベートの合成）
糖からピルベートへの変換
解糖を介した糖からピルベートへの変換が、非常によく知られている。解糖では、１モルのグルコースから、２モルのＡＴＰ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの形態の２モルの還元等価物および２モルのピルベートが生じる。
グリセロールからピルベートへの変換
グリセロールは、嫌気的と微好気的の両方で解糖中間体に変換され得る。嫌気的には、グリセロールは、ジヒドロキシアセトンに脱水素され、そのジヒドロキシアセトンは、リン酸化（ホスホエノールピルベートまたはＡＴＰを使用する）の後、解糖経路中間体であるジヒドロキシアセトンリン酸に変換される（Ｄｈａｒｍａｄｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４：８２１−８２９（２００６））。グリセロール変換のための呼吸経路は、グリセロールのリン酸化（ＡＴＰによるもの）の後の酸化（電子受容体としてのキノン）を含み、それにより、ジヒドロキシアセトンリン酸が得られ、それが、解糖を介してピルベートに変換され得る（Ｂｏｏｔｈ ＩＲ．Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ａｎｄ ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｏｘａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ ＦＣ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｗｅｂ ｅｄｉｔｉｏｎ）．２００５，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ；Ｄｕｒｎｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１０３（１）：１４８−１６１（２００９））。
（４．ピルベートおよびＣ−３アルデヒド（３−オキソプロピオネート、３−ヒドロキシプロパナールおよび３−アミノプロパナール）からのアジピン酸（ＡＤＡ）の合成）
Ｃ６アシル−ＣｏＡ分子、例えば、アジピル−ＣｏＡ、６−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡおよび６−アミノ−ヘキサノイル−ＣｏＡを、ピルベートおよびそれぞれＣ３アルデヒドである３−オキソ−プロピオン酸（Ｒ＝ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）、３−ヒドロキシプロパナール（Ｒ＝ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）および３−アミノ−プロパナール（Ｒ＝ＣＨ２ＮＨ２）から合成するためのいくつかの例示的な経路が、図２および３に示されている。図３のこれらのアシル−ＣｏＡ化合物および中間体（一般式化合物２５、２８〜３０）、具体的には：３−オキソ−プロピオン酸がアルデヒドであるとき、４−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ３３および４−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−アジピル−ＣｏＡ４４；アルデヒドが３−アミノ−プロパナールであるとき、４−ヒドロキシ−６−アミノ−ヘキサノイル−ＣｏＡ５０、４−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−６−アミノ−ヘキサノイル−ＣｏＡ５１および４−ヒドロキシ−６−アミノ−ヘキサノエート５２；アルデヒドが３−ヒドロキシ−プロパノールであるとき、４，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ３１、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡ４２および４，６−ジヒドロキシ−ヘキサノエート５５が、図４に示されている様々な工程を介して、アジピン酸に変換される。３−アミノ−プロパナールの自発的な環状イミン形成の傾向に起因して、アジペートへの変換の前に、この環化を回避するために、アミノ基をアミド（アセトアミド）としてマスクすることができる。あるいは、３−アミノ−プロパナールを合成するための前駆体である３−アミノプロピオニル−ＣｏＡに対してアセチル化を行うこともできる。さらに、下記に記載され、図２〜４に示されている、Ｃ６位にアミノ基およびＣ１位にチオエステル（例えば、ＣｏＡ）を含むＣ６誘導体もまた、自発的な環化を起こして、２−オキソ基およびＣ６−アミン官能基を有するＣ６誘導体に対して対応するε−ラクタムまたはイミンを形成し得る。アセチルまたはスクシニル官能基を使用することによる第一級アミンの保護は、そのような環化を妨げ得る。保護基は、合成が終わった後に除去され得る。これにより、Ｃ３アルデヒドとして３−アミノプロパナールを含む任意の経路において、それぞれアセチラーゼおよびデアセチラーゼを使用したそのような保護基の付加および除去を含み得る２つのさらなる工程が追加される。好ましくは、そのアセチル化は、Ｃ３−アルデヒドである３−アミノプロパナールに対して行われることにより、Ｃ３アルデヒドとして使用される３−アミド−プロパナールをもたらし、本明細書中で述べられる任意のアミノ基転移／脱アミノ化工程の前に、Ｃ６中間体に対して脱アセチル化が行われる。Ｃ３アルデヒドが、３−アミノプロパナールとして言及されているが、３−アミドプロパナールもまたＣ３アルデヒドとして使用されることは当然のことである。
さらに、いくつかのＣ６ＡＤＡ経路中間体、特に、４−ヒドロキシ酸（例えば、図２、１１）および４−ヒドロキシアシル−ＣｏＡエステル（例えば、図３、２９、３０）が、ラクトン化を起こして、対応する１，４−ラクトンを形成し得る。酸性および中性のｐＨが、ラクトンの形成にとって好ましい。それらの１，４−ラクトンは、本明細書中で述べられる任意のＡＤＡ経路に対してラクトナーゼを使用する環状エステルの加水分解（可逆的反応）によって、それらの対応する直鎖ヒドロキシ酸に変換され得る。ラクトン加水分解反応を触媒すると知られているラクトナーゼが、この反応を行うために使用され得る。エステラーゼ、リパーゼ（ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５５５２４）およびペプチダーゼ（ＷＯ／２００９／１４２４８９）もまた、ラクトン化を行うと知られている。
ピルベートおよび３−オキソ−プロピオン酸からのＡＤＡの合成
ピルベートおよび３−オキソ−プロピオン酸（図２および図３においてＲ＝ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）から開始するアジピン酸を合成するための様々な方法および経路が、下記に記載される。
ＡＤＡ方法１。この方法では、ＡＤＡは、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸アルドラーゼ、４−ヒドロキシ−２−オキソアジピン酸デヒドラターゼ、３，４−デヒドロ−２−オキソ−アジピン酸レダクターゼ、２−オキソ−アジピン酸レダクターゼ、２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはシンテターゼ、２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ、２，３−デヒドロ−アジピル−ＣｏＡレダクターゼ、アジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼおよびアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたはアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼの存在下において、ピルベートおよび３−オキソ−プロピオン酸から調製される。いくつかの態様において、上記方法は、ピルベート、３−オキソ−プロピオン酸、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸アルドラーゼ、４−ヒドロキシ−２−オキソアジピン酸デヒドラターゼ、３，４−デヒドロ−２−オキソ−アジピン酸レダクターゼ、２−オキソ−アジピン酸レダクターゼ、２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはシンテターゼ、２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ、２，３−デヒドロ−アジピル−ＣｏＡレダクターゼ、アジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼおよびアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたはアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼを、ＡＤＡを調製する条件下の水溶液中で混和する工程を含む。いくつかの態様において、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸アルドラーゼ、４−ヒドロキシ−２−オキソアジピン酸デヒドラターゼ、３，４−デヒドロ−２−オキソ−アジピン酸レダクターゼ、２−オキソ−アジピン酸レダクターゼ、２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはシンテターゼ、２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ、２，３−デヒドロ−アジピル−ＣｏＡレダクターゼ、アジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼおよびアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたはアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼは、それらの酵素をインサイチュで産生する１種以上の微生物、例えば、Ｅ．コリ、酵母および／またはクロストリジア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）によって産生される。いくつかの態様において、上記方法は、ピルベートおよび３−オキソ−プロピオン酸を、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸アルドラーゼ、４−ヒドロキシ−２−オキソアジピン酸デヒドラターゼ、３，４−デヒドロ−２−オキソ−アジピン酸レダクターゼ、２−オキソ−アジピン酸レダクターゼ、２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはシンテターゼ、２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ、２，３−デヒドロ−アジピル−ＣｏＡレダクターゼ、アジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼおよびアジピル−ＣｏＡシンテターゼまたはアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼをインサイチュで産生する１種以上の微生物と混和する工程を含む。いくつかの態様において、上記条件は、０．０１〜１０００というピルベートと３−オキソ−プロピオン酸との比を含む。いくつかの態様において、酵素の比は、０．０１〜１０００である。いくつかの態様において、上記条件は、１０〜７０Ｃ、好ましくは、２０Ｃ〜３０Ｃ、３０Ｃ〜４０Ｃおよび４０Ｃ〜５０Ｃの範囲の温度を含む。いくつかの態様において、上記条件は、嫌気条件、実質的に嫌気性の条件または好気条件を含む。
図２は、方法１の例証の経路工程２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、４Ｆ１を示しており、ここで、第１の工程（工程２Ａ）は、アルドラーゼによって触媒される、３−オキソ−プロピオン酸へのピルベートのアルドール付加であり、それにより、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸が得られ、それが脱水される（工程２Ｂ）ことにより、３，４−デヒドロ２−オキソアジピン酸が得られ、それが還元される（工程２Ｃ）ことにより、２−オキソ−アジピン酸が得られる。２−オキソ−アジピン酸は、２−ヒドロキシアジピン酸に還元された（工程２Ｄ）後、アシル−ＣｏＡシンターゼまたはリガーゼまたはトランスフェラーゼによって、補酵素Ａ分子が結合される（工程２Ｅ）ことにより、２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡが得られ、それが脱水される（工程２Ｆ）ことにより、２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡが得られる。これが、エノイル−ＣｏＡレダクターゼによって還元される（工程２Ｇ）ことにより、アジピル−ＣｏＡを得ることができ、そしてそれが、アジピン酸に加水分解され得るかまたはエステル交換され得る（４Ｆ１，図４）。
ＡＤＡ経路２（工程２Ａ、３Ｂ１、３Ｇ１、３Ｍ、３Ｎ、２Ｆ、２Ｇ、４Ｆ１）。代替経路は、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸（経路１の中間体）の２−ケト基の還元を含み、それにより、２，４−ジヒドロキシアジピン酸が得られた後、ＣｏＡ分子（工程３Ｇ１）が結合されることにより、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡが得られる。４−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼによる２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡの脱水（工程３Ｍ）によって、２−オキソアジピル−ＣｏＡが得られ、それが２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡに還元され（工程３Ｎ）、そしてそれが、上で述べたようにアジピン酸に変換される。あるいは、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡの脱水によって、５，６−デヒドロ２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ（工程２Ｉ）が得られ、それが、エン酸レダクターゼ（ＡＤＡ経路２７）によって２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡに還元される（工程２Ｊ）。
ＡＤＡ経路３（工程２Ａ、３Ｂ１、３Ｇ１、３Ｄ３、３Ｋ１、３Ｈ、２Ｇ、４Ｆ１）。図３に示されている別の経路は、２−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼによる２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ（経路２の中間体）の脱水（工程３Ｄ３）を含み、それにより、２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡが得られ、それが、エノイル−ＣｏＡレダクターゼによって還元され（工程３Ｋ１）、それにより、４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡが得られる。４−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼによる４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡの脱水（工程３Ｈ）によって、２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡが得られ、それが、前で述べたようにアジピン酸に還元される。
ＡＤＡ経路４（工程２Ａ、３Ｂ１、３Ｇ１、３Ｄ３、３Ｋ１、４Ｄ３、４Ｅ３、４Ｆ１）。図３および４に示されている別の経路は、デヒドラターゼによる４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡの変換脱水（工程４Ｄ３）を含み、それにより、５，６−デヒドロアジピル−ＣｏＡが得られ、それが、エン酸レダクターゼ（４Ｅ３）によって還元されることにより、アジピル−ＣｏＡを得ることができ、それが、前で述べたようにアジピン酸に還元される。
ＡＤＡ経路５（工程２Ａ、３Ｂ１、３Ｇ１、３Ｃ１、３Ｄ１、３Ｅ１、３Ｆ１、３Ｈ、２Ｇ、４Ｆ１）および６（工程２Ａ、３Ｂ１、３Ｇ１、３Ｃ１、３Ｄ１、３Ｅ１、３Ｆ１、４Ｄ３、４Ｅ３、４Ｆ１）。図３に示されているような別の経路は、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ（経路２の中間体）の酸化（工程３Ｃ１）を含み、それにより、２−ヒドロキシ４−オキソアジピル−ＣｏＡが得られ、それが脱水される（工程３Ｄ１）ことにより、２，３−デヒドロ４−オキソ−アジピル−ＣｏＡが得られる。エノイルレダクターゼによるその還元（工程３Ｅ１）によって、４−オキソ−アジピル−ＣｏＡが得られ、それがアルコールデヒドロゲナーゼによってさらに還元されることにより、４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡが得られ、それが、経路３および４において述べたような２つの経路によってアジピン酸に変換される。
ＡＤＡ経路７および８（工程２Ａ、３Ｂ１、３Ｃ２、３Ｄ２、３Ｅ２、３Ｆ２、３Ｇ５および３Ｈ、２Ｇ、４Ｆ１または４Ｄ３、４Ｅ３、４Ｆ１）別の経路（図３）は、２，４−ジヒドロキシアジペート（経路２の中間体）の酸化（工程３Ｃ２）を含み、それにより、２−ヒドロキシ４−オキソアジペートが得られ、それが脱水される（工程３Ｄ２）ことにより、２，３−デヒドロ４−オキソ−アジペートが得られる。その還元（工程３Ｅ２）によって、４−オキソ−アジペートが得られ、それが、アルコールデヒドロゲナーゼによってさらに還元される（工程３Ｆ２）ことにより、４−ヒドロキシアジペートが得られ、補酵素Ａ分子を結合することによって４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡに変換される（３Ｇ５）。４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡからアジペートへの変換は、前に記載された。
ＡＤＡ経路９〜１０（工程２Ａ、３Ｂ１、３Ｃ２、３Ｄ２、３Ｌ２、３Ｋ２、３Ｇ５および３Ｈ、２Ｇ、４Ｆ１または４Ｄ３、４Ｅ３、４Ｆ１）別の経路（図３）は、アルコールデヒドロゲナーゼによる２，３−デヒドロ４−オキソ−アジペート（経路７〜８の中間体）の還元（工程３Ｌ２）を含み、それにより、２，３−デヒドロ４−ヒドロキシ−アジペートが得られ、それが還元される（工程３Ｋ２）ことにより、４−ヒドロキシ−アジピン酸が得られ、それが、上に記載されたようにアジペート（ａｄｉｐｉａｔｅ）に変換される。ＡＤＡ経路１１〜１２（工程２Ａ、３Ｂ１、３Ｃ２、３Ｇ２、３Ｄ１、３Ｅ１、３Ｆ１および３Ｈ、２Ｇ、４Ｆ１または４Ｄ３、４Ｅ３、４Ｆ１）：別の経路は、アシル−ＣｏＡシンターゼまたはリガーゼまたはトランスフェラーゼによる２−ヒドロキシ−４−オキソ−アジピン酸（経路７における中間体でもある）への補酵素Ａ分子の結合（工程３Ｇ２）を含み、それにより、２−ヒドロキシ−４−オキソ−アジピル−ＣｏＡが得られ、それが脱水される（ｄｅｈｙｒａｔｅｄ）（工程３Ｄ１）ことにより、２，３−デヒドロ−４オキソアジピル−ＣｏＡが得られた後、還元される（工程３Ｅ１）ことにより、４−オキソアジピル−ＣｏＡが得られ、それがアルコールデヒドロゲナーゼによって還元される（工程３Ｆ１）ことにより、４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡが得られ、それが上で述べた２つの方法によってアジペートに変換され得る。
ＡＤＡ経路１３〜１８：別の経路セット（図３、下記のリストを参照のこと）は、アルコールデヒドロゲナーゼによる４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸（経路１の中間体）の酸化（工程３Ｂ２）を含み、それにより、２，４−ジオキソアジペートが得られ、それが２−ケト位で選択的に還元される（工程３Ｃ３）ことにより、２−ヒドロキシ−４−オキソ−アジピン酸が得られ、それが経路７〜１０に記載されたようにアジペートに変換される。あるいは、アシル−ＣｏＡシンターゼまたはリガーゼまたはトランスフェラーゼによる２−ヒドロキシ−４−オキソ−アジピン酸（経路９における中間体でもある）への補酵素Ａ分子の結合（工程３Ｇ２）によって、２−ヒドロキシ−４−オキソ−アジピル−ＣｏＡが得られ、それが経路ＡＤＡ１１〜１２によってアジペートに変換される。
ＡＤＡ経路２０〜２４：別の経路セットは、２，３−デヒドロ４−ケト−アジピル−ＣｏＡ（２４）（経路５、１１、１７の中間体）から２，３−デヒドロ４−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡ（Ｂ）への還元（工程３Ｌ１，図３）を含み、それが、前に記載されたように、２つの経路（ＡＤＡ経路３および４）（工程３Ｈ、２Ｇ、４Ｆ１または４Ｄ３、４Ｅ３、４Ｆ１）によってアジピン酸に変換される。
ＡＤＡ経路２５：別の経路は、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ（１９，経路２の中間体）の脱水（工程２Ｉ）を含み、それにより、４，５−デヒドロ−２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡが得られ、それがエン酸レダクターゼによって還元される（工程２Ｊ）ことにより、２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡが得られ、それが、ＡＤＡ経路１において上で述べたようにアジペートに変換され得る。
ピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナール（図２および図３におけるＲ＝ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）からのＡＤＡの合成
ＡＤＡ経路２６〜２８：図２に示されているように、第１の工程（工程２Ａ）は、アルドラーゼによって触媒される３−ヒドロキシプロパナールへのピルベートのアルドール付加であり、それにより、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸が得られ、それが脱水される（工程２Ｂ）ことにより、２，３−デヒドロ−６−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸が得られ、それが還元される（工程２Ｃ）ことにより、６−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸が得られる。６−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸が、２，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸に還元された（工程２Ｄ）後、アシル−ＣｏＡシンターゼまたはリガーゼまたはトランスフェラーゼによって補酵素Ａ分子が結合される（工程２Ｅ）ことにより、２，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡが得られ、それが脱水される（工程２Ｆ）ことにより、２，３−デヒドロ−６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡが得られる。これが、エノイル−ＣｏＡレダクターゼによって還元される（工程２Ｇ）ことにより、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡを得ることができる。６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡが、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡに酸化され（工程４Ａ３，図４）、それが２つの経路（ｐａｗｔｈｗａｙｓ）によってアジピン酸に変換される。６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡが、アルデヒドデヒドロゲナーゼによって酸化されることにより、アジピル−ＣｏＡが得られ（工程４Ｂ６，図４）、それが上で述べたようにアジピン酸に変換される（工程４Ｆ１，図４）。あるいは（ＡＤＡ経路２７）、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡが、チオエステラーゼまたはＣｏＡ−トランスフェラーゼによって６−オキソ−ヘキサン酸に加水分解されるかまたはエステル交換され（工程４Ｆ２，図４）、続いて、アルデヒドデヒドロゲナーゼによってアジペートに酸化される（工程４Ｂ７，図４）。あるいは（ＡＤＡ経路２８）、６−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡが、チオエステラーゼまたはＣｏＡ−トランスフェラーゼによって６−ヒドロキシ−ヘキサン酸に加水分解されるまたはエステル交換され（工程４Ｆ３，図４）、続いて、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼによってアジペートに酸化される（工程４Ａ４／４Ｂ７，図４）。
ＡＤＡ経路２９〜３１：図２に示されているように、これらの経路は、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸（経路２６の中間体）の２−ケト基の還元を含み、それにより、２，４，６−トリヒドロキシル−ヘキサン酸が得られた（工程３Ｂ１）後、ＣｏＡ分子の結合（工程３Ｇ１）およびそれに続く４−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼによる脱水（工程３Ｍ）により、６−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡが得られ、それが２，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡに還元され（工程３Ｎ）、それが、３つの経路（ＡＤＡ経路２６〜２８）によって上で述べたようにアジピン酸に変換される。
図３〜４に示されているようなピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナールから開始するアジピン酸の合成に対して可能性のある経路が多数あることに起因して、アルデヒドが、３−ヒドロキシ−プロパノールであるとき、中間体である４，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ３１の合成およびそれのアジペートへの変換、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡ４２の合成およびそれのアジペートへの変換および４，６−ジヒドロキシ−ヘキサノエート５５の合成およびそれのアジペートへの変換のためのモジュラー経路に経路を分解する。
４，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（３１，図４または３０，図３）を合成するための経路（上記の表におけるＰ１〜Ｐ１１）：図３に示されている１つの経路は、２−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼによる２，４，６−トリヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（１９）の脱水（工程３Ｄ３）を含み、それにより、２，３−デヒドロ−４，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡが得られ、それがエノイル−ＣｏＡレダクターゼによって還元される（工程３Ｋ１）ことにより、４，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（３０）が得られる。別の経路は、２，４，６−トリヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（１９）の酸化（工程３Ｃ１）を含み、それにより、２，６−ヒドロキシ４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ（２２）が得られ、それが脱水される（工程３Ｄ１）ことにより、２，３−デヒドロ−４オキソ−６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ（２４）が得られる。エノイルレダクターゼによるその還元（工程３Ｅ１）によって、４オキソ−６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ（２７）が得られ、それが、アルコールデヒドロゲナーゼによってさらに還元される（工程３Ｆ１）ことにより、４，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡが得られる。別の経路（Ｐ３）（図３）は、２，４，６−トリヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（１９）の酸化（工程３Ｃ２）を含み、それにより、２，６−ジヒドロキシ４−オキソヘキサン酸が得られ、それが脱水される（工程３Ｄ２）ことにより、２，３−デヒドロ４−オキソ−６−ヒドロキシヘキサン酸（２３）が得られる。その還元（工程３Ｅ２）により、４−オキソ−６−ヒドロキシヘキサン酸（２６）が得られ、それがアルコールデヒドロゲナーゼによってさらに還元される（工程３Ｆ２）ことにより、４，６−ジヒドロキシヘキサン酸（２９）が得られ、補酵素Ａ分子を結合することによって、それが変換されて４，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡが得られる（工程３Ｇ５）。別の経路（Ｐ４）（図３）は、アルコールデヒドロゲナーゼによる２，３−デヒドロ４−オキソ−６−ヒドロキシヘキサン酸（２３）の還元（工程３Ｌ２）を含み、それにより、２，３−デヒドロ４，６−ジヒドロキシヘキサン酸（２８）が得られ、それが還元される（工程３Ｋ２）ことにより、４，６−ジヒドロキシヘキサン酸（２９）が得られ、補酵素Ａ分子を結合することによって、それが変換されて４，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（２９）が得られる（工程３Ｇ５）。別の経路セット（図３，Ｐ５〜Ｐ６）は、アルコールデヒドロゲナーゼによる４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸（１１）の酸化（工程３Ｂ２）を含み、それにより、６−ヒドロキシ−２，４−ジオキソ−ヘキサン酸（２０）が得られ、それが２−ケト位で選択的に還元される（工程３Ｃ３）ことにより、２，６−ジヒドロキシ−４−オキソ−ヘキサン酸（２１）が得られ、それが上に記載されたように（Ｐ３〜Ｐ４）、４，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（３０）に変換される。あるいは（経路Ｐ７、Ｐ８）、アシル−ＣｏＡリガーゼまたはトランスフェラーゼによって２，６−ヒドロキシ−４オキソ−ヘキサン酸（２１）に補酵素Ａ分子を結合する（工程３Ｇ２）ことにより、２，６−ヒドロキシ−４オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（２２）が得られ、それが、経路Ｐ３〜Ｐ４において上に記載されたように４，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（３０）に変換される。別の経路セット（Ｐ９〜Ｐ１１）は、２，３−デヒドロ−４−ケト−６−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（２４）（経路Ｐ２、Ｐ７およびＰ８の中間体）から２，３−デヒドロ−４，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（２５）への還元（工程３Ｌ１）を含み、２５が、上に記載されたように４，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（３０）に変換される。
４，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡからアジペートを合成するための経路（Ｐ１２〜Ｐ１５）：アルコールデヒドロゲナーゼによる４，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡの酸化（工程４Ａ２，図４）によって、４−ヒドロキシ６−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡが得られ、それが４−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡに酸化され（工程４Ｂ４，図４）、それが、先に記載したように（工程４Ｄ３、４Ｅ３および４Ｆ１，図４）アジペートに変換される。（工程４Ｄ４）による４−ヒドロキシ６−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡの脱水によって、４，５−デヒドロ６−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡが得られる。これが、エンレダクターゼによって還元される（工程４Ｅ４）ことにより、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡを得ることができ、それがアジピル−ＣｏＡに酸化され（工程Ｂ６）、アジペートに変換される（工程４Ｆ１）。あるいは、４，５−デヒドロ−６−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡは、アルデヒドデヒドロゲナーゼによっても酸化される（工程４Ｂ５）ことにより、４，５−デヒドロ−アジピル−ＣｏＡが得られ、それが、先に記載したように（工程４Ｅ３および４Ｆ１）アジペートに変換される。あるいは、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡは、６−オキソヘキサノエートに変換された（工程４Ｆ２）後、アジペートに酸化される（工程４Ｂ７）。本明細書中に記載されるような４，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ３１の合成およびそれのアジペートへの変換のための経路を組み合わせることにより、ＡＤＡ経路３２〜７５がもたらされる。
Figure 0006680671
４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（４２，図４または２５，図３）の合成およびそれのアジペートへの変換のためのＡＤＡ経路（７６〜７９）：４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡは、経路Ｐ１、Ｐ９〜Ｐ１１における中間体である。図４に示されているように、第一級アルコールデヒドロゲナーゼによる４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡの酸化（工程４Ａ１）によって、４−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−６−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡが得られ、それがデヒドロゲナーゼによって酸化されることにより、４−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−アジピル−ＣｏＡが得られ（工程４Ｂ１）、それが、ＡＤＡ経路４に記載されたようにアジペートに変換される。
４，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸（２９，図３または５５，図４）の合成およびそれのアジペートへの変換のためのＡＤＡ経路（８０〜８３）：４，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸は、経路Ｐ３〜Ｐ６における中間体である。アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒される４，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸の酸化によって、４−ヒドロキシ−６−オキソ−ヘキサン酸が得られ（工程４Ａ５）、それが脱水されることにより、２，３−デヒドロ−６−オキソ−ヘキサン酸（工程４Ｄ５）が得られ、それが還元される（工程４Ｆ４）ことにより、６−オキソ−ヘキサノエート（ｈｅｘｎｏａｔｅ）が得られ、それが前に記載されたようにアジペート（ａｄｉｐｄａｔｅ）に酸化される（工程４Ｂ７）。
ピルベートおよび３−アミノ−プロパナール（図２および図３におけるＲ＝ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）からのＡＤＡの合成
ＡＤＡ経路８４〜８６：図２に示されているように、第１の工程（工程２Ａ）は、アルドラーゼによって触媒される３−アミノ−プロパナールへのピルベートのアルドール付加であり、それにより、６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸が得られ、それが脱水される（工程２Ｂ）ことにより、２，３−デヒドロ−６−アミノ−２−オキソ−ヘキサン酸が得られ、それが還元される（工程２Ｃ）ことにより、６−アミノ−２−オキソ−ヘキサン酸が得られる。６−アミノ−２−オキソ−ヘキサン酸が、６−アミノ−２−ヒドロキシ−ヘキサン酸に還元された（工程２Ｄ）後、アシル−ＣｏＡリガーゼまたはトランスフェラーゼによって補酵素Ａ分子が結合される（工程２Ｅ）ことにより、６−アミノ−２−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡが得られ、それが脱水される（工程２Ｆ）ことにより、２，３−デヒドロ−６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡが得られる。これが、エノイル−ＣｏＡレダクターゼによって還元される（工程２Ｇ）ことにより、６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡを得ることができる。６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡが、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡに変換され（工程４Ｇ１，図４）、それが、上で述べたように２つの経路（工程４Ｂ６、４Ｆ１または４Ｆ２、４Ｂ７）によってアジピン酸に変換される。あるいは、６−アミノ−ヘキサノイル−ＣｏＡが、チオエステラーゼまたはＣｏＡ−トランスフェラーゼによって６−アミノ−ヘキサン酸に加水分解されるかまたはエステル交換され（工程４Ｆ５，図４）、それがその後、トランスアミナーゼ／アミノ酸オキシダーゼまたはデヒドロゲナーゼによって６−オキソヘキサン酸に変換され、それがアルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼによってアジペートに変換される（工程４Ａ４／４Ｂ７，図４）。
ＡＤＡ経路８７〜８９：図２に示されているように、いくつかの経路が、６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸（工程２Ａの生成物）の２−ケト基の還元（工程３Ｂ１）を含み、それにより、２，４−ジヒドロキシル−６−アミノヘキサン酸が得られた後、ＣｏＡ分子を結合し（工程３Ｇ１）、続いて、４−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼによって脱水する（工程３Ｍ）ことにより、６−アミノ−２−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡが得られ、それが３つの経路（ＡＤＡ経路８４〜８６）によって上で述べたようにアジピン酸に変換される。
図３〜４に示されているようなピルベートおよび３−アミノ−プロパナールから開始するアジピン酸の合成に対して可能性のある経路が多数あることに起因して、経路を、中間体である６−アミノ−４−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ５０の合成およびそれのアジペートへの変換、６−アミノ−４−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡ５１の合成およびそれのアジペートへの変換ならびに６−アミノ−４−ヒドロキシ−ヘキサノエート５２の合成およびそれのアジペートへの変換のためのモジュラー経路、ならびにこれらの中間体をアジピン酸に変換するための経路に分解する。ピルベートおよび３−アミノ−プロパナールから６−アミノ−４−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ５０を合成するための経路（Ｐ１〜Ｐ１１）は、ピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナールから４，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡを合成するための合成するための経路（Ｐ１〜Ｐ１１）と同一である。関与する変換反応の一般的なセットは、同じであるが、しかしながら、各変換反応に対する基質は、Ｃ６位において異なる（アルデヒド基に対してアミノ基）。
６−アミノ−４−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（５０，図４または３０，図３）を合成するための経路（上記の表におけるＰ１〜Ｐ１１）：図３に示されている１つの経路は、２−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（工程３Ｄ３）による６−アミノ−２，４−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（１９）の脱水（工程３Ｄ３）を含み、それにより、６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（２５）が得られ、それがエノイル−ＣｏＡレダクターゼによって還元される（工程３Ｋ１）ことにより、６−アミノ−４−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（３０）が得られる。別の経路は、６−アミノ−２，４−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（１９）の酸化（工程３Ｃ１）を含み、それにより、６−アミノ−２−ヒドロキシ４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ（２２）が得られ、それが脱水される（工程３Ｄ１）ことにより、６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（２４）が得られる。エノイルレダクターゼによるその還元（工程３Ｅ１）によって、６−アミノ−４−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（２７）が得られ、それがアルコールデヒドロゲナーゼによってさらに還元される（工程３Ｆ１）ことにより、６−アミノ−４−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（３０）が得られる。別の経路（Ｐ３）（図３）は、６−アミノ−２，４−ジヒドロキシ−ヘキサン酸（１８）の酸化（工程３Ｃ２）を含み、それにより、６−アミノ−２−ヒドロキシ４−オキソ−ヘキサン酸（２１）が得られ得られ、それが脱水される（工程３Ｄ２）ことにより、６−アミノ−２，３−デヒドロ４−オキソ−ヘキサン酸（２３）が得られる。その還元（工程３Ｅ２）によって、６−アミノ−４−オキソ−ヘキサン酸（２６）が得られ、それがアルコールデヒドロゲナーゼによってさらに還元される（工程３Ｆ２）ことにより、６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサン酸（２９）が得られ、それが補酵素Ａ分子の結合によって変換されることにより、６−アミノ−４−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（３０）が得られる（工程３Ｇ５）。別の経路（Ｐ４）（図３）は、アルコールデヒドロゲナーゼによる６−アミノ−２，３−デヒドロ４−オキソヘキサン酸（２３）の還元（工程３Ｌ２）を含み、それにより、６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシ−ヘキサン酸（２８）が得られ、それが還元される（工程３Ｋ２）ことにより、６−アミノ−４−ヒドロキシ−ヘキサン酸（２９）が得られ、それが補酵素Ａ分子の結合によって６−アミノ−４−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（３０）に変換される（工程３Ｇ５）。別の経路セット（図３，Ｐ５〜Ｐ６）は、アルコールデヒドロゲナーゼによる６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸（１１）の酸化（工程３Ｂ２）を含み、それにより、６−アミノ−２，４−ジオキソ−ヘキサン酸（２０）が得られ、それが２−ケト位において選択的に還元される（工程３Ｃ３）ことにより、６−アミノ−２−ヒドロキシ−４−オキソ−ヘキサン酸（２１）が得られ、それが上に記載されたように（Ｐ３〜Ｐ４）６−アミノ−４−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（３０）に変換される。あるいは（経路Ｐ７、Ｐ８）、アシル−ＣｏＡリガーゼまたはトランスフェラーゼによる６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソ−ヘキサン酸（２１）への補酵素Ａ分子の結合（工程３Ｇ２）によって、６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（２２）が得られ、それが経路Ｐ３〜Ｐ４において上に記載されたように６−アミノ−４−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（３０）に変換される。別の経路セット（Ｐ９〜Ｐ１１）は、６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（２４）（経路Ｐ２、Ｐ７およびＰ８の中間体）から６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（２５）への還元（工程３Ｌ１）を含み、それが上に記載されたように６−アミノ−４−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（３０）に変換される。
６−アミノ−４−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡからアジペートを合成するための経路（Ｐ１６〜１９）：トランスアミナーゼまたはアミノ酸オキシダーゼまたはデヒドロゲナーゼによる６−アミノ−４−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡのアミノ基転移（工程４Ｇ３，図４）によって、４−ヒドロキシ６−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（３２）が得られ、それが先に記載されたように（Ｐ１２〜Ｐ１５）アジペートに変換される。本明細書中に記載されるような６−アミノ−４−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ５０の合成およびそれのアジペートへの変換のための経路の組み合わせは、ＡＤＡ経路９０〜１３３をもたらす。
６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（５１，図４または２５，図３）の合成およびそれのアジペートへの変換のためのＡＤＡ経路（１３４〜１３７）：６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡは、経路Ｐ１、Ｐ９〜Ｐ１１における中間体である。トランスアミナーゼまたはアミノ酸オキシダーゼまたはデヒドロゲナーゼによる６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ５１のアミノ基転移（工程４Ｇ４，図４）によって、２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシ６−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡ４３が得られ、それが前に記載されたようにアジペートに変換される。
６−アミノ−４−ヒドロキシ−ヘキサン酸（２９，図３または５２，図４）の合成およびそれのアジペートへの変換のためのＡＤＡ経路（１３９〜１４１）：６−アミノ−４−ヒドロキシ−ヘキサン酸は、経路Ｐ３〜Ｐ６における中間体である。６−アミノ−４−ヒドロキシ−ヘキサン酸のアミノ基転移によって、４−ヒドロキシ−６−オキソ−ヘキサン酸（工程４Ｇ５）が得られ、それが前に記載されたようにアジペートに変換される。
図２〜４に示されるすべての基質生成物変換反応（経路工程）は、（基質の特異性に関係なく）当該酵素が触媒する化学反応（それらの酵素番号）に基づいて下記の表において分類される酵素によって触媒される。そのような各群に属するいくつかの遺伝子（酵素をコードする遺伝子）が下記に記載され、それらの遺伝子は、ピルベートおよびＣ３アルデヒドからアジペートを合成するために、図２〜４に示されているような所望の基質に対する変換反応を行うために特異的に使用され得る。
Figure 0006680671
Ｅ．Ｃ．４．１．２／３−アルドラーゼ
対応する４−ヒドロキシ−２−ケト酸（４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸および６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸）へのピルベートおよびＣ３アルデヒド（３−オキソ−プロピオン酸、３−ヒドロキシプロパナールおよび３−アミノプロパナール）のアルドール付加（工程２Ａ，図２〜３）は、クラスＩ／ＩＩピルビン酸依存性アルドラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．１．２−およびＥ．Ｃ．４．１．３−）によって触媒される。クラスＩピルビン酸アルドラーゼは、ピルベート化合物とともにシッフ塩基中間体を形成してエナミン求核剤を生成する保存されたリジン残基を活性部位に提示する。クラスＩＩアルドラーゼでは、二価の金属イオンが、ルイス酸錯体形成を介してピルベート基質のエノール化を促進する。次いで、求核エナミンまたはエノレートが、アクセプター基質のカルボニル炭素を攻撃して、新しいＣ−Ｃ結合を形成する。アルドール付加反応は、通常、可逆的であり、その平衡はアルドール切断反応を好むが、しかしながら、その平衡は、生成物を下流の酵素と共役させることによって、合成方向にシフトし得る。このアルドール付加反応は、クラスＩおよび／またはクラスＩＩのピルビン酸アルドラーゼによって触媒され得ることが企図される。所望の基質に構造的に類似している、ピルベートおよび４−オキソ−ブチレートへの４−ヒドロキシ−２−ケトヘプタン−１，７−ジオエートのアルドール切断を触媒する芳香族メタ切断経路に関わるピルビン酸アルドラーゼが、興味深い。具体的には、アルドラーゼＨｐａＩおよびＢｐｈＩ［６］は、グリセルアルデヒド／プロパナール／グリコアルデヒド（３−オキソプロパノールおよび３−オキソプロパナールに構造的に類似）およびコハク酸セミアルデヒド（３−オキソプロパノールに類似）を含む一連の異なるＣ２、Ｃ３、Ｃ４およびＣ５アルデヒドへのピルベートのアルドール付加を行うと示されている。他の有望なピルビン酸アルドラーゼとしては、ＤｍｐＧ［７］、ＨｓａＦ［８］、ＴＴＨＢ４２［９］および２−デヒドロ−３−デオキシ−グルカル酸アルドラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．１．２．５１、ＫＤＧアルドラーゼ）、特に、一連のアルデヒドを基質として使用するスルフォロブス由来のもの［１０］が挙げられる。ＢｐｈＩは、ピルビン酸エノラートがアルデヒドのｒｅ面を攻撃することだけを可能にし、それにより、そのプロセスにおいて（４Ｓ）−アルドール産物を形成するので、非常に立体選択的である。対照的に、ＨｐａＩのより大きい基質結合部位は、その酵素が、代替の立体配座でアルデヒドに結合するのを可能にし、ラセミ生成物の形成をもたらす。そのような立体選択性またはそれを欠くことが、その経路における下流の酵素によるプロセシングにとって重要であり得る。あるいは、タンパク質工学を用いることにより、アルドラーゼ［１１］の基質特異性および／または立体特異性を変更することができる。この変換反応を行う興味深い他のアルドラーゼとしては、グリオキシレート［１２］（マロン酸セミアルデヒドに類似）を使用する４−ヒドロキシ−２−オキソ−グルタル酸アルドラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．１．３．１６）、２−デヒドロ−３−デオキシ−ホスホガラクトン酸アルドラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．１．２．２１）［１３］、およびグリセルアルデヒド３−リン酸（マロン酸セミアルデヒドに類似）を使用する２−デヒドロ−３−デオキシ−ホスホグルコン酸アルドラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．１．２．１４、ＫＤＰＧアルドラーゼ）［１４］、タルトロン酸セミアルデヒド［１５］（マロン酸セミアルデヒドに類似）を使用する２−デヒドロ−３−デオキシ−グルカル酸アルドラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．１．２．２０、ＫＤＧアルドラーゼ）、および基質としてオキサロアセテート［１６］（マロン酸セミアルデヒドに類似）を使用する４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソ−グルタル酸アルドラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．１．３．１７）が挙げられる。
Figure 0006680671
Ｅ．Ｃ．４．２．１−デヒドラターゼ（ヒドロリアーゼ）
上に記載されたようなＣ３アルデヒドからアジペートを合成するための経路（ｐａｔｗｈａｙｓ）におけるいくつかの変換反応には、デヒドラターゼ（ヒドロリアーゼとも呼ばれる）によって触媒される脱水工程が含まれる。これらの反応には、工程２Ｂ、２Ｉ、３Ｍ、３Ｈ、２Ｆ、３Ｄ３、３Ｄ２、３Ｄ１、４Ｄ１、４Ｄ２、４Ｄ３、４Ｄ４および４Ｄ５が含まれる。各変換反応に対して、脱水されるヒドロキシル基における両方の立体中心（ＲまたはＳ）が、脱水を行うための酵素によって使用され得る。
工程２Ｆ（図２）および３Ｄ１（図３）は、２−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡから対応する２，３−デヒドロ−アシル−ＣｏＡへの脱水を含む。工程２Ｆ（図２）および３Ｄ１（図３）は、２−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡから対応する２，３−デヒドロ−アシル−ＣｏＡへの脱水を含む。Ｃ３アルデヒドが、そのアジピン酸経路に対して、それぞれ３−ヒドロキシプロパナール、３−アミノ−プロパナールおよび３−オキソ−プロピオン酸であるとき、工程２Ｆは、２，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡから２，３−デヒドロ−６−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡへの脱水；６−アミノ−２−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡから６−アミノ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡへの脱水；および２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡから２，３−デヒドロ−アジピル−ＣｏＡの脱水を含み；工程３Ｄ１は、２，６−ジヒドロキシ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡから２，３−デヒドロ−６−ヒドロキシ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡへの脱水；６−アミノ−２−ヒドロキシ−４−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡから６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡへの脱水；および２−ヒドロキシ−４−オキソアジピル−ＣｏＡから２，３−デヒドロ−４オキソアジピル−ＣｏＡへの脱水を含む。２−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、２−ヒドロキシアシル−ＣｏＡから（Ｅ）−２−エノイル−ＣｏＡへの可逆的な脱水を触媒する［１７］。これらの［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスター含有酵素では、一電子還元または一電子酸化によってケチルラジカルが形成され、そのケチルラジカルは、各ターンオーバーの後にさらなるエネルギーの投入無しに再利用される。これらの酵素は、ＡＴＰの加水分解によって駆動される鉄−硫黄タンパク質（フェレドキシン（ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ）またはフラボドキシン）からの一電子移動による活性化を必要とする。この酵素は、非常に酸素感受性であり、活性化のために活性化タンパク質を必要とする［１７］。具体的には、クロストリジウム・シンビオスム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ）由来の２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ｈｇｄＡＢ）および活性化因子（ｈｇｄＣ）が、２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを脱水して、２，３−（Ｅ）−デヒドロアジピル−ＣｏＡ（工程２Ｆ）をもたらすと示されている［１８］。このデヒドラターゼ（ヘキサ−２，４−ジエンジオイル−ＣｏＡ、５−ヒドロキシムコニル−ＣｏＡおよびブチンジオイル−ＣｏＡが逆反応に対する基質として働く）の比較的広範な特異性を所与として、本発明者らは、その酵素が、アジピン酸経路の他のＣ６置換２−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ分子の脱水を触媒すると予測する。工程２Ｆおよび３Ｄ１の変換反応を行うために使用され得る他の関連する（ｒｅｌｅｖｅｎｔ）２−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ｄｅｈｙｒａｔａｓｅ）酵素としては、クロストリジウム・プロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）（ラクチル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｅ．Ｃ．４．２．１．５４）、アシダミノコッカス・フェルメンタンス（Ｒ−２−ヒドロキシ−グルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｒ−２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼ）、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）（Ｒ−フェニルラクチル−ＣｏＡデヒドラターゼ）およびクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（Ｒ−２−ヒドロキシイソカプロイル−ＣｏＡ）に由来する酵素が挙げられる［１９］。
Figure 0006680671
Ｃ３アルデヒドが、アジピン酸経路に対してそれぞれ３−ヒドロキシプロパナール、３−アミノ−プロパナールおよび３−オキソ−プロピオン酸であるとき、工程３Ｈ（３０から１６への変換，図３）は、４，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡから２，３−デヒドロ−６−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡへの脱水；６−アミノ−４−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡから６−アミノ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡへの脱水；および４−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡから２，３−デヒドロ−アジピル−ＣｏＡへの脱水を含み；工程３Ｍ（１９から２０への変換，図２）は、２，４，６−トリヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡから６−ヒドロキシ−２−オキソヘキサノイル−ＣｏＡへの脱水；６−アミノ−２，４−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡから６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソヘキサノイル−ＣｏＡへの脱水；および２，４−ジヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡから２−オキソアジピル−ＣｏＡへの脱水を含む。４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡへの可逆的な脱水を触媒する４−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１２０）が、上述の脱水を触媒するために使用され得る。２−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼと同様に、この酵素もまた、ケチルラジカルを通じて機能し、酸素感受性である。工程３Ｈおよび３Ｍの変換反応を行うために使用され得る例示的な４−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素としては、クロストリジウム・アミノブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）（４−ヒドロキシ−ブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ）［２０］およびイグニコッカス・ホスピタリス（Ｉｇｎｉｃｏｃｃｕｓ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｓ）（４−ヒドロキシ−ブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ）［２１］に由来する酵素が挙げられる。そのような酵素は、クロストリジウム・クルイベリ［２２］、メタッロスパエラ（Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ）、スルフォロブス、アルカエオグロブスおよびケナルカエウム（Ｃｅｎａｒｃｈａｅｕｍ）の種［４］においても同定されている。これらの酵素のいずれもが、この脱水を行うことができる。
Figure 0006680671
脱水を含むアジピン酸経路の他の工程は、工程２Ｂ（１１から１２への脱水）、２Ｉ（１９から９への脱水）、３Ｄ２（２１から２３への脱水）、３Ｄ１（２２から２４への脱水）、４Ｄ１（４３から４５への脱水）、４Ｄ２（４４から４６への脱水）、４Ｄ３（３３から３４への脱水）、４Ｄ４（３２から３７への脱水）および４Ｄ５（５４から５９への脱水）を含む。ラジカルデヒドラターゼ、鉄−硫黄クラスターベースのデヒドラターゼならびにエノレートイオンベースのデヒドラターゼを含むいくつかのクラスのデヒドラターゼが特徴づけられており、それらは、これらの脱水を触媒するために使用され得る。
メタ経路からの複数のデヒドラターゼが知られており、それらは、１１（４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸、６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸、４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジペート、図２）から対応する３，４−デヒドロ生成物１２（工程２Ｂ、図２）への脱水を触媒するために使用され得る。多くの細菌におけるメタ切断経路からのヒドラターゼは、２−ヒドロキシ−アルキル−２，４−ジエノエートから対応する４−ヒドロキシ−２−ケト−アルカン酸に水和すると知られている。４−ヒドロキシ−２−ケト−アルカン酸の脱水は、直接、２−ケト−３−アルケン酸をもたらすか、あるいはその逆反応が、２−ヒドロキシ−アルキル−２，４−ジエノエートの合成をもたらし得、その２−ヒドロキシ−アルキル−２，４−ジエノエートが、より安定な２−ケト−３−アルケン酸（図２，１２）に互変異性化し得る。デヒドラターゼＨｐｃＧ／ＨｐａＨ［２３］［２４］は、２−ヒドロキシ−ヘキサ−２，４−ジエノエートを水和して、４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸を生成すると示されており、その４−ヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸は、所望の脱水基質１１と化学的および構造的に非常に類似している（図２，Ｃ６における官能基だけが異なる）。他の例示的なメタ切断経路デヒドラターゼとしては、この反応を行うためにも使用され得る、ＭｈｐＤ、ＤｍｐＥ、ＴｅｓＥおよびＢｐｈＨ［２５−２７］［２８］が挙げられる。
Figure 0006680671
あるいは、ＤＨＤＰＳ（ジヒドロジピコリン酸シンターゼ）／ＦＡＨ（フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ）スーパーファミリーに属する２−ケト−３−デオキシ−糖酸デヒドラターゼもまた、１１から１２への脱水（工程２Ｂ，図２）を行うために使用され得る。これらのデヒドラターゼは、１１に構造的に非常に類似している基質である３−デオキシ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−糖酸の脱水を触媒する。例示的なデヒドラターゼとしては、２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−アラビノン酸デヒドラターゼ［２９］、Ｌ−２−ケト−３−デオキシアラボン酸デヒドラターゼ［３０］および２−ケト−３−デオキシ−Ｌ−リキソン酸デヒドラターゼ［３１］が挙げられる。そのような複数のデヒドラターゼが、生化学的に特徴づけられており、それらの配列情報を下記の表に示す。これらのデヒドラターゼは、β−ヒドロキシケトン基質の脱水を触媒する（シッフ塩基形成またはＭｇ＋２によって安定化されたエノレート機構を介して）ので、それらは、脱水工程４Ｄ４（図４，３２から３７への脱水）、工程４Ｄ５（５４から５９への脱水）、工程４Ｄ１（４３から４５への脱水）、工程３Ｄ２および３Ｄ１（図３，Ｃ３アルデヒドが３−ヒドロキシプロパナール、３−アミノ−プロパナールおよび３−オキソ−プロピオン酸であるとき、それぞれ２１、２２から２３、２４への脱水）を触媒するためにも使用され得、これらの脱水は、β位（ｐｏｓｔｉｏｎ）に存在するヒドロキシ基から基質内のケトン官能基への脱水を含む。
Figure 0006680671
あるいは、マレートからフマレートへの可逆的な脱水およびＤ−タルタレートからエノール−オキサロアセテート（２−および／または３−ヒドロキシ酸）への可逆的な脱水を触媒するフマラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２）もまた、２−ヒドロキシ−４−ケト酸２１（Ｃ３アルデヒドが３−ヒドロキシプロパナール、３−アミノ−プロパナールおよび３−オキソ−プロピオン酸であるとき、それぞれ２，６−ヒドロキシ−４−ケトヘキサノエート、６−アミノ−２−ヒドロキシ−４−ケトヘキサノエートおよび２−ヒドロキシ−４−ケトアジペート）の脱水、およびマレート（３−カルボキシ−２−ヒドロキシ−プロパノエート）に化学的に類似している２−ヒドロキシ−４−ケト−アシル−ＣｏＡ，２２（Ｃ３アルデヒドが３−ヒドロキシプロパナール、３−アミノ−プロパナールおよび３−オキソ−プロピオン酸であるとき、それぞれ２，６−ヒドロキシ−４−ケトヘキサノイル−ＣｏＡ、６−アミノ−２−ヒドロキシ−４−ケトヘキサノイル−ＣｏＡおよび２−ヒドロキシ−４−ケトアジピル−ＣｏＡ）の脱水を含む工程３Ｄ２および３Ｄ１（図３）を行うために使用され得る。クラスＩフマラーゼＦｕｍＡおよびＦｕｍＢは、酸素感受性触媒［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスターを含み、細菌、主に腸内細菌およびバクテロイデス門、例えば、サルモネラおよびクレブシエラに見られる。鉄非依存的で酸素安定性のＦｕｍＣは、クラスＩＩに属し、真核生物のフマラーゼと同種である。ＦｕｍＡ、ＦｕｍＢおよびＦｕｍＣは、Ｅ．コリから同定されており、広く特徴づけられている［３２−３４］。他のフマラーゼとしてはまた、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のＦｕｍＣ［３５］、Ｓ．セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｉｅ）由来のフマラーゼ［３６］、サーマス・サーモフィルス由来のｆｕｍＣ［３７］、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）のフマラーゼＭｍｃＢＣ（エシェリヒア・コリにおけるフマラーゼＡと３３％相同）［３８］およびカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）由来のｆｕｍＣ［３９］が挙げられる。フマラーゼは、マレート／タルタレートに構造的に類似している３−ヒドロキシ酸の脱水を含む、脱水工程４Ｄ２（４４から４６への脱水）、４Ｄ３（３３から３４への脱水）および２Ｉ（１９から９への脱水）も触媒し得る。
Figure 0006680671
アコニット酸ヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３）は、単一［４Ｆｅ−４Ｓ］中心を含む広く分布しているモノマー酵素であり、３−ヒドロキシ酸、例えば、クエン酸からアコニット酸への脱水、ならびにイソシトレートからアコニット酸への脱水を触媒すると知られており、ＴＣＡサイクルにおいて極めて重要な役割を果たすと知られている［４０］。十分に研究されたアコニット酸ヒドラターゼとしては、Ｅ．コリのａｃｎＡおよびａｃｎＢ［４１］ならびにＳ．セレビシェのアコニターゼ［４２］および他の類似のデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．７９，２−メチルクエン酸デヒドラターゼ［４３］、Ｅ．Ｃ．４．２．１．３１、マレイン酸ヒドラターゼ−ｃｉｓ二重結合形成［４４］）が挙げられる。
Figure 0006680671
糖酸から水分子を開裂してその糖酸の２−ケト−３−デオキシ誘導体を生成し、エノラーゼスーパーファミリー（二価カチオンによって安定化されるエノレートを形成することによって機能する）に属するいくつかの糖酸デヒドラターゼが知られている。そのようなデヒドラターゼがいくつか知られており、一連の異なる糖酸に対する脱水を触媒し得る［４５］［４６］。そのようなデヒドラターゼは、興味深く、本明細書中に記載される脱水工程を触媒し得る。例示的な糖酸デヒドラターゼおよびいくつかのエノイル−ＣｏＡヒドラターゼが下記の表に示され、これらは、本明細書中で述べられる脱水を行うために使用することができる。
Figure 0006680671
Figure 0006680671
Ｅ．Ｃ．１．１．１−オキシドレダクターゼ（アルコールからアルデヒドへ）
アジペートを合成するための様々な経路における、図４に示されているようないくつかの経路工程４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ４および４Ａ５は、第一級アルコールからアルデヒドへの酸化を含み、アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒される。特に、工程４Ａ１は、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼ（４Ａ１）によって触媒され、工程４Ａ２は、４，６−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼ（４Ａ２）によって触媒され、工程４Ａ３は、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼ（４Ａ３）によって触媒され、工程４Ａ４は、６−ヒドロキシヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼ（４Ａ４）によって触媒され、４Ａ５は、４，６−ジヒドロキシヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼ（４Ａ５）によって触媒される。６−ヒドロキシヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼ（４Ａ４）は、アシネトバクターＮＣＩＢ９８７１［４７］、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．Ｐｈｉ２株およびアルスロバクターｓｐ．ＢＰ２株［４８］におけるシクロヘキサノン分解経路において同定された。この酵素は、可逆的であると示されており、６−オキソヘキサノエートの還元も触媒し得る。あるいは、この酵素は、６−ヒドロキシヘキサノエートに化学的におよび構造的に類似している基質の酸化を含む工程４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３および４Ａ５を触媒するためにも使用され得る。
Figure 0006680671
多くの第一級アルコールデヒドロゲナーゼが、文献において知られており、これらの工程を触媒する例示的な候補を下記に記載する。ｄｈＥ、ａｄｈＰ、ｅｕｔＧ、ｙｉａＹ、ｙｑｈＤ、ｆｕｃＯおよびｙｊｇＢをはじめとしたいくつかのＥ．コリアルコール−アルデヒドデヒドロゲナーゼが知られている［４９］。最近になって、４４個のアルデヒドレダクターゼがＥ．コリにおいて同定された。逆方向におけるこれらの酵素は、所望のアルコール酸化を触媒するために使用され得る［５０］。これらの変換反応を触媒するＣ．アセトブチリカム由来のブタノールデヒドロゲナーゼ［５１］は、興味深い。いくつかのＳ．セレビシエアルコールデヒドロゲナーゼは、ＡＤＨ２〜６を含む一連の異なるアルコールを可逆的に酸化すると示されている。ＡＤＨ６は、Ｃ２−Ｃ８長からアルコールの酸化をＮＡＤＰ＋依存的様式で触媒すると示された広範な特異性の酵素であり、Ｃ６長にとって最適である［５２］。Ｓ．セレビシエ由来のＡｄｈ２もまた、様々なアルコールを可逆的に酸化すると示されたプロミスカスな（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）酵素である［５３］。特に興味深いものには、長鎖アルカン分解株ジオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＮＧ８０−２由来の２つのアルキルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）遺伝子［５４］からのＡＤＨＩ−ＡＤＨＩＩも含まれる。ＡＤＨ１およびＡＤＨ２は、少なくともＣ３０までの広範囲のアルキルアルコールを酸化し得る。他のプロミスカスなＡＤＨとしては、中鎖アルコールデヒドロゲナーゼをコードするＡｌｒＡが挙げられる［５５］。Ａ．タリアナ［５６］、Ｅ．コリ（ｙｉｈｕ）［５７］およびＣ．クルイベリ［５８］において見出された、４−ヒドロキシブチレートの酸化を触媒する４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．６１）もまた興味深い。Ａ．タリアナ酵素ならびにＡ．テルス（ｔｅｒｒｕｓ）酵素（表中のＡＴＥＧ）は、グルタル酸セミアルデヒドを還元し得る（ＷＯ２０１０／０６８９５３Ａ２、ＷＯ２０１０／０６８９５３Ａ２）。
Figure 0006680671
Ｅ．Ｃ．１．１．１−オキシドレダクターゼ（ケトからアルコールまたはアルコールからケトンへ）
アジペートを合成するための様々な経路における、図２〜３に示されているようないくつかの経路工程、例えば、工程２Ｄ、３Ｎ、３Ｂ１、３Ｃ３、３Ｌ２、３Ｌ１、３Ｆ２および３Ｆ１は、ケト基から第二級アルコールへの還元を含む。工程３Ｃ１および３Ｃ２は、第二級アルコールからケト基への酸化を含む。これらの変換反応は、２−オキソアジペート、６−ヒドロキシ−２−オキソヘキサノエートおよび６−アミノ−２−オキソヘキサノエートの２−オキソ基の還元である工程２Ｄ；２−オキソアジピル−ＣｏＡ、６−ヒドロキシ−２−オキソヘキサノイル（ｏｘｏｈｅｘｎｏｙｌ）−ＣｏＡおよび６−アミノ−２−オキソヘキサノイル−ＣｏＡの２−オキソ基の還元である工程３Ｎ；４−ヒドロキシ−２−オキソアジペート、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソヘキサノエートおよび６−アミノ−４−ヒドロキシ−２−オキソヘキサノエートの２−オキソ基の還元である工程３Ｂ１を含み；工程３Ｃ３は、２，４−ジオキソアジペート、６−ヒドロキシ−２，４−ジオキソヘキサノエート、６−アミノ−２，４−ジオキソヘキサノエートの２−オキソ基の還元であり、工程３Ｌ２は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジペート、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノエート、６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノエートの４−オキソ基の還元であり、工程３Ｌ１は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピル−ＣｏＡ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ、６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡの４−オキソ基の還元であり、工程３Ｆ２は、４−オキソアジペート、６−ヒドロキシ−４−オキソヘキサノエート、６−アミノ−４−オキソヘキサノエートの４−オキソ基の還元であり、３Ｆ１は、４−オキソアジピル−ＣｏＡ、６−ヒドロキシ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ、６−アミノ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡの４−オキソ基の還元であり、工程３Ｃ１は、２，４−ジヒドロキシアジピル−ＣｏＡ、２，４，６−トリヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ、６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡの４−ヒドロキシ基の酸化であり、工程３Ｃ２は、２，４−ジヒドロキシアジペート、２，４，６−トリヒドロキシヘキサノエート、６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサノエートの４−ヒドロキシ基の酸化である。
典型的には、キノン（ＱＨ２）依存性デヒドロゲナーゼ、還元型フェリシトクロム依存性デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性デヒドロゲナーゼ、ＦＭＮＨ２依存性デヒドロゲナーゼ、ＦＡＤＨ２依存性デヒドロゲナーゼが、この還元（または該当するとき、逆方向の酸化）を行うために使用され得る。２−オキソ酸または２−オキソアシル−ＣｏＡまたは２−オキソエステルからそれらの対応する２−ヒドロキシ生成物への還元が可能である任意の酵素が、これらの変換反応の多くを行うために適している。理想的な酵素は、Ｃ−２ケト基を２（Ｒ）または２（Ｓ）異性体に選択的に還元することができるべきである。乳酸デヒドロゲナーゼが、この反応にとって好ましいが、第二級アルコールデヒドロゲナーゼもまた、この変換反応を行うために使用することができる。アシダミノコッカス・フェルメンタンス由来のＮＡＤＨ依存性（Ｒ）−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ（ＨＧＤＨ）は、２−オキソアジペートの還元を可逆的に触媒して、２−（Ｒ）−ヒドロキシアジペートをもたらすと示されている［５９］（工程２Ｄ）。そのような酵素は、ヒト胎盤［６０］およびラッツスｓｐ．［６１］においても見出されている。さらに、Ｃ．ディフィシル由来のＬｄｈＡは、２−オキソヘキサノエート、２−オキソペンタノエートおよび２−イソカプロエートを含む一連の２−オキソ酸（ｏｘｏａｃｄｓ）の還元をＮＡＤＨ依存的様式で触媒すると示されているＮＡＤ＋依存性（Ｒ）−２−ヒドロキシイソカプロン酸デヒドロゲナーゼである［６２］。ＳｅｒＡは、エシェリヒア・コリにおいて３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）デヒドロゲナーゼをコードするが、しかしながら、その酵素は、２−オキソグルタレートを還元するとも見出されている［６３］。ラクトバチルス・ペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ）のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼにおいてＴｙｒ５２をバリンまたはアラニンで置換したところ、２−ケトブチレート、２−ケトカプロエート、２−ケトイソカプロエート、２−ケトバレレート、２−ケトグルタレートおよび２−ケトイソバレレートを含む大きな脂肪族２−ケト酸に対して高い活性および優先度が誘導された［６４］。他の興味深い２−オキソ酸レダクターゼとしては、種々の２−ケト酸（２−ケトブチレート、２−ケトカプロエート、２−ケトイソカプロエート、２−ケトバレレートおよび２−ケトブチレート）およびまた２−ケト−チオエステル、例えば、２−ケトメチルチオブチレート（本明細書中における２−オキソアシル−ＣｏＡを還元する場合）の還元を触媒するＬ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）由来のｐａｎＥが挙げられる［６５］。あるいは、マンデル酸デヒドロゲナーゼは、直鎖脂肪族２−ケト酸、分枝鎖２−ケト酸および芳香族側鎖を有する２−ケト酸をはじめとした広範囲の２−ケト酸を還元すると示されているので、それらもまた優れた候補である。そのような酵素の１つとしては、ラクトバチスル・デルブルエッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）亜種（ｓｕｂｓｐ．）ブルガリカス（ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）由来のＤ−２−ヒドロキシ４−メチル吉草酸デヒドロゲナーゼ（Ｃ−４における置換を許容する）が挙げられる［６６］。他の興味深い類似のアルコールデヒドロゲナーゼとしては、Ｅ．コリおよびラルストニア・ユートロファ由来の乳酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。
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ケトレダクターゼもまた、これらの変換反応を行うために使用され得る。特に、酵母アルコールデヒドロゲナーゼは、一連の異なるケト酸およびケトエステル、例えば、３−ケトエステル、４−ケト酸、５−ケト酸およびエステル（３−オキソ酪酸エチル、３−オキソヘキサン酸エチル、４−オキソペンタン酸および５−オキソヘキサン酸を含む）を還元すると示されている［６７］。Ｓ．セレビシエの２２個のオキシドレダクターゼ（ｏｘｉｄｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ）が試験され、それらのほとんどが、一連のそのようなケトエステルに対して活性を示した。いくつかの酵母オキシドレダクターゼ［６８］を下記の表に示すが、それらは、４−オキソ還元工程および２−オキソ還元工程を触媒する優れた候補である。これらの反応は、天然には可逆的であるので、本明細書中で述べられるこれらの酵素は、工程３Ｃ１および工程３Ｃ２における４−ヒドロキシ酸の酸化工程を行うためにも適している。
Figure 0006680671
所望の基質に対するこれらの酸化還元工程を触媒する他の関連するアルコールデヒドロゲナーゼとしては、３−ヒドロキシル−アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、２−ヒドロキシプロピル−ＣｏＭデヒドロゲナーゼ、ならびに下記の表に示される短鎖および中鎖第二級アルコールデヒドロゲナーゼが挙げられる。３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、ｐａａＣおよびＰｈａＣによって触媒されると示されている［６９］［７０］。あるいは、クロストリジアの３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡをもたらすアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼもまた優れた候補である［７１］。
Figure 0006680671
Ｅ．Ｃ．１．２．１−オキシドレダクターゼ（アルデヒドから酸へ）
アジペートを合成するための様々な経路における、図４に示されているようないくつかの経路工程、例えば、工程４Ｂ１、４Ｂ４、４Ｂ５、４Ｂ６および４Ｂ７は、アルデヒド基から酸への酸化を含む。これらの工程のための酵素は、４Ｂ１（４−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼ）、４Ｂ４（４−ヒドロキシ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼ）、４Ｂ５（４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼ）、４Ｂ６（６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ６−デヒドロゲナーゼ）および４Ｂ７（６−オキソヘキサン酸６−デヒドロゲナーゼ）である。シクロヘキサノン分解経路からのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．２．１．６３）は、６−オキソヘキサノエートをアジペートに酸化すると知られている［４７］。そのような酵素は、アシネトバクターｓｐ［４７］、ロドコッカスｓｐ．（ＲＨＡ１株）およびバークホルデリア・リゾキニカ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｒｈｉｚｏｘｉｎｉｃａ）ＨＫＩ４５４において同定され、それらの配列は、下記の表に示されている。これらの酵素は、基質の長さおよびそれらの化学的性質が類似していることに起因して、他の工程を触媒するためにも使用され得る。優れた候補として働くさらなる酵素としては、ヘキサナールをヘキサン酸に酸化するアルデヒドデヒドロゲナーゼ、例えば、長鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、ＮＡＤ依存性酵素であるジオバチルス・サーモレオボランス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）Ｂ２３ＡｌｄＨ）が挙げられる［５４］。他の興味深いそのような生化学的に特徴づけられた長鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼ［７２，７３］も下記の表に列挙されている。さらに、２，５−ジオキソバレレートを２−オキソグルタレートに酸化する酵素、特に、アゾスピリルム・ブラシレンセ由来の酵素は、一連のアルデヒド（Ｃ１−Ｃ８直鎖アルデヒド）ならびに置換されたアルデヒドグルタルアルデヒド、ベタインアルデヒド、グリコアルデヒドおよびコハク酸セミアルデヒドも酸化するので、それも興味深い［７４］。あるいは、Ｒ．ノルベギクス由来のコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ［７５］は、工程４Ｂ５に類似の基質であるヘキセナールを酸化すると示されており、これもまた興味深い。
Figure 0006680671
Ｅ．Ｃ．２．８．３−補酵素Ａトランスフェラーゼ
ＣｏＡトランスフェラーゼは、１つの分子から別の分子へのＣｏＡ部分の可逆的な転移を触媒する。多くの変換反応は、カルボン酸をそれらの対応するアシル−ＣｏＡ誘導体に相互変換するためおよびその逆のためにＣｏＡ−トランスフェラーゼを必要とし、それらとしては、図２〜４の４Ｆ１（アジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ）、４Ｆ２（６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ）、４Ｆ３（６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ）、４Ｆ５（６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ）、３Ｇ１（２，４−ジヒドロキシアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、２，４，６−トリヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは６−アミノ−２，４−ジヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ）、２Ｅ（２−ヒドロキシ−アジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、２，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ）、３Ｇ２（２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、２，６−ジヒドロキシ−４オキソヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは６−アミノ−２−ヒドロキシ−４オキソヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ）および３Ｇ５（４−ヒドロキシアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、４，６−ジヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは６−アミノ−４−ヒドロキシヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ）が挙げられる。多くのＣｏＡトランスフェラーゼ酵素が、これらの変換反応を行うと知られているか、または（ｏｔ）このためにふさわしく、それらは、下記で説明される。エステル化の方向の反応を触媒する経路酵素は、カルボン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（例えば、４−ヒドロキシアジピン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ，３Ｇ５）と呼ばれるのに対し、逆方向の触媒は、カルボキシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（４Ｆ１，アジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ）と呼ばれる。多くの異なる酸またはＣｏＡ−エステルが、他方の反応パートナーとして使用されるので、それは、その酵素の系統名から省略される。任意の所与の（ｇｉｖｅ）代謝的に利用可能なＣｏＡ−エステルまたは酸が、これらの工程を触媒するこれらの酵素によって、反応パートナーとして使用され得ることは当然のことである。
Ｃ．ディフィシルにおけるロイシン発酵の酸化的分岐（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｂｒａｎｃｈ）の一部である２−ヒドロキシイソカプロン酸ＣｏＡトランスフェラーゼであるＨａｄＡは、Ｃ６化合物、例えば、２（Ｒ）−ヒドロキシイソカプロエート、イソカプロエートおよび２（Ｅ）−イソカプレノエート（ｉｓｏｃａｐｒｅｎｏａｔｅ）へのＣｏＡ分子の可逆的な結合を触媒すると示されている［６２］。それがＣ．ディフィシル由来のＬｄｈＡの隣りに位置するという事実とともに、所望の工程の基質に構造的に関係するＣ６化合物に対するその活性（上記を参照のこと）は、その酵素をこれらの工程の多くを触媒するための主要な候補にする。アシダミノコッカス・フェルメンタンス由来のグルタコン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ｇｃｔＡＢ）は、種々のＣｏＡ供与体、例えば、アセチル−ＣｏＡおよびグルタコニル−ＣｏＡを使用して、補酵素Ａ部分を２−（Ｒ／Ｓ）−ヒドロキシグルタレートの両方のＲ／Ｓ異性体ならびに２−（Ｒ）−ヒドロキシアジペートに転移すると示されている（工程２Ｅ）。さらに、アセチル−ＣｏＡがＣｏＡ供与体であるとき、グルタコネート、アクリレート、クロトネートおよびイソクロトネートに加えて、アジペート（工程４Ｆ１）、プロピオネート、ブチレート、２（Ｒ／Ｓ）−ヒドロキシグルタレート（ｈｙｄｏｒｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ）およびグルタレートにＣｏＡ分子を可逆的に結合するために、ＣｏＡ供与体としてグルタコニル−ＣｏＡを使用することも示されている［７６，７７］。それらの配列ならびに同種の配列を下記の表に示す。これらの工程を触媒するための３−オキソ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、特に、３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼは、所望の基質に構造的におよび化学的に類似の基質を使用するので、それらもまた特に興味深い。そのような酵素は、シュードモナス・プチダ［７８］、アシネトバクター・ベイリー（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉ）、ストレプトマイセス・セリカラーではｐａｃＩ／ｐａｃＪによってコードされ、シュードモナス・ナックムッシでは遺伝子ｃａｔＩ／ｃａｔＪによってコードされ［７８］、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）［７９］およびＢ．サブチルス［８０］にも存在する。ＣｏＡを、本明細書中の変換反応に構造的に関連する一連の基質、例えば、５−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシ−２−ペンテノエートおよび４−ペンテノエートに転移することができる、クロストリジウム・アミノワレリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃｕｍ）から報告されたＣｏＡ−トランスフェラーゼ（遺伝子は同定されていない）［８１］もまた興味深い。リンゴ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、マリル−ＣｏＡに類似の基質であるＣ６置換２−ヒドロキシ−４−オキソ／ヒドロキシアシル−ＣｏＡをもたらす本明細書中に記載される変換反応、特に、工程３Ｇ１および３Ｇ２にも関連する。そのような酵素（遺伝子ｓｍｔＡ、ｓｍｔＢアクセッション番号ＮＺ＿ＡＡＡＨ０２００００１９、１９，２００〜３０，６００ｂｐ）は、光合成細菌であるクロロフレクサス・アウランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）における３−ヒドロキシプロピオン酸回路から（ｆｏｒｍ）特徴づけられた［８２］。他の関連するＣｏＡ−トランスフェラーゼとしては、比較的広範な基質許容性を有する、Ｅ．コリのアセト−アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼが挙げられる［８３，８４］。
Figure 0006680671
Ｅ．Ｃ．６．２．１−補酵素Ａリガーゼまたはシンテターゼ
ＣｏＡ−トランスフェラーゼを使用することに対する別の選択肢は、工程２Ｅ、３Ｇ１、３Ｇ２、３Ｇ５、４Ｆ１、４Ｆ２、４Ｆ３および４Ｆ５を触媒するために補酵素Ａリガーゼを使用することである。多くのアシル−ＣｏＡリガーゼが、ＡＤＰを使用してＣｏＡエステルの可逆的な加水分解を触媒すると知られており、それにより、ＡＴＰが同時に形成される（逆方向ではＡＤＰが形成）。ＡＴＰを生成することによって、このリガーゼのサブセットは、チオエステル（ｔｈｉｅｓｔｅｒ）結合に蓄えられたエネルギーを放出せず、これは、微生物宿主におけるアジペートの生成にとって有益である。超好熱性古細菌であるサーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓｈａｓ）由来のスクシニル−ＣｏＡシンテターゼ（ＳＣＳ−Ｔｋ）は、２つのサブユニット（α／β）を含み、チオエステル結合に存在するエネルギーを保存することによって（ＡＴＰの形成に起因して）、二酸、例えば、アジペート（工程２Ｅおよび工程４Ｆ１）およびその他のもの（ルタレート、ブチレート、プロピオネートおよびオキサレート）の合成に関わるアシル−補酵素Ａリガーゼをコードすると示されている。ＡＣＳ−Ｔｋ（ＳＣＳ−Ｔｋと同じサブユニットｂ）は、変換反応を行う別の有望な候補であり、その基質において等しく柔軟である。これらの酵素のパラログは、他の好熱菌、例えば、Ｐ．アビシ（ＰＡＢ）、Ｐ．フリオスス（ＰＦ）およびＰ．ホリコシイ（ＰＨ）において見出された［８５］。他の関連するＣｏＡ−リガーゼとしては、Ｅ．コリ由来のＳｕｃＣＤ［８６］、アルカエオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）のＣｏＡ−リガーゼ（アイソザイム）ＡＣＤＩ／ＩＩ［８７］（多くの直鎖、分枝鎖アシル−ＣｏＡと活性）および多くのカルボキシレート（Ｃ３−Ｃ８カルボキシレート）分子に対して活性を有すると見出されたシュードモナス・プチダのＣｏＡ−リガーゼ［８８］が挙げられる。別の興味深い候補としては、Ｃ８およびＣ９ジオエートとともに働いて、対応するＣｏＡエステルを生成する、シュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）由来の６−カルボキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼ（ＥＣ６．２．１．１４）が挙げられる［８９］。
Figure 0006680671
以下の他のＥ．Ｃ．６．２．１クラスに属する他の酵素もまた、所望の変換反応を行うために使用することができる。
Ｅ．Ｃ．３．２．１−ＣｏＡヒドロラーゼ
工程４Ｆ１、４Ｆ２、４Ｆ３および４Ｆ５は、ＣｏＡヒドロラーゼによって触媒され得る。アジピル−ＣｏＡからアジペートを生成する（４Ｆ１）ＣｏＡヒドロラーゼ（４Ｆ１）は、ホモ・サピエンスにおいて同定され、生化学的に特徴づけられている［９０］。他の興味深いヒドロラーゼとしては、Ｅ．コリ由来のｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、Ｙｄｉｌ、ｐａａＩ、ｙｂｇＣおよびＹｂｄＢが挙げられる［９１］［９２］。ＹｄｉｌとＹｂｄＢの両方が、ヘキサノイル−ＣｏＡを含む様々なＣｏＡ分子に対して活性を示す。
Figure 0006680671
Ｅ．Ｃ．１．３．１−アルケンレダクターゼ
アジペートを合成するための様々な経路における、図２〜４に示されているような工程２Ｊ、２Ｃ、２Ｇ、３Ｅ１、３Ｅ２、４Ｅ３、４Ｅ４、３Ｋ２、３Ｋ１および４Ｆ４は、アルケン基からアルカンへの還元を含む。具体的には、工程２Ｊは、４，５−デヒドロ−２−ヒドロキシ−アジピル−ＣｏＡの還元を必要とし、工程２Ｃは、３，４−デヒドロ−２−オキソ−アジペート、６−ヒドロキシ−３，４−デヒドロ−２−オキソヘキサノエートおよび６−アミノ−３，４−デヒドロ−２−オキソヘキサノエートの還元を必要とし、工程２Ｇは、２，３−デヒドロ−アジピル−ＣｏＡ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡおよび６−アミノ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼの還元を必要とし、工程３Ｅ１は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピル−ＣｏＡ、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡおよび６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼの還元を必要とし、工程３Ｅ２は、２，３−デヒドロ−４−オキソアジペート、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノエートおよび６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−オキソヘキサノエートの還元を必要とし、工程４Ｅ３は、４，５−デヒドロアジピル−ＣｏＡの還元を必要とし、工程４Ｅ４は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡの還元を必要とし、工程３Ｋ２は、２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシアジペート、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノエートおよび６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシヘキサノエートの還元を必要とし、工程３Ｋ１は、２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ、４，６−ジヒドロキシ−２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡおよび６−アミノ−２，３−デヒドロ−４−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡの還元を必要とし、工程４Ｆ４は、４，５−デヒドロ−６−オキソヘキサノエートの還元を必要とする。アルケンレダクターゼは、文献において周知の酵素であり、所望の基質または類似の基質に対するこの各工程を触媒できる多くのそのような酵素が、本明細書中に記載される。
フラビンメディエーターの非存在下または存在下においてエノイル−ＣｏＡからアシル−ＣｏＡへの還元を触媒するエノイル−ＣｏＡレダクターゼが、工程２Ｇ、３Ｅ１および３Ｋ１を触媒するために使用され得る。ＮＡＤＨを使用したｔｒａｎｓ２−エノイル−ＣｏＡの直接還元は、クロトニル−ＣｏＡ還元工程において速度論的トラップ（ｋｉｎｅｔｉｃ ｔｒａｐ）を効果的に導入することによってＥ．コリにおけるｎ−ブタノール合成経路を通じてフラックス（ｆｌｕｘ）を駆動すると示されている。Ｔ．デンティコラ由来のＴｒａｎｓ−２−エノールＣｏＡレダクターゼ（ＴＥＲ）は、補因子としてＮＡＤＨを使用してこの還元を触媒すると示されている。ＴｄＴＥＲは、クロトニル−ＣｏＡと比べてｔｒａｎｓ−２−ヘキセノイル−ＣｏＡに対して７倍高い活性を示し［９３］、これらの変換反応に対する好適な候補である。下記の表に示されるそのホモログの多くも関連性がある。同様に、ユーグレナ・グラシリス由来のＴＥＲも、補因子としてＮＡＤＨを利用すると示されており、ｔｒａｎｓ−２−ヘキセノイル−ＣｏＡなどのＣ６チオエステルの還元に対して活性を示す［９４］。ＥｇＴＥＲの多くのホモログもまた報告されており、それらもまた本明細書中で使用され得、それらのいくつかを下記に示す。ＮＡＤＰＨ依存性ヒトペルオキシソームＴＥＲは、４〜１６個の炭素原子の鎖長の範囲のアシル−ＣｏＡに対して活性を示し［９５］、これもまた、これらの変換反応を行うための好適な候補である。
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活性化された二重結合、すなわち、カルボニルまたはカルボキシレート基の隣りの二重結合の還元は、旧黄色酵素ファミリーのエン酸レダクターゼ、アルケナール−レダクターゼを含む多くの酵素（ＥＣ１．３．１．７４）ならびにキノン−レダクターゼによって触媒され得る。ＯＹＥ酵素は、典型的には、各ターンオーバーで酸化され、そしてＮＡＤ（Ｐ）Ｈによって還元されるフラビン（ＦＭＮＨ２）補因子を使用するのに対し、アルケナール−レダクターゼおよびキノン−レダクターゼは、還元のためにＮＡＤ（Ｐ）Ｈを直接使用し得る。文献において周知であるマレイル酢酸（２，３−デヒドロ−４−オキソアジピン酸）レダクターゼは、芳香族分解経路の一部であるので、工程３Ｅ２は、それらのマレイル酢酸（２，３−デヒドロ−４−オキソアジピン酸）レダクターゼによって触媒される。工程３Ｅ２を触媒すると示された［９６，９７］２つのそのようなマレイル酢酸レダクターゼを下記に示す。あるいは、２−エン酸レダクターゼもまた、この工程、ならびに２，３−エノエートまたは４，５−エノエート部分の還元を含む２Ｊ、３Ｋ２および４Ｅ３を行うために使用され得る。クロストリジアの２−エン酸レダクターゼ（ｅｎｒ）は、この工程を触媒するために使用され得る［９８］。ＯＹＥファミリーのエン酸レダクターゼなどは、それらが還元する基質に対して極めてプロミスカスであると示されている［９９］。工程２Ｃ、３Ｅ２、３Ｅ１、４Ｆ４および４Ｅ４においてカルボニル基に共役したアルケンの還元を行うために特に興味深いのは、一連の直鎖および環状α，β不飽和ケトンおよびアルデヒドを還元すると示されている［１００］、シュードモナス・プチダ由来のＸｅｎＡ、クルイヴェロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）由来のＫＹＥ１およびエルシニア・ベルコビエリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ）由来のＥＲである。Ｈ．ｖｕｌｇａｒｅアルケナールレダクターゼ［１０１］およびＯＹＥ（Ｂ．サブチルス）［１０２］もまた、ｔｒａｎｓ−２−ヘキセナールを含む、それらが還元する基質に対して極めてプロミスカスである（工程４Ｆ４および４Ｅ４に類似）。そのような「エナール」基質を還元する他の酵素としては、ヘキセナールを還元することができるトマトＯＹＥ（ＬｅＯＰＲ，α，β−不飽和アルデヒド、ケトン、マレイミドおよびニトロアルケン、ジカルボキシレートおよびジ−メチルエステル（例えば、シンナムアルデヒド、ｔｒａｎｓ−ドデカ−２−エナール、２−フェニル−１−ニトロプロペン、ケトイソホロン、Ｎ−エチルマレイミド、ａ−メチルマレイン酸）および１２−オキソフィトジエン酸も還元する）、２−ヘキセナール（α，β−不飽和アルデヒド、ケトン、マレイミドおよびニトロアルケン、ジカルボン酸およびジメチルエステルに加えて）も還元するＢ．サブチルス由来のＯＹＥ、アラビドプシス・タリアナにおけるＰ１−ゼータ−クリスタリン（Ｐ１−ＺＣｒ）ＮＡＤＰＨ：キノンオキシドレダクターゼ（ＮＡＤＰＨを用いて、４−ヒドロキシヘキセナールおよびヘキセナールを含む炭素鎖Ｃ（３）−Ｃ（９）の２−アルケナールの還元を触媒する）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．ＰＣＣ７９４２のエン−レダクターゼおよびシアノバクテリア由来の１０個の異なる酵素（ヘキセナールを含む一連の基質の還元を触媒する）およびサッカロマイセス由来のＯＹＥ１−３（置換および非置換のα，β−不飽和アルデヒド、ケトン、イミド、ニトロアルケン、カルボン酸およびエステル；環式および非環式エノンを還元する）が挙げられる［１０３−１０８］。これらの酵素の多くは、２−ヘキセナールを還元し、２−ヘキセナールのＣ６位における置換を許容する（工程４Ｅ４）。本明細書中に記載されるこれらの酵素の多く（配列は下記の表に示される）は、基質特異性に関して極めて融通が利き、上に記載された工程（例えば、エノイル−ＣｏＡ還元またはエノエート還元）に関連するそれらの好ましい基質のほかに他の反応も触媒すると予想される。
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Ｅ．Ｃ．１．４．１−アミノ酸デヒドロゲナーゼまたはＥ．Ｃ．２．６．１トランスアミナーゼ
トランスアミナーゼは、アミン供与体からアルデヒド受容体へのアミノ基の可逆的な転移を触媒する。末端アルデヒドのアミノ化は、Ｅ．Ｃ．２．６．１に属するＰＬＰ（ピリドキサールリン酸）依存性トランスアミナーゼによって触媒され得る。トランスアミナーゼは、アミノ酸、ヌクレオチドならびに小分子を含む一連の異なる供与体から末端アルデヒド基へのアミノ基の転移をＰＬＰ依存的様式で触媒する。工程３Ｇ１〜３Ｇ５は、そのような工程を含む（基質の６−アミノ基に対して脱アミノ化方向）。この変換反応を行う興味深いものとしては、所望の変換反応に化学的におよび構造的に類似した、コハク酸セミアルデヒドおよびグルタメートから４−アミノブチレートおよび２−オキソグルタレートを可逆的に形成し得る４−アミノ酪酸トランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．９）のメンバーが挙げられる。リジン６−アミノトランスフェラーゼ（６−脱アミノ化，Ｅ．Ｃ．２．６．１．３６）もまた興味深く、これらの多くは、特徴づけられており（下記の表に配列）、ＡＤＡ経路工程（脱アミノ化方向）の所望の基質に非常に構造的に類似している６−オキソ−２−アミノヘキサノエートを生成物としてもたらす。複数の４−アミノ酪酸トランスアミナーゼが報告されており、それらは、広い特異性を有する［１０９，１１０］［１１１］。そのようなクラスの酵素は、Ｅ．コリにおいて示されており［１１２，１１３］、シュードモナス・フルオレッセンス、ムース・ムースクルスおよびスース・スクロファでも示されており、基質として６−アミノヘキサノエートを使用する（工程４Ｇ２）［１１４］。基質として末端アミン／アルデヒドを使用するトランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．４８ ５−アミノ吉草酸トランスアミナーゼ；Ｅ．Ｃ．２．６．１．４３アミノレブリン酸トランスアミナーゼ、Ｅ．Ｃ．２．６．１．８ベータ−アラニントランスアミナーゼ）または基質としてジアミンを使用するトランスアミナーゼ［１１５］［１１６］［１１７］［１１５］［１１８］（Ｅ．Ｃ．２．６．１．７６ジアミノ酪酸トランスアミナーゼおよび２．６．１．８２プトレシン（ｐｕｔｒｓｅｓｃｉｎｅ）トランスアミナーゼ［１１３］）が関連し、それらのうちのいくつかは、４−アミノブチレートに対して機能するのと同様に、リジンに対して作用すると示されている。これらのメンバーから特徴づけられた酵素もまた表に列挙される。
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あるいは、アミノ化は、還元型フェリシトクロム、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ＦＭＮＨ２、ＦＡＤＨ２、Ｈ２Ｏ２、還元型アミシアニンまたはアズリンなどの補因子の存在下において、Ｅ．Ｃ．１．４．に属するアミノ酸デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼによって触媒され得る。Ｅ．Ｃ．１．４．群に属するアミノ酸デヒドロゲナーゼおよびアミンオキシダーゼまたはこれらの配列の同種の酵素もまた、この工程を行うために使用することができる。あるいは、アミノ酸およびＮＡＤＨ（電子供与体は変動し得る（ｃａｎ ｖｅｒｙ））を対応する２−オキソ酸、アンモニアおよびＮＡＤに相互変換するアミノ酸デヒドロゲナーゼもまた、この反応を行うために使用され得る。いずれのそのような酵素も使用することができるが、リジンデヒドロゲナーゼ（２−アミノアジペートをもたらす６−脱アミノ化）が、これらの工程の触媒においては特に興味深い。例示的な酵素は、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス［１１９］、アグロバクテリウム・ツメファシエンス［１２０］およびアクロモバクター・デニトリフィカンス［１２１］において見られ得る。
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Ｅ．Ｃ．２．１．３−Ｎ−アセチル化／Ｎ−脱アセチル化：
アジピン酸経路における工程として明示的に（ｅｘｐｌｉｔｌｙ）示されないが、ピルベートおよび３−アミノプロパナール（ａｍｉｎｏｐｒｏｎａｎａｌ）からのＡＤＡ中間体に対して、自発的なラクタム化または望まれない反応を回避するためにＣ６アミノ基が保護され得ることが理解される。これにより、Ｃ３アルデヒドとして３−アミノプロパナールを使用する任意の経路において、アセチラーゼおよびデアセチラーゼをそれぞれ使用するそのような保護基の付加および除去を含み得る２つのさらなる工程が加えられる。さらに、代謝前駆体からの３−アミノプロパナールの合成には、第一級アミノ基の保護が必要とされる場合がある。Ｎ−アセチルトランスフェラーゼは、アセチル基をアミンに転移させて、アセトアミド部分を形成する。リジンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．３２）、グルタミン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＯＡＴ、ＥＣ２．３．１．３５およびＥＣ２．３．１．１）およびジアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．５７）が、第一級アミン基のアセチル化を行うために使用され得る。アセチルホスフェートからＬ−リジン、ベータ−Ｌ−リジンまたはＬ−オルニチンの末端アミノ基にアセチル部分を転移させるリジンＮ−アセチルトランスフェラーゼが、この変換反応を行うために使用され得る。リジンＮ−アセチルトランスフェラーゼは、メタノサルキナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）から特徴づけられた（Ｐｆｌｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：６０４７−６０５５（２００３））。メタン生成古細菌もまた、この官能基を有する酵素をコードすると予測される（Ｐｆｌｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：６０４７−６０５５（２００３））。末端ジアミンをアシル化するためにアセチル−ＣｏＡを供与体として使用するジアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ａｃｔｅｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ）もまた、このアミド形成反応を行うために使用され得る。あるいは、アセチル−ＣｏＡまたはＮ−アセチルオルニチンを使用してグルタメートのアセチル化を触媒するグルタミン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＯＡＴ、ＥＣ２．３．１．３５およびＥＣ２．３．１．１）もまた、アセチル化反応ならびに脱アセチル化反応を行うために使用され得る。
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（５．ピルベートおよびＣ３アルデヒド（３−オキソプロピオネート、３−ヒドロキシプロパナールおよび３−アミノプロパナール）からのアジピン酸合成経路の中間体からの６−アミノ−ヘキサノエートの合成）
本明細書中に記載されるように６−アミノヘキサノエートに変換される、６−アミノヘキサノエート、または中間体、例えば、６−オキソヘキサノエート、６−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡおよびアジピル−ＣｏＡを介して先行するピルベートおよびＣ３アルデヒド（３−オキソプロピオネート、３−ヒドロキシプロパナールおよび３−アミノプロパナール）から開始する複数のＡＤＡ経路は、実施例ＩＶ（図２〜４）に記載されている。これらの中間体を６−アミノヘキサノエートに変換する酵素的工程と組み合わされるこれらの中間体の合成に至るＡＤＡ経路工程は、ピルベートおよびＣ３アルデヒド（３−オキソプロピオネート、３−ヒドロキシプロパナールおよび３−アミノプロパナール）から６−アミノヘキサノエート（ＡＨＡ）を合成するための経路をもたらす。ピルベートおよびＣ３アルデヒド（３−オキソプロピオネート、３−ヒドロキシプロパナールおよび３−アミノプロパナール）から６−アミノヘキサノエートを生成するためのそのような経路（ＡＨＡ経路１〜７８）を、すべての経路の所望の各工程を行うために必要とされる酵素（ｅｎｙｚｍｅｓ）とともに下記に記載する。
ピルベートおよび３−アミノプロパナールからの６−アミノヘキサノエートの合成
６−アミノヘキサノエート（ＡＨＡ）（４９，図４）は、上記の実施例ＩＶにおいて記載され、図２〜４に示されているような、ピルベートおよび３−アミノプロパナールからアジピン酸を合成するための経路（ＡＤＡ８６およびＡＤＡ８９）における中間体（工程４Ｆ５の生成物，図４）である。ゆえに、経路ＡＤＡ８４および８７は、６−アミノヘキサノエートを生成するために使用され得る。しかしながら、これらの経路における６−アミノヘキサノエートをアジピン酸に変換するための工程を除去することにより、その生成に対して選択的である、ピルベートおよび３−アミノプロパナールからの６−アミノヘキサン酸経路（経路（ｐａｗｔｈａｙ）ＡＨＡ１および２，表Ｂを参照のこと）がもたらされる。
ピルベートおよび３−オキソプロパノールからの６−アミノヘキサノエートの合成
６−オキソ−ヘキサノエート（３９，図４）は、ピルベートおよびＣ３アルデヒドである３−ヒドロキシプロパナールからのアジピン酸合成経路（ＡＤＡ２７、２８、３０、３１、６５〜７５、８０〜８３、表Ａ、実施例（Ｅｘａｍｐｌ）ＩＶ）の中間体である。６−オキソ−ヘキサノエートをアジピン酸に変換する工程４Ｂ７（図４）を含めないことによって、これらの経路は、ピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナールからの６−オキソ−ヘキサノエートの合成に対して改変される。６−オキソ−ヘキサノエートは、アミノ化によって６−アミノヘキサノエートに変換され（工程５Ｊ，図５）、それにより、ピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナールからの６−アミノヘキサン酸経路（ＡＨＡ３〜２１，表Ｂ）がもたらされる。さらに、６−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（３８，図４）は、ピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナールからのアジピン酸合成経路（ＡＤＡ２６、２９、４３〜５３、表Ａおよび実施例ＩＶ）の前駆体である。６−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（３８，図４）をアジピン酸に変換する工程４Ｂ６および４Ｆ１（図４）を含めないことによって、これらの経路は、ピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナールからの６−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡの合成に対して改変される。６−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡは、アミノ化によって６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡに変換され（工程５Ｉ，図５）、それはさらに、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、ＣｏＡ−リガーゼまたはＣｏＡヒドロラーゼによって６−アミノヘキサノエートに変換されることにより（工程４Ｆ５，図５）、ピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナールからの６−アミノヘキサン酸合成経路（ＡＨＡ２２〜３４）がもたらされる。
ピルベートおよび３−オキソプロピオネートからの６−アミノヘキサノエートの合成
アジピル−ＣｏＡは、ピルベートおよび３−オキソプロピオネートからのアジペートの合成（ＡＤＡ経路１〜２５、表Ａ、実施例ＩＶ）における中間体である。これらの経路に工程４Ｆ１（図４）を含めないことにより、アジピル−ＣｏＡの合成が可能な経路がもたらされる。アジピル−ＣｏＡは、ＣｏＡ依存性デヒドロゲナーゼによる６−オキソ−ヘキサノエートへのそれの変換（工程５Ｇ，図５）によって６−アミノヘキサノエートに変換された後、上で述べたように６−アミノヘキサノエートに変換される（工程５Ｊ）（ＡＨＡ３５〜５９，表Ｂ）。
これらの変換反応を触媒することができる例示的な酵素を下記に記載する：
中間体である６−アミノヘキサノエート（ピルベートおよび３−アミノプロパナールから）、６−オキソヘキサノエート（ピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナールから）、６−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（ピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナールから）およびアジピル−ＣｏＡ（ピルベートおよび３−オキソプロピオネートから）を介して先行するピルベートおよびＣ３アルデヒド（３−オキソプロピオネート、３−ヒドロキシプロパナールおよび３−アミノプロパナール）からのＡＤＡ経路は、これらの中間体の合成に至る工程を含むこれらの経路の各工程を触媒することができる酵素とともに、実施例ＩＶに記載されている。さらに（Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｙ）、これらの中間体を６−アミノヘキサノエートに変換するために必要な酵素を下記に記載する。
工程５Ｇ：アジピル−ＣｏＡ１−レダクターゼ（Ｅ．Ｃ．１．２．１）によるアジピル−ＣｏＡから６−オキソヘキサノエートへの変換
この反応は、Ｅ．Ｃ．１．２．１に属するＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼによって行われる。補酵素Ａアシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）は、主に細菌に見られ、それらは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを使用してアシル−ＣｏＡから対応するアルデヒドへの可逆的な変換を触媒すると知られている。さらに、ヘキサノイル−ＣｏＡレダクターゼは、この反応を行う関連性のある候補である。Ｅ．コリＡＤＨＥ２は、ヘキサノイル−ＣｏＡをヘキサナールに（ヘキサノール上に）還元すると示されている。サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）から同定された酵素であるＰｄｕＰは、プロピオンアルデヒドからプロピオニル−ＣｏＡへの酸化の触媒に関与する。Ｓ．エンテリカ、そのホモログであるアエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、クレブシエラ・ニューモニエ、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）およびポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）由来のＰｄｕＰは、それらの基質特異性について極めてプロミスカスであると示されている。それらは、Ｃ２−Ｃ１２アシル−ＣｏＡ分子を還元すると知られており、工程５Ｇの触媒に関連性がある。他の興味深い酵素としては、マロニル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｓ．トドカディ（ｔｏｄｏｋａｄｉｉ）［１２２］、他の古細菌［３，４］およびクロレフレクサス（ｃｈｌｏｒｅｆｌｅｘｕｓ）種［１，２］に見られるアナログ３−炭素二酸レダクターゼ（ここで、この酵素は、２つの部分（３−ヒドロキシプロピオネート生成に対してＣｏＡ−ＡＬＤＨおよびアルコールデヒドロゲナーゼ）に分割された）、クロストリジウム・クルイベリ由来のスクシニル−ＣｏＡレダクターゼ（類似の（ａｎａｌｏｇｕｓ）Ｃ４二酸）［１２３］およびＰ．ジンジバリスのｓｕｃＤ［１２４］、およびグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（類似のＣ５二酸）が挙げられる。サルモネラ・ティフィムリウムの５−ヒドロキシペンタナールプロピオニル−ＣｏＡレダクターゼに対する５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡの還元もまた報告されている（ＷＯ２０１０／０６８９５３Ａ２）。クロストリジウム・ベイジェリンキＢ５９３株由来のＡＬＤＨは、主にＮＡＤＨを使用して（しかしながらＮＡＤＰＨとも機能する）、ブチリル（ｂｕｒｔｙｒｙｌ）−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡからのブチルアルデヒドおよびアセトアルデヒドの形成を触媒すると示されているので、有望な候補である。アシネトバクターｓｐ．ＨＢＳ−２由来のＡｌｄｈもまた、ＮＡＤＨ依存的様式で反応を行うと示されている。ＢｐｈＪは、ＮＡＤＨの存在下において、アシル−ＣｏＡ（Ｃ２−Ｃ５）から対応するアルデヒドへの可逆的な還元を触媒する、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）汚染物質分解性細菌バークホルデリア・ゼノボランスＬＢ４００由来の非リン酸化ＣｏＡ依存性ＡＬＤＨである［１２５］。同種のデヒドロゲナーゼとしては、シュードモナスｓｐ．ＣＦ６００株由来の（ＤｍｐＧ）が挙げられる。他の候補としては、脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼ、例えば、Ｃ１８アシル−ＣｏＡまでのより長い鎖長に対して作用するシアノバクテリア由来のもの［１２６］が挙げられる。
Figure 0006680671
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工程５Ｊおよび５Ｉ：６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡから６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡへの変換（工程５Ｉ）および６−オキソヘキサノエートから６−アミノヘキサノエートへの変換（工程５Ｊ）
トランスアミナーゼ／アミノ酸デヒドロゲナーゼは、アミン供与体からアルデヒド受容体へのアミノ基の可逆的な転移を触媒する。トランスアミナーゼ／アミノ酸デヒドロゲナーゼによる、末端アミンである６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡ（工程４Ｇ１，図４）および６−アミノヘキサノエート（工程４Ｇ２，図４）からのそれぞれ６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡおよび６−オキソヘキサノエートへの脱アミノ化は、実施例ＩＶに記載されている。同じ酵素が、その反応を逆に行うために使用され得ることが理解される。生成物／基質の平衡状態は、正しい酵素ならびに反応条件を選択することによってコントロールされ得る。
（６．前駆体である６−アミノヘキサノエート（ａｍｉｎｏｈｅｘｎｏａｔｅ）および６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡを介したピルベートおよびＣ３アルデヒド（３−オキソプロピオネート、３−ヒドロキシプロパナールおよび３−アミノプロパナール）からのε−カプロラクタムの合成）
ε−カプロラクタム（ＣＰＬ）は、図５に示されているように、６−アミノ−ヘキサノイル−ＣｏＡの自発的環化（工程５Ｂ，図５）によって合成される。６−アミノ−ヘキサン酸経路（ＡＨＡ１、２、２２〜３４、表Ｂ）は、中間体として６−アミノ−ヘキサノイル−ＣｏＡを介して進み、その６−アミノ−ヘキサノイル−ＣｏＡが環化してε−カプロラクタムをもたらし得る。したがって、経路は、ε−カプロラクタムを生成するための経路でもある。６−アミノ−ヘキサノイル−ＣｏＡを６−アミノヘキサノエートに変換する工程４Ｆ５をこれらの経路から除去することは、６−アミノ−ヘキサノイル−ＣｏＡからε−カプロラクタムへの変換をより良好に可能にし得る（経路ＣＰＬ１〜１３，表Ｃ）。ε−カプロラクタムは、（Ｒｉｔｚ，Ｊ．，Ｈ．Ｆｕｃｈｓ，ｅｔ ａｌ．（２０００）．Ｃａｐｒｏｌａｃｔａｍ．Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ＆Ｃｏ．ＫＧａＡ）またはアミドヒドロラーゼによる６−アミノ−ヘキサン酸の環化（工程５Ａ，図５）によっても合成される。あるいは、６−アミノ−ヘキサン酸は、６−アミノ−ヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは６−アミノ−ヘキサン酸ＣｏＡ−リガーゼによって６−アミノ−ヘキサノイル−ＣｏＡにも変換され得（工程５Ｃ，図５）、その６−アミノ−ヘキサノイル−ＣｏＡが自発的に環化することにより、ε−カプロラクタムがもたられる。したがって、アミドヒドロラーゼ（工程５Ａ，図５）または６−アミノ−ヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたは６−アミノ−ヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼ（工程５Ｃ，図５）を、６−アミノ−ヘキサノイル−ＣｏＡ中間体を介して進まない、ピルベートおよびＣ３アルデヒド（３−オキソ−プロピオン酸、３−ヒドロキシ−プロパナールおよび３−アミノ−プロパナール）からの６−アミノ−ヘキサン酸の合成が可能である、実施例Ｖに記載されている経路（ＡＨＡ３〜２１、３５〜５９）に組み合わせることにより、ピルベートおよびＣ３アルデヒド（３−オキソ−プロピオン酸、３−ヒドロキシ−プロパナールおよび３−アミノ−プロパナール）からε−カプロラクタムを生成するための経路（ＣＰＬ経路，表Ｃ）がもたらされる。６−アミノヘキサノエートまたは６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡの第一級アミノ基が、ピルベートおよびＣ３アルデヒドからのＡＨＡ経路の任意の中間体（ｉｎｔｅｒｅｍｅｄｉａｔｅｓ）の合成中のそのような環化を防ぐためにアセトアミド基として保護されるとき、随意のＮ−脱アセチル化工程が必要であり得る。そのようなＮ−脱アセチル化（ｄｅａｃｔｅｙｌａｔｉｎｇ）酵素は、実施例ＩＶに記載されている。
これらの変換反応を触媒することができる例示的な酵素を下記に記載する：
ピルベートおよびＣ３アルデヒド（３−オキソプロピオネート、３−ヒドロキシプロパナールおよび３−アミノプロパナール）からのＡＨＡ経路は、実施例ＩＶ〜Ｖに記載された６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡ中間体の合成に至る工程を含むこれらの経路の各工程を触媒することができる酵素とともに実施例Ｖに記載されている。さらに、これらの中間体をＣＰＬに変換するために必要な酵素を下記に記載する。
工程５Ｃ：６−アミノヘキサノエートから６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡへの変換
逆（ｒｅｖｅｓｅ）反応、すなわち、６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡから６−アミノヘキサノエートへの変換（工程４Ｆ３，図４）を触媒するＣｏＡ−トランスフェラーゼおよびＣｏＡリガーゼは、実施例ＩＶに記載されている。これらの酵素の両方ともが、可逆的であるので、それらは、６−アミノヘキサノエートから６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡへの変換（工程５Ｃ）を行うために使用される。
工程５Ａ：６−アミノヘキサノエートからε−カプロラクタム（ＣＰＬ）への環化および工程５Ｂ：６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡの環化
アミド結合形成酵素、例えば、ペプチドシンターゼ（Ｍａｒｔｉｎ ＪＦ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５０：１−１５（１９９８））、ベータ−ラクタムシンターゼ（（Ｔａｈｌａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４８：９３０−９３９（２００４），Ｈａｍｅｄ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｐ．３０：２１−１０７（２０１３））、アミノシクラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．１４に属する）、Ｅ．Ｃ．３．５．２．１１に属するＬ−リジンラクタマーゼ、および環状アミドの形成を触媒すると知られている他の酵素（Ｅ．Ｃ．群３．５．２に属する）を使用する、６−アミノ−ヘキサン酸またはそのチオエステルバージョン（ＣｏＡエステル）。酸性および塩基性ｐＨもまた、ラクタムの自発的な形成を触媒する。６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡは、特に、自発的環化に適している。Ｌ−アルファ−アミノ−イプシロン−カプロラクタムからリジンを生成するために逆方向で機能すると示されている［１２７］、クリプトコッカス・ローレンティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）およびサルモネラ株由来のリジンラクタマーゼ（ヌクレオチド配列またはタンパク質配列は入手可能でない）が、特に興味深い。そのような酵素は、６−アミノヘキサノエートを環化するために使用され得る。６−アミノヘキサノエート環状二量体ヒドロラーゼは、６−アミノヘキサノエート二量体／三量体およびオリゴマー（ｏｌｏｇｏｍｅｒ）を６−アミノヘキサノエートに加水分解すると示されている。いくつかのそのような酵素が、文献において知られている［１２８］［１２９］［１３０］。例示的なＥ．Ｃ．群を下記の表に示すが、そのタンパク質候補がＣＰＬの合成について試験され得る（工程５Ａ）。
Figure 0006680671
（７．ピルベートおよびＣ３アルデヒド（３−オキソ−プロピオン酸および３−ヒドロキシ−プロパナール）からのアジピン酸合成経路の中間体からの６−ヒドロキシ−ヘキサン酸の合成）
ピルベートおよびＣ３アルデヒド（３−オキソプロピオネートおよび３−ヒドロキシプロパナール）から開始する複数のＡＤＡ経路が、実施例ＩＶ（図２〜４）に記載され、表Ａに列挙されており、それらの経路は、６−ヒドロキシヘキサノエート、または中間体、例えば、６−オキソヘキサノエート、６−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡおよびアジピル−ＣｏＡを介して先行し、この実施例に記載されるように６−ヒドロキシヘキサノエート（ＨＨＡ）に変換される。これらの中間体を６−ヒドロキシヘキサノエートに変換する酵素的工程と組み合わされる、これらの中間体の合成に至るＡＤＡ経路は、ピルベートおよびＣ３アルデヒド（３−オキソプロピオネートおよび３−ヒドロキシプロパナール）から６−アミノヘキサノエート（ＨＨＡ）を合成するための経路をもたらす。ピルベートおよびＣ３アルデヒド（３−オキソプロピオネートおよび３−ヒドロキシプロパナール）から６−ヒドロキシヘキサノエートを生成するためのそのような経路（表Ｄに列挙されているＨＨＡ経路）を、すべての経路の所望の各工程を行うために必要とされる酵素とともに下記に記載する。
ピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナールからの６−ヒドロキシヘキサノエートの合成
６−ヒドロキシヘキサノエート（ＨＨＡ）（４１，図４）は、上記の実施例ＩＶにおいて記載され、図２〜４に示されているような、ピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナールからアジピン酸を合成するための経路ＡＤＡ２８およびＡＤＡ３１における中間体（工程４Ｆ３の生成物，図４）である。ゆえに、経路ＡＤＡ２８およびＡＤＡ３１は、６−ヒドロキシヘキサノエートを合成するために使用することができる。しかしながら、これらの経路において６−ヒドロキシヘキサノエートをアジピン酸に変化するための工程を除去することにより、その生成に対して選択的である、ピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナールからの６−ヒドロキシヘキサン酸経路（経路ＨＨＡ−１および−２，表Ｄ）がもたらされる。
６−オキソ−ヘキサノエート（３９，図４）は、ピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナールからのアジピン酸合成経路（ＡＤＡ２７、２８、３０、３１、６５〜７５、８０〜８３、表Ａ、実施例ＩＶ）の中間体である。６−オキソ−ヘキサノエートをアジピン酸に変換する工程４Ｂ７（図４）を含めないことによって、これらの経路は、ピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナールからの６−オキソ−ヘキサノエートの合成に対して改変され、それは、６−オキソ−ヘキサン酸６−レダクターゼによって６−ヒドロキシヘキサノエートに変換される（工程５Ｋ，図５）。６−オキソヘキサノエートを介してピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナールから６−ヒドロキシヘキサノエートを合成するための対応する（ｃｏｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）経路（ＨＨＡ３〜３０）は、表Ｄに列挙されている。
さらに、６−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（３８，図４）は、ピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナールからのアジピン酸合成経路（ＡＤＡ２６、２９、４３〜５３、表Ａおよび実施例ＩＶ）の前駆体である。６−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（３８，図４）をアジピン酸に変換する工程４Ｂ６および４Ｆ１（図４）を含めないことによって、これらの経路は、ピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナールからの６−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡの合成に対して改変される。６−オキソ−ヘキサノイル−ＣｏＡは、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ６−レダクターゼによって６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡに還元され（工程５Ｌ，図５）、それはさらに、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡリガーゼまたは６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡヒドロラーゼによって６−ヒドロキシヘキサノエートに変換される（工程４Ｆ３，図５）ことにより、ピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナールからの６−ヒドロキシヘキサン酸合成経路がもたらされる。
ピルベートおよび３−オキソプロピオネートからの６−ヒドロキシヘキサノエートの合成
アジピル−ＣｏＡは、ピルベートおよび３−オキソプロピオネートからのアジペートの合成における中間体である（ＡＤＡ経路１〜２３，実施例ＩＶ）。これらの経路に工程４Ｆ１（図４）を含めないことにより、アジピル−ＣｏＡの合成が可能な経路がもたらされる。アジピル−ＣｏＡは、それがアジピル−ＣｏＡ１−レダクターゼによって６−オキソ−ヘキサノエートに変換された（工程５Ｇ，図５）後、上で述べたように６−ヒドロキシヘキサノエートに変換されることによって６−ヒドロキシヘキサノエートに変換される（ＨＨＡ５７〜７９）。アジピル−ＣｏＡおよび６−オキソヘキサノエート中間体を介してピルベートおよび３−オキソプロピオネートから６−ヒドロキシヘキサノエートを合成するための経路は、表Ｄに列挙されている。
これらの変換反応を触媒することができる例示的な酵素を下記に記載する：
各個別の工程を行うために必要とされる酵素を含む、ピルベートおよびＣ３アルデヒド（３−オキソプロピオネートおよび３−ヒドロキシプロパナール）から開始するＡＤＡ経路は、実施例ＩＶ（図２〜４）に記載されている。工程５Ｇの触媒に関与する酵素（５Ｇ）は、実施例Ｖにも記載されている。さらに、この実施例に記載されているような、これらの経路の中間体を６−ヒドロキシヘキサノエートに変換するために必要な酵素を下記に詳細に記載する。
工程５Ｌは、６−オキソヘキサノイル−ＣｏＡから６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡへの還元を含む。工程５Ｋは、６−オキソヘキサノエートから６−ヒドロキシヘキサノエートへの還元を含む。工程５Ｋおよび工程５Ｌのそれぞれの逆反応（工程４Ａ３および４Ａ４）は、これらの反応を触媒すると知られているかまたはこれらの反応を触媒するのに適した候補酵素とともに、実施例ＩＶに記載されている。アルコールデヒドロゲナーゼ（特に、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ）は、逆方向で機能すると見出されており、工程５Ｋを触媒すると示されている。同様に、先の実施例ＩＶに記載された他のアルコールデヒドロゲナーゼ候補もまた、本明細書中で必要に応じて、アルコールからアルデヒド（ａｌｄｈｅｈｙｄｅ）への酸化反応を触媒するために使用され得る。ある特定のアルデヒドレダクターゼは、アルデヒドの還元を支持する傾向があり、この反応を行うのに好ましい。
（８．６−ヒドロキシヘキサノエートおよび６−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡを介したピルベートおよびＣ３アルデヒドである３−ヒドロキシ−プロパナールからのε−カプロラクトンの合成）
ピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナールからのε−カプロラクトンの合成
ε−カプロラクトンは、ピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナールからの、先の実施例ＶＩＩに記載された任意の６−ヒドロキシヘキサン酸経路から合成される。６−ヒドロキシヘキサン酸またはそのチオエステルである６−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（実施例ＶＩＩにおけるピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナールからの６−ヒドロキシヘキサン酸経路の中間体）は、自発的なラクトン化を起こして、対応するε−カプロラクトンを形成し得る。酸性および中性のｐＨは、ラクトンの形成を支持する。経路ＨＨＡ３〜３０によって合成される６−ヒドロキシヘキサン酸は、直接（工程５Ｐ，自発的なラクトン化またはラクトン化酵素による処理によって，図５）（経路ＣＬＯ１〜３０）または６−ヒドロキシ−ヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼによってそれが６−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡに変換された（工程５Ｍ，図５）後、自発的なラクトン化またはラクトン化酵素による処理（工程５Ｑ，図５）（経路ＣＬＯ３１〜６０）によって、ε−カプロラクトンに変換される。さらに、６−ヒドロキシヘキサン酸経路ＨＨＡ１、ＨＨＡ２およびＨＨＡ３３〜５６は、６−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ中間体を介して進み、その中間体は、自発的なラクトン化またはラクトン化酵素による処理（それぞれ工程５Ｑ，図５）によってε−カプロラクトンに変換される。６−ヒドロキシヘキサノエート（ｈｙｈｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏａｔｅ））（ヒドロキシ酸）と比べて、６−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（ヒドロキシルエステル）の環化が容易であることに起因して、これらの経路における工程４Ｆ３（図５）を省略することにより、ε−カプロラクトンの収量が高まる。６−ヒドロキシヘキサン酸の酵素的ラクトン化（本明細書中で、その酵素はシクラーゼと称される）は、６−ヒドロキシヘキサン酸シクラーゼによって行われ得、６−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡの酵素的ラクトン化は、６−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡシクラーゼによって行われ得る。ラクトン化反応（工程５Ｐおよび５Ｑ）を行うと知られている例示的な酵素（本明細書中でシクラーゼと称される）としては、ラクトナーゼ、エステラーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１）、リパーゼ（ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５５５２４）（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）およびペプチダーゼ（ＷＯ／２００９／１４２４８９）が挙げられる。この変換反応を行う例示的な候補（ｃａｎｄｉｄｉａｔｅｓ）（下記の表に配列）は、シクロヘキサノン（ｃｙｃｌｃｏｈｅｎｘａｎｏｎｅ）分解性細菌由来のカプロラクトンヒドロラーゼ（ＣｈｎＣ）である［４８］［４７］。バレロラクトンを生成するために使用されるラクトナーゼ、ならびに広範な基質の周知のエステラーゼであるｃａｎｄｉｄａリパーゼもまた興味深い。さらに、工程５Ｍは、ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたはＣｏＡ−リガーゼによって触媒され得る。逆で（ｉｓ ｒｅｖｅｒｓｅ）この反応を行う（可逆的な反応）６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ−トランスフェラーゼおよびリガーゼは、実施例ＩＶに記載されている。下記のＥ．Ｃ．クラスに属するラクトナーゼもまた興味深い。上に記載されたような６−ヒドロキシヘキサン酸および／または６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡを介したピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナールからのε−カプロラクトン合成のための経路（ＣＬＯ１〜６９）は、表Ｅに列挙されている。
Figure 0006680671
Figure 0006680671
（９．６−ヒドロキシヘキサノエートおよび６−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡを介したピルベートおよびＣ３アルデヒド（３−ヒドロキシ−プロパナールおよび３−オキソプロピオネート）からの１，６−ヘキサンジオールの合成）
ピルベートおよび３−ヒドロキシプロパナールからの１，６−ヘキサンジオールの合成
１，６−ヘキサンジオールは、先の実施例ＶＩＩに記載された任意の６−ヒドロキシヘキサン酸経路（ピルベートならびにＣ３アルデヒドである３−ヒドロキシプロパナールおよび３−オキソプロピオネートからの）（ＨＨＡ１〜７９）から合成される。６−ヒドロキシヘキサン酸またはそのチオエステルである６−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ（実施例ＶＩＩにおける６−ヒドロキシヘキサン酸経路の中間体）は、図５に示されているように１，６−ヘキサンジオールに変換される（ｃｏｎｖｅｒｅｔｅｄ）。ＨＨＡ経路３〜３０（実施例ＶＩＩ，経路の中の最後の工程５Ｋ）の６−ヒドロキシヘキサン酸は、まず、６−ヒドロキシヘキサン酸６−レダクターゼ（工程５Ｒ，図５）によって直接（経路ＨＤＯ１〜２８，表Ｆ）またはそれが６−ヒドロキシ−ヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼによって６−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡに変換された後（工程５Ｍ，図５）、６−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ１−レダクターゼの還元（工程５Ｏ，図５）（経路ＨＤＯ２９〜５６）によって、６−ヒドロキシヘキサナールに変換される。６−ヒドロキシヘキサナールはさらに、６−ヒドロキシヘキサナール１−レダクターゼによって１，６−ヘキサンジオールに変換される（工程５Ｓ，図５）。さらに、残りの６−ヒドロキシヘキサン酸経路（最後の工程４Ｆ３を欠く）によって、６−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡが得られ、それは、前に述べたように１，６−ヘキサンジオールに変換される（工程５Ｏおよび５Ｓ，図５）（経路ＨＤＯ５７〜６９）。上に記載されたようなピルベートおよびＣ３アルデヒド（３−ヒドロキシプロパナールおよび３−オキソプロピオネート）からの１，６−ヘキサンジオール合成のための経路（ＨＤＯ１〜６９）を下記に列挙する。
これらの変換反応を触媒することができる例示的な酵素を下記に記載する：
各個別の工程を行うために必要とされる酵素を含む、ピルベートおよびＣ３アルデヒド（３−オキソプロピオネートおよび３−ヒドロキシプロパナール）から開始するＨＨＡ経路は、実施例ＶＩＩに記載されており、実施例ＶＩＩおよびＩＶにも記載されている。さらに、この実施例に記載されるようにこれらの経路の中間体を１，６−ヘキサンジオールに変換するために必要な酵素を下記に詳細に記載する。
工程５Ｒ：６−ヒドロキシヘキサナールへの６−ヒドロキシヘキサノエートの還元
このエネルギー大量消費の工程は、Ｅ．Ｃ．１．２．１−に属するカルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）によって触媒される。それらは、典型的には、例えば、リン酸化を介してブチレートをブタノールに還元するクロストリジウム・アセトブチリカムの系におけるように、カルボキシレートをリン酸エステルとして活性化した後、ＣｏＡ転移反応（ｒｅｃａｔｉｏｎ）を起こし、次いで、還元することによって機能する（これにより、これがエネルギー大量消費の経路となる）。ノカルジア・イオウェンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｉｏｗｅｎｓｉｓ）由来のＣＡＲは、ＡＴＰ／ＮＡＤＰＨ依存的形式で、一連の酸の還元を触媒する［１３１］。ＣＡＲは、ホスホパンテテイントランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）によって再活性化される（ｒｅａｃｔｉｖｉｖａｔｅｄ）必要がある。そのようなＰＰＴａｓｅおよびＣＡＲの例示的な配列を下記に示す。関連する他の酵素としては、アルファ−アミノアジペートをアミノアジピン酸セミアルデヒドに還元するアルファ−アミノアジピン酸レダクターゼ（ＡＡＲ，ＥＣ１．２．１．３１）が挙げられ、それは、発現されており、特徴づけられている。
Figure 0006680671
工程５Ｏ：６−ヒドロキシヘキサナールへの６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡの還元
そのような反応は、ＣｏＡ依存性アルコールデヒドロゲナーゼによって行われる。多くのそのような例示的な酵素は、実施例ＶＩに記載されている。多くの酵素が記載され、この反応を行うために使用され得るが、最も関連する酵素としては、同じ反応を行うが、非常によく似た基質に対するサルモネラ・ティフィムリウムのプロピオニル−ＣｏＡレダクターゼ（５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡから５−ヒドロキシペンタナールへの還元）が挙げられる。ヘキサノイル−ＣｏＡをヘキサナールに還元することを含む広範な基質特異性を示す他のプロピオニル−ＣｏＡレダクターゼのいずれもが、工程５Ｏを触媒する（ｃａｙａｌｚｅ）好適な候補である。
工程５Ｓ：６−ヒドロキシヘキサナールから１，６−ヘキサンジオールへの還元
そのような反応は、実施例ＩＶに記載されているように、アルデヒドレダクターゼ／アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒され得る。実施例ＩＶで述べられている酵素の多くが、この反応を行うことができるが、関連する酵素としては、１，４−ブタンジオールをもたらす４−ヒドロキシブチルアルデヒド（ｈｄｙｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｌｄｅｈｙｄｅ）レダクターゼが挙げられる。そのような酵素およびそれをコードする遺伝子は、工業用の１，４−ＢＤＯ産生株において報告されている［１３２］。アルコールデヒドロゲナーゼ（４ｈｂ）もまた、この反応を行うために使用され得る。この酵素もまた、工程５Ｏを触媒する好適な候補である。ヘキサナールに対して機能する他のアルデヒドレダクターゼもまた、好適な候補である。これらは、Ｅ．コリＡＤＨＥ、Ｓ．セレビシエＡＤＨ、特に、ＡＤＨ６［５２］およびＥ．コリｙｑｈＤ［４９］である。それらのタンパク質配列は、実施例ＩＶに見られる。
（１０．６−ヒドロキシヘキサノエート、６−ヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡおよび６−アミノプロパノール中間体を介したピルベートおよびＣ３アルデヒド（３−ヒドロキシ−プロパナール、３−アミノプロパナールおよび３−オキソプロピオネート）からのヘキサメチレンジアミンの合成）
ヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤＡ）は、ピルベートおよびＣ３アルデヒド（３−オキソ−プロピオン酸、３−ヒドロキシ−プロパナールおよび３−アミノ−プロパナール）からの先に記載された多くの経路から合成され得る。図５に示されているように、６−アミノ−ヘキサン酸（ＡＨＡ経路１〜２１、３５〜５９）がまず、６−アミノ−ヘキサン酸１−レダクターゼによって６−アミノ−ヘキサナールに還元され（工程５Ｖ，図５）、それがアミノ化されて（工程５Ｘ，図５）、ＨＭＤＡが得られる（６−アミノ−ヘキサナールトランスアミナーゼ（アミノ化）または６−アミノ−ヘキサナールデヒドロゲナーゼ（アミノ化）によってＨＭＤＡが得られる）。ＨＭＤＡ合成の別の経路は、実施例ＩＸの任意の１，６−ヘキサンジオール経路の中間体である６−ヒドロキシヘキサナールから開始する（図５）。６−ヒドロキシヘキサナールは、６−ヒドロキシヘキサナールトランスアミナーゼ（アミノ化）または６−ヒドロキシヘキサナールデヒドロゲナーゼ（アミノ化）によってアミノ化されて（工程５Ｔ，図５）、６−アミノプロパノールをもたらし、それが、６−アミノプロパノール１−デヒドロゲナーゼによって６−アミノプロパナールに酸化され（工程５Ｕ，図５）、それが上で述べたようにＨＭＤＡに変換される（工程５Ｘ，図５）。工程５Ｔ、５Ｕおよび５Ｘを、工程５Ｓ（６−ヒドロキシ（ｈｄｙｒｏｘｙ）プロパナールをＨＤＯに還元する）を欠く任意の１，６−ヘキサンジオール経路（ＨＤＯ１〜６９）に付け加えることにより、ピルベートおよびＣ３アルデヒドからのＨＭＤＡ経路がもたらされ得る（表Ｇ）。別の経路は、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼによる６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡから６−アミノヘキサナールへの変換（工程５Ｗ）を含む。６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡを中間体として用いる任意のＣＰＬ経路（ＣＰＬ６８〜１１９）は、工程５Ｗおよび５Ｘ（ＨＭＤＡ１１５〜１６７）を付け加えると、ＨＭＤＡ経路をもたらし得る。６−アミノ−ヘキサナールは、第一級アミンとアルデヒドとの間の反応によって環状イミン形成を起こし得る。これを防ぐために、アミノ基をアミド（アセトアミド）としてマスクすることにより、この環化が回避され得る。アセチルまたはスクシニル官能基を使用することによって、図５における６−アミノ−ヘキサナール前駆体である６−アミノ−ヘキサン酸または６−アミノヘキサノールの第一級アミンを保護することにより、そのような環化を防ぐことができる。保護基は、６−アセトアミドＨＭＤＡの合成が終わった後（工程５Ｘ，図５）に除去され得る。これにより、それぞれアセチラーゼおよびデアセチラーゼを使用したそのような保護基の付加および除去を含み得る２つのさらなる工程が追加される。Ｎ−アセチルトランスフェラーゼは、アセチル基をアミンに転移させて、アセトアミド部分を形成する。リジンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．３２）、グルタミン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＯＡＴ、ＥＣ２．３．１．３５およびＥＣ２．３．１．１）およびジアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．５７）は、第一級アミン基のアセチル化を行うために使用され得る。
これらの変換反応を触媒することができる例示的な酵素を下記に記載する：
各個別の工程を行うために必要とされる酵素を含む、ピルベートおよびＣ３アルデヒドから開始するＡＨＡおよびＨＤＯ経路が、上に記載されており、実施例ＩＶ〜ＩＸにも記載されている。さらに、この実施例に記載されているようにこれらの経路の中間体をＨＭＤＡに変換するために必要な酵素を下記で詳細に論じる。
工程５Ｔおよび工程５Ｘ：工程５Ｔおよび工程５Ｘはそれぞれ、６−ヒドロキシヘキサナールおよび６−アミノヘキサナールのアミノ化を含む。そのような反応は、トランスアミナーゼおよび／またはアミノ酸デヒドロゲナーゼによって行われ得、候補酵素は、実施例ＩＶに記載されている。末端アルデヒドのアミノ化は、Ｅ．Ｃ．２．６．１に属するＰＬＰ（ピリドキサールリン酸）依存性トランスアミナーゼによって触媒され得る。トランスアミナーゼは、アミノ酸、ヌクレオチドならびに小分子を含む一連の異なる供与体から末端アルデヒド基へのアミノ基の転移をＰＬＰ依存的様式で触媒する。工程５Ｘおよび工程５Ｔは、ジミノ（ｄｉｍｉｎｏ）トランスフェラーゼ、例えば、先の実施例ＩＶに記載されたものによって触媒され得る。工程５Ｘを触媒することができるそのようなジアミントランスアミナーゼ酵素は、Ｅ．コリにおいて実証されており（Ｋｉｍ，Ｋ．Ｈ．；Ｔｃｈｅｎ，Ｔ．Ｔ．；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７Ｂ，８１２−８１５（１９７１）、精製されており［１３３］、実施例ＩＶに列挙されている。シュードモナスの酵素、ｇａｂａ（ガンマ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ）、リジン６−アミノトランスフェラーゼ、リジンデヒドロゲナーゼ、および実施例ＩＶに記載されている他の候補を含む、Ｅ．Ｃ．２．６．１．２９に属する他のジアミントランスフェラーゼもまた、この反応を行うために有用である。
工程５Ｖ：６−アミノヘキサノエートから６−アミノヘキサナールへの還元。この工程は、カルボン酸レダクターゼによって行われ得る。この反応を行う例示的な酵素は、実施例ＩＸに記載されている。
工程５Ｕ：６−アミノヘキサノールから６−アミノヘキサナールへの酸化。Ｅ．Ｃ．１．１．１に属し、実施例ＩＶに記載されているアルコールデヒドロゲナーゼが、この反応を行うために使用され得る。具体的には、アルコールデヒドロゲナーゼが、６−アミノヘキサノールに構造的に類似している基質であるヘキサノールをヘキサナールに酸化し、この反応を行うと記載されており、この反応を行うのに適している。
工程５Ｗ：６−アミノヘキサノイル−ＣｏＡ（または６−アセトアミドヘキサノイル−ＣｏＡ）のＣｏＡ依存性還元を含む（Ｉｎｖｏｖｌｅｓ）。そのような反応は、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼによって行われる。この反応に関連する候補としては、広範な基質特異性を有する様々な（ｖａｉｏｕｓ）ｐｄｕＰプロピオニル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、５−ヒドロキシ−バレリル−ＣｏＡレダクターゼ、ならびに実施例ＩＶに記載されているようなヘキサノイル−ＣｏＡレダクターゼが挙げられる。
（１１．Ｃ３アルデヒドおよびピルベートからの１−ヘキサノールの合成）
この実施例では、ピルベートおよびプロパナールから１−ヘキサノールを合成するための経路およびその経路の各工程を触媒する酵素が記載される。
２−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡ中間体を介してピルベートおよび直鎖アルデヒドからアシル−ＣｏＡを合成するための一般的な循環的経路が、図６に示されている。示されている工程は、以下の変換反応に対応する：工程１：アルドール付加（アルドラーゼによって触媒される）、工程２：脱水（デヒドラターゼによって触媒される）、工程３：還元（エン−レダクターゼによって触媒される）、工程４：還元（第二級アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒される）、工程５：チオエステル形成（２−ヒドロキシ酸補酵素Ａ−トランスフェラーゼまたはリガーゼによって触媒される）、工程６：脱水（２−ヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒される）、工程７：還元（２，３−エノイルレダクターゼによって触媒される）、工程８：随意の還元（レダクターゼによって触媒される）。各伸長サイクル（工程１〜７）によって、開始時の直鎖アルデヒドが３炭素伸長する。ＣＮアルデヒド（Ｎ＝炭素数）から開始することにより、ＣＮ＋３ｘ炭素長（Ｎ＝開始時のアルデヒドにおける炭素の数およびｘ＝伸長サイクルの回数）であるアシル−ＣｏＡがもたらされる。
この変換反応のセットを使用する具体的な例が本明細書中に記載される。ピルベートおよびプロパナールを使用して１−ヘキサノールを合成するための例示的な経路が、図６に示されている。ピルベートおよびプロパナールから開始して、提案される経路を使用して１−ヘキサノールを合成するために含められる工程、および各工程を触媒し得る最も可能性が高い酵素候補を下記に記載する。
工程１：２−オキソ−４−ヒドロキシ−ヘキサン酸アルドラーゼによって触媒される、２−オキソ−４−ヒドロキシ−ヘキサン酸をもたらす、プロパナールへのピルベートのアルドール付加。クラスＩおよび／またはクラスＩＩの多くのピルビン酸アルドラーゼが、この反応を行うために使用される。例示的なアルドラーゼとしては、メタ切断経路からのものであるＢｐｈＩ、ＨｐａＩ、ＹｆａＵおよびＤｍｐＧが挙げられる。ＨｐａＩおよびＢｐｈＩは両方とも、この工程を触媒して、２−オキソ−４−ヒドロキシヘキサノエートを合成すると示されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４９（１７）：３７７４−３７８２（２０１０）；Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５０（１７）：３５５９−３５６９（２０１１）；Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３４（１）：５０７−５１３（２０１２）；Ｒｅａ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７（３８）：９９５５−９９６５（２０１８））。ＢｐｈＩは、ピルビン酸エノラートがアルデヒドのｒｅ面を攻撃することだけを可能にし、それにより、そのプロセスにおいて（４Ｓ）−アルドール産物を形成するので、非常に立体選択的である。対照的に、ＨｐａＩのより大きい基質結合部位は、その酵素が、代替の立体配座でアルデヒドに結合するのを可能にし、ラセミ生成物の形成をもたらす。そのような立体選択性またはそれを欠くことが、その経路における下流の酵素によるプロセシングにとって重要であり得る。
工程２：２−オキソ−４−ヒドロキシ−ヘキサン酸から２−オキソ−３−ヘキセン酸への脱水（２−オキソヘキサ−３−エン酸ヒドラターゼ）。多くの細菌におけるメタ切断経路からのヒドラターゼは、２−ヒドロキシ−アルキル−２，４−ジエノエートを対応する４−ヒドロキシ−２−ケト−アルカン酸に変換すると知られている。逆反応は、２−ヒドロキシ−アルキル−２，４−ジエノエートの合成に導き、それは、より安定な２−ケト−３−（Ｅ）−アルケン酸に互変異性化し得る。他の興味深いデヒドラターゼとしては、フマラーゼ、糖酸デヒドラターゼ、３−デヒドロ２−ケト酸デヒドラターゼなどが挙げられる。これらのデヒドラターゼ（ｄｅｈｙｒｄａｔａｓｅｓ）は、実施例ＩＶに記載されており、そこに記載されている多くのタンパク質が、この脱水を行うために使用される。
工程３：２−オキソ−３−ヘキセン酸から２−オキソ−ヘキサン酸への還元。活性化された二重結合の還元は、旧黄色酵素ファミリーのエン酸レダクターゼ、アルケナール−レダクターゼ（ＥＣ１．３．１．７４）、ならびにキノン−レダクターゼによって触媒され得る。多くのそのような酵素が、実施例ＩＶに記載されている。この変換反応に関連する酵素としては、一連の直鎖および環状α，β不飽和ケトンおよびアルデヒドを還元すると示されている、シュードモナス・プチダ由来のＸｅｎＡ、クルイヴェロマイセス・ラクティス由来のＫＹＥ１およびエルシニア・ベルコビエリ由来のＥＲが挙げられる。酵母由来のＯＹＥもまた興味深い。
工程４：２−オキソ−ヘキサン酸から２−ヒドロキシ−ヘキサン酸への還元（２オキソヘキサン酸−２−レダクターゼ）：ケトンから第二級アルコールへの還元を触媒するいくつかの第二級アルコールデヒドロゲナーゼが、所望の基質に対するそれらの活性を評価するために出発点として働き得る。典型的には、キノン（ＱＨ２）依存性デヒドロゲナーゼ、還元型フェリシトクロム依存性デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性デヒドロゲナーゼ、ＦＭＮＨ２依存性デヒドロゲナーゼ、ＦＡＤＨ２依存性デヒドロゲナーゼが、２−ケトヘキサノエートを２−ヒドロキシヘキサノエートに位置選択的に還元するために使用され得る。理想的な酵素は、Ｃ−２ケト基を２（Ｒ）または２（Ｓ）異性体に選択的に還元することができるべきである。乳酸デヒドロゲナーゼが、この反応にとって好ましいが、第二級アルコールデヒドロゲナーゼもまた、この変換反応を行うために使用することができる。Ｃ．ディフィシル由来のＬｄｈＡは、２−ケトヘキサノエートから２−（Ｒ）−ヒドロキシヘキサノエートへの還元をＮＡＤＨ依存的様式で触媒すると示されているＮＡＤ＋依存性（Ｒ）−２−ヒドロキシイソカプロン酸デヒドロゲナーゼである。これらのタンパク質の例示的な配列は、実施例ＩＶに示されている。
工程５：２−ヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは２−ヒドロキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼによる２−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡの形成：Ｃ．ディフィシルにおけるロイシン発酵の酸化的分岐の一部である２−ヒドロキシイソカプロン酸ＣｏＡトランスフェラーゼであるＨａｄＡは、Ｃ６化合物、例えば、２（Ｒ）−ヒドロキシイソカプロエート（ｈｙｄｒｏｘｙｓｏｃａｐｒｏａｔｅ）、イソカプロエートおよび２（Ｅ）−イソカプレノエートへのＣｏＡ分子の可逆的な結合を触媒すると示されている。それがＣ．ディフィシル由来のＬｄｈＡの隣りに位置するという事実とともに、２−（Ｒ）−ヒドロキシヘキサノエートに構造的に関係するＣ６化合物に対するその活性（上記を参照のこと）は、その酵素をこの反応を触媒するための主要な候補にする。アシダミノコッカス・フェルメンタンス由来のグルタコン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ｇｃｔＡＢ）は、種々のＣｏＡ供与体、例えば、アセチル−ＣｏＡおよびグルタコニル−ＣｏＡを使用して、補酵素Ａ部分を２−（Ｒ／Ｓ）−ヒドロキシグルタレートの両方のＲ／Ｓ異性体ならびに２−（Ｒ）−ヒドロキシアジペートに転移すると示されている。これらのタンパク質の例示的な配列は、実施例ＩＶに示されている。
工程６：２−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡデヒドラターゼによる２−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡからヘキセノイル−ＣｏＡへの脱水：２−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１）は、２−ヒドロキシアシル−ＣｏＡから（Ｅ）−２−エノイル−ＣｏＡへの可逆的な脱水を触媒する。それらは、２−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡから２，３−デヒドロヘキサノイル−ＣｏＡへの脱水を触媒するために使用され得る。２−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、他のラジカルＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオン）依存性酵素と比べて、ラジカル生成の非常に異なる方法に適用される。これらの酵素では、一電子還元または一電子酸化によってケチルラジカルが形成され、そのケチルラジカルは、各ターンオーバーの後にさらなるエネルギーの投入無しに再利用される。これらの酵素は、ＡＴＰの加水分解によって駆動される鉄−硫黄タンパク質（フェレドキシンまたはフラボドキシン）からの一電子移動による活性化を必要とする。この酵素は、非常に酸素感受性であり、活性化のために活性化タンパク質を必要とする。クロストリジウム・シンビオスム由来の２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ｈｇｄＣ＋ｈｇｄＡＢ）は、２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡおよび２−ヒドロキシ−５−ケトアジピル−ＣｏＡを脱水して、それぞれ２，３−（Ｅ）−デヒドロアジピル−ＣｏＡおよび２，３−（Ｅ）−デヒドロ−５−ケトアジピル−ＣｏＡをもたらすと示されている。このデヒドラターゼの比較的広範な特異性を所与とすると、それは、２−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡの脱水を触媒するはずである。これらのタンパク質の例示的な配列は、実施例ＩＶに示されている。
工程７：エノイル−レダクターゼ（ヘキセノイル−ＣｏＡ２−レダクターゼ）によるヘキセノイル−ＣｏＡからヘキサノイル−ＣｏＡへの還元：
オキシドレダクターゼのスーパーファミリーに属し、すべての生物に遍在的に存在するエノイル−ＣｏＡレダクターゼは、補因子としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用して、エノイル−ＣｏＡからアシル−ＣｏＡへの還元を通常は可逆的な動態で触媒する。ユーグレナ・グラシリスおよびＴ．デンティコラにおいて同定されたＴｒａｎｓ−２−エノールＣｏＡレダクターゼ（ＴＥＲ）は、補因子としてＮＡＤＨを使用し、Ｃ６チオエステル、例えば、ｔｒａｎｓ−２−ヘキセノイル−ＣｏＡの還元に対して中程度の活性を示す。ＮＡＤＰＨ依存性ヒトペルオキシソームＴＥＲは、４〜１６個の炭素原子の鎖長の範囲のアシル−ＣｏＡに対して活性を示した。これらのタンパク質の例示的な（Ｅｘｍｐｌａｒｙ）配列は、実施例ＩＶに示されている。
工程８：ヘキサノイル−ＣｏＡからヘキサナールへの還元（ヘキサノイル−ＣｏＡ１−レダクターゼ）および工程９：ヘキサナールから１−ヘキサノールへの還元（ヘキサノールデヒドロゲナーゼ）
ヘキサノイル−ＣｏＡは、ＮＡＤＨ依存性反応において、ＡｄｈＥ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＫ０９３７９．１）によって、１−ヘキサノールに２回還元され得る。Ｃ．アセトブチリカム由来のＡｄｈＥ２は、この反応を触媒すると示されている。あるいは、別個の補酵素Ａ依存性レダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼが、より高い特異性でこの反応を行うために使用され得る。その経路の次の工程は、アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されるヘキサナールから１−ヘキサノールへの還元である。トマト短鎖デヒドロゲナーゼＳｌｓｃＡＤＨ１［２８］は、プロパナールに対する活性無しに、ヘキサナールを選択的に還元すると示されている。ＳｌｓｃＡＤＨ１は、１−ヘキサノール酸化に対して、ヘキサナールの還元を＞４０倍も支持する。その酵素は、補因子としてＮＡＤＨを好むが、ＮＡＤＰＨもそれほど効率的ではないが使用し得る。オリーブ果実（ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐｅａ）由来のＮＡＤＰＨ依存性アルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨＩもまた、ヘキサナールを選択的に還元すると示されている。
（１２．ピルベートおよび直鎖アルデヒドから開始する７〜２５炭素長の脂肪酸の合成）
脂肪酸を合成するための循環的経路が、図６に示されている。図６に示されている脂肪酸合成経路は、各サイクルに８つの工程を含む循環的経路であり、各サイクルが完了すると３炭素伸長する。脂肪酸合成は、伸長単位としてピルベートを用いて、規定の長さの直鎖アルデヒド（ＣＮアルデヒド，ここでＮ＝アルデヒド炭素鎖の長さ）から始まる。各伸長サイクルが完了すると、直鎖アルデヒドが合成される（ＣＮ＋３ｘ，ここでＮ＝開始時のアルデヒド炭素鎖の長さであり、ｘ＝完了した伸長サイクル数である）。下記の表に示されるように、開始時のアルデヒドの鎖長および伸長サイクル数をコントロールして、７〜２５炭素長の範囲の一連の異なる直鎖アルデヒドが合成され得る。その直鎖アルデヒドを酸化すると、対応する脂肪酸が合成されるとともに、脂肪酸の生合成が終了する。そのような各反応を触媒し得るいくつかの生化学的に特徴づけられた候補が、上記および実施例ＩＶに記載されている。さらに、これらの酵素の多くが、広範な基質特異性を有し、これらの工程の触媒により関連する。そのような各工程を触媒し得る一般的なクラスの酵素およびそれらが属するＥ．Ｃ．クラスを下記に記載する。
Figure 0006680671
工程１：４−ヒドロキシ−２−オキソ−カルボン酸をもたらす直鎖アルデヒドへのピルベートのアルドール付加。この反応は、クラスＩ／ＩＩピルビン酸依存性アルドラーゼによって触媒され得る。２−デヒドロ−３−デオキシ−グルカル酸アルドラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．１．２．２０，ＫＤＧアルドラーゼ）、２−デヒドロ−３−デオキシ−ホスホグルコン酸アルドラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．１．２．１４，ＫＤＰＧアルドラーゼ）、２−デヒドロ−３−デオキシ−ホスホガラクトン酸アルドラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．１．２．２１）、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソ−グルタル酸アルドラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．１．３．１７）、４−ヒドロキシ−２−オキソ−グルタル酸アルドラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．１．３．１６）および４−ヒドロキシ−２−オキソ−吉草酸アルドラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．１．３．３９）が、特に興味深く、これらは、アルデヒドへのピルベートの可逆的なアルドール付加を触媒するために使用され得る。これらの酵素は、現代タンパク質工学アプローチ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｈａｎｄｂｏｏｋ；Ｌｕｔｚ Ｓ．，＆ Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ Ｕ．Ｔ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧａＡ：２００８；Ｖｏｌ．１＆２）を使用して、所望の基質に対して活性であるように操作され得る。そのような操作（定向進化、合理的な突然変異誘発、コンピュータによるデザインまたはそれらの組み合わせを使用する）としては、ピルベートおよび受容体アルデヒドに対する所望の基質特異性を達成すること、立体選択性をコントロールしてエナンチオピュアな生成物またはラセミ生成物を合成すること、半減期、熱安定性、阻害剤／生成物耐性のような工業プロセス条件に耐えるために酵素を安定化すること、ならびに所望の最適な微生物生産宿主における酵素の発現および溶解性を改善することが挙げられ得る。
芳香族のメタ切断経路に関わるピルビン酸アルドラーゼであるＨｐａＩ、ＹｆａＵおよびＢｐｈＩが、特に興味深い（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４９（１７）：３７７４−３７８２（２０１０）；Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５０（１７）：３５５９−３５６９（２０１１）；Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３４（１）：５０７−５１３（２０１２）；Ｒｅａ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７（３８）：９９５５−９９６５（２０１８））。ＢｐｈＩは、ピルビン酸エノラートがアルデヒドのｒｅ面を攻撃することだけを可能にし、それにより、そのプロセスにおいて（４Ｓ）−アルドール産物を形成するので、非常に立体選択的である。対照的に、ＨｐａＩのより大きい基質結合部位は、その酵素が、代替の立体配座でアルデヒドに結合するのを可能にし、ラセミ生成物の形成をもたらす。そのような立体選択性またはそれを欠くことが、その経路における下流の酵素によるプロセシングにとって重要であり得る。
工程２：３，４−デヒドロ−２−オキソ−カルボン酸をもたらす４−ヒドロキシ−２−オキソ−カルボン酸の脱水。上で論じたように、フマラーゼ、エノラーゼおよび／もしくはクロトナーゼスーパーファミリーのデヒドラターゼまたはタンパク質工学によって得られる変異体が、この反応を触媒するために使用され得る。具体的には、両方のエナンチオマー（４Ｓ／４Ｒ）またはいずれかのエナンチオマーが、その脱水を行うためにその酵素によって使用され得る。Ｅ．Ｃ．４．２．１に属する他のデヒドラターゼもまた、この反応を行うために使用することができる。
工程３：２−オキソ−カルボン酸をもたらす３，４−デヒドロ−２−オキソ−カルボン酸の還元。上で論じたように、活性化された二重結合の還元は、旧黄色酵素ファミリーのエン酸レダクターゼ、アルケナール−レダクターゼ、エノイル−レダクターゼ（ＥＣ１．３．１．７４）、ならびにキノン−レダクターゼによって触媒され得る。
工程４：２−オキソ−カルボン酸から２−ヒドロキシ−カルボン酸への還元。上で論じたように、ケトンから第二級アルコールへの還元を触媒する第二級アルコールデヒドロゲナーゼは、この反応を行う好適な酵素として働き得る。典型的には、キノン（ＱＨ２）依存性デヒドロゲナーゼ、還元型フェリシトクロム依存性デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性デヒドロゲナーゼ、ＦＭＮＨ２依存性デヒドロゲナーゼ、ＦＡＤＨ２依存性デヒドロゲナーゼが、この還元を行うために使用され得る。乳酸デヒドロゲナーゼが、この反応にとって好ましいが、第二級アルコールデヒドロゲナーゼもまた、この変換反応を行うために使用することができる。示される。
工程５：２−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡをもたらす２−ヒドロキシ−カルボン酸への補酵素Ａ分子の転移。補酵素Ａ結合工程は、Ｅ．Ｃ．６．２．１−群に属するアシル−ＣｏＡシンターゼまたはリガーゼによって触媒され得る。この群に属する酵素は、遊離ＣｏＡ分子を使用してＣｏＡエステルの形成をＡＴＰ依存的様式で触媒すると知られている。あるいは、Ｅ．Ｃ．２．８．３群に属するＣｏＡトランスフェラーゼもまた、ＣｏＡ供与体としてアシル−ＣｏＡを使用して、経路中間体へのＣｏＡ分子の可逆的な結合を触媒し得る。
工程６：２−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡから２，３−デヒドロ−アシル−ＣｏＡへの脱水。２−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１）は、２−ヒドロキシアシル−ＣｏＡから（Ｅ）−２−エノイル−ＣｏＡへの可逆的な脱水を触媒する（Ｂｕｃｋｅｌ，ｅｔａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１８２４（１１）：１２７８−１２９０（２０１１））。それらは、この脱水を触媒するために使用され得る。これらの酵素は、ＡＴＰの加水分解によって駆動される鉄−硫黄タンパク質（フェレドキシンまたはフラボドキシン）からの一電子移動による活性化を必要とする。この酵素は、非常に酸素感受性であり、活性化のために活性化タンパク質を必要とする。
工程７：２，３−デヒドロ−アシル−ＣｏＡからアシル−ＣｏＡへの還元。上で論じたように、活性化された二重結合の還元は、旧黄色酵素ファミリーのエン酸レダクターゼ、アルケナール−レダクターゼ、エノイル−レダクターゼ（ＥＣ１．３．１．７４）、ならびにキノン−レダクターゼによって触媒され得る。フラビンメディエーターの非存在下においてエノイル−ＣｏＡからアシル−ＣｏＡへの還元を触媒するエノイル−ＣｏＡレダクターゼは、クロトニル−ＣｏＡ還元工程において速度論的トラップを効果的に導入することによってＥ．コリにおけるｎ−ブタノール合成経路を通じてフラックスを駆動すると示されている［Ｂｏｎｄ−Ｗａｔｔｓ，Ｂ．Ｂ．，Ｒ．Ｊ．Ｂｅｌｌｅｒｏｓｅ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１１，７（４）：２２２−２２７］。Ｔ．デンティコラ由来のＴｒａｎｓ−２−エノイルＣｏＡレダクターゼ（ＴＥＲ）は、複数の炭素長のｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡに対して非常に活性であるので、この還元を触媒する有望な候補である［Ｂｏｎｄ−Ｗａｔｔｓ，Ｂ．Ｂ．，Ａ．Ｍ．Ｗｅｅｋｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５１（３４）：６８２７−６８３７］。同様に、ユーグレナ・グラシリス由来のＴＥＲもまた、補因子としてＮＡＤＨを使用し、Ｃ６チオエステル、例えば、ｔｒａｎｓ−２−ヘキセノイル−ＣｏＡの還元に対して中程度の活性を示すと示されている［Ｄｅｋｉｓｈｉｍａ Ｙ，Ｌａｎ ＥＩ，Ｓｈｅｎ ＣＲ，Ｃｈｏ ＫＭ，Ｌｉａｏ ＪＣ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２０１１，１３３（３０）：１１３９９−１１４０１］。ＮＡＤＰＨ依存性ヒトペルオキシソームＴＥＲは、４〜１６個の炭素原子の鎖長の範囲のアシル−ＣｏＡに対して活性を示した［Ｇｌｏｅｒｉｃｈ Ｊ，Ｒｕｉｔｅｒ ＪＰＮ，Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｉｎｋ ＤＭ，Ｏｆｍａｎ Ｒ，Ｆｅｒｄｉｎａｎｄｕｓｓｅ Ｓ，Ｗａｎｄｅｒｓ ＲＪＡ．Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００６，５８０（８）：２０９２−２０９６］。すべてのＴＥＲに対する結晶構造が利用可能であることは、この酵素の基質特異性を必要に応じて変更するためのタンパク質工学研究に役立ち得る。
工程８：アシル−ＣｏＡからアルデヒドへの還元。アシル−ＣｏＡからアルデヒドへの変換は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを使用して、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼまたはオキシドレダクターゼによって触媒され得る。アルデヒドは、細胞生体分子を改変し得るので、有毒な反応性の化合物である。アルドラーゼ−デヒドロゲナーゼ複合体は、デヒドロゲナーゼからアルドラーゼへのおよびその逆の揮発性アルデヒド産物の直接チャネリング（ｄｉｒｅｃｔ ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ）によって、これらの有害な分子の隔離を可能にする。ＢｐｈＪは、ＮＡＤＨの存在下において、アシル−ＣｏＡから対応するアルデヒドへの可逆的な還元を触媒する、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）汚染物質分解性細菌バークホルデリア・ゼノボランスＬＢ４００由来の非リン酸化ＣｏＡ依存性ＡＬＤＨである［Ｂａｋｅｒ Ｐ，Ｃａｒｅｒｅ Ｊ，Ｓｅａｈ ＳＹ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１２，５１（２２）：４５５８−４５６７．］。ＢｐｈＪは、アルドラーゼであるＢｐｈＩと安定した複合体を形成する（上記を参照のこと）。そのようなピルビン酸アルドラーゼ−デヒドロゲナーゼ複合体は、工程１に加えて、工程８を行うために使用され得る。
工程９：鎖伸長の終結。成長中の炭素鎖は、工程８の終わりに（脂肪アルデヒドの酸化によって、図７ 工程８Ｅ）または工程７の終わりに（アシル−ＣｏＡのエステル交換（ｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆａｃａｔｉｏｎ）または加水分解によって、図７ 工程８Ｃ）終結されて、脂肪酸をもたらし得る（図７）。直鎖アルデヒドから対応するカルボン酸への酸化は、Ｅ．Ｃ１．２．１．３、Ｅ．Ｃ．１．２．１．４、Ｅ．Ｃ．１．２．１．５、Ｅ．Ｃ．１．２．１．８、Ｅ．Ｃ１．２．１．１０、Ｅ．Ｃ．１．２．１．２４、Ｅ．Ｃ．１．２．１．３６、Ｅ．Ｃ．１．２．３．１、Ｅ．Ｃ．１．２．７．５、Ｅ．Ｃ．１．２．９９．３、Ｅ．Ｃ１．２．９９．６およびＥ．Ｃ１．２．９９．７に属する任意のアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドオキシドレダクターゼを使用することによって、酵素的に行われ得る（Ｈｅｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２（１１）：１８９０−１９００（１９９３）；Ｓｏｐｈｏｓ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍｉｃｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ １４３：５−２２（２００３）；ＭｃＩｎｔｉｒｅ ＷＳ，Ｆａｓｅｂ Ｊｏｕｒｎａｌ ８（８）：５１３−５２１（１９９４）；Ｇａｒａｔｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ６５（７−８）：１０１９−１０４８（２００８））。典型的には、キノン依存性デヒドロゲナーゼ、フェリシトクロム依存性デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）依存性デヒドロゲナーゼ、ＦＭＮ依存性デヒドロゲナーゼ、ＦＡＤ依存性デヒドロゲナーゼが、使用される。あるいは、Ｅ．Ｃ．２．８．３群に属するＣｏＡトランスフェラーゼもまた、ＣｏＡ受容体として他のカルボン酸を使用して、アシル−ＣｏＡからのＣｏＡ分子の可逆的な除去を触媒し得る。Ｅ．Ｃ．３．１．２群に属するチオエステラーゼは、経路中間体のＣｏＡ誘導体から（図７）それらの対応する遊離カルボン酸バージョンへの加水分解を触媒するために使用され得る。所望の鎖長の基質に対して特異性を示す酵素（天然の脂肪酸生合成におけるチオエステラーゼに類似）を選択するかまたは操作することによって、所望の鎖長の脂肪酸の合成を操作することができる。例えば、３つのチオエステラーゼが、一連の中鎖アシル−ＡＣＰを加水分解することができると示されている［Ｂｒｙａｎｔｅｌｌａ ｆｏｒｍａｔｅｘｉｇｅｎｓ由来のＢｆＴＥＳ、ＣｐＦａｔＢ１およびＵｃＦａｔＢ２（Ｔｏｒｅｌｌａ ＪＰ．，ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ２０１３／０６／２４，１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３０７１２９１１０］。あるいは、一連の異なるアシル−ＣｏＡ分子に対して基質特異性を有する多くの哺乳動物チオエステラーゼが知られており［Ｋｉｒｋｂｙ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，４９（４）３６６−３７７］、それらも使用することができる。
（１３．セバシン酸およびドデカン二酸（ｄｏｄｅｃａｎｅｄｉｏｃ ａｃｉｄ）の合成）
セバシン酸は、１０炭素長のジカルボン酸であり、上に記載された脂肪酸生合成経路を使用して合成され得る（図６／７に示されている）。ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼを使用して、ＴＣＡサイクルのユビキタス代謝産物であるスクシニル−ＣｏＡから合成され得るコハク酸セミアルデヒド（Ｃ４アルデヒド）が、出発直鎖アルデヒドであり、供与体としてピルベートを用いて２回連続した伸長サイクルを経ると、セバシン酸セミアルデヒドが生成され、それが、アルデヒドデヒドロゲナーゼを使用して、上に記載されたようにセバシン酸に酸化され得る。同様に、合成を終結する、アルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒される酸化とともに、出発直鎖アルデヒドとして３−オキソ−プロピオン酸を使用すること、およびピルベートを用いて３回連続した伸長サイクルを使用することにより、生成物としてドデカン二酸がもたらされる。直鎖アルデヒドから対応するカルボン酸への酸化は、Ｅ．Ｃ１．２．１．３、Ｅ．Ｃ．１．２．１．４、Ｅ．Ｃ．１．２．１．５、Ｅ．Ｃ．１．２．１．８、Ｅ．Ｃ１．２．１．１０、Ｅ．Ｃ．１．２．１．２４、Ｅ．Ｃ．１．２．１．３６、Ｅ．Ｃ．１．２．３．１、Ｅ．Ｃ．１．２．７．５、Ｅ．Ｃ．１．２．９９．３、Ｅ．Ｃ１．２．９９．６およびＥ．Ｃ１．２．９９．７に属する任意のアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドオキシドレダクターゼを使用することによって酵素的に行われ得る（Ｈｅｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２（１１）：１８９０−１９００（１９９３）；Ｓｏｐｈｏｓ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍｉｃｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ １４３：５−２２（２００３）；ＭｃＩｎｔｉｒｅ ＷＳ，Ｆａｓｅｂ Ｊｏｕｒｎａｌ ８（８）：５１３−５２１（１９９４）；Ｇａｒａｔｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ６５（７−８）：１０１９−１０４８（２００８））。典型的には、キノン依存性デヒドロゲナーゼ、フェリシトクロム依存性デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）依存性デヒドロゲナーゼ、ＦＭＮ依存性デヒドロゲナーゼ、ＦＡＤ依存性デヒドロゲナーゼが使用される。
（１４．脂肪酸および脂肪アルデヒドからの脂肪アルコール、アルケンおよびアルカンの合成）
脂肪アルデヒドおよび脂肪酸からの脂肪アルコールの合成
脂肪アルコール（Ｃ７−Ｃ２５）は、ピルベートおよび直鎖アルデヒドから開始して脂肪酸（Ｃ７−Ｃ２５）を合成することができる先に記載された任意の経路から合成され得る。鎖終結は、第一級アルコールデヒドロゲナーゼを使用して、脂肪アルデヒド（図６における工程８の生成物）を脂肪アルコールに還元することによって行われ得る（図７）。第一級アルコールからアルデヒドへの酸化を触媒するいくつかの第一級アルコールデヒドロゲナーゼが、所望の脂肪アルデヒドから対応するアルコールへの還元に対する活性を評価するために出発点として働き得る（Ｒａｄｉａｎｉｎｇｔｙａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｅｍｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２７（５）：５９３−６１６（２００３）；ｄｅ Ｓｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ，Ｆｅｍｓ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８（７）：９６７−９７８；Ｒｅｉｄ ｅｔ ａｌ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０：１３−５６（１９９４）；Ｖｉｄａｌ Ｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｍａｕｒｙ Ｌ，Ｇｕｅｒｒｅｒｏ ＭＧ，Ｆｌｏｒｅｎｃｉｏ ＦＪ（２００９）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９１（１３）：４３８３−４３９１．）。典型的には、キノン依存性デヒドロゲナーゼ、フェリシトクロム依存性デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）依存性デヒドロゲナーゼ、ＦＭＮ依存性デヒドロゲナーゼ、ＦＡＤ依存性デヒドロゲナーゼが使用され得る。
脂肪アルコール合成のための別の方法としては、脂肪酸の還元が挙げられ、それは、複数の方法で行われ得る。その還元は、Ｐｔ／Ｈ２、ＬｉＡｌＨ４、ホウ水素化物、または文献において公知の他の方法を用いて化学的にも行われ得る。脂肪酸は、カルボン酸レダクターゼによって脂肪アルデヒドに還元された後、先に記載された第一級アルコールデヒドロゲナーゼを使用して脂肪アルコールにも還元され得る。Ｅ．Ｃ．１．２．９９．６に属するカルボン酸レダクターゼは、補因子として還元型ビオロゲンを使用して、ヘキサン酸からヘキサナールへの還元を行うために使用され得る。マイコバクテリウム・マリヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｍａｒｉｎｕｍ）由来のカルボン酸レダクターゼ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｂ２ＨＮ６９、ＣＡＲ）は、補因子としてＮＡＤＰＨを使用して脂肪酸（Ｃ６−Ｃ１８）から脂肪アルデヒドへの変換を触媒すると示されている（Ａｋｈｔａｒ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１３：８７−９２．）。
脂肪アルデヒドからの末端アルカンの合成
アルカン（Ｃ６−Ｃ２４）は、ピルベートおよび直鎖アルデヒドから開始する、脂肪アルデヒド（上に記載され、図７に示されている脂肪酸経路の中間体）または酸（Ｃ７−Ｃ２５）を合成することができる先に記載された任意の経路から合成され得る。アルカン生合成は、脂肪アルデヒドからギ酸およびアルカンへの脱カルボニルを触媒するためにアルデヒドデカルボニラーゼ（図７，工程７Ｄ）を必要とする［Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｌｋａｎｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２９，５５９−５６２（２０１０）］。そのような２つのアルデヒドデカルボニラーゼ遺伝子（遺伝子アクセッション番号ＹＰ４０００６１０およびＺＰ０１０８０３７０）が、同定され、シネココッカスｓｐ．からこの反応を行うと生化学的に特徴づけられている［Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｌｋａｎｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２９，５５９−５６２（２０１０）］。これらの酵素またはこれらの配列の同種の酵素もまた、この工程を行うために使用することができる。
脂肪酸からの末端アルケンの合成
アルケン（Ｃ６−Ｃ２４）は、ピルベートおよび直鎖アルデヒドから開始する、脂肪酸（Ｃ７−Ｃ２５）を合成することができる先に記載された任意の経路から合成され得る（図７，工程７Ｇ）。末端アルケンの生合成のための経路は、少なくとも２つ存在する。第１の経路は、脱炭酸的酸化を触媒して、脂肪酸を末端アルケンに変換するシトクロムＰ４５０酵素（遺伝子アクセッション番号ＨＱ７０９２６６）を使用する［Ｒｕｄｅ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７７，１７１８−１７２７（２０１１）］。第２の経路は、ポリケチドシンターゼを含み、スルホン化によって助けられる脱炭酸を介して末端アルケンを生成する［Ｍｅｎｄｅｚ−Ｐｅｒｅｚ，Ｄ．，Ｂｅｇｅｍａｎｎ，Ｍ．Ｂ．＆ Ｐｆｌｅｇｅｒ，Ｂ．Ｆ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７７，４２６４−４２６７（２０１１）］（遺伝子アクセッション番号ＹＰ００１７３４４２８．１）。これらの酵素またはこれらの配列の同種の酵素もまた、この工程を行うために使用することができる。
（１５ ピルベートおよびＣ３アルデヒドである３−オキソプロピオネートをアジペートに変換するための経路を有するアジピン酸生成微生物生物の作製）
ピルベートおよび３−オキソプロピオネートから開始する図３〜４に示されているアジピン酸経路（ＡＤＡ経路８、２Ａ、３Ｂ１、３Ｃ２、３Ｄ２、３Ｅ２、３Ｆ２、３Ｇ５、４Ｄ３、４Ｅ３、４Ｆ１）を操作する標的生物として、エシェリヒア・コリを使用する。この経路からアジペートを生成することができるＥ．コリを作製するために、この経路の各個別の酵素をコードする核酸をクローニングし、Ｅ．コリにおいて発現させる。特に、ｈｐａＩ（ＹＰ＿００６１２７２２１．１）４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸アルドラーゼ、ｌｄｈＡ（ＡＡＡ２２５６８．１．）４−ヒドロキシ−２−オキソ−アジピン酸２−レダクターゼおよびＳｃＡＤＨ（ＡＡＡ３４４０８）２，４−ジヒドロキシアジピン酸４−デヒドロゲナーゼを、Ｔ７プロモーターの支配下のｐＥＴＤｕｅｔベクターにクローニングする。２−ヒドロキシ−４オキソアジピン酸２−デヒドラターゼ（ＣＡＡ２７６９８．１．）、２，３−デヒドロ−４−オキソアジピン酸２，３−レダクターゼ（ＢＡＦ４４５２４．１．）、４−オキソ−アジピン酸４−レダクターゼ（ＮＣ＿００１１３６．１０）を、アラビノース誘導性プロモーターの支配下のｐＢＡＤベクターにクローニングする。最後に、４−ヒドロキシアジピン酸ＣｏＡトランスフェラーゼｃａｔＩ（Ｐ３８９４６．１）、４−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＮＰ＿３７７０３２．１）、４，５−デヒドロアジピル−ＣｏＡレダクターゼ（ＮＣ＿０００９６４．３）およびアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼｇｃｔＡＢ（ＣＡＡ５７１９９およびＣＡＡ５７２００）を、Ｔ７プロモーターの支配下のｐＲＳＦＤｕｅｔベクターにクローニングする。これらのベクターは、商業的に入手可能である。得られた遺伝的に操作された生物を、当該分野で周知の手順に従って、グルコース含有培地中で培養する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，前出，２００１を参照のこと）。発現された酵素の酵素活性を、個別の活性に特異的なアッセイを用いて確かめる。操作されたＥ．コリ株がアジペートを生成する能力を、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣＭＳ）および／または液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）を用いて確かめる。機能的なアジピン酸合成経路を有するように操作された微生物菌株は、当該分野で周知の方法によって、さらにアジペート生成を増加させることができる。アジペートの大量生産のために、嫌気条件下での上記生物の生育を支持する当該分野で公知の培地を使用して、その生物を発酵槽において培養する。発酵は、バッチ、フェドバッチまたは連続様式で行われる。限られた通気のために隔壁に小さい穴を設けることによる微好気的条件もまた使用され得る。培地のｐＨは、Ｈ２ＳＯ４などの酸を加えることによって、およそ７というｐＨで維持される。増殖速度は、分光光度計（６００ｎｍ）を使用して光学濃度を計測すること、および長時間にわたって炭素源の枯渇をモニターすることによってグルコース取り込み速度を計測することによって測定される。副産物、例えば、望ましくないアルコール、有機酸および残留グルコースは、ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ ＭＤ）によって、例えば、Ａｍｉｎｅｘ（登録商標）シリーズのＨＰＬＣカラム（例えば、ＨＰＸ−８７シリーズ）（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）を使用して、グルコースおよびアルコールに対しては屈折率検出器ならびに有機酸に対してはＵＶ検出器を使用して（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７７５−７７９（２００５））、定量され得る。
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中に提供されるすべてのヌクレオチド配列は、５’から３’の方向で提示される。
本明細書中に例証的に記載された本発明は、本明細書中に明確に開示されていない任意のエレメント、限度の非存在下においても、適切に実施され得る。したがって、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などは、拡張的に、かつ制限なく、解釈されるものとする。さらに、本明細書中で使用される用語および表現は、説明の用語として使用されており、限定の用語としては使用されておらず、示された特徴および記載された特徴またはそれらの一部の任意の等価物を排除するような用語および表現を使用する意図はなく、特許請求される本発明の範囲内において様々な改変が可能であることが認識される。
本発明は、上記の態様とともに記載されてきたが、前述の説明および実施例は、例証を意図したものであって、本発明の範囲を限定する意図はないことが理解されるべきである。本発明の範囲内での他の態様、利点および改変は、本発明が属する分野の当業者には明らかだろう。
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Claims (9)

  1. ４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸アルドラーゼ（２Ａ）、４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドラターゼ（２Ｂ）、６−ヒドロキシ−３，４−デヒドロ−２−オキソヘキサン酸３−レダクターゼ（２Ｃ）、６−ヒドロキシ−２−オキソヘキサン酸２−レダクターゼ（２Ｄ）、２，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（２Ｅ）、２，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼ（２Ｆ）、６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼ（２Ｇ）、６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（４Ｆ３）、６−ヒドロキシヘキサン酸１−レダクターゼ（５Ｒ）、および６−ヒドロキシヘキサナール１−レダクターゼ（５Ｓ）からなる１，６−ヘキサンジオール経路の１０酵素をコードする遺伝子を含み、
    該遺伝子のうちの少なくとも１つを含む外来性核酸を含み；
    前記酵素を外来的に発現させる場合は、
    前記４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸アルドラーゼは、エシェリヒア・コリのＨｐａＩ遺伝子によってコードされる２，４−ジヒドロキシヘプタ−２−エン−１，７−二酸アルドラーゼであり、
    前記４，６−ジヒドロキシ−２−オキソ−ヘキサン酸４−デヒドラターゼは、、エシェリヒア・コリのＨｐｃＧ／ＨｐａＨ遺伝子によってコードされる２−オキソ−ヘプタ−４−エン−１，７−二酸ヒドラターゼであり、
    前記６−ヒドロキシ−３，４−デヒドロ−２−オキソヘキサン酸３−レダクターゼは、アラビドプシス・タリアナのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＣ０１７１０．１のＮＡＤＰ依存性アルケナールレダクターゼＰ１であり、
    前記６−ヒドロキシ−２−オキソヘキサン酸２−レダクターゼは、ラクトコッカス・ラクティスのｐａｎＥ遺伝子によってコードされるＤ−２−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼであり、
    前記２，６−ジヒドロキシ−ヘキサン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼおよび前記６−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、クロストリジウム・ディフィシルのＨａｄＡ遺伝子にコードされるグルタコン酸−ＣｏＡ−トランスフェラーゼであり、
    前記２，６−ジヒドロキシ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２−デヒドラターゼは、クロストリジウム・ディフィシルで発現する２−ヒドロキシイソカプロイル−ＣｏＡデヒドラターゼであり、
    前記６−ヒドロキシ−２，３−デヒドロ−ヘキサノイル−ＣｏＡ２，３−レダクターゼは、トレポネーマ・デンティコラのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥ０１７２４８のｔｒａｎｓ−２−エノイルＣｏＡレダクターゼであり；
    前記６−ヒドロキシヘキサン酸１−レダクターゼは、ノカルジア・イオウェンシスのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＲ９１６８１．１のＡＴＰ／ＮＡＤＰＨ−ＣＡＲであり、
    前記６−ヒドロキシヘキサナール１−レダクターゼは、ロドコッカスのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＮ３７４８９．１の６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼであり；
    ２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、４Ｆ３、５Ｒ、又は５Ｓから選ばれるいずれかの酵素を外来的に発現せず、内在的に発現する、天然に存在しない微生物生物。
  2. １，６−ヘキサンジオールまたはその溶媒和物を調製するための方法であって、
    該方法は、（ａ）アルドール付加を介して、Ｃ３アルデヒドおよびピルベートをＣ６β−ヒドロキシケトン中間体に変換する工程；および次いで（ｂ）酵素的工程を介して、該Ｃ６β−ヒドロキシケトン中間体を１，６−ヘキサンジオールまたはその溶媒和物に変換する工程を含み、ここで、請求項１に記載の天然に存在しない微生物生物が（ａ）および（ｂ）の工程のための宿主として使用される、方法。
  3. 変換が、エノイルまたはエノエートの還元、ケトンの還元、アルデヒドの還元、脱水、チオエステルの形成、チオエステルの還元、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２に記載の方法。
  4. グリセロール、Ｃ５糖、Ｃ６糖、ホスホ−グリセレート、他の炭素源、解糖経路の中間体、プロパン酸代謝の中間体またはそれらの組み合わせから選択される供給源からＣ３アルデヒドおよびピルベートを調製する工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
  5. Ｃ５糖が、キシロース、キシルロース、リブロース、アラビノース、リキソースまたはリボースのうちの１つ以上から選択される糖を含む、請求項４に記載の方法。
  6. Ｃ６糖が、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、タロース、ガラクトース、フルクトース、プシコース、ソルボースまたはタガトースのうちの１つ以上から選択される糖を含む、請求項４に記載の方法。
  7. 他の炭素源が、微生物に対する炭素源として適した供給原料を構成し、ここで、該供給原料は、アミノ酸、脂質、トウモロコシ茎葉、ススキ、都市廃棄物、砂糖黍、サトウキビ、バガス、デンプン流、デキストロース流、メタノール、ホルメートまたはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、請求項４に記載の方法。
  8. Ｃ３アルデヒドが、一連の酵素的工程を介して得られ、ここで、該酵素的工程は、ジオールの脱水を含む、請求項４に記載の方法。
  9. さらに、天然に存在しない微生物生物又は該微生物生物を含む培養液から、１，６ヘキサンジオールを分離する工程を含む、請求項４に記載の方法。
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