JP6676036B2 - マイクロ流体またはミリ流体デバイス内で、反応体と試薬液滴とを融合させ、または接触させるための方法 - Google Patents

Description

液滴ベースの流動反応体は、特性が反応条件によって強く影響される機能性材料を制御して合成するための特有の価値があることが分かっている。例えば、（バッチ及び連続流動合成の両方に関して）製造の制御における顕著な改善が、金属ナノ結晶、量子ドット及び共役ポリマーを含む、幅広い光電子材料について行われている。しかし、これまで、液滴合成は、単純な１段階処理に大きく限定されており、この場合、全ての試薬が液滴内に最初に入れられることとなり、採用可能な化学物質の範囲を極めて限定する。液滴流体の利益を適切に利用し、アクセス可能な化学物質／材料のパレットを拡大するために、反応が進むにつれて流動する液滴内に順に試薬を追加可能である、多段階液滴反応体を開発する必要があることは明らかである。

液滴流動プロセスにおいて、連続相は、好適には流路の壁を濡らす液体であり、試薬相は、流路を同じ速度で通過する、一連の個別のほぼ独立した小体積の液滴に分割される。異なる活性成分を有する液滴が望ましい場合、または液滴が微生物、典型的には真菌の胞子などの、変化する（成長するなど）成分を含む場合、液滴の成分は、液滴ごとに異なるものであってもよい。その小さな体積（典型的にはマイクロリットル以下）のために、液滴は、化学組成及び温度に関して極めて均一であり、そのため、化学反応を実行するための、高度に制御された環境を提供することとなる。さらに、液滴は連続相によって流路の壁からは離れた状態を維持するため、試薬の沈殿または流路の壁上の生成物による反応体の汚れの可能性が事実上排除され、安定した、変化しない反応環境を確保することができる。

液滴融合は、生物学的及び／または化学的反応の開始のための試薬の組み合わせを可能にするため、デジタルマイクロ／ミリ流体学のために非常に重要な操作である。流動流路において、液滴の合体は、それらを分離する連続相の除去を必要とする。２つの液滴が近接して接触すると、薄い液体ブリッジが液滴間に形成される。ブリッジの周囲に形成された曲率の大きなメニスカスが、２つの液滴を合体させる表面張力の不均衡を生じさせる。臨界的な最小時間の間、液滴間で近接して接触することが、合体に必要である。液滴融合を達成するために、空間的及び時間的な同期が必要となる。既存の液滴融合技術は、複雑な流路設計及び／または内部液滴の汚染という欠点を有する。本発明は、単純な流路設計で、試薬リザーバーの汚染がなく、液滴間汚染がない、３相流動システムにおける反応体液滴によって、試薬液滴の自己同期注入及びその融合、有利にはその受動融合を可能にする。

既存技術
受動液滴融合
幾何学的に介在された受動液滴融合は、体積拡張部における連続相の排除に基づく（図１）。この方法は、液滴間の汚染が少ないという利点を特徴とするが、追加的に設計が複雑になる流路を必要とし、能動誘導法よりもスループットが低い。

表面濡れ性誘導型受動液滴融合（図２）は、水溶性液滴の対の間の融合を誘導する親水性パッチの使用に基づく。液滴同期を必要としないかわり、本方法の主な欠点は、濡れ性パッチの通過の間に高い液滴間汚染が生じることである。

別の受動法において、試薬が、通過する液滴に追加される（図３）。液滴間汚染は、親水性の狭い流路を使用することによって低減された（なくなってはいない）が、本手法は、基板の連続的な試薬注入が連続相及び分散相の体積流速の慎重な均衡を必要とするため、通過する液滴に追加された試薬の特定の量の制御性が低い。

能動液滴融合
能動液滴融合法は、その多くが液滴を融合させるために、電極の製造及び電気信号の正確なタイミングを必要とするため、多くの受動液滴融合法よりも複雑である。これらの方法は、液滴の合体に必要な表面張力の不安定性を生じさせるために電気を用いる。最も有利な設計の１つは、図４に示されたピコインジェクターである。液滴がピコインジェクターの近くを通過する際に、電極が活性化され、試薬を液滴に注入することができる水／油界面の薄膜不安定性を発生させる。高いスループット（数キロヘルツ）及びピコリットル以下の注入精度があると主張された。本方法の主な不便な点は、通過する液滴との融合の最中に、注入溶液リザーバーの汚染の可能性があることである。電気の使用は、ＤＮＡやたんぱく質などの生物学的分子への電気信号の生物学的適合性が問題となる。

３相マイクロ流体システム
特許文献１は、連続相と、反応体液滴と、スペーサーとを含む３相マイクロ流体システムを開示する。スペーサーは、反応体液滴の合体を防ぐ不混和性液体または疎水性粒子によって形成される。この出願はまた、Ｔ字型接合マイクロ流体デバイスを用いた注入によって試薬液滴を追加することを開示しているが、どのように注入を行うかについては具体的に説明していない。特に、この出願は、合体前に試薬液滴を分けることについて教示も示唆もしていない。

国際公開第２００８／０７９２７４号

本明細書で使用される方法は、汚染、特にリザーバーの汚染を防ぐだけでなく、特に一連の液滴が規則的でない場合に、流動する液滴間の汚染も防ぐ。本明細書で使用される方法は自己同期されず、状況に応じて試薬の液滴の体積を制御も調整もしない。さらに、本明細書で使用される方法は、「ターゲット」反応体液滴を選択することもしない。

幾何学的に介在された受動液滴融合である（先行技術）。 表面濡れ性誘導型受動液滴融合である（先行技術）。 通過する液滴に追加される試薬である（先行技術）。 電極の使用による、能動液滴融合システムのピコインジェクターである（先行技術）。 本発明の３相マイクロ／ミリ流体システムである。 本発明の好適な自己同期融合方法の主な段階の図であり、６ａは試薬液滴の生成であり、６ｂは試薬液滴のノズルからの離脱であり、６ｃは液滴の接触及び連続相の排除であり、６ｄは液滴の融合である。 本発明のスペーサープラグの概略図であり、注入領域はＩＺであり、Ｄは流路の直径であり、Ｌはスペーサープラグの長さである。 自己同期融合モジュールの主な要素であり、１はテフロンチューブであり、２は試薬リザーバーであり、３は穿孔であり、４は注入された試薬液滴であり、５は反応体液滴であり、６はフッ化オイルの連続相であり、７は圧縮空気スペーサーであり、８はアクリル製マニホールドマウントであり、９は取付けナットであり、１０はソレノイドバルブである。 追加された一連の真菌のミリ流体の蛍光信号である。 追加された一連の真菌のミリ流体の蛍光信号（拡大図）である。 Ａ．ｎｉｇｅｒの突然変異株ライブラリの酵素活性である。 デバイスの等価回路である。 最小液滴半径の測定値に対する離脱モデルの予測のグラフである。 様々な体積の注入における蛍光信号である。 様々な体積の注入における注入された液滴の大きさの増加量である。 様々な体積の注入における、Ｖ_Ｔ／Ｖ_Ｒ比の計算値である。 キャパシタ導入によるメニスカス収縮の強化であり、左側は気泡がなく、右側は気泡があり、１６ａは水であり、１６ｂはフッ化オイルであり、１６ｃはメニスカスであり、１６ｄは気泡である。

本発明は、３相マイクロ流体またはミリ流体システムにおける反応体と試薬の液滴を融合しまたは接触させるための方法を初めて開示し、本発明において、インジェクターと呼ぶ側面インレットによって一連の流体内に注入される試薬液滴が、反応体液滴と合体する前に試薬リザーバーから離脱する。より具体的には、試薬液滴は、反応体液滴と接触する前に離脱する。本発明の方法は、２つの連続的ではあるが同時には生じない段階を伴う。第１の段階は、一連の流体内に試薬の液滴を発生させる段階であり、試薬の液滴は、合体の第２の段階の前に離脱する。本発明の方法によって、その場で試薬の液滴を形成し、その形成は同期可能であり、必要であれば選択的である。試薬液滴はその場で形成され、得られた液滴は注入点（側面インレット）にとどまっており、反応体液滴が注入点に到達する前に試薬リザーバーから分離する。

本発明の方法によって、液滴は、汚染なく、すなわち、液滴内に微生物が存在したとしても、さらには真菌が存在したとしても、リザーバーの汚染がなく、液滴間の相互汚染がなく、融合される。

本発明の方法は、能動または受動融合のために使用することができ、すなわち、液滴の融合のための電極の使用は任意選択的であり、さらに有利には、電極を使用しない（受動融合）。さらに、マイクロ流体またはミリ流体デバイスの流路は規則的にすることができる。特に、これは、試薬の液滴が追加される位置において分岐幾何形状を含まず、例えば、流路は、分岐幾何形状を有しない円形流路とすることができる。

本発明の方法は、規則的または不規則的な一連の流体について使用可能である。特に、本発明の方法によって、等距離にない試薬を含む一連の流体が操作可能になる。

マイクロ／ミリ流体とは、マイクロ流体またはミリ流体を意味する。マイクロ流体は、小さな体積の流体が、マイクロメートル規模の流路／管内で取り扱われるシステムを指す。ミリ流体は、小さな体積の流体が、ミリメートル規模の流路／管内で取り扱われるシステムを指す。

本発明は、反応体と試薬の液滴をマイクロ流体またはミリ流体デバイス内で融合させまたは接触させるための方法に関し、
（ａ）マイクロ流体またはミリ流体システムの流路内で、連続相と、少なくとも２つの反応体液滴と、２つの反応体液滴Ａ_ｎとＡ_ｎ＋１との間の少なくとも１つのスペーサープラグと、を含み、ｎが０以上の整数である一連の３相マイクロ／ミリ流体を発生させる段階と、
（ｂ）インジェクターと呼ぶ側面インレットによって、一連の流体内に、非濡れ性の単一の液滴Ｂ内に試薬を注入する段階であって、液滴Ｂが反応体液滴Ａ_ｎ＋１に直接先行するスペーサープラグの注入点を通過する間にその場で生成され、反応体液滴Ａ_ｎ＋１が注入点に到達する前に、液滴Ｂが注入点から分離してインジェクター端部において試薬流体のメニスカスが形成され、反応体液滴Ａ_ｎ＋１が注入点にあるときに試薬流体メニスカスが側面インレット内に収縮する、試薬を注入する段階と、
（ｃ）液滴Ｂを注入点から離れた位置で反応体液滴Ａ_ｎ＋１と融合または接触させる段階と、を含み、
（ｄ）ｎ＞１の場合に、段階（ｂ）及び（ｃ）を反復する。

マイクロ流体またはミリ流体システムの流路は、円筒形の幾何形状または平面状の幾何形状を有する。以下の説明において、円筒形の幾何形状を参照し、そのため流路の大きさを直径を参照することによって定義する。これらの参照は、一連の液滴が平面状の幾何形状について循環する場合は、流路の高さ及び幅によって置き換えるべきである。

本説明において、「注入点」とは、注入位置に対応する液滴Ｂの発生点を意味する。以下、液滴Ｂを試薬液滴とも呼ぶ。

本説明において、「試薬液滴」、「試薬流体」という用語は、それぞれ試薬を含む液滴及び流体を定義するものとして使用する。同様に、「反応体液滴」、「反応体流体」という用語は、それぞれ反応体を含む液滴及び流体を定義するものとして使用する。

「プラグ」という用語は、体積ＶがπＤ＾３／６よりも大きな液滴を定義するものとして使用し、Ｄは、一連の液滴が円筒形の幾何形状について循環する場合には、管の直径であり、または、体積ＶがπＨＷ＾２／４よりも大きな液滴を定義するものとして使用し、Ｈ及びＷはそれぞれ一連の液滴が平面幾何形状について循環する場合の流路の高さ及び幅を表す。

本発明の方法において、マイクロ／ミリ流体システムは、少なくとも３つの相、すなわち連続相（２）、スペーサー相（１）及び反応体液滴相（３）を含む（図５）。スペーサープラグと試薬液滴との間の連続相内の領域は、毛細管ブリッジ（図５の網掛け領域）を形成する。本発明の方法において、連続相は流路、スペーサー、試薬液滴及び反応体液滴を濡らし、スペーサーのプラグ並びに試薬及び／または反応体の液滴は、連続相の薄い膜によって取り囲まれ、流路に接触しない。そのため、毛細管ブリッジは他の毛細管ブリッジと連続的に接続される。流路の壁に近接する連続相の存在は、他の２つの構成要素の境界から推定され、これらは共にスペーサープラグ／反応体液滴の界面において流路の壁から接線方向に曲線を描いて離れる。

少なくとも３つの相が存在することは、それぞれ連続相／スペーサー、連続相／反応体流体、スペーサー／反応体流体間の界面張力γが測定可能であることを意味する。同様に、それぞれ連続相／試薬流体、スペーサー／試薬流体間の界面張力を測定することもできる。

スペーサー液滴及び反応体液滴は、好適には連続相で完全に濡らされている。（ｉ，ｊ，ｋ）＝（１，２，３）として、拡散パラメータＳ＿ｉ＝γ＿ｊｋ−（γ＿ｉｊ＋γ＿ｉｋ）における条件は、Ｔｏｒｚａ及びＭａｓｏｎ著、1970 (Three-Phase Interactions In Shear and Electrical Fields, S. TORZA AND S. G. MASON, Journal of Colloid and Interface Science, vol. 33, No. 1, May 1970)の図１に示されている。

化学的な観点から、
・連続相は、反応体液滴の流体及び試薬液滴の流体と実質的に混合しない。
・スペーサー流体は、連続相、反応体液滴の流体及び試薬液滴の流体と実質的に混合しない。

本方法の重要な特性の１つは、段階ｂ）において、試薬の流体が非濡れ性であることである。これは、試薬の流体が流路の壁及び注入壁を濡らさないことを意味する。

本発明の方法の段階ｂ）及びｃ）は、好適には、以下の実質的に主要な段階を含む。
ｉ）その場にとどまっている、すなわち試薬リザーバーと依然として接続され、制御された体積を有する試薬液滴の発生（段階ｂ）
ｉｉ）注入点からの試薬液滴の離脱（段階ｂ）
ｉｉｉ）試薬液滴の反応体液滴との接触及び連続相の排出（段階ｃ）
ｉｖ）能動的または受動的な液滴の融合（段階ｃ）

その場にとどまっている試薬液滴の体積は、注入圧力によって決定され、これは、一連の流体を移動させるために用いられる圧力よりも大きい。

好適な自己同期融合方式の主要な段階の図は、図６に示されている。

本方法は、本段落では、図６を参照して説明される。この特定の実施形態において、試薬は側面インレットによって追加される。本発明の自己同期という特徴は、図６ａに示されており、試薬液滴は、試薬リザーバーに取り付けられたままであり、そのため、スペーサープラグの先端がその場にとどまっている試薬液滴に到達するまで、側面インレットの位置にとどまる液滴を形成する。次いで、離脱が生じ、最後に形成された試薬液滴が、図６ｂに示されるように、スペーサープラグの後端と反応体液滴の前端とを分割する（すなわち可動式の受動融合チャンバーを生成する）体積によって画定された、連続相の毛細管ブリッジ内に入る。本方法の汚染がないという特徴は図６ｃに示されており、試薬液滴が、離脱後に完全性を保つ。次いで、液滴融合は、試薬液滴の生成点から離れて生じ（図６ｄ）、試薬溶液リザーバーを汚染のない状態に保つ。汚染がないという特徴の追加的な証拠は、図６ｃに示されており、試薬液滴が側面インレットの下を通過する際に、試薬流体のメニスカスは、側面インレット端から収縮され、確実に、反応体液滴と試薬リザーバーとの間の接触を防ぐ。

スペーサープラグと試薬液滴との間の連続相内の領域は、毛細管ブリッジを形成する。好適な実施形態において、試薬液滴は注入点に付着した状態を保ち、反応体液滴Ａ_ｎ＋１の前方の毛細管ブリッジが試薬液滴に到達したときに分離する。

本発明の方法は、新規な液滴形成メカニズムに関し、界面張力が、その場にとどまる液滴の分離を誘導する。

その場にとどまる液滴に働く毛細管力が、その場にとどまる液滴を保持する毛細管力よりも大きいときに、試薬液滴は離脱する。このメカニズムは、生成可能な最小の試薬液滴の大きさを画定する。

注入される流体の最小体積は、分離することとなる、その場にとどまる液滴を得るために必要な体積である。有利には、試薬液滴の最小半径ｒ_ｍｉｎは、以下の方程式：ｒ_ｍｉｎ〜ｄ×γ_１２／γ_２３で定義される。
・ｄは側面インレットの直径（またはインレットが円形でない場合は幅もしくは高さ）である。
・γ_１２は、相１（試薬）と相２（連続相）との間の表面張力である。
・γ_２３は、相２（連続相）と相３（スペーサー）との間の表面張力である。

好適な実施形態において、液滴Ｂの体積は、有利には５ｐＬ超、より有利には１０ｐＬ超である。好適な実施形態において、液滴Ｂの体積は２ｎＬ超である。

最大直径は、状況に応じて当業者によって決定されることとなる。特に、試薬液滴の最大の大きさは、注入された液滴が２つの部分にスペーサーを切断してしまう危険性を回避するための、主要な流路の大きさである。

スペーサー流体が気体、特に空気である場合、界面張力により誘導された液滴の形成によって形成された最大直径は、大部分は連続相の流速とは独立であり、一連の流体が移動する管の大きさにほぼ対応する。注入可能である流体の最大体積は、液滴がプラグになる（すなわち、液滴の直径が流路の直径以上になる）体積である。特に、流体がこれ以上液滴を形成せず、プラグになる場合、注入された流体がスペーサープラグを分離させる危険性がある。

その一方、鉱物油のような粘性スペーサについて、その場にとどまる液滴は、流体の速度、すなわち連続相の流速の増加関数である粘性力によって離脱可能である。剪断誘導分離が生じるよりも大きな臨界液滴の大きさは、スペーサの速度並びに連続相及びスペーサー相の粘性に反比例する。次いで、液滴はスペーサー位置から排出され、最終的に汚染がない状態で、反応体液滴と接触し、または融合しうる。液滴の形成と排出との間の遅延時間は、例えば、検出モジュールの位置だけでなく、実際の融合が誘導される位置を変更することによって、当業者が容易に決定することができる。

段階ｂ）において注入される液滴の体積は、主に流路の大きさに依存する。特定の実施形態において、体積は１９０ｎＬよりも小さい。

好適な実施形態において、ｒが試薬液滴の半径であり、Ｒが流路の半径（または流路が円形でない場合には幅の半分もしくは高さの半分）である場合、比ｒ／Ｒは０．１から１であり、有利には０．１から０．９であり、より有利には０．２から０．７であり、さらにより有利には０．２５から０．６０である。

側面インレットの直径ｄ（または側面インレットが円形でない場合、幅もしくは高さ）は、流路の直径Ｄ（または流路が円形でない場合、幅もしくは高さ）よりも小さい。具体的には、ｄ＜Ｄである。好適な実施形態において、ｄ／Ｄ＜０．５であり、具体的には、ｄ／Ｄは、０．０５から０．５の範囲である。

そのため、ｄは、流路の大きさＤに依存する。特定の実施形態において、ｄは２００μｍ未満であり、有利にはミリ流体条件の場合５０μｍから２００μｍの範囲で備えられ、またはマイクロ流体条件の場合、１０μｍから５０μｍの範囲で備えられる。

試薬液滴の大きさ及び、すなわち試薬液滴の体積は、変更可能である。特に、ｒ＿ｍｉｎ／ｄ〜１であり（図１２を参照）、従って、ｒ＿ｍｉｎ／Ｄ〜ｄ／Ｄであり、ｒ＿ｍａｘ／Ｄ〜０．５である。

本発明の方法において、スペーサープラグの存在は、この新しい分離及び合体のメカニズムに必要である。

スペーサープラグは、注入点において平坦な界面を示している。スペーサーの長さＬは、好適には以下の方程式に従う。
Ｌ＝Ｄ＋εｄ
ここで、Ｄ及びｄは前述のように定義される（または、流路または側面インレットが円形でない場合は、幅Ｗ及びｗ、高さＨ及びｈに置き換えることができる）。
εは２より大きな数であり、特に２から１００の範囲である。この数字は、比ｄ／Ｄに依存し、当業者によって調整可能である。

より好適には、スペーサーの長さＬは、Ｄの少なくとも２倍であり、より好適にはＤの少なくとも３倍である。

注入は、好適には注入点がスペーサープラグの平坦面の前方にあるときに生じる。注入領域は、概略的には図７で示され、注入領域ＩＺはスペーサープラグの平坦区画に対応し、ここではａ≧Ｄ／２及びｂ≧Ｄ／２である。

有利には、スペーサーの先端は球形である。

注入後、連続的な薄い膜のせん断が、液滴の首部の破壊を生じさせるのに不十分である場合、すなわち、スペーサーの速度が十分遅いか、またはスペーサーの粘度が気体スペーサーの場合のように小さい場合は、発生した試薬液滴は、スペーサー流体が通過する間、インジェクター（図６ａの側面インレット）の端部に付着したままである。取得したビデオの目視検査では、液滴の離脱は、３相間に形成された連続的な毛細管ブリッジが、その場にとどまる試薬液滴に接触する際に生じる（図６ｂ）。スペーサー相と連続相との間の界面張力が、試薬液滴の離脱を誘導するのに必要な力を提供する。離脱後、連続的な毛細管ブリッジは、可動式の液滴融合チャンバーとして働き（図６ｃ）、これによって、２つの液滴間の連続相の排除とともに、反応体液滴と試薬液滴との間の接触が可能になり、これは、液滴の融合に必要である（図６ｄ）。融合後、試薬相と反応体相とが、反応体液滴に運動によって誘導された内部流動のために混合される（図６ｄ）。

段階ｂ）において、反応体液滴が注入点から離脱すると、試薬流体のメニスカスはインジェクターの端部から収縮し、確実に、反応体液滴と試薬リザーバーとの間の接触を防ぐ。試薬流体のメニスカスは、反応体液滴Ａ_ｎ＋１が注入点に到達する前にインジェクターから収縮し、反応体液滴Ａ_ｎ＋１が注入点にある場合は収縮したままである。

メニスカスの収縮を増大させるために、好適には、別の圧縮性流体を含み、及び／または圧縮性材料を含む注入デバイスを使用する。例えば、注入デバイスのチャンバーは、本明細書では注入チャンバーと呼ばれ、試薬リザーバーと注入点との間に配置され、試薬流体及び空気を含みうる。試薬液滴が分離すると、離脱が生じ、メニスカスは、圧力の変化に起因してインジェクターの端部から収縮する。この現象は、注入デバイスをキャパシタまたはキャパシタンスに接続することによって強められ、抵抗／キャパシタンスと共に働いて、圧力変動を発生させ、そのためメニスカスの収縮を強めることができる。

好適な実施形態において、試薬液滴は、側面インレットを通して注入され、一連の液滴が循環している流路またはチューブ内に現れる。注入デバイスは、好適にはピコインジェクターまたはナノインジェクターであるが、任意の適切な手段とすることもできる。好適には、側面インレットは、流路内の穴であり、穴の横方向側面の両方において、流路は、油を含む第１の被覆によって取り囲まれ、この第１の被覆は、ポリマーによって被覆される。ポリマーは、試薬流体の性質によって、ポリアクリルなどの親水性ポリマーまたは疎水性ポリマーとすることができる。

注入は連続的または不連続的とすることができるが、好適には不連続である。不連続な注入により、状況に応じて試薬液滴の体積の制御が可能になる。さらに、不連続な注入では、要求された場合にのみ、「ターゲット」反応体液滴及び、それに従って注入を選択することができる。そのため、段階ｂ）の前に、本方法は、有利には反応体液滴Ａ_ｎ＋１を検出する段階を含む。反応体液滴Ａ_ｎ＋１は、任意選択的な手段（レーザービーム、蛍光、ラマン分光分析、画像取得など）、電気的手段（インピーダンスなど）、磁気的手段、放射線測定手段、音響手段からなる群から選択された検出手段によって検出可能である。さらに、この方法は、反応体液滴Ａ_ｎ＋１を検出する段階の後であるが、段階ｃ）の前に、検出された液滴Ａ_ｎ＋１を選択し、それによって試薬液滴の体積を調整し、その体積はヌル（注入しない）かまたは１ｐＬより多い段階を含むことができる。

不連続な注入によって、一連の反応体液滴が不規則である場合に、本方法は実装可能である。不規則な連なりは、液滴の大きさ及び／または連なりを構成する液滴の間の距離の変動によって定義される。本発明の方法において、連なりは、完全な連なりまたは不規則な連なりである。

好適な実施形態において、試薬相の注入は、ポリマーマニホールドによって側面インレットに整列されたバルブ、特にソレノイドバルブによって行われ、バルブは試薬リザーバーに接続される。デバイスはさらに、メニスカス収縮を強めるためにキャパシタもしくはキャパシタンスを、及び／または注入された体積を正確に制御するために抵抗を含んでもよい。

スペーサーは、試薬、反応体及び連続相とは混合しない気体または液体とすることができる。第１の実施形態において、スペーサーは、圧縮空気、アルゴン、窒素、ＣＯ_２、または前述のものの組み合わせからなる群から選択された気体である。

この実施形態において、試薬を含む液滴の流体は、試薬液滴と溶解しない流体、例えば鉱物油またはシリコーンオイルとすることができる。そのような場合、注入後に、システムは４相システムとなる。この一連の４相は、反応体相内の特定の試薬の溶解性に困難が存在するような分析を行う際に適切である。

第２の実施形態において、スペーサーは、鉱物油など、連続相、反応体相及び試薬相と混合しない液体である。

通常、マイクロ／ミリ流体デバイスの流路は、好適には、フッ化物ポリマー、より好適にはテフロン（登録商標）からなる。連続相は好適にはフッ化物オイル及び可能な場合には界面活性剤を含む。当業者は、これらの成分を使用する。

当業者であれば、反応体液滴及び、状況に応じて試薬を含む液滴の流体を、予測される反応に応じて、その技術的知識に基づいて選択するであろう。反応体液滴は個別の、小体積の液滴であり、ほぼ同一の小体積の液滴である場合があり、これらは流路を共通の速度で通過する。

例えば、以下の試薬−反応体を使用することができる。
胞子産生：ジャガイモのＤ型グルコース寒天プレート
成長媒体：ペプトン−グルコース−塩、ｐＨ４．６
酵素活性：Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ ＥｎｚＣｈｅｋキット（アセテートバッファ４．６内）このキットは、クエンチした蛍光を有するでんぷん基板を含む。この基板は、アミラーゼによって効率的に分解され、消化はクエンチを緩和し、高度に蛍光を有する破片を得る。これに伴う蛍光の増加は、アミラーゼ活性に比例し、蛍光で監視することができる。

本方法についての実際の応用の例として、コンビナトリアル化学、化学生物学スクリーン、遺伝子シーケンシングを挙げることができる。生物学スクリーンの例として、代謝産物（酵素、薬品）を産生する微生物のスクリーニングを挙げることができる。そのため、本発明はまた、コンビナトリアル化学、化学生物学スクリーン、遺伝子シーケンシングにおいて使用するための方法にも関する。

一連の３相は、当業者に知られている方法によってＴ接続を用いることによってミリ／マイクロ流体流路管の内部で生成され、液体の流速は、ポンプ及び、圧力制御部による気体圧力によって制御される。

好適な実施形態において、デバイスはミリ流体デバイスである。

本発明はまた、
連続相、少なくとも２つの反応体液滴、及びｎが０以上の整数である２つの反応体液滴Ａ_ｎとＡ_ｎ＋１との間の少なくとも１つのスペーサープラグを含む一連の３相マイクロ／ミリ流体で満たされたミリ／マイクロ流体流路管と、
流路上に開く、液相内の試薬を含むリザーバーと接続された開口部と、
リザーバーと開口部とを接続するバルブと、
開口部の上流側に配置された検出器と、を含む、
ミリ流体またはマイクロ流体デバイスに関する。

検出器は、バルブの開放を、反応体液滴の到達と同期させることを可能にする。特に、バルブはソレノイドバルブである。注入される反応対象物の体積は、バルブの開放時間（脈動時間）によって制御される。

ミリ流体またはマイクロ流体デバイスの等価回路は以下の通りでありうる。２つの抵抗Ｒ１及びＲ２が直列に接続されている。この２つの抵抗の間の接続は、抵抗Ｒ３と直列に、素子ＩＣに接続されている。

素子ＩＣは、並列に配置されたキャパシタＣ１及び抵抗Ｒ４からなる。

等価回路は図１１に示されている。

以下の説明において、デバイスは、例示的ではあるが限定的ではない実施形態として、側面インレットが流路内の穴であるデバイスを参照して説明される。そして、本発明はまた、穴によって穿孔された流路管と、穴の側方の両側において、流路を取り囲む被覆内の空間によって形成された注入チャンバーと、試薬リザーバーと、任意選択的にバルブと、を含むミリ流体またはマイクロ流体デバイスに関する。通常、管はテフロン（登録商標）からなる。穴の大きさは、側面インレットに関して前述したとおりである。

好適には、デバイスは、試薬リザーバーと注入チャンバーとの間のバルブを含む。特に、バルブはソレノイドバルブである。注入される反応対象物の体積は、バルブの開放時間（脈動時間）によって制御される。

デバイスはさらに、試薬リザーバーと注入チャンバーとの間、より具体的には試薬リザーバーとバルブとの間に抵抗を含む。特に、抵抗は、試薬リザーバーと注入チャンバー、より具体的にはバルブを接続する薄いテフロン（登録商標）の管とすることができる。抵抗は、大きな流動抵抗を提供し、そのため、一定の追加された液滴体積を得るために使用される。ミリ流体システムでは、管は例えば１００μｍから３００μｍ、より具体的には２００μｍの内径を有する。

穴の側方両側における流路は、ポリマー被覆によって取り囲まれている。被覆は、本明細書ではマニホールドとも呼ぶ。ポリマーは、任意の適切なポリマーとすることができ、試薬の性質に依存して、当業者によって、その技術的知識に基づいて選択される。特定の実施形態において、ポリマーはアクリル系である。ポリマーと流路との間に、被覆は有利にはさらに油の相を含む。油の性質は、好適には連続相の油と同一である。

マニホールドは、試薬リザーバー及び／またはバルブ並びに穴を整列させるように使用される。試薬リザーバー及び／またはバルブは、取付けナットアクセサリなどの適切な手段によって、マニホールドに対して整列され、取り付けられる。

注入チャンバーは、穿孔した穴と整列され、特にバルブと穿孔した穴との間に整列されたマニホールドの内部の空間である。注入チャンバーの等価回路図は、並列に接続された抵抗及びキャパシタンスである。

好適な実施形態において、キャパシタンスは注入デバイスのチャンバー内に存在する圧縮性流体である。

他の実施形態において、キャパシタンスは人工気泡として働くこととなる薄い柔軟なメンブレンである。そのようなメンブレンは、チャンバー内に開けられた穴にシールされうる。

他の実施形態において、キャパシタンスは、弾性率の低い材料からなる壁を有する管である。

デバイスの等価回路は図１１に示されており、Ｒ１及びＲ２は注入点の両側における一連の液滴の流動抵抗に対応し、Ｒ３は前述の抵抗であり、Ｒ４は試薬流体が注入チャンバーを通過する流動に起因する抵抗であり、Ｃ１は注入チャンバー内部のキャパシタンスである。

本発明は、対象として、図１１に示された等価回路を有するミリ／マイクロ流体デバイスを有する。

デバイスは、例示的であるが制限的でない実施形態として、図８に示されたデバイスを参照して説明される。

そのため、ミリ流体またはマイクロ流体デバイスは、穴（図８、３）によって穿孔された流路管（図８、１）と、穴の側面両方において流路を取り囲む（図８、８）アクリルマニホールド内の空間によって形成された注入チャンバーと、試薬リザーバー（図８、２）と、バルブ（図８、９）と、を含む。

本発明は、以下の非限定的な例で説明される。
例１：一連の３相ミリ流体の生成
一連の３相は、連続相（フッ化物オイル Ｎｏｖｅｃ ＨＦＥ７５００＋０．５％ｖ／ｖ パーフルオロオクタノール界面活性剤）と、反応体液滴（ペプトン−グルコース−塩媒体、ｐＨ４．６）と、スペーサー流体（空気または鉱物油）と、からなる。一連の流体は、Ｔ接続を使用して、７５０ｕｍのＩＤ ＦＥＰテフロン（登録商標）管内に生成され、液体の流速は、シリンジポンプ及び圧力制御部による気体の圧力で制御される。一連の空気のスペーサーでは、フッ化物オイル及び媒体の流速はそれぞれ６．５及び７．５ｍｌ／ｈであり、空気の圧力は１Ｂａｒである。一連の鉱物油スペーサーについては、フッ化物オイル、媒体及び鉱物油の流速はそれぞれ、５、５、及び１０ｍｌ／ｈである。

実験的に測定された表面の値（ペンダント液滴法）は、以下の通りである。
γ（ＨＦＥ＋ＰＦＯ ０．５％）／空気：１２．５ｍＮ／ｍ±０．５ｍＮ／ｍ
γ（ＨＦＥ＋ＰＦＯ ０．５％）／鉱物油：３．７ｍＮ／ｍ±０．５ｍＮ／ｍ
γ（ＨＦＥ＋ＰＦＯ ０．５％）／水：３０．５ｍＮ／ｍ±０．５ｍＮ／ｍ

液滴放出機構の実験的評価に関して、フルオレセインイソチオシアネートＦＩＴＣ １Ｅ−０４Ｍが、反応体液滴流体として使用される。水の液滴は、空気または鉱物油スペーサーとともに、一連のミリ流体内に注入される。注入は、反応体液滴の蛍光検出によって開始され、３つの異なる半径（３０、５０及び９０μｍ）で穿孔された穴を通してソレノイドバルブによって活性化される。Ｒｍｉｎは、提案される離脱メカニズムに従う最小の液滴半径であり、注入プロセスのビデオキャプチャの画像分析によって決定される。

報告された値は以下の表のとおりである。

最小液滴半径に対する離脱モデルの予測の測定結果に関するグラフ
結果は図１２に示されている。

物質及び方法
１． ７５０μｍ ＩＤ ＦＥＰテフロン（登録商標）管上への一連のミリ流体液滴の発生（シリンジポンプ及び／または圧力制御部）
一連の要素：
ａ．スペーサー流体：圧縮空気または鉱物油（管の内径の少なくとも３倍の長さ）
ｂ．連続相：フッ化物オイル Ｎｏｖｅｃ ＨＦＥ７５００＋０．５％ｖ／ｖパーフルオロオクタノール表面活性剤
ｃ．反応体液滴：ペプトン−グルコース−塩媒体＋ＢｏｄｉｐｙＦＬ（管の内径の８０から８５％の高さ）
２． 反応対象物液滴の注入（メチレンブルー水溶液またはアセテートバッファ（ｐＨ４．５）溶液＋ＢｏｄｉｐｙＦＬ） 本方法の要素は図８に示されている。
段階：
ａ．反応体液滴の蛍光信号検出。
ｂ．（管内に穿孔された穴を通した）反応体液滴の前方への反応対象物液滴の注入。注入は、アクリル系マニホールド（Ｌｅｅ社製マニホールド取付けキット）によって、穿孔された穴に整列されたソレノイドバルブ（Ｌｅｅ社製ＶＨＳ型）によって行われる。画像取得による評価（ＧｕｐｐｙＰｒｏファイアーワイヤーカメラ及びＮｉｋｏｎ１０倍対物レンズ）。図６ａ。
ｃ．反応対象物液滴の穿孔された穴への付着。図６ａ。
ｄ．同期：穿孔された穴から連続相毛細管ブリッジ（可動受動融合チャンバー）内への試薬液滴の離脱。画像取得による評価。図６ｂ。
ｅ．可動受動融合チャンバー上における、試薬液滴及び反応体液滴の接触。画像取得による評価。図６ｃ。
ｆ．可動受動融合チャンバーの連続相の排出。画像取得による評価。図６ｃ。
ｇ．液滴融合。画像取得及び蛍光信号モニタリングによる評価。図６ｄ。

結果
スペーサー流体として空気（図６）及び鉱物油を有する一連のミリ流体での試薬液滴注入試験は、自己同期形式の４つの典型的な段階、試薬液滴の発生、試薬液滴のノズルからの離脱、液滴の接触及び連続相の排出、並びに液滴の融合を示した。

試薬溶液としてメチレンブルー溶液を使用することによって、液滴融合後の混合流動パターンを観察することができる。

ＢｏｄｉｐｙＦＬ ５ｘ溶液の追加後、一連のミリ流体の蛍光ピークプロファイルが観察される。ギャップがないことは、全ての液滴への投与を示しており、その一方、最大レベルが一定であることは、追加された液滴の体積が一定であることを示している。

実施例
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの変異株の胞子が、０．０００３７５のＯＤを得るための抽出後に、ＰＧＳ媒体内で希釈される。この濃度により、ＰＧＳ媒体反応体液滴内への単一の胞子の閉じ込めが可能となる。空気スペーサーを有する、３１０５個の反応体液滴の一連のミリ流体が、３０ｍの長さのＦＥＰテフロン（登録商標）管（７５０ｕｍ ＩＤ）内で生成された。一連の流体の生成について、（０．５％ ｖ／ｖ パーフルオロオクタノール界面活性剤を有する）Ｎｏｖｅｃ７５００フッ化物オイル及びＰＧＳ媒体の流速は、それぞれ６．５及び７．５ｍｌ／ｈであり、空気の圧力は１Ｂａｒである。一連の流体は、一定の圧力（２５０ｍＢａｒ）を印加することによって前後に循環する。一連の流体の全てがレーザー液滴検出器を通過した後、一連の液滴の流動方向は自動的に切り替えられる。３０℃における菌の成長の３０ｈ後の酵素活性を決定するために、５ｎＬのＢｏｄｉｐｙ ＦＬ液滴が、本発明のモジュールを用いて、一連の流体の循環のために２５０ｍＢａｒの圧力、試薬液滴追加のために３００ｍＢａｒの圧力を印加し、５０μｍの半径の穿孔された穴について、ソレノイドバルブ解放のための３ｍｓパルスを発生させて、一連のミリ流体の各液滴内に注入される。液滴追加と蛍光検出との間の４５秒の遅延は、追加モジュールと蛍光モジュールとが３０ｃｍだけ離れて位置することによって得られる。この遅延により、多数の先行試験によって示されるように、酵素活性曲線の線形区間内に各液滴の単一のデータ点を確実に集めることができる。追加された一連の流体の蛍光信号が、図９ｂ（拡大図）に示されている。この曲線において、ベースラインは、空の液滴の信号に対応し、ピークは菌で占められた５５８個の液滴のアミラーゼ活性による蛍光に対応する。

図９ａ及び９ｂは、空の液滴の一定の蛍光強度として表される高品質の追加モジュールを示している。

ミリ流体システムで分析されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ変異ライブラリの酵素活性が図１０に示されており、ライブラリの酵素活性における幅広い分布とともに、空の液滴と菌に占められた液滴との間の完全な区別が観察された。

例２：可変体積注入の例
蛍光により、追加された液滴の体積を決定するために、蛍光色素濃縮液滴が、スペーサーとして気泡を有する希釈された蛍光色素液滴で形成された一連のミリ流体内に追加される。一連のミリ流体発生条件は、前述の例１で示されたものと同一である。ソレノイドバルブの作動は、蛍光による液滴検出に基づく。ＦＩＴＣ蛍光色素 １Ｅ−０４Ｍ液滴が、本発明のモジュール（穿孔された穴の半径：５０μｍ）を用い、ソレノイドバルブ（Ｌｅｅ社製ＶＨＳ型）の開放の１０ｍｓパルス、一連の流体の循環のための１５０ｍＢａｒの圧力、及び試薬液滴追加のための１５０から３００ｍＢａｒの可変圧力を印加して、一連のミリ流体（ＦＩＴＣ蛍光色素 １Ｅ−０６Ｍ液滴）の各液滴内に注入される。一連のミリ流体への注入の完了後、流動は追加された液滴の蛍光信号を記録するために反転される。注入された一連の流体の蛍光信号は図１３に示されており、各ステップは試薬液滴追加の異なる圧力に対応する。圧力の増加とともに試薬液滴の体積の増加が図１４において見られ、これは取得されたビデオのスナップショットに対応する。質量バランスは、ターゲット液滴体積の試薬液滴体積に対する比（Ｖ_Ｔ／Ｖ_Ｒ）の定量化を可能にし、Ｖ_Ｔ／Ｖ_Ｒ＝（Ｃ_Ｆ−Ｃ_Ｔ）／（Ｃ_Ｒ−Ｃ_Ｆ）で表され、Ｃ_Ｆ、Ｃ_Ｔ及びＣ_Ｒは、追加された液滴、ターゲット液滴及び試薬液滴の濃度である。蛍光色素の濃度と蛍光ピークの高さとの間の比が与えられると、Ｃ_Ｆ及びＣ_Ｔは、追加された液滴及びターゲット液滴についての蛍光ピークの高さに対応する。Ｃ_Ｒ／Ｃ_Ｔ＝１００では、各ステップについての平均ピーク高さの値を用いて、（Ｖ_Ｔ／Ｖ_Ｒ）についての計算値は、図１５に印加された圧力の試薬液滴追加の関数としてプロットされる。９８から１６のＶ_Ｔ／Ｖ_Ｒの比が、実験した圧力範囲で観察され、幅広い体積の範囲に渡って、試薬液滴を生成するための開発されたモジュールの柔軟性を明らかにした。この特徴は、マイクロ及びミリ流体システム内の濃度勾配の生成についての潜在的な用途を有している。

例３：メニスカス収縮の増加
注入システムにキャパシタを導入することによるメニスカス収縮の増加を行うために、気泡が試薬リザーバー内に導入される。試薬液滴形成の際の離脱後、メニスカスの位置がビデオ取得によって記録された。図１６は、２．５ｍｌ／ｈで流れるフッ化物オイルＮｏｖｅｃ７５００＋０．５％ ｖ／ｖ パーフルオロオクタノール界面活性剤の流動における、５０μｍの半径の穴を通過する、連続的な試薬流動下における最大メニスカス収縮（水、印加圧力１００ｍＢａｒ）を示している。同一の動作条件を維持して、気泡がない状態で行った平行試験（図１６、左）と比較すると、メニスカス収縮は気泡が存在する場合の方が大きい（図１６、右）。この効果は、試薬液滴が分離した後の気泡の圧縮性によって圧力の変化が大きくなることに起因している。

１ テフロンチューブ
２ 試薬リザーバー
３ 穿孔
４ 注入された試薬液滴
５ 反応体液滴
６ フッ化オイルの連続相
７ 圧縮空気スペーサー
８ アクリル製マニホールドマウント
９ 取付けナット
１０ ソレノイドバルブ

Claims (15)

1. マイクロ流体またはミリ流体デバイスにおける、反応体液滴と試薬液滴とを融合または接触させるための方法であって、
   （ａ）前記マイクロ流体またはミリ流体システムの流路内において、連続相、少なくとも２つの反応体液滴Ａ _ｎ 及びＡ _ｎ＋１ 、並びにｎが０以上の整数である２つの前記反応体液滴Ａ_ｎとＡ_ｎ＋１との間の少なくとも１つのスペーサープラグを含む一連の３相マイクロ／ミリ流体を発生させる段階と、
   （ｂ）インジェクターと呼ぶ側面インレットによって、一連の流体内に、非濡れ性の単一の試薬液滴Ｂとして試薬流体を注入する段階であって、前記試薬液滴Ｂが、前記反応体液滴Ａ_ｎ＋１に直接先行する前記スペーサープラグの注入点の通過の際にその場で生成され、前記反応体液滴Ａ_ｎ＋１が前記注入点に到達する前に、前記インジェクター端部に試薬流体のメニスカスを形成しつつ前記試薬液滴Ｂが前記注入点から離脱し、前記反応体液滴Ａ_ｎ＋１が前記注入点にあるときに前記試薬流体のメニスカスがインジェクターと呼ぶ前記側面インレット内に引き込まれる、段階と、
   （ｃ）前記試薬液滴Ｂが、前記注入点から離れて、前記反応体液滴Ａ_ｎ＋１と融合または接触する段階と、
   （ｄ）ｎ＞１のときに、段階（ｂ）及び（ｃ）を繰り返す段階と、
   を含む、方法。
2. 前記試薬液滴Ｂが、前記注入点に付着した状態を保ち、前記反応体液滴Ａ_ｎ＋１の前方の毛細管ブリッジが前記試薬液滴Ｂに到達する際に分離する、請求項１に記載の方法。
3. ｒが前記試薬液滴の半径であり、Ｒが円筒形の幾何形状を有する前記流路の半径であるか、または平面幾何形状を有する流路の幅の半分もしくは高さの半分である場合に、比ｒ／Ｒが０．１から１の範囲である、請求項１または２に記載の方法。
4. 段階（ｂ）において注入される前記試薬液滴Ｂの体積が、１ｐＬよりも大きい、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. ｄが前記側面インレットの直径であり、Ｄが円筒形の幾何形状を有する前記流路の直径であるか、またはＤが平面幾何形状を有する前記流路の高さもしくは幅である場合に、比ｄ／Ｄが０．０５から０．５の範囲である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記注入が不連続である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記試薬液滴Ｂがバルブ、特にソレノイドバルブによって作動される、請求項６に記載の方法。
8. 段階（ｂ）の前に、前記反応体液滴Ａ_ｎ＋１が、光学的手段、電気的手段、磁気的手段、放射線検出手段、音響手段からなる群から選択された検出手段によって検出される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 段階（ｂ）がさらに、前記反応体液滴Ａ_ｎ＋１を検出する段階の後であって、段階（ｃ）の前に、検出された前記反応体液滴Ａ_ｎ＋１を選択し、それによって、ヌル、すなわち前記試薬液滴Ｂが注入されないか、または前記試薬液滴Ｂの体積が１ｐＬより大きいように、前記試薬液滴Ｂの体積を調整する段階を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記スペーサーが、前記連続相、反応体相、及び試薬相と非混合性である気体または液体である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記スペーサーが、鉱物油などの非混合性液体である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記デバイスがミリ流体デバイスである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. コンビナトリアル化学、化学生物学スクリーニング、遺伝子シーケンシングにおいて使用される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 連続相、少なくとも２つの反応体液滴、ｎが０以上の整数である２つの反応体液滴Ａ_ｎとＡ_ｎ＋１との間の少なくとも１つのスペーサープラグを含む一連の３相マイクロ／ミリ流体で満たされたミリ／マイクロ流体流路管と、
    前記流路管上に開口する開口部であって、前記開口部が液体相の試薬を含むリザーバーと接続された、開口部と、
    前記リザーバー及び前記開口部に結合するバルブであって、試薬液滴Ｂを前記流路管に放出するように構成された、バルブと、
    前記流路管上であって、前記開口部の上流側に配置された検出器であって、前記反応体液滴Ａ _ｎ＋１ が前記開口部に到達する前に、前記試薬液滴Ｂが前記流路管内に注入されるように、前記検出器が、前記反応体液滴Ａ _ｎ＋１ を検出し、前記バルブの開放を前記反応体液滴Ａ _ｎ＋１ の到達と同期させるように構成された、検出器と、を含む、
    ミリ／マイクロ流体デバイス。
15. 前記ミリ／マイクロ流体デバイスが、
    ２つの抵抗Ｒ１及びＲ２が直列接続され、
    前記２つの抵抗の間の接続部が、抵抗Ｒ３と直列に素子ＩＣに接続され、
    前記素子ＩＣが並列に配置されたキャパシタＣ１及び抵抗Ｒ４からなることを含む等価回路に対応し、
    Ｒ１及びＲ１が注入点の両側における一連の液滴の流動抵抗に対応し、
    Ｒ３が試薬リザーバーと前記バルブとの間の流動抵抗に対応し、
    Ｒ４が試薬流体が注入チャンバーを通過する流動に起因する抵抗に対応し、
    Ｃ１が注入チャンバー内部のキャパシタンスに対応する、
    請求項１４に記載のミリ／マイクロ流体デバイス。