JP6675247B2 - Fibroin-hyaluronic acid hydrogel complex - Google Patents
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Description
本発明はフィブロインとヒアルロン酸ハイドロゲルとの複合体に関する。 The present invention relates to a complex of fibroin and hyaluronic acid hydrogel.
生分解性高分子であるヒアルロン酸は、高粘弾性や高保湿性に加え、安全性も高いことから、化粧品分野や医療分野などにおいて利用されている。さらに、ヒアルロン酸は、生体適合性や透明性も高いことから、眼科分野において好ましく用いられている。 Hyaluronic acid, which is a biodegradable polymer, is used in cosmetics and medical fields because of its high viscoelasticity and high moisture retention, as well as high safety. Furthermore, hyaluronic acid is preferably used in the field of ophthalmology because of its high biocompatibility and high transparency.
ヒアルロン酸の水溶液は極めて粘稠な溶液であることから、金属イオンなどの存在下においてヒアルロン酸ゲルを形成し得る。ところが、ヒアルロン酸ハイドロゲルは、一般的に流動性が高く、所望の形状を保持することが困難なものである。そこで、ヒアルロン酸ハイドロゲルの形状を安定化する試みが種々検討されている。 Since the aqueous solution of hyaluronic acid is an extremely viscous solution, it can form a hyaluronic acid gel in the presence of metal ions and the like. However, the hyaluronic acid hydrogel generally has a high fluidity, and it is difficult to maintain a desired shape. Thus, various attempts have been made to stabilize the shape of the hyaluronic acid hydrogel.
例えば、ヒアルロン酸の官能基を重合性基により修飾したヒアルロン酸化合物を重合反応に供して分子内架橋を形成することにより得られる、分子内架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルが知られている（特許文献１を参照）。 For example, an intramolecular crosslinked hyaluronic acid hydrogel obtained by subjecting a hyaluronic acid compound in which a functional group of hyaluronic acid is modified with a polymerizable group to a polymerization reaction to form an intramolecular crosslink is known (Patent Document 1). See).
また、ヒアルロン酸ハイドロゲルの形状安定性が向上したものとして、ヒアルロン酸にコラーゲン及びゼラチンを包含してなるハイドロゲルが知られている（非特許文献１を参照）。 Further, a hydrogel comprising hyaluronic acid containing collagen and gelatin has been known as one having improved shape stability of the hyaluronic acid hydrogel (see Non-Patent Document 1).
一方、組織工学や再生医療工学分野において、新たなスキャフォールド材料としてフィブロインが注目されている。フィブロインは親水性ユニットと疎水性ユニットとが交互に繰り返される構造を有するタンパク質であり、高含水性でありながらも強度と弾性に優れ、細胞培養支持体や組織再生支持体などに利用されている。 On the other hand, fibroin is attracting attention as a new scaffold material in the field of tissue engineering and regenerative medicine engineering. Fibroin is a protein having a structure in which hydrophilic units and hydrophobic units are alternately repeated.It has high water content and excellent strength and elasticity, and is used as a support for cell culture and tissue regeneration. .
フィブロインからなるハイドロゲルやフィブロインを含有させてなるハイドロゲルがいくつか知られており、例えば、フィブロインを凍結乾燥して物理架橋を生じせしめることにより形成されるフィブロインハイドロゲル（特許文献２を参照）、フィブロインを含有するポリビニルアルコールハイドロゲル（特許文献３を参照）、フィブロイン水溶液に共重合性モノマーを添加した後、共重合に供することでゲル状物質を得て、次いで該ゲル状物質を乾燥固化して塊状物を得て、次いで該塊状物を成形することにより得られるコンタクトレンズ（特許文献４を参照）などがある。 Several hydrogels comprising fibroin and hydrogels containing fibroin are known. For example, fibroin hydrogel formed by freeze-drying fibroin to cause physical crosslinking (see Patent Document 2) A fibrin-containing polyvinyl alcohol hydrogel (see Patent Document 3), a copolymerizable monomer is added to an aqueous fibroin solution, and the mixture is subjected to copolymerization to obtain a gel-like substance, and then the gel-like substance is dried and solidified. To obtain a lump, and then molding the lump (see Patent Document 4).
しかし、特許文献１〜４及び非特許文献１に記載のハイドロゲルには、それぞれ以下に記載の問題がある。 However, the hydrogels described in Patent Literatures 1 to 4 and Non-Patent Literature 1 have problems described below, respectively.
特許文献１に記載の分子内架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルは極めて含水量が多いため、医療用材料として用いる場合に、所望の形状を保持するための表面や内部の硬度が十分でないという問題がある。また、当該分子内架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルは、再生医療における細胞培養の足場材として用いる場合に、表面の親水性が高過ぎるために、細胞の成長性及び、形成されるコロニー端部の細胞形状が十分とはいえない。 The intramolecularly crosslinked hyaluronic acid hydrogel described in Patent Document 1 has an extremely large water content, and thus has a problem that when used as a medical material, the hardness of the surface and the inside for maintaining a desired shape is not sufficient. In addition, when the intramolecular cross-linked hyaluronic acid hydrogel is used as a scaffold for cell culture in regenerative medicine, the hydrophilicity of the surface is too high, so that the cell growth and the cell shape at the edge of the formed colony are too high. Is not enough.
非特許文献１に記載のハイドロゲルは、コラーゲンがｐＨなどの周辺環境の影響を受けて、繊維化して不透明になり易い性質を有していることから、眼科用の医療用材料として利用することは好ましくない。また、医療用材料として利用するためには滅菌処理に供することや安全面が重視されるところ、非特許文献１に記載のハイドロゲルは、コラーゲンは主として動物由来であることから、オートクレーブなどの熱処理に供することが困難であり、さらに使用時の免疫反応も懸念されるという問題がある。 The hydrogel described in Non-Patent Document 1 is used as a medical material for ophthalmology because collagen is easily fiberized and opaque under the influence of the surrounding environment such as pH. Is not preferred. Also, in order to use as a medical material, sterilization and safety are considered important. However, the hydrogel described in Non-Patent Document 1 is heat-treated in an autoclave or the like because collagen is mainly derived from animals. However, there is a problem in that it is difficult to provide the same, and there is a concern about an immune reaction at the time of use.
特許文献２に記載のハイドロゲルは、使用するフィブロインの量や凍結時間などの製造条件により、得られるハイドロゲルの性質にばらつきが生じやすく、形状が安定した均質なハイドロゲルとすることができないという問題がある。 According to the hydrogel described in Patent Document 2, the properties of the obtained hydrogel tend to vary depending on the production conditions such as the amount of fibroin used and the freezing time, and it is not possible to obtain a homogeneous hydrogel having a stable shape. There's a problem.
特許文献３及び４に記載のハイドロゲルは、ともにフィブロインを内包した状態で含有させたハイドロゲルであるところ、ハイドロゲル内のフィブロインの存在により架橋構造が疎になり、形状安定性が劣るという問題がある。特に、特許文献３に記載のハイドロゲルは、放射線照射による物理的架橋により形成されるものであることから、形状安定性が著しく低い可能性がある。 The hydrogels described in Patent Documents 3 and 4 are both hydrogels containing fibroin in a state of being encapsulated therein. However, the presence of fibroin in the hydrogel causes the crosslinked structure to become loose, resulting in poor shape stability. There is. In particular, since the hydrogel described in Patent Document 3 is formed by physical crosslinking by irradiation with radiation, the shape stability may be extremely low.
また、特許文献３には、アルデヒド系化合物を架橋剤として用いることによって、化学的架橋によりハイドロゲルを形成しているところ、アルデヒド系化合物は生体に対する毒性を有することから、特許文献３に記載のハイドロゲルは安全性に問題がある。同様に、特許文献４に記載のハイドロゲルは、添加する共重合性モノマーが生体適合性を有していないことから、やはり安全性に問題があり、再生医療用材料としては好ましくないという問題がある。 Patent Document 3 discloses that a hydrogel is formed by chemical cross-linking by using an aldehyde compound as a cross-linking agent. However, since the aldehyde compound has toxicity to a living body, it is described in Patent Document 3. Hydrogels have safety issues. Similarly, the hydrogel described in Patent Document 4 also has a problem in safety because the copolymerizable monomer to be added does not have biocompatibility, and thus is not preferable as a material for regenerative medicine. is there.
上記のとおり、特許文献１〜４及び非特許文献１に記載のハイドロゲルには、形状安定性及び細胞接着性や安全性といった生体適合性の観点で、問題がある。したがって、特許文献１〜４及び非特許文献１に記載のハイドロゲルは、これら種々の問題により、生体に対する医療用デバイスとしては適していないという課題がある。 As described above, the hydrogels described in Patent Literatures 1 to 4 and Non-Patent Literature 1 have problems in view of shape stability and biocompatibility such as cell adhesion and safety. Therefore, the hydrogels described in Patent Literatures 1 to 4 and Non-Patent Literature 1 have a problem that they are not suitable as a medical device for a living body due to these various problems.
そこで、本発明の目的は、上記課題を鑑み、高含水性であるにも関わらず、形状が安定的に維持され、かつ、細胞培養支持体や組織再生支持体などとして利用が可能である生体適合性を有するハイドロゲルを提供することにある。 In view of the above problems, it is an object of the present invention to provide a living body that is stably maintained in shape despite having high water content, and can be used as a cell culture support, a tissue regeneration support, or the like. It is to provide a hydrogel having compatibility.
本発明者らは、上記課題を解決するために種々検討したところ、ともに生体適合性があるヒアルロン酸及びフィブロインを用いることにより、生体適合性に優れた医療用デバイスが製造できるのではないかと考えた。 The present inventors have conducted various studies in order to solve the above-described problems, and thought that a medical device with excellent biocompatibility can be manufactured by using hyaluronic acid and fibroin, both of which are biocompatible. Was.
しかし、フィブロインは水溶液の状態で用いられるのが一般的であるところ、フィブロイン水溶液は自己凝集的に会合しゲル化する性質を有することから、ハイドロゲル中にフィブロインを均一に配して均質な複合体を形成することが困難であることを見出した。結果として、フィブロインを内包した状態で含有させたハイドロゲルは、利用範囲が限られたものであった。 However, since fibroin is generally used in the form of an aqueous solution, the fibroin aqueous solution has a property of self-aggregating and gelling, so that fibroin is uniformly arranged in a hydrogel and a homogeneous complex is formed. It has been found that it is difficult to form a body. As a result, the hydrogel containing fibroin in a contained state has a limited use range.
そこで、本発明者らはさらに研究開発を進めたところ、フィブロイン膜、特にフィブロイン超薄膜に着眼するに至った。そして、後述する実施例に記載の方法によるなどして、予め均質なものとして膜状に形成したフィブロインをゲルの表面又は全部を覆うようにして用いることで、フィブロインが均一に配置されたハイドロゲルを形成することに成功した。また、このようなハイドロゲルは、フィブロインの膜厚や配する部位をコントロールすることにより、所望の性能を有したものとすることが可能である。本発明は、これらの知見や成功例に基づき完成された発明である。 Then, the present inventors further proceeded with research and development, and came to focus on a fibroin film, particularly an ultrathin fibroin film. Then, by using the fibroin formed in a film form as a homogeneous material in advance so as to cover the entire surface or the entire surface of the gel, for example, by a method described in Examples described later, a hydrogel in which fibroin is uniformly arranged is used. Successfully formed. Further, such a hydrogel can have desired performance by controlling the film thickness of fibroin and the site where the fibroin is disposed. The present invention has been completed based on these findings and successful examples.
したがって、本発明によれば、フィブロインを含むフィブロイン層と、構成単位として（メタ）アクリル化ヒアルロン酸を含むヒアルロン酸ハイドロゲル層とを含む複合体が提供される。 Therefore, according to the present invention, there is provided a composite comprising a fibroin layer containing fibroin and a hyaluronic acid hydrogel layer containing (meth) acrylated hyaluronic acid as a constituent unit.
好ましくは、本発明の複合体において、前記フィブロイン層は、厚さが１〜５００ｎｍであるフィブロイン層である。
好ましくは、本発明の複合体において、前記（メタ）アクリル化ヒアルロン酸は、（メタ）アクリル酸アルキルイソシアネート又は（メタ）アルキルオキシアルキルイソシアネートと、ヒアルロン酸との縮合体である。
好ましくは、本発明の複合体において、前記フィブロイン層が、前記複合体の最外層として位置している。
Preferably, in the composite of the present invention, the fibroin layer is a fibroin layer having a thickness of 1 to 500 nm.
Preferably, in the composite of the present invention, the (meth) acrylated hyaluronic acid is a condensate of (meth) acrylic acid alkyl isocyanate or (meth) alkyloxyalkyl isocyanate with hyaluronic acid.
Preferably, in the composite of the present invention, the fibroin layer is located as the outermost layer of the composite.
本発明の複合体は、ヒアルロン酸ハイドロゲルの表面の一部又は全部をフィブロインにより被覆したものとすることにより、ヒアルロン酸ハイドロゲルの特徴である、優れた透明性、生体適合性及び柔軟性を保持したまま、形状の安定性も兼ね備えたものとすることができることから、所望の形状に成形することができる応用範囲の広いものである。 The composite of the present invention has excellent transparency, biocompatibility and flexibility, which are characteristics of hyaluronic acid hydrogel, by covering a part or all of the surface of hyaluronic acid hydrogel with fibroin. Since it is possible to maintain the shape while maintaining the shape, it can be formed into a desired shape.
本発明の複合体は、従来のヒアルロン酸ハイドロゲルのようにコラーゲンやゼラチンを含有するものとすることができ、さらにはこれらを含有させずに耐熱性を有するものとすることができる。したがって、本発明の複合体は、オートクレーブによる滅菌処理に供することができ、安全性に対し高い優位性を有するものとすることができる。 The complex of the present invention can contain collagen or gelatin like a conventional hyaluronic acid hydrogel, and can have heat resistance without containing these. Therefore, the complex of the present invention can be subjected to a sterilization treatment using an autoclave, and can have high safety advantages.
以下、本発明の詳細について説明する。
本発明の複合体は、フィブロインを含むフィブロイン層と、構成単位として（メタ）アクリル化ヒアルロン酸を含むヒアルロン酸ハイドロゲル層とを少なくとも含む。
Hereinafter, details of the present invention will be described.
The composite of the present invention includes at least a fibroin layer containing fibroin and a hyaluronic acid hydrogel layer containing (meth) acrylated hyaluronic acid as a constituent unit.
［（メタ）アクリル化ヒアルロン酸］
ヒアルロン酸ハイドロゲル層は、構成単位である（メタ）アクリル化ヒアルロン酸における（メタ）アクリル基を重合反応に供することにより、分子内に架橋構造を形成させたヒアルロン酸ハイドロゲルを少なくとも含む。
[(Meth) acrylated hyaluronic acid]
The hyaluronic acid hydrogel layer contains at least a hyaluronic acid hydrogel in which a (meth) acryl group in the (meth) acrylated hyaluronic acid as a structural unit is subjected to a polymerization reaction to form a crosslinked structure in the molecule.
（メタ）アクリル化ヒアルロン酸は、側鎖を（メタ）アクリレート化したヒアルロン酸の誘導体であれば特に限定されない。 The (meth) acrylated hyaluronic acid is not particularly limited as long as it is a derivative of hyaluronic acid in which the side chain is (meth) acrylated.
（メタ）アクリル化ヒアルロン酸の具体的態様としては、例えば、ヒアルロン酸の一級水酸基にウレタン結合させた、置換されていてもよい（メタ）アクリル酸アルキルイソシアネート又は（メタ）アクリル酸アルキルオキシアルキルイソシアネートを有する重合性ヒアルロン酸誘導体が挙げられる。 Specific examples of the (meth) acrylated hyaluronic acid include, for example, an optionally substituted alkyl (meth) acrylate or alkyloxyalkyl isocyanate (meth) acrylate in which a primary hydroxyl group of hyaluronic acid is urethane-bonded. And a polymerizable hyaluronic acid derivative having the formula:
上記の重合性ヒアルロン酸誘導体は、例えば、置換されていてもよい（メタ）アクリル酸アルキルイソシアネート又は（メタ）アクリル酸アルキルオキシアルキルイソシアネートのイソシアネート基（−ＮＣＯ）と、ヒアルロン酸分子中の一級水酸基（−ＣＨ２−ＯＨ）とがウレタン結合（−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｏ−）を形成したものであり得る。 The polymerizable hyaluronic acid derivative includes, for example, an isocyanate group (—NCO) of an optionally substituted alkyl (meth) acrylate or alkyloxyalkyl isocyanate (meth) acrylate, and a primary hydroxyl group in a hyaluronic acid molecule. (—CH 2 —OH) may form a urethane bond (—NHC (O) —O—).
本明細書における「置換されていてもよい」とは、（メタ）アクリル酸アルキルイソシアネート又は（メタ）アクリル酸アルキルオキシアルキルイソシアネートにおける（メタ）アクリル基が、１以上の置換基を有することにより、置換された（メタ）アクリル基であり得ることを意味する。なお、（メタ）アクリル基とは、アクリル基（ＣＨ２＝ＣＨＣＯＯ−）又はメタクリル基（ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯ−）を意味する。 In the present specification, “may be substituted” means that the (meth) acryl group in the alkyl (meth) acrylate isocyanate or the alkyloxyalkyl isocyanate (meth) acrylate has one or more substituents, It means that it may be a substituted (meth) acryl group. Incidentally, (meth) acrylic group, acrylic group (CH 2 = CHCOO-) or methacrylic group (CH 2 = C (CH 3 ) COO-) means.
（メタ）アクリル化ヒアルロン酸の好ましい態様としては、例えば、下記一般式（１）
で示される（メタ）アクリル化ヒアルロン酸や下記一般式（２）
で示される（メタ）アクリル化ヒアルロン酸が挙げられる。
Preferred embodiments of the (meth) acrylated hyaluronic acid include, for example, the following general formula (1)
(Meth) acrylated hyaluronic acid represented by the following general formula (2)
And (meth) acrylated hyaluronic acid.
上記一般式（１）及び（２）で示される（メタ）アクリル化ヒアルロン酸は、例えば、それぞれ、ヒアルロン酸の一級水酸基と、下記一般式（３）
で示される（メタ）アクリル酸アルキルイソシアネートや下記一般式（４）
で示される（メタ）アクリル酸アルキルオキシアルキルイソシアネートとがウレタン結合を形成してなるものである。
The (meth) acrylated hyaluronic acid represented by the above general formulas (1) and (2) is, for example, each of a primary hydroxyl group of hyaluronic acid and the following general formula (3)
(Meth) acrylic acid alkyl isocyanate represented by the following general formula (4)
And a (meth) acrylate alkyloxyalkyl isocyanate forming a urethane bond.
（メタ）アクリル化ヒアルロン酸において、ヒアルロン酸の一級水酸基に結合する（メタ）アクリル酸アルキルイソシアネートや（メタ）アクリル酸アルキルオキシアルキルイソシアネートの数、すなわち、（メタ）アクリル化ヒアルロン酸における（メタ）アクリル基の数は、特に限定されないが、例えば、（メタ）アクリル基の数により重合反応に供して形成されるヒアルロン酸ハイドロゲルの柔軟性や取り扱い易さが変動することから、（メタ）アクリル化ヒアルロン酸分子中の一級水酸基の総数に対する（メタ）アクリル基の数の割合は１〜５０％であることが好ましく、２０〜４０％であることがより好ましい。（メタ）アクリル化ヒアルロン酸において、ヒアルロン酸の一級水酸基に結合するものは、（メタ）アクリル酸アルキルイソシアネート及び（メタ）アクリル酸アルキルオキシアルキルイソシアネートのいずれか一方又は（メタ）アクリル酸アルキルイソシアネート及び（メタ）アクリル酸アルキルオキシアルキルイソシアネートの両方であり得る。 In (meth) acrylated hyaluronic acid, the number of alkyl (meth) acrylates or alkyloxyalkyl isocyanates (meth) acrylates bonded to primary hydroxyl groups of hyaluronic acid, that is, (meth) in (meth) acrylated hyaluronic acid Although the number of acrylic groups is not particularly limited, for example, (meth) acrylic acid is used because the flexibility and ease of handling of a hyaluronic acid hydrogel formed by subjecting to a polymerization reaction vary depending on the number of (meth) acrylic groups. The ratio of the number of (meth) acryl groups to the total number of primary hydroxyl groups in the functionalized hyaluronic acid molecule is preferably 1 to 50%, more preferably 20 to 40%. In the (meth) acrylated hyaluronic acid, the one bonded to the primary hydroxyl group of the hyaluronic acid is one of the alkyl (meth) acrylate and the alkyloxyalkyl isocyanate (meth) acrylate or the alkyl isocyanate (meth) acrylate. It can be both an alkyloxyalkyl isocyanate (meth) acrylate.
上記一般式（３）及び（４）で示される（メタ）アクリル酸イソシアネートの好ましい態様は、例えば、これらを利用して得られるヒアルロン酸ハイドロゲルの形状保持性や柔軟性を考慮した場合、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ水素原子であることが好ましく、ｘ及びｙはそれぞれ独立して１又は２であることが好ましく、及び／又はＲ３はメチル基であることが好ましい。上記一般式（３）及び（４）で示される（メタ）アクリル化イソシアネートの具体例としては、例えば、２−イソシアネートエチルメタクリレートや２−（２−イソシアネートエチルオキシ）エチルメタクリレートなどが挙げられる。 Preferred embodiments of the (meth) acrylic acid isocyanates represented by the above general formulas (3) and (4) are, for example, those in which the shape retention and flexibility of the hyaluronic acid hydrogel obtained by using these are considered. 1 and R 2 are preferably each a hydrogen atom, x and y are each independently preferably 1 or 2, and / or R 3 is preferably a methyl group. Specific examples of the (meth) acrylated isocyanate represented by the general formulas (3) and (4) include, for example, 2-isocyanatoethyl methacrylate and 2- (2-isocyanatoethyloxy) ethyl methacrylate.
上記一般式（３）及び（４）で示される（メタ）アクリル酸イソシアネートやその他の（メタ）アクリル酸イソシアネートは、その入手方法について特に限定されず、例えば、市販のものを用いてもよいし、米国特許２８２１５４４号明細書や特開昭５４−００５９２１号公報などを参照して合成することもできる。 The method for obtaining the (meth) acrylate isocyanate and the other (meth) acrylate isocyanates represented by the general formulas (3) and (4) is not particularly limited, and for example, commercially available ones may be used. It can also be synthesized with reference to U.S. Pat. No. 2,821,544 and JP-A-54-005921.
（メタ）アクリル化ヒアルロン酸を構成するヒアルロン酸は当業者に通常知られているとおりのものであれば特に限定されず、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルクロン酸を二糖単位として連結した構造をとるものである。ヒアルロン酸の分子量は、特に制限はないが、例えば、２０万〜２００万が好ましく、より好ましくは６０万〜１００万である。ヒアルロン酸における二糖単位の繰り返し数（ｎ）は、特に限定されないが、例えば、５００〜５，０００が好ましく、より好ましくは１，０００である。ヒアルロン酸は、市販のものの他に、当業者に知られる方法により天然物から単離したもの、微生物などを用いて合成したものなどを広く挙げることができる。 The hyaluronic acid constituting the (meth) acrylated hyaluronic acid is not particularly limited as long as it is generally known to those skilled in the art. For example, a structure in which N-acetylglucosamine and glucuronic acid are linked as a disaccharide unit is used. Take it. The molecular weight of hyaluronic acid is not particularly limited, but is preferably, for example, 200,000 to 2,000,000, and more preferably 600,000 to 1,000,000. The number of repeating disaccharide units (n) in hyaluronic acid is not particularly limited, but is preferably, for example, 500 to 5,000, and more preferably 1,000. Examples of hyaluronic acid include a commercially available product, a product isolated from a natural product by a method known to those skilled in the art, and a product synthesized using a microorganism or the like.
（メタ）アクリル化ヒアルロン酸を入手する方法は特に限定されず、例えば、特許文献１に記載の方法に従って、２−イソシアネートエチルメタクリレートや２−（２−イソシアネートエチルオキシ）エチルメタクリレートなどの（メタ）アクリル酸イソシアネートと、ヒアルロン酸との反応により製造され得る。 The method for obtaining the (meth) acrylated hyaluronic acid is not particularly limited. For example, according to the method described in Patent Document 1, (meth) such as 2-isocyanatoethyl methacrylate or 2- (2-isocyanatoethyloxy) ethyl methacrylate It can be produced by reacting acrylic acid isocyanate with hyaluronic acid.
（メタ）アクリル化ヒアルロン酸の好ましい具体例としては、例えば、下記一般式（５）
で示される化合物や下記一般式（６）
で示される化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
Preferred specific examples of the (meth) acrylated hyaluronic acid include, for example, the following general formula (5)
Or a compound represented by the following general formula (6)
However, the present invention is not limited thereto.
（メタ）アクリル化ヒアルロン酸の合成方法は特に限定されないが、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの非プロトン性極性溶媒にヒアルロン酸塩を分散させたヒアルロン酸分散液をアルカリ性にして、ヒアルロン酸の一級水酸基を活性化状態（−ＣＨ２−Ｏ−）にさせたヒアルロン酸反応溶液を得て、次いでこのヒアルロン酸反応溶液に（メタ）アクリル酸イソシアネートを滴下して、室温で数時間、攪拌又は静置して反応させる方法が挙げられる。反応終了後は、適当な酸溶液を用いて、室温で数時間攪拌又は静置して中和処理を実施することが好ましい。 The method for synthesizing the (meth) acrylated hyaluronic acid is not particularly limited. For example, a hyaluronic acid dispersion obtained by dispersing a hyaluronic acid salt in an aprotic polar solvent such as dimethyl sulfoxide (DMSO) is made alkaline to prepare a hyaluronic acid. A hyaluronic acid reaction solution having a primary hydroxyl group in an activated state (—CH 2 —O − ) is obtained, and then (meth) acrylic acid isocyanate is added dropwise to the hyaluronic acid reaction solution, followed by stirring at room temperature for several hours or A method of allowing the reaction to stand still is used. After completion of the reaction, it is preferable to carry out neutralization treatment by stirring or standing at room temperature for several hours using an appropriate acid solution.
［ヒアルロン酸ハイドロゲル層］
ヒアルロン酸ハイドロゲル層に含まれるヒアルロン酸ハイドロゲルは、構成単位である（メタ）アクリル化ヒアルロン酸における（メタ）アクリル基を重合反応に供することにより、分子内に架橋構造を形成させたものである。
[Hyaluronic acid hydrogel layer]
The hyaluronic acid hydrogel contained in the hyaluronic acid hydrogel layer has a crosslinked structure formed in the molecule by subjecting the (meth) acryl group in the (meth) acrylated hyaluronic acid, which is a structural unit, to a polymerization reaction. is there.
ヒアルロン酸ハイドロゲルの合成方法は特に限定されないが、例えば、後述する実施例に記載があるとおり、一般的なポリマー形成方法として、（メタ）アクリル化ヒアルロン酸を溶媒に溶解又は分散させたモノマー含有溶液中に、重合開始剤及び、必要に応じて、ゲル化剤などを添加した後、これらを重合開始剤の特性に応じた重合反応に供する方法が挙げられる。（メタ）アクリル化ヒアルロン酸を溶解又は分散させる溶媒は特に限定されず、例えば、（メタ）アクリル化ヒアルロン酸に可溶性である溶媒であり、好ましくは水である。モノマー含有溶液における（メタ）アクリル化ヒアルロン酸の濃度は特に限定されず、例えば、０．０１〜２０％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは０．１〜１０％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは１〜５％（ｗ／ｖ）である。 The method for synthesizing the hyaluronic acid hydrogel is not particularly limited. For example, as described in Examples described later, as a general method for forming a polymer, a monomer containing (meth) acrylated hyaluronic acid dissolved or dispersed in a solvent is used. After adding a polymerization initiator and, if necessary, a gelling agent to the solution, a method of subjecting them to a polymerization reaction according to the characteristics of the polymerization initiator may be mentioned. The solvent for dissolving or dispersing the (meth) acrylated hyaluronic acid is not particularly limited, and is, for example, a solvent that is soluble in (meth) acrylated hyaluronic acid, and is preferably water. The concentration of the (meth) acrylated hyaluronic acid in the monomer-containing solution is not particularly limited, and is, for example, 0.01 to 20% (w / v), and preferably 0.1 to 10% (w / v). , More preferably 1 to 5% (w / v).
重合開始剤は特に限定されないが、例えば、アゾビスバレロニトリルやアゾビスイソブチロニトリルなどのアゾ系化合物；ラウロイルパーオキサイドやベンゾイルパーオキサイドなどの過酸化物；ペルオキソ二硫酸アンモニウムなどの一般的なラジカル重合開始剤が使用できる。重合開始剤の配合量は特に限定されないが、例えば、モノマー総量に対して１０〜１０，０００ｐｐｍであることが好ましい。 Although the polymerization initiator is not particularly limited, for example, azo compounds such as azobisvaleronitrile and azobisisobutyronitrile; peroxides such as lauroyl peroxide and benzoyl peroxide; general radicals such as ammonium peroxodisulfate A polymerization initiator can be used. The amount of the polymerization initiator is not particularly limited, but is preferably, for example, 10 to 10,000 ppm based on the total amount of the monomers.
モノマー含有溶液中に、テトラメチルエチレンジアミン、トリメチルエチレンジアミン、ジメチルエチレンジアミン、テトラエチルエチレンジアミン、トリメチルエチレンジアミン、トリエチルエチレンジアミン、ジエチルエチレンジアミンといった脂肪族アミンなどをゲル化剤として併せて添加することで、重合反応に際してポリマー化が促進されることから、これらのゲル化剤を用いることが好ましい。ゲル化剤の配合量は特に限定されないが、例えば、モノマー含有溶液１ｍＬに対し、１〜５０μＬが好ましい。 In the monomer-containing solution, by adding an aliphatic amine such as tetramethylethylenediamine, trimethylethylenediamine, dimethylethylenediamine, tetraethylethylenediamine, trimethylethylenediamine, triethylethylenediamine, diethylethylenediamine, etc. as a gelling agent, polymerization during the polymerization reaction is performed. It is preferable to use these gelling agents because they are promoted. The amount of the gelling agent is not particularly limited, but is preferably, for example, 1 to 50 μL per 1 mL of the monomer-containing solution.
重合反応の条件は、使用した重合開始剤の特性に応じて適宜設定すればよく、特に限定されず、例えば、モノマー含有溶液を室温下、加温下、加熱下、可視光、紫外線、電子線、ガンマ線などの光線照射下において、数分間〜数十時間で重合を完了させる条件を挙げることができる。重合反応の具体的な条件としては、例えば、段階的又は連続的に２５℃〜４０℃の範囲で昇温し、６〜２４時間で重合を完了させる条件が挙げられるが、これらに限定されない。 The polymerization reaction conditions may be appropriately set according to the characteristics of the polymerization initiator used, and are not particularly limited.For example, a monomer-containing solution is heated at room temperature, heated, heated, visible light, ultraviolet light, electron beam. And the conditions for completing polymerization in several minutes to several tens of hours under irradiation of light rays such as gamma rays. Specific conditions for the polymerization reaction include, for example, conditions in which the temperature is raised stepwise or continuously in the range of 25 ° C to 40 ° C and the polymerization is completed in 6 to 24 hours, but is not limited thereto.
重合反応により得た重合体を、室温以外の温度で重合反応を実施した場合には得られた重合体を室温に戻した後、水に数時間〜数十時間、例えば、２〜２４時間浸漬させることにより水和膨潤させると、所望のヒアルロン酸ハイドロゲルが得られる。水和膨潤の際には、未反応の（メタ）アクリル化ヒアルロン酸及び触媒などを除去することが好ましい。 When the polymer obtained by the polymerization reaction is subjected to a polymerization reaction at a temperature other than room temperature, after the obtained polymer is returned to room temperature, it is immersed in water for several hours to several tens of hours, for example, 2 to 24 hours. The desired hyaluronic acid hydrogel is obtained by hydration and swelling. Upon hydration swelling, it is preferable to remove unreacted (meth) acrylated hyaluronic acid and a catalyst.
ヒアルロン酸ハイドロゲルは、（メタ）アクリル化ヒアルロン酸の単独重合体でもよく、その他の重合性官能基を有するモノマーとの共重合体であってもよい。ヒアルロン酸ハイドロゲル層の厚さは特に限定されず、例えば、用途に応じて適宜設定することができる。 The hyaluronic acid hydrogel may be a homopolymer of (meth) acrylated hyaluronic acid or a copolymer with another monomer having a polymerizable functional group. The thickness of the hyaluronic acid hydrogel layer is not particularly limited, and can be appropriately set, for example, depending on the application.
［フィブロイン］
フィブロイン層は、フィブロインを少なくとも含む。
[Fibroin]
The fibroin layer contains at least fibroin.
フィブロインは、通常繊維状タンパク質の一種として知られているとおりのものであれば特に限定されないが、例えば、家蚕、野蚕、天蚕などの天然蚕やトランスジェニック蚕から産生されるフィブロインが挙げられる。フィブロインは、例えば、ＣＡＳ登録番号が９００７−７６−５であるものとして知られている。 The fibroin is not particularly limited as long as it is generally known as a kind of fibrous protein, and examples include fibroin produced from natural silkworms such as domestic silkworms, wild silkworms, natural silkworms, and transgenic silkworms. Fibroin is known, for example, as having a CAS Registry Number of 9007-76-5.
フィブロインは、その入手方法については特に限定されず、例えば、市販品として入手すること、繭からの抽出や絹糸腺からの抽出などのこれまでに知られている抽出方法を利用することなどが挙げられる。 The method of obtaining fibroin is not particularly limited.Examples include obtaining it as a commercial product, and using a conventionally known extraction method such as extraction from a cocoon or extraction from a silk gland. Can be
［フィブロイン層］
フィブロイン層はフィブロインを少なくとも含めば特に限定されず、その入手方法についても特に限定されないが、例えば、市販品として入手してもよく、通常知られているフィブロインの製造方法、特にフィブロイン膜の製造方法を利用して入手してもよい。
[Fibroin layer]
The fibroin layer is not particularly limited as long as it contains at least fibroin, and the method of obtaining the fibroin is not particularly limited.For example, it may be obtained as a commercial product, a generally known method for producing fibroin, and particularly a method for producing a fibroin membrane. It may be obtained by using.
フィブロイン膜の製造方法は特に限定されないが、例えば、後述する実施例に記載があるとおり、フィブロインを含有するフィブロイン水溶液を用いる方法が挙げられる。フィブロインは溶解性が悪く、直接水に溶解することが困難である傾向にある。フィブロイン水溶液を得る方法は特に限定されず、公知のいかなる手法を用いてもよいが、例えば、高濃度の臭化リチウム水溶液にフィブロインを溶解後、透析による脱塩及び風乾による濃縮を経る手法が簡便であることから好ましい。ここで、臭化リチウム水溶液における臭化リチウムの濃度は特に限定されないが、例えば、８〜１０Ｍが好ましく、８．５〜９．５Ｍがより好ましい。臭化リチウム水溶液の濃度が、上記範囲内であると、フィブロイン水溶液がゲル化しにくく、安定して均一な膜厚のフィブロイン膜を得ることができる傾向がある。 The method for producing the fibroin membrane is not particularly limited, and examples thereof include a method using an aqueous fibroin solution containing fibroin, as described in Examples described later. Fibroin has poor solubility and tends to be difficult to directly dissolve in water. The method for obtaining the aqueous fibroin solution is not particularly limited, and any known method may be used.For example, a method in which fibroin is dissolved in a high-concentration lithium bromide aqueous solution, followed by desalting by dialysis and concentration by air drying is simple. Is preferred. Here, the concentration of lithium bromide in the aqueous lithium bromide solution is not particularly limited, but is preferably, for example, 8 to 10 M, and more preferably 8.5 to 9.5 M. When the concentration of the aqueous lithium bromide solution is within the above range, the aqueous fibroin solution is less likely to gel, and a fibroin film having a stable and uniform thickness tends to be obtained.
フィブロイン水溶液中のフィブロイン濃度は特に限定されないが、例えば、０．０１〜１０．０質量％であることが好ましく、０．０５〜５．０質量％であることがより好ましく、０．１〜２．０質量％であることがさらに好ましい。 The fibroin concentration in the aqueous fibroin solution is not particularly limited, but is, for example, preferably 0.01 to 10.0% by mass, more preferably 0.05 to 5.0% by mass, and 0.1 to 2% by mass. More preferably, it is 0.0% by mass.
フィブロイン水溶液は、フィブロイン膜を形成するに際して有用又は無害な無機塩類などの添加剤を含んでいてもよい。 The aqueous fibroin solution may contain additives such as inorganic salts that are useful or harmless in forming a fibroin film.
フィブロイン水溶液に添加する添加剤は、フィブロインの不溶化を促進する効果を有する添加剤であることが好ましい。添加剤としては、例えば、水溶性モノアルコール、ジオール、トリオール、ポリオールなどを用いることができ、メタノール、エタノール、ブタノール、イソプロピルアルコール、グリセリンを好ましく用いることができる。これらの添加剤は、単独で、又は２種類以上を組み合わせて使用することができる。 The additive added to the aqueous fibroin solution is preferably an additive having an effect of promoting the insolubilization of fibroin. As the additive, for example, a water-soluble monoalcohol, diol, triol, polyol or the like can be used, and methanol, ethanol, butanol, isopropyl alcohol, and glycerin can be preferably used. These additives can be used alone or in combination of two or more.
添加剤を含むフィブロイン水溶液中の添加剤の含有量は特に限定されないが、例えば、０．０５〜１０．０質量％であることが好ましく、０．１〜５．０質量％であることがより好ましく、０．８〜３．０質量％であることがさらに好ましい。添加剤の含有量がこの範囲内であるとフィブロイン膜の不溶化が促進される傾向がある。また、添加剤としてアルコール類の含有量が３．０質量％以下である場合、アルコール類を添加したフィブロイン水溶液を静置しても、ゲル化が起こりにくく、結果として安定して均一な膜厚のフィブロイン膜が得られる傾向がある。フィブロイン水溶液にアルコール類を添加する際に起こりやすいゲル化を予防するために、目的とするフィブロイン濃度よりも高濃度なフィブロイン水溶液を予め調製しておき、そこにアルコール類の希釈水溶液を加えることが好ましい。 The content of the additive in the aqueous fibroin solution containing the additive is not particularly limited, but is preferably, for example, 0.05 to 10.0% by mass, and more preferably 0.1 to 5.0% by mass. More preferably, it is 0.8 to 3.0% by mass. When the content of the additive is within this range, insolubilization of the fibroin membrane tends to be promoted. Further, when the content of the alcohol as an additive is 3.0% by mass or less, gelation is unlikely to occur even when the aqueous fibroin solution to which the alcohol is added is left, and as a result, a stable and uniform film thickness is obtained. Tends to be obtained. In order to prevent gelation that is likely to occur when alcohols are added to an aqueous fibroin solution, a fibroin aqueous solution having a higher concentration than the intended fibroin concentration is prepared in advance, and a diluted aqueous solution of alcohols is added thereto. preferable.
フィブロイン膜の厚さは特に限定されない。例えば、自己密着性、吸水性、乾燥状態での柔軟性などの特性がより優れたものとなることから、フィブロイン膜の厚さは、１〜５００ｎｍの範囲内であることが好ましく、４０〜３００ｎｍであることがより好ましく、４０〜２５０ｎｍの範囲内であることがさらに好ましく、４０〜２００ｎｍの範囲内であることがなおさらに好ましい。フィブロイン層は、このような厚さを有するフィブロイン膜からなるフィブロイン層であることが好ましい。 The thickness of the fibroin membrane is not particularly limited. For example, since the properties such as self-adhesion, water absorption, and flexibility in a dry state are more excellent, the thickness of the fibroin film is preferably in the range of 1 to 500 nm, and 40 to 300 nm. Is more preferably in the range of 40 to 250 nm, and still more preferably in the range of 40 to 200 nm. The fibroin layer is preferably a fibroin layer composed of a fibroin membrane having such a thickness.
フィブロイン膜の好ましい態様は、例えば、９９質量％以上のフィブロインで構成され、厚さが１００〜２００ｎｍであり、かつ、透明性を有する薄膜であり、これはフィブロイン水溶液をフィルム化することなどで得られる。フィルム化することによりフィブロインが均質になって構造が安定化するために、本発明の複合体の形成過程において、フィブロインの凝集を抑止することが可能となる。 A preferred embodiment of the fibroin membrane is, for example, a thin film having a thickness of 100 to 200 nm and having transparency, which is composed of 99% by mass or more of fibroin, and which is obtained by forming a fibroin aqueous solution into a film. Can be Since the fibroin is homogenized and the structure is stabilized by forming the film, the aggregation of the fibroin can be suppressed in the process of forming the complex of the present invention.
フィブロイン膜は、例えば、フィブロイン水溶液を支持基材上へ塗布することにより製造することができる。支持基材上へのフィブロイン水溶液の塗布の方法としては、例えば、キャスト法、スピンコート法、スプレーコート法、ダイコート法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。支持基材上へフィブロイン水溶液を塗布した後、通常知られているとおりの方法で支持基材の全体又は主として塗布面を乾燥することが好ましい。 The fibroin membrane can be produced, for example, by applying a fibroin aqueous solution onto a supporting substrate. Examples of the method of applying the aqueous fibroin solution on the supporting substrate include, but are not limited to, a casting method, a spin coating method, a spray coating method, and a die coating method. After applying the aqueous fibroin solution onto the support substrate, it is preferable to dry the entire support substrate or mainly the coated surface by a generally known method.
支持基材は、平滑な面を有するものであれば特に限定されず、例えば、シート状又はロール状の支持基材が挙げられる。支持基材の材質は特に限定されず、例えば、熱可塑性樹脂及び熱硬化性樹脂などが挙げられ、具体的には、ポリエチレン（高密度、中密度又は低密度）、ポロプロピレン（アイソタクチック型又はシンジオタクチック型）、ポリブテン、エチレン−プレピレン共重合体、エチレン−酢酸ビニル共重合体（ＥＶＡ）、エチレン−プロピレン−ブテン共重合体等のポリオレフィン、環状ポリオレフィン、変性ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリカーボネート、ポリ−（４−メチルベンテン−１）、アイオノマー、アクリル系樹脂、ポリメチルメタクリレート、ポリブチル（メタ）アクリレート、メチル（メタ）アクリレート−ブチル（メタ）アクリレート共重合体、メチル（メタ）アクリレート−スチレン共重合体、アクリル−スチレン共重合体（ＡＳ樹脂）、ブタジエン−スチレン共重合体、ポリオ共重合体（ＥＶＯＨ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、エチレン−テレフタレート−イソフタレート共重合体、ポリエチレンナフタレート、プリシクロヘキサンテレフタレート（ＰＣＴ）等のポリエステル、ポリエーテル、ポリエーテルケトン（ＰＥＫ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルイミド、ポリアセタール（ＰＯＭ）、ポリフェニレンオキシド、変性ポリフェニレンオキシド、ポリアリレート、芳香族ポリエステル（液晶ポリマー）、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、その他フッ素系樹脂、スチレン系、ポリオレフィン系、ポリ塩化ビニル系、ポリウレタン系、フッ素ゴム系、塩素化ポリエチレン系等の各種熱可塑性エラストマー、エボキシ樹脂、フェノール樹脂、ユリア樹脂、メラミン樹脂、不飽和ポリエステル、シリコーン樹脂、ポリウレタン、ナイロン、ニトロセルロース、酢酸セルロース、セルロースアセテートプロピオネート等のセルロース系樹脂、又はこれらを主とする共重合体、ブレンド体、ポリマーアロイなどが挙げられ、これらのうちの１種又は２種以上を組み合わせて（例えば、２層以上の積層体として）用いることができる。 The support base material is not particularly limited as long as it has a smooth surface, and examples thereof include a sheet-like or roll-like support base material. The material of the supporting base material is not particularly limited, and examples thereof include a thermoplastic resin and a thermosetting resin. Specific examples include polyethylene (high-density, medium-density or low-density) and polypropylene (isotactic type). Or syndiotactic type), polybutene, ethylene-propylene copolymer, ethylene-vinyl acetate copolymer (EVA), polyolefin such as ethylene-propylene-butene copolymer, cyclic polyolefin, modified polyolefin, polyvinyl chloride, poly Vinylidene chloride, polystyrene, polyamide, polyimide, polyamideimide, polycarbonate, poly- (4-methylbenthene-1), ionomer, acrylic resin, polymethyl methacrylate, polybutyl (meth) acrylate, methyl (meth) acrylate-butyl (meth) ) Acrylate Copolymer, methyl (meth) acrylate-styrene copolymer, acryl-styrene copolymer (AS resin), butadiene-styrene copolymer, polio copolymer (EVOH), polyethylene terephthalate (PET), polybutylene terephthalate (PBT) ), Ethylene-terephthalate-isophthalate copolymer, polyethylene naphthalate, polyester such as precyclohexane terephthalate (PCT), polyether, polyetherketone (PEK), polyetheretherketone (PEEK), polyetherimide, polyacetal ( POM), polyphenylene oxide, modified polyphenylene oxide, polyarylate, aromatic polyester (liquid crystal polymer), polytetrafluoroethylene, polyvinylidene fluoride, and other fluororesins Various thermoplastic elastomers such as styrene, polyolefin, polyvinyl chloride, polyurethane, fluoro rubber, and chlorinated polyethylene, ethoxy resin, phenol resin, urea resin, melamine resin, unsaturated polyester, silicone resin, polyurethane, Nylon, nitrocellulose, cellulose acetate, cellulosic resins such as cellulose acetate propionate, or copolymers, blends, polymer alloys, etc. based on these, and one or more of these are used. They can be used in combination (for example, as a laminate of two or more layers).
上記樹脂の中でも、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＣ）等の樹脂が好適に用いられる。積層膜の接着性がより優れることから、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）がより好ましい。 Among the above resins, resins such as polyethylene terephthalate (PET), polyethylene (PE), polypropylene (PP), and polyvinyl chloride (PC) are preferably used. Polyethylene terephthalate (PET) is more preferable because the adhesion of the laminated film is more excellent.
支持基材の表面はフィブロイン膜が形成できるものであれば特に限定されず、例えば、コロナ放電処理、グロー放電処理、プラズマ処理、紫外線照射処理、オゾン処理、アルカリや酸等による化学的エッチング処理などが施されたものであってもよい。 The surface of the supporting substrate is not particularly limited as long as a fibroin film can be formed, and examples thereof include a corona discharge treatment, a glow discharge treatment, a plasma treatment, an ultraviolet irradiation treatment, an ozone treatment, and a chemical etching treatment with an alkali or an acid. May be applied.
支持基材の表面は、樹脂膜、無機膜、有機材料と無機材料とを含む膜（有機−無機膜）などの膜が積層されたものであってもよい。積層構造を形成する樹脂膜層、無機膜層、有機−無機膜層は、支持基材の表面の一部又は全部を覆った層であり得る。また、積層構造中、最表面層に位置しない膜は、極性基を有してなくともよい。 The surface of the support substrate may be a laminate of films such as a resin film, an inorganic film, and a film containing an organic material and an inorganic material (organic-inorganic film). The resin film layer, the inorganic film layer, and the organic-inorganic film layer forming the laminated structure may be a layer covering a part or the whole of the surface of the support base material. In the laminated structure, a film that is not located on the outermost surface layer may not have a polar group.
支持基材の膜厚は特に限定されないが、例えば、１〜５００μｍの範囲内であることが好ましく、３〜３００μｍの範囲内であることがより好ましく、５〜２００μｍの範囲内であることがさらに好ましい。 The thickness of the support base material is not particularly limited, but is, for example, preferably in a range of 1 to 500 μm, more preferably in a range of 3 to 300 μm, and further preferably in a range of 5 to 200 μm. preferable.
フィブロイン膜は、支持基材とは反対の面上に、溶解性支持層を形成することが好ましい。 Preferably, the fibroin membrane forms a soluble support layer on the side opposite to the support substrate.
溶解性支持層は、溶媒に溶解するものであれば特に限定されないが、例えば、肌への刺激性を考慮すると、水又はアルコールに可溶な高分子から形成された膜からなる層であることが好ましい。溶解性支持層は、弱アルカリ性又は弱酸性水溶液に可溶な層であってもよい。 The dissolvable support layer is not particularly limited as long as it dissolves in a solvent.For example, considering irritation to the skin, the dissolvable support layer should be a layer formed of a polymer formed from a polymer soluble in water or alcohol. Is preferred. The soluble support layer may be a layer that is soluble in a weakly alkaline or weakly acidic aqueous solution.
水又はアルコールに可溶な高分子は特に限定されないが、例えば、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸等の高分子電解質；ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルコールの誘導体、デンプン、ヒドロキシプロピルセルロース、セルロースアセテート等の非イオン性の水溶性高分子；ノボラック又はポリ（Ｎ−アルキルシアノアクリレート）等の樹脂などを例示することができる。 The polymer soluble in water or alcohol is not particularly limited. For example, polyelectrolytes such as polyacrylic acid and polymethacrylic acid; polyethylene glycol, polyacrylamide, polyvinyl alcohol, derivatives of polyvinyl alcohol, starch, hydroxypropyl cellulose, Examples include nonionic water-soluble polymers such as cellulose acetate; resins such as novolak or poly (N-alkylcyanoacrylate).
水又はアルコールに可溶な高分子の粘度平均分子量は特に限定されないが、例えば、１００〜１００万であることが好ましく、５，０００〜５０万であることがより好ましい。 The viscosity average molecular weight of the polymer soluble in water or alcohol is not particularly limited, but is preferably, for example, 100 to 1,000,000, and more preferably 5,000 to 500,000.
なお、「粘度平均分子量」とは、一般的な測定方法である粘度法により評価すればよく、例えば、ＪＩＳ Ｋ ７３６７−３：１９９９に基づいて測定した極限粘度数［η］からＭνを算出して求められる。 The “viscosity average molecular weight” may be evaluated by a viscosity method which is a general measurement method. For example, Mν is calculated from an intrinsic viscosity number [η] measured based on JIS K 7367-3: 1999. Required.
水又はアルコールに可溶な高分子の好ましい態様として、ポリビニルアルコール又はその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。ポリビニルアルコールの平均重合度は特に限定されないが、例えば、膜形成性及び溶媒への溶解性の観点から、１００〜２，０００であることが好ましく、２００〜１，０００であることがより好ましい。ここで、平均重合度は、ＪＩＳ Ｋ ６７２６で規定の方法に基づいて測定することができる。 Preferred embodiments of the polymer soluble in water or alcohol include, but are not limited to, polyvinyl alcohol and derivatives thereof. Although the average degree of polymerization of polyvinyl alcohol is not particularly limited, for example, it is preferably from 100 to 2,000, more preferably from 200 to 1,000, from the viewpoints of film formability and solubility in a solvent. Here, the average degree of polymerization can be measured based on a method specified in JIS K 6726.
溶解性支持層の膜厚は特に限定されないが、例えば、フィブロイン膜との剥離性及び貼り合わせ性の観点から、１μｍ〜１００μｍの範囲内であることが好ましく、２μｍ〜５０μｍの範囲内であることがより好ましく、５μｍ〜２０μｍの範囲内であることがさらに好ましい。 The thickness of the dissolvable support layer is not particularly limited, but is preferably in the range of 1 μm to 100 μm, and more preferably in the range of 2 μm to 50 μm, for example, from the viewpoint of the releasability and bonding property with the fibroin film. Is more preferable, and it is more preferable that it is in the range of 5 μm to 20 μm.
溶解性支持層を形成する方法は特に限定されないが、例えば、支持基材の一面側に形成されたフィブロイン膜上に、高分子を水又はアルコールに溶解した高分子溶液を塗布して、通常１０分〜２４時間、好ましくは１時間〜１２時間乾燥させて水又はアルコールを除去する方法が挙げられる。 The method for forming the dissolvable support layer is not particularly limited. For example, a polymer solution obtained by dissolving a polymer in water or alcohol is applied on a fibroin film formed on one surface side of a support substrate, and usually, 10 A method of removing water or alcohol by drying for minutes to 24 hours, preferably for 1 hour to 12 hours.
フィブロイン膜上への上記高分子溶液の塗布の方法は特に限定されないが、例えば、キャスト法、スピンコート法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。溶解性支持層は、バーコーターやロールコーターなどを用いて形成することもできる。 The method for applying the polymer solution on the fibroin membrane is not particularly limited, and examples thereof include a casting method and a spin coating method, but are not limited thereto. The soluble support layer can also be formed using a bar coater, a roll coater, or the like.
上記高分子溶液の高分子の濃度は、特に限定されないが、例えば、塗工性の観点から、１〜４０質量％が好ましく、２〜３０質量％がより好ましく、５〜２０質量％がさらに好ましく、５〜１０質量％がなおさらに好ましい。 The concentration of the polymer in the polymer solution is not particularly limited, but is, for example, preferably 1 to 40% by mass, more preferably 2 to 30% by mass, and still more preferably 5 to 20% by mass from the viewpoint of coatability. Even more preferred is 5 to 10% by weight.
溶解性支持層は、ピンセット等を用いて支持基材からフィブロイン膜とともに剥離できる。このとき、溶解性支持層とフィブロイン膜との間に生じる静電的相互作用、水素結合、ファンデルワールス力等の２次結合力によって、剥離と同時にフィブロイン膜を溶解性支持層に移し取ることが可能となる。このようにして、フィブロイン膜−溶解性支持層からなるフィブロイン層が得られる。 The dissolvable support layer can be peeled off from the support substrate together with the fibroin film using tweezers or the like. At this time, the fibroin film is transferred to the soluble support layer at the same time as the separation due to the electrostatic interaction generated between the soluble support layer and the fibroin membrane, hydrogen bonding, and secondary bonding force such as van der Waals force. Becomes possible. Thus, a fibroin layer composed of a fibroin membrane and a soluble support layer is obtained.
［フィブロイン層−ヒアルロン酸ハイドロゲル層の複合体］
本発明の複合体は、フィブロイン層とヒアルロン酸ハイドロゲル層とを少なくとも含む複合体である。本発明の複合体の特性は特に限定されず、例えば、後述する実施例に記載の評価方法によって、本発明の複合体の含水率は９５％以上が好ましく、９８％以上がより好ましく；その透明度は評価基準「△」以上が好ましく、評価基準「○」がより好ましく；耐熱性は評価基準「○」が好ましく；表面の硬さは評価基準「○」が好ましく；接触角は上限が５０°以下が好ましく、４５°以下がより好ましく、下限が４０°以上が好ましく；及び、細胞増殖性は配向性を有した増殖形態を示すことが好ましい。
[Composite of fibroin layer-hyaluronic acid hydrogel layer]
The composite of the present invention is a composite including at least a fibroin layer and a hyaluronic acid hydrogel layer. The properties of the composite of the present invention are not particularly limited. For example, according to the evaluation method described in Examples described later, the water content of the composite of the present invention is preferably 95% or more, more preferably 98% or more; Is preferably equal to or more than the evaluation criterion “△”, more preferably the evaluation criterion “○”; the heat resistance is preferably the evaluation criterion “○”; the surface hardness is preferably the evaluation criterion “○”; The following is preferable, 45 ° or less is more preferable, and the lower limit is preferably 40 ° or more; and it is preferable that the cell growth property shows a growth form having orientation.
フィブロイン及びヒアルロン酸ハイドロゲルを含む複合体は、従来は、水溶液状態のフィブロインと、フィブロイン保持体となるハイドロゲル材料とを混合した後に形成してなるものであり、フィブロインとヒアルロン酸ハイドロゲルとが渾然一体となったものであった。しかし、このように形成してなる複合体は、その形成過程において、フィブロインが凝集しやすく、所望の態様に形成することが困難であるという問題があった。 A complex containing fibroin and hyaluronic acid hydrogel is conventionally formed by mixing fibroin in an aqueous solution state and a hydrogel material serving as a fibroin holder, and fibroin and hyaluronic acid hydrogel are formed. It was a whole thing. However, the complex formed in this manner has a problem in that fibroin easily aggregates during the formation process, and it is difficult to form the complex into a desired form.
そこで、本発明の複合体は、予め膜状態、好ましくは超薄膜状態に形成したフィブロイン（層）を用いることにより、フィブロインとヒアルロン酸ハイドロゲルとが部分的に一体となっていても、全体的に一体となっておらず、これらが積層構造をとることにより形成されたものであることから、フィブロインの凝集を発生することなく、所望の態様のハイドロゲルを形成することができるものである。上記のとおりに、本発明の複合体において、フィブロイン層とヒアルロン酸ハイドロゲル層との接着面は特に限定されず、例えば、個々の層が分離して接着していてもよく、個々の層が部分的に入り組んで接着していてもよい。本発明の複合体において、フィブロイン層及びヒアルロン酸ハイドロゲル層の数は特に限定されず、例えば、フィブロイン層−ヒアルロン酸ハイドロゲル層、フィブロイン層−ヒアルロン酸ハイドロゲル層−フィブロイン層などの構造をとりうる。また、フィブロイン層とヒアルロン酸ハイドロゲル層との接着は、それぞれの一部又は全部において接着することができる。 Therefore, the composite of the present invention uses fibroin (layer) formed in a membrane state, preferably in an ultra-thin state in advance, so that even if fibroin and hyaluronic acid hydrogel are partially integrated, the overall Since they are not integrated with each other and are formed by taking a laminated structure, a hydrogel in a desired mode can be formed without causing aggregation of fibroin. As described above, in the composite of the present invention, the bonding surface between the fibroin layer and the hyaluronic acid hydrogel layer is not particularly limited, and for example, the individual layers may be separated and adhered, and the individual layers may be separated. It may be partially intricately adhered. In the composite of the present invention, the numbers of the fibroin layer and the hyaluronic acid hydrogel layer are not particularly limited, and for example, the fibroin layer-hyaluronic acid hydrogel layer, fibroin layer-hyaluronic acid hydrogel layer-fibroin layer, etc. sell. Further, the adhesion between the fibroin layer and the hyaluronic acid hydrogel layer can be partially or wholly adhered.
本発明の複合体は、その製造方法について特に限定されず、例えば、それぞれ予め形成させたフィブロイン層とヒアルロン酸ハイドロゲル層とを用いて製造する方法、予め形成させたフィブロイン層と（メタ）アクリル化ヒアルロン酸とを接触させた後に、重合反応に供することなどによりヒアルロン酸ハイドロゲル層を形成させて製造する方法などが挙げられる。ただし、フィブロイン膜上でヒアルロン酸ハイドロゲルを形成させる方法は、ヒアルロン酸ハイドロゲルの形成に際してフィブロイン層と接触する部分においてフィブロインを取り込みながら合成が進むことから、得られた複合体におけるフィブロイン層とヒアルロン酸ハイドロゲル層との接着の度合いが高まることから好ましい。フィブロインとヒアルロン酸ハイドロゲルとの結合様式は、主に水素結合によるものと推測されるが、これに限定されない。フィブロイン層とヒアルロン酸ハイドロゲル層との接着の度合いは特に限定されないが、例えば、得られた複合体を水置換に供することによっても両者がそれぞれ剥離しない程度である。 The method for producing the composite of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a method for producing using a fibroin layer and a hyaluronic acid hydrogel layer which are respectively formed in advance, and a method for preparing a fibroin layer and a (meth) acrylic layer which are formed in advance. And then subjecting it to a polymerization reaction after contacting it with hyaluronic acid hydride to form a hyaluronic acid hydrogel layer. However, the method of forming a hyaluronic acid hydrogel on a fibroin membrane is based on the fact that the synthesis proceeds while taking in fibroin in the portion that comes into contact with the fibroin layer during the formation of the hyaluronic acid hydrogel. It is preferable because the degree of adhesion to the acid hydrogel layer increases. The mode of binding between fibroin and hyaluronic acid hydrogel is presumed to be mainly due to hydrogen bonding, but is not limited thereto. The degree of adhesion between the fibroin layer and the hyaluronic acid hydrogel layer is not particularly limited, but is, for example, such that the two are not separated from each other by subjecting the obtained composite to water replacement.
本発明の複合体の製造方法の具体例としては、例えば、重合開始剤を添加した、（メタ）アクリル化ヒアルロン酸含有溶液に接するように、フィブロイン膜を所望の状態に配し、次いでこれらを重合反応に供する方法が挙げられる。 As a specific example of the method for producing the composite of the present invention, for example, a fibroin membrane is arranged in a desired state so as to be in contact with a (meth) acrylated hyaluronic acid-containing solution to which a polymerization initiator has been added, A method for subjecting to a polymerization reaction may be mentioned.
本発明の複合体の製造方法のより具体的な例としては、例えば、雄型及び雌型の組み合わせよりなる成形型の雌型内に（メタ）アクリル化ヒアルロン酸含有溶液を注入し、フィブロイン膜を雌型内に載置した後に、雄型と雌型とを嵌合し、加熱又は光線照射により行う重合反応に供する方法が挙げられる。 As a more specific example of the method for producing the composite of the present invention, for example, a (meth) acrylated hyaluronic acid-containing solution is injected into a female mold of a mold composed of a combination of a male mold and a female mold, and a fibroin membrane is formed. Is placed in a female mold, the male mold and the female mold are fitted together, and subjected to a polymerization reaction performed by heating or irradiation with light.
本発明の複合体のより具体的な別の例は、例えば、（メタ）アクリル化ヒアルロン酸含有溶液とフィブロイン膜とを、金属、ガラス、プラスチックなどの平板に挟み込んだ後に、加熱又は光線照射による重合反応に供する方法が挙げられる。 Another more specific example of the composite of the present invention is, for example, a method in which a (meth) acrylated hyaluronic acid-containing solution and a fibroin film are sandwiched between flat plates of metal, glass, plastic, or the like, and then heated or irradiated with light. A method for subjecting to a polymerization reaction may be mentioned.
本発明の複合体のさらなる具体的な製造方法は、例えば、実施例において詳しく後述するが、これらに限定されるものではなく、上記した通り、一般的に行われる重合反応を適用するものであれば特に制限なく使用できる。 Further specific methods for producing the composite of the present invention will be described in detail in Examples, for example, but are not limited thereto. As described above, any method may be used in which a generally performed polymerization reaction is applied. Can be used without any particular restrictions.
本発明の複合体は、その使用態様において特に限定されないが、例えば、生体内又は生体組織に接するように適用した医療用デバイスとして使用できる。また、細胞や組織を培養するための基材として用いることが可能である。さらには、本発明の複合体を利用して培養した細胞や組織を、生体内に移植することによる、再生医療用デバイスとして用いることが可能である。本発明の複合体は、ヒアルロン酸の高親水性を低減することができ、このことによる利点を付与し得るものである。また、本発明の複合体は、ともに生体適合性の高いフィブロイン及びヒアルロン酸ハイドロゲルを構成成分とすることから、細胞定着性及び細胞増殖性に優れた医療用デバイスとすることができる。 The complex of the present invention is not particularly limited in its use mode, but can be used, for example, as a medical device applied in a living body or in contact with a living tissue. Further, it can be used as a substrate for culturing cells and tissues. Furthermore, cells or tissues cultured using the complex of the present invention can be used as a regenerative medicine device by transplanting the cells or tissues into a living body. The composite of the present invention can reduce the high hydrophilicity of hyaluronic acid, and can provide advantages due to this. In addition, since the composite of the present invention contains fibroin and hyaluronic acid hydrogel, which are both highly biocompatible components, it can be used as a medical device having excellent cell adhesion and cell proliferation.
また、（メタ）アクリル化ヒアルロン酸に導入する重合性官能基の数を調整すれば、その重合体であるヒアルロン酸ハイドロゲルの架橋密度や生分解性を制御できることから、使用目的に合致した医療用デバイスを得ることができ、そのようなものにはコンタクトレンズが含まれる。 In addition, by adjusting the number of polymerizable functional groups to be introduced into (meth) acrylated hyaluronic acid, the crosslink density and biodegradability of the polymer, hyaluronic acid hydrogel, can be controlled. Devices can be obtained, such as contact lenses.
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples, and the present invention may take various aspects as long as the object of the present invention can be solved. it can.
［フィブロイン超薄膜の調製］
フィブロイン超薄膜は、以下に示すとおり、特開２０１５−２２１０８６号公報における実施例１に記載の方法に準じて調製した。
[Preparation of ultra-thin fibroin film]
The fibroin ultra-thin film was prepared according to the method described in Example 1 in JP-A-2015-21086 as shown below.
（１）フィブロイン水溶液の調製
フィブロイン水溶液は、高圧精錬済み切繭（ながすな繭株式会社製）１５０ｇを９Ｍ臭化リチウム水溶液１，０００ｍＬに溶解し、常温（２５℃）で６時間攪拌して溶解した。次いで、遠心分離（回転数：１２，０００ｍｉｎ−１、５分間）して、デカンテーションで沈殿物を除去した後、透析チューブ（商品名：Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ１ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＷＣＯ６，０００−８，０００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製）に注入し、超純水製造装置（ＰＲＯ−０５００及びＦＰＣ−０５００（型番）；オルガノ株式会社製）から採水した超純水５Ｌに対して１２時間の透析を５回繰り返し、フィブロイン水溶液を得た。
(1) Preparation of Fibroin Aqueous Solution A fibroin aqueous solution is prepared by dissolving 150 g of a cut cocoon having a high-pressure refining (manufactured by Nagasana Mayon Co., Ltd.) in 1,000 mL of a 9 M lithium bromide aqueous solution, and stirring at room temperature (25 ° C.) for 6 hours to dissolve. did. Then, after centrifugation (rotation speed: 12,000 min -1 , 5 minutes) to remove the precipitate by decantation, a dialysis tube (trade name: Spectra / Por1 Dialysis Membrane, MWCO 6,000-8,000, Spectrum Laboratories, Inc.), and subjected to dialysis for 12 hours against 5 L of ultrapure water sampled from an ultrapure water production apparatus (PRO-0500 and FPC-0500 (model number; manufactured by Organo Corporation)). This was repeated twice to obtain an aqueous fibroin solution.
得られたフィブロイン水溶液２ｍＬをポリスチレン製容器に分取し、秤量した後、乾燥した。得られた乾燥物を秤量し、質量減少からフィブロイン水溶液中のフィブロイン濃度（質量％）を定量した。 2 mL of the obtained aqueous fibroin solution was placed in a polystyrene container, weighed, and dried. The obtained dried product was weighed, and the fibroin concentration (% by mass) in the aqueous fibroin solution was determined from the decrease in mass.
（２）フィブロインナノ薄膜層の作製
濃度を測定したフィブロイン水溶液に、グリセリン及び超純水を加え、フィブロイン濃度１質量％、グリセリン１質量％のフィブロイン水溶液を調製した。そのフィブロイン水溶液を支持基材であるポリエチレンテレフタレートフィルム（東洋紡績株式会社製、商品名：Ａ４１００、長さ１５０ｍｍ×幅１００ｍｍ×厚さ１００μｍ）上にアプリケータを用いて塗工した。その後、１００℃で１時間の乾燥を行った。形成したフィブロインナノ薄膜層の膜厚をフィルメトリスク株式会社製の型番：Ｆ２０によって測定した結果、フィブロインナノ薄膜層の膜厚は１００ｎｍであった。
(2) Glycerin and ultrapure water were added to the fibroin aqueous solution in which the concentration of the fibroin nano thin film layer was measured to prepare a fibroin aqueous solution having a fibroin concentration of 1% by mass and glycerin of 1% by mass. The aqueous fibroin solution was applied onto a polyethylene terephthalate film (manufactured by Toyobo Co., Ltd., trade name: A4100, length 150 mm × width 100 mm × thickness 100 μm) as a support substrate using an applicator. Thereafter, drying was performed at 100 ° C. for 1 hour. As a result of measuring the film thickness of the formed fibroin nano-thin film layer by Model No .: F20 manufactured by Filmethrisk Co., Ltd., the film thickness of the fibroin nano-thin film layer was 100 nm.
続いて、ポリビニルアルコール５００（関東化学株式会社製、平均重合度＝５００）を超純水に溶解した１０質量％水溶液を用いて、乾燥後の膜厚が５μｍとなるように、フィブロインナノ薄膜層上にバーコーターによって塗布し、溶解性支持層を形成した。したがって、得られたフィブロイン超薄膜は、支持基材−フィブロインナノ薄膜層−溶解性支持層という構造をとる。 Subsequently, using a 10% by mass aqueous solution of polyvinyl alcohol 500 (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd., average degree of polymerization = 500) in ultrapure water, the fibroin nano thin film layer was dried so that the film thickness became 5 μm. It was applied on the top with a bar coater to form a soluble support layer. Therefore, the obtained fibroin ultrathin film has a structure of supporting substrate-fibroin nano thin film layer-soluble supporting layer.
得られたフィブロイン超薄膜について、手指により、溶解性支持層及びフィブロインナノ薄膜層を支持基材から剥離して、溶解性支持層に接するようにガラス板の上に戴置した。これにより、フィブロインナノ薄膜層−溶解性支持層−ガラス板という構造をとるフィブロイン超薄膜を戴置したガラス板を得た。 With respect to the obtained fibroin ultrathin film, the dissolvable support layer and the fibroin nano thin film layer were peeled off from the support substrate by a finger and placed on a glass plate so as to be in contact with the dissolvable support layer. As a result, a glass plate on which an ultrathin fibroin thin film having a structure of a fibroin nano-thin film layer-soluble support layer-glass plate was obtained.
［フィブロイン超薄膜−ヒアルロン酸ハイドロゲル複合体の調製］
（１）実施例１
特許文献１の実施例２に記載の方法に従い、ヒアルロン酸エチルオキシエチルメタクリレート（化合物６）を合成した。
[Preparation of ultra-thin fibroin-hyaluronic acid hydrogel composite]
(1) Example 1
According to the method described in Example 2 of Patent Document 1, ethyloxyethyl methacrylate hyaluronate (Compound 6) was synthesized.
すなわち、平均分子量６０万のヒアルロン酸ナトリウム（キッコーマンバイオケミファ（株）社製）１ｇを５０ｍＬのジメチルスルホキシドに分散し、次いで水１２ｍＬと５Ｎ水酸化ナトリウム１ｍＬとを加えた。この溶液に、ヒアルロン酸中の二糖単位と等量の２−（２−イソシアネートエチルオキシ）エチルメタクリレート（カレンズＭＯＩ−ＥＧ／昭和電工（株）社製）１．５ｍＬを滴下し、室温にて２４時間撹拌し反応を完了させた。反応終了後、５Ｎ塩酸１ｍＬを加え、さらに室温にて２４時間撹拌し中和処理を行った。 That is, 1 g of sodium hyaluronate having an average molecular weight of 600,000 (manufactured by Kikkoman Biochemifa Corporation) was dispersed in 50 mL of dimethyl sulfoxide, and then 12 mL of water and 1 mL of 5N sodium hydroxide were added. To this solution, 1.5 mL of 2- (2-isocyanatoethyloxy) ethyl methacrylate (Karenz MOI-EG / manufactured by Showa Denko KK) in an amount equivalent to the disaccharide unit in hyaluronic acid was added dropwise, and the mixture was added at room temperature. The reaction was completed by stirring for 24 hours. After completion of the reaction, 1 mL of 5N hydrochloric acid was added, and the mixture was further stirred at room temperature for 24 hours to perform a neutralization treatment.
当該溶液に３００ｍＬのエタノール及び２００ｍＬの酢酸エチルを注ぎ入れ、生じた沈殿を濾過した。得られた沈殿物をさらに酢酸エチルにて３回洗浄し、精製後減圧乾燥することにより、ヒアルロン酸エチルオキシエチルメタクリレートの白色粉末（化合物６）１．２５ｇを得た。 300 mL of ethanol and 200 mL of ethyl acetate were poured into the solution, and the resulting precipitate was filtered. The obtained precipitate was further washed with ethyl acetate three times, purified and dried under reduced pressure to obtain 1.25 g of ethyloxyethyl ethyl hyaluronate methacrylate (compound 6) as a white powder.
得られたヒアルロン酸エチルオキシエチルメタクリレート（化合物６）０．０４ｇを精製水２ｍＬに溶解し、ヒアルロン酸水溶液を調製した。その後、ヒアルロン酸水溶液にペルオキソ二硫酸ナトリウムの１０質量％水溶液１００μＬとテトラメチルエチレンジアミン１０μＬとを添加して、ボルテックスミキサーにて混合することにより、ヒアルロン酸反応溶液を調製した。 0.04 g of the obtained ethyloxyethyl methacrylate hyaluronate (compound 6) was dissolved in 2 mL of purified water to prepare an aqueous solution of hyaluronic acid. Thereafter, 100 μL of a 10% by mass aqueous solution of sodium peroxodisulfate and 10 μL of tetramethylethylenediamine were added to the aqueous solution of hyaluronic acid and mixed with a vortex mixer to prepare a hyaluronic acid reaction solution.
ガラス板上に滴下した前記ヒアルロン酸反応溶液２ｍＬの上に、溶解性支持層として水溶性ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を介してフィブロイン超薄膜を載置したガラス板を被せ置き、フィブロイン超薄膜とヒアルロン酸反応溶液とが接するようにガラス板で挟み込んだ。室温にて終夜静置することにより重合反応を進行させ、ガラス板−ＰＶＡ−フィブロイン超薄膜−ヒアルロン酸重合体（ハイドロゲル）−ガラス板複合体を得た。重合後、フィブロイン超薄膜の支持体として接着していたＰＶＡの余剰分を水置換によって洗い流すことによって、フィブロイン超薄膜−ヒアルロン酸ハイドロゲル−ガラス板複合体を得た。 A glass plate on which a fibroin ultrathin film is placed as a soluble support layer via water-soluble polyvinyl alcohol (PVA) is placed on 2 mL of the hyaluronic acid reaction solution dropped on the glass plate, and the fibroin ultrathin film and the hyaluronic acid It was sandwiched between glass plates so as to be in contact with the reaction solution. The polymerization reaction was allowed to proceed by standing at room temperature overnight to obtain a glass plate-PVA-ultra-fibroin thin film-hyaluronic acid polymer (hydrogel) -glass plate composite. After the polymerization, excess PVA adhered as a support for the fibroin ultrathin film was washed away by water replacement to obtain a fibroin ultrathin film-hyaluronic acid hydrogel-glass plate composite.
得られたフィブロイン超薄膜−ヒアルロン酸ハイドロゲル−ガラス板複合体について、ガラス板を除去した後、純水に室温にて２時間浸漬することにより、フィブロイン超薄膜−ヒアルロン酸ハイドロゲル複合体を得た。 About the obtained ultrathin fibroin-hyaluronic acid hydrogel-glass plate composite, after removing the glass plate, it was immersed in pure water at room temperature for 2 hours to obtain a fibroin ultrathin film-hyaluronic acid hydrogel composite. Was.
（２）実施例２
ガラス板上にＰＶＡを介してフィブロイン超薄膜を載置し、その上に前記ヒアルロン酸反応溶液２ｍＬを滴下した後、ヒアルロン酸反応溶液とフィブロイン超薄膜とが接するように、ＰＶＡを介してフィブロイン超薄膜を載置したガラス板を被せ置き、フィブロイン超薄膜−ヒアルロン酸反応溶液−フィブロイン超薄膜となるように、２つのフィブロイン超薄膜によりヒアルロン酸反応溶液を挟み込んだ。
(2) Example 2
The ultra-thin fibroin thin film is placed on a glass plate via PVA, and 2 mL of the above-mentioned hyaluronic acid reaction solution is dropped thereon. The glass plate on which the thin film was placed was placed, and the hyaluronic acid reaction solution was sandwiched between the two fibroin ultrathin films so as to become a fibroin ultrathin film-hyaluronic acid reaction solution-fibroin ultrathin film.
その後は、実施例１と同一の方法にて処理を行い、フィブロイン超薄膜−ヒアルロン酸ハイドロゲル−フィブロイン超薄膜複合体を得た。 Thereafter, the same treatment as in Example 1 was performed to obtain a fibroin ultrathin film-hyaluronic acid hydrogel-fibroin ultrathin composite.
（３）実施例３
特許文献１の実施例１に記載の方法に従い、ヒアルロン酸エチルメタクリレート（化合物５）を合成した。すなわち、２−（２−イソシアネートエチルオキシ）エチルメタクリレートに代えて、２−イソシアネートエチルメタクリレート（カレンズＭＯＩ／昭和電工（株）社製）１．８５ｍＬを用いることにより、メタクリル化ヒアルロン酸の白色粉末（化合物５）１．１０ｇを得た。
(3) Example 3
Ethyl hyaluronate methacrylate (compound 5) was synthesized according to the method described in Example 1 of Patent Document 1. That is, instead of 2- (2-isocyanateethyloxy) ethyl methacrylate, 1.85 mL of 2-isocyanateethyl methacrylate (Karenz MOI / manufactured by Showa Denko KK) is used to obtain a white powder of methacrylated hyaluronic acid ( 1.10 g of compound 5) was obtained.
ヒアルロン酸エチルメタクリレート（化合物５）を用いた以外は、実施例１と同一の処理を行い、フィブロイン超薄膜−ヒアルロン酸ハイドロゲル複合体を得た。 The same treatment as in Example 1 was performed except that ethyl hyaluronate methacrylate (compound 5) was used to obtain a fibroin ultrathin film-hyaluronic acid hydrogel composite.
（４）実施例４
ヒアルロン酸エチルメタクリレート（化合物５）を用いた以外は、実施例２と同一の処理を行い、フィブロイン超薄膜−ヒアルロン酸ハイドロゲル−フィブロイン超薄膜複合体を得た。
(4) Example 4
The same treatment as in Example 2 was performed except that ethyl hyaluronate methacrylate (compound 5) was used, to obtain a fibroin ultrathin film-hyaluronic acid hydrogel-fibroin ultrathin composite.
［ヒアルロン酸ハイドロゲルの調製］
（１）比較例１
ヒアルロン酸エチルオキシエチルメタクリレート（化合物６）を含むヒアルロン酸反応溶液２ｍＬをガラス板上に滴下し、さらにその上にガラス板を被せ置いた後、実施例１と同一の処理を行うことにより、ヒアルロン酸ハイドロゲルを得た。
[Preparation of hyaluronic acid hydrogel]
(1) Comparative example 1
2 mL of a hyaluronic acid reaction solution containing ethyloxyethyl methacrylate hyaluronic acid (compound 6) was dropped on a glass plate, and the glass plate was further placed thereon. Then, the same treatment as in Example 1 was performed. An acid hydrogel was obtained.
（２）比較例２
ヒアルロン酸エチルメタクリレート（化合物５）を含むヒアルロン酸反応溶液２ｍＬをガラス板上に滴下し、さらにその上にガラス板を被せ置いた後、実施例１と同一の処理を行うことにより、ヒアルロン酸ハイドロゲルを得た。
(2) Comparative example 2
2 mL of a hyaluronic acid reaction solution containing ethyl hyaluronate methacrylate (compound 5) was dropped on a glass plate, and further placed on the glass plate, and the same treatment as in Example 1 was performed. A gel was obtained.
（３）比較例３
ヒアルロン酸エチルオキシエチルメタクリレート（化合物６）０．０４ｇを精製水１３３０μＬ及び３ｍｇ／ｍＬコラーゲン溶液６７０μＬの混合液に溶解し、コラーゲン含有ヒアルロン酸水溶液を調製した。得られたコラーゲン含有ヒアルロン酸水溶液に、ペルオキソ二硫酸ナトリウムの１０重量％水溶液を１００μＬとテトラメチルエチレンジアミン１０μＬとを添加してボルテックスミキサーにて混合することにより、コラーゲン含有ヒアルロン酸反応溶液を調製した。
(3) Comparative example 3
0.04 g of ethyloxyethyl methacrylate hyaluronate (compound 6) was dissolved in a mixture of 1330 μL of purified water and 670 μL of a 3 mg / mL collagen solution to prepare a collagen-containing aqueous solution of hyaluronic acid. A collagen-containing hyaluronic acid reaction solution was prepared by adding 100 μL of a 10% by weight aqueous solution of sodium peroxodisulfate and 10 μL of tetramethylethylenediamine to the obtained aqueous solution of collagen-containing hyaluronic acid and mixing with a vortex mixer.
ガラス板上に前記コラーゲン含有ヒアルロン酸反応溶液２ｍＬを滴下した後、ガラス板を被せ置き、コラーゲン含有ヒアルロン酸エチルオキシエチルメタクリレートを挟み込んだ。これを室温にて終夜静置することにより重合反応を進行させ、ガラス板に挟み込んだコラーゲン含有ヒアルロン酸ハイドロゲルを得た。その後は、実施例１と同一の方法にて処理を行い、コラーゲン含有ヒアルロン酸ハイドロゲルを得た。 After 2 mL of the above-mentioned collagen-containing hyaluronic acid reaction solution was dropped on a glass plate, the glass plate was covered, and the collagen-containing ethyloxyethyl hyaluronate methacrylate was sandwiched. This was allowed to stand at room temperature overnight to allow the polymerization reaction to proceed, and a collagen-containing hyaluronic acid hydrogel sandwiched between glass plates was obtained. Thereafter, the same treatment as in Example 1 was performed to obtain a collagen-containing hyaluronic acid hydrogel.
（４）比較例４
ヒアルロン酸エチルメタクリレート（化合物５）０．０４ｇを用いた以外は、比較例３と同一の方法にて処理を行い、コラーゲン含有ヒアルロン酸ハイドロゲルを得た。
(4) Comparative example 4
A treatment was performed in the same manner as in Comparative Example 3 except that 0.04 g of ethyl hyaluronate methacrylate (compound 5) was used, to obtain a collagen-containing hyaluronic acid hydrogel.
［複合体及びハイドロゲルの評価方法］
（１）表面状態
実施例１の複合体及び比較例１のハイドロゲルの表面状態について、ＡＴＲ−ＩＲ（日本分光株式会社製）及び走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、Ｐｈｅｎｏｍ−Ｗｏｒｌｄ社製）を用いて測定した。
[Evaluation method of composite and hydrogel]
(1) Surface State The surface states of the composite of Example 1 and the hydrogel of Comparative Example 1 were measured using ATR-IR (manufactured by JASCO Corporation) and a scanning electron microscope (SEM, manufactured by Phenom-World). It was measured.
（２）含水率
実施例１〜４の複合体及び比較例１〜４のハイドロゲルを一定の大きさに切断し、表面の水分を拭き取った後、スライドガラス上に載せ、乾燥前の質量（Ｗ１）を測定した。その後、６０℃に設定した乾燥機で６時間静置することにより、乾燥処理した複合体の質量（Ｗ２）を測定した。得られたＷ１及びＷ２を用いて、下式に従い含水率を算出した。
含水率（％）＝［（Ｗ１）−（Ｗ２）／Ｗ１］×１００
(2) Moisture Content The composites of Examples 1 to 4 and the hydrogels of Comparative Examples 1 to 4 were cut to a certain size, the surface was wiped off, and then placed on a slide glass. W 1 ) was measured. Thereafter, the mass (W 2 ) of the dried composite was measured by allowing it to stand for 6 hours in a dryer set at 60 ° C. Using the obtained W 1 and W 2, were calculated water content in accordance with the following formula.
Water content (%) = [(W 1 ) − (W 2 ) / W 1 ] × 100
（３）透明性
実施例１〜４の複合体及び比較例１〜４のハイドロゲルを直径８ｍｍ、厚み０．５ｍｍとなるように抜き取った後、方眼紙の上に載せ、目視による複合体下の方眼（マス目）の見え方により、以下の基準にて透明度を評価した。
○：下のマス目が見える
△：下のマス目がぼやける
×：下のマス目が見えない
(3) Transparency After extracting the composites of Examples 1 to 4 and the hydrogels of Comparative Examples 1 to 4 so as to have a diameter of 8 mm and a thickness of 0.5 mm, place them on graph paper, and visually check the lower part of the composites. The degree of transparency was evaluated according to the following criteria according to the appearance of the grid (grid).
○: The lower cell is visible △: The lower cell is blurred ×: The lower cell is not visible
（４）耐熱性
実施例１〜４の複合体及び比較例１〜４のハイドロゲルを直径８ｍｍ、厚み０．５ｍｍとなるように抜き取った後、精製水中に浸漬させ、高圧蒸気滅菌にて１２１℃、３０分間滅菌し、複合体の状態を目視にて観察し、以下の基準により評価した。
○：状態が変化しない
×：状態が変化する
(4) Heat resistance After the composites of Examples 1 to 4 and the hydrogels of Comparative examples 1 to 4 were extracted so as to have a diameter of 8 mm and a thickness of 0.5 mm, the composites were immersed in purified water, and sterilized by high-pressure steam sterilization. The mixture was sterilized at 30 ° C. for 30 minutes, and the state of the complex was visually observed and evaluated according to the following criteria.
○: State does not change ×: State changes
（５）表面の硬さ
実施例１〜４の複合体及び比較例１〜４のハイドロゲルを直径８ｍｍにくり抜いた後、その表面を指の腹で押さえることにより、以下の基準に基づいて表面の硬さを評価した。
○：硬く、抵抗がある
×：柔らかく、表面が沈み込む
(5) Surface Hardness After the composites of Examples 1 to 4 and the hydrogels of Comparative Examples 1 to 4 were hollowed out to a diameter of 8 mm, the surface was pressed with a finger pad to obtain a surface based on the following criteria. Was evaluated for hardness.
○: Hard and resistant ×: Soft and sinks in surface
（６）接触角
実施例１〜４の複合体及び比較例１〜４のハイドロゲルを一定の大きさに切断し、液中液滴法にて、接触角計（協和界面科学株式会社製）を用いて接触角を測定した。
(6) Contact Angle The composites of Examples 1 to 4 and the hydrogels of Comparative Examples 1 to 4 were cut to a certain size, and a contact angle meter (manufactured by Kyowa Interface Science Co., Ltd.) by a liquid-in-liquid method. Was used to measure the contact angle.
（７）細胞増殖性
実施例１の複合体及び比較例１のハイドロゲルを直径８ｍｍとなるようにくり抜いた後、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地５００μｌを加えた２４ウェルプレート中の各ウェルに浸漬させた。その後、各ウェルに不死化ヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥ−Ｔ）懸濁液（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）５００μｌを添加することで、細胞を播種した。一定時間培養後、ハイドロゲル上の細胞の状態を倒立型リサーチ顕微鏡（オリンパス株式会社製）にて観察した。
(7) Cell Proliferation The composite of Example 1 and the hydrogel of Comparative Example 1 were hollowed out to have a diameter of 8 mm, and then a 24-well plate containing 500 μl of DMEM / F12 medium containing 10% FBS (fetal bovine serum) was added. Each well was immersed. Thereafter, cells were seeded by adding 500 μl of an immortalized human corneal epithelial cell (HCE-T) suspension (1 × 10 6 cells / ml) to each well. After culturing for a certain period of time, the state of the cells on the hydrogel was observed with an inverted research microscope (manufactured by Olympus Corporation).
［複合体及びハイドロゲルの評価結果］
ＡＴＲ−ＩＲの測定結果を図１に、ＳＥＭの測定結果を図２及び図３に示す。図１〜３から、実施例１のハイドロゲルの表面はヒアルロン酸ハイドロゲルに結合したフィブロインであり、それに対して比較例１のハイドロゲルの表面はヒアルロン酸であることがわかった。
[Evaluation results of composite and hydrogel]
ATR-IR measurement results are shown in FIG. 1, and SEM measurement results are shown in FIGS. 2 and 3. From FIGS. 1 to 3, it was found that the surface of the hydrogel of Example 1 was fibroin bound to the hyaluronic acid hydrogel, whereas the surface of the hydrogel of Comparative Example 1 was hyaluronic acid.
含水率、透明性、耐熱性、表面の硬さ及び接触角の測定結果を表１に示す。表１に示すとおり、含水率は、実施例１〜４の複合体及び比較例１〜４のハイドロゲルのすべてにおいて、９８％以上であった。それに対して、透明性、耐熱性及び表面の硬さについては、実施例１〜４の複合体の評価結果は全て優れたものであったが、比較例１〜４のハイドロゲルはいずれかの項目で劣るものであった。接触角については、実施例１〜４の複合体は、比較例１〜４に比し、５〜１０°増加しており、親水性が低下する結果となった。 Table 1 shows the measurement results of the water content, transparency, heat resistance, surface hardness, and contact angle. As shown in Table 1, the water content was 98% or more in all of the composites of Examples 1 to 4 and the hydrogels of Comparative Examples 1 to 4. On the other hand, regarding the transparency, heat resistance and surface hardness, the evaluation results of the composites of Examples 1 to 4 were all excellent, but the hydrogels of Comparative Examples 1 to 4 Items were inferior. Regarding the contact angle, the composites of Examples 1 to 4 increased by 5 to 10 ° as compared with Comparative Examples 1 to 4, resulting in a decrease in hydrophilicity.
細胞増殖性の測定結果を図４〜５に示す。図４〜５から、実施例１の複合体の表面上では播種した細胞は配向性を有した増殖形態を示し増殖性が優れており、それに対して比較例１の複合体の表面上では播種した細胞は複数の小規模のコロニーを形成し、増殖する形態を示すことがわかった。配向性を有した細胞の増殖は、通常の細胞増殖形態である円状方向への増殖に比し、細胞の成長性及び、形成されるコロニー端部の細胞形状に対し、好適に作用する。 The measurement results of cell proliferation are shown in FIGS. From FIGS. 4 and 5, the seeded cells showed an oriented growth morphology on the surface of the complex of Example 1 and were excellent in growth, whereas the seeded cells were seeded on the surface of the complex of Comparative Example 1. The cells thus obtained were found to form a plurality of small-sized colonies and exhibit a morphologically proliferating form. Propagation of cells having an orientation has a better effect on cell growth and cell shape at the end of a colony to be formed, as compared to growth in a circular direction, which is a normal cell growth form.
以上の結果より、本発明の複合体は、従前のヒアルロン酸ハイドロゲルと比較すると、含水性は同等でありながら、透明性、耐熱性及び表面の硬さのいずれにおいても優れたものであり、さらに表面の外観及び表面上の細胞増殖性が優れたものであることから、形状安定性及び生体適合性が高く、再生医療デバイスなどとして安定して製造し得るものである。 From the above results, the composite of the present invention is excellent in both transparency, heat resistance and surface hardness while having the same water content as compared with the conventional hyaluronic acid hydrogel, Furthermore, since it has excellent surface appearance and cell proliferation on the surface, it has high shape stability and biocompatibility, and can be stably manufactured as a regenerative medical device or the like.
本発明の複合体は、高含水性、形状安定性及び生体適合性を有する複合体であることから、医療用デバイスとして利用することにより、再生医療などが期待される者の健康と福祉に貢献できるものである。 Since the composite of the present invention is a composite having high water content, shape stability and biocompatibility, by using it as a medical device, it contributes to the health and welfare of those who are expected to have regenerative medicine etc. You can do it.
Claims (3)
前記（メタ）アクリル化ヒアルロン酸は、（メタ）アクリル酸アルキルイソシアネート又は（メタ）アクリル酸アルキルオキシアルキルイソシアネートと、ヒアルロン酸との縮合体である、前記複合体。 A composite comprising a fibroin layer containing fibroin and a hyaluronic acid hydrogel layer obtained by subjecting a (meth) acrylated hyaluronic acid that has been brought into contact with the fibroin layer to a polymerization reaction ,
The above composite, wherein the (meth) acrylated hyaluronic acid is a condensate of an alkyl (meth) acrylate isocyanate or an alkyloxyalkyl isocyanate (meth) acrylate with hyaluronic acid .
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