JP6673224B2 - Cell image analysis method and cell image analysis device - Google Patents
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Description
本発明は、複数細胞種を含む試料を撮像した細胞画像を自動的に解析し、目的の細胞を抽出する細胞画像解析装置に関し、特に、非希少細胞群の中に混在する希少細胞を検出する細胞画像解析方法及び細胞画像解析装置に関する。 The present invention relates to a cell image analyzer that automatically analyzes a cell image obtained by imaging a sample containing a plurality of cell types and extracts a target cell, and in particular, detects rare cells mixed in a non-rare cell group. The present invention relates to a cell image analysis method and a cell image analysis device.
血液循環癌細胞（ＣＴＣ：Circulating Tumor Cells）は、乳癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌などの患者の血中に見出される細胞であり、その数は癌の転移性を反映しているなど、臨床上の重要な情報になることで注目されている。 Circulating Tumor Cells (CTCs) are cells found in the blood of patients such as breast cancer, lung cancer, prostate cancer, and pancreatic cancer, and their numbers reflect the metastatic nature of cancer. It is attracting attention because it becomes important information.
しかしながら、血液中のＣＴＣの密度は極めて低く（少ない場合、全血１０ｍＬあたり１〜１０個程度）、その検出および計数は容易ではない。 However, the density of CTCs in blood is extremely low (if low, about 1 to 10 per 10 mL of whole blood), and its detection and counting are not easy.
従来、このような希少細胞を複数細胞種が混在した試料から識別するため、目的の希少細胞に特異的な染色を施した状態で複数細胞種を含む試料を撮像し、得られた明視野像や蛍光画像などの細胞画像において特定の細胞種のコントラストを上げるなどの画像処理をして、特異的な染色が施された希少細胞を検出している。 Conventionally, in order to distinguish such rare cells from a sample in which multiple types of cells are mixed, a bright field image obtained by imaging a sample containing multiple types of cells in a state in which the specific rare cells of interest are stained. Image processing such as increasing the contrast of a specific cell type in a cell image such as a fluorescence image or a fluorescence image is performed to detect rare cells to which specific staining has been applied.
このように希少細胞に対して特異的な染色を行った場合であっても、ある程度の割合で非希少細胞に対して非特異的な染色がなされる場合があり、細胞種の推定の特異度を高めるために、複数の染色を施すこともある。 Even when rare cells are specifically stained in this way, non-rare cells may be non-specifically stained at a certain rate, and the estimated specificity of the cell type In order to enhance the dyeing, a plurality of dyeings may be applied.
この場合、例えば、目的の細胞種に特異的な染色を施すとともに、それ以外の細胞種のいずれかに特異的な染色を施し、２通りの蛍光画像を組み合わせて、目的の細胞種を推定している。これにより、目的外の細胞種を確実に除外でき、希少細胞の検出結果の信頼性を高めている。 In this case, for example, specific staining is performed on the target cell type, specific staining is performed on any of the other cell types, and the two types of fluorescent images are combined to estimate the target cell type. ing. As a result, unintended cell types can be reliably excluded, and the reliability of rare cell detection results is enhanced.
このように、細胞画像を用いて画像解析により目的の細胞種を検出する方法では、細胞画像内の細胞密度が低い場合、特に、関心領域に１つしか細胞が無い場合には、単一の細胞からの信号であることが明らかであるため、単に透過光や反射光、散乱光、蛍光（以下、「検出光」と呼ぶ。）の強度（以下、「検出光強度」と呼ぶ。）を測定することで、細胞種の推定が可能である。 As described above, in the method of detecting a target cell type by image analysis using a cell image, when a cell density in the cell image is low, particularly when there is only one cell in the region of interest, a single cell is detected. Since it is clear that the signal is from a cell, the intensity of transmitted light, reflected light, scattered light, or fluorescence (hereinafter, referred to as “detection light”) is simply referred to as “detection light intensity”. By measuring, the cell type can be estimated.
一方で、細胞画像内の細胞密度が高い場合、特に、細胞同士が近接、密集、凝集している場合には、隣接する細胞との重なりが生じ、検出光強度を測定したとしても、どの細胞に由来する信号であるかが判別しにくいため、細胞種の推定が容易ではないことが多く、細胞画像内の目的細胞数を計数することも困難である。 On the other hand, when the cell density in the cell image is high, particularly when the cells are close to each other, densely packed, or agglutinated, overlapping with adjacent cells occurs, and even if the detection light intensity is measured, any cell may be detected. Since it is difficult to determine whether the signal is derived from a cell, it is often difficult to estimate the cell type, and it is also difficult to count the number of target cells in a cell image.
このため、特許文献１では、目的の細胞種に対して特異的な染色がなされた複数細胞種を含む試料の細胞画像について、細胞核領域及び細胞質領域についての形態、すなわち、細胞核の輪郭及び細胞質の輪郭の検出を行い、細胞核と細胞質の重なりから、検出光がどの細胞に由来するかを決定し、細胞画像から目的の細胞種の検出を行っている。 For this reason, in Patent Document 1, with respect to the cell image of a sample containing a plurality of cell types stained specifically for the target cell type, the morphology of the cell nucleus region and the cytoplasmic region, that is, the contour of the cell nucleus and the cytoplasm The contour is detected, the cell from which the detection light is derived is determined based on the overlap between the cell nucleus and the cytoplasm, and the target cell type is detected from the cell image.
しかしながら、目的の細胞種に対して特異的に染色する染色手段では、必ずしも細胞質全体を染色するわけではなく、細胞質の輪郭を検出出来ない場合があり、特許文献１に記載された方法では、目的の細胞種を検出出来ないことがある。 However, the staining means that specifically stains the target cell type does not necessarily stain the entire cytoplasm and may not be able to detect the outline of the cytoplasm. Cell type may not be detected.
また、細胞が局所的に染色される場合、細胞核と細胞質の染色領域が重ならないこともあり、このような場合にも、特許文献１に記載された方法では、目的の細胞種を検出出来ないことがある。 In addition, when cells are locally stained, the cell nucleus and the cytoplasmic stained region may not overlap, and even in such a case, the method described in Patent Document 1 cannot detect the target cell type. Sometimes.
さらには、目的細胞を特異的に染色する際に、非目的細胞が非特異的に染色され目的細胞と間違えて検出されてしまったり、目的細胞が局所的に染色され細胞核と細胞質の領域が重ならなかったりするという問題も生じる。 Furthermore, when the target cells are specifically stained, the non-target cells are stained non-specifically and detected incorrectly, or the target cells are locally stained and the cell nucleus and cytoplasm region overlap. There is also a problem that it may not be.
また、細胞同士が重なった際には、目的細胞が染色された箇所なのか、非目的細胞が染色された箇所なのかの判別が困難である。 In addition, when cells overlap, it is difficult to determine whether the target cell is a stained part or a non-target cell is stained.
本発明では、このような現状に鑑み、希少細胞などの目的細胞と非希少細胞などの非目的細胞とが混在する複数細胞種を含む試料の細胞画像から、目的細胞を検出するための細胞画像解析装置において、細胞質が局所的に染色されている場合にも、目的細胞を検出することができる細胞画像解析方法及び細胞画像解析装置を提供することを目的とする。 In the present invention, in view of such circumstances, a cell image for detecting a target cell from a cell image of a sample containing a plurality of cell types in which target cells such as rare cells and non-target cells such as non-rare cells are mixed. It is an object of the present invention to provide a cell image analysis method and a cell image analysis device capable of detecting a target cell even when the cytoplasm is locally stained in the analysis device.
本発明は、前述したような従来技術における課題を解決するために発明されたものであって、上述した目的のうち少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した細胞画像解析方法は、
複数種類の細胞を含む試料についての細胞画像を用いて、目的細胞を検出する細胞画像解析方法であって、
目的細胞を特異的に染色した細胞画像を取得する第１細胞画像取得工程と、
非目的細胞を特異的に染色した細胞画像を取得する第２細胞画像取得工程と、
目的細胞及び非目的細胞を染色した細胞画像を取得する第３細胞画像取得工程と、
前記第１細胞画像取得工程で取得した第１細胞画像と、前記第２細胞画像取得工程で取得した第２細胞画像と、前記第３細胞画像取得工程で取得した第３細胞画像と、に基づいて、前記目的細胞を検出する目的細胞検出工程とを備え、
前記目的細胞検出工程は、前記第２細胞画像の輝度値を反転させた反転第２細胞画像と、前記第１細胞画像と、前記第３細胞画像とを乗算処理することによって、前記目的細胞を検出する。
また、本発明の一側面を反映した細胞画像解析方法は、
複数種類の細胞を含む試料についての細胞画像を用いて、目的細胞を検出する細胞画像解析方法であって、
目的細胞を特異的に染色した細胞画像を取得する第１細胞画像取得工程と、
非目的細胞を特異的に染色した細胞画像を取得する第２細胞画像取得工程と、
目的細胞及び非目的細胞を染色した細胞画像を取得する第３細胞画像取得工程と、
前記第１細胞画像取得工程で取得した第１細胞画像と、前記第２細胞画像取得工程で取得した第２細胞画像と、前記第３細胞画像取得工程で取得した第３細胞画像と、に基づいて、前記目的細胞を検出する目的細胞検出工程と、
を備え、
前記第３細胞画像から、前記第２細胞画像の重畳部分を除去することで中間画像を生成する中間画像生成工程をさらに備え、
前記目的細胞検出工程は、前記第１細胞画像と前記中間画像とを比較することによって、前記目的細胞を検出する。
The present invention has been invented to solve the problems in the prior art as described above, and in order to realize at least one of the above objects, a cell image analysis reflecting one aspect of the present invention. The method is
Using a cell image for a sample containing multiple types of cells, a cell image analysis method for detecting a target cell,
A first cell image acquisition step of acquiring a cell image specifically stained for the target cell,
A second cell image acquisition step of acquiring a cell image specifically stained for a non-target cell,
A third cell image obtaining step of obtaining a cell image obtained by staining the target cell and the non-target cell,
Based on the first cell image obtained in the first cell image obtaining step, the second cell image obtained in the second cell image obtaining step, and the third cell image obtained in the third cell image obtaining step A target cell detection step of detecting the target cell,
The target cell detection step is to multiply the inverted second cell image obtained by inverting the luminance value of the second cell image, the first cell image, and the third cell image to obtain the target cell. you detected.
Further, a cell image analysis method that reflects one aspect of the present invention,
Using a cell image for a sample containing multiple types of cells, a cell image analysis method for detecting a target cell,
A first cell image acquisition step of acquiring a cell image specifically stained for the target cell,
A second cell image acquisition step of acquiring a cell image specifically stained for a non-target cell,
A third cell image obtaining step of obtaining a cell image obtained by staining the target cell and the non-target cell,
Based on the first cell image obtained in the first cell image obtaining step, the second cell image obtained in the second cell image obtaining step, and the third cell image obtained in the third cell image obtaining step A target cell detection step of detecting the target cell,
With
An intermediate image generating step of generating an intermediate image by removing a superimposed portion of the second cell image from the third cell image,
The target cell detection step detects the target cell by comparing the first cell image with the intermediate image.
本発明の一側面を反映した細胞画像解析装置は、
目的細胞を特異的に染色した第１細胞画像と、非目的細胞を特異的に染色した第２細胞画像と、目的細胞及び非目的細胞を染色した第３細胞画像とを取得する細胞画像取得手段と、
前記第１細胞画像と、前記第２細胞画像と、前記第３細胞画像と、に基づいて、前記目的細胞を検出する目的細胞検出手段と、
を備え、
前記目的細胞検出手段は、
前記第２細胞画像の輝度値を反転させて反転第２細胞画像を生成し、
前記第１細胞画像と、前記反転第２細胞画像と、前記第３細胞画像とを乗算処理することによって、前記目的細胞を検出する。
また、本発明の一側面を反映した細胞画像解析装置は、
複数種類の細胞を含む試料についての細胞画像を用いて、目的細胞を検出する細胞画像解析装置であって、
目的細胞を特異的に染色した第１細胞画像と、非目的細胞を特異的に染色した第２細胞画像と、目的細胞及び非目的細胞を染色した第３細胞画像とを取得する細胞画像取得手段と、
前記第１細胞画像と、前記第２細胞画像と、前記第３細胞画像と、に基づいて、前記目的細胞を検出する目的細胞検出手段と、
を備え、
前記第３細胞画像から、前記第２細胞画像の重畳部分を除去することで中間画像を生成する中間画像生成手段をさらに備え、
前記目的細胞検出手段は、前記第１細胞画像と前記中間画像とを比較することによって、前記目的細胞を検出する。
A cell image analyzer that reflects one aspect of the present invention,
Cell image acquisition means for acquiring a first cell image specifically staining target cells, a second cell image specifically staining non-target cells, and a third cell image staining target cells and non-target cells When,
Target cell detection means for detecting the target cell based on the first cell image, the second cell image, and the third cell image;
With
The target cell detection means,
Inverting the brightness value of the second cell image to generate an inverted second cell image;
Said first cell image, wherein the inverted second cell image, by multiplying processing and the third cell image, you detect the target cell.
Further, a cell image analyzer that reflects one aspect of the present invention,
Using a cell image of a sample containing a plurality of types of cells, a cell image analyzer for detecting a target cell,
Cell image acquisition means for acquiring a first cell image specifically staining target cells, a second cell image specifically staining non-target cells, and a third cell image staining target cells and non-target cells When,
Target cell detection means for detecting the target cell based on the first cell image, the second cell image, and the third cell image;
With
An intermediate image generating unit that generates an intermediate image by removing a superimposed portion of the second cell image from the third cell image;
The target cell detection unit detects the target cell by comparing the first cell image with the intermediate image.
本発明によれば、異なる染色が施された複数の細胞画像を用い、それぞれの細胞画像の染色領域の違いにより、画像解析によって目的細胞の染色領域を確実に特定することができ、細胞画像内の目的細胞を確実に検出することができる。 According to the present invention, a plurality of cell images subjected to different staining are used, and a stained region of a target cell can be reliably specified by image analysis based on a difference in a stained region of each cell image. Can be reliably detected.
以下、本発明の実施の形態（実施例）を図面に基づいて、より詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments (examples) of the present invention will be described in more detail with reference to the drawings.
図１は、本発明の一態様における細胞画像解析装置の概略構成を示すブロック図である。 FIG. 1 is a block diagram illustrating a schematic configuration of a cell image analyzer according to one embodiment of the present invention.
図１に示すように、本実施例の細胞画像解析装置１０は、複数種類の細胞を含む試料（以下、「被検試料」と呼ぶ）についての細胞画像を取得する細胞画像取得手段１２と、細胞画像取得手段１２で取得した複数の細胞画像から後述するように中間画像を生成する中間画像生成手段１６と、細胞画像及び中間画像から後述するように検出対象である目的細胞を検出する目的細胞検出手段１８とを備えている。 As shown in FIG. 1, a cell image analyzer 10 of the present embodiment includes a cell image acquisition unit 12 that acquires a cell image of a sample containing a plurality of types of cells (hereinafter, referred to as a “test sample”), Intermediate image generating means 16 for generating an intermediate image from a plurality of cell images acquired by the cell image acquiring means 12 as described below, and target cells for detecting target cells to be detected from the cell image and the intermediate image as described later Detecting means 18.
なお、細胞画像解析装置１０は、コンピュータなどによって構成することができ、細胞画像取得手段１２、中間画像生成手段１６、目的細胞検出手段１８は、コンピュータにより実行されるソフトウェアであってもよい。 The cell image analysis device 10 can be configured by a computer or the like, and the cell image acquisition unit 12, the intermediate image generation unit 16, and the target cell detection unit 18 may be software executed by a computer.
また、細胞画像取得手段１２は、目的細胞を特異的に染色した細胞画像である第１細胞画像と、非目的細胞を特異的に染色した細胞画像である第２細胞画像と、目的細胞、非目的細胞、残余細胞を全て染色した細胞画像である第３細胞画像とを取得するように構成されている。 In addition, the cell image acquisition unit 12 includes a first cell image that is a cell image specifically stained for a target cell, a second cell image that is a cell image specifically stained for a non-target cell, a target cell, It is configured to acquire a third cell image which is a cell image in which all target cells and remaining cells are stained.
本明細書において、「目的細胞」とは、細胞画像解析装置１０によって検出する任意の細胞であって、例えば、血液循環癌細胞（ＣＴＣ：Circulating Tumor Cells）などの希少細胞とすることができる。 In the present specification, the “target cell” is any cell detected by the cell image analyzer 10, and may be, for example, a rare cell such as a blood circulating cancer cell (CTC: Circulating Tumor Cells).
また、「非目的細胞」とは、被検試料中に含まれる細胞のうち「目的細胞」以外の細胞であって、比較的、被検試料中の含有量が多い非希少細胞とすることができる。なお、「非目的細胞」には、複数種類の細胞が含まれていてもよい。 The “non-target cell” is a cell other than the “target cell” among the cells contained in the test sample, and may be a non-rare cell having a relatively large content in the test sample. it can. The “non-target cell” may include a plurality of types of cells.
また、「残余細胞」とは、被検試料中に含まれる「目的細胞」でも「非目的細胞」でもない細胞を意味する。すなわち、通常であれば、目的細胞を特異的に染色する抗体にも、非目的細胞を特異的に染色する抗体にも染色されない細胞である。なお、本実施例では残余細胞が存在する場合で説明するが、残余細胞が存在しない場合もある。 Further, “residual cells” means cells that are not “target cells” or “non-target cells” contained in a test sample. That is, cells that are not normally stained with an antibody that specifically stains target cells or an antibody that specifically stains non-target cells. In this example, the case where the residual cells exist will be described, but there may be cases where the residual cells do not exist.
このような目的細胞、非目的細胞、残余細胞が含まれる試料としては、特に限定されるものではないが、例えば、血液、尿、リンパ液、組織液、体腔液など、ヒトまたはその他の動物から採取された検体などが挙げられる。 Samples containing such target cells, non-target cells, and residual cells are not particularly limited, and include, for example, blood, urine, lymph, tissue fluid, body cavity fluid, and the like, collected from humans or other animals. Sample.
なお、細胞画像取得手段１２は、事前に撮影されデータ化された細胞画像を細胞画像解析装置１０に取り込むためのソフトウェアのみによって構成することもできるし、図１に示すように、さらに、細胞画像を撮影するためのデジタルカメラなどの画像撮影装置１４も含まれる構成とすることもできる。 The cell image acquiring means 12 can be constituted only by software for taking in the cell image analysis device 10 a cell image which has been photographed and converted into data in advance, or as shown in FIG. An image capturing device 14 such as a digital camera for capturing an image may be included.
中間画像生成手段１６は、第２細胞画像と第３細胞画像とから中間画像を生成する。第２細胞画像には、通常であれば、非目的細胞のみが撮像されており、また、第３細胞画像には、目的細胞、非目的細胞、残余細胞の全てが撮像されている。 The intermediate image generation means 16 generates an intermediate image from the second cell image and the third cell image. Normally, only the non-target cells are captured in the second cell image, and all of the target cells, non-target cells, and residual cells are captured in the third cell image.
しかしながら、残余細胞の一部や細胞ではない異物が、非目的細胞を特異的に染色した際に染色されてしまい、第２細胞画像に撮像されてしまうことがある。 However, some of the remaining cells and foreign substances that are not cells are stained when non-target cells are specifically stained, and may be captured in the second cell image.
このため、第３細胞画像から、第２細胞画像が重畳する部分を除去することで、目的細胞と残余細胞（場合によっては残余細胞の一部）のみが撮像された中間画像を生成することができる。 Therefore, by removing the portion where the second cell image overlaps from the third cell image, it is possible to generate an intermediate image in which only the target cell and the remaining cells (in some cases, a part of the remaining cells) are imaged. it can.
また、目的細胞検出手段１８は、中間画像と第１細胞画像とから目的細胞を検出する。第１細胞画像には、通常であれば、目的細胞のみが撮像されているが、非目的細胞の一部や細胞ではない異物が、目的細胞を特異的に染色した際に染色されてしまい、第１細胞画像に撮像されてしまうこともある。 The target cell detecting means 18 detects a target cell from the intermediate image and the first cell image. In the first cell image, usually, only the target cell is imaged, but a part of the non-target cell or a foreign substance that is not a cell is stained when the target cell is specifically stained, The first cell image may be captured.
このため、目的細胞、非目的細胞の一部、細胞ではない異物が撮像されている第１細胞画像と、目的細胞、残余細胞（場合によっては残余細胞の一部）が撮像されている中間画像とを比較し、例えば、両方の染色領域が重畳または近接する領域を目的細胞として判別している。 Therefore, a first cell image in which a target cell, a part of a non-target cell, and a foreign substance that is not a cell are imaged, and an intermediate image in which a target cell and a residual cell (in some cases, a part of the residual cell) are imaged. For example, a region where both stained regions overlap or approach each other is determined as a target cell.
以下、このように構成された細胞画像解析装置１０を用いて被検試料から目的細胞を検出する流れをより詳細に説明する。 Hereinafter, the flow of detecting a target cell from a test sample using the cell image analyzer 10 configured as described above will be described in more detail.
１．染色工程
まず、被検試料に対して、目的細胞、非目的細胞に対してそれぞれ特異的に染色を施すとともに、目的細胞、非目的細胞、残余細胞の全て、すなわち、細胞全てに対して染色を施す。1. Staining step First, the test sample is stained specifically for target cells and non-target cells, and all target cells, non-target cells, and residual cells, that is, all cells, are stained. Apply.
なお、目的細胞を特異的に染色する方法としては、検出対象となる細胞が有する抗原に結合する標識抗体を含む溶液と、被検試料とを接触させることで行うことができる。 The method of specifically staining the target cells can be performed by bringing a test sample into contact with a solution containing a labeled antibody that binds to an antigen of the cells to be detected.
検出対象となる細胞が有する抗原と特異的な反応を示す抗体としては、特に限定されるものではないが、例えば、抗ＣＤ４５抗体、抗β-アクチン抗体、抗α-チューブリン抗体、抗β-チューブリン抗体、抗ビメンチン抗体などを用いることができる。 The antibody that specifically reacts with the antigen of the cell to be detected is not particularly limited. For example, an anti-CD45 antibody, an anti-β-actin antibody, an anti-α-tubulin antibody, an anti-β- Tubulin antibodies, anti-vimentin antibodies and the like can be used.
また、非目的細胞を特異的に染色する方法としては、細胞膜全域を染色するような標識抗体を含む溶液と、被検試料とを接触させることで行うことができる。 In addition, a method for specifically staining non-target cells can be performed by contacting a test sample with a solution containing a labeled antibody that stains the entire cell membrane.
細胞膜全域を染色するような抗体としては、特に限定されるものではないが、例えば、抗ＣＫ抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０３ｃ抗体などを用いることができる。 The antibody that stains the whole cell membrane is not particularly limited, and examples thereof include an anti-CK antibody, an anti-CD2 antibody, an anti-CD13 antibody, an anti-CD14 antibody, an anti-CD15 antibody, an anti-CD19 antibody, and an anti-CD203c antibody. Can be used.
なお、非目的細胞を特異的に染色する場合には、複数の染色剤によって染色を施し、細胞画像において、非目的細胞の輪郭が識別可能な程度に、非目的細胞全体を染色することが好ましい。 When the non-target cells are specifically stained, it is preferable to perform staining with a plurality of stains and stain the entire non-target cells to the extent that the contours of the non-target cells can be identified in the cell image. .
また、このような標識抗体としては、公知の蛍光色素によって標識された抗体や、色素によって標識された抗体などによって標識された抗体などを用いることができる。なお、蛍光色素を用いる場合には、目的細胞を染色する標識抗体の蛍光色素と、非目的細胞を染色する標識抗体の蛍光色素とを分離して測定できるように、それぞれ異なる励起波長、蛍光波長を有する蛍光色素を用いればよい。 In addition, as such a labeled antibody, an antibody labeled with a known fluorescent dye, an antibody labeled with an antibody labeled with a dye, or the like can be used. When a fluorescent dye is used, different excitation wavelengths and fluorescent wavelengths are used so that the fluorescent dye of the labeled antibody that stains the target cells and the fluorescent dye of the labeled antibody that stains the non-target cells can be measured separately. May be used.
また、細胞全てに対して染色を施す方法としては、細胞核を染色することで行うことができ、例えば、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）、Hoechst系色素（Hoechst 33342, Hoechst 33258等）、Acridine Orange、ＤＡＭＯ、Ethidium Bromide（臭化エチジウム）、Ethidium Homodimer、Propidium Iodideなどを用いることができる。 In addition, the method of staining all cells can be performed by staining the cell nucleus. For example, DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole), Hoechst dyes (Hoechst 33342, Hoechst 33258) Etc.), Acridine Orange, DAMO, Ethidium Bromide (ethidium bromide), Ethidium Homodimer, Propidium Iodide, and the like.
このように染色を施しているため、細胞全てに対して染色を施す場合には、細胞それぞれについて、局所的に染色が行われることになる。 Since the staining is performed as described above, when all the cells are stained, the cells are locally stained.
なお、非目的細胞を特異的に染色する方法と、細胞全てに対して染色を施す方法としては、以下のいずれかの条件を満たすようにすることが好ましい。
（１）非目的細胞と特異的に染色する方法で染色した場合の非目的細胞の染色領域が、細胞全てに対して染色を施す方法により染色した場合の非目的細胞の染色領域に含まれる。（２）非目的細胞と特異的に染色する方法で染色した場合に、非目的細胞の細胞膜全域または細胞質全域を染色し、非目的細胞の染色領域が、非目的細胞の輪郭を描出するとともに、細胞全てに対して染色を施す方法により染色した場合の非目的細胞の染色領域が、細胞の一部であって、非目的細胞の輪郭とは一致しない。In addition, it is preferable to satisfy any of the following conditions as a method of specifically staining a non-target cell and a method of staining all cells.
(1) The stained area of the non-target cell when stained by a method of specifically staining with the non-target cell is included in the stained area of the non-target cell when stained by a method of staining all cells. (2) When stained by a method of specifically staining with a non-target cell, the entire cell membrane or the entire cytoplasm of the non-target cell is stained, and the stained region of the non-target cell outlines the non-target cell, The stained area of the non-target cell when stained by the method of staining all cells is a part of the cell and does not match the contour of the non-target cell.
このように染色を施すことによって、第３細胞画像２６における非目的細胞の染色領域が、第２細胞画像２４における非目的細胞の染色領域よりも小さくなるため、後述するように中間画像生成手段１６により、第３細胞画像２６から第２細胞画像２４を除去した場合に、第３細胞画像２６における非目的細胞の染色領域が確実に除去された中間画像を生成することができる。 By performing the staining in this manner, the stained area of the non-target cell in the third cell image 26 becomes smaller than the stained area of the non-target cell in the second cell image 24. Accordingly, when the second cell image 24 is removed from the third cell image 26, it is possible to generate an intermediate image in which the stained region of the non-target cell in the third cell image 26 is reliably removed.
また、このように第２細胞画像２４が第３細胞画像２６と重畳するように染色を施すことによって、第２細胞画像２４と第３細胞画像２６とが一部だけ重畳しているものについては、非目的細胞ではないと判断することができ、細胞同士が重なっていた場合にも、目的細胞と非目的細胞とを区別することができる。 By dyeing the second cell image 24 so as to be superimposed on the third cell image 26, the second cell image 24 and the third cell image 26 are partially superimposed. Therefore, it can be determined that the cells are not the non-target cells, and even when the cells overlap each other, the target cells and the non-target cells can be distinguished.
なお、このように被検試料に対して染色を施す前に、適切な前処理を行うことが好ましい。以下、被検試料として代表的な検体である血液を用いた場合の前処理方法について説明する。 In addition, it is preferable to perform an appropriate pretreatment before staining the test sample in this way. Hereinafter, a pretreatment method when blood, which is a typical sample, is used as a test sample will be described.
・抗凝固処理
採取されて体外に取り出された血液（全血）は、そのまま空気に触れさせると時間の経過と共に凝固し、そこに含まれる細胞を回収して観察することができなくなる。そのため、採取された血液は直ちに抗凝固処理することが好ましい。-Anticoagulation treatment Blood that has been collected and taken out of the body (whole blood), if exposed to air as it is, will coagulate with the passage of time, making it impossible to collect and observe the cells contained therein. Therefore, it is preferable that the collected blood be immediately subjected to anticoagulation treatment.
全血用の抗凝固剤としては様々なものが公知であり、一般的な濃度、処理時間等の条件に従って用いることができる。例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）やクエン酸（ナトリウム塩等の塩を含む）に代表される、キレート作用によりカルシウムイオンと結合し、反応系から除去することによって凝固を阻止するタイプの抗凝固剤や、ヘパリンに代表される、血漿中のアンチトロンビンIIIと複合体を形成してトロンビンの産生を抑制することにより凝固を阻止するタイプの抗凝固剤が挙げられる。このような抗凝固剤があらかじめ収容された採血管を利用してもよい。 Various anticoagulants for whole blood are known and can be used in accordance with conditions such as general concentration and processing time. For example, a type of anticoagulant, such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) or citric acid (including salts such as sodium salts), which binds to calcium ions by chelating action and prevents coagulation by removing it from the reaction system. And anticoagulants of the type that inhibit clotting by forming a complex with antithrombin III in plasma and suppressing the production of thrombin, such as heparin. A blood collection tube containing such an anticoagulant in advance may be used.
・密度勾配遠心処理
密度勾配遠心処理は、細胞を含む血液中の成分を比重に従って分画することができ、特に血液中に多量に含まれている赤血球を除去して、ＣＴＣ等の目的細胞を含む白血球のみを細胞観察の対象とするために用いることができる。-Density gradient centrifugation Density gradient centrifugation can separate components in blood including cells according to specific gravity. In particular, red blood cells contained in a large amount in blood are removed and target cells such as CTC are removed. It can be used to target only leukocytes containing the cells for cell observation.
密度勾配遠心法に用いられる分離液は、血液中の細胞の分画に適した比重を有し、また細胞を破壊することのない浸透圧およびｐＨを有するよう溶接できるものであればよいが、例えば、市販されているフィコール（登録商標）、パーコール（登録商標）などのショ糖溶液を用いることができる。 The separation solution used in the density gradient centrifugation method has a specific gravity suitable for fractionating cells in blood, and may be any as long as it can be welded to have an osmotic pressure and a pH that does not destroy cells. For example, a commercially available sucrose solution such as Ficoll (registered trademark) or Percoll (registered trademark) can be used.
この分離液の比重を、赤血球の比重よりも小さく、白血球の比重よりも大きくなるよう調節した上で密度勾配遠心処理を行うと、血液検体を「赤血球が多く含まれる画分」と「赤血球以外の細胞が多く含まれる画分」の少なくとも二層に分離することができる。 When the density of the separated solution is adjusted to be smaller than the specific gravity of red blood cells and larger than the specific gravity of white blood cells and then subjected to density gradient centrifugation, the blood sample is separated into a `` fraction rich in red blood cells '' and `` other than red blood cells ''. Fraction containing a large amount of cells "can be separated into at least two layers.
例えば、分離液の比重を好ましくは１．１１３以下、より好ましくは１．０８５以下にすると、「赤血球以外の細胞が多く含まれる画分」への赤血球の混入率を２〜６％またはそれ以下に抑えることができる。「赤血球以外の細胞が多く含まれる画分」を用いて細胞
観察を行うと、ＣＴＣ等の目的細胞が赤血球に紛れて検出し損ねる危険性が低下し、診断の精度を高めることができるため好ましい。For example, when the specific gravity of the separated solution is preferably 1.113 or less, more preferably 1.085 or less, the mixing ratio of erythrocytes to the “fraction rich in cells other than erythrocytes” is 2 to 6% or less. Can be suppressed. It is preferable to perform cell observation using “a fraction containing a large amount of cells other than red blood cells” because the risk of target cells such as CTCs being lost in the red blood cells and failing to detect them can be reduced, and the accuracy of diagnosis can be improved. .
また、被検試料に含まれる細胞に対して必要に応じて、固定化処理、浸透化処理、ブロッキング処理、その他の前処理を行うこともできる。これらの前処理は、所期の効果が発揮される限り、任意の時点で、任意の順序で行うことができる。 Further, immobilization treatment, permeation treatment, blocking treatment, and other pretreatments can be performed on the cells contained in the test sample, if necessary. These pretreatments can be performed at any time and in any order as long as the desired effect is exhibited.
例えば、密度勾配遠心処理で細胞画分を得た後、観察用基板に固相化する前に、細胞の固定化処理をし、観察用基板に固相化した後、浸透化処理およびブロッキング処理を同時に行う（つまり浸透化剤およびブロッキング剤の両方を含む溶液で細胞を処理する）ようにしてもよい。 For example, after obtaining the cell fraction by density gradient centrifugation, before immobilizing the cells on the observation substrate, the cells are immobilized, immobilized on the observation substrate, and then permeabilized and blocked. (Ie, treating the cells with a solution containing both a penetrating agent and a blocking agent).
なお、観察用基板に固相化する前に細胞を固定化する場合、固定化によっても細胞は観察用基板に吸着する能力を失っていないので、固相化の際には細胞の吸着（細胞と基板との物理的（分子間）相互作用）を利用することができる。 When the cells are immobilized before being immobilized on the observation substrate, the cells do not lose their ability to adsorb to the observation substrate even after immobilization. (Physical (intermolecular) interaction between the substrate and the substrate) can be utilized.
また、観察用基板に固相化した後に細胞を固定化する場合、すでに細胞が観察用基板に吸着していれば、その後に固定化しても吸着による固相化を保持することができる。 When the cells are immobilized after being immobilized on the observation substrate, if the cells have already been adsorbed on the observation substrate, the immobilization by adsorption can be maintained even after immobilization.
また、場合によっては、細胞に対する前処理を、血液等の検体から細胞画分を分離する前に行う（例えば血液検体を採取した直後に血液の抗凝固処理とともに細胞の固定化処理等を行い、その後密度勾配遠心処理を行って細胞画分を得る）ようにすることも可能である。 In some cases, pretreatment of cells is performed before separating a cell fraction from a sample such as blood (for example, immediately after collecting a blood sample, immobilization of cells together with anticoagulation of blood, etc. Thereafter, density gradient centrifugation is performed to obtain a cell fraction).
・固定化処理
固定化処理は、細胞の自己分解や腐敗を遅延させ、その形態や抗原性を保持するために行われる処理であり、本発明では、ＣＴＣ等の目的細胞の検出性を高めるとともに、抗原抗体解離工程で用いる酸等の解離剤が細胞または抗原に与えるダメージを抑えることが可能となる。-Immobilization treatment Immobilization treatment is a treatment that is performed to delay autolysis and decay of cells and maintain their morphology and antigenicity. In the present invention, the detection of target cells such as CTCs is improved and In addition, it is possible to suppress damage to cells or antigens caused by a dissociating agent such as an acid used in the antigen-antibody dissociation step.
特に結合と解離を複数回繰り返して実験を行うような場合、解離剤のダメージが細胞に与える影響は格段に大きくなるため、通常であれば細胞劣化が大きくなり実験が継続出来ないこともあり得る。 In particular, in the case where an experiment is performed by repeating binding and dissociation a plurality of times, the influence of the dissociation agent on the cells is significantly large, so that in general, the cell deterioration may be large and the experiment may not be continued. .
しかし本工程のように固定化処理を行うことで細胞が形態や抗原性の保持力が高まり、複数回繰り返して実験を行うような場合であっても免疫染色性が劣化しにくくなるという効果をもたらす。 However, by performing the immobilization treatment as in this step, the morphology and antigenicity of the cells are increased, and the effect that the immunostaining property is hardly deteriorated even when the experiment is repeated several times is improved. Bring.
固定化剤としては様々なものが公知であるが、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサール等のアルデヒド類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；エタノール、メタノール等のアルコール類が挙げられる。このうち、ホルムアルデヒド等のアルデヒド類およびアセトン等のケトン類は、アルデヒド基およびケトン基が特定のアミノ酸残基と反応して共有結合を形成し、架橋剤として作用する固定化剤であり、タンパク質構造を安定化すると共に細胞の原形質をゲル化して酵素活性を抑えることができるため、本発明における好ましい固定化剤である。 Various immobilizing agents are known, and examples thereof include aldehydes such as formaldehyde, glutaraldehyde, and glyoxal; ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; and alcohols such as ethanol and methanol. Among them, aldehydes such as formaldehyde and ketones such as acetone are immobilizing agents in which an aldehyde group and a ketone group react with a specific amino acid residue to form a covalent bond and act as a cross-linking agent. Is a preferable immobilizing agent in the present invention, because it can stabilize the enzyme and suppress the enzyme activity by gelling the cytoplasm of the cell.
また、それ自体が固定化剤として直接作用するものではないが、加水分解等を受けることによって固定化剤を遊離する供与体、たとえばホルムアルデヒド供与体も固定化剤の一形態として用いることができる。これらの固定化剤をＰＢＳ等の適切な溶媒に溶解した（あるいはホルマリンのようにもとから水溶液で市販されているものを希釈した）水溶液を固定化処理液として用いることができる。 In addition, a donor which does not directly act as a fixing agent by itself but releases the fixing agent upon hydrolysis or the like, for example, a formaldehyde donor can also be used as one form of the fixing agent. An aqueous solution obtained by dissolving these immobilizing agents in a suitable solvent such as PBS (or diluting a commercially available aqueous solution such as formalin) can be used as the immobilization solution.
固定化処理は、適切な濃度の固定化処理液を適切な時間、細胞に接触させることで行うことができる。固定化処理液中の固定化剤の濃度は適宜調節することができるが、たとえばアルデヒド類の場合は０．１〜１０ｗ／ｗ％程度、アルコール類の場合は７０〜１００ｖ／ｖ％程度である。固定化処理液と細胞との接触時間（固定化処理時間）も適宜調節することができるが、例えば、室温で、１０分間〜１時間程度である。 The immobilization treatment can be performed by contacting cells with an appropriate concentration of an immobilization treatment solution for an appropriate time. The concentration of the immobilizing agent in the immobilization solution can be appropriately adjusted. For example, in the case of aldehydes, it is about 0.1 to 10 w / w%, and in the case of alcohols, it is about 70 to 100 v / v%. . The contact time between the immobilization solution and the cells (immobilization time) can also be appropriately adjusted, and is, for example, about 10 minutes to 1 hour at room temperature.
固定化処理は、染色工程前または工程中に実施することができ、１回目の染色工程前または工程中の１回だけであってもよいし、第Ｎ回の解離工程後かつ第（Ｎ＋１）回の染色工程前または工程中に繰り返し実施してもよい。 The immobilization treatment can be performed before or during the staining step, may be performed only once before or during the first staining step, or may be performed after the Nth dissociation step and after the (N + 1) th dissociation step. It may be carried out repeatedly before or during each dyeing step.
・浸透化処理
浸透化処理は、細胞膜の透過性を向上させて細胞の外部から細胞の内部に物質が浸透しやすくするための処理であり、本発明では、細胞内（原形質）にある抗原に対して蛍光標識抗体を結合させやすくして免疫染色性を向上させるという効果をもたらす。-Permeabilization treatment The permeabilization treatment is a treatment for improving the permeability of the cell membrane to facilitate the penetration of a substance from the outside of the cell to the inside of the cell. And has an effect of improving the immunostaining property by facilitating the binding of the fluorescent-labeled antibody.
浸透化剤としては様々なものが公知であるが、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、サポニン、ジギトニン、Ｌｅｕｃｏｐｅｒｍ、ＮＰ−４０などの界面活性剤（商品）が挙げられる。これらの浸透化剤をＰＢＳ等の適切な溶媒に溶解させた水溶液を浸透化処理液として用いることができる。 Various penetrants are known, for example, Triton X-100 (polyoxyethylene alkyl phenyl ether), Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate), saponin, digitonin, Leucoperm, NP-40 and the like. Surfactants (commercially available). An aqueous solution in which these penetrants are dissolved in a suitable solvent such as PBS can be used as a permeation treatment liquid.
浸透化処理は、適切な濃度の浸透化処理液を適切な時間、細胞に接触させることで行うことができる。浸透化処理液中の浸透化剤の濃度は適宜調節することができるが、例えば上記のような界面活性剤であれば、０．０１〜１．０ｖ／ｖ％程度である。浸透化処理液と細胞との接触時間（浸透化処理時間）も適宜調節することができるが、例えば、室温で、１０分間〜１時間程度である。 The infiltration treatment can be performed by contacting a cell with an appropriate concentration of a permeation treatment solution for an appropriate time. The concentration of the penetrating agent in the permeabilizing solution can be adjusted as appropriate. For example, in the case of the surfactant described above, the concentration is about 0.01 to 1.0 v / v%. The contact time (permeation treatment time) between the permeation treatment solution and the cells can also be adjusted as appropriate, and is, for example, about 10 minutes to 1 hour at room temperature.
・ブロッキング処理
ブロッキング剤は、細胞の目的抗原以外の部位が非特異的に染色されるのを防ぐために用いられる。細胞のブロッキング処理は、染色工程前あるいは染色工程中に実施すればよく、いずれか一方で実施しても、両方で実施してもよい。-Blocking treatment A blocking agent is used to prevent non-specific staining of cells other than the target antigen. The cell blocking treatment may be performed before or during the staining step, and may be performed on either one or both.
ブロッキング剤を入れた細胞を固相化する場合は、上述したように観察用基板にマイクロチャンバー等を形成しておく（後述する細胞の固相化方法に関する構造的手法を用いる）必要がある。 When the cells containing the blocking agent are immobilized, it is necessary to form a microchamber or the like on the observation substrate as described above (using a structural method relating to the cell immobilization method described later).
また、細胞表面の観察用基板との吸着（相互作用）を起こしやすい部位を被覆することにより、マイクロチャンバー等の細胞の固相化に関与する部位以外に細胞が吸着してしまうことを防止し、所定の部位に細胞を収容されるようにするためにも用いられる。 In addition, by covering the portion of the cell surface that is likely to be adsorbed (interaction) with the observation substrate, it is possible to prevent the cell from being adsorbed to a portion other than the site involved in immobilizing the cell such as a microchamber. It is also used for accommodating cells in a predetermined site.
ブロッキング剤としては様々なものが公知であるが、例えば、カゼイン、スキムミルク、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリエチレングリコール等の親水性高分子、リン脂質、エチレンジアミン、アセトニトリル等の低分子化合物が挙げられる。これらのブロッキング剤をＰＢＳ等の適切な溶媒で希釈した水溶液をブロッキング処理液として用いることができる。 Various blocking agents are known, and examples thereof include hydrophilic polymers such as casein, skim milk, bovine serum albumin (BSA), and polyethylene glycol, and low molecular compounds such as phospholipids, ethylenediamine, and acetonitrile. An aqueous solution obtained by diluting these blocking agents with a suitable solvent such as PBS can be used as the blocking treatment solution.
ブロッキング処理は、適切な濃度のブロッキング処理液を適切な時間、細胞あるいは観察用の基板に接触させることで行うことができる。ブロッキング処理液中のブロッキング剤の濃度は適宜調節することができるが、例えば、０．０１〜２０ｗ／ｖ％程度である。ブロッキング処理液と細胞との接触時間（ブロッキング処理時間）も適宜調節することができるが、例えば、室温で、５〜１２０分間程度である。 The blocking treatment can be performed by bringing a blocking treatment solution having an appropriate concentration into contact with cells or a substrate for observation for an appropriate time. The concentration of the blocking agent in the blocking treatment solution can be appropriately adjusted, and is, for example, about 0.01 to 20 w / v%. The contact time between the blocking solution and the cells (blocking time) can also be adjusted as appropriate, but is, for example, about 5 to 120 minutes at room temperature.
２．撮影工程
上述する染色工程において、３種類の染色が施された被検試料について画像撮影装置１４を用いて細胞画像の撮影を行う。2. Imaging Step In the above-described staining step, a cell image is captured using the image capturing apparatus 14 for the test sample that has been subjected to three types of staining.
なお、蛍光色素による標識を行っている場合には、目的細胞を染色する標識抗体の蛍光色素、非目的細胞を染色する標識抗体の蛍光色素、細胞全てを標識する蛍光色素のそれぞれを励起する励起光を順次照射し、それぞれの蛍光色素から発光する蛍光に基づく細胞画像を撮影すればよい。 When labeling with a fluorescent dye, excitation is performed to excite the fluorescent dye of a labeled antibody that stains target cells, the fluorescent dye of a labeled antibody that stains non-target cells, or the fluorescent dye that labels all cells. Light may be sequentially emitted and a cell image based on the fluorescence emitted from each fluorescent dye may be taken.
このような細胞画像を撮影する画像撮影装置１４としては、特に限定されるものではないが、コンピュータで実行されるソフトウェアにより取り扱うことが可能な画像データとして細胞画像を撮影する装置であることが好ましく、例えば、ＣＣＤイメージセンサやＣＭＯＳイメージセンサなどを用いたデジタルカメラとすることができる。 The image capturing device 14 that captures such a cell image is not particularly limited, but is preferably a device that captures a cell image as image data that can be handled by software executed by a computer. For example, a digital camera using a CCD image sensor, a CMOS image sensor, or the like can be used.
画像撮影装置１４により撮影された細胞画像の画像データは、細胞画像取得手段１２により細胞画像解析装置１０に読み込まれ、細胞画像の画像解析が行われる。 The image data of the cell image photographed by the image photographing device 14 is read into the cell image analyzing device 10 by the cell image acquiring means 12, and the image analysis of the cell image is performed.
３．画像解析工程
中間画像生成手段１６及び目的細胞検出手段１８では、図２に示す工程図のように、細胞画像取得手段１２によって取り込まれた目的細胞を特異的に染色した細胞画像である第１細胞画像２２と、非目的細胞を特異的に染色した細胞画像である第２細胞画像２４と、目的細胞、非目的細胞、残余細胞を全て染色した細胞画像である第３細胞画像２６とに基づいて、被検試料中の目的細胞を検出する。3. Image Analysis Step In the intermediate image generation means 16 and the target cell detection means 18, as shown in the process diagram in FIG. 2, the first cell which is a cell image specifically stained with the target cells taken in by the cell image acquisition means 12 Based on the image 22, a second cell image 24 that is a cell image specifically stained for non-target cells, and a third cell image 26 that is a cell image that stains all target cells, non-target cells, and residual cells Then, target cells in the test sample are detected.
（中間画像生成工程）
中間画像生成手段１６では、第３細胞画像２６から第２細胞画像２４の重畳部分を除去することで中間画像２８を生成する。(Intermediate image generation step)
The intermediate image generation means 16 generates an intermediate image 28 by removing the superimposed portion of the second cell image 24 from the third cell image 26.
具体的には、画像処理演算によって、まず、第３細胞画像２６及び第２細胞画像２４を２値化処理した後、第３細胞画像２６から第２細胞画像２４を減算処理すればよい。 Specifically, first, the third cell image 26 and the second cell image 24 may be binarized by an image processing operation, and then the second cell image 24 may be subtracted from the third cell image 26.
本明細書において「減算処理」とは、画像処理における減算を意味し、一方の細胞画像の画素の値から、他方の細胞画像の同じ位置の画素の値を引くことを全ての位置の画素において行うことにより求めることができる。なお、画素の値は通常、最低値を０とし、減算処理の結果、画素の値が負となった場合には、０とすることが好ましい。 In the present specification, “subtraction processing” means subtraction in image processing, and subtracting the value of the pixel at the same position in the other cell image from the value of the pixel in one cell image is performed on the pixels at all positions. It can be obtained by doing. It is preferable that the pixel value is usually set to 0 at the lowest value, and to 0 when the pixel value becomes negative as a result of the subtraction processing.
なお、本実施例における２値化処理では、任意の閾値を設定し処理することができる。また、２値化処理（１ビット画像化）には限らず、８ビット画像化や１６ビット画像化（グレースケール化）としてもよいし、このような処理を行わず、細胞画像取得手段１２によって取得した細胞画像をそのまま利用しても構わない。 In the binarization process in the present embodiment, an arbitrary threshold value can be set and processed. The processing is not limited to the binarization processing (1-bit imaging), but may be 8-bit imaging or 16-bit imaging (gray scale). The acquired cell image may be used as it is.
表１に示すように、第３細胞画像２６には、目的細胞、非目的細胞、残余細胞が染色され撮像されており、一方で、第２細胞画像２４には、通常であれば非目的細胞のみが染色され撮像されているはずであるが、場合によって、残余細胞の一部や細胞ではない異物の一部が染色され撮像されている場合がある。このため、中間画像２８には、通常であれば、目的細胞と残余細胞が撮像されており、場合によって、目的細胞と残余細胞の一部のみが撮像されていることがある。 As shown in Table 1, target cells, non-target cells, and residual cells are stained and imaged in the third cell image 26, while non-target cells are usually included in the second cell image 24. Only the cells should be stained and imaged, but in some cases, some of the residual cells and some of the foreign substances that are not cells may be stained and imaged. For this reason, the target cell and the residual cell are normally imaged in the intermediate image 28, and in some cases, only a part of the target cell and the residual cell may be imaged.
（目的細胞検出工程）
次いで、目的細胞検出手段１８では、中間画像２８と第１細胞画像２２とを比較することによって、目的細胞を検出する。(Target cell detection step)
Next, the target cell detection unit 18 detects the target cell by comparing the intermediate image 28 and the first cell image 22.
表２に示すように、第１細胞画像２２には、通常であれば、目的細胞のみが染色され撮像されているはずであるが、場合によって、非目的細胞や細胞でない異物の一部が染色され撮像されてしまうことがある。 As shown in Table 2, in the first cell image 22, normally only the target cells should be stained and imaged. However, in some cases, some of the non-target cells and foreign substances that are not cells are stained. And may be imaged.
具体的には、以下のようにして、中間画像２８の染色領域２９（目的細胞と残余細胞の一部が染色された領域）と、第１細胞画像２２の染色領域２３（目的細胞、非目的細胞、細胞でない異物の一部が染色された領域）とを比較し、両方の染色領域が重畳または近接する領域を目的細胞として検出している。 Specifically, as described below, the stained area 29 of the intermediate image 28 (the area where the target cell and a part of the residual cells are stained) and the stained area 23 of the first cell image 22 (the target cell and the non-target A region where both cells and a part of a non-cellular foreign substance are stained) is compared, and a region where both stained regions overlap or approach each other is detected as a target cell.
なお、両方の染色領域が近接しているか否かの判定は、例えば、以下のように行うことができる。 The determination as to whether or not both stained areas are close to each other can be performed, for example, as follows.
中間画像２８と第１細胞画像２２を重ね合わせた状態で、図３に示すように、両方の染色領域の各画素同士の距離の最小値ｔを算出し、この最小値ｔを中間画像２８の染色領域２９と第１細胞画像２２の染色領域２３との最短距離とする。この最短距離が所定の近接判定値ｊ以下であれば近接していると判断することができる。 In a state where the intermediate image 28 and the first cell image 22 are superimposed on each other, as shown in FIG. 3, a minimum value t of the distance between the pixels in both the staining regions is calculated, and the minimum value t of the intermediate image 28 is calculated. The shortest distance between the staining area 29 and the staining area 23 of the first cell image 22 is set. If the shortest distance is equal to or less than a predetermined proximity determination value j, it can be determined that the objects are close to each other.
なお、近接判定値ｊは、検出対象とする細胞に応じて任意の値とすることができ、例えば、目的細胞の平均的な大きさが白血球と同等と考えられる場合には、白血球の半径が７μｍ程度であると想定する場合には、近接判定値を７μｍとすることが望ましい。また、白血球の半径が１５μｍ程度であると想定する場合には、近接判定値を１５μｍとすることが望ましい。これは白血球などの半径の範囲にお互いの細胞が位置していれば、細胞同士が上下方向に重複していない限り１つの細胞であると判断できるからである。 Note that the proximity determination value j can be an arbitrary value according to the cell to be detected. For example, if the average size of the target cell is considered to be equivalent to a white blood cell, the radius of the white blood cell is When it is assumed that the distance is about 7 μm, it is desirable to set the proximity determination value to 7 μm. When it is assumed that the radius of the white blood cell is about 15 μm, it is desirable to set the proximity determination value to 15 μm. This is because if cells are located within a radius range of a white blood cell or the like, it can be determined that the cells are one unless the cells overlap in the vertical direction.
また、中間画像２８と第１細胞画像２２を重ね合わせた状態で、図４に示すように、両方の染色領域を既知の画像処理アルゴリズム（例えば、最近傍法、バイリニア補間法、バイキュービック補間法、Lanczos補間法等）に基づいて所定の膨張値ｄだけ膨張させ、膨張後の染色領域２９ａ，２３ａが重畳する場合に近接していると判断することもできる。 Further, in a state where the intermediate image 28 and the first cell image 22 are superimposed, as shown in FIG. 4, both stained areas are subjected to a known image processing algorithm (for example, nearest neighbor method, bilinear interpolation method, bicubic interpolation method). , Lanczos interpolation method, etc.), it is also possible to determine that the stained areas 29a and 23a are close to each other when the stained areas 29a and 23a are superimposed.
なお、膨張値ｄは、検出対象とする細胞に応じて任意の値とすることができ、近接判定値ｊの半分よりやや大きい値とすることができる。例えば、目的細胞の大きさが白血球と同等と想定される場合、染色対象同士が白血球の直径の範囲内に存在すれば同一の可能性があるため、白血球の直径が１５μｍ程度であると想定する場合には、膨張値を８μｍとすることができる。 The expansion value d can be an arbitrary value according to the cell to be detected, and can be a value slightly larger than half of the proximity determination value j. For example, when the size of the target cell is assumed to be equivalent to that of leukocytes, it is assumed that the diameter of the leukocyte is about 15 μm, since there is a possibility that the staining targets are the same if they exist within the range of the diameter of the leukocyte. In that case, the expansion value can be 8 μm.
また、染色対象同士が白血球の半径の範囲内に存在すれば上記以上に同一の可能性が高いと判断することができ、白血球の半径が７μｍ程度であると想定する場合には、膨張値ｄを４μｍとすることができる。 Further, if the staining targets are within the range of the radius of the white blood cell, it can be determined that the same possibility is higher than the above. If the radius of the white blood cell is assumed to be about 7 μm, the expansion value d Can be set to 4 μm.
また、上述する近接判定を組み合わせて行うことにより、より正確に、両方の染色領域が近接しているか否かを判定することができる。 In addition, by performing the above-described proximity determination in combination, it is possible to more accurately determine whether or not both stained areas are in proximity.
また、一方の染色領域の中心（重心）位置と、他方の染色領域の中心（重心）位置との距離が、所定の近接判定値よりも小さい場合に、両染色領域が近接していると判定するようにしてもよい。 If the distance between the center (center of gravity) of one stained area and the center (center of gravity) of the other stained area is smaller than a predetermined proximity determination value, it is determined that both stained areas are close to each other. You may make it.
このように目的細胞が検出された場合には、例えば、ディスプレイなどの表示手段に、目的細胞の位置を示す判別画像３０を表示する。 When the target cell is detected in this way, for example, the determination image 30 indicating the position of the target cell is displayed on a display unit such as a display.
なお、上記実施例では、第３細胞画像と第２細胞画像とから中間画像を生成するように構成しているが、必ずしも中間画像を生成する必要はなく、第１細胞画像２２、第２細胞画像２４、第３細胞画像２６を適宜組み合わせて目的細胞を検出するように構成することができる。 In the above embodiment, the configuration is such that an intermediate image is generated from the third cell image and the second cell image. However, it is not always necessary to generate the intermediate image. The target cell can be detected by appropriately combining the image 24 and the third cell image 26.
例えば、第２細胞画像２４の輝度値を反転させた反転第２細胞画像と第１細胞画像と第３細胞画像とを乗算処理することによって、目的細胞を検出することができる。 For example, the target cell can be detected by multiplying the inverted second cell image obtained by inverting the luminance value of the second cell image 24, the first cell image, and the third cell image.
なお、本明細書において「乗算処理」とは、画像処理における乗算を意味し、一方の細胞画像の画素の値と、他方の細胞画像の同じ位置の画素の値の積を画像の色深度（例えば、８ビット画像であれば２５６もしくは２５５）で乗算することを全ての位置の画素において行うことにより求めることができる。 In this specification, “multiplication processing” means multiplication in image processing, and the product of the value of a pixel in one cell image and the value of a pixel at the same position in the other cell image is defined as the color depth of the image. For example, in the case of an 8-bit image, the multiplication by 256 or 255) can be performed by performing the multiplication by pixels at all positions.
図５は、別の実施例における画像解析工程の工程図である。なお、この実施例では、第１細胞画像２２、第２細胞画像２４、第３細胞画像２６とは別に明視野画像３２を画像撮影装置１４によって撮影し、細胞画像取得手段１２によって細胞画像解析装置１０に取り込んでいる。 FIG. 5 is a process diagram of an image analysis process in another embodiment. In this embodiment, a bright field image 32 is photographed by the image photographing device 14 separately from the first cell image 22, the second cell image 24, and the third cell image 26, and the cell image analyzing device 12 I am taking it into 10.
また、この実施例でも、中間画像生成工程については、上記と同様に行うことができるため、その説明は省略する。 Also in this embodiment, since the intermediate image generation step can be performed in the same manner as described above, the description thereof is omitted.
（目的細胞検出工程）
目的細胞検出手段１８では、まず、明視野画像３２を既知の画像処理アルゴリズム（例えば、Sobelフィルタ、Robertsフィルタ、Prewittフィルタ等）に基づいて、細胞等の輪郭を抽出し、輪郭画像３４を生成する。(Target cell detection step)
First, the target cell detecting unit 18 extracts the contour of the cells or the like based on the known image processing algorithm (for example, a Sobel filter, a Roberts filter, a Prewitt filter, etc.) from the bright field image 32, and generates a contour image 34. .
なお、輪郭画像３４には、目的細胞、非目的細胞、残余細胞、細胞ではない異物の輪郭が全て表示されることになる。 The contour image 34 displays all contours of the target cell, the non-target cell, the residual cell, and the foreign substance which is not the cell.
次いで、中間画像２８と第１細胞画像２２と輪郭画像３４とを重ね合わせることによって、中間画像２８の染色領域と、第１細胞画像２２の染色領域が、輪郭画像３４における同一輪郭内、すなわち、同一細胞の輪郭内に存在する場合に、当該領域が目的細胞であると判別する。 Next, by superimposing the intermediate image 28, the first cell image 22, and the outline image 34, the stained region of the intermediate image 28 and the stained region of the first cell image 22 are within the same outline in the outline image 34, that is, If the area is within the outline of the same cell, the area is determined to be the target cell.
以上、本発明の好ましい実施の態様を説明してきたが、本発明はこれに限定されることはなく、上記実施例では、目的細胞としてＣＴＣ等の希少細胞を検出するようにしているが、目的細胞としては希少細胞に限定されるわけではなく、任意の細胞を検出するために用いることができるなど、本発明の目的を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。 As described above, the preferred embodiments of the present invention have been described. However, the present invention is not limited to this. In the above embodiments, rare cells such as CTC are detected as target cells. The cells are not limited to rare cells, and various changes can be made without departing from the purpose of the present invention, such as being able to be used to detect any cells.
また、上述する細胞画像解析方法をコンピュータにより実行させるためのプログラム及び該プログラムを記録した、例えば、磁気テープ（デジタルデータストレージ（ＤＳＳ）など）、磁気ディスク（ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）、フレキシブルディスク（ＦＤ）など）、光ディスク（コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタルバーサタイルディスク（ＤＶＤ）、ブルーレイディスク（ＢＤ）など）、光磁気ディスク（ＭＯ）、フラッシュメモリ（ＳＳＤ（Solid State Drive）、メモリーカード、ＵＳＢメモリなど）などのコンピュータ可読記録媒体も本発明の一態様として含まれる。 Also, a program for causing a computer to execute the above-described cell image analysis method, and a magnetic tape (such as a digital data storage (DSS)), a magnetic disk (a hard disk drive (HDD), a flexible disk (FD) ), Optical disks (compact disk (CD), digital versatile disk (DVD), Blu-ray disk (BD), etc.), magneto-optical disk (MO), flash memory (SSD (Solid State Drive), memory card, USB memory, etc.) ) Is also included as one embodiment of the present invention.
１０ 細胞画像解析装置
１２ 細胞画像取得手段
１４ 画像撮影装置
１６ 中間画像生成手段
１８ 目的細胞検出手段
２２ 第１細胞画像
２３ 染色領域
２３ａ 膨張後の染色領域
２４ 第２細胞画像
２６ 第３細胞画像
２８ 中間画像
２９ 染色領域
２９ａ 膨張後の染色領域
３０ 判別画像
３２ 明視野画像
３４ 輪郭画像Reference Signs List 10 Cell image analyzer 12 Cell image acquisition means 14 Image photographing apparatus 16 Intermediate image generation means 18 Target cell detection means 22 First cell image 23 Stained area 23a Stained area after expansion 24 Second cell image 26 Third cell image 28 Intermediate Image 29 Stained area 29a Stained area 30 after dilation Discrimination image 32 Bright field image 34 Contour image
Claims (20)
目的細胞を特異的に染色した細胞画像を取得する第１細胞画像取得工程と、
非目的細胞を特異的に染色した細胞画像を取得する第２細胞画像取得工程と、
目的細胞及び非目的細胞を染色した細胞画像を取得する第３細胞画像取得工程と、
前記第１細胞画像取得工程で取得した第１細胞画像と、前記第２細胞画像取得工程で取得した第２細胞画像と、前記第３細胞画像取得工程で取得した第３細胞画像と、に基づいて、前記目的細胞を検出する目的細胞検出工程と、
を備え、
前記目的細胞検出工程は、前記第２細胞画像の輝度値を反転させた反転第２細胞画像と、前記第１細胞画像と、前記第３細胞画像とを乗算処理することによって、前記目的細胞を検出する細胞画像解析方法。 Using a cell image for a sample containing multiple types of cells, a cell image analysis method for detecting a target cell,
A first cell image acquisition step of acquiring a cell image specifically stained for the target cell,
A second cell image acquisition step of acquiring a cell image specifically stained for a non-target cell,
A third cell image obtaining step of obtaining a cell image obtained by staining the target cell and the non-target cell,
Based on the first cell image obtained in the first cell image obtaining step, the second cell image obtained in the second cell image obtaining step, and the third cell image obtained in the third cell image obtaining step A target cell detection step of detecting the target cell,
Equipped with a,
The target cell detection step is to multiply the inverted second cell image obtained by inverting the luminance value of the second cell image, the first cell image, and the third cell image to obtain the target cell. Cell image analysis method to be detected .
目的細胞を特異的に染色した細胞画像を取得する第１細胞画像取得工程と、 A first cell image acquisition step of acquiring a cell image specifically stained for the target cell,
非目的細胞を特異的に染色した細胞画像を取得する第２細胞画像取得工程と、 A second cell image acquisition step of acquiring a cell image specifically stained for a non-target cell,
目的細胞及び非目的細胞を染色した細胞画像を取得する第３細胞画像取得工程と、 A third cell image obtaining step of obtaining a cell image obtained by staining the target cell and the non-target cell,
前記第１細胞画像取得工程で取得した第１細胞画像と、前記第２細胞画像取得工程で取得した第２細胞画像と、前記第３細胞画像取得工程で取得した第３細胞画像と、に基づいて、前記目的細胞を検出する目的細胞検出工程と、 Based on the first cell image obtained in the first cell image obtaining step, the second cell image obtained in the second cell image obtaining step, and the third cell image obtained in the third cell image obtaining step A target cell detection step of detecting the target cell,
を備え、With
前記第３細胞画像から、前記第２細胞画像の重畳部分を除去することで中間画像を生成する中間画像生成工程をさらに備え、 An intermediate image generating step of generating an intermediate image by removing a superimposed portion of the second cell image from the third cell image,
前記目的細胞検出工程は、前記第１細胞画像と前記中間画像とを比較することによって、前記目的細胞を検出する細胞画像解析方法。 The target cell detection step is a cell image analysis method for detecting the target cell by comparing the first cell image and the intermediate image.
前記目的細胞検出工程は、前記中間画像における染色領域と、前記第１細胞画像における染色領域と、前記明視野画像とを比較し、前記中間画像における染色領域と前記第１細胞画像における染色領域の両方が、前記明視野画像での同一細胞の輪郭内に存在する場合に、当該領域が前記目的細胞であると判別する請求項２に記載の細胞画像解析方法。 Further comprising a bright-field image acquisition step of acquiring a bright-field image for the sample containing the plurality of types of cells,
The target cell detection step compares the stained area in the intermediate image, the stained area in the first cell image, and the bright field image, and compares the stained area in the intermediate image and the stained area in the first cell image. The cell image analysis method according to claim 2 , wherein when both are present within the outline of the same cell in the bright field image, the region is determined to be the target cell.
目的細胞を特異的に染色した第１細胞画像と、非目的細胞を特異的に染色した第２細胞画像と、目的細胞及び非目的細胞を染色した第３細胞画像とを取得する細胞画像取得手段と、
前記第１細胞画像と、前記第２細胞画像と、前記第３細胞画像と、に基づいて、前記目的細胞を検出する目的細胞検出手段と、
を備え、
前記目的細胞検出手段は、
前記第２細胞画像の輝度値を反転させて反転第２細胞画像を生成し、
前記第１細胞画像と、前記反転第２細胞画像と、前記第３細胞画像とを乗算処理することによって、前記目的細胞を検出する細胞画像解析装置。 Using a cell image of a sample containing a plurality of types of cells, a cell image analyzer for detecting a target cell,
Cell image acquisition means for acquiring a first cell image specifically staining target cells, a second cell image specifically staining non-target cells, and a third cell image staining target cells and non-target cells When,
Target cell detection means for detecting the target cell based on the first cell image, the second cell image, and the third cell image;
Equipped with a,
The target cell detection means,
Inverting the brightness value of the second cell image to generate an inverted second cell image;
A cell image analyzer that detects the target cell by multiplying the first cell image, the inverted second cell image, and the third cell image .
目的細胞を特異的に染色した第１細胞画像と、非目的細胞を特異的に染色した第２細胞画像と、目的細胞及び非目的細胞を染色した第３細胞画像とを取得する細胞画像取得手段と、 Cell image acquisition means for acquiring a first cell image specifically staining target cells, a second cell image specifically staining non-target cells, and a third cell image staining target cells and non-target cells When,
前記第１細胞画像と、前記第２細胞画像と、前記第３細胞画像と、に基づいて、前記目的細胞を検出する目的細胞検出手段と、 Target cell detection means for detecting the target cell based on the first cell image, the second cell image, and the third cell image;
を備え、With
前記第３細胞画像から、前記第２細胞画像の重畳部分を除去することで中間画像を生成する中間画像生成手段をさらに備え、 An intermediate image generating unit that generates an intermediate image by removing a superimposed portion of the second cell image from the third cell image;
前記目的細胞検出手段は、前記第１細胞画像と前記中間画像とを比較することによって、前記目的細胞を検出する細胞画像解析装置。 The cell image analysis device, wherein the target cell detection unit detects the target cell by comparing the first cell image with the intermediate image.
前記目的細胞検出手段は、前記中間画像における染色領域と、前記第１細胞画像における染色領域と、前記明視野画像とを比較し、前記中間画像における染色領域と前記第１細胞画像における染色領域の両方が、前記明視野画像での同一細胞の輪郭内に存在する場合に、当該領域が前記目的細胞であると判別する請求項１１に記載の細胞画像解析装置。 The cell image obtaining means is configured to further obtain a bright-field image of the sample containing the plurality of types of cells,
The target cell detection unit compares the stained area in the intermediate image, the stained area in the first cell image, and the bright field image, and compares the stained area in the intermediate image and the stained area in the first cell image. 12. The cell image analysis device according to claim 11 , wherein when both are present within the outline of the same cell in the bright field image, the region is determined to be the target cell.
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