JP6672775B2 - 繊維状高分子及びそれを用いた測定方法 - Google Patents
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Description
(1)標識が結合していることを特徴とする繊維状高分子。
(2)繊維状高分子が、有機繊維、無機繊維、繊維状タンパク質又はDNA配列である、(1)に記載の繊維状高分子。
(3)線維状タンパク質繊維がムチン、鞭毛又はチューブリンである、(2)に記載の繊維状高分子。
(4)ムチンがMUC1である、(3)に記載の繊維状高分子。
(5)測定対象と、測定対象への特異的結合物質とを反応させて、測定対象と反応した又は反応しなかった特異的結合物質を検出することにより、測定対象を測定する方法において、(1)〜(4)いずれかに記載の繊維状高分子を特異的結合物質に結合させて、その標識を検出することにより測定対象を測定することを特徴とする、前記測定方法。
以下、本発明を更に詳細に説明する。
ウサギより単離されたエストラジオールを認識する抗体(以下、抗E2抗体とする)(東ソー研究報告,52,3−9(2008))のシグナルペプチドを含むH鎖の可変領域が終わる配列(配列番号3)の下流に、リンカー配列(配列番号4)を導入し、その直下に配列(配列番号5)から始まり(配列番号6)までの、L鎖の可変領域を連結させ、scFvを作製した。さらにその下流に、MUC1の20アミノ酸からなるドメイン(配列番号1)をコードする遺伝子を、合計で1、3、6、12、24、又は48個導入した。その下流に、BNCタグペプチド(配列番号2)(特開2011−122957号公報)をコードする遺伝子を導入した。このようにして得られる融合タンパク質をそれぞれOM1、OM3、OM6、OM12、OM24、OM48とし、その模式図を図1に示す。なお、上記の遺伝子組み換え操作は、通常行われている方法で実施した。その後、作製した遺伝子を、pECEdhfr(J.Biochem.,108,673−676(1990))の発現ベクターのBglIIサイトとXbaIサイトに導入した。その後、定法によりプラスミドを精製し、CHO−K1細胞にリポフェクトアミン2000(Invitrogen社製)を用い、取扱説明書に従い遺伝子を導入した。遺伝子を導入してから3日後に培養上清を回収し以下の実験に使用した。
固相化用緩衝液(12mM Na2CO3、38mM NaHCO3、pH9.6)で、エストラジオールで標識したBSA(E2−BSA。シグマ社製)を0.5μg/mlとなるように希釈し、100マイクロリットルを96ウエルのELISAプレートに添加した。これを1時間室温でインキュベートし、E2−BSAをELISAプレートに固相化した。該ELISAプレートを洗浄用緩衝液(20mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、150mM 塩化ナトリウム、0.1% Tween20)で3回洗浄した後、1%スキムミルクを含むPBSを添加し、1時間室温でインキュベートすることで該ELISAプレートをブロッキングした。その後、実施例1で作製した6種類の融合タンパク質を含む培養上清を、0.1%スキムミルクを含むPBSで10倍希釈したものを出発として、さらに同緩衝液で3倍希釈の濃度希釈系列を作り一時間反応させた。上記の方法で同じプレートを2枚作製した。
図2から、MUC1ドメインの数と結合性を比較した。同じ蛍光強度(縦軸で15,000)が得られる融合タンパク質量を図2から読み取り、グラフ化した(図3)。横軸は、融合タンパク質中のMUC1ドメインの数を、縦軸は融合タンパク質の量を示す。この結果から分かるように、分子中のMUC1ドメインの数が増加するに従い、同じ蛍光強度を得るために必要な融合タンパク質の量が少なくて済むことが分かり、その間には相関性があった。
実施例1で得られたOM3とOM6の遺伝子を大腸菌で発現させるために、Gene,194,35−46(1997)に記載の発現ベクター(pAALSC)を使用した。発現ベクター(pAALSC)から、シグナルペプチド配列が終わった以降の配列(配列番号7:QVQLQ)から終始コドンまでの遺伝子を除去し、OM3とOM6の遺伝子のH鎖の可変領域の始まりの配列(配列番号8)から、BNCタグ(配列番号2)までの遺伝子をそれぞれ挿入した。その後、文献に記載された方法で発現させた。実施例2に記載された方法で、大腸菌で生産したOM3、OM6とCHO細胞で生産されたOM3、OM6の性能を比較した結果が図4である。また検出用の抗体を、KL−6 No.1からKL−6 No.3(ミリ免疫社製)(糖鎖を有するMUC1を認識する抗体)に変更した結果が、図5である。図5の結果を見ると、大腸菌で発現したMUC1に対して全く反応していない。しかし、図4の結果では、両方のタンパク質に反応していることから、大腸菌で発現したMUC1には糖鎖が結合していないが、アミノ酸の一次配列は予想したものが合成されていることがわかる。図4を見ると、大腸菌で発現したOM3、6がCHO細胞で発現したOM3、6よりも検出用抗体との反応性が高い。これは、MUC1上の糖鎖が検出用抗体との反応性を阻害していないためである。このように、大腸菌でも融合タンパク質を生産することができる。
固相化用緩衝液(12mM Na2CO3、38mM NaHCO3、pH9.6)で、実施例1で使用した抗E2抗体を1μg/mlとなるように希釈し、100マイクロリットルを96ウエルのELISAプレートに添加した。これを1時間室温でインキュベートし、抗E2抗体をELISAプレートに固相化した。該ELISAプレートを洗浄用緩衝液(20mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、150mM 塩化ナトリウム、0.1% Tween20)で3回洗浄した後、2.5%スキムミルクを含むPBSを添加し、1時間室温でインキュベートすることで該ELISAプレートをブロッキングした。その後、エストラジオールで標識したBSA(E2−BSA。シグマ社製)を1μg/mlから3倍希釈列の溶液を0.1%スキムミルクを含むPBSで調整し、100マイクロリットルを96ウエルのELISAプレートに添加した。1時間室温でインキュベートし、洗浄用緩衝液で3回洗浄した後、OM1とOM24を含む培養上清を同モル数含むように希釈して添加した。具体的には、0.1%スキムミルクを含むPBSで10倍希釈したOM1の培養上清と3倍希釈したOM1の培養上清を使用した。一時間反応させた後、洗浄用緩衝液で洗浄後、MUC1を認識する抗体(KL−6 No.1 ミクリ免疫社製)のALP標識体を1000倍希釈したものを、1時間反応させた。ALP標識は、同仁化学社製のALP標識試薬(LK−12)を説明書通りに使用した。室温で1時間反応させた後、該ELISAプレートを洗浄用緩衝液で3回洗浄し、4−MUP溶液(1M ジエタノールアミン、0.5mM 塩化マグネシウム、1mM 4−MUP)を添加し、30分間室温でインキュベートした。該ELISAプレートの蛍光強度(励起波長360nm、発光波長465nm)をプレートリーダーで測定した。その結果を図6に示す。
固相化用緩衝液で、ストレプトアビジンを0.1μg/mlとなるように希釈し、100マイクロリットルを96ウエルのELISAプレートに添加した。これを1時間室温でインキュベートし、ストレプトアビジンをELISAプレートに固相化した。該ELISAプレートを洗浄用緩衝液で3回洗浄した後、3%BSAを含むPBSを添加し、1時間室温でインキュベートすることで該ELISAプレートをブロッキングした。その後、C末端をビオチン化した配列番号9で示すペプチド(図7のbio−peptide:ペプチド合成機で合成したもの)を0.1μg/mlになるように3%BSAを含むPBSで調整したものを出発として、さらに同緩衝液で3倍希釈の濃度希釈系列を作り、100マイクロリットルを96ウエルのELISAプレートに添加し一時間反応させた。該ELISAプレートを洗浄用緩衝液で3回洗浄した後、エストラジオールで標識した配列番号10を認識する抗体(C32−127。配列番号9のペプチドのC末端にCysを付加したものをキャリアプロテインに結合したものでマウスを免疫し、その脾リンパ球とミエローマ細胞を融合させたハイブリドーマから得たもの。)を1マイクログラム/mlになるように3%BSAを含むPBSで調整し、100マイクロリットルを96ウエルのELISAプレートに添加し1時間反応させた。
Claims (1)
- 測定対象と、前記測定対象への特異的結合物質に3ドメイン以上のMUC1が結合した融合タンパク質とを、前記測定対象への特異的結合物質が固定化された担体上で反応させた後、MUC1を認識する抗体のALP標識体を反応させ、蛍光強度を測定することにより、測定対象を測定する方法。
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