JP6660994B1 - 核酸(dna及びrna)由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び/又は塩基の定量方法 - Google Patents
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Abstract
Description
しかし、デオキシリボヌクレオシドの分離に関してはデオキシリボヌクレオチドとの同時分析が不可であった。
[1]核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び/又は塩基を含む試料溶液中の前記ヌクレオチド、ヌクレオシド及び/又は塩基の定量を1回のHPLC分離により達成する方
法であって、
前記HPLC分離に使用するカラムは、分析用の逆相カラムであり、
前記HPLC分離に使用する溶離液は、以下の溶離液A及び溶離液Bの2種の溶離液であり、そして、以下の工程1乃至工程3を含む方法、
溶離液A:pH5.3〜5.5の範囲にある10〜50mM酢酸緩衝液又はpH6.8〜7.5の範囲にある10〜50mMリン酸緩衝液
溶離液B:アセトニトリル
工程1:HPLCに核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び/又は塩基を含む試料溶液を注入する工程
工程2:試料溶液の注入後、カラムオーブン温度30〜40℃及び流速0.3〜0.5mL/分で20〜40分間、溶離液A:溶離液B=100:0の比率の溶離液で溶出する工程
工程3:工程2に続いてカラムオーブン温度30〜40℃及び流速0.3〜0.5mL/分で、25〜45分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液A:溶離液B=100:0の比率から溶離液A:溶離液B=90:10ないし60:40の比率まで直線勾配で変化させて溶出する工程
[2]前記溶離液Aは、該溶離液の容積に基づいて、0.1〜2.0%(v/v)のメタノールを含む[1]記載の方法、
[3]前記溶離液Aは、pH5.3〜5.5の範囲にある20〜30mM酢酸緩衝液である[1]又は[2]記載の方法、
[4]前記溶離液Aは、pH6.8〜7.2の範囲にある20〜40mMリン酸緩衝液である[1]又は[2]記載の方法、
[5]工程2における溶出時間は20〜25分間であり、工程3は、40〜45分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液A:溶離液B=100:0の比率から溶離液A:溶離液B=85:15ないし60:40の比率まで直線勾配で変化させて溶出する[3]記載の方法、
[6]工程2における溶出時間は20〜40分間であり、工程3は、25〜45分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液A:溶離液B=100:0の比率から溶離液A:溶離液B=90:10ないし70:30の比率まで直線勾配で変化させて溶出する[4]記載の方法
に関する。
本発明の方法は、汎用性が高く操作も簡便であるため、核酸関連成分の定量分析において有利に使用することができ、特に、微生物、食品、生体検体等は、DNA・RNA由来のヌクレオチド・ヌクレオシド及び塩基を含むことから、これらの定量分析において有利に使用することができる。
本発明は、核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び/又は塩基を含む試料溶液中の前記ヌクレオチド、ヌクレオシド及び/又は塩基の定量を1回のHPLC分離により達成する方法であって、
前記HPLC分離に使用するカラムは、分析用の逆相カラムであり、
前記HPLC分離に使用する溶離液は、以下の溶離液A及び溶離液Bの2種の溶離液であり、そして、以下の工程1乃至工程3を含む方法に関する。
溶離液A:pH5.3〜5.5の範囲にある10〜50mM酢酸緩衝液又はpH6.8〜7.5の範囲にある10〜50mMリン酸緩衝液
溶離液B:アセトニトリル
工程1:HPLCに核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び/又は塩基を含む試料溶液を注入する工程
工程2:試料溶液の注入後、カラムオーブン温度30〜40℃及び流速0.3〜0.5mL/分で20〜40分間、溶離液A:溶離液B=100:0の比率の溶離液で溶出する工程
工程3:工程2に続いてカラムオーブン温度30〜40℃及び流速0.3〜0.5mL/分で、25〜45分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液A:溶離液B=100:0の比率から溶離液A:溶離液B=90:10ないし60:40の比率まで直線勾配で変化させて溶出する工程
2−デオキシアデノシン一リン酸、チミジン一リン酸、2−デオキシグアノシン一リン酸、2−デオキシシトシン一リン酸、2−デオキシアデノシン、チミジン、2−デオキシグアノシン、2−デオキシシトシン、アデノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、アノシン一リン酸、シトシン一リン酸、アデノシン、ウリジン、グアノシン、シトシン、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル
前記核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び/又は塩基を含む試料溶液中に含まれる各成分の濃度は、HPLC分離において支障を来さない濃度であれば特に限定されないが、0.1〜50mg/100mLの範囲が好ましく、1.0〜20mg/100mLの範囲がより好ましい。
前記試料溶液としては、前記核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び/又は塩基を、溶離液Aに溶解した溶液を用いるのが好ましい。
具体的な上記カラムとしては、TSKgel ODS−100V 3μm 4.6φ×250mm(東ソー(株)社製)、TSKgel ODS−100V 5μm 4.6φ×250mm(東ソー(株)社製)、TSKgel ODS−80Ts 5μm 4.6φ×250mm(東ソー(株)社製)等が挙げられる。
溶離液A:pH5.3〜5.5の範囲にある10〜50mM酢酸緩衝液又はpH6.8〜7.5の範囲にある10〜50mMリン酸緩衝液
溶離液B:アセトニトリル
前記溶離液Aとして用いる酢酸緩衝液としては、pH5.3〜5.5の範囲にある20〜30mM酢酸緩衝液が好ましい。
前記溶離液Aとして用いるリン酸緩衝液としては、pH6.8〜7.2の範囲にある20〜40mMリン酸緩衝液が好ましい。
工程1:HPLCに核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び/又は塩基を含む試料溶液を注入する工程
工程2:試料溶液の注入後、カラムオーブン温度30〜40℃及び流速0.3〜0.5mL/分で20〜40分間、溶離液A:溶離液B=100:0の比率の溶離液で溶出する工程
工程3:工程2に続いてカラムオーブン温度30〜40℃及び流速0.3〜0.5mL/分で、25〜45分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液A:溶離液B=100:0の比率から溶離液A:溶離液B=90:10ないし60:40の比率まで直線勾配で変化させて溶出する工程
HPLCに試料溶液が注入される段階において、HPLCには、工程2と同様のカラムオーブン温度及び流速で溶離液Aが流される。
該工程における溶出時間は、溶離液A:溶離液B=100:0の比率の溶離液で、20〜40分間であるが、酢酸緩衝液を用いる場合の溶出時間は、20〜25分間の範囲とすることもできる。
該工程において、25〜45分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液A:溶離液B=100:0の比率から溶離液A:溶離液B=90:10ないし60:40の比率まで直線勾配で変化させて溶出する。
該工程において酢酸緩衝液を用いる場合、40〜45分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液A:溶離液B=100:0の比率から溶離液A:溶離液B=85:15ないし60:40の比率まで直線勾配で変化させて溶出するのが好ましく、リン酸緩衝液を用いる場合、25〜45分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液A:溶離液B=100:0の比率から溶離液A:溶離液B=90:10ないし70:30の比率まで直線勾配で変化させて溶出するのが好ましい。
好ましい検出手段としては、PDA検出器(UV波長:240−280nm)を用いる検出法が挙げられる。
以下に示す21種類の核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び/又は塩基を、HPLC分離で使用する溶離液(溶離液A)に溶解して、各成分の濃度が以下となる試料溶液を調製した。
2−デオキシアデノシン一リン酸:10mg/100mL
チミジン一リン酸:10mg/100mL
2−デオキシグアノシン一リン酸:10mg/100mL
2−デオキシシトシン一リン酸:10mg/100mL
2−デオキシアデノシン:10mg/100mL
チミジン:10mg/100mL
2−デオキシグアノシン:10mg/100mL
2−デオキシシトシン:10mg/100mL
アデノシン一リン酸:10mg/100mL
ウリジン一リン酸:10mg/100mL
アノシン一リン酸:10mg/100mL
シトシン一リン酸:10mg/100mL
アデノシン:10mg/100mL
ウリジン:10mg/100mL
グアノシン:10mg/100mL
シトシン:10mg/100mL
アデニン:10mg/100mL
チミン:10mg/100mL
グアニン:1.0mg/100mL
シトシン:10mg/100mL
ウラシル:10mg/100mL
1.使用機器
・HPLC:(株)島津製作所製、Prominence−i LC−2030C 3D・分析用逆相カラム:東ソー(株)社製、TSKgel ODS−100V 3μm 4.6φ×250mm
・検出器:PDA検出器(UV波長:240−280nm)
2.分離操作
以下の操作による分離方法を方法1とした。
調製例1で調製した試料溶液20μLをHPLCに注入し、カラムオーブン温度35℃及び流速0.4mL/分で25分間、溶離液Aで溶出し(溶出1)、続いて、カラムオーブン温度35℃及び流速0.4mL/分で、40分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液A:アセトニトリル(溶離液B)=100:0の比率から溶離液A:アセトニトリル(溶離液B)=85:15の比率まで直線勾配で変化させて溶出した(溶出2)。
方法1における溶出1の溶出時間、溶出2の溶出時間、並びに、溶出2における溶離液の最終組成(溶離液A:アセトニトリル(溶離液B))を、表1に示されるように種々変化させたものを方法2−11とした。
1.溶離液Aとして酢酸緩衝液を用いた分析例
溶離液Aとして用いた酢酸緩衝液の種類及び分離操作の種類を種々変更して、分析例1−16を実施した。
溶離液Aとして用いた酢酸緩衝液の種類及び分離操作の種類を表2に纏めた。
また、分析の結果の判定は以下の通りとした。
○:21成分のピークが分離して観察され、各成分における定量が可能であった。
△:ピークの部分的な重なりがあったが、21成分のピークの各成分における定量が可能であった。
×:20以下のピークしか観察されなかった。
分析の結果の判定を表2中に示した。
尚、表中の“+メタノール0.3%”は、使用した溶離液Aが、該溶離液の容積に基づいて、0.3%(v/v)のメタノールを含むことを意味する。
溶離液Aとして用いたリン酸緩衝液の種類及び分離操作の種類を種々変更して、分析例17−40を実施した。
溶離液Aとして用いたリン酸緩衝液の種類及び分離操作の種類を表4に纏めた。
また、分析の結果の判定は、上記と同様とした。
分析の結果の判定を表4中に示した。
尚、表中の“+メタノール0.3%”は、使用した溶離液Aが、該溶離液の容積に基づいて、0.3%(v/v)のメタノールを含むことを意味し、“+メタノール1.0%”は、使用した溶離液Aが、該溶離液の容積に基づいて、1.0%(v/v)のメタノールを含むことを意味する。
カラムオーブン温度の変更による分離に対する影響を評価するために、表6に記載の溶離液A及びカラムオーブン温度を採用して分析例41−50を実施した。
カラムオーブン温度及び溶離液Aの種類以外の条件は以下の通りとした。
調製例1で調製した試料溶液20μLをHPLCに注入し、流速0.4mL/分で25分間、溶離液Aで溶出し(溶出1)、続いて、流速0.4mL/分で、溶離液の組成を、40分間で、溶離液A:アセトニトリル(溶離液B)=100:0から溶離液A:アセトニトリル(溶離液B)=60:40の比率に直線勾配で変化させて溶出した(溶出2)。
分析の結果の判定は、上記と同様とし、分析の結果の判定を表6中に示した。
尚、表中の “+メタノール1.0%”は、使用した溶離液Aが、該溶離液の容積に基づいて、1.0%(v/v)のメタノールを含むことを意味する。
Claims (6)
- 核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び/又は塩基を含む試料溶液中の前記ヌクレオチド、ヌクレオシド及び/又は塩基の定量を1回のHPLC分離により達成する方法であって、
前記HPLC分離に使用するカラムは、分析用の逆相カラムであり、
前記HPLC分離に使用する溶離液は、以下の溶離液A及び溶離液Bの2種の溶離液であり、そして、以下の工程1乃至工程3を含む方法。
溶離液A:pH5.3〜5.5の範囲にある10〜50mM酢酸緩衝液又はpH6.8〜7.5の範囲にある10〜50mMリン酸緩衝液
溶離液B:アセトニトリル
工程1:HPLCに核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び/又は塩基を含む試料溶液を注入する工程
工程2:試料溶液の注入後、カラムオーブン温度30〜40℃及び流速0.3〜0.5mL/分で20〜40分間、溶離液A:溶離液B=100:0の比率の溶離液で溶出する工程
工程3:工程2に続いてカラムオーブン温度30〜40℃及び流速0.3〜0.5mL/分で、25〜45分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液A:溶離液B=100:0の比率から溶離液A:溶離液B=90:10ないし60:40の比率まで直線勾配で変化させて溶出する工程 - 前記溶離液Aは、該溶離液の容積に基づいて、0.1〜2.0%(v/v)のメタノールを含む請求項1記載の方法。
- 前記溶離液Aは、pH5.3〜5.5の範囲にある20〜30mM酢酸緩衝液である請求項1又は請求項2記載の方法。
- 前記溶離液Aは、pH6.8〜7.2の範囲にある20〜40mMリン酸緩衝液である請求項1又は請求項2記載の方法。
- 工程2における溶出時間は20〜25分間であり、工程3は、40〜45分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液A:溶離液B=100:0の比率から溶離液A:溶離液B=85:15ないし60:40の比率まで直線勾配で変化させて溶出する請求項3記載の方法。
- 工程2における溶出時間は20〜40分間であり、工程3は、25〜45分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液A:溶離液B=100:0の比率から溶離液A:溶離液B=90:10ないし70:30の比率まで直線勾配で変化させて溶出する請求項4記載の方法。
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