JP6660504B2 - Primer and nut detection method - Google Patents
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Description
本発明は、アレルギーを引き起こす恐れのある木の実（アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ）を検出対象とし、当該木の実が食品原料や製品等に含まれていた場合に、その量が微量であっても高感度で検出することを可能とする木の実の検出方法、並びにその方法に使用するPCRプライマー、プライマーセット、及びキットに関するものである。 The present invention relates to nutrients that may cause allergies (almonds, beach nuts, brazil nuts, butter nuts, cashew nuts, chestnuts, tincappins, coconut, ginkgo, hazelnuts, hickory nuts, lychees, macadamia nuts, pecan nuts, pine nuts, Detection of tree nuts that can be detected with high sensitivity even if the amount of the tree nuts is contained in food raw materials or products, etc., as detection targets (pinuts, pistachios, shea nuts, walnuts) The present invention relates to a method, a PCR primer, a primer set, and a kit used in the method.
食物アレルギーを引き起こす恐れのある食品のうち、特にその患者数の多い乳、卵、魚、甲殻類、小麦、大豆、落花生、木の実の8品目は、「The Big-8」とも言われ、アメリカ、カナダ、シンガポール、EU等、世界の多くの国や地域において、共通して含有食品への表示が義務付けられている。 Among the foods that can cause food allergies, the eight items of milk, eggs, fish, crustaceans, wheat, soybeans, peanuts, and nuts, especially those with a large number of patients, are also called `` The Big-8 '', the United States, In many countries and regions around the world, such as Canada, Singapore, and the EU, labeling of food products is commonly required.
アレルギーを引き起こす恐れのある食品は、生産、流通、加工段階での意図しない微量の混入も起こり得るため、食品原料ないし製品の提供者としては、それらが混入しているか否かの品質管理を行うことが重要となる。 Foods that may cause allergies can have unintended traces of contamination during the production, distribution, and processing stages.As a food material or product provider, perform quality control to determine whether or not such contamination has occurred. It becomes important.
乳、卵については、それぞれに特徴的な蛋白質を検出する方法（ELISA法、ウェスタンブロット法、及びイムノクロマト法）が、魚については、それぞれに特徴的なDNA塩基配列を検出する方法（PCR法）が、また、甲殻類、小麦、大豆、落花生については、その両方の検出方法が、各々確立されており、検査キットとして商用的に入手、利用可能となっている。一方、木の実とは総称であり、生物学的に非常に幅広い生物種が含まれるため、木の実としてまとめて検出する方法は確立されていない。 For milk and eggs, methods for detecting characteristic proteins (ELISA, Western blotting, and immunochromatography) are used. For fish, methods for detecting characteristic DNA base sequences (PCR) are used. However, for crustaceans, wheat, soybeans, and peanuts, both detection methods have been established and are commercially available and available as test kits. On the other hand, nuts are a generic term and include a very wide range of biological species, and no method has been established to detect them collectively as nuts.
木の実表示義務のある各国において、表示対象となる木の実とは、例えば、EU、シンガポールでは、アーモンド、クルミ、ピーカンナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ピスタチオの8種、カナダではさらに松の実を加えた9種が挙げられている。アメリカでは最も多く、上記の9種に加え、ビーチナッツ、バターナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヒッコリーナッツ、ライチ、ピリナッツ、シアナッツの計19種が挙げられている。 In countries where tree nuts are obliged to be labeled, for example, in the EU and Singapore, eight kinds of nuts are almonds, walnuts, pecan nuts, hazelnuts, macadamia nuts, Brazil nuts, cashew nuts, pistachios, and in Canada, pine nuts. Nine species with fruit are listed. In the United States, 19 kinds of beach nuts, butternuts, chestnuts, chincapin, coconut, ginkgo, hickory nuts, lychee, pili nuts, and shea nuts are listed in addition to the above nine kinds.
日本は諸外国とは異なり、木の実を一括した表示対象とせず、クルミとカシューナッツを「特定原材料に準ずるもの」として個別に表示することが推奨されている（アレルギー物質を含む食品に関する表示について、平成25年9月20日、消食表第257号）。近年、日本人の食生活の欧米化に伴って、木の実摂取量は増加しており、今後クルミ、カシューナッツ以外の木の実に対する食物アレルギー患者数の増加や、それに伴う「特定原材料に準ずるもの」への追加も大いにあると考えられる。 In Japan, unlike other countries, it is recommended that walnuts and cashew nuts be individually labeled as "substances conforming to specified raw materials" instead of collectively labeling tree nuts. September 20, 2013, Food Eating Table No. 257). In recent years, with the westernization of Japanese dietary habits, tree nut intake has increased, and in the future the number of patients with food allergies to nuts other than walnuts and cashew nuts will increase, and as a result, `` substances conforming to specific raw materials '' will increase. It is thought that there is much addition.
木の実混入の有無を検査するためには、個々の木の実に対する検出法を複数組み合わせることになるが、ELISA法やウェスタンブロット法を複数回行うことは、膨大な手間と費用がかかる。一方PCR法の場合、PCR条件が同一であれば、複数セットの試薬を調製し、一斉に検査することが可能となるため、木の実検出法として有用であると考えられる。また、一般に、蛋白質は、DNAと比べて、食品製造工程における様々な加工処理に対する安定性が低いため、蛋白質を検出する方法は、高度に加工された被験食品に対しては適用できない可能性が高い。そのため、蛋白質よりも加工処理に比較的強いとされるDNAの塩基配列を標的としたPCR法は、様々な加工処理工程を経た食品原料や製品中からの検出法に適していると考えられる。 In order to test for the presence or absence of tree nut contamination, a plurality of detection methods for individual tree nuts are combined. However, performing ELISA and Western blotting multiple times requires enormous labor and cost. On the other hand, in the case of the PCR method, if the PCR conditions are the same, a plurality of sets of reagents can be prepared and tested at once, which is considered to be useful as a method for detecting tree nuts. In addition, proteins are generally less stable to various types of processing in the food manufacturing process than DNA, so that methods for detecting proteins may not be applicable to highly processed test foods. high. Therefore, the PCR method targeting the base sequence of DNA, which is considered to be relatively more resistant to processing than proteins, is considered to be suitable for detection from food materials and products that have undergone various processing steps.
現在、アーモンド、クルミ、ピーカンナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ピスタチオの8種については、PCR法を用いた個別の検出法が確立されており、検査キットとして商用的に入手、利用可能となっている。該キットはTaqManプローブを用いたリアルタイムPCR法を採用することによって検出特異性を確保しているが、リアルタイムPCR用機器、試薬を必要とするため、プローブを用いない通常のPCR法と比較すると費用がかかる。また、前述の通り、食物アレルギーを引き起こす恐れのある木の実には少なくとも19種が存在し、該キットでは検出不可能な木の実が多く存在する。 Currently, individual detection methods using PCR have been established for eight types of almonds, walnuts, pecan nuts, hazelnuts, macadamia nuts, Brazil nuts, cashew nuts, and pistachios, and are commercially available and used as test kits. It is possible. Although the kit uses a real-time PCR method using a TaqMan probe to ensure detection specificity, it requires equipment and reagents for real-time PCR, so it is more expensive than a normal PCR method without a probe. It takes. As described above, there are at least 19 types of nuts that may cause food allergies, and there are many nuts that cannot be detected by the kit.
個別の木の実検出法としては他にも、アーモンド、ヘーゼルナッツ、カシューナッツ、クルミについて、PCR法による検出方法が報告されている（特許文献1、2、3、4）が、いずれも単一種の木の実を検出する方法であり、複数種の木の実を検出することはできない。
As another method for detecting individual nuts, PCR methods for almond, hazelnut, cashew nut, and walnut have been reported (
また、クリの品種解析を目的として、SSRマーカーを用いた方法が報告されている（非特許文献1）が、被験試料が単一種の植物である場合に使用することを前提としており、複数の植物種が混合する試料の場合、使用するPCRプライマーは、他の植物DNAとも反応する可能性が非常に高いために、クリを特異的に検出することは困難となる。それ故に、複数の植物を含む食品中のクリDNAを特異的に検出するために使用することはできない。 In addition, for the purpose of analyzing chestnut varieties, a method using SSR markers has been reported (Non-Patent Document 1), but it is presumed that the test sample is used when a single species of plant is used. In the case of a sample in which plant species are mixed, it is very difficult for the PCR primers used to react with other plant DNAs, so that it is difficult to specifically detect chestnuts. Therefore, it cannot be used to specifically detect chestnut DNA in foods containing multiple plants.
また、ココナッツの検出法としては、ココナッツ特異的蛋白質標的としたイムノクロマト法を用いた検出法が確立されており、検査キットとして商用的に入手、利用可能となっているが、DNA塩基配列を標的とした検出法に関する報告はない。 In addition, as a method for detecting coconut, a detection method using an immunochromatography method targeting coconut-specific protein has been established, and it is commercially available and usable as a test kit. There is no report on the detection method used.
ビーチナッツ、バターナッツ、チンカピン、銀杏、ヒッコリーナッツ、ライチ、ピリナッツ、松の実、シアナッツについては、これまでに検出法に関する報告はない。 There have been no reports on detection methods for beach nuts, butter nuts, tin capin, ginkgo, hickory nuts, lychees, pili nuts, pine nuts, and shea nuts.
上述したように、食物アレルギーを引き起こす恐れのある木の実（アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ）を同一条件で簡便に検出する方法は報告されておらず、これらの木の実が食品原料や製品に混入しているか否かを科学的に検証可能な手法が、食品の品質管理手法として待望されている。 As mentioned above, nuts that can cause food allergies (almonds, beach nuts, Brazil nuts, butternuts, cashew nuts, chestnuts, tincapin, coconut, ginkgo, hazelnut, hickory nuts, lychees, macadamia nuts, pecan nuts, pine nuts No simple method has been reported for the simple detection of nuts, peanuts, pistachios, shea nuts, walnuts) under the same conditions, and there is a method that can scientifically verify whether or not these nuts are mixed in food ingredients or products. It is expected as a food quality control technique.
本発明は、アレルギーを引き起こす恐れのある木の実（アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ）を、食品原料や製品中から特異的に、一斉に検出できる方法、及びこの方法に用いるPCRプライマー、プライマーセット、キットを提供することを、主目的とする。 The present invention relates to nutrients that may cause allergies (almonds, beach nuts, brazil nuts, butter nuts, cashew nuts, chestnuts, tincappins, coconut, ginkgo, hazelnuts, hickory nuts, lychees, macadamia nuts, pecan nuts, pine nuts, It is a primary object of the present invention to provide a method for simultaneously and specifically detecting pili nut, pistachio, shea nut, and walnut) from food materials and products, and a PCR primer, a primer set, and a kit used in the method.
上記課題を達成するために、本発明者らは、分子生物学的観点から、検出対象とする木の実及びその他の生物の遺伝子配列における共通性と特異性に着目し、食物アレルギー原因食物である木の実（アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ）を高感度に検出することができる方法を鋭意研究した。その結果、アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、あるいはクルミの各々に特徴的な塩基配列を見いだし、これらの塩基配列を利用してPCR法などの核酸分析を行うことで、アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、あるいはクルミをそれぞれ簡便に検出し得ることを見いだし、更に鋭意検討を重ねて、それらを同一条件のもとで検出できるよう工夫し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、以下の木の実検出用PCRプライマーセット、木の実検出法、並びに、木の実検出用キットに関与する。 In order to achieve the above object, the present inventors have focused on the commonality and specificity in the gene sequences of the tree nuts to be detected and other organisms from a molecular biological point of view, and have focused on the tree nuts that are food allergic foods. (Almonds, beach nuts, Brazil nuts, butternuts, cashew nuts, chestnuts, tincapin, coconut, ginkgo, hazelnuts, hickory nuts, lychees, macadamia nuts, pecan nuts, pine nuts, pili nuts, pistachios, shea nuts, walnuts) We have studied the methods that can be detected. As a result, almonds, beach nuts, Brazil nuts, butternuts, cashew nuts, chestnuts, tincapin, coconut, ginkgo, hazelnuts, hickory nuts, lychees, macadamia nuts, pecan nuts, pine nuts, pili nuts, pistachios, shea nuts, or walnuts By finding characteristic nucleotide sequences for each and performing nucleic acid analysis such as PCR using these nucleotide sequences, almonds, beach nuts, Brazil nuts, butter nuts, cashew nuts, chestnuts, tin capin, coconut, ginkgo, Hazelnuts, hickory nuts, lychees, macadamia nuts, pecan nuts, pine nuts, pili nuts, pistachios, shea nuts, or walnuts were found to be easily detectable, and after further intensive studies, they were identified in the same article. It devised so that can be detected by the original, which resulted in the completion of the present invention. That is, the present invention relates to the following PCR primer set for detecting tree nuts, a method for detecting tree nuts, and a kit for detecting tree nuts.
項1. 下記の(1)〜(34)のいずれかのPCRプライマーセット。
(1) 配列表の配列番号1における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号2における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるPCRプライマーセット。
(2) 配列表の配列番号3における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号4における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(3) 配列表の配列番号5における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号6における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(4) 配列表の配列番号7における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号8における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(5) 配列表の配列番号9における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号10における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(6) 配列表の配列番号11における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号12における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(7) 配列表の配列番号13における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号14における塩基番号13〜27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(8) 配列表の配列番号15における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号16における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(9) 配列表の配列番号17における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号18における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるPCRプライマーセット。
(10) 配列表の配列番号19における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号20における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(11) 配列表の配列番号21における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号22における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(12) 配列表の配列番号23における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号24における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(13) 配列表の配列番号25における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号26における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(14) 配列表の配列番号27における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号28における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(15) 配列表の配列番号29における塩基番号10〜24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号30における塩基番号15〜29の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(16) 配列表の配列番号31における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号32における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(17) 配列表の配列番号33における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号34における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(18) 配列表の配列番号1の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号2の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(19) 配列表の配列番号3の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号4の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(20) 配列表の配列番号5の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号6の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(21) 配列表の配列番号7の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号8の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(22) 配列表の配列番号9の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号10の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(23) 配列表の配列番号11の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号12の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(24) 配列表の配列番号13の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号14の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(25) 配列表の配列番号15の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号16の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(26) 配列表の配列番号17の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(27) 配列表の配列番号19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(28) 配列表の配列番号21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(29) 配列表の配列番号23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(30) 配列表の配列番号25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号26の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(31) 配列表の配列番号27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号28の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(32) 配列表の配列番号29の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号30の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(33) 配列表の配列番号31の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号32の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(34) 配列表の配列番号33の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号34の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(1) a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of base numbers 9 to 23 in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing at the 3 ′ end,
A PCR primer set comprising a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of
(2) a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of
And a PCR primer comprising a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of
(3) a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of base numbers 9 to 23 in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing at the 3 ′ end,
And a PCR primer comprising a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of
(4) a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of
A primer set consisting of a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of
(5) a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of
A primer set consisting of a maximum of 30 nucleotides of DNA including the nucleotide sequence of
(6) a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of
A primer set consisting of a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of
(7) a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of
A primer set consisting of a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of bases 13 to 27 in SEQ ID NO: 14 at the 3 'end side in the sequence listing
(8) a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of
A primer set consisting of a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of bases 11 to 25 in the sequence listing at SEQ ID NO: 16 on the 3 'end side
(9) a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of
A PCR primer set comprising a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of bases 9 to 23 in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing at the 3 ′ end side.
(10) a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of
And a PCR primer comprising a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of
(11) a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of
A primer set comprising a maximum of 30 nucleotides of DNA containing the nucleotide sequence of
(12) a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of
A primer set consisting of a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of
(13) a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of
And a PCR primer comprising a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of
(14) a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of
A primer set comprising a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of
(15) a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of base numbers 10 to 24 in SEQ ID NO: 29 in the sequence listing at the 3 ′ end,
A PCR primer comprising a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of base numbers 15 to 29 in SEQ ID NO: 30 in the sequence listing at the 3 'end side.
(16) a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of
A PCR primer comprising a maximum of 30 nucleotides of DNA including the nucleotide sequence of
(17) a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of
And a PCR primer comprising a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of
(18) a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of SEQ ID NO: 1 on the 3 ′ end side of the sequence listing,
A primer set consisting of a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 2 at the 3 ′ end in the sequence listing
(19) a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing at the 3 ′ end,
A primer set consisting of a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of SEQ ID NO: 4 at the 3 'end in the sequence listing
(20) a PCR primer consisting of a maximum of 30 nucleotides of DNA including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing at the 3 ′ end,
A primer set consisting of a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 6 at the 3 ′ end in the sequence listing
(21) a PCR primer comprising a maximum of 30 nucleotides of DNA including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 in the sequence listing at the 3 ′ end,
A primer set consisting of a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of SEQ ID NO: 8 at the 3 ′ end in the sequence listing
(22) a PCR primer consisting of a maximum of 30 nucleotides of DNA including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 on the 3 'end side of the sequence listing,
A primer set consisting of a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 10 at the 3 ′ end side in the sequence listing
(23) a PCR primer consisting of a maximum of 30 nucleotides of DNA including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 in the sequence listing at the 3 ′ end,
A primer set consisting of a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of SEQ ID NO: 12 on the 3 'end side in the sequence listing
(24) a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of SEQ ID NO: 13 in the sequence listing at the 3 ′ end,
A primer set consisting of a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 14 at the 3 ′ end in the sequence listing
(25) a PCR primer consisting of a maximum of 30 nucleotides of DNA including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 in the sequence listing at the 3 ′ end,
A primer set consisting of a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 16 on the 3 'end side in the sequence listing
(26) a PCR primer consisting of a maximum of 30 nucleotides of DNA including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 in the sequence listing at the 3 ′ end,
A primer set consisting of a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 18 at the 3 ′ end in the sequence listing
(27) a PCR primer consisting of a maximum of 30 nucleotides of DNA including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 on the 3 'end side of the sequence listing,
A primer set consisting of a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 20 on the 3 'end side in the sequence listing
(28) a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of SEQ ID NO: 21 in the sequence listing at the 3 ′ end,
A primer set consisting of a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 22 at the 3 'end side in the sequence listing
(29) a PCR primer consisting of a maximum of 30 nucleotides of DNA including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 on the 3 'end side of the sequence listing,
A primer set consisting of a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of SEQ ID NO: 24 at the 3 ′ end in the sequence listing
(30) a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of SEQ ID NO: 25 on the 3 ′ end side of the sequence listing,
A primer set consisting of a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 26 at the 3 ′ end in the sequence listing
(31) a PCR primer consisting of a maximum of 30 nucleotides of DNA including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 in the sequence listing at the 3 ′ end,
A primer set consisting of a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of SEQ ID NO: 28 at the 3 ′ end in the sequence listing
(32) a PCR primer consisting of a maximum of 30 nucleotides of DNA including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 in the sequence listing at the 3 ′ end,
A primer set consisting of a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of SEQ ID NO: 30 at the 3 'end in the sequence listing
(33) a PCR primer consisting of a maximum of 30 nucleotides of DNA including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31 in the sequence listing at the 3 ′ end,
A primer set consisting of a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 32 on the 3 'end side in the sequence listing
(34) a PCR primer consisting of a maximum of 30 nucleotides of DNA including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33 in the sequence listing at the 3 ′ end,
A primer set consisting of a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 34 at the 3 'end in the sequence listing
項２. 請求項１の(1)に記載のプライマーセット。
項３. 請求項１の(2)に記載のプライマーセット。
項４. 請求項１の(3)に記載のプライマーセット。
項５. 請求項１の(4)に記載のプライマーセット。
項６. 請求項１の(5)に記載のプライマーセット。
項７. 請求項１の(6)に記載のプライマーセット。
項８. 請求項１の(7)に記載のプライマーセット。
項９. 請求項１の(8)に記載のプライマーセット。 Item 9. The primer set according to Item 1 (8).
項１０. 請求項１の(9)に記載のプライマーセット。 Item 10. The primer set according to Item 1 (9).
項１１. 請求項１の(10)に記載のプライマーセット。 Item 11. The primer set according to Item 1 (10).
項１２. 請求項１の(11)に記載のプライマーセット。 Item 12. The primer set according to Item 1 (11).
項１３. 請求項１の(12)に記載のプライマーセット。 Item 13. The primer set according to Item 1 (12).
項１４. 請求項１の(13)に記載のプライマーセット。 Item 14. The primer set according to Item 1 (13).
項１５. 請求項１の(14)に記載のプライマーセット。 Item 15. The primer set according to Item 1 (14).
項１６. 請求項１の(15)に記載のプライマーセット。 Item 16. The primer set according to Item 1 (15).
項１７. 請求項１の(16)に記載のプライマーセット。 Item 17. The primer set according to Item 1 (16).
項１８. 請求項１の(17)に記載のプライマーセット。 Item 18. The primer set according to Item 1 (17).
項１９. 請求項１の(18)に記載のプライマーセット。 Item 19. The primer set according to Item 1 (18).
項２０. 請求項１の(19)に記載のプライマーセット。 Item 20. The primer set according to Item 1 (19).
項２１. 請求項１の(20)に記載のプライマーセット。 Item 21. The primer set according to Item 1 (20).
項２２. 請求項１の(21)に記載のプライマーセット。 Item 22. The primer set according to Item 1 (21).
項２３. 請求項１の(22)に記載のプライマーセット。 Item 23. The primer set according to Item 1 (22).
項２４. 請求項１の(23)に記載のプライマーセット。
項２５. 請求項１の(24)に記載のプライマーセット。 Item 25. The primer set according to Item 1 (24).
項２６. 請求項１の(25)に記載のプライマーセット。 Item 26. The primer set according to Item 1 (25).
項２７. 請求項１の(26)に記載のプライマーセット。 Item 27. The primer set according to Item 1 (26).
項２８. 請求項１の(27)に記載のプライマーセット。 Item 28. The primer set according to Item 1 (27).
項２９. 請求項１の(28)に記載のプライマーセット。 Item 29. The primer set according to Item 1 (28).
項３０. 請求項１の(29)に記載のプライマーセット。 Item 30. The primer set according to Item 1 (29).
項３１. 請求項１の(30)に記載のプライマーセット。 Item 31. The primer set according to Item 1 (30).
項３２. 請求項１の(31)に記載のプライマーセット。 Item 32. The primer set according to Item 1 (31).
項３３. 請求項１の(32)に記載のプライマーセット。 Item 33. The primer set according to Item 1 (32).
項３４. 請求項１の(33)に記載のプライマーセット。 Item 34. The primer set according to Item 1 (33).
項３５. 請求項１の(34)に記載のプライマーセット。 Item 35. The primer set according to Item 1 (34).
項３６. 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項２〜３５のいずれかに記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中に木の実が存在しているか否かを検出する工程とを含む木の実の検出方法。
Item 36. A step of extracting DNA from the sample, a step of performing PCR using the DNA as a template and the primer set according to any one of
項３７ 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項２又は１９記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にアーモンドが存在しているか否かを検出する工程とを含むアーモンドの検出方法。
Item 37: a step of extracting DNA from a sample, a step of using this DNA as a template and performing PCR using the primer set according to
項３８ 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項３又は２０記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にビーチナッツが存在しているか否かを検出する工程とを含むビーチナッツの検出方法。
Item 38: A step of extracting DNA from a sample, a step of using this DNA as a template and performing PCR using the primer set of
項３９ 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項４又は２１記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にブラジルナッツが存在しているか否かを検出する工程とを含むブラジルナッツの検出方法。
Item 39: a step of extracting DNA from the sample, a step of performing PCR using the DNA as a template and the primer set of
項４０ 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項５又は２２記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にカシューナッツが存在しているか否かを検出する工程とを含むカシューナッツの検出方法。
Item 40: a step of extracting DNA from the sample, a step of performing PCR using the DNA as a template and the primer set of
項４１ 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項６又は２３記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にクリが存在しているか否かを検出する工程とを含むクリの検出方法。
Item 41: a step of extracting DNA from a sample, a step of performing PCR using the DNA as a template and the primer set according to
項４２ 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項７又は２４記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にココナッツが存在しているか否かを検出する工程とを含むココナッツの検出方法。
Item 42: a step of extracting DNA from the sample, a step of performing PCR using the DNA as a template and the primer set of
項４３ 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項８又は２５記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中に銀杏が存在しているか否かを検出する工程とを含む銀杏の検出方法。
Item 43: a step of extracting DNA from the sample, a step of performing PCR using the DNA as a template and the primer set according to
項４４ 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項９又は２６記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にヘーゼルナッツが存在しているか否かを検出する工程とを含むヘーゼルナッツの検出方法。 Item 44: a step of extracting DNA from the sample, a step of performing PCR using the DNA as a template and the primer set according to claim 9 or 26, and the presence of hazelnuts in the sample by detecting the amplified DNA. Detecting a hazelnut.
項４５ 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項１０又は２７記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にヒッコリーナッツが存在しているか否かを検出する工程とを含むヒッコリーナッツの検出方法。 Item 45: a step of extracting DNA from a sample, a step of performing PCR using the DNA as a template and the primer set of claim 10 or 27, and detecting the amplified DNA to form a hickory nut in the sample. Detecting the presence or absence of hickory nuts.
項４６ 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項１１又は２８記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にライチが存在しているか否かを検出する工程とを含むライチの検出方法。 Item 46: a step of extracting DNA from the sample, a step of performing PCR using the DNA as a template and the primer set according to claim 11 or 28, and detecting the amplified DNA so that litchi is present in the sample. Detecting the presence or absence of litchi.
項４７ 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項１２又は２９記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にマカダミアナッツが存在しているか否かを検出する工程とを含むマカダミアナッツの検出方法。 Item 47: a step of extracting DNA from a sample, a step of performing PCR using the DNA as a template and the primer set according to claim 12 or 29, and detecting macadamia nut in the sample by detecting the amplified DNA. Detecting the presence or absence of macadamia nuts.
項４８ 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項１３又は３０記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にピーカンナッツが存在しているか否かを検出する工程とを含むピーカンナッツの検出方法。 Item 48 A step of extracting DNA from a sample, a step of performing PCR using the DNA as a template and the primer set of claim 13 or 30, and detecting the amplified DNA to form pecan nuts in the sample. Detecting whether or not it is present.
項４９ 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項１４又は３１記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中に松の実が存在しているか否かを検出する工程とを含む松の実の検出方法。 Item 49 A step of extracting DNA from a sample, a step of performing PCR using the DNA as a template and the primer set according to claim 14 or 31, and detecting pine nuts in the sample by detecting the amplified DNA. Detecting whether or not pine is present.
項５０ 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項１５又は３２記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にピリナッツが存在しているか否かを検出する工程とを含むピリナッツの検出方法。 Item 50: a step of extracting DNA from a sample, a step of performing PCR using the DNA as a template and the primer set of claim 15 or 32, and detecting amplified DNA to allow the presence of pili nuts in the sample. Detecting the presence or absence of pili nuts.
項５１ 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項１６又は３３記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にピスタチオが存在しているか否かを検出する工程とを含むピスタチオの検出方法。 Item 51: a step of extracting DNA from a sample, a step of performing PCR using the DNA as a template and the primer set of claim 16 or 33, and the presence of pistachio in the sample by detecting the amplified DNA. Detecting pistachio activity.
項５２ 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項１７又は３４記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にシアナッツが存在しているか否かを検出する工程とを含むシアナッツの検出方法。 Item 52 A step of extracting DNA from a sample, a step of performing PCR using the DNA as a template and the primer set of claim 17 or 34, and the presence of shea nut in the sample by detecting the amplified DNA. Detecting whether or not shea nuts are present.
項５３ 試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項１８又は３５記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にクルミが存在しているか否かを検出する工程とを含むクルミの検出方法。
Item 53: a step of extracting DNA from the sample, a step of performing PCR using the DNA as a template and the primer set of claim 18 or 35, and detecting the amplified DNA so that walnuts are present in the sample. Detecting whether or not the walnut is on the walnut.
本発明によれば、PCR等を用いた核酸分析による、精度及び検出感度の高い木の実（アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ）由来DNAの検出を可能とし、被験食品原料や被験食品中に、上記木の実が混入しているか否か、又は、使用されているか否かといった品質管理検査の実施を可能にするという効果を奏する。また、アレルギーの未然防止、アレルギー症状が生じた際の原因物質の調査等にも寄与する。
According to the present invention, nuts (almonds, beach nuts, brazil nuts, butternuts, cashew nuts, chestnuts, tincapin, coconut, ginkgo, hazelnuts, hickory nuts, litchi, etc.) having high accuracy and detection sensitivity by nucleic acid analysis using PCR and the like are provided. , Macadamia nuts, pecan nuts, pine nuts, pili nuts, pistachios, shea nuts, walnuts) can be detected, and whether or not the above nuts are mixed in the test food raw materials or test foods, or It is possible to carry out a quality control inspection such as whether or not the inspection is performed. It also contributes to prevention of allergies and investigation of the causative substances when allergic symptoms occur.
以下、本発明を詳細に説明する。
木の実検出用PCRプライマーセット
本発明者等は、上記の目的に従い、以下の17種の木の実検出用PCRプライマーセットを開発した。本発明の木の実検出用PCRプライマーセットには、アーモンドに特徴的な塩基配列を有するもの、ビーチナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、ブラジルナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、カシューナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、クリに特徴的な塩基配列を有するもの、ココナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、ヘーゼルナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、銀杏に特徴的な塩基配列を有するもの、ヒッコリーナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、ライチに特徴的な塩基配列を有するもの、マカダミアナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、ピーカンナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、ピリナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、松の実に特徴的な塩基配列を有するもの、ピスタチオに特徴的な塩基配列を有するもの、シアナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、及びクルミに特徴的な塩基配列を有するものがある。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
PCR primer set for detecting tree nuts The present inventors have developed the following 17 types of PCR primer sets for detecting tree nuts in accordance with the above objects. The PCR primer set for detecting nuts of the present invention includes those having a nucleotide sequence characteristic of almonds, those having a nucleotide sequence characteristic of beach nuts, those having a nucleotide sequence characteristic of Brazil nuts, and those of cashew nuts. Having a typical base sequence, having a base sequence characteristic of chestnuts, having a base sequence characteristic of coconut, having a base sequence characteristic of hazelnut, having a base sequence characteristic of ginkgo , Those having a characteristic nucleotide sequence in hickory nuts, those having a characteristic nucleotide sequence in litchi, those having a characteristic nucleotide sequence in macadamia nuts, those having a characteristic nucleotide sequence in pecan nuts, pili nuts Bases characteristic of pine nuts, bases characteristic of pistachio Those having a row, having a characteristic nucleotide sequence in shea nut, and those having a characteristic nucleotide sequence walnut.
それぞれのプライマーセットは以下のようにして設計した。標的とする塩基配列は、感度向上の観点から、1細胞あたりのコピー数が多いものが望ましく、クロロプラストのrbcL(large subunit gene for ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase)遺伝子配列、matk（maturase-encoding gene）遺伝子配列、rRNA遺伝子の内部転写スペーサー領域1（ITS1）塩基配列、及び内部転写スペーサー領域2（ITS2）塩基配列を候補として選定した。各種植物のそれらの配列を既知のDNAデータベース（GenBank nucleotide sequence database）から取得、あるいは、一部の植物については独自に解析することによって取得し、それらの膨大な塩基配列の多重並列配列図を作成した。その中でも、ITS領域は進化速度が速く、より近縁の種の識別が可能となるため、各種木の実特異的プライマーの標的配列として好適であった。 Each primer set was designed as follows. From the viewpoint of improving sensitivity, it is desirable that the target base sequence has a high copy number per cell, and the rbcL (large subunit gene for ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase) gene sequence of chloroplast, matk ( The maturase-encoding gene) gene sequence, the internal transcribed spacer region 1 (ITS1) nucleotide sequence of the rRNA gene, and the internal transcribed spacer region 2 (ITS2) nucleotide sequence were selected as candidates. The sequences of various plants are obtained from a known DNA database (GenBank nucleotide sequence database), or some plants are obtained by independent analysis, and a multiplex parallel sequence diagram of their vast base sequences is created. did. Among them, the ITS region has a high evolution rate and enables the discrimination of closely related species, so that it was suitable as a target sequence for nut-specific primers of various trees.
アーモンド検出用プライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をアーモンド（バラ目バラ科サクラ属ヘントウ（Prunus dulcis））に設定し、アーモンドと、その近縁種である同属のモモ（Prunus percica）、プルーン（Prunus domestica）、ウメ（Prunus mume）、スモモ（Prunus salicina）、アンズ（Prunus armeniaca）、サクランボ（Prunus avium）のITS領域の塩基配列を比較した。ITS領域の塩基配列は近縁種との相同性が高く、アーモンド特異的な塩基配列を選出することは困難であったが、多重並列配列図を詳細に比較検討したところ、アーモンドに特異的な塩基配列領域を選出することができ、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。設計の際には、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。 When developing a primer set for detecting almonds, the species to be detected was set to almond (Rosaceae: Prunus dulcis), and almond and its closely related peach (Prunus percica) ), Prunes (Prunus domestica), plums (Prunus mume), plums (Prunus salicina), apricots (Prunus armeniaca), and cherries (Prunus avium). Although the nucleotide sequence of the ITS region was highly homologous to closely related species, it was difficult to select almond-specific nucleotide sequences. A nucleotide sequence region could be selected, and a PCR primer set was newly designed from the nucleotide sequence region. At the time of design, the nucleotide sequence region of the target species for detection is hybridized under stringent conditions, but the ingenuity and design are made so as not to hybridize with the species not intended for detection. did.
ビーチナッツ検出用プライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をビーチナッツ（ブナ目ブナ科ブナ属（Fagus spp.））に設定し、ビーチナッツと、その近縁種である同科クリ属のクリ（Castanea spp.）、シイ属のシイ（Castanopsis spp.）、コナラ属のドングリ（Quercus spp.）、同目クルミ科ペカン属のヒッコリーナッツ（Carya spp.）、ピーカンナッツ（Carya illinoinensis）、クルミ科クルミ属のクルミ（Juglans spp.）、カバノキ科ハシバミ属のヘーゼルナッツ（Corylus spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。ビーチナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。 When developing a beach nut detection primer set, the species to be detected was set to beach nuts (Fagas spp.), And the beach nuts and their close relatives, the same species, were selected. Genus chestnut (Castanea spp.), Narcissus genus (Castanopsis spp.), Quercus acorn (Quercus spp.), Same order walnut family pecan genus hickory nut (Carya spp.), Pecan nut (Carya illinoinensis) The nucleotide sequences of the ITS regions of walnuts of the genus Walnut (Juglans spp.) And hazelnuts of the birch family (Corylus spp.) Were compared. A base sequence region specific to beach nuts was selected, and a PCR primer set was newly designed from the base sequence region. At this time, the nucleotide sequence was hybridized with the nucleotide sequence region of the species to be detected under a stringent condition, but was invented and designed so as not to hybridize to the species not to be detected.
ブラジルナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をブラジルナッツ（ツツジ目サガリバナ科ブラジルナッツノキ属ブラジルナッツノキ（Bertholletia excelsa））に設定し、ブラジルナッツと、その近縁種である同目アカテツ科シアーバターノキ属のシアナッツ（Vitellaria paradoxa）、アカテツ科フルクリコ属のミラクルフルーツ（Synsepalum dulcificum）、カキノキ科カキノキ属のカキ（Diospyros kaki）、カキノキ科ツバキ属の茶（Camellia sinensis）、マタタビ科マタタビ属のキウイフルーツ（Actinidia deliciosa）、ツツジ科スノキ属のブルーベリー（Vaccinium spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。ブラジルナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。 When developing a PCR primer set for the detection of Brazil nuts, the target species to be detected was set to Brazil nuts (Bertholletia excelsa), and Brazil nuts and their related species were set as Brazil nuts (Bertholletia excelsa). Sheena nuts (Vitellaria paradoxa) of the same order, Aceraceae, Shea butter, Genus Miracle fruits (Synsepalum dulcificum), Asteraceae, Persimmon (Diospyros kaki), Camellia (Camellia sinensis) The nucleotide sequences of the ITS regions of the Kiwi fruit (Actinidia deliciosa) belonging to the genus Agaricus genus and the blueberry (Vaccinium spp.) Belonging to the genus Rhododendron were compared. A nucleotide sequence region specific to Brazil nut was selected, and a new PCR primer set was designed from the nucleotide sequence region. At this time, the nucleotide sequence was hybridized with the nucleotide sequence region of the species to be detected under a stringent condition, but was invented and designed so as not to hybridize to the species not to be detected.
また、カシューナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をカシューナッツ（ムクロジ目ウルシ科カシューナットノキ属カシューナットノキ（Anacardium occidentale））に設定し、カシューナッツと、その近縁種である同科カイノキ属のピスタチオ（Pistacia vera）、マンゴー属のマンゴー（Mangifera indica）、サンショウモドキ属のピンクペッパー（Schinus molle）のITS領域の塩基配列を比較した。カシューナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。 In developing a PCR primer set for detecting cashew nuts, the target species to be detected is cashew nuts (Anacardium occidentale), and cashew nuts and their close relatives, cypress, The nucleotide sequences of the ITS regions of the genus pistachio (Pistacia vera), the mango genus mango (Mangifera indica), and the gingerbread genus Pink pepper (Schinus molle) were compared. A base sequence region specific to cashew nut was selected, and a PCR primer set was newly designed from the base sequence region. At this time, the nucleotide sequence was hybridized with the nucleotide sequence region of the species to be detected under a stringent condition, but was invented and designed so as not to hybridize to the species not to be detected.
また、クリ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をクリ（ブナ目ブナ科クリ属（Castanea spp.））に設定した。チンカピン（Castanea pumila）もクリ属の一種であるため、検出対象とした。クリと、近縁種である同科ブナ属のビーチナッツ（Fagus spp.）、シイ属のシイ（Castanopsis spp.）、コナラ属のドングリ（Quercus spp.）、同目クルミ科ペカン属のヒッコリーナッツ（Carya spp.）、ピーカンナッツ（Carya illinoinensis）、クルミ科クルミ属のクルミ（Jugrans spp.）、カバノキ科ハシバミ属のヘーゼルナッツ（Corylus spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。ITS領域の塩基配列は近縁種との相同性が高く、クリ特異的な塩基配列を選出することは難しかったが、多重並列配列図を詳細に比較検討し、センスプライマー用の領域をヒッコリーナッツ、ピーカンナッツと相同性が高い領域から選出し、アンチセンスプライマー用の領域をヒッコリーナッツ、ピーカンナッツと相同性が低いが、ドングリとは相同性が高い領域を選出し、検出目的のクリ以外の生物種(ヒッコリーナッツ、ピーカンナッツ)に対して交錯性を示すセンスプライマーと、それらとはまた別の生物種(ドングリ)に対する交錯性を示すアンチセンスプライマーを互いに組み合わせることで、検出目的とするクリの当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないPCRプライマーセットを創意工夫して、新規に設計した。 In the development of a PCR primer set for chestnut detection, the species to be detected was set to chestnut (Castneaea spp.). Tincapine (Castanea pumila) is also a member of the genus Chestnut and was therefore detected. Chestnuts and closely related beech genus beech nuts (Fagus spp.), Narcissus genus (Castanopsis spp.), Oak genus acorns (Quercus spp.), Same walnut family pecan genus hickory nuts (Carya spp.), Pecan nuts (Carya illinoinensis), walnuts of the genus Walnut (Jugrans spp.), And base sequences of ITS regions of Hazelnuts (Corylus spp.) Of the birch family Hazelnut were compared. Although the nucleotide sequence of the ITS region was highly homologous to closely related species, it was difficult to select a chestnut-specific nucleotide sequence. Select a region with high homology with pecan nuts, select a region for antisense primers for hickory nuts, a region with low homology with pecan nuts, but select a region with high homology with acorns, other than chestnuts for detection purposes. By combining a sense primer that shows cross-compatibility with biological species (hickory nuts and pecan nuts) with an antisense primer that shows cross-compatibility with another biological species (acorn), it is possible to combine Hybridizes under stringent conditions, but hybridizes with a species not intended for detection. A newly designed PCR primer set was ingeniously devised.
また、ココナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をココナッツ（ヤシ目ヤシ科ココヤシ属ココヤシ（Cocos nucifera））に設定し、ココナッツと、その近縁種である同科ナツメヤシ属のナツメヤシ（Phoenix dactylifera）、エウテルペ属のアサイー（Euterpe oleracea）のITS領域の塩基配列を比較した。ココナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。 In developing a PCR primer set for coconut detection, the target species to be detected is set to coconut (Coconus nucifera), and coconut and its closely related date palm, Cocos nucifera, are set. The nucleotide sequences of the ITS regions of the genus date palm (Phoenix dactylifera) and the genus Euterpe oleracea (Euterpe oleracea) were compared. A nucleotide sequence region specific to coconut was selected, and a PCR primer set was newly designed from the nucleotide sequence region. At this time, the nucleotide sequence was hybridized with the nucleotide sequence region of the species to be detected under a stringent condition, but was invented and designed so as not to hybridize to the species not to be detected.
また、銀杏検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種を銀杏（イチョウ目イチョウ科イチョウ属イチョウ（Ginko biloba））に設定し、銀杏と、その他裸子植物のクロロプラストmatK遺伝子配列を比較した。銀杏に特異的な遺伝子配列領域を選定し、当該遺伝子配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該遺伝子配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。 When developing a PCR primer set for detecting ginkgo, the species to be detected was set to ginkgo (Ginkgo ginkgoaceae, Ginkgo biloba), and the ginkgo and chloroplast matK gene sequences of other gymnosperms were set. Were compared. A gene sequence region specific to Ginkgo was selected, and a PCR primer set was newly designed from the gene sequence region. At that time, the gene sequence region of the species to be detected was hybridized under stringent conditions, but was designed and devised so as not to hybridize to the species not to be detected.
また、ヘーゼルナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をヘーゼルナッツ（ブナ目カバノキ科ハシバミ属（Corylus spp.））に設定し、ヘーゼルナッツと、その近縁種である同目クルミ科ペカン属のヒッコリーナッツ（Carya spp.）、ピーカンナッツ（Carya illinoinensis）、クルミ科クルミ属のクルミ（Jugrans spp.）、クリ科クリ属のクリ（Castanea spp.）、ブナ科ブナ属のビーチナッツ（Fagus spp.）、ブナ科シイ属のシイ（Castanopsis spp.）、ブナ科コナラ属のドングリ（Quercus spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。ヘーゼルナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。 When developing a PCR primer set for detecting hazelnuts, the target species for detection was set to hazelnuts (Corylus spp.), And hazelnuts and their closely related species, walnuts of the same species, were used. Hickory nuts (Carya spp.), Pecan nuts (Carya illinoinensis), Walnuts (Jugrans spp.), Walnuts (Jugrans spp.), Chestnuts chestnuts (Castanea spp.), Fagaceae beech beach nuts (Fagus spp.), The base sequence of the ITS region of Fagaceae genus Cyprus (Castanopsis spp.) And the acorn of the genus Quercus spp. (Quercus spp.) Were compared. A nucleotide sequence region specific to hazelnut was selected, and a PCR primer set was newly designed from the nucleotide sequence region. At this time, the nucleotide sequence was hybridized with the nucleotide sequence region of the species to be detected under a stringent condition, but was invented and designed so as not to hybridize to the species not to be detected.
また、ヒッコリーナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をヒッコリーナッツ（ブナ目クルミ科ペカン属（Carya spp.））に設定し、ヒッコリーナッツと、その近縁種である同目クルミ科クルミ属のクルミ（Juglans spp.）、クリ科クリ属のクリ（Castanea spp.）、ブナ科ブナ属のビーチナッツ（Fagus spp.）、ブナ科シイ属のシイ（Castanopsis spp.）、ブナ科コナラ属のドングリ（Quercus spp.）、カバノキ科ハシバミ属のヘーゼルナッツ（Corylus spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。ヒッコリーナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。 When developing a PCR primer set for detecting hickory nuts, the target species to be detected is set to hickory nuts (Carya spp.), And the species of hickory nuts and related species are set. Walnut (Juglans spp.), Chestnut chestnut (Castanea spp.), Fagaceae beech beach nut (Fagus spp.), Fagaceae lintel (Castanopsis spp.) The nucleotide sequences of the ITS regions of the acorns of Quercus spp. And the hazelnuts of Corylus spp. A nucleotide sequence region specific to hickory nut was selected, and a PCR primer set was newly designed from the nucleotide sequence region. At this time, the nucleotide sequence was hybridized with the nucleotide sequence region of the species to be detected under a stringent condition, but was invented and designed so as not to hybridize to the species not to be detected.
また、ライチ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をライチ（ムクロジ目ムクロジ科レイシ属レイシ（Litchi chinensis））に設定し、ライチとその近縁種である同科ランブータン属のランブータン（Nephelium lappaceum）のITS領域の塩基配列を比較した。ライチに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。 When developing a PCR primer set for detecting litchi, the target species to be detected is lychee (Litchi chinensis), and lychee and its closely related rambutan The nucleotide sequences of the ITS region of the genus Rambutan (Nephelium lappaceum) were compared. A litchi-specific nucleotide sequence region was selected, and a PCR primer set was newly designed from the nucleotide sequence region. At this time, the nucleotide sequence was hybridized with the nucleotide sequence region of the species to be detected under a stringent condition, but was invented and designed so as not to hybridize to the species not to be detected.
また、マカダミアナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をマカダミアナッツ（ヤマモガシ目ヤマモガシ科マカダミア属（Macadamia spp.））に設定し、マカダミアナッツと、その近縁種である同目ハス科ハス属のレンコン（Nelumbo nucifera）のITS領域の塩基配列を比較した。マカダミアナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。 When developing a PCR primer set for detecting macadamia nuts, the species to be detected is set to macadamia nuts (Macadamia spp.), Which are macadamia nuts and related species. The nucleotide sequence of the ITS region of the lotus root lotus (Nelumbo nucifera) of the same order Lotus family was compared. A base sequence region specific to macadamia nut was selected, and a PCR primer set was newly designed from the base sequence region. At this time, the nucleotide sequence was hybridized with the nucleotide sequence region of the species to be detected under a stringent condition, but was invented and designed so as not to hybridize to the species not to be detected.
また、ピーカンナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をピーカンナッツ（ブナ目クルミ科ペカン属ペカン（Carya illinoinensis））に設定した。ピーカンナッツは前述のヒッコリーナッツ（ペカン属）の一種であるが、ヒッコリーナッツの中で最も多く市場に流通していることから、ピーカンナッツをその他のヒッコリーナッツと識別する必要があると考えた。ピーカンナッツと、その近縁種である同属のヒッコリーナッツ（Carya ovata、Carya laciniosa）、同目クルミ科クルミ属のクルミ（Juglans spp.）、クリ科クリ属のクリ（Castanea spp.）、ブナ科ブナ属のビーチナッツ（Fagus spp.）、ブナ科シイ属のシイ（Castanopsis spp.）、ブナ科コナラ属のドングリ（Quercus spp.）、カバノキ科ハシバミ属のヘーゼルナッツ（Corylus spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。ITS領域の塩基配列は近縁種との相同性が高く、ピーカンナッツ特異的な塩基配列を選出することは難しかったが、多重並列配列図を詳細に比較検討したところ、ピーカンナッツに特異的な塩基配列領域を選出することができ、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。 In the development of a PCR primer set for detecting pecan nuts, the species to be detected was set to pecan nuts (Carya illinoinensis). Pecan nuts are a kind of the above-mentioned hickory nuts (pecan genus), but since they are the most abundant in the market among hickory nuts, it was thought that pecan nuts need to be distinguished from other hickory nuts. Pecan nuts and their closely related species, hickory nuts of the same genus (Carya ovata, Carya laciniosa), walnuts of the same family, walnuts of the genus Walnut (Juglans spp.), Chestnuts of the genus Chestnut (Castanea spp.), Beech family Beech nuts (Fagus spp.), Fagaceae lintels (Castanopsis spp.), Fagaceae Quercus acorns (Quercus spp.), Birch family Hazelnut hazelnuts (Corylus spp.) The nucleotide sequences were compared. The nucleotide sequence of the ITS region has high homology to closely related species, and it was difficult to select a pecan nut-specific nucleotide sequence. A nucleotide sequence region could be selected, and a PCR primer set was newly designed from the nucleotide sequence region. At this time, the nucleotide sequence was hybridized with the nucleotide sequence region of the species to be detected under a stringent condition, but was invented and designed so as not to hybridize to the species not to be detected.
また、松の実検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種を松の実（マツ目マツ科マツ属（Pinus spp.））に設定し、松の実と、その他裸子植物のITS領域の塩基配列を比較した。松の実に特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。 When developing a PCR primer set for detecting pine nuts, the target species was set to pine nuts (Pinus spp.), And pine nuts and other gymnosperms Of the ITS region were compared. A nucleotide sequence region specific to pine nuts was selected, and a PCR primer set was newly designed from the nucleotide sequence region. At this time, the nucleotide sequence was hybridized with the nucleotide sequence region of the species to be detected under a stringent condition, but was invented and designed so as not to hybridize to the species not to be detected.
また、ピリナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をピリナッツ（ムクロジ目カンラン科カンラン属ピリナッツ（Canarium ovatum））に設定し、ピリナッツと、その近縁種である同目ウルシ科カシューナットノキ属のカシューナッツ（Anacardium occidentale）、ウルシ科カイノキ属のピスタチオ（Pistacia vera）、ウルシ科マンゴー属のマンゴー（Mangifera indica）、ウルシ科サンショウモドキ属のピンクペッパー（Schinus molle）、ムクロジ科レイシ属のライチ（Litchi chinensis）、ムクロジ科ランブータン属のランブータン（Nephelium lappaceum）、ミカン科ミカン属のオレンジ（Citrus sinensis）のITS領域の塩基配列を比較した。ピリナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。 In developing a PCR primer set for detecting pili nuts, the target species to be detected was set to piri nut (Canarium ovatum), and the pili nut and its closely related species, urushi Cashew nut (Anacardium occidentale) of the family Cashew nutraceae, Pistachio (Pistacia vera) of the genus Poaceae, Mangifera indica of the mango genus Poaceae, Pink pepper (Schinus molle) of the genus Poaceae, The nucleotide sequences of the ITS regions of litchi (Litchi chinensis), rambutan (Nephelium lappaceum) of the genus Rambutan, and orange (Citrus sinensis) of the citrus family Rutaceae were compared. A nucleotide sequence region specific to pili nut was selected, and a PCR primer set was newly designed from the nucleotide sequence region. At this time, the nucleotide sequence was hybridized with the nucleotide sequence region of the species to be detected under a stringent condition, but was invented and designed so as not to hybridize to the species not to be detected.
また、ピスタチオ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をピスタチオ（ムクロジ目ウルシ科カイノキ属ピスタチオ（Pistacia vera））に設定し、ピスタチオと、その近縁種である同科カシューナットノキ属のカシューナッツ（Anacardium occidentale）、マンゴー属のマンゴー（Mangifera indica）、サンショウモドキ属のピンクペッパー（Schinus molle）のITS領域の塩基配列を比較した。ピスタチオに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。 When developing a PCR primer set for detecting pistachios, the species to be detected was set to pistachio (Pistachia vera), and the pistachios and their close relatives, cashew nuts The nucleotide sequences of the ITS regions of the genus cashew nut (Anacardium occidentale), the mango genus mango (Mangifera indica), and the gingerbread genus Pink pepper (Schinus molle) were compared. A base sequence region specific to pistachio was selected, and a PCR primer set was newly designed from the base sequence region. At this time, the nucleotide sequence was hybridized with the nucleotide sequence region of the species to be detected under a stringent condition, but was invented and designed so as not to hybridize to the species not to be detected.
また、シアナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をシアナッツ（ツツジ目アカテツ科シアーバターノキ属シアーバターノキ（Vitellaria paradoxa））に設定し、近縁種である同科フルクリコ属のミラクルフルーツ（Synsepalum dulcificum）、同目サガリバナ科ブラジルナッツノキ属のブラジルナッツ（Bertholletia excelsa）、カキノキ科カキノキ属のカキ（Diospyros kaki）、カキノキ科ツバキ属の茶（Camellia sinensis）、マタタビ科マタタビ属のキウイフルーツ（Actinidia deliciosa）、ツツジ科スノキ属のブルーベリー（Vaccinium spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。シアナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。 When developing a PCR primer set for the detection of shea nuts, the target species to be detected was set to shea nuts (Ericaceae: Asteraceae, Shea butter tree genus Shea butter tree (Vitellaria paradoxa)), and a closely related species, Frucrico Miracle fruit of the genus (Synsepalum dulcificum), same species Sagaribana (Bertholletia excelsa), Brassica nut (Bertholletia excelsa), oyster family (Diospyros kaki), oyster family camellia (Camellia sinensis), and red snapper The nucleotide sequences of the ITS regions of the genus Kiwifruit (Actinidia deliciosa) and the blueberry (Vaccinium spp.) Of the genus Rhododendron were compared. A base sequence region specific to shea nut was selected, and a PCR primer set was newly designed from the base sequence region. At this time, the nucleotide sequence was hybridized with the nucleotide sequence region of the species to be detected under a stringent condition, but was invented and designed so as not to hybridize to the species not to be detected.
また、クルミ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をクルミ（ブナ目クルミ科クルミ属（Juglans spp.））に設定した。バターナッツ（Juglans cinerea）もクルミ属の一種であるため、検出対象とした。クルミと、その近縁種である同科ペカン属のヒッコリーナッツ（Carya ovata、Carya laciniosa）、ピーカンナッツ（Carya illinoinensis）、同目クリ科クリ属のクリ（Castanea spp.）、ブナ科ブナ属のビーチナッツ（Fagus spp.）、ブナ科シイ属のシイ（Castanopsis spp.）、ブナ科コナラ属のドングリ（Quercus spp.）、カバノキ科ハシバミ属のヘーゼルナッツ（Corylus spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。クルミに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。 When developing a PCR primer set for detecting walnuts, the species to be detected was set to walnut (Juglans spp.). Butternut (Juglans cinerea) was also detected because it is a member of the genus Walnut. Walnuts and their closely related species, pecans, hickory nuts (Carya ovata, Carya laciniosa), pecan nuts (Carya illinoinensis), chestnuts belonging to the same family of chestnuts (Castanea spp.), The nucleotide sequence of the ITS region of beech nut (Fagus spp.), Beech family locust (Castanopsis spp.), Beech family Quercus acorn (Quercus spp.), And birch family Hazelnut hazelnut (Corylus spp.) Compared. A nucleotide sequence region specific to walnut was selected, and a PCR primer set was newly designed from the nucleotide sequence region. At this time, the nucleotide sequence was hybridized with the nucleotide sequence region of the species to be detected under a stringent condition, but was invented and designed so as not to hybridize to the species not to be detected.
なお、センスプライマーとアンチセンスプライマーのハイブリダイズや、個々のプライマー自身によるハイブリダイズを生じないように、すなわち、いわゆるプライマーダイマーの形成を極力回避するような工夫を施して、各々のプライマーを設計した。例えば、プライマーダイマーの形成を回避させるために、プライマーの検出特異性及び検出感度の低下を導かないような塩基置換をプライマーに施している。アーモンド検出用プライマーのセンスプライマーである配列番号1における塩基番号3及び4の塩基は、本来、Aであるが、センスプライマー自身によるプライマーダイマーの形成を回避するために、プライマーの検出特異性及び検出感度の低下を導かないような塩基置換として、Aの代わりにTを採用している。同様に、配列番号10における塩基番号8の塩基をCからAに、配列番号15における塩基番号6の塩基をGからAに、配列番号21における塩基番号3の塩基をCからAに、配列番号24における塩基番号4の塩基をCからAに、塩基番号7の塩基をAからTに置換している。
Each primer was designed so as not to cause hybridization between the sense primer and the antisense primer, or to cause hybridization by individual primers themselves, that is, to avoid formation of a so-called primer dimer as much as possible. . For example, in order to avoid the formation of a primer dimer, the primer is subjected to a base substitution so as not to lower the detection specificity and the detection sensitivity of the primer. The bases of
さらに、上記17種のプライマーセットによるPCR反応条件を同一にするため、PCR反応において、その反応条件を最も左右するアニーリング条件（アニーリング温度、アニーリング時間）が同一になるよう各PCRプライマーを設計した。複数種のPCRプライマーのアニーリング条件を同一にすることは非常に困難であったが、PCRプライマーの塩基数、プライマー自身の塩基配列を詳細に検討することにより、各々の検出特異性を損なうことなく、アニーリング条件が同一となるよう設計した。 Furthermore, in order to make the PCR reaction conditions using the above 17 kinds of primer sets the same, the PCR primers were designed so that the annealing conditions (annealing temperature, annealing time) which most influenced the reaction conditions in the PCR reaction were the same. It was very difficult to make the annealing conditions of multiple types of PCR primers the same, but by carefully examining the number of bases of the PCR primers and the base sequence of the primers themselves, without impairing the specificity of each detection And the annealing conditions were designed to be the same.
本発明が提供するプライマーの塩基配列について網羅的に述べてきたが、理論上は首尾よく設計されたプライマーであっても、意図する性能（検出特異性等）を保有しえないプライマーが設計される場合がある。例えば、本発明の研究段階において、配列番号６９と配列番号７０とからなるピーカンナッツ検出用PCRプライマーセットを用いたPCRでは、ピーカンナッツに特有の塩基配列を用いたにも関わらず、ピーカンナッツDNAだけでなく、ヒッコリーナッツ（オーバータヒッコリー）DNAも検出し、意図した検出特異性を示さなかった。このように、単に論理的にプライマーを設計すれば、意図する性能（検出特異性等）を取得できるとは限らず、必要な性能を保有しない場合も生じうるために、その設計の際には、論理的設計だけでなく、さらなる工夫とその性能評価試験が重要となる。本発明が提供するプライマーは、論理的設計の上に、さらなる工夫を施して設計したものであり、最終的には性能評価試験をクリアーしたものである。 Although the nucleotide sequences of the primers provided by the present invention have been comprehensively described, theoretically, even if the primers are designed successfully, primers that do not possess the intended performance (detection specificity, etc.) may be designed. In some cases. For example, in the research stage of the present invention, in the PCR using the pecan nut detection PCR primer set consisting of SEQ ID NO: 69 and SEQ ID NO: 70, despite using a pecan nut-specific nucleotide sequence, pecan nut DNA In addition, hickory nut (overta hickory) DNA was detected and did not show the intended detection specificity. Thus, simply designing primers logically does not always result in obtaining the intended performance (detection specificity, etc.), and may not always have the required performance. In addition to logical design, further innovations and performance evaluation tests are important. The primer provided by the present invention has been designed by further devising it on a logical design, and has finally passed the performance evaluation test.
従って、本発明の木の実検出用PCRプライマーセットを用いたPCR法などの核酸分析の手法を用いて、各種食品中に含まれる木の実（アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、あるいはクルミ）由来DNAを高感度かつ特異的に、一斉に検出することができる。 Therefore, tree nuts (almonds, beach nuts, Brazil nuts, butter nuts, butternuts, cashew nuts, chestnuts, chestnuts, tin capin) contained in various foods can be obtained by using a nucleic acid analysis technique such as a PCR method using a PCR primer set for detecting tree nuts of the present invention. , Coconut, ginkgo, hazelnut, hickory nut, lychee, macadamia nut, pecan nut, pine nut, pili nut, pistachio, shea nut, or walnut) can be detected simultaneously with high sensitivity and specificity.
ここで、核酸分析とは、生物分類における、個々の種、属、あるいは、グループによって特徴的な塩基配列が存在することを利用して、その特徴的な塩基配列の有無を分析することによって、その生物の種、属、あるいは、グループを把握するために有効な手段であって、特定の微生物の検出や生物種の同定などに有用に用いられる方法である。 Here, the nucleic acid analysis, in the biological classification, individual species, genus, or utilizing the presence of a characteristic base sequence by group, by analyzing the presence or absence of the characteristic base sequence, This is an effective means for ascertaining the species, genus, or group of the organism, and is a method that is usefully used for detecting a specific microorganism, identifying a biological species, and the like.
本発明が提供するプライマーの塩基配列は以下のとおりである。
塩基番号 12345678901234567890123456789
配列番号１ （アーモンドS）AGTTCTAGTTTCAAAGCGGGGGC
配列番号２ （アーモンドAS） ACGACGGGCAACCGAGGTC
配列番号３ （ビーチナッツS）GCCTTTCGTCCCCAAACGGTC
配列番号４ （ビーチナッツAS）TGCCACGGTCGCTTCGAATG
配列番号５ （ブラジルナッツS）GACGAGTGGTGGATCACGACACG
配列番号６ （ブラジルナッツAS）TCGATGCCTTGCCGCTTCG
配列番号７ （カシューナッツS）TGGCGTTCGGAACGAACCCG
配列番号８ （カシューナッツAS）GCGATGCGGGCGGGCATAG
配列番号９ （クリS）GGAACGCGCCAAGGAAATCA
配列番号１０（クリAS）TCCGCCCAGCCCCGAACC
配列番号１１（ココナッツS）GACGCTCCGCCCCCTCGA
配列番号１２（ココナッツAS) GTGCGGCACGCACCTGGG
配列番号１３（銀杏S）GGTGCTCACTCCCCAGTCAGG
配列番号１４（銀杏AS) CATCTAGCATTTTGATCCTAACCACGG
配列番号１５（ヘーゼルナッツS）ATGCCAGGGGCGAATCTTGTG
配列番号１６（ヘーゼルナッツAS) GCTACAGGGTCACAGAGCACAAGAC
配列番号１７（ヒッコリーナッツS）TGGGAGGGCACGATGAAAGC
配列番号１８（ヒッコリーナッツAS）CGACGCAATAGGGTCGAGGAGAG
配列番号１９（ライチS）GAGGCGTGGGGATGCGTTATC
配列番号２０（ライチAS）CGAGAGCCTTACGCCGACCG
配列番号２１（マカダミアナッツS）GCACCCCGTGTCTCTGTTCG
配列番号２２（マカダミアナッツAS）CGATGTCCGAACAATGGCAAAG
配列番号２３（ピーカンナッツS）ACGGTTGGGAGGGCACGA
配列番号２４（ピーカンナッツAS）TGTAGTTGCGCTCGTCGCCC
配列番号２５（松の実S）CAGGCGATGTTTCGTGGCG
配列番号２６（松の実AS）CCCTACCCAATGGGAGGACAAG
配列番号２７（ピリナッツS） TGGTCGTAACGAACCTCGGTGC
配列番号２８（ピリナッツAS）CGTCACGGCGGCGCTTTC
配列番号２９（ピスタチオS） GGTGTCGGTCGTATGCTTCTGCAT
配列番号３０（ピスタチオAS）GTCGTTATTGATAATGAAAGAAGGCTACC
配列番号３１（シアナッツS） GCGTTGCCTCGGCTAAAAACTC
配列番号３２（シアナッツAS）GCGGTCAAGGCTCCGCAA
配列番号３３（クルミS） GGTTGGGAGGGCACGTTGAG
配列番号３４（クルミAS）CGACGGGTCACGAGGGTTTC
また、本発明が提供する３０塩基のＤＮＡからなるプライマーとしては、例えば以下の塩
基配列のものを上げることができる。
配列番号３５（アーモンドS） cgacccgAGTTCTAGTTTCAAAGCGGGGGC
配列番号３６（アーモンドAS）gacgaacgcacACGACGGGCAACCGAGGTC
配列番号３７（ビーチナッツS）ggcttcgcgGCCTTTCGTCCCCAAACGGTC
配列番号３８（ビーチナッツAS）cggacgaggtTGCCACGGTCGCTTCGAATG
配列番号３９（ブラジルナッツS）acggcacGACGAGTGGTGGATCACGACACG
配列番号４０（ブラジルナッツAS）tggggtcgcggTCGATGCCTTGCCGCTTCG
配列番号４１（カシューナッツS）cgacggtcggTGGCGTTCGGAACGAACCCG
配列番号４２（カシューナッツAS）ggggtcgcgacGCGATGCGGGCGGGCATAG
配列番号４３（クリS） accccggcgcGGAACGCGCCAAGGAAATCA
配列番号４４（クリAS） gggaggccaactTCCGCCCAGCCCCGAACC
配列番号４５（ココナッツS） atcatgccaagcGACGCTCCGCCCCCTCGA
配列番号４６（ココナッツAS）ccgatggctgggGTGCGGCACGCACCTGGG
配列番号４７（銀杏S） gctctgaagGGTGCTCACTCCCCAGTCAGG
配列番号４８（銀杏AS） aatCATCTAGCATTTTGATCCTAACCACGG
配列番号４９（ヘーゼルナッツS）acggcgtgcATGCCAGGGGCGAATCTTGTG
配列番号５０（ヘーゼルナッツAS）gcgcaGCTACAGGGTCACAGAGCACAAGAC
配列番号５１（ヒッコリーナッツS）caaaaacggtTGGGAGGGCACGATGAAAGC
配列番号５２（ヒッコリーナッツAS）gcaagaaCGACGCAATAGGGTCGAGGAGAG
配列番号５３（ライチS） gcctcggacGAGGCGTGGGGATGCGTTATC
配列番号５４（ライチAS）gcttcagggtCGAGAGCCTTACGCCGACCG
配列番号５５（マカダミアナッツS）gcgaagattgGCACCCCGTGTCTCTGTTCG
配列番号５６（マカダミアナッツAS）cacgcacaCGATGTCCGAACAATGGCAAAG
配列番号５７（ピーカンナッツS）cccctcccaaaaACGGTTGGGAGGGCACGA
配列番号５８（ピーカンナッツAS）cgggaggccaTGTAGTTGCGCTCGTCGCCC
配列番号５９（松の実S） ctgaaatgtggCAGGCGATGTTTCGTGGCG
配列番号６０（松の実AS）taaatccgCCCTACCCAATGGGAGGACAAG
配列番号６１（ピリナッツS） accttcggTGGTCGTAACGAACCTCGGTGC
配列番号６２（ピリナッツAS）gtgcgggcgccgCGTCACGGCGGCGCTTTC
配列番号６３（ピスタチオS） tcgtcgGGTGTCGGTCGTATGCTTCTGCAT
配列番号６４（ピスタチオAS）aGTCGTTATTGATAATGAAAGAAGGCTACC
配列番号６５（シアナッツS） cctgaattGCGTTGCCTCGGCTAAAAACTC
配列番号６６（シアナッツAS）tgacctggggtcGCGGTCAAGGCTCCGCAA
配列番号６７（クルミS） cccaaaaaacGGTTGGGAGGGCACGTTGAG
配列番号６８（クルミAS）gggcaacacaCGACGGGTCACGAGGGTTTC
The nucleotide sequences of the primers provided by the present invention are as follows.
Base number 12345678901234567890123456789
SEQ ID NO: 1 (Almond S) AGTTCTAGTTTCAAAGCGGGGGC
Sequence number 2 (almond AS) ACGACGGGCAACCGAGGTC
SEQ ID NO: 3 (beach nut S) GCCTTTCGTCCCCAAACGGTC
SEQ ID NO: 4 (beach nut AS) TGCCACGGTCGCTTCGAATG
SEQ ID NO: 5 (Brazil nut S) GACGAGTGGTGGATCACGACACG
SEQ ID NO: 6 (Brazil nut AS) TCGATGCCTTGCCGCTTCG
SEQ ID NO: 7 (Cashew nut S) TGGCGTTCGGAACGAACCCG
SEQ ID NO: 8 (Cashew nut AS) GCGATGCGGGCGGGCATAG
SEQ ID NO: 9 (Chrysanthemum S) GGAACGCGCCAAGGAAATCA
SEQ ID NO: 10 (Chrysanthemum AS) TCCGCCCAGCCCCGAACC
SEQ ID NO: 11 (coconut S) GACGCTCCGCCCCCTCGA
SEQ ID NO: 12 (coconut AS) GTGCGGCACGCACCTGGG
SEQ ID NO: 13 (Ginkgo S) GGTGCTCACTCCCCAGTCAGG
SEQ ID NO: 14 (Gingko AS) CATCTAGCATTTTGATCCTAACCACGG
SEQ ID NO: 15 (hazelnut S) ATGCCAGGGGCGAATCTTGTG
Sequence number 16 (hazelnut AS) GCTACAGGGTCACAGAGCACAAGAC
SEQ ID NO: 17 (hickory nut S) TGGGAGGGCACGATGAAAGC
SEQ ID NO: 18 (hickory nut AS) CGACGCAATAGGGTCGAGGAGAG
SEQ ID NO: 19 (Lyche S) GAGGCGTGGGGATGCGTTATC
SEQ ID NO: 20 (Litchi AS) CGAGAGCCTTACGCCGACCG
SEQ ID NO: 21 (Macadamia nut S) GCACCCCGTGTCTCTGTTCG
SEQ ID NO: 22 (Macadamia nut AS) CGATGTCCGAACAATGGCAAAG
SEQ ID NO: 23 (pecan nut S) ACGGTTGGGAGGGCACGA
SEQ ID NO: 24 (pecan nut AS) TGTAGTTGCGCTCGTCGCCC
SEQ ID NO: 25 (pine nut S) CAGGCGATGTTTCGTGGCG
SEQ ID NO: 26 (pine nut AS) CCCTACCCAATGGGAGGACAAG
SEQ ID NO: 27 (Pilinut S) TGGTCGTAACGAACCTCGGTGC
SEQ ID NO: 28 (pyri nut AS) CGTCACGGCGGCGCTTTC
SEQ ID NO: 29 (pistachio S) GGTGTCGGTCGTATGCTTCTGCAT
SEQ ID NO: 30 (pistachio AS) GTCGTTATTGATAATGAAAGAAGGCTACC
SEQ ID NO: 31 (Sianut S) GCGTTGCCTCGGCTAAAAACTC
SEQ ID NO: 32 (Sheanuts AS) GCGGTCAAGGCTCCGCAA
Sequence number 33 (walnut S) GGTTGGGAGGGCACGTTGAG
SEQ ID NO: 34 (walnut AS) CGACGGGTCACGAGGGTTTC
Further, as the primer comprising 30 bases of DNA provided by the present invention, for example, those having the following base sequences can be used.
SEQ ID NO: 35 (almond S) cgacccgAGTTCTAGTTTCAAAGCGGGGGC
SEQ ID NO: 36 (almond AS) gacgaacgcacACGACGGGCAACCGAGGTC
SEQ ID NO: 37 (beach nut S) ggcttcgcgGCCTTTCGTCCCCAAACGGTC
SEQ ID NO: 38 (beach nut AS) cggacgaggtTGCCACGGTCGCTTCGAATG
SEQ ID NO: 39 (Brazil nut S) acggcacGACGAGTGGTGGATCACGACACG
SEQ ID NO: 40 (Brazil nut AS) tggggtcgcggTCGATGCCTTGCCGCTTCG
SEQ ID NO: 41 (cashew nut S) cgacggtcggTGGCGTTCGGAACGAACCCG
SEQ ID NO: 42 (cashew nut AS) ggggtcgcgacGCGATGCGGGCGGGCATAG
SEQ ID NO: 43 (chrysanthemum S) accccggcgcGGAACGCGCCAAGGAAATCA
SEQ ID NO: 44 (chrysanthemum AS) gggaggccaactTCCGCCCAGCCCCGAACC
SEQ ID NO: 45 (coconut S) atcatgccaagcGACGCTCCGCCCCCTCGA
SEQ ID NO: 46 (coconut AS) ccgatggctgggGTGCGGCACGCACCTGGG
SEQ ID NO: 47 (Ginkgo S) gctctgaagGGTGCTCACTCCCCAGTCAGG
SEQ ID NO: 48 (gingko AS) aatCATCTAGCATTTTGATCCTAACCACGG
SEQ ID NO: 49 (hazelnut S) acggcgtgcATGCCAGGGGCGAATCTTGTG
SEQ ID NO: 50 (hazelnut AS) gcgcaGCTACAGGGTCACAGAGCACAAGAC
SEQ ID NO: 51 (hickory nut S) caaaaacggtTGGGAGGGCACGATGAAAGC
SEQ ID NO: 52 (hickory nut AS) gcaagaaCGACGCAATAGGGTCGAGGAGAG
SEQ ID NO: 53 (Lyche S) gcctcggacGAGGCGTGGGGATGCGTTATC
SEQ ID NO: 54 (Lyche AS) gcttcagggtCGAGAGCCTTACGCCGACCG
SEQ ID NO: 55 (macadamia nut S) gcgaagattgGCACCCCGTGTCTCTGTTCG
SEQ ID NO: 56 (macadamia nut AS) cacgcacaCGATGTCCGAACAATGGCAAAG
SEQ ID NO: 57 (pecan nut S) ccccccccaaaaACGGTTGGGAGGGCACGA
SEQ ID NO: 58 (pecan nut AS) cgggaggccaTGTAGTTGCGCTCGTCGCCC
SEQ ID NO: 59 (pine nut S) ctgaaatgtggCAGGCGATGTTTCGTGGCG
SEQ ID NO: 60 (pine nut AS) taaatccgCCCTACCCAATGGGAGGACAAG
SEQ ID NO: 61 (pyri nut S) accttcggTGGTCGTAACGAACCTCGGTGC
SEQ ID NO: 62 (pyri nut AS) gtgcgggcgccgCGTCACGGCGGCGCTTTC
SEQ ID NO: 63 (pistachio S) tcgtcgGGTGTCGGTCGTATGCTTCTGCAT
SEQ ID NO: 64 (pistachio AS) aGTCGTTATTGATAATGAAAGAAGGCTACC
SEQ ID NO: 65 (Cia nut S) cctgaattGCGTTGCCTCGGCTAAAAACTC
SEQ ID NO: 66 (Shear nut AS) tgacctggggtcGCGGTCAAGGCTCCGCAA
SEQ ID NO: 67 (walnut S) cccaaaaaacGGTTGGGAGGGCACGTTGAG
SEQ ID NO: 68 (walnut AS) gggcaacacaCGACGGGTCACGAGGGTTTC
本発明の研究段階において、意図した検出特異性を示さなかったプライマーの塩基配列は、以下の通りである。
配列番号６９（ピーカンナッツS） CCCCAACACCTCGTATGATGTGTA
配列番号７０（ピーカンナッツAS）TGTAGTTGCGCTCGTCGCCC
（ Sはセンスプライマーを表し、ASはアンチセンスプライマーを表す。）
The base sequences of the primers that did not exhibit the intended detection specificity in the research stage of the present invention are as follows.
SEQ ID NO: 69 (pecan nut S) CCCCAACACCTCGTATGATGTGTA
SEQ ID NO: 70 (pecan nut AS) TGTAGTTGCGCTCGTCGCCC
(S represents a sense primer, AS represents an antisense primer.)
本発明は、第1のプライマーセットとして、配列表の配列番号1における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号2における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、アーモンド検出用に好適に使用できる。
The present invention provides, as a first primer set, a PCR primer consisting of a DNA having a minimum length of 15 and a maximum of 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of nucleotide numbers 9 to 23 in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing at the 3 'end side as a sense primer, We propose a primer set using a PCR primer consisting of a DNA of a minimum of 15 and a maximum of 30 bases containing the base sequence of
本発明は、第2のプライマーセットとして、配列表の配列番号3における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号4における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ビーチナッツ検出用に好適に使用できる。
The present invention provides, as a second primer set, a PCR primer consisting of a DNA having a minimum of 15 and a maximum of 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of
本発明は、第3のプライマーセットとして、配列表の配列番号5における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号6における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ブラジルナッツ検出用に好適に使用できる。
The present invention provides, as a third primer set, a PCR primer consisting of a DNA having a minimum of 15 nucleotides and a maximum of 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of nucleotide numbers 9 to 23 in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing at the 3 'end side, as a sense primer, We propose a primer set using a PCR primer consisting of a DNA of a minimum of 15 and a maximum of 30 bases containing the base sequence of
本発明は、第4のプライマーセットとして、配列表の配列番号7における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号8における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、カシューナッツ検出用に好適に使用できる。
The present invention provides, as a fourth primer set, a sense primer, a PCR primer consisting of a DNA of a minimum of 15 and a maximum of 30 bases including the base sequence of
本発明は、第5のプライマーセットとして、配列表の配列番号9における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号10における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、クリ検出用に好適に使用できる。
The present invention provides, as a fifth primer set, a PCR primer consisting of a DNA having a minimum of 15 nucleotides and a maximum of 30 nucleotides including the nucleotide sequence of
本発明は、第6のプライマーセットとして、配列表の配列番号11における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号12における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ココナッツ検出用に好適に使用できる。
The present invention provides, as a sixth primer set, a PCR primer consisting of a DNA having a minimum of 15 and a maximum of 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of
本発明は、第7のプライマーセットとして、配列表の配列番号13における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号14における塩基番号13〜27の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、銀杏検出用に好適に使用できる。
The present invention provides, as a seventh primer set, a PCR primer consisting of a DNA having a minimum of 15 nucleotides and a maximum of 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of
本発明は、第8のプライマーセットとして、配列表の配列番号15における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号16における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ヘーゼルナッツ検出用に好適に使用できる。
The present invention provides, as an eighth primer set, a PCR primer consisting of a DNA having a minimum of 15 and a maximum of 30 bases including the base sequence of
本発明は、第9のプライマーセットとして、配列表の配列番号17における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号18における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ヒッコリーナッツ検出用に好適に使用できる。
The present invention provides, as a ninth primer set, a PCR primer consisting of a DNA having a minimum of 15 nucleotides and a maximum of 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of
本発明は、第10のプライマーセットとして、配列表の配列番号19における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号20における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ライチ検出用に好適に使用できる。
The present invention provides, as a tenth primer set, a PCR primer consisting of a DNA having a minimum of 15 and a maximum of 30 bases including the base sequence of
本発明は、第11のプライマーセットとして、配列表の配列番号21における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号22における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、マカダミアナッツ検出用に好適に使用できる。
The present invention provides, as an eleventh primer set, a PCR primer consisting of a DNA of a minimum of 15 and a maximum of 30 bases including the base sequence of
本発明は、第12のプライマーセットとして、配列表の配列番号23における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号24における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ピーカンナッツ検出用に好適に使用できる。
The present invention provides, as a twelfth primer set, a PCR primer consisting of a DNA having a minimum of 15 nucleotides and a maximum of 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of
本発明は、第13のプライマーセットとして、配列表の配列番号25における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号26における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、松の実検出用に好適に使用できる。
The present invention provides, as a thirteenth primer set, a PCR primer consisting of a DNA of a minimum of 15 and a maximum of 30 bases including the base sequence of
本発明は、第14のプライマーセットとして、配列表の配列番号27における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号28における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ピリナッツ検出用に好適に使用できる。
The present invention provides, as a fourteenth primer set, a PCR primer consisting of a DNA having a minimum of 15 and a maximum of 30 bases including the base sequence of
本発明は、第15のプライマーセットとして、配列表の配列番号29における塩基番号10〜24の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号30における塩基番号15〜29の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ピスタチオ検出用に好適に使用できる。 The present invention provides, as a fifteenth primer set, a PCR primer consisting of a DNA having a minimum of 15 and a maximum of 30 bases including the base sequence of base numbers 10 to 24 in SEQ ID NO: 29 in the sequence listing at the 3 ′ end side as a sense primer, We propose a primer set using a PCR primer consisting of a DNA of a minimum of 15 and a maximum of 30 bases containing the base sequence of base numbers 15 to 29 in SEQ ID NO: 30 on the 3 'end side in the column list as an antisense primer. This primer set can be suitably used for pistachio detection.
本発明は、第16のプライマーセットとして、配列表の配列番号31における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号32における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、シアナッツ検出用に好適に使用できる。
The present invention provides, as a sixteenth primer set, a PCR primer consisting of a DNA of a minimum of 15 and a maximum of 30 bases including the base sequence of
本発明は、第17のプライマーセットとして、配列表の配列番号33における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号34における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、クルミ検出用に好適に使用できる。
The present invention provides, as a seventeenth primer set, a PCR primer consisting of a DNA of a minimum of 15 and a maximum of 30 bases including the base sequence of
前記各プライマーにおいて、塩基配列の長さを15から30とするのは、PCR用プライマーとしての塩基配列の適切な長さが15〜30程度であること、また、3´末端側15個の塩基配列を特定するのは、3´末端側15個程度がPCRの特異的な増幅反応において重要であって、5´末端側の塩基配列が若干異なっていたり、配列の長さが多少違っていたりしても、PCRの反応自体への悪影響が、たいていの場合、小さいためである。 In each of the primers, the base sequence length of 15 to 30 is that the appropriate length of the base sequence as a primer for PCR is about 15 to 30, and 15 bases at the 3 'end It is important to specify the sequence that about 15 3'-ends are important in the specific amplification reaction of PCR, and that the base sequence at the 5'-end is slightly different or the sequence length is slightly different. Even so, the adverse effect on the PCR reaction itself is almost always small.
本発明においては、さらに、第1のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号1の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（1´）（最も好ましくは配列番号1の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号2の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（2´）（最も好ましくは配列番号2の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはアーモンド検出用に好適に使用でき、配列番号1のプライマーと配列番号2のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（1´）の具体例としては配列番号３５のプライマー、（2´）の具体例としては配列番号３６のプライマーを例示できる。 In the present invention, further, as a preferred embodiment of the first primer set, a PCR primer (1 ′) consisting of a DNA of up to 30 bases containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing at the 3 ′ end (most preferred) Is a primer consisting of a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as a sense primer, and a PCR primer (2 ') consisting of a DNA of up to 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 at the 3' end in the sequence listing (most preferable) Proposes a primer set using a primer comprising a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2) as an antisense primer. This primer set can be suitably used for almond detection, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 1 and the primer of SEQ ID NO: 2 in a set. In addition, as a specific example of (1 ′), a primer of SEQ ID NO: 35 can be exemplified, and as a specific example of (2 ′), a primer of SEQ ID NO: 36 can be exemplified.
本発明においては、さらに、第2のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号3の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（3´）（最も好ましくは配列番号3の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号4の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（4´）（最も好ましくは配列番号4の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはビーチナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号3のプライマーと配列番号4のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（3´）の具体例としては配列番号３７のプライマー、（4´）の具体例としては配列番号３８のプライマーを例示できる。 In the present invention, as a further preferred embodiment of the second primer set, a PCR primer (3 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing at the 3' end side (most preferred) Is a primer consisting of a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3) as a sense primer, and a PCR primer (4 ') consisting of a DNA of up to 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 at the 3' end in the sequence listing (most preferred) Proposes a primer set using a primer comprising a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4) as an antisense primer. This primer set can be suitably used for detection of beach nuts, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 3 and the primer of SEQ ID NO: 4 in a set. In addition, as a specific example of (3 ′), a primer of SEQ ID NO: 37 can be exemplified, and as a specific example of (4 ′), a primer of SEQ ID NO: 38 can be exemplified.
本発明においては、さらに、第3のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号5の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（5´）（最も好ましくは配列番号5の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号6の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（6´）（最も好ましくは配列番号6の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはブラジルナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号5のプライマーと配列番号6のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（5´）の具体例としては配列番号３９のプライマー、（6´）の具体例としては配列番号４０のプライマーを例示できる。 In the present invention, as a further preferred embodiment of the third primer set, a PCR primer (5 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing on the 3' end side (most preferred) Is a PCR primer (6 ') consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of SEQ ID NO: 6 on the 3' end side as a sense primer using a primer consisting of the DNA of the base sequence of SEQ ID NO: 5 (most preferable) Proposes a primer set using a primer comprising a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6) as an antisense primer. This primer set can be suitably used for detecting Brazil nuts, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 5 and the primer of SEQ ID NO: 6 in a set. In addition, as a specific example of (5 ′), a primer of SEQ ID NO: 39 can be exemplified, and as a specific example of (6 ′), a primer of SEQ ID NO: 40 can be exemplified.
本発明においては、さらに、第4のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号7の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（7´）（最も好ましくは配列番号7の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号8の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（8´）（最も好ましくは配列番号8の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはカシューナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号7のプライマーと配列番号8のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（7´）の具体例としては配列番号４１のプライマー、（8´）の具体例としては配列番号４２のプライマーを例示できる。 In the present invention, as a further preferred embodiment of the fourth primer set, a PCR primer (7 ') consisting of a DNA of up to 30 bases including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 in the sequence listing on the 3' end side (most preferable) Is a primer consisting of a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7) as a sense primer, and a PCR primer (8 ') consisting of a DNA of up to 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 at the 3' end in the sequence listing (most preferred) Proposes a primer set using a primer consisting of the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8) as an antisense primer. This primer set can be suitably used for detecting cashew nuts, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 7 and the primer of SEQ ID NO: 8 in a set. In addition, as a specific example of (7 '), the primer of SEQ ID NO: 41 can be exemplified, and as a specific example of (8'), a primer of SEQ ID NO: 42 can be exemplified.
本発明においては、さらに、第5のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号9の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（9´）（最も好ましくは配列番号9の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号10の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（10´）（最も好ましくは配列番号10の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはクリ検出用に好適に使用でき、配列番号9のプライマーと配列番号10のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（9´）の具体例としては配列番号４３のプライマー、（10´）の具体例としては配列番号４４のプライマーを例示できる。 In the present invention, as a further preferred embodiment of the fifth primer set, a PCR primer (9 ′) consisting of a DNA of up to 30 bases including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 in the sequence listing on the 3 ′ end side (most preferred) Is a primer consisting of a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9) as a sense primer, and a PCR primer (10 ') comprising a DNA of up to 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 at the 3' end in the sequence listing (most preferred) Proposes a primer set using a primer consisting of DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10) as an antisense primer. This primer set can be suitably used for chestnut detection, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 9 and the primer of SEQ ID NO: 10 in a set. In addition, as a specific example of (9 ′), a primer of SEQ ID NO: 43 can be exemplified, and as a specific example of (10 ′), a primer of SEQ ID NO: 44 can be exemplified.
本発明においては、さらに、第6のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表
の配列番号11の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（11´）（最も好ましくは配列番号11の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号12の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（12´）（最も好ましくは配列番号12の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはココナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号11のプライマーと配列番号12のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（11´）の具体例としては配列番号４５のプライマー、（12´）の具体例としては配列番号４６のプライマーを例示できる。
In the present invention, as a further preferred embodiment of the sixth primer set, a PCR primer (11 ′) consisting of a DNA of up to 30 bases containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 in the sequence listing on the 3 ′ end side (most preferred) Is a PCR primer (12 ') consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of SEQ ID NO: 12 on the 3' end side as a sense primer using a primer consisting of the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 11 (most preferable) Proposes a primer set using a primer consisting of the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12) as an antisense primer. This primer set can be suitably used for coconut detection, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 11 and the primer of SEQ ID NO: 12 in a set. In addition, as a specific example of (11 ′), a primer of SEQ ID NO: 45 can be exemplified, and as a specific example of (12 ′), a primer of SEQ ID NO: 46 can be exemplified.
本発明においては、さらに、第7のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表
の配列番号13の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（13´）（最も好ましくは配列番号13の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号14の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（14´）（最も好ましくは配列番号14の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは銀杏検出用に好適に使用でき、配列番号13のプライマーと配列番号14のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（13´）の具体例としては配列番号４７のプライマー、（14´）の具体例としては配列番号４８のプライマーを例示できる。
In the present invention, as a further preferred embodiment of the seventh primer set, a PCR primer (13 ') consisting of a DNA of up to 30 bases including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 in the sequence listing at the 3' end side (most preferable) Is a primer consisting of a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 as a sense primer, and a PCR primer (14 ') consisting of a DNA of up to 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 at the 3' end in the sequence listing (most preferable) Proposes a primer set using a primer consisting of DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14) as an antisense primer. This primer set can be suitably used for ginkgo detection, and the primer of SEQ ID NO: 13 and the primer of SEQ ID NO: 14 are most preferably used as a set. In addition, as a specific example of (13 ′), the primer of SEQ ID NO: 47 can be exemplified, and as a specific example of (14 ′), a primer of SEQ ID NO: 48 can be exemplified.
本発明においては、さらに、第8のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号15の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（15´）（最も好ましくは配列番号15の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号16の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（16´）（最も好ましくは配列番号16の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはヘーゼルナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号15のプライマーと配列番号16のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（15´）の具体例としては配列番号４９のプライマー、（16´）の具体例としては配列番号５０のプライマーを例示できる。 In the present invention, further, as a preferred embodiment of the eighth primer set, a PCR primer (15 ′) consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of SEQ ID NO: 15 in the sequence listing on the 3 ′ end side (most preferable) Is a PCR primer (16 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 16 on the 3' end side as a sense primer using a primer consisting of the DNA of the base sequence of SEQ ID NO: 15 (most preferable) Proposes a primer set using a primer comprising a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16) as an antisense primer. This primer set can be suitably used for detecting hazelnut, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 15 and the primer of SEQ ID NO: 16 in a set. In addition, as a specific example of (15 ′), the primer of SEQ ID NO: 49 can be exemplified, and as a specific example of (16 ′), a primer of SEQ ID NO: 50 can be exemplified.
本発明においては、さらに、第9のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号17の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（17´）（最も好ましくは配列番号17の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（18´）（最も好ましくは配列番号18の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはヒッコリーナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号17のプライマーと配列番号18のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（17´）の具体例としては配列番号５１のプライマー、（18´）の具体例としては配列番号５２のプライマーを例示できる。 In the present invention, further, as a preferred embodiment of the ninth primer set, a PCR primer (17 ′) consisting of a DNA of up to 30 bases including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 in the sequence listing at the 3 ′ end side (most preferred) Is a primer consisting of a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 as a sense primer, and a PCR primer (18 ') comprising a DNA of up to 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 in the sequence listing at the 3' end (most preferable) Proposes a primer set using a primer consisting of DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18) as an antisense primer. This primer set can be suitably used for detecting hickory nuts, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 17 and the primer of SEQ ID NO: 18 in a set. In addition, as a specific example of (17 '), the primer of SEQ ID NO: 51 can be exemplified, and as a specific example of (18'), a primer of SEQ ID NO: 52 can be exemplified.
本発明においては、さらに、第10のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（19´）（最も好ましくは配列番号19の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（20´）（最も好ましくは配列番号20の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはライチ検出用に好適に使用でき、配列番号19のプライマーと配列番号20のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（19´）の具体例としては配列番号５３のプライマー、（20´）の具体例としては配列番号５４のプライマーを例示できる。 In the present invention, as a further preferred embodiment of the tenth primer set, a PCR primer (19 ′) consisting of a DNA of up to 30 bases containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 on the 3 ′ end side in the sequence listing (most preferred) Is a primer consisting of a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19) as a sense primer, and a PCR primer (20 ') consisting of a DNA of up to 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20 at the 3' end in the sequence listing (most preferred) Proposes a primer set using a primer comprising a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20) as an antisense primer. This primer set can be suitably used for lychee detection, and the primer of SEQ ID NO: 19 and the primer of SEQ ID NO: 20 are most preferably used as a set. In addition, as a specific example of (19 '), a primer of SEQ ID NO: 53 can be exemplified, and as a specific example of (20'), a primer of SEQ ID NO: 54 can be exemplified.
本発明においては、さらに、第11のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（21´）（最も好ましくは配列番号21の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（22´）（最も好ましくは配列番号22の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはマカダミアナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号21のプライマーと配列番号22のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（21´）の具体例としては配列番号５５のプライマー、（22´）の具体例としては配列番号５６のプライマーを例示できる。 In the present invention, as a further preferred embodiment of the eleventh primer set, a PCR primer (21 ′) consisting of a DNA of up to 30 bases containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 on the 3 ′ end side in the sequence listing (most preferred) Is a primer consisting of a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21) as a sense primer, and a PCR primer (22 ') consisting of a DNA having a maximum of 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22 at the 3' end in the sequence listing (most preferable) Proposes a primer set using a primer comprising a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22) as an antisense primer. This primer set can be suitably used for detecting macadamia nuts, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 21 and the primer of SEQ ID NO: 22 in a set. In addition, as a specific example of (21 ′), a primer of SEQ ID NO: 55 can be exemplified, and as a specific example of (22 ′), a primer of SEQ ID NO: 56 can be exemplified.
本発明においては、さらに、第12のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（23´）（最も好ましくは配列番号23の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（24´）（最も好ましくは配列番号24の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはピーカンナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号23のプライマーと配列番号24のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（23´）の具体例としては配列番号５７のプライマー、（24´）の具体例としては配列番号５８のプライマーを例示できる。 In the present invention, as a further preferred embodiment of the twelfth primer set, a PCR primer (23 ') consisting of a DNA of up to 30 bases including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 in the sequence listing at the 3' end side (most preferred) Is a primer consisting of a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23) as a sense primer, and a PCR primer (24 ') consisting of a DNA of up to 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24 at the 3' end in the sequence listing (most preferable) Proposes a primer set using a primer consisting of DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24) as an antisense primer. This primer set can be suitably used for pecan nut detection, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 23 and the primer of SEQ ID NO: 24 as a set. In addition, as a specific example of (23 '), the primer of SEQ ID NO: 57 can be exemplified, and as a specific example of (24'), a primer of SEQ ID NO: 58 can be exemplified.
本発明においては、さらに、第13のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（25´）（最も好ましくは配列番号25の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号26の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（26´）（最も好ましくは配列番号26の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは松の実検出用に好適に使用でき、配列番号25のプライマーと配列番号26のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（25´）の具体例としては配列番号５９のプライマー、（26´）の具体例としては配列番号６０のプライマーを例示できる。 In the present invention, further, as a preferred embodiment of the thirteenth primer set, a PCR primer (25 ') consisting of a DNA of up to 30 bases containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25 in the sequence listing on the 3' end side (most preferable) Is a primer consisting of a DNA having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25) as a sense primer, and a PCR primer (26 ') consisting of a DNA of up to 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26 in the sequence listing at the 3' end, most preferably Proposes a primer set using a primer consisting of DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26) as an antisense primer. This primer set can be suitably used for detecting pine nuts, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 25 and the primer of SEQ ID NO: 26 in a set. In addition, as a specific example of (25 '), the primer of SEQ ID NO: 59 can be exemplified, and as a specific example of (26'), a primer of SEQ ID NO: 60 can be exemplified.
本発明においては、さらに、第14のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表
の配列番号27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（27´）（最も好ましくは配列番号27の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号28の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（28´）（最も好ましくは配列番号28の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはピリナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号27のプライマーと配列番号28のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（27´）の具体例としては配列番号６１のプライマー、（28´）の具体例としては配列番号６２のプライマーを例示できる。
In the present invention, further, as a preferred embodiment of the fourteenth primer set, a PCR primer (27 ′) consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of SEQ ID NO: 27 in the sequence listing at the 3 ′ end side (most preferred) Is a PCR primer (28 ') consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of SEQ ID NO: 28 on the 3' end side as a sense primer using a primer consisting of the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 27 (most preferable) Proposes a primer set using a primer consisting of DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28) as an antisense primer. This primer set can be suitably used for detecting peanuts, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 27 and the primer of SEQ ID NO: 28 as a set. In addition, as a specific example of (27 '), the primer of SEQ ID NO: 61 can be exemplified, and as a specific example of (28'), a primer of SEQ ID NO: 62 can be exemplified.
本発明においては、さらに、第15のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号29の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（29´）（最も好ましくは配列番号29の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号30の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（30´）（最も好ましくは配列番号30の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはピスタチオ検出用に好適に使用でき、配列番号29のプライマーと配列番号30のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（29´）の具体例としては配列番号６３のプライマー、（30´）の具体例としては配列番号６４のプライマーを例示できる。 In the present invention, as a further preferred embodiment of the fifteenth primer set, a PCR primer (29 ′) consisting of a DNA of up to 30 bases containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 in the sequence listing on the 3 ′ end side (most preferred) Is a primer consisting of a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29) as a sense primer, and a PCR primer (30 ') comprising a DNA of up to 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30 in the sequence listing on the 3' end side (most preferable) Proposes a primer set using a primer comprising a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30) as an antisense primer. This primer set can be suitably used for pistachio detection, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 29 and the primer of SEQ ID NO: 30 in a set. In addition, as a specific example of (29 '), the primer of SEQ ID NO: 63 can be exemplified, and as a specific example of (30'), a primer of SEQ ID NO: 64 can be exemplified.
本発明においては、さらに、第16のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号31の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（31´）（最も好ましくは配列番号31の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号32の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（32´）（最も好ましくは配列番号32の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはシアナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号31のプライマーと配列番号32のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（31´）の具体例としては配列番号６５のプライマー、（32´）の具体例としては配列番号６６のプライマーを例示できる。 In the present invention, further, as a preferred embodiment of the sixteenth primer set, a PCR primer (31 ′) consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of SEQ ID NO: 31 in the sequence listing at the 3 ′ end side (most preferred) Is a PCR primer (32 ') consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of SEQ ID NO: 32 on the 3' end side as a sense primer using a primer consisting of DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 31 (most preferable) Proposes a primer set using a primer consisting of DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32) as an antisense primer. This primer set can be suitably used for the detection of shea nut, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 31 and the primer of SEQ ID NO: 32 as a set. In addition, as a specific example of (31 ′), a primer of SEQ ID NO: 65 can be exemplified, and as a specific example of (32 ′), a primer of SEQ ID NO: 66 can be exemplified.
本発明においては、さらに、第17のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号33の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（33´）（最も好ましくは配列番号33の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号34の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（34´）（最も好ましくは配列番号34の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはクルミ検出用に好適に使用でき、配列番号33のプライマーと配列番号34のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（33´）の具体例としては配列番号６７のプライマー、（34´）の具体例としては配列番号６８のプライマーを例示できる。 In the present invention, further, as a preferred embodiment of the seventeenth primer set, a PCR primer (33 ') consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of SEQ ID NO: 33 in the sequence listing at the 3' end side (most preferable) Is a primer consisting of a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33) as a sense primer, and a PCR primer (34 ') consisting of a DNA of up to 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 34 at the 3' end in the sequence listing (most preferably) Proposes a primer set using a primer consisting of DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 34) as an antisense primer. This primer set can be suitably used for walnut detection, and it is most preferable to use the primer of SEQ ID NO: 33 and the primer of SEQ ID NO: 34 in a set. In addition, as a specific example of (33 '), the primer of SEQ ID NO: 67 can be exemplified, and as a specific example of (34'), a primer of SEQ ID NO: 68 can be exemplified.
木の実検出法
本発明の木の実検出方法は、試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、本発明のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中に木の実（アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、カシューナッツ、クリ、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ）が存在しているか否かを検出する工程とを含む方法である。
Tree nut detection method The tree nut detection method of the present invention comprises a step of extracting DNA from a sample, a step of performing PCR using the DNA as a template and a primer set of the present invention, and detecting the amplified DNA. By doing so, tree nuts (almonds, beach nuts, brazil nuts, cashew nuts, chestnuts, coconut, ginkgo, hazelnuts, hickory nuts, lychees, macadamia nuts, pecan nuts, pine nuts, pili nuts, pistachios, shea nuts, walnuts) Detecting whether it is present.
即ち、上記本発明の木の実検出用PCRプライマーセットを用いて、試料中のDNAをPCR等で核酸分析することにより、試料中の木の実を特異的に検出することが可能となる。このとき、アーモンドを検出する場合には、アーモンド検出用PCRプライマーセットを使用し、同様にビーチナッツ、ブラジルナッツ、カシューナッツ、クリ、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミを検出する場合には、それぞれビーチナッツ検出用PCRプライマーセット、ブラジルナッツ検出用PCRプライマーセット、カシューナッツ検出用PCRプライマーセット、クリ検出用PCRプライマーセット、ココナッツ検出用PCRプライマーセット、銀杏検出用PCRプライマーセット、ヘーゼルナッツ検出用PCRプライマーセット、ヒッコリーナッツ検出用PCRプライマーセット、ライチ検出用PCRプライマーセット、マカダミアナッツ検出用PCRプライマーセット、ピーカンナッツ検出用PCRプライマーセット、松の実検出用PCRプライマーセット、ピリナッツ検出用PCRプライマーセット、ピスタチオ検出用PCRプライマーセット、シアナッツ検出用PCRプライマーセット、クルミ検出用PCRプライマーセットを使用すればよい。 That is, by using the PCR primer set for detecting tree nuts of the present invention, nucleic acid analysis of DNA in a sample by PCR or the like enables specific detection of tree nuts in the sample. At this time, when detecting almonds, use a PCR primer set for detecting almonds, and similarly use beach nuts, Brazil nuts, cashew nuts, chestnuts, coconut, ginkgo, hazelnuts, hickory nuts, lychees, macadamia nuts, pecan nuts, When detecting pine nuts, pili nuts, pistachios, shea nuts, and walnuts, PCR primer set for detecting beach nuts, PCR primer set for detecting Brazil nuts, PCR primer set for detecting cashew nuts, PCR primer set for detecting chestnuts, coconut, respectively PCR primer set for detection, PCR primer set for ginkgo detection, PCR primer set for hazelnut detection, PCR primer set for hickory nut detection, PCR primer set for lychee detection, PCR for macadamia nut detection Use Limer set, PCR primer set for pecan nut detection, PCR primer set for pine nut detection, PCR primer set for pili nut detection, PCR primer set for pistachio detection, PCR primer set for shea nut detection, PCR primer set for walnut detection I just need.
検出法（核酸分析）の種類は、特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、PCRプライマーを用いてPCR増幅する方法やPCR増幅産物をプローブで検出する方法等を例示することができる。 The type of detection method (nucleic acid analysis) is not particularly limited, and a known method can be used as appropriate. For example, a method of performing PCR amplification using PCR primers and a method of detecting a PCR amplification product with a probe can be exemplified.
PCRプライマーを用いてPCR増幅する方法としては、検出目的に応じて選択した上記本発明の木の実検出用プライマーセットを用いて、試料中のDNAにおける標的塩基配列を選択的に増幅させ、PCR増幅産物の有無を測定する方法が挙げられる。PCR増幅産物の有無の確認は、通常、PCR増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドやサイバーグリーンIなどの核酸染色によって行うことができる。リアルタイムPCR装置を用いてPCRを行う場合は、その装置の検出システムにより自動的にPCR増幅産物の有無を確認することができる。例えば、PCR反応液中にサイバーグリーンIを添加した場合、サイバーグリーンIが二本鎖DNAに結合したときに発する蛍光量に依存したPCR増幅産物量をサイクル毎にモニターすることができる。蛍光量によりPCR増幅が見られた場合には、先述のアガロースゲル電気泳動によって増幅産物の有無とそのサイズを確認すればよい。 As a method of PCR amplification using PCR primers, using the primer set for detecting tree nuts of the present invention selected according to the purpose of detection, the target base sequence in the DNA in the sample is selectively amplified, and the PCR amplification product Method for measuring the presence or absence of the Confirmation of the presence or absence of the PCR amplification product can be usually performed by separating the PCR amplification product by agarose gel electrophoresis and staining a nucleic acid such as ethidium bromide or cyber green I. When PCR is performed using a real-time PCR device, the presence or absence of a PCR amplification product can be automatically confirmed by the detection system of the device. For example, when Cyber Green I is added to a PCR reaction solution, the amount of PCR amplification product depending on the amount of fluorescence emitted when Cyber Green I binds to double-stranded DNA can be monitored for each cycle. When PCR amplification is observed depending on the amount of fluorescence, the presence or absence of the amplification product and its size may be confirmed by agarose gel electrophoresis described above.
具体的には、配列番号1記載のプライマーと配列番号2記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約515 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にアーモンドが存在していたことを示唆する。 Specifically, the size of a PCR amplification product using the primer described in SEQ ID NO: 1 and the primer described in SEQ ID NO: 2 is about 515 bp. The detection of an amplification product of that size in agarose electrophoresis indicates that almond was present in the test sample.
具体的には、配列番号3記載のプライマーと配列番号4記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約75 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にビーチナッツが存在していたことを示唆する。 Specifically, the size of a PCR amplification product using the primer described in SEQ ID NO: 3 and the primer described in SEQ ID NO: 4 is about 75 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose electrophoresis indicates that beach nuts were present in the test sample.
具体的には、配列番号5記載のプライマーと配列番号6記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約91 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にブラジルナッツが存在していたことを示唆する。 Specifically, the size of a PCR amplification product using the primer described in SEQ ID NO: 5 and the primer described in SEQ ID NO: 6 is about 91 bp. The detection of an amplification product of this size in agarose electrophoresis indicates that Brazil nuts were present in the test sample.
具体的には、配列番号7記載のプライマーと配列番号8記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約102 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にカシューナッツが存在していたことを示唆する。 Specifically, the size of a PCR amplification product using the primer described in SEQ ID NO: 7 and the primer described in SEQ ID NO: 8 is about 102 bp. The detection of an amplification product of that size in agarose electrophoresis indicates that cashew nuts were present in the test sample.
具体的には、配列番号9記載のプライマーと配列番号10記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約293 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にクリが存在していたことを示唆する。 Specifically, the size of a PCR amplification product using the primer described in SEQ ID NO: 9 and the primer described in SEQ ID NO: 10 is about 293 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose electrophoresis indicates that chestnuts were present in the test sample.
具体的には、配列番号11記載のプライマーと配列番号12記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約224 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にココナッツが存在していたことを示唆する。 Specifically, the size of a PCR amplification product using the primer described in SEQ ID NO: 11 and the primer described in SEQ ID NO: 12 is about 224 bp. The detection of an amplification product of this size in agarose electrophoresis indicates that coconut was present in the test sample.
具体的には、配列番号13記載のプライマーと配列番号14記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約186 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に銀杏が存在していたことを示唆する。 Specifically, the size of a PCR amplification product using the primer described in SEQ ID NO: 13 and the primer described in SEQ ID NO: 14 is about 186 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose electrophoresis indicates that ginkgo was present in the test sample.
具体的には、配列番号15記載のプライマーと配列番号16記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約361 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にヘーゼルナッツが存在していたことを示唆する。 Specifically, the size of a PCR amplification product using the primer described in SEQ ID NO: 15 and the primer described in SEQ ID NO: 16 is about 361 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose electrophoresis indicates that hazelnuts were present in the test sample.
具体的には、配列番号17記載のプライマーと配列番号18記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約543 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にヒッコリーナッツが存在していたことを示唆する。 Specifically, the size of a PCR amplification product using the primer described in SEQ ID NO: 17 and the primer described in SEQ ID NO: 18 is about 543 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose electrophoresis indicates that hickory nuts were present in the test sample.
具体的には、配列番号19記載のプライマーと配列番号20記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約162 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にライチが存在していたことを示唆する。 Specifically, the size of a PCR amplification product using the primer described in SEQ ID NO: 19 and the primer described in SEQ ID NO: 20 is about 162 bp. The detection of an amplification product of that size in agarose electrophoresis indicates that litchi was present in the test sample.
具体的には、配列番号21記載のプライマーと配列番号22記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約111 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にマカダミアナッツが存在していたことを示唆する。 Specifically, the size of a PCR amplification product using the primer described in SEQ ID NO: 21 and the primer described in SEQ ID NO: 22 is about 111 bp. The detection of an amplification product of that size in agarose electrophoresis indicates that macadamia nuts were present in the test sample.
具体的には、配列番号23記載のプライマーと配列番号24記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約468 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にピーカンナッツが存在していたことを示唆する。 Specifically, the size of a PCR amplification product using the primer described in SEQ ID NO: 23 and the primer described in SEQ ID NO: 24 is about 468 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose electrophoresis indicates that pecan nuts were present in the test sample.
具体的には、配列番号25記載のプライマーと配列番号26記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約139 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に松の実が存在していたことを示唆する。 Specifically, the size of a PCR amplification product using the primer described in SEQ ID NO: 25 and the primer described in SEQ ID NO: 26 is about 139 bp. The detection of an amplification product of that size in agarose electrophoresis indicates that pine nuts were present in the test sample.
具体的には、配列番号27記載のプライマーと配列番号28記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約83 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にピリナッツが存在していたことを示唆する。 Specifically, the size of a PCR amplification product using the primer described in SEQ ID NO: 27 and the primer described in SEQ ID NO: 28 is about 83 bp. The detection of an amplification product of this size in agarose electrophoresis indicates that pirinut was present in the test sample.
具体的には、配列番号29記載のプライマーと配列番号30記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約163 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にピスタチオが存在していたことを示唆する。 Specifically, the size of a PCR amplification product using the primer described in SEQ ID NO: 29 and the primer described in SEQ ID NO: 30 is about 163 bp. The detection of an amplification product of that size in agarose electrophoresis indicates that pistachio was present in the test sample.
具体的には、配列番号31記載のプライマーと配列番号32記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約518 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にシアナッツが存在していたことを示唆する。 Specifically, the size of a PCR amplification product using the primer described in SEQ ID NO: 31 and the primer described in SEQ ID NO: 32 is about 518 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose electrophoresis indicates that shea nut was present in the test sample.
具体的には、配列番号33記載のプライマーと配列番号34記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約501 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にクルミが存在していたことを示唆する。 Specifically, the size of a PCR amplification product using the primer described in SEQ ID NO: 33 and the primer described in SEQ ID NO: 34 is about 501 bp. Detection of an amplification product of that size in agarose electrophoresis indicates that walnut was present in the test sample.
PCR増幅産物をプローブで検出する方法としては、Taq Man法に代表されるように、PCR増幅産物の内部塩基配列とハイブリダイズするような蛍光物質標識プローブを反応液に添加し、該プローブがPCR増幅産物にハイブリダイズ後、該プローブが分解されるときに生じる蛍光量をリアルタイムPCR装置で自動的に検出することによって、PCR増幅産物の有無を確認する方法が挙げられる。なお、PCR増幅産物をプローブで検出するその他の方法としては、Molecular Beacon法、CycleavePCR法、ハイブリプローブを利用する方法等が挙げられる。これらの方法で使用するPCRプライマーは、本発明の木の実検出用PCRプライマーセットの何れかを使用すればよく、各々のPCRプライマーセットで増幅されるPCR増幅産物の内部塩基配列から標的とする生物種に共通な塩基配列領域を別途選択し、その領域に基づいたプローブを使用すればよい。 As a method of detecting a PCR amplification product with a probe, as represented by the Taq Man method, a fluorescent substance-labeled probe that hybridizes with the internal nucleotide sequence of the PCR amplification product is added to the reaction solution, and the probe is subjected to PCR. After hybridization to an amplification product, a method for confirming the presence or absence of a PCR amplification product by automatically detecting the amount of fluorescence generated when the probe is decomposed by a real-time PCR device is exemplified. Other methods for detecting a PCR amplification product with a probe include a Molecular Beacon method, a Cycleave PCR method, a method using a hybrid probe, and the like. The PCR primers used in these methods may be any of the PCR primer sets for detecting tree nuts of the present invention, and the target species may be determined from the internal nucleotide sequence of the PCR amplification product amplified by each PCR primer set. May be separately selected and a probe based on that region may be used.
本発明の木の実の検出法において、対象となる被験試料の種類は、特に限定されない。例えば、被験試料としては、食品原料や加工食品等が挙げられる。食品原料としては、木の実を取り扱う食品原料生産工場において、別途生産される木の実を意図的に含まない食品原料が挙げられる。加工食品としては、菓子類、麺類、粉末スープ、液体スープ、熱風乾燥又は凍結乾燥した具材、あるいは、これらの加工食品を含有する各種調理食品等が挙げられる。また、木の実を取り扱う食品製造工場において、別途生産される木の実を意図的に含まない加工食品が挙げられる。また、木の実を含む加工食品を製造後、木の実を含まない加工食品を製造する際には、木の実残渣の除去を念頭においた食品製造設備の入念な清掃作業が必須となる。この清掃作業方法の有効性、並びに、食品製造設備の木の実残渣の有無を確認する観点から、当該製造設備の拭き取り試料も被験試料として挙げられる。 In the method for detecting a nut of the present invention, the type of the target test sample is not particularly limited. For example, test samples include food raw materials and processed foods. Examples of the food raw material include a food raw material that is not intentionally contained in a nut that is separately produced in a food raw material production factory that handles nuts. Examples of the processed food include confectionery, noodles, powdered soup, liquid soup, hot air-dried or freeze-dried ingredients, and various cooked foods containing these processed foods. In addition, processed foods that do not intentionally contain nuts that are separately produced in a food manufacturing factory that handles nuts are also included. In addition, when manufacturing processed foods containing tree nuts after manufacturing processed foods containing tree nuts, careful cleaning of food manufacturing equipment in consideration of removal of tree nut residues is essential. From the viewpoint of confirming the effectiveness of the cleaning operation method and the presence or absence of tree residues of food production equipment, a wiped sample of the production equipment is also a test sample.
また、試料の形態も特に限定されず、一般的な既知のDNA抽出法（消費者庁次長通知、アレルギー物質を含む食品の検査方法について、平成26年3月26日、消食表第36号）や市販の各種DNA抽出キット［例えば、Nucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kits（GE Healthcare Biosciences Corp., USA）、DNA Extraction IsoplantII kit（Nippon Gene Co. Ltd., Japan）、DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）等］によって、DNAの回収が可能な試料であれば、上記の検出法に適用することができる。上記のDNA抽出法によって、ゲノムDNA及び細胞小器官由来DNA（ミトコンドリアDNAやクロロプラストDNA）を、通常、試料から抽出することができる。 In addition, the form of the sample is not particularly limited, and a generally known DNA extraction method (Notification of the Deputy Director-General of the Consumer Affairs Agency, a method for testing foods containing allergic substances, March 26, 2014, Food Eating Table No. 36) And various commercially available DNA extraction kits [for example, Nucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kits (GE Healthcare Biosciences Corp., USA), DNA Extraction Isoplant II kit (Nippon Gene Co. Ltd., Japan), DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) can be applied to the above detection method as long as the sample can recover DNA. By the above-described DNA extraction method, genomic DNA and organelle-derived DNA (mitochondrial DNA or chloroplast DNA) can usually be extracted from a sample.
木の実検出用キット
本発明は、また、木の実検出キットに関する。当該キットは、上記本発明の木の実検出用PCRプライマーセットの少なくとも１セットを含んで成るものであれば、その構成は特に限定されない。
具体的には、配列番号1における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号2における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号3における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号4における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号5における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号6における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号7における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号8における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号9における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号10における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号11における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号12における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号13における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号14における塩基番号13〜27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号15における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号16における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号17における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号18における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号19における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号20における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号21における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号22における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列表の配列番号23における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号24における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号25における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号26における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号27における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号28における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号29における塩基番号10〜24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号30における塩基番号15〜29の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号31における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号32における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号33における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号34における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；の1セット以上を含む木の実検出キットが挙げられる。
Kit for detecting nuts The present invention also relates to a kit for detecting nuts. The configuration of the kit is not particularly limited as long as it comprises at least one set of the PCR primer set for detecting the nut of the present invention.
Specifically, a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of base numbers 9 to 23 in SEQ ID NO: 1 at the 3 'end side, and the base sequence of base numbers 5 to 19 in SEQ ID NO: 2 A set of a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA included on the terminal side; a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of base numbers 7 to 21 in SEQ ID NO: 3 on the 3 ′ end side; A set of PCR primers consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of base numbers 6 to 20 at the 3 'end; a maximum of 30 containing the base sequence of base numbers 9 to 23 at the 3' end of SEQ ID NO: 5 A set of a PCR primer consisting of base DNA and a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of base numbers 5 to 19 in SEQ ID NO: 6 on the 3 ′ end side; base numbers 6 to 20 in SEQ ID NO: 7 Consisting of up to 30 bases of DNA containing the base sequence at the 3 'end A set of a primer and a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of base numbers 5 to 19 in SEQ ID NO: 8 at the 3 'end side; the base sequence of base numbers 6 to 20 in SEQ ID NO: 9 being 3' A set of a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases on the terminal side and a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of base numbers 4 to 18 in SEQ ID NO: 10 on the 3 'end side; SEQ ID NO: 11 A PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of base numbers 4 to 18 at the 3 ′ end, and a PCR primer of up to 30 bases containing the base sequence of base numbers 4 to 18 at the 3 ′ end in SEQ ID NO: 12 A set of PCR primers consisting of DNA; a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA including the base sequence of bases 7 to 21 in SEQ ID NO: 13 at the 3 ′ end, and bases of bases 13 to 27 in SEQ ID NO: 14 Up to 30 bases of DNA containing the sequence at the 3 'end A PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of base numbers 7 to 21 in SEQ ID NO: 15 on the 3 'end side, and a base sequence of base numbers 11 to 25 in SEQ ID NO: 16 A set of a PCR primer consisting of a DNA having a maximum of 30 bases at the 3 ′ end; a PCR primer consisting of a DNA having a maximum of 30 bases containing the base sequence of base numbers 6 to 20 in SEQ ID NO: 17 at the 3 ′ end; A set of a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases DNA containing the base sequence of base numbers 9 to 23 in No. 18 at the 3 ′ end side; the base sequence of base numbers 7 to 21 in SEQ ID No. 19 is included in the 3 ′ end side A set of a PCR primer consisting of a DNA having a maximum of 30 bases and a PCR primer consisting of a DNA having a maximum of 30 bases including the base sequence of base numbers 6 to 20 in SEQ ID NO: 20 at the 3 ′ end; base number 6 in SEQ ID NO: 21 Up to 20 nucleotide sequences at the 3 'end A set of a PCR primer consisting of a 30-base DNA and a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of base numbers 8 to 22 in SEQ ID NO: 22 at the 3 ′ end; From a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases DNA containing the base sequence of Nos. 4 to 18 at the 3 ′ end, and a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of base Nos. 6 to 20 of SEQ ID NO: 24 at the 3 ′ end A set of PCR primers; a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of base numbers 5 to 19 in SEQ ID NO: 25 on the 3 ′ end side, and a base sequence of base numbers 8 to 22 in SEQ ID NO: 26 A set of a PCR primer consisting of a DNA having a maximum of 30 bases on the 3 ′ end side; a PCR primer consisting of a DNA consisting of a maximum of 30 bases containing the base sequence of base numbers 8 to 22 in SEQ ID NO: 27 on the 3 ′ end side; The base sequence of base numbers 4 to 18 in No. 28 at the 3 'end A set of a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases on the end side; a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of base numbers 10 to 24 in SEQ ID NO: 29 on the 3 ′ end side; A set of PCR primers consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of base numbers 15 to 29 at the 3 ′ end side; a maximum of 30 base sequences of base numbers 8 to 22 of SEQ ID NO: 31 at the 3 ′ end side A set of a PCR primer consisting of base DNAs and a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of base numbers 4 to 18 in SEQ ID NO: 32 on the 3 ′ end side; base numbers 6 to 20 in SEQ ID NO: 33 A PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of 3 ′ end, and a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of base numbers 6 to 20 in SEQ ID NO: 34 at the 3 ′ end Tree set containing at least one set of Tsu door, and the like.
そして、好ましいものとして、配列番号1の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号2の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号3の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号4の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号5の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号6の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号7の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号8の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号9の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号10の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号11の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号12の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号13の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号14の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号15の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号16の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号17の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列表の配列番号23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号26の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号28の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号29の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号30の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号31の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号32の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号33の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号34の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセットの1セット以上を含む木の実検出キットが挙げられる。 Preferably, the primer comprises a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of SEQ ID NO: 1 at the 3 ′ end and a DNA consisting of a base DNA of 30 bases including the base sequence of SEQ ID NO: 2 at the 3 ′ end. A set of PCR primers; a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 at the 3 'end, and a DNA consisting of up to 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 at the 3' end A set of PCR primers; a PCR primer consisting of a maximum of 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 at the 3 'end and a DNA consisting of a maximum of 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 at the 3' end A set of PCR primers; a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 at the 3 'end and a DNA consisting of a DNA of up to 30 bases containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 at the 3' end Set with PCR primer; base sequence of SEQ ID NO: 9 at 3 'end A set of a PCR primer consisting of a DNA having a maximum of 30 bases and a PCR primer consisting of a DNA having a maximum of 30 bases including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 at the 3 'end; A set of a PCR primer consisting of a DNA having a maximum of 30 bases and a PCR primer consisting of a DNA having a maximum of 30 bases including a base sequence of SEQ ID NO: 12 at the 3 'end; a base sequence of SEQ ID NO: 13 being located at the 3' end A set of a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases and a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of SEQ ID NO: 14 at the 3 'end; the base sequence of SEQ ID NO: 15 at the 3' end A set of a PCR primer consisting of a DNA having a maximum of 30 bases and a PCR primer consisting of a DNA having a maximum of 30 bases including a base sequence of SEQ ID NO: 16 at the 3 'end; a base sequence of SEQ ID NO: 17 being located at the 3' end PCR primer consisting of DNA of up to 30 bases including, SEQ ID NO: 18 A set of PCR primers consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence at the 3 ′ end; a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 19 at the 3 ′ end; A set of PCR primers consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence at the 3 ′ end; a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 21 at the 3 ′ end; A set of PCR primers consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence at the 3 ′ end; a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 23 in the sequence listing at the 3 ′ end; A set of a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of No. 24 at the 3 ′ end; a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 25 at the 3 ′ end; P consisting of a DNA of up to 30 bases including the base sequence of No. 26 at the 3 ′ end A set of CR primers; a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases of DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 27 at the 3 'end and a DNA consisting of a maximum of 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 28 at the 3' end A set of PCR primers; a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 at the 3 'end and a DNA consisting of a DNA of up to 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30 at the 3' end A set of PCR primers; a PCR primer consisting of a DNA of up to 30 bases containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31 at the 3 'end and a DNA consisting of a DNA of up to 30 nucleotides containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32 at the 3' end A set of PCR primers; a PCR primer consisting of a maximum of 30 bases DNA containing the base sequence of SEQ ID NO: 33 at the 3 'end, and a DNA consisting of a maximum of 30 bases containing the base sequence of SEQ ID NO: 34 at the 3' end A nut detection key containing at least one set of PCR primers Door and the like.
その中でも、特に好ましいものとして、配列番号1の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号2の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；
配列番号3の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号4の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号5の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号6の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号7の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号8の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号9の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号10の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号11の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号12の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号13の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号14からなるPCRプライマーとのセット；配列番号15の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号16の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号17の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号18の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号19の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号20の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号21の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号22の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列表の配列番号23の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号24の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号25の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号26の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号27の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号28の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号29の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号30の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号31の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号32の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号33の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号34の塩基配列からなるPCRプライマーとのセットの1セット以上を含む木の実検出キットが挙げられる。
また、上記の各々のプライマーセット、及び当該の各々のプライマーセットで増幅され
るPCR増幅産物を検出するためのプローブ等を含む木の実検出キットなども挙げられる。
Among them, a particularly preferred set of a PCR primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a PCR primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2;
A set of a PCR primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a PCR primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4; a PCR primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, and a PCR primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 Set: a set of a PCR primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 7 and a PCR primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 8; a PCR primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 9 and a PCR primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 10 A set of a PCR primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 11 and a PCR primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 12; a PCR primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 13; A set of a PCR primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and a PCR primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16; A set of a PCR primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 18; a set of a PCR primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 19; and a PCR primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 20; A set of a PCR primer consisting of a base sequence and a PCR primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 22; a set of a PCR primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 23 in the sequence listing and a PCR primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 24 A set of a PCR primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 25 and a PCR primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 26; a PCR primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 27; and a PCR primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 28 A set of a PCR primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 and a PCR primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30; a salt of SEQ ID NO: 31 A set of a PCR primer consisting of a sequence and a PCR primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 32; at least one set of a PCR primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 33 and a PCR primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 34 And a nut detection kit containing the same.
In addition, a tree nut detection kit and the like including the above-mentioned respective primer sets and a probe for detecting a PCR amplification product amplified by the respective primer sets are also included.
当該キットには、使用目的等に応じて、適当な試薬や各種容器等を含めることができる。具体的には、PCRプライマー伸長生成物を合成するための重合用試薬、例えば、耐熱性DNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド、マグネシウム及び、PCR反応用緩衝液、並びに、それらの品質を適切に保持可能な保存容器等を含めることができる。
The kit can contain appropriate reagents, various containers, and the like according to the purpose of use and the like. Specifically, a polymerization reagent for synthesizing a PCR primer extension product, for example, a thermostable DNA polymerase, deoxyribonucleotide, magnesium, and a buffer for a PCR reaction, and a storage that can appropriately retain the quality thereof Containers and the like can be included.
実施例
以下に、本発明について実施例を用いて、さらに、詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定して解釈されるものではない。また、本発明の要旨を逸脱することなく、適宜変更することが可能である。
Examples Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention should not be construed as being limited to these Examples. Further, it can be appropriately changed without departing from the gist of the present invention.
実施例1
各種動物、植物、真菌、及び細菌由来DNAに対する木の実検出用PCRプライマーセットの検出特異性の確認
本発明の木の実検出用PCRプライマーセットを使用したPCR分析法の有効性を確認するために、各種生物由来DNAに対するPCRの検出特異性を調べる実験を、下記のように実施した。
Example 1
Confirmation of detection specificity of PCR primer set for detecting tree nuts against DNA derived from various animals, plants, fungi, and bacteria.To confirm the effectiveness of PCR analysis using PCR primer set for detecting tree nuts of the present invention. Next, an experiment for examining the detection specificity of PCR for DNAs derived from various organisms was performed as follows.
ヒトの精製DNAは、セマイン社（CeMines, LLC, USA）から購入したものを使用した。 Purified human DNA used was purchased from Semains (CeMines, LLC, USA).
ウシ、ブタ、ニワトリ、シロエビ、タラバガニ、コウイカ、ベニザケ、及びマサバの精製DNAは、商店から購入した各々の試料の（筋）肉質部分を凍結後、マルチビーズショッカー（安井器械、大阪）で破砕した試料からNucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kits（GE Healthcare Biosciences Corp., USA）、DNA Extraction IsoplantIIkit（Nippon Gene Co. Ltd., Japan）、またはDNeasy Blood&Tissue kit（Qiagen GmbH,Germany）を用いて調製したものを使用した。 Purified DNA of cattle, pig, chicken, white shrimp, king crab, squid, sockeye salmon, and sorghum was frozen with a multi-beads shocker (Yasui Kikai, Osaka) after freezing the (muscle) fleshy portion of each sample purchased from a store. Prepared from the sample using Nucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kits (GE Healthcare Biosciences Corp., USA), DNA Extraction Isoplant II kit (Nippon Gene Co. Ltd., Japan), or DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen GmbH, Germany). One used.
コショウ、ナガイモ、ネギ、ココナッツ、ナツメヤシ、アサイー、バナナ、マカダミアナッツ（オーストラリア産、ケニア産）、レンコン、ラッカセイ、ダイズ、アーモンド（アメリカ産、スペイン産）、モモ、プルーン、ウメ、スモモ、アンズ、サクランボ、リンゴ、ビワ、イチゴ、カボチャ、ピーカンナッツ、クルミ（アメリカ産、フランス産）、ヘーゼルナッツ、ピリナッツ、カシューナッツ（インド産、ベトナム産）、ピスタチオ（イラン産、アメリカ産）、マンゴー、ピンクペッパー、ライチ、ランブータン、キャベツ、ブラジルナッツ、シアナッツ、ミラクルフルーツ、カキ、茶、キウイフルーツ、ブルーベリー、ゴマ、ジャガイモ、ニンジン、銀杏、松の実は、商店から購入し、イネは国内栽培農家から入手した。これらの精製DNAは、各々の試料の一部（種子、果皮部、葉部、塊茎部）を70%エタノールで洗浄し、さらに、TE緩衝液で素早く洗浄後、マルチビーズショッカー（安井器械、大阪）で破砕した試料からGenomic-tip 20/G（Qiagen GmbH, Germany）、DNeasy plant Mini kits（Qiagen GmbH, Germany）、Nucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kits、または、DNA Extraction IsoplantII kitを用いて調製したものを使用した。 Pepper, potato, leek, coconut, date palm, acai, banana, macadamia nut (from Australia, Kenya), lotus root, peanut, soybean, almond (from the United States and Spain), peach, prunes, plum, plum, apricot, cherry , Apple, loquat, strawberry, pumpkin, pecan nut, walnut (US, France), hazelnut, pili nut, cashew nut (India, Vietnam), pistachio (Iran, US), mango, pink pepper, litchi, Rambutan, cabbage, Brazil nuts, shea nuts, miracle fruits, oysters, tea, kiwi fruits, blueberries, sesame, potatoes, carrots, ginkgo and pine nuts were purchased from shops, and rice was obtained from domestic growers. As for these purified DNAs, a part of each sample (seed, pericarp, leaf, tuber) was washed with 70% ethanol, and then quickly washed with TE buffer, then multi-bead shocker (Yasui Kikai, Osaka, Japan). Prepared using Genomic-tip 20 / G (Qiagen GmbH, Germany), DNeasy plant Mini kits (Qiagen GmbH, Germany), Nucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kits, or DNA Extraction IsoplantII kit What was used was used.
ソバ及びコムギの精製DNAは、商店から購入したそば粉及び小麦粉からGenomic-tip 20/Gを用いて調製したものを使用した。 Purified DNA of buckwheat and wheat was prepared from buckwheat flour and flour purchased from a store using Genomic-tip 20 / G.
トウモロコシの精製DNAは、バイオチェイン・インスティテュート社（BioChain Institute, Inc., USA）から購入したものを使用した。 Purified corn DNA used was purchased from BioChain Institute, Inc., USA.
ヒッコリーナッツ（オーバータヒッコリー）の精製DNAは、東京大学大学院理学系研究科附属植物園から分譲された葉からDNeasy Plant Mini Kitを用いて調製したものを使用した。 As the purified DNA of hickory nuts (Oberta hickory), those prepared by using DNeasy Plant Mini Kit from leaves distributed from the botanical garden attached to the Graduate School of Science, the University of Tokyo were used.
クリ（和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ）の精製DNAは、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構果樹研究所から提供された葉からDNeasy Plant Mini Kitを用いて調製したものを使用した。 As the purified DNA of chestnuts (Japanese chestnuts, Chinese gooseberry, European chestnut), those prepared by using DNeasy Plant Mini Kit from leaves provided by National Institute of Agricultural and Food Technology Fruit Tree Research Institute were used.
クリ（チンカピン）の精製DNAは、独立行政法人森林総合研究所多摩森林科学園から分譲された葉からDNeasy Plant Mini Kitを用いて調製したものを使用した。 The purified DNA of chestnut (tin capine) was prepared from leaves obtained from the National Forest Research Institute Tama Forest Science Park using the DNeasy Plant Mini Kit.
ビーチナッツ（ブナ、イヌブナ）、シイ、ドングリ（シラカシ）の精製DNAは、自然界より入手した葉からDNeasy Plant Mini Kitを用いて調製したものを使用した。 Purified DNA of beech nuts (beech, canine beech), shii, and acorns (shirakashi) was prepared from leaves obtained from the natural world using a DNeasy Plant Mini Kit.
ピキア・アノマラ（Pichia anomala IFO 0144）、及びバチルス・セレウス菌（Bacillus cereus ATCC11950）の精製DNAは、各々の菌株を適切な培地で培養後、その培養液からPuregene Yeast and Gram-Positive DNA Isolation kit（Gentra Systems Inc., USA）を用いて調製したものを使用した。なお、いずれの精製DNAもRNA分解酵素によるRNAの除去操作を実施してある。 Purified DNA of Pichia anomala IFO 0144 and Bacillus cereus ATCC 11950 can be obtained by culturing each strain in an appropriate medium, and then purifying from the culture solution a Puregene Yeast and Gram-Positive DNA Isolation kit ( Gentra Systems Inc., USA). In addition, all the purified DNAs were subjected to the operation of removing RNA with RNase.
配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、及び34に記載の各々のPCRプライマーは、ユーロフィンジェノミクス社で合成されたものを、以下のPCRで使用した。 SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 22, 23, 24, The PCR primers described in 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, and 34 were synthesized by Eurofin Genomics and used in the following PCR.
上述したように準備した各種動物、植物、真菌、及び細菌DNA量を測定後、滅菌水を用いて、DNA濃度を10 ng/μLに調製した。調製した5 μLのDNA試料液を含む20 μL容量の反応液は、タカラバイオ社のSYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)（Takara Bio Inc., Japan）を用いて調製した。この試薬は、TaKaRa Ex Taq HS（ホットスタートタイプ）、dNTP Mixture、Mg2+およびSYBR Green Iを溶液中に含んでいる。反応液は、SYBR Premix ExTaqをベースとし、250 nMセンスプライマー、250 nMアンチセンスプライマーを含む組成として、調製した。PCR反応は、LightCycler（Roche Diagnostics GmbH, Germany）で行い、増幅反応条件は以下の通りである。 After measuring the amount of various animal, plant, fungal, and bacterial DNAs prepared as described above, the DNA concentration was adjusted to 10 ng / μL using sterile water. A 20 μL reaction solution containing 5 μL of the prepared DNA sample solution was prepared using SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (Takara Bio Inc., Japan) manufactured by Takara Bio Inc. This reagent contains TaKaRa Ex Taq HS (hot start type), dNTP Mixture, Mg2 + and SYBR Green I in a solution. The reaction solution was prepared based on SYBR Premix ExTaq and had a composition containing 250 nM sense primer and 250 nM antisense primer. The PCR reaction was performed by LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Germany), and the amplification reaction conditions were as follows.
95℃で1分間のサイクルを一回実施後、20℃/秒の速度で95℃まで昇温後、5秒間同温度で保温、次に20℃/秒の速度で68℃まで降温後、10秒間同温度で保温、さらに10℃/秒の速度で72℃まで昇温後、30秒間同温度で保温する3つのステップからなる増幅サイクルを35回実施した。PCR増幅産物は、SYBR Green I依存性の蛍光量として、各々のサイクルの最終ステップに記録した。蛍光量から増幅が確認された場合は、2%（wt/vol）アガロースゲル電気泳動によってPCR増幅産物（反応液の5 μL）を分離し、Gel DOC EZ（Bio Rad）を用いて増幅産物を視覚化することによって、増幅産物の有無を確認した。分子量マーカーとしてOneMARK 100（GeneDireX）を使用した。電気泳動により標的サイズの増幅産物が検出された場合を、PCR反応陽性と判定した。これらのPCRの結果を表1に記載した。表中の＋（プラス）はPCR反応陽性を示し、−（マイナス）はPCR反応陰性を示す。 After one cycle of 1 minute at 95 ° C, raise the temperature to 95 ° C at a rate of 20 ° C / sec, keep the temperature at the same temperature for 5 seconds, then cool down to 68 ° C at a rate of 20 ° C / sec, then 10 After maintaining the temperature at the same temperature for 2 seconds and further raising the temperature to 72 ° C. at a rate of 10 ° C./second, 35 amplification cycles consisting of three steps of maintaining the temperature at the same temperature for 30 seconds were performed. PCR amplification products were recorded at the final step of each cycle as SYBR Green I-dependent fluorescence. If amplification was confirmed by the amount of fluorescence, the PCR amplification product (5 μL of the reaction solution) was separated by 2% (wt / vol) agarose gel electrophoresis, and the amplification product was separated using Gel DOC EZ (Bio Rad). The presence or absence of the amplification product was confirmed by visualization. OneMARK 100 (GeneDireX) was used as a molecular weight marker. When an amplification product of the target size was detected by electrophoresis, it was determined that the PCR reaction was positive. Table 1 shows the results of these PCRs. In the table, + (plus) indicates a positive PCR reaction, and-(minus) indicates a negative PCR reaction.
アーモンド検出用PCRプライマー（配列番号1及び2からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、アーモンド（アメリカ産、スペイン産）DNAを使用した場合のみ515bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるモモDNA、プルーンDNA、ウメDNA、スモモDNA、アンズDNA、サクランボDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。 When using almond detection PCR primers (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 1 and 2), an amplification product of around 515 bp was confirmed only when almond (US and Spain) DNA was used, and was determined to be positive. (table 1). The results were negative when peach DNA, prune DNA, plum DNA, plum DNA, apricot DNA, cherry DNA, or other species DNA including other plants were used (Table 1).
また、ビーチナッツ検出用PCRプライマー（配列番号3及び4からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ビーチナッツ（ブナ、イヌブナ）DNAを使用した場合のみ75bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるクリ（和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン）DNA、シイDNA、ドングリ（シラカシ）DNA、ピーカンナッツDNA、ヒッコリーナッツDNA、クルミ（アメリカ産、フランス産）DNA、ヘーゼルナッツDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。 In addition, when PCR primers for detecting beach nuts (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 3 and 4) were used, an amplification product of about 75 bp was confirmed only when beach nut (beech, canine beech) DNA was used, and was determined to be positive. (Table 1). Relatives of chestnut (Japanese chestnut, Chinese mitten, European american, chincapin) DNA, shii DNA, acorn (Shirakashi) DNA, pecan nut DNA, hickory nut DNA, walnut (US, French) DNA, hazelnut DNA, Use of other species DNA, including other plants, was negative (Table 1).
また、ブラジルナッツ検出用PCRプライマー（配列番号5及び6からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ブラジルナッツDNAを使用した場合のみ91bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるシアナッツDNA、ミラクルフルーツDNA、カキDNA、茶DNA、キウイフルーツDNA、ブルーベリーDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。 In addition, when a Brazil nut detection PCR primer (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 5 and 6) was used, an amplification product of about 91 bp was confirmed only when Brazil nut DNA was used, and was determined to be positive (Table 1). ). Negative results were obtained using the related species, shea nut DNA, miracle fruit DNA, oyster DNA, tea DNA, kiwi fruit DNA, blueberry DNA, and other species DNA, including other plants (Table 1). ).
また、カシューナッツ検出用PCRプライマー（配列番号7及び8からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、カシューナッツ（インド産、ベトナム産）DNAを使用した場合のみ102bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるピスタチオ（イラン産、アメリカ産）DNA、マンゴーDNA、ピンクペッパーDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。 In addition, when a cashew nut detection PCR primer (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 7 and 8) was used, an amplification product of around 102 bp was confirmed only when cashew nut (Indian and Vietnamese) DNA was used, and was determined to be positive. (Table 1). Negative results were obtained using closely related pistachio (Iranian and American) DNA, mango DNA, pink pepper DNA, and other species DNA, including other plants (Table 1).
また、クリ検出用PCRプライマー（配列番号9及び10からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、クリ（和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン）DNAを使用した場合のみ293bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるビーチナッツ（ブナ、イヌブナ）DNA、シイDNA、ドングリ（シラカシ）DNA、ピーカンナッツDNA、ヒッコリーナッツDNA、クルミ（アメリカ産、フランス産）DNA、ヘーゼルナッツDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。 In addition, when PCR primers for chestnut detection (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 9 and 10) were used, an amplification product of around 293 bp was confirmed only when chestnut (Waguri, Chugogoku, European guri, tincapin) DNA was used. , Was determined to be positive (Table 1). Includes closely related beach nut (beech, cane beech) DNA, shii DNA, acorn (silk oak) DNA, pecan nut DNA, hickory nut DNA, walnut (US and French) DNA, hazelnut DNA, and other plants It was negative when other species DNA was used (Table 1).
また、ココナッツ検出用PCRプライマー（配列番号11及び12からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ココナッツDNAを使用した場合のみ224bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるナツメヤシDNA、アサイーDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。 When a coconut detection PCR primer (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 11 and 12) was used, an amplification product of around 224 bp was confirmed only when coconut DNA was used, and was determined to be positive (Table 1). The results were negative when the related species, such as date palm DNA and acai DNA, and DNA of other species including other plants were used (Table 1).
また、銀杏検出用PCRプライマー（配列番号13及び14からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、銀杏DNAを使用した場合のみ186bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。 In addition, when a ginkgo detection PCR primer (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 13 and 14) was used, an amplification product of around 186 bp was confirmed only when ginkgo DNA was used, and was determined to be positive (Table 1). Use of other species DNA, including other plants, was negative (Table 1).
また、ヘーゼルナッツ検出用PCRプライマー（配列番号15及び16からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ヘーゼルナッツDNAを使用した場合のみ361bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるピーカンナッツDNA、ヒッコリーナッツDNA、クルミ（アメリカ産、フランス産）DNA、クリ（和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン）DNA、ビーチナッツ（ブナ、イヌブナ）DNA、シイDNA、ドングリ（シラカシ）DNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。 When a hazelnut detection PCR primer (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 15 and 16) was used, an amplification product of about 361 bp was confirmed only when hazelnut DNA was used, and the product was determined to be positive (Table 1). Closely related pecan nut DNA, hickory nut DNA, walnut (American and French) DNA, chestnut (Japanese chestnut, Chinese gourd, European gourd, chinkapin) DNA, beach nut (beech, dogwood) DNA, sea bass DNA, acorn (Shirakashi) DNA and other species DNA including other plants were negative (Table 1).
また、ヒッコリーナッツ検出用PCRプライマー（配列番号17及び18からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ヒッコリーナッツ（オーバータヒッコリー）DNA、ピーカンナッツDNAを使用した場合のみ543bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるクルミ（アメリカ産、フランス産）DNA、クリ（和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン）DNA、ビーチナッツ（ブナ、イヌブナ）DNA、ヘーゼルナッツDNA、シイDNA、ドングリ（シラカシ）DNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。 In addition, when PCR primers for detecting hickory nuts (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 17 and 18) were used, amplification products of around 543 bp were confirmed only when hickory nut (overta hickory) DNA and pecan nut DNA were used. , Was determined to be positive (Table 1). Closely related walnut (American and French) DNA, chestnut (Japanese chestnut, Chinese auricularia, European auricles, chincapin) DNA, beach nut (beech, dogwood) DNA, hazelnut DNA, shii DNA, acorn (silk) DNA, The results were negative when DNA of other species including other plants was used (Table 1).
また、ライチ検出用PCRプライマー（配列番号19及び20からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ライチDNAを使用した場合のみ162bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるランブータンDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。 In addition, when a lychee detection PCR primer (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 19 and 20) was used, an amplification product of about 162 bp was confirmed only when lychee DNA was used, and was determined to be positive (Table 1). The results were negative when the related species Rambutan DNA and other species DNA including other plants were used (Table 1).
また、マカダミアナッツ検出用PCRプライマー（配列番号21及び22からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、マカダミアナッツ（オーストラリア産、ケニア産）DNAを使用した場合のみ111bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるレンコンDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。 In addition, when a PCR primer for detecting macadamia nuts (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 21 and 22) was used, an amplification product of about 111 bp was confirmed only when macadamia nut (Australia and Kenya) DNA was used, and was positive. (Table 1). Negative results were obtained when the related species, lotus root DNA, or other species DNA including other plants were used (Table 1).
また、ピーカンナッツ検出用PCRプライマー（配列番号23及び24からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ピーカンナッツDNAを使用した場合のみ468bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるヒッコリーナッツ（オーバータヒッコリー）DNA、クルミ（アメリカ産、フランス産）DNA、クリ（和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン）DNA、ビーチナッツ（ブナ、イヌブナ）DNA、ヘーゼルナッツDNA、シイDNA、ドングリ（シラカシ）DNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。 In addition, when a pecan nut detection PCR primer (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 23 and 24) was used, an amplification product of about 468 bp was confirmed only when pecan nut DNA was used, and was determined to be positive (Table 1). ). Closely related species are hickory nut (overta hickory) DNA, walnut (US and France) DNA, chestnut (waguri, Chinese auricularia, European ginseng, chinkapin) DNA, beach nut (beech and dogwood) DNA, hazelnut DNA, Negative results were obtained when stalk DNA, acorn (silk oak) DNA, and DNA of other species including other plants were used (Table 1).
また、松の実検出用PCRプライマー（配列番号25及び26からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、松の実DNAを使用した場合のみ139bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。 In addition, when a pine nut detection PCR primer (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 25 and 26) was used, an amplification product of about 139 bp was confirmed only when pine nut DNA was used, and was determined to be positive ( table 1). Use of other species DNA, including other plants, was negative (Table 1).
また、ピリナッツ検出用PCRプライマー（配列番号27及び28からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ピリナッツDNAを使用した場合のみ83bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるカシューナッツ（インド産、ベトナム産）DNA、ピスタチオ（イラン産、アメリカ産）DNA、マンゴーDNA、ピンクペッパーDNA、ライチDNA、ランブータンDNA、オレンジDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。 When a PCR primer for detecting pili nut (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 27 and 28) was used, an amplification product of about 83 bp was confirmed only when pirinut DNA was used, and was determined to be positive (Table 1). Related species include cashew nut (Indian and Vietnamese) DNA, pistachio (Iranian and American) DNA, mango DNA, pink pepper DNA, lychee DNA, rambutan DNA, orange DNA, and other plants, including other plants. The results were negative when species DNA was used (Table 1).
また、ピスタチオ検出用PCRプライマー（配列番号29及び30からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ピスタチオ（イラン産、アメリカ産）DNAを使用した場合のみ163bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるカシューナッツ（インド産、ベトナム産）DNA、マンゴーDNA、ピンクペッパーDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。 Also, when PCR primers for detecting pistachio (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 29 and 30) were used, an amplification product of around 163 bp was confirmed only when pistachio (Iran, USA) DNA was used, and was determined to be positive. (Table 1). Negative results were obtained using cashew nut (Indian and Vietnamese) DNA, mango DNA, pink pepper DNA, and other species DNA including other plants (Table 1).
また、シアナッツ検出用PCRプライマー（配列番号31及び32からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、シアナッツDNAを使用した場合のみ518bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるミラクルフルーツDNA、ブラジルナッツDNA、、カキDNA、茶DNA、キウイフルーツDNA、ブルーベリーDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。 In addition, when a PCR primer for detecting shea nut (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 31 and 32) was used, an amplification product of about 518 bp was confirmed only when shea nut DNA was used, and was determined to be positive (Table 1). Negative results were obtained using DNA of related species such as miracle fruit DNA, Brazil nut DNA, oyster DNA, tea DNA, kiwifruit DNA, blueberry DNA, and other species DNA including other plants ( table 1).
また、クルミ検出用PCRプライマー（配列番号33及び34からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、クルミ（アメリカ産、フランス産）DNAを使用した場合のみ501bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるピーカンナッツDNA、ヒッコリーナッツ（オーバータヒッコリー）DNA、クリ（和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン）DNA、ビーチナッツ（ブナ、イヌブナ）DNA、ヘーゼルナッツDNA、シイDNA、ドングリ（シラカシ）DNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。 In addition, when the walnut detection PCR primers (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 33 and 34) were used, an amplification product of around 501 bp was confirmed only when walnut (US and France) DNA was used, and was determined to be positive. (Table 1). Closely related species are pecan nut DNA, hickory nut (overta hickory) DNA, chestnut (Japanese chestnut, Chinese gooseberry, European gourd, chinkapin) DNA, beach nut (beech, dogwood) DNA, hazelnut DNA, shii DNA, and acorn (silk oak) A) Negative when DNA or other species DNA, including other plants, was used (Table 1).
実施例2
木の実検出用PCRプライマーセットを用いたPCRの検出感度の確認
実施例1で使用した木の実検出用PCRプライマーセットを用いたPCRの検出感度を調べるために、下記のような実験を実施した。実施例1で調製したアーモンド（アメリカ産）、ビーチナッツ（ブナ）、ブラジルナッツ、カシューナッツ（インド産）、クリ（チュウゴクグリ）、ココナッツ、ヘーゼルナッツ、銀杏、ライチ、マカダミアナッツ（オーストラリア産）、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ（アメリカ産）、シアナッツ、及びクルミ（アメリカ産）の各DNAを滅菌水で希釈し、1 fg/μl、10 fg/μl、100 fg/μl、1 pg/μl、10 pg/μl、100 pg/μl のDNA溶液の希釈系列を作製し、これらの希釈した被験DNA液の1 μLを、実施例1に記載したPCR反応条件で、PCRに供した。PCR反応後、増幅産物の有無をアガロースゲル電気泳動によって確認した。
Example 2
Confirmation of PCR detection sensitivity using PCR primer set for detecting tree nuts The following experiment was performed to examine the detection sensitivity of PCR using the PCR primer set for detecting tree nuts used in Example 1. Almond (American), Beach nut (Buna), Brazil nut, Cashew nut (India), Chestnut (Cherry), Coconut, Hazelnut, Ginkgo, Lychee, Macadamia nut (Australia), Pecan nut prepared in Example 1 , Pine nuts, pili nuts, pistachios (US), shea nuts, and walnuts (US) are diluted in sterile water, 1 fg / μl, 10 fg / μl, 100 fg / μl, 1 pg / μl , 10 pg / μl and 100 pg / μl of a DNA series were prepared, and 1 μL of the diluted test DNA solution was subjected to PCR under the PCR reaction conditions described in Example 1. After the PCR reaction, the presence or absence of the amplification product was confirmed by agarose gel electrophoresis.
図1に示すように、アーモンド検出用PCRプライマー（配列番号1及び2からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ビーチナッツ検出用PCRプライマー（配列番号3及び4からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、10 fg DNA/分析であり、ブラジルナッツ検出用PCRプライマー（配列番号5及び6からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、カシューナッツ検出用PCRプライマー（配列番号7及び8からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、1 ｐg DNA/分析であり、クリ検出用PCRプライマー（配列番号9及び10からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、1 pg DNA/分析であり、ココナッツ検出用PCRプライマー（配列番号11及び12からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 pg DNA/分析であり、銀杏検出用PCRプライマー（配列番号13及び14からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ヘーゼルナッツ検出用PCRプライマー（配列番号15及び16からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ヒッコリーナッツ検出用PCRプライマー（配列番号17及び18からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ライチ検出用PCRプライマー（配列番号19及び20からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、マカダミアナッツ検出用PCRプライマー（配列番号21及び22からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ピーカンナッツ検出用PCRプライマー（配列番号23及び24からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、10 fg DNA/分析であり、松の実検出用PCRプライマー（配列番号25及び26からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ピリナッツ検出用PCRプライマー（配列番号27及び28からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ピスタチオ検出用PCRプライマー（配列番号29及び30からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、シアナッツ検出用PCRプライマー（配列番号31及び32からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、10 fg DNA/分析であり、クルミ検出用PCRプライマー（配列番号33及び34からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、1 fg DNA/分析であった。 As shown in FIG. 1, the detection sensitivity when using the almond detection PCR primer (PCR primer set consisting of SEQ ID NOS: 1 and 2) is 100 fg DNA / analysis, and the beach nut detection PCR primer (SEQ ID NO: The detection sensitivity when using the PCR primer set consisting of 3 and 4) is 10 fg DNA / analysis, and the detection using the PCR primer for detecting Brazil nuts (the PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 5 and 6). The sensitivity is 100 fg DNA / analysis, and the detection sensitivity when using the PCR primer for detecting cashew nuts (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 7 and 8) is 1 pg DNA / analysis, and the PCR primer for chestnut detection The detection sensitivity when using (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 9 and 10) is 1 pg DNA / analysis, and the PCR primer for coconut detection (PC consisting of SEQ ID NOs: 11 and 12) R primer set), the detection sensitivity is 100 pg DNA / analysis, and the detection sensitivity when using Ginkgo detection PCR primers (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 13 and 14) is 100 fg DNA The detection sensitivity when using the hazelnut detection PCR primer (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 15 and 16) was 100 fg DNA / analysis, and the hickory nut detection PCR primer (SEQ ID NOs: 17 and 16). The detection sensitivity when using the PCR primer set consisting of 18) is 100 fg DNA / analysis, and the detection sensitivity when using the PCR primer for litchi detection (the PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 19 and 20) is as follows. The detection sensitivity is 100 fg DNA / analysis when using the PCR primer for detecting macadamia nuts (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 21 and 22). In addition, the detection sensitivity when using the PCR primer for pecan nut detection (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 23 and 24) is 10 fg DNA / analysis, and the PCR primer for detecting pine nuts (SEQ ID NOs: 25 and 26) Is 100 fg DNA / analysis, and the detection sensitivity when using PCR primers for detecting peanuts (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 27 and 28) is 100 fg DNA / analysis. fg DNA / analysis, and the detection sensitivity when using the pistachio detection PCR primer (PCR primer set consisting of SEQ ID NOS: 29 and 30) was 100 fg DNA / analysis, and the shea nut detection PCR primer (SEQ ID NO: 31) The detection sensitivity when using a PCR primer set consisting of PCR primers consisting of PCR primers consisting of SEQ ID NOs: 33 and 34 is 10 fg DNA / analysis. The detection sensitivity when using (1) was 1 fg DNA / analysis.
実施例3
木の実検出用PCRプライマーセットを用いたPCRによる木の実含有食品中の木の実由来DNAの検出
各種木の実を原料として含有する市販食品等に対する本発明の木の実検出用PCRプライ
マーセットを用いたPCR分析を下記のように行い、本発明の実用性を検討した。
Example 3
Detection of DNA derived from nuts in nut-containing foods by PCR using PCR primer set for detecting nuts PCR analysis using the PCR primer set for detecting nuts of the present invention for commercial foods containing various nuts as a raw material is as follows. And examined the practicality of the present invention.
各種木の実を原料として含有することが明記されている市販食品（表2）を準備し、10〜100 gをマルチビーズショッカーで粉砕した。その混合破砕物の2 gから各々のDNAをGenomic-tip 20/G kitを用いて抽出した。抽出時には、RNA分解酵素によるRNAの除去操作も実施した。抽出した食品試料DNA量を測定後、滅菌水を用いて、食品試料DNAの濃度を10 ng/μLに調製した。なお、ビーチナッツ、ヒッコリーナッツ、およびシアナッツを原料として含有する市販食品の入手が困難であったため、代替試料として、ココナッツサブレ（日清シスコ）DNA溶液（10 ng/μL）に各DNAを10 pg/μLの濃度で添加したものを使用した。これらの調製DNA液の5 μLを、実施例1で使用した木の実検出用PCRプライマーセットを用い、実施例1に記載したPCR反応条件で、PCRに供した。蛍光量から増幅が確認された場合は、2%（wt/vol）アガロースゲル電気泳動によってPCR増幅産物（反応液の5 μL）を分離し、Gel DOC EZ（Bio Rad）を用いて増幅産物を視覚化することによって、増幅産物の有無を確認した。分子量マーカーとしてOneMARK 100（GeneDireX）を使用した。電気泳動により標的サイズの増幅産物が検出された場合を、PCR反応陽性と判定した。これらのPCRの結果を表2に記載した。表中の＋（プラス）はPCR反応陽性を示し、−（マイナス）はPCR反応陰性を示す。さらに、食品試料DNAから増幅されたPCR増幅産物を、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit（Applied Biosystems社）を用いて、両方向からダイレクトシーケンス後、Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社）によって塩基配列を分析した。分析した塩基配列データをGenBank nucleotide sequence database（BLAST search）もしくは、発明者らが保有するDNAデータベースと比較解析し、その塩基配列の類似性に基づいて、PCR増幅産物由来DNAの生物種を帰属・同定した。 Commercial foods (Table 2), which are specified to contain various nuts as raw materials, were prepared, and 10 to 100 g were pulverized with a multi-beads shocker. Each DNA was extracted from 2 g of the mixed crushed product using a Genomic-tip 20 / G kit. At the time of extraction, an operation of removing RNA with an RNase was also performed. After measuring the amount of extracted food sample DNA, the concentration of the food sample DNA was adjusted to 10 ng / μL using sterilized water. As it was difficult to obtain commercial foods containing beach nuts, hickory nuts, and shea nuts as raw materials, 10 pg of each DNA was added to a coconut sable (Nissin Cisco) DNA solution (10 ng / μL) as an alternative sample. A solution added at a concentration of / μL was used. 5 μL of these prepared DNA solutions were subjected to PCR under the PCR reaction conditions described in Example 1 using the PCR primer set for detecting nuts used in Example 1. If amplification was confirmed by the amount of fluorescence, the PCR amplification product (5 μL of the reaction solution) was separated by 2% (wt / vol) agarose gel electrophoresis, and the amplification product was separated using Gel DOC EZ (Bio Rad). The presence or absence of the amplification product was confirmed by visualization. OneMARK 100 (GeneDireX) was used as a molecular weight marker. When an amplification product of the target size was detected by electrophoresis, it was determined that the PCR reaction was positive. The results of these PCRs are shown in Table 2. In the table, + (plus) indicates a positive PCR reaction, and-(minus) indicates a negative PCR reaction. Furthermore, the PCR amplification product amplified from the food sample DNA was directly sequenced from both directions using the BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems), and then subjected to the nucleotide sequence using an Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Was analyzed. The analyzed nucleotide sequence data is compared and analyzed with the GenBank nucleotide sequence database (BLAST search) or the DNA database owned by the inventors, and based on the similarity of the nucleotide sequence, the species of the DNA derived from the PCR amplification product is assigned. Identified.
その結果、アーモンド検出用PCRプライマー（配列番号1及び2からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、アーモンド含有食品である、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）及びプチチョコリーフパイ（エル・マドロン）由来DNAにおいてのみ、515bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）及びプチチョコリーフパイ（エル・マドロン）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、アーモンドのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、アーモンド非含有食品試料からアーモンド由来DNAやその他のDNAを検出しないが、アーモンド含有食品試料からアーモンド由来DNAを特異的に検出できることを確認した。 As a result, when the almond-detecting PCR primers (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 1 and 2) were used, the DNAs derived from the almond-containing foods, Realy Natty Muesli (Dorset Cereal) and Petit Choco Leaf Pie (El Madron) Only in, an amplification product of about 515 bp was confirmed, and was determined to be positive. The results were negative when DNA from other food samples was used (Table 2). As a result of the nucleotide sequence analysis of the PCR amplification product, the nucleotide sequence of the PCR amplification product amplified from the DNA derived from Lear Naty Muesli (Dorset Cereal) and Petit Chocolate Leaf Pie (El Madron) matches the ITS nucleotide sequence of almond. did. That is, PCR using the PCR primers does not detect almond-derived DNA or other DNA from an almond-free food sample in a plurality of commercially available foods, but can specifically detect almond-derived DNA from an almond-containing food sample. confirmed.
また、ビーチナッツ検出用PCRプライマー（配列番号3及び4からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、ビーチナッツ含有食品の代替試料［50pgビーチナッツDNAを添加したココナッツサブレ(日清シスコ)］由来DNAにおいてのみ、75 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、ビーチナッツ含有食品の代替試料由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ビーチナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ビーチナッツ非含有食品試料からビーチナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ビーチナッツ非含有食品中に添加された微量のビーチナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。 In addition, when PCR primers for detecting beach nuts (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 3 and 4) are used, they are derived from an alternative sample of beach nut-containing food [coconut sable (Nissin Cisco) with 50 pg beach nut DNA added). Only in DNA, an amplification product of about 75 bp was confirmed, and it was determined to be positive. The results were negative when DNA from other food samples was used (Table 2). As a result of the nucleotide sequence analysis of the PCR amplification product, the nucleotide sequence of the PCR amplification product amplified from the DNA derived from the alternative sample of the beach nut-containing food coincided with the ITS nucleotide sequence of the beach nut. That is, the PCR using the PCR primers does not detect beachnut-derived DNA or other DNA from a beachnut-free food sample in a plurality of commercially available foods, but a trace amount of beach added to the beachnut-free food. It was confirmed that nut-derived DNA could be specifically detected.
また、ブラジルナッツ検出用PCRプライマー（配列番号5及び6からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ブラジルナッツ含有食品である、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）由来DNAにおいてのみ、91bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ブラジルナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ブラジルナッツ非含有食品試料からブラジルナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ブラジルナッツ含有食品試料からブラジルナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。 In addition, when a PCR primer for detecting Brazil nuts (a PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 5 and 6) is used, an amplification product of about 91 bp only in DNA derived from Brazilian nut-containing food, Lear Naty Muesli (Dorset cereal) Was confirmed and determined to be positive. The results were negative when DNA from other food samples was used (Table 2). In addition, as a result of the nucleotide sequence analysis of the PCR amplification product, the nucleotide sequence of the PCR amplification product amplified from the DNA derived from Learnay Muesli (Dorset cereal) was consistent with the ITS nucleotide sequence of Brazil nut. That is, PCR using the PCR primers does not detect Brazil nut-derived DNA or other DNA from a Brazil nut-free food sample in a plurality of commercially available foods, but specifically detects Brazil nut-derived DNA from a Brazil nut-containing food sample. It was confirmed that it could be detected.
また、カシューナッツ検出用PCRプライマー（配列番号7及び8からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、カシューナッツ含有食品である、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）及びトリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）由来DNAにおいてのみ、102bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）及びトリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、カシューナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、カシューナッツ非含有食品試料からカシューナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、カシューナッツ含有食品試料からカシューナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。 In addition, when a PCR primer for detecting cashew nuts (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 7 and 8) is used, cashew nut-containing foods, DNA derived from real nutty muesli (dorset cereal) and triple nut chocolate (merry chocolate campanie) Only in, an amplification product of around 102 bp was confirmed and determined to be positive. The results were negative when DNA from other food samples was used (Table 2). In addition, as a result of the nucleotide sequence analysis of the PCR amplification product, the nucleotide sequence of the PCR amplification product amplified from the DNA derived from Lear Naty Muesli (Dorset Cereal) and Triple Nut Chocolate (Mary Chocolate Kampanee) matches the ITS nucleotide sequence of cashew nut did. That is, PCR using the PCR primers does not detect cashew nut-derived DNA or other DNA from a cashew nut-free food sample in a plurality of commercially available foods, but can specifically detect cashew nut-derived DNA from a cashew nut-containing food sample. confirmed.
また、クリ検出用PCRプライマー（配列番号9、及び10からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、クリ含有食品である、栗饅頭（山久YK）由来DNAにおいてのみ、293bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、栗饅頭（山久YK）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、クリのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、クリ非含有食品試料からクリ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、含有食品試料からクリ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。 When PCR primers for chestnut detection (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 9 and 10) were used, amplification products of around 293 bp were confirmed only in chestnut-containing food, DNA derived from chestnut bun (Yamakyu YK). Was determined to be positive. The results were negative when DNA from other food samples was used (Table 2). As a result of the nucleotide sequence analysis of the PCR amplification product, the nucleotide sequence of the PCR amplification product amplified from the DNA derived from chestnut bun (Yamakyu YK) was consistent with the ITS nucleotide sequence of chestnut. In other words, PCR using the PCR primers did not detect chestnut-derived DNA or other DNA from chestnut-free food samples, but confirmed that chestnut-derived DNA could be specifically detected from contained food samples in multiple commercial foods. did.
また、ココナッツ検出用PCRプライマー（配列番号11及び12からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、ココナッツ含有食品である、トリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）及びココナッツサブレ（日清シスコ）由来DNAにおいてのみ、224bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、トリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）及びココナッツサブレ（日清シスコ）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ココナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ココナッツ非含有食品試料からココナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ココナッツ含有食品試料からココナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。 When coconut detection PCR primers (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 11 and 12) are used, the coconut-containing foods, such as DNA from triple nut chocolate (merry chocolate campanie) and coconut sable (Nissin Cisco), are used. Only in this case, an amplification product of about 224 bp was confirmed, and was determined to be positive. The results were negative when DNA from other food samples was used (Table 2). As a result of the nucleotide sequence analysis of the PCR amplification product, the nucleotide sequence of the PCR amplification product amplified from DNA derived from triple nut chocolate (Merry Chocolate Kampanee) and coconut sable (Nisshin Cisco) was consistent with the coconut ITS nucleotide sequence. . That is, PCR using the PCR primers does not detect coconut-derived DNA or other DNA from a coconut-free food sample in a plurality of commercially available foods, but can specifically detect coconut-derived DNA from a coconut-containing food sample. confirmed.
また、銀杏検出用PCRプライマー（配列番号13及び14からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、銀杏含有食品である、ぎんなん羊羹（山岸モータース）由来DNAにおいてのみ、186bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、ぎんなん羊羹（山岸モータース）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、銀杏のクロロプラストmatK遺伝子配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、銀杏非含有食品試料から銀杏由来DNAやその他のDNAを検出しないが、銀杏含有食品試料から銀杏由来DNAを特異的に検出できることを確認した。 When a PCR primer set for detecting ginkgo (a PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 13 and 14) was used, an amplification product of around 186 bp was confirmed only in the DNA derived from Ginkgo-containing yokan (Yamagishi Motors). Was determined to be positive. The results were negative when DNA from other food samples was used (Table 2). As a result of the nucleotide sequence analysis of the PCR amplification product, the nucleotide sequence of the PCR amplification product amplified from the DNA derived from Ginnan Yokan (Yamagishi Motors) was consistent with the Ginkgo chloroplast matK gene sequence. That is, PCR using the PCR primers does not detect ginkgo-derived DNA or other DNA from a ginkgo-free food sample in a plurality of commercial foods, but can specifically detect ginkgo-derived DNA from a ginkgo-containing food sample. confirmed.
また、ヘーゼルナッツ検出用PCRプライマー（配列番号15及び16からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、ヘーゼルナッツ含有食品である、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）由来DNAにおいてのみ、361bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ヘーゼルナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ヘーゼルナッツ非含有食品試料からヘーゼルナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ヘーゼルナッツ含有食品試料からヘーゼルナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。 When a hazelnut-detecting PCR primer (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 15 and 16) was used, an amplification product of about 361 bp was obtained only in DNA derived from real nutty muesli (dorset cereal), which is a hazelnut-containing food. It was confirmed and determined to be positive. The results were negative when DNA from other food samples was used (Table 2). In addition, as a result of the nucleotide sequence analysis of the PCR amplification product, the nucleotide sequence of the PCR amplification product amplified from the DNA derived from the real nutty muesli (Dorset cereal) was consistent with the ITS nucleotide sequence of hazelnut. That is, the PCR using the PCR primers does not detect hazelnut-derived DNA or other DNA from a hazelnut-free food sample in a plurality of commercially available foods, but can specifically detect hazelnut-derived DNA from a hazelnut-containing food sample. confirmed.
また、ヒッコリーナッツ検出用PCRプライマー（配列番号17及び18からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、ヒッコリーナッツ含有食品の代替試料［50pgヒッコリーナッツDNAを添加したココナッツサブレ（日清シスコ）］由来DNA、及びピーカンナッツ含有食品であるトリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）においてのみ、543 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、ヒッコリーナッツ含有食品の代替試料由来DNA及びトリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ヒッコリーナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ヒッコリーナッツ非含有食品試料からヒッコリー由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ピーカンナッツ含有食品試料、及びヒッコリーナッツ非含有食品中に添加された微量のヒッコリーナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。 When a PCR primer for detecting hickory nuts (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 17 and 18) is used, it is derived from a substitute sample of a food containing hickory nuts [coconut sable with 50 pg hickory nut DNA (Nissin Cisco)]. Only in DNA and triple nut chocolate (merry chocolate campanie), which is a pecan nut-containing food, an amplification product of about 543 bp was confirmed and determined to be positive. The results were negative when DNA from other food samples was used (Table 2). As a result of the base sequence analysis of the PCR amplification product, the base sequence of the PCR amplification product amplified from the DNA derived from the alternative sample of the food containing hickory nuts and the DNA derived from the triple nut chocolate (Merry Chocolate Campany) is the ITS base sequence of the hickory nut. And matched. That is, PCR using the PCR primers does not detect hickory-derived DNA or other DNA from a hickory nut-free food sample in a plurality of commercially available foods, but does not detect pecan nut-containing food samples and hickory nut-free foods. It was confirmed that the added trace of hickory nut-derived DNA could be specifically detected.
また、ライチ検出用PCRプライマー（配列番号19及び20からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、ライチ含有食品である、フルーツセラピー ホワイトピーチ（フジッコ）由来DNAにおいてのみ、162bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、フルーツセラピー ホワイトピーチ（フジッコ）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ライチのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ライチ非含有食品試料からライチ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ライチ含有食品試料からライチ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。 In addition, when PCR primers for detecting litchi (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 19 and 20) were used, amplification products of around 162 bp were confirmed only in DNA from lychee-containing food, Fruit Therapy White Peach (Fujikko). Was determined to be positive. The results were negative when DNA from other food samples was used (Table 2). As a result of the nucleotide sequence analysis of the PCR amplification product, the nucleotide sequence of the PCR amplification product amplified from the DNA derived from Fruit Therapy White Peach (Fujico) was consistent with the ITS nucleotide sequence of Litchi. That is, PCR using the PCR primers does not detect lychee-derived DNA or other DNA from lychee-free food samples, but can specifically detect litchi-derived DNA from lychee-containing food samples in a plurality of commercially available foods. confirmed.
また、マカダミアナッツ検出用PCRプライマー（配列番号21及び22からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、マカダミアナッツ含有食品である、プチチョコリーフパイ（エル・マドロン）由来DNAにおいてのみ、111bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、プチチョコリーフパイ（エル・マドロン）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、マカダミアナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、マカダミアナッツ非含有食品試料からマカダミアナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、マカダミアナッツ含有食品試料からマカダミアナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。 In addition, when a PCR primer for detecting macadamia nuts (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 21 and 22) is used, an amplification product of about 111 bp only in DNA derived from a petite chocolate leaf pie (El Madron), a food containing macadamia nuts Was confirmed and determined to be positive. The results were negative when DNA from other food samples was used (Table 2). In addition, as a result of the nucleotide sequence analysis of the PCR amplification product, the nucleotide sequence of the PCR amplification product amplified from the DNA derived from Petit Chocolate Leaf Pie (El Madron) was consistent with the ITS nucleotide sequence of macadamia nut. That is, PCR using the PCR primers does not detect macadamia nut-derived DNA or other DNA from a macadamia nut-free food sample in a plurality of commercial foods, but specifically detects macadamia nut-derived DNA from a macadamia nut-containing food sample. It was confirmed that it could be detected.
また、ピーカンナッツ検出用PCRプライマー（配列番号23及び24からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、ピーカンナッツ含有食品であるトリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）においてのみ、468 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、トリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ピーカンナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ピーカンナッツ非含有食品試料からピーカンナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ピーカンナッツ含有食品試料からピーカンナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。 In addition, when a PCR primer for pecan nut detection (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 23 and 24) was used, an amplification product of about 468 bp was obtained only in triple nut chocolate (merry chocolate campanie), which is a pecan nut-containing food. It was confirmed and determined to be positive. The results were negative when DNA from other food samples was used (Table 2). In addition, as a result of the nucleotide sequence analysis of the PCR amplification product, the nucleotide sequence of the PCR amplification product amplified from the DNA derived from triple nut chocolate (Merry Chocolate Campani) was consistent with the ITS nucleotide sequence of pecan nut. That is, PCR using the PCR primers does not detect pecan nut-derived DNA or other DNA from pecan nut-free food samples in a plurality of commercially available foods, but specifically detects pecan nut-derived DNA from pecan nut-containing food samples. It was confirmed that it could be detected.
また、松の実検出用PCRプライマー（配列番号25及び26からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、松の実含有食品であるまぜるだけのスパゲッティソース バジル（エスビー食品）においてのみ、139 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、まぜるだけのスパゲッティソース バジル（エスビー食品）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、松の実のITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、松の実非含有食品試料から松の実由来DNAやその他のDNAを検出しないが、松の実含有食品試料から松の実由来DNAを特異的に検出できることを確認した。 When pine nut detection PCR primers (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 25 and 26) are used, only 139 bp of spaghetti sauce basil (Sb food), which is a pine nut-containing food, is mixed. Was confirmed as positive. The results were negative when DNA from other food samples was used (Table 2). In addition, as a result of the nucleotide sequence analysis of the PCR amplification product, the nucleotide sequence of the PCR amplification product amplified from the DNA derived from spaghetti sauce basil (SB food), which was merely mixed, was consistent with the ITS nucleotide sequence of pine nuts. That is, PCR using the PCR primers does not detect pine nut-derived DNA or other DNA from pine nut-free food samples in a plurality of commercially available foods, but does not detect pine nut-derived DNA samples from pine nut-containing food samples. It was confirmed that DNA could be specifically detected.
また、ピリナッツ検出用PCRプライマー（配列番号27及び28からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、ピリナッツ含有食品であるLA2PU CRISPY PILINUT with Garlic（ロイヤルコンツェルン）においてのみ、83 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、LA2PU CRISPY PILINUT with Garlic（ロイヤルコンツェルン）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ピリナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ピリナッツ非含有食品試料からピリナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ピリナッツ含有食品試料からピリナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。 In addition, when PCR primers for detecting peanuts (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 27 and 28) were used, an amplification product of around 83 bp was confirmed only in LA2PU CRISPY PILINUT with Garlic, a peanut-containing food. Was determined to be positive. The results were negative when DNA from other food samples was used (Table 2). As a result of the nucleotide sequence analysis of the PCR amplification product, the nucleotide sequence of the PCR amplification product amplified from the DNA derived from LA2PU CRISPY PILINUT with Garlic (Royal Conzern) was consistent with the ITS nucleotide sequence of pirinut. In other words, PCR using the PCR primers does not detect pilinut-derived DNA or other DNA from pirinut-free food samples in a plurality of commercially available foods, but can specifically detect pilinut-derived DNA from pilinut-containing food samples. confirmed.
また、ピスタチオ検出用PCRプライマー（配列番号29及び30からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ピスタチオ含有食品である、プチチョコリーフパイ（エル・マドロン）由来DNAにおいてのみ、163bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、プチチョコリーフパイ（エル・マドロン）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ピスタチオのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ピスタチオ非含有食品試料からピスタチオ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ピスタチオ含有食品試料からピスタチオ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。 In addition, when PCR primers for detecting pistachios (PCR primer sets consisting of SEQ ID NOs: 29 and 30) were used, an amplification product of about 163 bp was confirmed only in pistachio-containing food, DNA from Petit Chocolate Leaf Pie (El Madron). Was determined to be positive. The results were negative when DNA from other food samples was used (Table 2). As a result of the nucleotide sequence analysis of the PCR amplification product, the nucleotide sequence of the PCR amplification product amplified from the DNA derived from Petit Chocolate Leaf Pie (El Madron) was identical to the pistachio ITS nucleotide sequence. That is, PCR using the PCR primers does not detect pistachio-derived DNA or other DNA from pistachio-free food samples in a plurality of commercially available foods, but can specifically detect pistachio-derived DNA from pistachio-containing food samples. confirmed.
また、シアナッツ検出用PCRプライマー（配列番号31及び32からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、シアナッツ含有食品の代替試料［50pgシアナッツDNAを添加したココナッツサブレ（日清シスコ）］由来DNAにおいてのみ、518 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、シアナッツ含有食品の代替試料由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、シアナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、シアナッツ非含有食品試料からシアナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、シアナッツ非含有食品中に添加された微量のシアナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。 In addition, when a PCR primer set for detecting shea nuts (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 31 and 32) is used, only DNA derived from an alternative sample of a food containing shea nuts [coconut sable (Nissin Cisco) with 50 pg shea nut DNA added) is used. Amplification products of about 518 bp were confirmed and determined to be positive. The results were negative when DNA from other food samples was used (Table 2). As a result of the base sequence analysis of the PCR amplification product, the base sequence of the PCR amplification product amplified from the DNA derived from the alternative sample of the shea nut-containing food coincided with the ITS base sequence of the shea nut. That is, PCR using the PCR primers does not detect shea nut-derived DNA or other DNA from a shea nut-free food sample in a plurality of commercially available foods, but removes traces of shea nut-derived DNA added to the shea nut-free food. It was confirmed that it could be specifically detected.
また、クルミ検出用PCRプライマー（配列番号33及び34からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、クルミ含有食品である、あずきくるみデニッシュ（敷島製パン）由来DNAにおいてのみ、501bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、あずきくるみデニッシュ（敷島製パン）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、クルミのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、クルミ非含有食品試料からクルミ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、クルミ含有食品試料からクルミ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。 In addition, when using walnut detection PCR primers (PCR primer set consisting of SEQ ID NOs: 33 and 34), amplification products of around 501 bp were confirmed only in walnut-containing food, DNA derived from Azuki Kurumi Danish (Shikishima bread). Was determined to be positive. The results were negative when DNA from other food samples was used (Table 2). As a result of the nucleotide sequence analysis of the PCR amplification product, the nucleotide sequence of the PCR amplification product amplified from the DNA derived from Azuki Kurumi Danish (Shikishima bread) was consistent with the ITS nucleotide sequence of walnut. In other words, PCR using the PCR primers does not detect walnut-derived DNA or other DNA from a walnut-free food sample, but can specifically detect walnut-derived DNA from a walnut-containing food sample, in a plurality of commercially available foods. confirmed.
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