JP6650315B2 - 耐熱性セロビオハイドロラーゼ - Google Patents

Description

本発明は、耐熱性セロビオハイドロラーゼ、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチド、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体及び当該耐熱性セロビオハイドロラーゼを用いたセルロース分解物の製造方法に関する。

地球温暖化や大気汚染などの環境上の問題に加えて、原油価格の大幅上昇や近い将来の原油枯渇予想（ピークオイル）などの輸送用エネルギー供給に関わる懸念から、近年、石油代替エネルギー開発は非常に重要な課題である。植物バイオマス、若しくはリグノセルロースは、地球上に最も豊富にある再生可能エネルギー源であり、石油代替資源として期待されている。植物バイオマス乾燥重量の主要構成要素は、セルロースやヘミセルロース等の多糖類とリグニンから成るリグノセルロースである。例えば、多糖類は、グリコシド加水分解酵素であるセルラーゼやヘミセルラーゼによってグルコースやキシロースなどの単糖に加水分解された後、バイオ燃料や化成品の原料として利用される。

リグノセルロースは複雑な構造を持ち、難分解性であり、単一のグリコシド加水分解酵素では分解、糖化が難しい。リグノセルロースの全分解には、一般的に、エンドグルカナーゼ（セルラーゼ又はエンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、ＥＣ ３．２．１．４）、エキソ型のセロビオハイドロラーゼ（１，４−β−セロビオシダーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、ＥＣ ３．２．１．９１、ＥＣ ３．２．１．１７６）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２１）の３種の酵素が必要とされ、その他にも、ヘミセルラーゼであるキシラナーゼ（エンド−１，４−β−キシラナーゼ、ＥＣ ３．２．１．８）やβ−キシロシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３７）などの他の植物細胞壁分解酵素も含めた複数酵素の適切な配合が必要であると考えられている。

従来のリグノセルロースを資源とするバイオエタノール製造では、エタノールの高エネルギー効率変換を目的として、高固体負荷（３０〜６０％ ｓｏｌｉｄ ｌｏａｄｉｎｇ）による糖化処理が試みられている。このような高固体負荷によるリグノセルロースの酵素糖化は、バイオマス糖化液の粘性が高く、リグノセルロースの加水分解反応が進み難い。そこで、耐熱性酵素を用いて、例えば６５℃以上の高温で酵素糖化処理を行うことにより、加水分解反応速度が上昇することに加えて、バイオマス糖化液の粘性が低下することから、糖化反応時間の短縮及び酵素量の削減が達成できると期待される。また、高温で反応を行うことにより酵素反応中の雑菌の繁殖を防ぐことができるという利点もある。このため、各種グリコシド加水分解酵素について、より耐熱性に優れた酵素の開発が望まれている。

高温環境で機能するセルラーゼについては、これまでに、好熱性糸状菌や好熱性細菌等からの分離が試みられているが、これらの多くはエンドグルカナーゼ活性、キシラナーゼ活性、キシロシダーゼ活性、又はグルコシダーゼ活性を持つ酵素であり、リグノセルロース加水分解プロセスにおいて重要な役割を果たすセロビオハイドロラーゼについては多くはない。例えば、セルロースの非還元末端から加水分解するセロビオハイドロラーゼについては、ＧＨ６ファミリーにおいて、至適温度が７５℃を超えるものが報告されている（例えば、特許文献１参照）。

セロビオハイドロラーゼの中には、セルロースを加水分解する触媒ドメインだけでなく、セルロースへ結合する機能を持つモジュール（ＣＢＭ、ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ）を持つものがある。ＣＢＭはそれ自身分解活性を持たないが、単独でセルロースに結合する能力を有する。ＣＢＭの機能としては、不溶性の基質に吸着することで、基質周辺における触媒ドメインの濃度を上昇させてセルロースの分解速度を向上させたり、ＣＢＭの結合によってセルロース鎖間の水素結合を切り離して結晶構造を崩したりすることが知られている（非特許文献１、２）。また、結晶性セルロースを分解するＣＢＨからＣＢＭを除くと可溶性基質に対する反応性は変わらないにも係わらず、結晶性セルロースに対する分解活性や親和性が極端に低下することから、ＣＢＭは酵素が結晶性セルロースに作用するために必要なドメインであると考えられている（非特許文献３）。

国際公開第２０１４／１５７４９２号

Bolam et al., Biochemical Journal, 1998, vol.331, p.775-781. DIN et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 1994, vol.91, p.11383-11387. Riedel et al., FEMS Microbiology Letters, 1998, vol.164, p.261-267.

本発明は、少なくとも９５℃で、さらにはカルシウムイオン存在下においては１０５℃でセロビオハイドロラーゼ活性を示す、新規なＣＢＭを有する耐熱性セロビオハイドロラーゼ、当該ＣＢＭを有する耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチド、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体及び当該耐熱性セロビオハイドロラーゼを用いたセルロース分解物の製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく、温泉高温土壌から直接ＤＮＡを抽出し、難培養性微生物叢の大規模メタゲノムシーケンスを行うことにより、新規アミノ酸配列を持つ耐熱性セロビオハイドロラーゼの取得に成功し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼ、ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換体、耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法、セルラーゼ混合物及びセルロース分解物の製造方法は、下記［１］〜［１２］である。
［１］ （Ａ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は
（Ｃ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセルロースへ結合する機能を有するポリペプチド、
からなるセルロース結合モチーフ領域と、セロビオハイドロラーゼ触媒領域とを有し、かつ少なくとも９５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有することを特徴とする、耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
［２］ 前記セロビオハイドロラーゼ触媒領域が、
（Ａ２）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１６４位のロイシン残基から５９０位のプロリン残基までの部分配列からなるポリペプチド、又は
（Ｃ２）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１６４位のロイシン残基から５９０位のプロリン残基までの部分配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
からなる、前記［１］の耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
［３］ （Ａ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は
（Ｃ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
からなる、前記［１］の耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
［４］ カルシウムイオン存在下において、少なくとも１０５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有する、前記［１］〜［３］のいずれかの耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
［５］ （ａ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセルロースへ結合する機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｄ１）配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつセルロースへ結合する機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
と、
セロビオハイドロラーゼ触媒活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列と、を有する、ポリヌクレオチド。
［６］ （ａ２）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ２）配列番号３で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｄ２）配列番号４で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも９５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなる、前記［５］のポリヌクレオチド。
［７］ 前記ポリペプチドが、カルシウムイオン存在下において、少なくとも１０５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有する、前記［５］又は［６］のポリヌクレオチド。
［８］ 前記［５］〜［７］のいずれかのポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、セロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
［９］ 前記［８］の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
［１０］ 前記［８］の形質転換体内で、耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産することを含む、耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法。
［１１］ 前記［１］〜［４］のいずれかの耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は前記［５］〜［７］のいずれかのポリヌクレオチドがコードする耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
［１２］ セルロースを含む材料を、前記［１］〜［４］のいずれかの耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記［５］〜［７］のいずれかのポリヌクレオチドがコードする耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は前記［８］に記載の形質転換体に接触させることにより、セルロース分解物を生産することを含む、セルロース分解物の製造方法。

本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、少なくとも９５℃、ｐＨ５．５において、カルシウムイオン存在下においては少なくとも１０５℃、ｐＨ５．５において、セロビオハイドロラーゼ活性を有する。このため、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼは、高温条件下におけるセルロースの糖化処理に好適である。
また、本発明に係るポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造に好適に用いられる。

オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａがコードすると推定されるポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３）と放線菌マイクロビスポーラ・サブスピーシーズのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼのＣＢＭ２領域のアミノ酸配列のアライメント図である。 実施例１において、ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２遺伝子を大腸菌に発現させて得られたＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図であり、図２（Ａ）がＣＢＢ染色の結果、図２（Ｂ）がウェスタンブロッティングの結果である。 実施例１において、ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２遺伝子を大腸菌に発現させて得られたＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２タンパク質と、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＡ遺伝子を大腸菌に発現させて得られたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＡタンパク質の、カルシウムイオン存在下又は非存在下における各温度におけるＰＳＡ加水分解活性（ｐＨ５．５）を計測した結果を示した図である。 実施例１において、ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２遺伝子を大腸菌に発現させて得られたＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２タンパク質と、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＡ遺伝子を大腸菌に発現させて得られたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＡタンパク質の、カルシウムイオン存在下又は非存在下における各温度におけるアビセル加水分解活性（ｐＨ５．５）を計測した結果を示した図である。 実施例１において、ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２遺伝子を大腸菌に発現させて得られたＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２タンパク質と、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＡ遺伝子を大腸菌に発現させて得られたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＡタンパク質が示す、カルシウムイオン存在下又は非存在下における熱変性に伴って引き起こされるＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅの蛍光強度変化を示した図であり、図５（Ａ）が蛍光強度の実測値を、図５（Ｂ）が１階微分「−ｄ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）／ｄｔ」を、それぞれ示す。 実施例１において、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質と、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質にＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２タンパク質のＣＢＭを付加したＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２−１タンパク質の、カルシウムイオン存在下又は非存在下における各温度におけるアビセル加水分解活性（ｐＨ５．５）を計測した結果を示した図である。

［耐熱性セロビオハイドロラーゼ］
糸状菌、細菌、アーキアを含む多くの微生物は難培養性であり、土壌など微生物環境に生息する菌の９９％が未知の菌であるといわれている。特に、高温環境に生息する微生物の培養は極めて困難であり、現在の微生物の単離を目指す培養技術では、自然界から採取された天然サンプル中に生息する微生物の０．１％以下を単離しているにすぎないと考えられている。この微生物の難培養性が、耐熱性セロビオハイドロラーゼの開発が進まない一因である。よって、耐熱性セロビオハイドロラーゼの開発には、従来のような単離培養技術に頼らないアプローチが必要である。

近年、ギガ塩基対の大量配列解読を可能にした次世代シーケンサーが開発されたことにより、土壌等に含まれる微生物叢のゲノムを丸ごと解読することが可能となった。この解析技術を利用して、土壌などの環境サンプルから微生物集団のゲノムＤＮＡを調製し、ゲノム構成が不均一、雑多な集団について直接ゲノムを網羅的に解読し、並列コンピュータにより解読データをアセンブルすることで微生物叢ゲノム配列を再構成するメタゲノム解析法が提案され、難培養性微生物のゲノム解読が急速に進展した。

本発明者らは、後記実施例１に示すように、日本国内において採取した高温温泉土壌から微生物集団のゲノムＤＮＡを調製し、ゲノムＤＮＡのショットガンシーケンス及びアノテーションを行い、既知セロビオハイドロラーゼ酵素と類似したアミノ酸配列を持つオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を得た。得られたＯＲＦの塩基配列情報に基づいてプライマーを設計し、ＰＣＲ法により、高温温泉土壌由来のゲノムＤＮＡから遺伝子候補をクローニングした。ＰＣＲクローニングされたＤＮＡを大腸菌に組込み、当該塩基配列がコードするタンパク質を発現させ、リン酸膨潤アビセル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ ｓｗｏｌｌｅｎ Ａｖｉｃｅｌ、ＰＳＡ）分解活性アッセイによる機能スクリーニングを行った。最終的に、これらのＯＲＦの中からＰＳＡ分解活性を持つ耐熱性セロビオハイドロラーゼ（以下、「ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２」）を得た。ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２のアミノ酸配列を配列番号３に、塩基配列を配列番号４に、それぞれ表す。

ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２は、セロビオハイドロラーゼ触媒領域とＣＢＭ（セルロース結合モジュール）を有する。配列番号３のアミノ酸配列のうち、２位のシステイン残基から１０３位のシステイン残基までの１０２アミノ酸残基がＣＢＭ領域であり、１６４位のロイシン残基から５９０位のプロリン残基までの４２７アミノ酸残基がセロビオハイドロラーゼ触媒領域である。ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２のＣＢＭ領域のアミノ酸配列を配列番号１に、塩基配列を配列番号２に、それぞれ表す。つまり、ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２は、セロビオハイドロラーゼ活性を有するグリコシド加水分解酵素である。

なお、本発明及び本願明細書において、「セロビオハイドロラーゼ活性」とは、β−１，３結合とβ−１，４結合からなるグルカン及び結晶性セルロースからなる群より選択される少なくとも１つの化合物、並びにＰＳＡを基質とし、前記基質を非還元末端側から加水分解することにより、セロビオースを生成する活性を意味する。

ＣＢＭは、それ自身分解活性を持たないが、単独でセルロースに結合する能力を有する。ＣＢＭの機能としては、不溶性の基質に吸着することにより、基質周辺における触媒ドメインの濃度を上昇させてセルロースの分解速度を向上させたり、ＣＢＭの結合によってセルロース鎖間の水素結合を切り離して結晶構造を崩したりすることが知られている。

ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２のアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して検索したところ、セロビオハイドロラーゼ触媒領域は、特許文献１に記載のＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡの１アミノ酸変異体（Ｒ２９９Ｑ）であるＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＡのアミノ酸配列（配列番号１０）と同一であった。また、ＣＢＭのアミノ酸配列は、放線菌マイクロビスポーラ・サブスピーシーズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ ｓｐ．）のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ 登録ＩＤ：ＥＴＫ３６９０６．１）（配列番号９）のＣＢＭ（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ）２領域と最も配列同一性が高く、両者は６４％の配列同一性（相同性）を示した。

ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２は、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡの１アミノ酸変異体（Ｒ２９９Ｑ）と同じセロビオハイドロラーゼ触媒領域を有することから、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡやＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＶと同様に、ＰＳＡに対し高い加水分解活性を示し、β−１，３結合とβ−１，４結合グルカンからなるリケナン（Ｌｉｃｈｅｎａｎ）や結晶性セルロースのアビセルに対し、弱いながらも分解活性を示す。一方、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）やβ−１，３結合とβ−１，６結合グルカンからなるラミナリン（Ｌａｍｉｎａｒｉｎ）に対しては、ほとんど分解活性は示さない。

ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２は、少なくとも９５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有する。実際に、後記実施例１に示すように、ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２は、ｐＨ５．５の条件下で、５０〜１０５℃の広い温度範囲内でＰＳＡ加水分解活性を示し、５０〜９９℃の広い温度範囲内でアビセル加水分解活性を示す。

また、ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２は、２価の金属イオン存在下で、金属イオン非存在下よりも、高温下でより高いセロビオハイドロラーゼ活性を示す。実際に、後記実施例１に示すように、ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２は、７５℃以上の高温下において、カルシウムイオン存在下のほうが、カルシウムイオン非存在下よりも、高いセロビオハイドロラーゼ活性を示す。特に、ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２は、カルシウムイオン存在下において、少なくとも１０５℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＳＡ加水分解活性を有する。

一般的に何らかの生理活性を有するタンパク質は、その生理活性を損なうことなく、１個又は複数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。つまり、ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２に対しても、セロビオハイドロラーゼ活性を失わせることなく、１個又は複数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。

すなわち、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、下記（Ａ１）〜（Ｃ１）のいずれかからなるＣＢＭとセロビオハイドロラーゼ触媒領域とを有し、かつ少なくとも９５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有する、耐熱性セロビオハイドロラーゼである。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、ＣＢＭを有することによって、セロビオハイドロラーゼ触媒領域のみからなる耐熱性セロビオハイドロラーゼよりも高いセロビオハイドロラーゼ活性を示す。
（Ａ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルロースへ結合する機能を有するポリペプチド、又は
（Ｃ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセルロースへ結合する機能を有するポリペプチド。

本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼが有するセロビオハイドロラーゼ触媒領域は、本発明に係るＣＢＭ（前記（Ａ１）〜（Ｃ１）のいずれかからなるＣＢＭ）と連結されることにより、少なくとも９５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドであれば特に限定されるものではなく、公知の耐熱性セロビオハイドロラーゼの中から適宜選択して用いることができる。

本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼが有するセロビオハイドロラーゼ触媒領域としては、下記（Ａ２）〜（Ｃ２）のいずれかが好ましい。
（Ａ２）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１６４位のロイシン残基から５９０位のプロリン残基までの部分配列からなるポリペプチド、
（Ｂ２）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１６４位のロイシン残基から５９０位のプロリン残基までの部分配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ２）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１６４位のロイシン残基から５９０位のプロリン残基までの部分配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド。

本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼが有するＣＢＭとセロビオハイドロラーゼ触媒領域は、直接連結されていてもよく、１個以上のアミノ酸残基からなるリンカーにより連結されていてもよい。また、ＣＢＭとセロビオハイドロラーゼ触媒領域は、ＣＢＭがＮ末端側になるように連結されていてもよく、ＣＢＭがＣ末端側になるように連結されていてもよい。

本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼとしては、例えば、下記（Ａ３）〜（Ｃ３）のいずれかからなるポリペプチド、又はこれを有するポリペプチドが挙げられる。
（Ａ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド。

前記（Ｂ１）、（Ｂ２）、及び（Ｂ３）のポリペプチドにおいて、配列番号１又は配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい。

前記（Ｃ１）、（Ｃ２）、及び（Ｃ３）のポリペプチドにおいて、配列番号１又は配列番号３で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、７０％以上１００％未満であれば特に限定されないが、８０％以上１００％未満であることが好ましく、８５％以上１００％未満であることがより好ましく、９０％以上１００％未満であることがさらに好ましく、９５％以上１００％未満であることが特に好ましい。

なお、アミノ酸配列同士の配列同一性（相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明におけるアミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。

前記（Ｂ１）〜（Ｂ３）及び（Ｃ１）〜（Ｃ３）のポリペプチドとしては、人工的に設計されたものであってもよく、ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２等のホモログ又はその部分タンパク質であってもよい。

前記（Ａ１）〜（Ａ３）、（Ｂ１）〜（Ｂ３）、（Ｃ１）〜（Ｃ３）のポリペプチドは、それぞれ、アミノ酸配列に基づいて化学的に合成してもよく、後記の本発明に係るポリヌクレオチドを用いて、タンパク質発現系によって生産してもよい。また、前記（Ｂ１）〜（Ｂ３）及び（Ｃ１）〜（Ｃ３）のポリペプチドは、それぞれ、配列番号１又は配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づいて、アミノ酸変異を導入する遺伝子組換え技術を用いて人工的に合成することもできる。

本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、ＰＳＡを基質とする。当該耐熱性セロビオハイドロラーゼは、ＰＳＡ以外のその他のβグルカンを基質としてもよい。当該その他のβグルカンとしては、例えば、アビセル（Ａｖｉｃｅｌ）、結晶性バクテリアセルロース(Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＢＭＣＣ)、濾紙などの結晶性セルロース、ＣＭＣ、セロビオース等のβ−１，４結合からなるグルカン；キシラン；ＰＮＰＧＡＬ；ＰＮＰＸ；リケナン等のβ−１，３結合とβ−１，４結合からなるグルカン；ラミナリン等のβ−１，３結合とβ−１，６結合からなるグルカン；β−１，３結合からなるグルカン；ゲンチオビオース等のβ−１，６結合からなるグルカン等が挙げられる。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼとしては、ＰＳＡに加えてアビセル及びリケナンを基質とするものが好ましい。

本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、少なくともｐＨ５．５の条件で、ＰＳＡを基質とする加水分解活性を、７０〜１００℃の温度範囲内で示すことが好ましく、７０〜１０５℃の温度範囲内で示すことがより好ましく、５０〜１０５℃の温度範囲内で示すことがさらに好ましい。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの至適温度は、８５〜１００℃の範囲内にあることが好ましく、９０〜１００℃の範囲内にあることがより好ましい。

本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼとしては、少なくともｐＨ４．５〜６．０の範囲内においてセロビオハイドロラーゼ活性を示すものが好ましく、ｐＨ４．０〜６．５の範囲内においてセロビオハイドロラーゼ活性を示すものがより好ましい。

また、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、２価の金属イオン存在下で、金属イオン非存在下よりもより高温でも高いセロビオハイドロラーゼ活性を示すことが好ましい。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、２価の金属イオン存在下で、少なくとも８０〜１００℃の温度範囲内、かつｐＨ４．５〜６．０でセロビオハイドロラーゼ活性を有することが好ましく、８０〜１０５℃の温度範囲内、かつｐＨ４．５〜６．５のｐＨ範囲内でセロビオハイドロラーゼ活性を示すことがより好ましく、５０〜１０５℃の温度範囲内、かつｐＨ４．５〜６．５のｐＨ範囲内でセロビオハイドロラーゼ活性を示すことがさらに好ましい。

本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、セロビオハイドロラーゼ活性以外のセルロース加水分解活性を有していてもよい。その他のセルロース加水分解活性としては、キシラナーゼ活性、β−ガラクトシダーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、キシロシダーゼ活性、又はβ−グルコシダーゼ活性等が挙げられる。

本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、本発明に係るＣＢＭと耐熱性セロビオハイドロラーゼ触媒領域とのみからなる酵素であってもよく、その他の領域を含んでいてもよい。その他の領域としては、公知のセロビオハイドロラーゼが有する、セロビオハイドロラーゼ触媒領域以外の領域が挙げられる。例えば、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼには、公知のセロビオハイドロラーゼに対し、セロビオハイドロラーゼ触媒領域を前記（Ａ３）〜（Ｃ３）のポリペプチドに置換することによって得られる酵素や、公知のセロビオハイドロラーゼに前記（Ａ１）〜（Ｃ１）のポリペプチドを付加した酵素も含まれる。

本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、その他にも、Ｎ末端又はＣ末端に、細胞内の特定の領域に移行させて局在させ得るシグナルペプチドや、細胞外へ分泌するシグナルペプチドを有していてもよい。このようなシグナルペプチドとして、例えば、アポプラスト移行シグナルペプチド、小胞体保留シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、分泌型シグナルペプチド等がある。小胞体保留シグナルペプチドとして、例えば、ＨＤＥＬのアミノ酸配列からなるシグナルペプチド等がある。

また、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、その他にも、発現系を用いて生産した場合に簡便に精製可能とするため、例えばＮ末端やＣ末端に、各種タグが付加されていてもよい。当該タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグ等の組換えタンパク質の発現・精製において汎用されているタグを用いることができる。

［耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチド］
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードする。当該耐熱性セロビオハイドロラーゼは、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクターを宿主に導入することにより、当該宿主の発現系を利用して生産することができる。

具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドは、下記（ａ１）〜（ｅ１)のいずれかの塩基配列と、セロビオハイドロラーゼ触媒活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列とを有する、ポリヌクレオチドである。
（ａ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルロースへ結合する機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセルロースへ結合する機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｄ１）配列番号２で表される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつセルロースへ結合する機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｅ１）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつセルロースへ結合する機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列。

本発明に係るポリヌクレオチドとしては、下記（ａ２）〜（ｅ２)のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は下記（ａ２）〜（ｅ２)のいずれかの塩基配列を含む塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
（ａ２）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ２）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ２）配列番号３で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｄ２）配列番号４で表される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも９５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｅ２）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも９５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。

なお、本願及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が欠失する」とは、ポリヌクレオチドを構成しているヌクレオチドの一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が置換する」とは、ポリヌクレオチドを構成している塩基が別の塩基に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が付加される」とは、ポリヌクレオチド中に新たな塩基が挿入されることを意味する。

本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ***ＤＮＡ、及び５０％フォルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、４２〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。

前記（ａ１）〜（ｅ１）及び（ａ２）〜（ｅ２）の塩基配列においては、縮重コドンは、宿主のコドン使用頻度の高いものを選択することが好ましい。例えば、前記（ａ１）の塩基配列としては、配列番号２で表される塩基配列であってもよく、配列番号２で表される塩基配列を、コードするアミノ酸配列は変更せずに、宿主において使用頻度の高いコドンへ改変した塩基配列であってもよい。コドンの改変は、公知の遺伝子配列変異技術又は人工遺伝子合成によって行うことができる。

配列番号２又は配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、塩基配列情報に基づいて化学的に合成してもよく、ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２をコードする遺伝子（「ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２遺伝子」ということがある。）の全長若しくはセロビオハイドロラーゼ触媒領域及びＣＢＭを含む部分領域を遺伝子組換え技術によって自然界から取得したものであってもよい。ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２遺伝子の全長又はその部分領域は、例えば、自然界から微生物を含むサンプルを取得し、当該サンプルから回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２で表される塩基配列に基づいて常法により設計したフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。当該サンプルから回収したｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型としてもよい。

前記（ｄ１）及び（ｄ２）の塩基配列において、配列番号２又は配列番号４で表される塩基配列との配列同一性は、８０％以上１００％未満であれば特に限定されないが、８５％以上１００％未満であることが好ましく、９０％以上１００％未満であることがより好ましく、９５％以上１００％未満であることがさらに好ましく、９８％以上１００％未満であることがよりさらに好ましい。

なお、塩基配列同士の配列同一性（相同性）は、２つの塩基配列を、対応する塩基が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除く塩基配列全体に対する一致した塩基の割合として求められる。塩基配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明における塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。

例えば、前記（ｂ１）、（ｂ２）、（ｃ１）、（ｃ２）、（ｄ１）又は（ｄ２）の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２又は配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、１又は２以上の塩基を欠失、置換若しくは付加することによって人工的に合成することができる。また、前記（ｂ１）、（ｂ２）、（ｃ１）、（ｃ２）、（ｄ１）又は（ｄ２）の塩基配列としては、ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２遺伝子のホモログ遺伝子の全長配列又はその部分配列であってもよい。ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２遺伝子のホモログ遺伝子は、塩基配列が既知の遺伝子のホモログ遺伝子を取得する際に用いられる遺伝子組換え技術によって取得することができる。

本発明に係るポリヌクレオチドは、セロビオハイドロラーゼ触媒領域とＣＢＭをコードする領域のみを有するものであってもよく、当該領域に加えて、リンカー配列、各種シグナルペプチド、各種タグ等をコードする領域を有していてもよい。

［発現ベクター］
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、少なくとも９５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る。すなわち、前記本発明に係るポリヌクレオチドが、前記本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現し得る状態で組込まれた発現ベクターである。具体的には、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、前記本発明に係るポリヌクレオチド、ターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現カセットとして発現ベクターに組込まれていることが必要である。なお、ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組込みは、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより行うことができ、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。

当該発現ベクターとしては、大腸菌等の原核細胞へ導入されるものであってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、植物細胞等の真核細胞へ導入されるものであってもよい。これらの発現ベクターとしては、それぞれの宿主に応じて通常用いられる任意の発現ベクターを用いることができる。

本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドのみならず、薬剤耐性遺伝子等も組込まれた発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターにより形質転換された細胞と形質転換されていない細胞の選抜を容易に行うことができるためである。当該薬剤耐性遺伝子として、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子等がある。

［形質転換体］
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る発現ベクターが導入されている。当該形質転換体中では、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現させ得る。従来公知のセロビオハイドロラーゼは、現宿主のレンジが狭い、つまり、異種発現が難しいものが多い。これに対して、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、大腸菌、酵母、糸状菌、高等植物葉緑体等、広範な発現宿主に発現させることができる。このため、発現ベクターを導入する宿主としては、大腸菌等の原核細胞であってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞であってもよい。大腸菌の形質転換体を培養することにより、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを、より簡便かつ大量に生産することができる。一方で、真核細胞内ではタンパク質に糖鎖修飾が施されるため、真核細胞の形質転換体を用いることにより、原核細胞の形質転換体を用いた場合よりも、より耐熱性に優れた耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産し得る。

発現ベクターを用いて形質転換体を作製する方法は、特に限定されるものではなく、形質転換体を作製する場合に通常用いられている方法により行うことができる。当該方法として、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法等がある。このうち、宿主が植物細胞である場合には、パーティクルガン法又はアグロバクテリウム法で行うことが好ましい。

宿主として、原核細胞、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、又は哺乳培養細胞等を用いた場合には、得られた形質転換体は、一般的には、形質転換前の宿主と同様にして、常法により培養することができる。

［耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法］
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産する方法である。前記本発明に係るポリヌクレオチドが、発現の時期等の制御能を有していないプロモーターの下流に組込まれている発現ベクターを用いて製造された形質転換体内では、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼが恒常的に発現している。一方で、特定の化合物や温度条件等によって発現を誘導するいわゆる発現誘導型プロモーターを用いて製造された形質転換体に対しては、それぞれの発現誘導条件に適した誘導処理を行うことにより、当該形質転換体内に耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現させる。

形質転換体によって生産された耐熱性セロビオハイドロラーゼは、当該形質転換体内に留めた状態で使用してもよく、当該形質転換体から抽出・精製してもよい。

形質転換体から耐熱性セロビオハイドロラーゼを抽出又は精製する方法は、耐熱性セロビオハイドロラーゼの活性を損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、細胞や生体組織からポリペプチドを抽出する場合に通常用いられている方法によって抽出することができる。当該方法として、例えば、形質転換体を適当な抽出バッファーに浸し、耐熱性セロビオハイドロラーゼを抽出した後、抽出液と固形残渣に分離する方法が挙げられる。当該抽出バッファーとしては、界面活性剤等の可溶化剤を含有するものが好ましい。形質転換体が植物である場合には、抽出バッファーに浸す前に、予め当該形質転換体を細断又は粉砕しておいてもよい。また、抽出液と固形残渣を分離する方法としては、例えば、濾過方法、圧縮濾過方法、又は遠心分離処理方法等の公知の固液分離処理を用いることができ、抽出バッファーに浸した状態の形質転換体を搾ってもよい。抽出液中の耐熱性セロビオハイドロラーゼは、塩析法、限外濾過法、又はクロマトグラフィー法等の公知の精製方法を用いて精製することができる。

本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを、形質転換体内で分泌型シグナルペプチドを有する状態で発現させた場合には、当該形質転換体を培養した後、得られた培養物から形質転換体を除いた培養液上清を回収することにより、簡便に耐熱性セロビオハイドロラーゼを含む溶液を得ることができる。また、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼが、Ｈｉｓタグ等のタグを有している場合、当該タグを利用したアフィニティクロマトグラフィ法により、抽出液や培養上清中の耐熱性セロビオハイドロラーゼを簡便に精製することができる。

すなわち、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産すること、及び所望により前記形質転換体から前記耐熱性セロビオハイドロラーゼを抽出し精製することを含む。

［グリコシド加水分解酵素混合物］
前記本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は前記本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素を含むグリコシド加水分解酵素混合物として使用することもできる。前記本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼは、形質転換体内に含まれた状態のものであってもよく、形質転換体から抽出又は精製されたものであってもよい。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを、その他のグリコシド加水分解酵素との混合物としてセルロースの分解反応に用いることにより、難分解性であるリグノセルロースをより効率よく分解させることができる。

当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる前記耐熱性セロビオハイドロラーゼ以外のその他のグリコシド加水分解酵素としては、セルロースの加水分解活性を有するものであれば特に限定されるものではない。当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる前記セロビオハイドロラーゼ以外のその他のグリコシド加水分解酵素としては、例えば、キシラナーゼ、若しくはβ−キシロシダーゼ等のヘミセルラーゼ、セロビオハイドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、又はエンドグルカナーゼ等が挙げられる。本発明に係るグリコシド加水分解酵素混合物としては、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼの少なくとも一方を含むものが好ましく、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼを両方含むものがより好ましい。中でも、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上のグリコシド加水分解酵素を含むものが好ましく、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、及びエンドグルカナーゼを全て含むものがより好ましい。

当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれるその他のグリコシド加水分解酵素は、少なくとも７０℃でグリコシド加水分解活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることが好ましく、７０〜９５℃でグリコシド加水分解活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることがより好ましく、７０〜１０５℃でグリコシド加水分解活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることがさらに好ましい。当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる全ての酵素が耐熱性であることにより、当該グリコシド加水分解酵素混合物によるセルロースの分解反応を高温条件下で効率よく行うことができる。すなわち、当該グリコシド加水分解酵素混合物が耐熱性グリコシド加水分解酵素のみを含む場合、当該グリコシド加水分解酵素混合物をリグノセルロース糖化処理に用いることにより、糖化温度７０〜９５℃の高温環境下でリグノセルロース加水分解反応を行うことが可能になる。この高温糖化により、酵素量と糖化時間を著しく減らすことができ、糖化コストが大幅に削減される。

［セルロース分解物の製造方法］
本発明に係るセルロース分解物の製造方法は、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼにより、セルロースを分解して分解物を得る方法である。具体的には、セルロースを含む材料を、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼ、本発明に係る形質転換体、又は本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産する。

セルロースを含む材料としては、セルロースが含まれていれば特に限定されるものではない。当該材料としては、例えば、雑草や農業系廃棄物等のセルロース系バイオマス、又は古紙等が挙げられる。当該セルロースを含む材料は、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼと接触させる前に、破砕若しくは細断等の物理的処理、酸若しくはアルカリ等による化学処理、又は適当なバッファーへの浸漬又は溶解処理等を行っておくことが好ましい。

本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼによるセルロースの加水分解反応の反応条件は、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼがセロビオハイドロラーゼ活性を示す条件であればよい。例えば、２価金属イオン非存在下では、６０〜１００℃、ｐＨ４．５〜６．５で反応を行うことが好ましく、５０〜１００℃、ｐＨ４．５〜６．５で反応を行うことがより好ましい。また、２価金属イオン存在下では、８０〜１０５℃、ｐＨ４．５〜６．５で反応を行うことが好ましく、７０〜１０５℃、ｐＨ４．５〜６．５で反応を行うことがより好ましい。前記加水分解反応の反応時間は、加水分解に供されるセルロースを含む材料の種類、前処理の方法、又は量等を考慮して適宜調整される。例えば、１０分間〜１００時間、セルロース系バイオマスを分解する場合には、１〜１００時間の反応時間で前記加水分解反応を行うことができる。

セルロースの加水分解反応には、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼに加えて、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素を用いることも好ましい。当該その他のグリコシド加水分解酵素としては、前記グリコシド加水分解酵素混合物に含められるグリコシド加水分解酵素と同様のものを用いることができ、少なくとも７０℃で、好ましくは少なくとも７０〜１００℃でグリコシド加水分解活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることが好ましい。また、当該セルロース分解物の製造方法には、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼ、本発明に係る形質転換体、又は本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼに代えて、前記グリコシド加水分解酵素混合物を用いてもよい。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］温泉土壌からの新規耐熱性セロビオハイドロラーゼのクローニング
＜１＞ 温泉土壌からのＤＮＡ抽出と全ゲノムシーケンス（Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＷＧＳ）
耐熱性セロビオハイドロラーゼ（至適温度：５５℃以上）、超耐熱性セロビオハイドロラーゼ（至適温度：８０℃以上）の遺伝子探索を目的として、中性〜弱アルカリ性温泉から土壌ＤＮＡを採取し、これらの土壌を構成する微生物叢メタゲノムＤＮＡの塩基配列解読を行った。
中性〜弱アルカリ性温泉土壌サンプルとして、野外にて高温の温泉が噴き出している日本国内の３ヶ所、５地点（メタゲノムＤＮＡサンプルＮ２、ＡＲ１９、ＡＲ１５、ＯＪ１、及びＨ１）から、土壌、泥、バイオマットを含む温泉水を採取した。これらの温泉土壌サンプルは、採取時の温度５８〜７８℃、ｐＨ７．２〜８のレンジにあった。

採取した温泉土壌サンプル各１０ｇから、ＤＮＡ抽出キット（ＩＳＯＩＬ Ｌａｒｇｅ ｆｏｒ Ｂｅａｄｓ ｖｅｒ．２、ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製）を使い、ＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡのうち５μｇに対して、ロシュダイアグノスティックス社製のシーケンサーＧＳ ＦＬＸ Ｔｉｔａｎｉｕｍ ４５４を用いて、メタゲノムＤＮＡのショットガンシーケンスを行った。

温泉土壌サンプルＡＲ１５について、メタゲノムＤＮＡの配列解読を行い、平均リード長３９６ｂｐ、総リード数２，７６６,３３２個、総ゲノム解読量１，１０６，２４３，２８０ｂｐの全ゲノムシーケンス（ＷＧＳ）データセットを得た。

＜２＞ 温泉メタゲノムデータのアセンブルと統計量
Ｒｏｃｈｅ ４５４の出力（ｓｆｆファイル）を、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ Ｖｅｒ．４ソフトウエア（ＣＬＣ社製）を用いて、低品質リードのトリミング及びｄｅ ｎｏｖｏアセンブルを行った。
５００ｂｐ以上にアセンブルされた総コンティグ長は、合計１５９，５８７，１５０ｂｐであり、このデータセットをセルラーゼ酵素遺伝子解析に用いた。トリミング後のリード総数は２，７６６，３２８リードであり、平均で１，２３０ｂｐのコンティグにアセンブルされ（計１２９，７４２コンティグ）、このうち最大コンティグ長は１０５，９７７ｂｐであった。

＜３＞ セロビオハイドロラーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）予測
ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（http://www.uniprot.org/）からＥＣ番号が３．２．１．４（セルラーゼ）、３．２．１．２１（β−グルコシダーゼ)、３．２．１．３７（β−キシロシダーゼ) 、３．２．１．９１（セルロース １，４−β−セロビオシダーゼ)、３．２．１．８（エンド１，４−β−キシラナーゼ）の配列をダウンロードし（アクセス日：２０１１／１２／９）、これらグリコシド加水分解酵素遺伝子のプロテオームローカルデータベースを構築した。アノテーションソフトウェアＭｅｔｅＧｅｎｅＡｎｏｔａｔｏｒ（Noguchi et al.，MetaGeneAnnotator: Detecting Species-Specific Patterns of Ribosomal Binding Site for Precise Gene Prediction in Anonymous Prokaryotic and Phage Genomes, DNA Res. 2008, 15, 387-396.)を使用して、前記＜２＞で得たコンティグ配列から、遺伝子領域（＝オープンリーディングフレーム）を推定した。推定されたＯＲＦからグリコシド加水分解酵素遺伝子を抽出するために、ＢＬＡＳＴＰ（ｂｌａｓｔａｌｌ ｖｅｒ. ２．２．１８）を使い、前記ローカルデータベースに参照した。ＢＬＡＳＴＰのｏｐｔｉｏｎ条件は、「Ｆｉｌｔｅｒ ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝ｆａｌｓｅ」、「Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ（Ｅ）＜１ｅ^−２０」［以下、デフォルト値：Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ａ ｇａｐ＝−１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｇａｐ＝−１、Ｘ ｄｒｏｐｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝０、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｆｏｒ ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｈｉｔｓ＝０、Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ＝ｄｅｆａｕｌｔ］とし、ヒットした配列をグリコシド加水分解酵素遺伝子として収集した。

＜４＞ 遺伝子のグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリー分類
前記＜３＞で収集されたセルラーゼ、エンドヘミセルラーゼ、脱分岐酵素等のグリコシド加水分解酵素を含む配列についてについて、タンパク質の機能領域配列データベースｐｆａｍ ＨＭＭｓ（Ｐｆａｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ２３．０ ａｎｄ ＨＭＭＥＲ ｖ２．３；Finn et al.，Nucleic Acids Research Database，2010，Issue 38，p.D211-222)を基準に、機能分類を行った。具体的には、タンパク質モチーフ検索プログラムＨＭＭＥＲ（Durbin et al.，‘The theory behind profile HMMs. Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids’, 1998，Cambridge University Press.；ｈｍｍｐｆａｍ（Ｖｅｒ．２．３．２）、Ｅ−ｖａｌｕｅ ｃｕｔｏｆｆ＜１ｅ^−５; Ｄａｔａｂａｓｅ＝Ｐｆａｍ＿ｆｓ（ｍｏｄｅｌｓ ｔｈａｔ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｆｉｎｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．))を用いて、Ｐｆａｍ領域データベースとの相同性からグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリーを決定した。

温泉土壌サンプルＡＲ１９のシーケンスデータを用いたＢＬＡＳＴＰによる相同性検索及びｐｆａｍ ＨＭＭｓにより、６１個のＯＲＦがセロビオハイドロラーゼ遺伝子と予測された。このうちの１つは、既知のＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡの１アミノ酸変異体（Ｒ２９９Ｑ）ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＡの配列のＮ末端側に、新規なＣＢＭファミリー２の配列が付加したものであった。このＯＲＦについてプライマーを設計し、ゲノムＤＮＡ増幅キット（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ Ｖ２ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＧＥヘルスケア社製）で増幅した温泉土壌ＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲにより遺伝子をクローニングした。その結果、５’末端側にＣＢＭファミリー２を有するＧＨファミリー６のセロビオハイドロラーゼ配列を持つオープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａからセロビオハイドロラーゼ遺伝子ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２が単離された。

＜５＞ オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ
オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａは、５９０アミノ酸残基からなるポリペプチド（配列番号３）をコードし、１位のアミノ酸残基がアラニン（Ａ）から開始し、３’末端が終始コドンで終わっている不完全長配列（配列番号４）であった。モチーフの配列相同性から、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａは、２位のシステイン（Ｃ）から１０３位のシステイン（Ｃ）までの１０２アミノ酸残基がＣＢＭファミリー２ドメインであり、１６４位のロイシン（Ｌ）から５９０位のプロリン（Ｐ）までの４２７アミノ酸残基がＧｌｙｃｏｓｉｄｅｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ６触媒ドメインをコードしていると推測された。このＣＢＭファミリー２ドメインは、放線菌マイクロビスポーラ・サブスピーシーズのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼのＣＢＭ２領域（配列番号９の２９〜１２８位のアミノ酸からなる領域）とＣＢＭ領域について６４％のアミノ酸配列同一性を示す、新規な配列であった。配列相同性は、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムにより算出した。

図１に、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａがコードすると推定されるポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３）とマイクロビスポーラ・サブスピーシーズのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（配列番号９）のＣＢＭ２領域のアミノ酸配列のアライメントを示す。図１中、黒白反転のアミノ酸は、これらの全アミノ酸配列において同一アミノ酸残基（identical）を示し、「−」は欠失（ギャップ）を示す。

＜６＞ セロビオハイドロラーゼ遺伝子ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２
ＰＣＲクローニングによりオープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａからセロビオハイドロラーゼ遺伝子ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２を単離した。ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２遺伝子は、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａと全て同一の１，７７３ｂｐからなる塩基配列を含んでいた。

＜７＞ セロビオハイドロラーゼ酵素タンパク質の発現及び精製
配列番号７で表される塩基配列からなるフォワードプライマー（５’−ＧＴＧＡＴＧＧＣＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＴＡＣ−３’：配列番号５で表される塩基配列の５’末端側に６塩基（ＧＴＧＡＴＧ）付加し、５’末端をリン酸化したもの。）と配列番号８で表される塩基配列からなるリバースプライマー（５’−ＡＴＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＴＡＧＧＧＴＴＧＧＡＴＣＧＧＣＧＧＡＴＡＧ−３’：配列番号６で表される塩基配列の５’末端側に制限酵素Ｓａｃ Ｉ認識配列を付加したもの。Ｓａｃ Ｉはベクターへの挿入に利用する配列である。）を用い、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製)で増幅したＰＣＲ産物をｐＬＥＡＤ５ベクター（ニッポン・ジーン社製）へ挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。なお、配列番号５で表される塩基配列は、配列番号４で表される塩基配列の１〜１８位の塩基からなる部分配列と相同的な（同一の）塩基配列である。また、配列番号６で表される塩基配列は、配列番号４で表される塩基配列の１，７５２〜１，７７３位の塩基からなる部分配列と相補的な塩基配列である。コロニーＰＣＲによりポジティブクローンを選抜し、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃、２００ｒｐｍで１７〜２０時間培養した後、ミニプレップキット（Ｗｉｚａｒｄ ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドの調製を行った。調製したプラスミドは、シーケンサー（ライフテクノロジーズ社の３７３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて配列確認を行った。ＰＣＲクローニングにより、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａから遺伝子クローンＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２を得た。

シーケンス確認されたＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２／ｐＬＥＡＤ５プラスミドを持つ形質転換大腸菌クローンを、５０ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＴｕｒｂｏ Ｂｒｏｔｈ培地（アテナ エンバイロメンタル サイエンス社製）に植菌し、 約２０時間培養することによって目的タンパク質を発現させた。培養後、遠心分離処理を行って大腸菌を回収し、培養液の１／１０容量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を加えて懸濁した。その後、超音波破砕装置ａｓｔｒａｓｏｎ３０００（ＭＩＳＯＮＩＸ社製）を用いて、５分間破砕−５分間休止工程を７〜８サイクル繰返し、目的タンパク質を含む遺伝子組換え大腸菌の粗抽出物を得た。当該遺伝子組換え大腸菌粗抽出物をフィルター（孔径φ＝０．４５μｍ、ミリポア社製）で濾過し、得られた濾液を遺伝子組換え大腸菌破砕上清とした。

当該遺伝子組換え大腸菌破砕上清を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したイオン交換カラムＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、中高圧液体クロマトグラフィーシステムＡＫＴＡ ｄｅｓｉｇｎ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜５０％の濃度勾配でタンパク質を分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、遠心式の限外濾過膜ＶＩＶＡＳＰＩＮ ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｓｔｅｄｉｍ社製）によって７５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）へ溶液交換した。溶液交換後のセロビオハイドロラーゼ活性分画を、同液で平衡化した疎水性相互作用分離カラムＨｉＴｒａｐ Ｐｈｎｅｎｙｌ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜１００％の濃度勾配でタンパク質を分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後に、液量が８ｍＬ程度になるまでＶＩＶＡＳＰＩＮ ２０を用いて濃縮した。濃縮したサンプルは、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したゲル濾過カラムＨｉｌｏａｄ２６／６０ ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）に添加し、カラム体積の１〜１．５倍容の同バッファーを流速２〜３ｍＬ／分で流すことによって分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）への溶液交換と濃縮を行い、終濃度約１ｍｇ／ｍＬの精製酵素を得た。

遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製酵素（精製したセロビオハイドロラーゼ酵素タンパク質）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により確認した。遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製酵素のＳＤＳ電気泳動は、ミニプロティアンＴＧＸステインフリーゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて行った。前記上清又は精製酵素を、それぞれＴｒｉｓ−ＳＤＳ βＭＥ処理液（コスモバイオ社製）と１：１で混合した泳動用サンプルを、１００℃で１０分間処理した後、１サンプルあたり、遺伝子組換え大腸菌破砕上清は１０μＬ、精製酵素は１μｇをそれぞれ泳動させた。泳動終了後、ＣＢＢ染色とウェスタンブロッティングによって、タンパク質のバンドを検出した。

ウェスタンブロッティングは、ＳＤＳ電気泳動を行った後、転写装置Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ＳＤ（バイオラッド社製）とＴｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐａｃｋ（バイオラッド社製）を用いてポリフッ化ビニリデン膜へ転写した。膜上のタンパク質は１０００倍に希釈したウサギ１次抗体と反応させた。当該ウサギ１次抗体は、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡがコードする３８４〜４０３位の２０アミノ酸残基（ＣＤＰＮＧＱＳＲＹＮＳＡＹＰＴＧＡＬＰＮ）からなるポリペプチドを合成し、ウサギを免疫して得られた血清をアフィニティー精製することによって作製した（オペロンバイオテクノロジー社製）。タンパク質と結合した１次抗体の検出は、ＦａｓｔＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて行い、化学発光シグナルの検出には、イメージング装置Ｅｚ−Ｃａｐｔｕｒｅ ＭＧ（ＡＴＴＯ社製）を使用した。

図２に、ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２遺伝子を導入した形質転換大腸菌から調製された遺伝子組換え大腸菌破砕上清及び当該遺伝子組換え大腸菌破砕上清から精製された精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析のＣＢＢ染色の結果（図２（Ａ））とウェスタンブロッティングの結果（図２（Ｂ））を示す。レーン１はタンパク質質量指標、レーン２は遺伝子組換え大腸菌破砕上清、レーンＰは精製酵素の電気泳動パターンである。この結果、ＣＢＢ染色とウェスタンブロッティングの両方において、前記遺伝子組換え大腸菌破砕上清（レーン２）において、アミノ酸配列（配列番号３）から予想される質量６３．４ｋＤａ近傍に強いバンドが認められ、精製酵素（レーンＰ）では、当該バンドに対応する単一バンドが認められた（図中、矢印）。

＜８＞ セロビオハイドロラーゼ活性
ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２遺伝子がコードする酵素タンパク質（ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２）のＰＳＡ及びアビセルを基質としたセロビオハイドロラーゼ活性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素を０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で１ｍｇ／ｍＬに希釈して用いた。

基質として用いるＰＳＡは、リン酸溶液でアビセル粉末（微結晶性セルロース粉末、Ｍｅｒｃｋ社製）を一旦溶解させた後に滅菌蒸留水を加えて析出させた後、ｐＨが５以上になるまで洗浄することによって調製した。なお、以降の実験に用いたＰＳＡは全て当該方法により調製した。

反応には、サーモミキサー（エッペンドルフ社）を用い、反応容器には１．５ｍＬ容のサンプルチューブを使用し、反応液の組成は、１０μＬの希釈した精製酵素、４０μＬの精製水、 ５０μＬの２００ｍＭ 酢酸バッファー（ｐＨ５．５）、１００ μＬの１質量％ 基質溶液とした。ＰＳＡを基質とした場合の９５〜１１０℃の反応には、リアクティサーモ（ジーエルサイエンス社製）を用い、反応容器には、１．５ｍＬ容のガラスバイアルを使用し、反応液量を４００μＬとした。反応液の組成は、２０μＬの希釈した精製酵素、８０μＬの精製水、１００μＬの２００ｍＭ 酢酸バッファー（ｐＨ５．５）、２００μＬの１質量％ ＰＳＡ溶液とした。

全ての計測において、精製酵素溶液の代わりに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を入れて同条件で反応させた混合液をコントロール区とした。また、基質溶液と、精製酵素溶液と、精製水と、バッファーとの混合液は、反応温度で５分間それぞれ別々に保温（プリインキュベーション）した後に混合し、反応開始とした。ＰＳＡでは２０分間、アビセルでは６０分間の反応終了後は、各反応液に対して等量の３，５−ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＮＳ溶液）を加えて１００℃で５分間加熱処理し、５分間の氷冷後に１７５００×ｇで遠心分離処理し、上清を得た。上清中の還元糖量を、分光光度計を用いて５４０ｎｍの吸光度を計測し、グルコースで作成した検量線を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求めた。１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。

＜９＞ ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２の温度依存性
ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２のＰＳＡ加水分解活性及びアビセル加水分解活性の温度依存性を調べた。
具体的には、ＰＳＡ加水分解活性の温度依存性の測定は、反応温度を、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、又は１１０℃とした以外は、前記＜８＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
アビセル加水分解活性の温度依存性の測定は、反応温度を、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、又は９９℃とした以外は、前記＜８＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、アビセル加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。

また、精製水の代わりに１０ｍＭ ＣａＣｌ_２水溶液を加えた反応液でも同様に測定し、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）とアビセル加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
さらに、比較対象として、ＣＢＭ部を持たないＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＡについても同様の測定を行った。

ＰＳＡ加水分解活性の測定結果を図３に示す。ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２は、温度範囲５０〜１０５℃においてＰＳＡ加水分解活性を示した（図３）。特に、カルシウムイオン存在下では、１００〜１０５℃においても高いＰＳＡ加水分解活性を示した。最も高い活性を示した至適温度（Ｔ_ｏｐｔ）は、カルシウムイオンが無い場合（図中、「ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２」）と有る場合（図中、「ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２＋Ｃａ^２＋」）で、それぞれ９５℃と１０５℃であった。一方、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＡの至適温度は、カルシウムイオンが無い場合（図中、「ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＡ」）と有る場合（図中、「ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＡ＋Ｃａ^２＋」）で、それぞれ７０℃と８０℃であった。これらの結果は、ＣＢＭによって、ＰＳＡ分解活性における至適温度が、２５℃も上昇したことを示す。

アビセル加水分解活性の測定結果を図４に示す。ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２とＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＡのいずれにおいても、カルシウムイオンの有無に関わらず、至適温度は８５℃であった。しかしながら、ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２においては、アビセル分解活性の大幅な上昇が見られた。ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＡの至適温度８５℃におけるアビセル分解活性の平均値は、カルシウムイオンが無い場合と有る場合で、それぞれ０．１７±０．０５Ｕ／ｍｇと０．１２±０．０４Ｕ／ｍｇであったのに対し、ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２では、それぞれ０．３４±０．０３Ｕ／ｍｇと０．４３±０．０２Ｕ／ｍｇとなった。これらの結果は、ＣＢＭによって、アビセル分解活性が、カルシウムイオン非存在下で２倍、カルシウムイオン存在下では３．６倍も上昇したことを示す。

＜１０＞ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙによるセロビオハイドロラーゼの熱安定性測定
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ （ＤＳＦ）は、蛍光色素とリアルタイムＰＣＲ装置を用いて、タンパク質の熱変性を計測する方法の一つであり、様々なタンパク質に応用可能である。ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ等、ＤＳＦに使われる蛍光色素は、疎水性部位と結合する無極性条件下で蛍光を発し、一方、水に溶けた極性条件下では発光が抑えられる。通常、タンパク質はその熱変性温度において折畳み構造が解け、内部にある疎水性部位がタンパク質表面に露出する。この露出した疎水性部位にＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇが結合すると、波長４７０〜４８０ｎｍの励起光により、波長５９５ｎｍ付近にピークを持つ強い蛍光を発する。タンパク質溶液の温度を一定間隔で段階的に上昇させ、蛍光強度を計測することにより、熱崩壊温度（＝蛍光強度の変化点）が算出される。

計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２を水で１ｍｇ／ｍＬに調整した精製酵素溶液又はＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＡを水で１ｍｇ／ｍＬに調整した精製酵素溶液を用いた。
具体的には、９６穴ＰＣＲプレート（Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ ９６ Ｗｅｌｌ ＰＣＲ Ｐｌａｔｅ ＭＬＬ−９６５１、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）のウェルに１００倍希釈したＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ（ライフテクノロジーズ社製）を２μＬ、濃度１ｍｇ／ｍＬの精製酵素溶液を１μＬ、２００ｍＭ 酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を５μＬ、精製水又は精製水と１０ｍＭ ＣａＣｌ_２を２：１で混合した溶液を１２μＬ加え、各ウェルの容積を２０μＬとした。ＰＣＲプレートはＯｐｔｉｃａｌ ８連フラットキャップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）でシールし、リアルタイムＰＣＲ装置（ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で０．２℃ずつ、３０℃から１００℃までウェルの温度を上昇させ、ターゲット温度が達成されてから１０秒間経過した後、各ウェルの蛍光強度を同時計測した。波長帯域４５０〜４９０ｎｍの光発光ダイオード（ＬＥＤ）によりＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅを励起し、ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ放射光は５６０〜５８０ｎｍレンジの帯域通過フィルターを通し、ＣＣＤカメラで蛍光強度の計測を行い、蛍光強度変化を温度の関数としてプロットした。熱変性温度（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；Ｔｍ値）は、温度関数である蛍光強度曲線の１階微分（図５（Ｂ）のＹ軸に示した「−ｄ(Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ)／ｄｔ」）の極小値として定義した。リアルタイムＰＣＲに付属の解析ソフトウェアＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製)を使い、データ解析を行った。各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。

図５には、ＤＳＦ法により計測したＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＡの酵素タンパク質が示す、熱変性に伴って引き起こされるＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅの蛍光強度変化を示す。図５（Ａ）は実測データであり、図５（Ｂ）は図５（Ａ）の蛍光強度変化曲線の１階微分「−ｄ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）／ｄｔ」を示している。

ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２（ＣａＣｌ_２無添加）の蛍光強度の一階微分は、９３．０±０℃に極小点を持ち、この温度で熱変性が起こることを示した。この温度は、ＰＳＡ加水分解活性から求めたこの酵素の至適温度９５℃に近かった。また、ＣａＣｌ_２を添加した条件では、１００℃に達しても極小点が出現しないことから、熱変性温度は１００℃以上であることが推測された。一方、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＡの熱変性温度の平均値は、それぞれ７５．３±０．１℃（ＣａＣｌ_２無添加）と８０．９±０．２℃（ＣａＣｌ_２添加）であり、ＰＳＡ加水分解活性から求めた当該酵素の至適温度７０℃（ＣａＣｌ_２無添加）と８０℃（ＣａＣｌ_２添加）に近い値を示した。

＜１１＞ ＣＢＭ領域によるセロビオハイドロラーゼ活性への効果
ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２の持つＣＢＭ領域を他の酵素に付加した場合の効果を確認するため、当該ＣＢＭ領域をＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡに付加した状態のセロビオハイドロラーゼ（ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２−１、配列番号１１）を作製し、アビセル分解活性の測定を行った。 ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２−１遺伝子（配列番号１２）は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い、ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２の４６２番目のグルタミンをアルギニンに置換することにより作製した。具体的には、ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２／ｐＬＥＡＤ５をテンプレートにし、配列番号１３で表される塩基配列からなる突然変異誘発プライマー１及び配列番号１４で表される塩基配列からなる突然変異誘発プライマー２を用いて作製した。ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２−１の発現と精製は前記＜７＞と同様にして行い、セロビオハイドロラーゼ活性の温度依存性は前記＜９＞と同様にして行った。さらに、比較対象として、ＣＢＭを持たないＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡについても同様の測定を行った。

アビセル分解活性の計測結果を図６に示す。ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２−１では、ＣＢＭを持たないＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡと比べて、６０〜８５℃の範囲でアビセル分解活性の大幅な上昇が見られた。ＡＲ１９Ｇ−１６６ｃ４Ａ−１９−２−１の８０℃におけるアビセル分解活性の平均値は、カルシウムイオンが無い場合と有る場合で、それぞれ０．２６±０．０６Ｕ／ｍｇと０．３１±０．０１Ｕ／ｍｇであったのに対し、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡでは、それぞれ０．０６±０．０６Ｕ／ｍｇと０．１０±０．０１Ｕ／ｍｇであった。このことは、ＣＢＭによって、アビセル分解活性が４．３倍（カルシウムイオン存在下では３．１倍）も上昇したことを示す。
これらの結果が示す通り、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの持つＣＢＭを、他のセロビオハイドロラーゼ酵素に付加することにより、当該酵素のセロビオハイドロラーゼ活性を上昇させることができる。

本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、少なくとも９５℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＳＡを基質とした加水分解活性を有しており、高温条件下におけるセルロース含有バイオマスの糖化処理に好適である。このため、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼ及びその生産に用いられるポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、例えば、セルロース含有バイオマスからのエネルギー産生の分野において利用が可能である。

Claims (12)

1. （Ａ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は
   （Ｃ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセルロースへ結合する機能を有するポリペプチド、
   からなるセルロース結合モチーフ領域と、セロビオハイドロラーゼ触媒領域とを有し、かつ少なくとも９５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有することを特徴とする、耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
2. 前記セロビオハイドロラーゼ触媒領域が、
   （Ａ２）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１６４位のロイシン残基から５９０位のプロリン残基までの部分配列からなるポリペプチド、又は
   （Ｃ２）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１６４位のロイシン残基から５９０位のプロリン残基までの部分配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
   からなる、請求項１に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
3. （Ａ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は
   （Ｃ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
   からなる、請求項１に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
4. カルシウムイオン存在下において、少なくとも１０５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
5. （ａ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
   （ｃ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセルロースへ結合する機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
   （ｄ１）配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつセルロースへ結合する機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
   と、
   セロビオハイドロラーゼ触媒活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列と、を有する、ポリヌクレオチド。
6. （ａ２）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
   （ｃ２）配列番号３で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
   （ｄ２）配列番号４で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも９５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
   からなる、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
7. 前記ポリペプチドが、カルシウムイオン存在下において、少なくとも１０５℃、ｐＨ５．５の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有する、請求項５又は６に記載のポリヌクレオチド。
8. 請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが組込まれており、
   宿主細胞において、セロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
9. 請求項８に記載の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
10. 請求項９に記載の形質転換体内で、耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産することを含む、耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法。
11. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドがコードする耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
12. セルロースを含む材料を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドがコードする耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は請求項９に記載の形質転換体に接触させることにより、セルロース分解物を生産することを含む、セルロース分解物の製造方法。