JP6639035B1 - Cell culture substrate prepared using nonwoven fabric made of biodegradable fiber and method for producing the same - Google Patents
Cell culture substrate prepared using nonwoven fabric made of biodegradable fiber and method for producing the same Download PDFInfo
- Publication number
- JP6639035B1 JP6639035B1 JP2019183498A JP2019183498A JP6639035B1 JP 6639035 B1 JP6639035 B1 JP 6639035B1 JP 2019183498 A JP2019183498 A JP 2019183498A JP 2019183498 A JP2019183498 A JP 2019183498A JP 6639035 B1 JP6639035 B1 JP 6639035B1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fibers
- nozzle
- nonwoven fabric
- spinning solution
- fiber
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Abstract
【課題】エレクトロスピニング法で作製された不織布はナノ繊維間に細胞が侵入するための十分なスペ−スが存在しないので、細胞培養基材として用いるのが難しい。【解決手段】シリンジに充填された紡糸溶液を口径の大きいノズルに速い送り出し速度でフィードすることによって紡糸溶液を太い繊維状に出射して回転ドラムに向けて落下飛行させ、繊維が落下飛行する軌道をエレクトロスピニングの飛行軌道の不安定化現象を利用して振らせることで、溶媒を効果的に蒸発させた上で回転ドラムに堆積することによって、マイクロオーダーの径を有する繊維からなる不織布を製造する。【選択図】図２A nonwoven fabric manufactured by an electrospinning method has difficulty in using a nonwoven fabric as a cell culture substrate because there is not enough space for cells to enter between nanofibers. A spinning solution filled in a syringe is fed to a large-diameter nozzle at a high feeding speed, so that the spinning solution is emitted in the form of a thick fiber, and is caused to fall and fly toward a rotating drum. Non-woven fabric consisting of fibers with a micro-order diameter by depositing on a rotating drum after evaporating the solvent effectively by using the instability phenomenon of the flight trajectory of electrospinning I do. [Selection] Figure 2
Description
本発明は、エレクトロスピニングを用いてマイクロオ−ダーの径を有する繊維、及びマイクロオーダーの径を有する繊維からなるシートを製造する方法、並びに、その方法で製造されたマイクロオーダーの径を有する繊維からなる細胞培養基材に関するものである。 The present invention relates to a method for producing a fiber having a micro-order diameter by using electrospinning and a sheet comprising a fiber having a micro-order diameter, and a method for producing a fiber having a micro-order diameter produced by the method. The present invention relates to a cell culture substrate.
近時、細胞培養基材としてエレクトロスピニング法を用いて紡糸されたナノ繊維からなる不織布が提案されている。エレクトロスピニング法を用いて紡糸されたナノ繊維からなる不織布は細胞外マトリクスと構造的に近似しており、優れた細胞接着、増殖用基材となり得ると指摘されている（非特許文献１）。また、エレクトロスピニング法を用いることによって繊維に無機フィラーを含有させることができることは大きな特長である。 Recently, a nonwoven fabric composed of nanofibers spun using an electrospinning method as a cell culture substrate has been proposed. It has been pointed out that a nonwoven fabric composed of nanofibers spun using an electrospinning method is structurally similar to an extracellular matrix and can be a substrate for excellent cell adhesion and growth (Non-Patent Document 1). It is also a great feature that the fiber can contain an inorganic filler by using the electrospinning method.
しかし、エレクトロスピニング法を用いて紡糸されたナノ繊維からなる不織布は、繊維と繊維の間のスペースが極わずかしかない。ヒトの細胞は通常１０μｍ以上の大きさを有するので、繊維間のスペースが１０μｍよりも狭いと細胞が侵入できないことが指摘されている（非特許文献２）。不織布に厚みを持たせるために複数の層を堆積させると、細胞が侵入することができる繊維の隙間はさらに小さくなる。 However, nonwoven fabrics made of nanofibers spun using the electrospinning method have very little space between the fibers. It is pointed out that human cells usually have a size of 10 μm or more, so that if the space between the fibers is smaller than 10 μm, the cells cannot enter (Non-Patent Document 2). Depositing multiple layers to increase the thickness of the nonwoven further reduces the interstices of the fibers where cells can enter.
不織布の繊維間のスペースは、不織布を構成する繊維の径を太くすることによって大きくすることが可能である。しかし、エレクトロスピニング法は、テイラーコーン現象によってノズルから出射された繊維がコレクターに向けて飛行する過程で電荷の偏りに起因して生じるbending instability現象を利用して繊維径を急激に細くしてナノオーダーの繊維にするものであるため、その方法を用いて数十μｍの径に繊維の太さを安定的に作り出すのは困難であった。上記非特許文献１、２が開示している繊維の径は数百ｎｍ〜数μｍである。 The space between the fibers of the nonwoven fabric can be increased by increasing the diameter of the fibers constituting the nonwoven fabric. However, the electrospinning method uses the bending instability phenomenon that occurs due to the bias of electric charges in the process in which the fiber emitted from the nozzle flies toward the collector due to the Taylor cone phenomenon. Since the fibers are of the order, it is difficult to stably produce a fiber thickness of several tens of μm using the method. The diameters of the fibers disclosed in Non-Patent Documents 1 and 2 are several hundred nm to several μm.
マイクロオーダーの径の繊維はメルトスピニング法を用いることによって簡単に紡糸することができる。メルトスピニング法は、溶融した樹脂をノズル穴から押し出して自重で落下させて巻き取り装置で巻き取ることによって繊維を回収する。しかし、メルトスピニング法では、繊維はノズルから出射された後かなり早いタイミングで温度の低下により固化してしまうので、ドラムに堆積する時点で繊維同士は互いに融着していないので、スピンされた繊維を不織布として回収するのが難しい。また、メルトスピニング法では、繊維にフィラーを多量に含有させることが困難である。 Fibers having a micro-order diameter can be easily spun by using a melt spinning method. In the melt spinning method, a molten resin is extruded from a nozzle hole, dropped by its own weight, and wound by a winding device to collect fibers. However, in the melt spinning method, the fibers are solidified due to a decrease in temperature at a considerably early timing after being emitted from the nozzle, and the fibers are not fused to each other when they are deposited on the drum. Is difficult to recover as nonwoven fabric. In addition, in the melt spinning method, it is difficult to make the fiber contain a large amount of filler.
不織布を細胞培養基材として用いるためには、不織布を構成する繊維の径が数十μｍのレベルに制御されて、繊維間に細胞が侵入するのに十分な間隙が確保されていることが望ましい。しかし、従来のエレクトロスピニング法はbending instability現象を利用してナノ繊維を紡糸するものであるため、数十μｍの径の繊維間に十分な間隙を有する不織布を製造することは困難であった。それ故、エレクトロスピニング法を用いて細胞培養基材を商業的に製造することは実際上難しかった。 In order to use the nonwoven fabric as a cell culture substrate, it is desirable that the diameter of the fibers constituting the nonwoven fabric is controlled to a level of several tens of μm, and that a sufficient gap is provided between the fibers for cells to enter. . However, since the conventional electrospinning method uses the bending instability phenomenon to spin nanofibers, it has been difficult to produce a nonwoven fabric having a sufficient gap between fibers having a diameter of several tens of μm. Therefore, it has been practically difficult to commercially produce cell culture substrates using the electrospinning method.
上記の課題を解決するために本発明の発明者等は実験を重ねて鋭意検討した結果、口径が大きいノズルを下方向に向けて設置して、紡糸溶液を速い送り出し速度でシリンジからノズルへフィードして電圧を印加すると、ノズルの吐出口先端から太い径の繊維がテイラーコーン現象によって出射され、出射された太い繊維が自重と電気力の作用によって回収用ドラムに向かって落下飛行することに気が付いた。 In order to solve the above-described problems, the inventors of the present invention have repeatedly conducted experiments and studied diligently.As a result, a large-diameter nozzle is installed facing downward, and the spinning solution is fed from the syringe to the nozzle at a high delivery speed. When a voltage is applied, a large diameter fiber is emitted from the tip of the nozzle outlet by the Taylor cone phenomenon, and it is noticed that the emitted thick fiber falls and flies toward the collection drum by the action of its own weight and electric force. Was.
その場合、溶媒を多量に含んだ太い繊維がそのまま回収用ドラムに落下して衝突すると、ドラムの表面にへばりついてしまい繊維としての形状を維持できない。しかし、ノズルから出射されて落下飛行中に軌道の不安定化現象を起こして繊維が振れることによって、繊維に含まれる溶媒がその過程で効果的に揮発し、その結果乾いた繊維がマイクロ繊維としての径と形状を失わずにドラムに堆積することを発見した。さらに、このようにしてドラムに堆積したマイクロ繊維は残留溶媒によって柔らかく、表面が弱い粘着性を有しているので、繊維と繊維が絡み合って接触する箇所において付着して連結しており、それをドラムから回収して乾燥させると、一定以上の長さを有する繊維間に十分なスペースを有する網目構造を有する不織布シートを得ることができることを発見した。 In this case, if a thick fiber containing a large amount of the solvent falls and collides with the collecting drum as it is, it sticks to the surface of the drum, and the shape as the fiber cannot be maintained. However, the fibers emitted from the nozzles cause the orbit to become unstable during the falling flight, causing the fibers to oscillate, and the solvent contained in the fibers is effectively volatilized in the process, resulting in the dry fibers becoming microfibers. Was found to accumulate on the drum without losing its diameter and shape. Furthermore, since the microfibers deposited on the drum in this way are soft due to the residual solvent and have a weak adhesive surface, they are attached and connected at places where the fibers are entangled and in contact with each other. It has been discovered that a nonwoven sheet having a network structure having a sufficient space between fibers having a certain length or more can be obtained by collecting and drying from a drum.
上記の発見に基づいて、本発明の発明者等は、
エレクトロスピニング法を用いてマイクロオーダーの径を有する溶媒可溶性樹脂繊維からなるシートを製造するための方法であって、
装置の内部空間の温度と湿度を調整可能な筐体と、
前記筐体の上部に取付けられており紡糸溶液を充填するためのシリンジと、
内径が０．４ｍｍ〜１．０ｍｍの吐出口を有する導電体製のノズルであって、前記ノズルは前記シリンジにチューブを介して連結されて、吐出口が下方向に向けられており、前記シリンジに充填された紡糸溶液を前記チューブを通して３ｍｌ／ｈ〜１５ｍｌ／ｈの送り出し速度で押し出すことによって紡糸溶液を前記ノズルの吐出口に体積流量０．８３ｍｍ３／秒〜４．２ｍｍ３／秒、質量流量１．２ｍｇ／秒〜６．８ｍｇ／秒でフィードするように設定されており、
前記ノズルに所定の高電圧を印加可能な直流電源と、
前記筐体の底部にあって前記ノズルの吐出口から下方向に１５０〜４００ｍｍ距離離れた位置に備え付けられ、かつ電気的に接地された回転ドラムを備え、
前記ノズルに前記所定の高電圧を印加することで、前記紡糸溶液を帯電させると共に、前記ノズルと前記回転ドラムの間に電位差を生じさせて、前記帯電した紡糸溶液を前記ノズルの先端からテイラーコーン現象によって静電引力で引っ張ることによって、前記紡糸溶液が繊維状に出射されて前記筐体内を落下飛行して前記回転ドラム上に堆積させることができるエレクトロスピニング装置を用いて、
分子量が５万〜７０万の溶媒可溶性樹脂を揮発性溶媒を用いて溶解することによって樹脂濃度が５重量％〜８重量％の紡糸溶液を調製し、
前記紡糸溶液をシリンジに充填して前記送り出し速度で押し出すことによって前記ノズルの吐出口にフィードし、
前記ノズルに所定の高電圧を印加することによって、前記送り出し速度でフィードされた前記紡糸溶液に前記ノズルの吐出口の先端においてテイラーコーン現象を生じさせて繊維状に出射させると共に、前記ノズルから出射されて前記回転ドラムに向かって落下飛行する繊維の飛行軌道を振らせ、
前記ノズルから出射されて飛行軌道を振られながら落下飛行してきた繊維を所定の速度で回転する前記回転ドラムの表面に堆積させることによって、外径１０μｍ〜１００μｍで長さが２０ｃｍ以上の複数の繊維が絡み合って互いに接触する複数の箇所で付着して連結しており、繊維間距離１μｍ〜１００μｍの網目構造を有するシートを製造する、
エレクトロスピニング法を用いてマイクロオーダーの径を有する溶媒可溶性樹脂繊維からなるシートを製造するための方法、という発明に至った。
Based on the above findings, the inventors of the present invention
A method for manufacturing a sheet made of solvent-soluble resin fibers having a micro-order diameter using an electrospinning method,
A housing capable of adjusting the temperature and humidity of the internal space of the device,
A syringe mounted on the top of the housing and for filling a spinning solution;
A nozzle made of a conductor having a discharge port having an inner diameter of 0.4 mm to 1.0 mm, wherein the nozzle is connected to the syringe via a tube, and the discharge port is directed downward. The spinning solution filled in is extruded through the tube at a delivery speed of 3 ml / h to 15 ml / h, so that the spinning solution flows to the discharge port of the nozzle at a volume flow rate of 0.83 mm 3 / sec to 4.2 mm 3 / sec, mass It is set to feed at a flow rate of 1.2 mg / sec to 6.8 mg / sec,
A DC power supply capable of applying a predetermined high voltage to the nozzle,
A rotary drum that is provided at a position at a distance of 150 to 400 mm downward from the discharge port of the nozzle at the bottom of the housing and is electrically grounded,
By applying the predetermined high voltage to the nozzle, the spinning solution is charged, and a potential difference is generated between the nozzle and the rotating drum, so that the charged spinning solution is discharged from the tip of the nozzle to the Taylor cone. By using an electrospinning device capable of being pulled out by the phenomenon by electrostatic attraction, the spinning solution is emitted in a fibrous form, dropped in the casing, and deposited on the rotating drum,
A solvent solution having a molecular weight of 50,000 to 700,000 is dissolved using a volatile solvent to prepare a spinning solution having a resin concentration of 5% by weight to 8% by weight,
The spinning solution is filled in a syringe and fed to the discharge port of the nozzle by extruding at the delivery speed,
By applying a predetermined high voltage to the nozzle, the spinning solution fed at the delivery speed causes a Taylor cone phenomenon at the tip of the discharge port of the nozzle to emit in a fiber form, and the fiber is emitted from the nozzle. Swing the flight trajectory of the fiber falling and flying toward the rotating drum,
A plurality of fibers having an outer diameter of 10 μm to 100 μm and a length of 20 cm or more are deposited on the surface of the rotating drum which rotates at a predetermined speed by dropping the fibers emitted from the nozzle and flying in a flight trajectory while falling. Are entangled and attached and connected at a plurality of points in contact with each other to produce a sheet having a network structure with a fiber-to-fiber distance of 1 μm to 100 μm.
The invention of a method for producing a sheet made of a solvent-soluble resin fiber having a micro-order diameter using an electrospinning method has been achieved.
好ましくは、前記ノズルの吐出口と前記回転ドラムの間の距離は、テイラーコーンを生じさせるために必要な電場の強さを得るために、Ｖ＝Ｅｄの公式に従って、ノズルに印加する電圧との関係で調整される。 Preferably, the distance between the outlet of the nozzle and the rotating drum is different from the voltage applied to the nozzle according to the formula V = Ed in order to obtain the strength of the electric field required to produce a Taylor cone. Adjusted in relationship.
好ましくは、前記筐体内部の温度を１５℃〜３０℃で湿度を６０％以下に保つ。 Preferably, the temperature inside the housing is kept at 15 to 30 ° C. and the humidity is kept at 60% or less.
好ましくは前記溶媒可溶性樹脂は分子量２０万〜４０万のＰＬＧＡ又はＰＬＬＡである。 Preferably, the solvent-soluble resin is PLGA or PLLA having a molecular weight of 200,000 to 400,000.
好ましくは、前記ノズルの口径は内径が０．７〜０．９ｍｍ（１８Ｇ）である。 Preferably, the nozzle has an inner diameter of 0.7 to 0.9 mm (18 G).
好ましくは、前記紡糸溶液をノズルに押し出す送り出し速度は、３ｍｌ／ｈ〜１５ｍｌ／ｈ、さらに好ましくは３ｍｌ／ｈ〜１２ｍｌ／ｈである。 Preferably, the feeding speed for pushing the spinning solution to the nozzle is 3 ml / h to 15 ml / h, more preferably 3 ml / h to 12 ml / h.
好ましくは、前記紡糸溶液は、生分解性樹脂を純度９９％以上のクロロホルムで溶解することによって調製される。 Preferably, the spinning solution is prepared by dissolving a biodegradable resin in chloroform having a purity of 99% or more.
好ましくは、前記紡糸溶液は、無機フィラーを含む。 Preferably, the spinning solution contains an inorganic filler.
本発明の発明者等はさらに、生分解性繊維からなるシートを用いて作製された細胞培養基材であって、
前記シートは、エレクトロスピニング法で紡糸された外径１０〜１００μｍで長さが２０ｃｍ以上の生分解性繊維からなり、複数の生分解性繊維がランダムな方向に配列して絡み合って、繊維と繊維とが接触する箇所において付着して連結することによって網目構造を構成しており、
前記シートを構成する繊維と繊維の間に１μｍ〜１００μｍのスペースが形成されており、
前記シートを構成する繊維の表面には無数の微細気孔が形成されており、
前記シートの厚さは０．５ｍｍ〜１．０ｍｍである、
生分解性繊維からなる網目構造を有するシートを用いて作製された細胞培養基材、という発明に到達した。
The inventors of the present invention are further a cell culture substrate prepared using a sheet made of biodegradable fibers,
The sheet is composed of biodegradable fibers having an outer diameter of 10 to 100 μm and a length of 20 cm or more spun by an electrospinning method, and a plurality of biodegradable fibers are arranged in a random direction and entangled to form fibers and fibers. A network structure is formed by attaching and connecting at places where
A space of 1 μm to 100 μm is formed between the fibers constituting the sheet, and
Innumerable fine pores are formed on the surface of the fibers constituting the sheet,
The thickness of the sheet is 0.5 mm to 1.0 mm,
The present invention has reached a cell culture substrate manufactured using a sheet having a network structure made of biodegradable fibers.
好ましくは、前記生分解性繊維は、リン酸カルシウムの粒子を含有しており、前記リン酸カルシウム粒子はその全部又は一部が前記生分解性繊維の表面に露出している。 Preferably, the biodegradable fiber contains particles of calcium phosphate, and the calcium phosphate particles are entirely or partially exposed on the surface of the biodegradable fiber.
好ましくは、前記生分解性繊維は、分子量が２０万〜４０万のＰＬＧＡ又はＰＬＬＡからなる。 Preferably, the biodegradable fiber is made of PLGA or PLLA having a molecular weight of 200,000 to 400,000.
本発明の方法では、ノズルから出射された太い繊維はノズルとドラムの間に形成された電場において飛行軌道の不安定化現象を生じて飛行軌道が振られることによって溶媒の蒸発が促進され、その結果乾いた繊維がマイクロオーダーの径の繊維としての形状を維持しながら回転ドラムに堆積して網目構造を有するシートを形成する。 In the method of the present invention, the thick fiber emitted from the nozzle causes an instability phenomenon of the flight trajectory in the electric field formed between the nozzle and the drum, and the flight trajectory is swung, thereby promoting the evaporation of the solvent. As a result, the dried fibers are deposited on the rotating drum while maintaining the shape of the fibers having a diameter on the order of micrometer, thereby forming a sheet having a network structure.
本発明の方法では、ノズルから出射された繊維は溶媒を多量に含んだ状態で飛行中に振られることで、溶媒が蒸発して乾燥する結果数十μの径を有する繊維が巻回した状態でドラム上に堆積するので、長い曲線状の繊維がドラム上で互いに絡み合って網目構造を有するシートを形成する。 In the method of the present invention, the fiber emitted from the nozzle is shaken during flight in a state containing a large amount of solvent, so that the solvent is evaporated and dried, and as a result, the fiber having a diameter of several tens of μ is wound. , The long curved fibers are entangled with each other on the drum to form a sheet having a network structure.
本発明の方法を用いて製造したシートは、外径数十μｍで長さ２０ｃｍ以上の複数の繊維が各々繊維としての形状を維持しながら絡み合って、互いに接触する箇所で付着連結して網目構造を形成するので、細胞が侵入できるのに十分な繊維間の隙間が形成されており、細胞外マトリクスに近似した構造を有する優れた細胞培養基材として用いることができる。 The sheet manufactured using the method of the present invention has a network structure in which a plurality of fibers having an outer diameter of several tens of μm and a length of 20 cm or more are entangled while maintaining the shape of each of the fibers, and are adhered and connected at places where they contact each other. Is formed, so that gaps between the fibers are formed enough to allow cells to enter, and the cell can be used as an excellent cell culture substrate having a structure similar to the extracellular matrix.
本発明の方法を用いて製造したシートを構成する繊維は、繊維の表面に無数の微細気孔が形成されていることによって比表面積が著しく増大しており、細胞培養基材として用いると、シートに捕捉された細胞を基材繊維に対して高い効率で接着させることができる。 The fibers constituting the sheet manufactured using the method of the present invention have a remarkably increased specific surface area due to the formation of innumerable fine pores on the surface of the fibers. The captured cells can be adhered to the base fiber with high efficiency.
本発明の方法では、エレクトロスピニングの紡糸溶液にヒドロキシアパタイトを含有させることができるので、ヒドロキシアパタイトを含有する繊維からなるシートを高い細胞接着性を有する細胞培養基材として製造することができる。 In the method of the present invention, hydroxyapatite can be contained in the spinning solution for electrospinning, so that a sheet made of hydroxyapatite-containing fibers can be produced as a cell culture substrate having high cell adhesion.
以下本発明を実施するための好ましい形態について図面を用いて説明する。
（１）本発明のエレクトロスピニング装置の構成
図１において、本発明のエレクトロスピニング装置１は、シリンジ２０、ノズル３０、回転ドラム４０を収納する筐体１０を有する。筐体１０は、静電気が帯電することを避けるために、スチール等の導電性の材料で形成されていることが好ましい。回転ドラム４０は電気的に接地されている。
Hereinafter, preferred embodiments for carrying out the present invention will be described with reference to the drawings.
(1) Configuration of the Electrospinning Apparatus of the Present Invention In FIG. 1, the electrospinning apparatus 1 of the present invention has a housing 10 that houses a syringe 20, a nozzle 30, and a rotating drum 40. The housing 10 is preferably formed of a conductive material such as steel in order to avoid charging with static electricity. The rotating drum 40 is electrically grounded.
＜筐体＞
筐体１０は、前面開口部を開閉可能に取り付けられた前扉１１を閉じることによって外気から遮断して筐体内の温度と湿度を個々の紡糸の紡糸条件に応じて調整することができる。筐体１０には、排気ファンが備えられており、装置の稼働中換気可能である。筐体１０の天井付近には、ノズル３０を水平方向にスライド移動させるための設備であるレール３１が取り付けられている。本発明の方法では、ノズルから出射した太い繊維が回転ドラムに繊維としての形状を有して堆積するためには、出射された繊維が筐体１０内を落下飛行する間に溶媒が十分に蒸発する必要があるので、筐体内の温度が15℃〜30℃、湿度が50％以下に調整されていることが望ましい。
<Housing>
The housing 10 can be closed from the outside air by closing the front door 11 attached to the front opening so that the front opening can be opened and closed, and the temperature and humidity in the housing can be adjusted according to the spinning conditions of individual spinning. The housing 10 is provided with an exhaust fan, and can perform ventilation during operation of the apparatus. A rail 31 which is a facility for sliding the nozzle 30 in a horizontal direction is attached near the ceiling of the housing 10. In the method of the present invention, in order for the thick fibers emitted from the nozzle to accumulate in the form of fibers on the rotating drum, the solvent is sufficiently evaporated while the emitted fibers fall and fly in the casing 10. Therefore, it is desirable that the temperature in the housing is adjusted to 15 ° C. to 30 ° C. and the humidity is adjusted to 50% or less.
＜シリンジ＞
シリンジ２０は筐体１０の天井付近に固定されている。シリンジ２０は、筐体１０に備えられたレールに取り付けられて、シリンジ２０自体がレール上をノズル３０と共にスライド移動するように構成されていてもよい。
<Syringe>
The syringe 20 is fixed near the ceiling of the housing 10. The syringe 20 may be configured to be attached to a rail provided on the housing 10 so that the syringe 20 itself slides on the rail together with the nozzle 30.
紡糸溶液をシリンジ２０に充填した後、紡糸開始のスイッチを押すと、シリンジ２０に充填された紡糸溶液がチューブを通して一定圧力／速度でノズル３０に押し出されて、エレクトロスピニングが開始される。本発明の一つの実施例では、シリンジに充填できる紡糸溶液の量は１０ｍｌに設定されている。 When the spinning start switch is pressed after filling the spinning solution into the syringe 20, the spinning solution filled in the syringe 20 is pushed out to the nozzle 30 at a constant pressure / speed through a tube, and electrospinning is started. In one embodiment of the present invention, the amount of spinning solution that can be filled into the syringe is set at 10 ml.
＜ノズル＞
図１において、ノズル３０はシリンジ２０にチューブ２１を介して接続されている。ノズル３０は、筐体１０に設けられたレール上をスライド移動可能に設置されている。シリンジ２０は筐体１０に固定して、シリンジ２０と柔軟なチューブ２１でつながったノズル３０が（チューブ２１が届く範囲で）レール３１上を水平移動するように構成されていてもよい。ノズル３０は、導電体製の中空のニードルを備え、シリンジ２０から押し出された紡糸溶液はノズル中に導入されて、ニードルの先端から吐出される。
<Nozzle>
In FIG. 1, the nozzle 30 is connected to the syringe 20 via a tube 21. The nozzle 30 is slidably mounted on a rail provided on the housing 10. The syringe 20 may be fixed to the housing 10 so that the nozzle 30 connected to the syringe 20 by the flexible tube 21 moves horizontally on the rail 31 (within the reach of the tube 21). The nozzle 30 includes a hollow needle made of a conductive material, and the spinning solution extruded from the syringe 20 is introduced into the nozzle and discharged from the tip of the needle.
＜ノズル径＞
本発明のエレクトロスピニング装置で用いられるノズルの口径は、その大きさに応じて２７Ｇ，２２Ｇ，１８Ｇに区別される。２７Ｇ，２２Ｇ，１８Ｇの口径の値は次の表に示す通りである。
<Nozzle diameter>
The diameter of the nozzle used in the electrospinning apparatus of the present invention is classified into 27G, 22G, and 18G according to its size. The values of the apertures of 27G, 22G and 18G are as shown in the following table.
＜電源＞
ノズル３０には電圧を調整可能な直流電源（ＰＷ）が接続されている。直流電源をＯＮにすると、ノズル３０にプラスの高電圧が印加され、ノズル３０がプラス電極となり、電気的に接地された回転ドラム４０が静電誘導を生じてマイナスに帯電することによってマイナス電極となって、ノズル３０と回転ドラム４０の間に電場が形成される。ノズル３０の先端では、ノズルから吐出したプラスに帯電した紡糸溶液が、静電引力を受けて、テイラーコーン現象を起こして、空中に繊維状に出射される。
<Power supply>
A DC power supply (PW) capable of adjusting the voltage is connected to the nozzle 30. When the DC power supply is turned on, a positive high voltage is applied to the nozzle 30, the nozzle 30 becomes a positive electrode, and the electrically grounded rotating drum 40 generates electrostatic induction and is negatively charged, so that the negative electrode is connected to the negative electrode. As a result, an electric field is formed between the nozzle 30 and the rotating drum 40. At the tip of the nozzle 30, the positively charged spinning solution discharged from the nozzle receives electrostatic attraction, causes a Taylor cone phenomenon, and is emitted into the air in a fibrous form.
＜回転ドラム＞
筐体１０の底部には、エレクトロスピニングで紡糸された繊維を不織布として回収するための回転ドラム４０が据え付けられている。回転ドラム３０は電気的に接地されており、ノズル３０にプラス電圧を印加すると静電誘導を生じて、回転ドラム４０はマイナスに帯
電してノズル３０の反対電極となる。
<Rotary drum>
A rotating drum 40 for collecting the fiber spun by electrospinning as a nonwoven fabric is installed at the bottom of the housing 10. The rotating drum 30 is electrically grounded. When a positive voltage is applied to the nozzle 30, electrostatic induction occurs, and the rotating drum 40 is negatively charged and becomes the opposite electrode of the nozzle 30.
回転ドラムには導電性のアルミシート又はシリコーンシート等の剥離性の高いシートを巻いて、ノズル３０から出射し落下飛行してきた繊維を、回転する巻き取り軸を中心にドラムに巻き取ることによって不織布を得ることができる。このとき、ドラムに堆積した繊維はＥＳの高電圧を受けて電荷を帯びているので、堆積したドラム表面において互いに反発し合う。ドラムの回転速度が速いと繊維は巻き取り方向に整列して配向する傾向が強いが、ドラムの回転速度が遅いと繊維の互いの反発力が勝って、その結果、繊維はランダムな方向に配向する傾向が強くなる。 A non-woven fabric is formed by winding a highly peelable sheet such as a conductive aluminum sheet or a silicone sheet around the rotating drum, and winding the fiber emitted from the nozzle 30 and flying down around the rotating winding shaft around the drum. Can be obtained. At this time, the fibers deposited on the drum are charged with the high voltage of the ES and repel each other on the surface of the deposited drum. When the drum rotation speed is high, the fibers tend to be aligned and oriented in the winding direction, but when the drum rotation speed is low, the fibers repel each other, and as a result, the fibers are oriented in random directions. Tendency to do so.
（２）樹脂
本発明に用いるエレクトロスピニング装置１によって紡糸できる樹脂の種類には特に制限がなく、溶媒によって溶かすことができる溶媒可溶性の樹脂であれば用いることができる。樹脂としてＰＬＡ，ＰＬＧＡ，ＰＣＬ等の生分解性樹脂を用いて製造された生分解性繊維からなるシートを細胞培養基材として用いると、細胞を培養した後で基材ごと生体内にインプラントすることが可能であるので、特に好適に用いることができる。
(2) Resin There is no particular limitation on the type of resin that can be spun by the electrospinning apparatus 1 used in the present invention, and any resin soluble in a solvent that can be dissolved by a solvent can be used. When a sheet made of biodegradable fibers manufactured using a biodegradable resin such as PLA, PLGA, or PCL as a resin is used as a cell culture substrate, the cells can be implanted together with the substrate into a living body after culturing the cells. Therefore, it can be particularly preferably used.
エレクトロスピニング法を用いて樹脂を繊維化するには、樹脂の分子量は５万〜７０万が好ましい。より好ましくは２０万〜４０万が好ましい。分子量が低すぎると分子鎖同士の絡み合いが弱くなり、繊維として形状を維持できなくなる可能性がある。逆に分子量が大きすぎると、紡糸溶液の粘度が高くなりすぎて、粘度を下げるために紡糸溶液中の溶媒の割合を大きくして樹脂濃度を下げる必要があるが、そうすると、今度は紡糸溶液中の溶媒の量が多くなりすぎて、ノズルから出射された後、飛行中に溶媒が十分に揮発されて繊維化するのが難しくなる。 In order to fiberize the resin using the electrospinning method, the molecular weight of the resin is preferably 50,000 to 700,000. More preferably, it is 200,000 to 400,000. If the molecular weight is too low, the entanglement between the molecular chains becomes weak, and the shape may not be maintained as a fiber. Conversely, if the molecular weight is too large, the viscosity of the spinning solution becomes too high, and it is necessary to reduce the resin concentration by increasing the proportion of the solvent in the spinning solution in order to reduce the viscosity. The amount of the solvent becomes too large, so that after the light is emitted from the nozzle, the solvent is sufficiently volatilized during flight and it is difficult to form fibers.
（３）揮発性溶媒
本発明の方法に用いる溶媒は、溶媒可溶性樹脂を溶解し、常圧で沸点が２００℃以下で揮発性が高く、室温で液体である物質が好ましい。クロロホルムは生分解性樹脂の溶解性に優れ、なおかつ揮発性が高いので本発明の方法に用いる揮発性の溶媒として好ましい。
(3) Volatile Solvent The solvent used in the method of the present invention is preferably a substance that dissolves a solvent-soluble resin, has a boiling point of 200 ° C. or less at normal pressure, has high volatility, and is liquid at room temperature. Chloroform is preferred as the volatile solvent used in the method of the present invention because it has excellent solubility of the biodegradable resin and high volatility.
（４）紡糸溶液の樹脂濃度
本発明の方法において、紡糸溶液の樹脂濃度は、シリンジからノズルに高い送り出し速度でスムーズに紡糸溶液を送り出すことができるためには一定以下にする必要がある。発明者等の実験によると、分子量が２０万〜４０万の樹脂をクロロホルムに溶解して得た紡糸溶液の樹脂濃度が８重量％を超えると紡糸溶液が固くてスムーズに送り出すことが難しかった。
(4) Resin Concentration of Spinning Solution In the method of the present invention, the resin concentration of the spinning solution needs to be lower than a certain value so that the spinning solution can be smoothly fed from the syringe to the nozzle at a high feeding speed. According to experiments performed by the inventors, when the resin concentration of a spinning solution obtained by dissolving a resin having a molecular weight of 200,000 to 400,000 in chloroform exceeds 8% by weight, the spinning solution is hard and cannot be smoothly fed.
他面、紡糸溶液の樹脂濃度は、ノズルから出射された紡糸溶液が回転ドラムの表面に堆積し乾燥した後に一本の連続した繊維を構成するためには一定以上であることが必要である。発明者等の実験によると、分子量が２０万〜４０万の樹脂をクロロホルムに溶解して得た紡糸溶液の樹脂濃度が４重量％以下では連続した繊維からなるシートを形成することができなかった。 On the other hand, the resin concentration of the spinning solution needs to be more than a certain level in order to form one continuous fiber after the spinning solution emitted from the nozzle is deposited on the surface of the rotating drum and dried. According to experiments by the inventors, it was not possible to form a sheet composed of continuous fibers when the resin concentration of a spinning solution obtained by dissolving a resin having a molecular weight of 200,000 to 400,000 in chloroform was 4% by weight or less. .
紡糸溶液は、樹脂と溶媒に加えて、フィラーとしてＨＡｐ等の無機粒子を含んでもよい。 The spinning solution may contain inorganic particles such as HAp as a filler in addition to the resin and the solvent.
（５）シリンジに充填した紡糸溶液をノズルに送り出す
本発明の方法では、シリンジに充填した紡糸溶液を高い速度で送り出すので、ノズルの吐出口における紡糸溶液の毎秒ごとの流量は大きくなる結果、テイラーコーンで出射される繊維の径が大きくなると考えられる。本発明の実施例では、シリンジに充填した紡糸溶液を３ｍｌ／ｈ〜１５ｍｌ／ｈの速度で内径が０．４ｍｍ〜１．０ｍｍの吐出口に送り出すと、ノズルの吐出口における紡糸溶液の体積流量は０．８３ｍｍ３／秒〜４．２ｍｍ３／秒、質量流量は１．２ｍｇ／秒〜６．８ｍｇ／秒である。
(5) In the method of the present invention in which the spinning solution filled in the syringe is sent to the nozzle, the spinning solution filled in the syringe is sent out at a high speed. It is considered that the diameter of the fiber emitted from the cone increases. In the embodiment of the present invention, when the spinning solution filled in the syringe is sent at a speed of 3 ml / h to 15 ml / h to an outlet having an inner diameter of 0.4 mm to 1.0 mm, the volume flow rate of the spinning solution at the outlet of the nozzle is increased. Is 0.83 mm 3 / sec to 4.2 mm 3 / sec, and the mass flow rate is 1.2 mg / sec to 6.8 mg / sec.
（６）ノズルに電圧を印加
紡糸溶液をシリンジに充填した上で直流電源をＯＮにしてノズル３０に電圧を印加する。ノズル３０に電圧を印加することによって、充填された紡糸溶液を帯電させると共に、設
置されたドラムコレクターとノズルの間に電位差を生じ、帯電した紡糸溶液がテイラーコーン現象によってドラム方向に引っ張られる。
(6) Applying voltage to the nozzle After filling the spinning solution into the syringe, the DC power supply is turned on to apply the voltage to the nozzle 30. By applying a voltage to the nozzle 30, the charged spinning solution is charged, and a potential difference is generated between the installed drum collector and the nozzle, whereby the charged spinning solution is pulled toward the drum by the Taylor cone phenomenon.
本発明の方法では、ノズルから出射された繊維状の紡糸溶液は、電場で飛行軌道を不安定化させる力を受けても、それによって急激に細くなってナノ繊維化することはなく、マイクロオーダーの繊維径を維持してドラムに堆積する。その理由は必ずしも明らかでないが、発明者等の推測によれば、出射された紡糸溶液が電気力と重力の作用を受けて落下飛行する状態では、電荷の偏りに起因する反発力を受けても、通常のエレクトロスピニングにおけるbending instability現象におけるような極細繊維化は起こらず、溶媒の蒸発と、それに伴い若干の繊維径の縮小が生じるに留まると考えられる。 According to the method of the present invention, the fibrous spinning solution emitted from the nozzle does not suddenly become thinner and become nanofibrous even if it receives a force that destabilizes the flight trajectory in an electric field, and thus has a micro-order. Is deposited on the drum while maintaining the fiber diameter. Although the reason is not always clear, the inventors have speculated that, in a state where the ejected spinning solution falls and flies under the action of electric force and gravity, even if it receives a repulsive force due to the bias of electric charge. However, it is considered that ultrafine fiber formation does not occur as in the bending instability phenomenon in ordinary electrospinning, and only the evaporation of the solvent and a slight reduction in the fiber diameter occur.
本発明の飛行軌道の不安定化現象が生じるためには、ノズルと回転ドラムの間に形成される電場が一定程度以上であることが必要である。電場の強さはＶ＝Ｅｄの公式より、印加する電圧の値とノズル３０と回転ドラム４０の距離によって決まるので、飛行軌道の不安定化現象を生じるために必要な印加電圧の値は単独では決まらない。しかし、ノズルから出射された繊維の飛行距離はその間に溶媒を蒸発させる必要があるので、一定以上にする必要があるので、印加する電圧の値は必然的に高く設定される。本発明の一つの実施例では、ノズルとドラム間の距離は２００ｍｍで、ノズルに印加する電圧は２８ｋＶに設定される。 In order for the flight orbit destabilization phenomenon of the present invention to occur, it is necessary that the electric field formed between the nozzle and the rotating drum be at least a certain level. Since the strength of the electric field is determined by the value of the applied voltage and the distance between the nozzle 30 and the rotating drum 40 according to the formula of V = Ed, the value of the applied voltage necessary to cause the phenomenon of instability of the flight trajectory alone is not decided. However, since the flight distance of the fiber emitted from the nozzle needs to evaporate the solvent during that time, it needs to be more than a certain value, so the value of the applied voltage is necessarily set to be high. In one embodiment of the present invention, the distance between the nozzle and the drum is 200 mm, and the voltage applied to the nozzle is set at 28 kV.
（７）不織布を回収
アルミシートやシリコーンシート等の剥離性の高いシートを巻いた回転ドラム上に繊維を不織布として堆積させた後、アルミシートを回転ドラムから取り外すことによって、シートを回収することができる。本発明の方法では、紡糸した一本一本の繊維の長さは２０ｃｍ以上あり、落下飛行中に軌道を振られることで巻回状態でドラムに到達するので、巻回して曲線状となった長い複数の繊維がドラム上で互いに絡み合って不織布を構成する。
(7) Recovering the nonwoven fabric After the fibers are deposited as a nonwoven fabric on a rotating drum wound with a highly releasable sheet such as an aluminum sheet or a silicone sheet, the sheet can be recovered by removing the aluminum sheet from the rotating drum. it can. In the method of the present invention, each spun fiber has a length of 20 cm or more, and reaches the drum in a wound state by being orbited during the falling flight, so that it is wound into a curved shape. Long fibers are intertwined with each other on the drum to form a nonwoven fabric.
実験
ＰＬＧＡ樹脂をクロロホルムで溶解して調製した紡糸溶液を用いてエレクトロスピニング法で紡糸したマイクロ繊維からなるシートを作製する実験１，２，３，４を実施した。
[実験１]
分子量３４万のPLGA （Evonik社製 LG855S）を純度９９％以上のクロロホルムに溶かして樹脂濃度６重量％の紡糸溶液を調製した。調製した紡糸溶液を用いて、エレクトロスピニング法で紡糸した。
1) ES条件
ES装置： NANON-03 (株式会社MECC提供)
溶媒：クロロホルム 純度９９％以上
溶媒中の樹脂濃度：６wt%
電圧：２８kV
押し出し速度：１０ml/h
針の太さ：１８Ｇ
ノズルからコレクターまでの飛距離：２００ｍｍ
コレクター：回転式ドラム（回転速度50rpm）。
2) 実験1の結果
・ノズルから出射した繊維は飛行軌道を途中で不安定化させながら下方向に落下飛行し、繊維の飛行軌道が振れながら回転ドラムに堆積するのが目視できた。
・ドラムに堆積した繊維の繊維径は大体１０〜２０μｍであった。
・回転ドラムに堆積した繊維は複数の繊維が絡み合って網目構造を有するシートを形成した（図２（Ａ），（Ｂ）、（Ｃ）参照）。
・実験１で紡糸した繊維の長さを測定するために、コレクターとして回転ドラムに代えてエタノール液を満たした容器に繊維を入射させて綿状に回収し、回収した綿をほぐして綿を構成している繊維の長さを推定したところ約５０ｃｍ程度であると考えられる（図２（Ｅ）参照）。
EXPERIMENTS Experiments 1, 2, 3, and 4 were performed in which a sheet composed of microfibers spun by electrospinning using a spinning solution prepared by dissolving PLGA resin in chloroform was performed.
[Experiment 1]
PLGA having a molecular weight of 340,000 (LG855S manufactured by Evonik) was dissolved in chloroform having a purity of 99% or more to prepare a spinning solution having a resin concentration of 6% by weight. Using the prepared spinning solution, spinning was performed by an electrospinning method.
1) ES condition
ES equipment: NANON-03 (provided by MECC Inc.)
Solvent: chloroform Purity 99% or higher Resin concentration in solvent: 6 wt%
Voltage: 28kV
Extrusion speed: 10ml / h
Needle thickness: 18G
Flying distance from nozzle to collector: 200mm
Collector: rotary drum (rotation speed 50 rpm).
2) As a result of Experiment 1, the fiber emitted from the nozzle flew downward while destabilizing the flight trajectory on the way, and it was visually observed that the fiber trajectory fluctuated and accumulated on the rotating drum.
-The fiber diameter of the fibers deposited on the drum was approximately 10-20 [mu] m.
The fibers deposited on the rotating drum were formed by entanglement of a plurality of fibers to form a sheet having a network structure (see FIGS. 2A, 2B, and 2C).
-In order to measure the length of the fiber spun in Experiment 1, the fiber is injected into a container filled with ethanol solution instead of a rotating drum as a collector, collected into a floc, and the collected cotton is loosened to form cotton. The estimated length of the fiber is considered to be about 50 cm (see FIG. 2E).
[実験２]
1) ES条件
実験１と同じ条件で、紡糸溶液を調製し、同じエレクトロスピニング装置を用いて紡糸した。但し、電圧２１ｋＶ，ノズルから回転ドラムまでの飛距離を１５０ｍｍとした。
2) 実験２の結果
・ノズルから出射した繊維は途中飛行軌道を不安定化させながら下方向に落下飛行して回転ドラムに堆積した。繊維の飛行軌道はドラムに堆積する直前で振れていたが実験１よりも振れ具合は少なかった。
・ドラムに堆積した繊維の繊維径は長手方向で必ずしも一定せず細い箇所と太い箇所があったが、大体１０〜５０μｍの範囲内であった。
・回転ドラムに堆積した繊維は網目構造を形成したが、実験１よりも繊維と繊維の間の付着傾向が強かった（図３参照）。
[Experiment 2]
1) ES conditions A spinning solution was prepared under the same conditions as in Experiment 1, and spun using the same electrospinning apparatus. However, the voltage was 21 kV, and the flight distance from the nozzle to the rotating drum was 150 mm.
2) Results of Experiment 2-The fiber emitted from the nozzle dropped and flew downward while accumulating on the rotating drum while destabilizing the flight trajectory on the way. The flight trajectory of the fiber was swayed immediately before being deposited on the drum, but the sway was less than in Experiment 1.
-The fiber diameter of the fibers deposited on the drum was not always constant in the longitudinal direction, and there were a thin portion and a thick portion, but they were approximately in the range of 10 to 50 m.
The fibers deposited on the rotating drum formed a network structure, but had a stronger tendency to adhere between the fibers than in Experiment 1 (see FIG. 3).
[実験３]
1) ES条件
実験１と同じ条件で、紡糸溶液を調製し、同じエレクトロスピニング装置を用いて紡糸した。但し、電圧は１４ｋＶ，ノズルからコレクターまでの飛距離を１００ｍｍとした。
2) 実験３の結果
・ノズルから出射した繊維は途中飛行軌道を不安定化させながら下方向に落下飛行して回転ドラムに堆積した。
・ドラムに堆積した繊維の繊維径は１０〜５０μｍの繊維と数μｍ又はそれ以下の径の繊維が混在していた。
・回転ドラムに堆積した繊維は網目構造を形成したが、実験２よりもさらに繊維径のばらつきが大きく、また繊維と繊維の間の付着傾向がさらに強かった（図４参照）。
[Experiment 3]
1) ES conditions A spinning solution was prepared under the same conditions as in Experiment 1, and spun using the same electrospinning apparatus. However, the voltage was 14 kV, and the flight distance from the nozzle to the collector was 100 mm.
2) Results of Experiment 3-The fiber emitted from the nozzle dropped and flew downward while destabilizing the flight trajectory on the way, and accumulated on the rotating drum.
The fiber diameter of the fibers deposited on the drum was 10 to 50 μm mixed with fibers having a diameter of several μm or less.
-The fibers deposited on the rotating drum formed a network structure, but the variation in fiber diameter was larger than in Experiment 2, and the tendency of adhesion between fibers was stronger (see Fig. 4).
[実験４]
1) ES条件
実験１と同じ条件で、紡糸溶液を調製し、同じエレクトロスピニング装置を用いて紡糸した。但し、ノズルの口径は２２Ｇのものを用いた。
2) 実験４の結果
・ノズルから出射した繊維は途中で飛行軌道が不安定化して見えなくなった。
・ドラムに堆積した繊維の繊維径は５μｍ〜６０μｍで繊維同士が接触する箇所で互いに付着連結して網目構造を形成していた。
[Experiment 4]
1) ES conditions A spinning solution was prepared under the same conditions as in Experiment 1, and spun using the same electrospinning apparatus. However, a nozzle having a diameter of 22 G was used.
2) As a result of Experiment 4-The fiber emitted from the nozzle became invisible due to unstable flight trajectory on the way.
The fiber diameter of the fibers deposited on the drum was 5 μm to 60 μm, and the fibers were adhered and connected to each other where the fibers contacted each other to form a network structure.
＜＜実験１、２、３、４の評価＞＞
i) ノズルとドラムの距離
実験１、２、３、４において、ノズルとドラムの間の距離が実験２は１５０ｍｍ、実験３は１００ｍｍと実験１より短いが、Ｅ＝Ｖ／ｄの公式で計算される電場の強さは４つとも同じである。実験１，２，３の結果の比較から、ノズルとドラムの間の距離は長い（２００ｍｍ）方がドラムに堆積した繊維は一定の範囲内の径を有する繊維が繊維としての形状を保って網目構造を有するシートを形成し、反対に、ノズルとドラムの間の距離を短くすると（実験２は１５０ｍｍ、実験３は１００ｍｍ）、ドラムに堆積した繊維の径は一定せず、繊維同士が互いに付着する傾向が強かった。このことから、数十μｍの繊維からなるシートを形成するためには、ノズルから出射された繊維がドラムに堆積するまでの間に溶媒を蒸発するのに十分な距離間隔が存在することが重要であると考えられる。
ii) ノズルの口径
実験１と実験４で紡糸された繊維と不織布を比べると、１８Ｇの口径のノズルを用いた実験１では数十μｍの繊維が均一に紡糸されており、２２Ｇの口径のノズルを用いた実験４では、径の大きい繊維状のものが互いに付着して不織布を形成した。１０ｍｌ／ｈの送り出し速度では、２２Ｇよりも１８Ｇの方が、繊維の紡糸条件として優れていると考えられる。
<< Evaluation of Experiments 1, 2, 3, and 4 >>
i) Distance between nozzle and drum In experiments 1, 2, 3, and 4, the distance between the nozzle and the drum was 150 mm in experiment 2 and 100 mm in experiment 3 which was shorter than experiment 1, but calculated using the formula of E = V / d. The electric field strength is the same for all four. From the comparison of the results of Experiments 1, 2 and 3, it was found that the longer the distance between the nozzle and the drum (200 mm), the more the fibers deposited on the drum had a diameter within a certain range. When a sheet having a structure is formed and the distance between the nozzle and the drum is shortened (experiment 2 is 150 mm, experiment 3 is 100 mm), the diameter of the fibers deposited on the drum is not constant, and the fibers adhere to each other. The tendency to do it was strong. For this reason, in order to form a sheet made of fibers of several tens of μm, it is important that there is a sufficient distance between the fibers emitted from the nozzles to evaporate the solvent before the fibers are deposited on the drum. It is considered to be.
ii) Comparing the fibers spun in the nozzle diameter experiments 1 and 4 with the non-woven fabric, in experiment 1 using a 18 G nozzle, fibers of several tens of μm were spun uniformly, and a 22 G nozzle was used. In Experiment 4, the fibrous materials having a large diameter adhered to each other to form a nonwoven fabric. At a feed rate of 10 ml / h, it is considered that 18G is superior to 22G as a fiber spinning condition.
比較実験
上記実験１の条件を変えた比較実験１，２，３，４を実施して、マイクロ繊維からなるシートが形成されるために必要な条件を確認した。
[比較実験１]
1) ES条件
実験１と同じ条件で、紡糸溶液を調製し、同じエレクトロスピニング装置を用いて紡糸した。但し、ノズルは口径を２７Ｇを用い、紡糸溶液の送り出し速度を１ｍｌ／ｈとした。
2) 比較実験１の結果
・ノズルから出射した繊維はすぐに飛行軌道が振れて見えなくなった。
・ドラムに堆積した繊維の繊維径は５００ｎｍ〜８００ｎｍのものと数μｍの径のものとが混在していた（図６参照）。
Comparative Experiments Comparative experiments 1, 2, 3, and 4 were performed by changing the conditions of Experiment 1 above, and conditions necessary for forming a sheet made of microfibers were confirmed.
[Comparative experiment 1]
1) ES conditions A spinning solution was prepared under the same conditions as in Experiment 1, and spun using the same electrospinning apparatus. However, the nozzle used had a diameter of 27G, and the spinning solution delivery speed was 1 ml / h.
2) Results of Comparative Experiment 1-The fiber emitted from the nozzle immediately fluctuated in flight orbit and became invisible.
The fiber diameter of the fibers deposited on the drum was 500 nm to 800 nm, and the fiber diameter of several μm was mixed (see FIG. 6).
[比較実験２]
1) ES条件
実験１と同じ条件で、紡糸溶液を調製し、同じエレクトロスピニング装置を用いて紡糸した。但し、ノズルの口径は２７Ｇのものを用いた。
2) 比較実験２の結果
・ノズルから出射した繊維は途中で飛行軌道が不安定化して見えなくなった。
・シリンジに過負荷がかかり、固定が外れてしまった。原因は早すぎる押出速度によって口径を通りきれなかった溶液の力の逃げ場所がシリンジ固定部品に行ってしまったことによると考えられる。
・ドラムに堆積した繊維の繊維径は細く、数μｍ又はそれ以下の径のものが混在していた（図７参照）。
＜＜比較実験２の評価＞＞
シリンジからノズルへの送り出し速度が１０ｍｌ／ｈでノズル口径が２７Ｇでは安定した紡糸はできず、不織布も形成されなかった。送り出し速度が１０ｍｌ／ｈでは、ノズル口径は１８Ｇが適合していると考えられる。
[Comparative experiment 2]
1) ES conditions A spinning solution was prepared under the same conditions as in Experiment 1, and spun using the same electrospinning apparatus. However, the nozzle diameter used was 27G.
2) Results of comparative experiment 2-The fiber emitted from the nozzle became unstable in flight trajectory on the way and became invisible.
・ Syringe was overloaded and loosened. It is considered that the cause was that a place where the force of the solution that could not pass through the caliber due to the premature extrusion speed escaped to the syringe fixing part went.
-The fiber diameter of the fibers deposited on the drum was small, and those having a diameter of several μm or less were mixed (see FIG. 7).
<< Evaluation of Comparative Experiment 2 >>
When the delivery speed from the syringe to the nozzle was 10 ml / h and the nozzle diameter was 27 G, stable spinning was not possible, and no nonwoven fabric was formed. At a delivery speed of 10 ml / h, a nozzle diameter of 18 G is considered to be suitable.
[比較実験３]
1) ES条件
実験１と同じ条件で、紡糸溶液を調製し、同じエレクトロスピニング装置を用いて紡糸した。但し、樹脂濃度は４重量％とし、ノズルとドラムの間の距離は３００ｍｍとした。
2) 比較実験３の結果
・ノズルから出射した繊維は飛行軌道が不安定化することなく、そのまま真下に真直ぐに落下してドラムに堆積した。
・ドラムにはナノ繊維と、太い繊維状のものが混在して堆積しており、繊維の長さは短く、不織布にはなっていなかった（図８参照）。
＜＜比較実験３の評価＞＞
樹脂濃度４重量％では紡糸溶液の溶媒の量が多く樹脂の量が少ないので、ノズルから出射した紡糸溶液は、一本の連続した繊維を形成できていなかった。飛行中に繊維から溶媒が蒸発せずに、樹脂の量に対して相対的に過剰な量の溶媒が残った状態で落下飛行して、ドラムにそのまま堆積し、その結果、溶媒を過剰に含んだ繊維がドラムの表面に衝突して、付着していると考えられる。
[Comparative experiment 3]
1) ES conditions A spinning solution was prepared under the same conditions as in Experiment 1, and spun using the same electrospinning apparatus. However, the resin concentration was 4% by weight, and the distance between the nozzle and the drum was 300 mm.
2) Results of comparative experiment 3-The fiber emitted from the nozzle dropped directly below and deposited on the drum without destabilizing the flight trajectory.
The nanofibers and the thick fibrous materials were mixed and deposited on the drum, and the length of the fibers was short and did not form a nonwoven fabric (see FIG. 8).
<< Evaluation of Comparative Experiment 3 >>
When the resin concentration was 4% by weight, the amount of the solvent in the spinning solution was large and the amount of the resin was small, so that the spinning solution emitted from the nozzle could not form one continuous fiber. During the flight, the solvent does not evaporate from the fiber, but falls and flies in a state in which an excess amount of solvent remains relative to the amount of resin, and is directly deposited on the drum, and as a result, contains excessive solvent. It is considered that the fibers hit the surface of the drum and adhered.
実験（印加電圧と飛行軌道）
実験１と同じ条件で、但し、ノズルに印加する電圧を０．５ｋＶ，１０ｋＶ，１４ｋＶ、１８ｋＶ，２２ｋＶ，２５ｋＶ，２８ｋＶ，３０ｋＶとして、出射された飛行軌道の変化と、回転ドラムに堆積された繊維の状態を観察した。
Experiment (applied voltage and flight trajectory)
Under the same conditions as in Experiment 1, except that the voltage applied to the nozzle was 0.5 kV, 10 kV, 14 kV, 18 kV, 22 kV, 25 kV, 28 kV, 30 kV, the change in the emitted flight trajectory and the fiber deposited on the rotating drum Was observed.
実験結果：
i) 飛行軌道の変化
・ ０．５ｋＶでは紡糸溶液がノズルから押し出されて下方に垂れながら落下し
・ １０ｋＶでは、紡糸溶液は短繊維状になって下方に落下した。
・１４ｋＶでは紡糸溶液は一本の線となってドラムに落下した。飛行軌道は若干の振れが認められた。
・１８ｋＶでは、ノズルから出射された繊維は飛行軌道が大きく振れながら回転ドラムに堆積した。
・２２ｋＶ，２５ｋＶ，２８ｋＶ，３０ｋＶでは、ノズルから出射された繊維はより強い力で引っ張られて回転ドラムに堆積した。回転ドラムに堆積する直前に飛行軌道が振れて繊維は肉眼で見えなくなった。
Experimental result:
i) Change in flight trajectory: At 0.5 kV, the spinning solution was pushed out of the nozzle and dropped downward and dropped. At 10 kV, the spinning solution became short fibers and dropped downward.
At 14 kV, the spinning solution dropped as a single line onto the drum. The flight trajectory was slightly deflected.
At 18 kV, the fiber emitted from the nozzle was deposited on the rotating drum while the flight orbit fluctuated greatly.
-At 22 kV, 25 kV, 28 kV, and 30 kV, the fiber emitted from the nozzle was pulled by a stronger force and deposited on the rotating drum. Immediately before depositing on the rotating drum, the flight trajectory fluctuated, and the fibers became invisible to the naked eye.
ii) 回転ドラムに堆積した繊維の状態
・印加電圧が１４ｋＶ以下では回転ドラムに堆積した繊維は不織布を形成しなかった。
・印加電圧が１８ｋＶ〜３０ｋＶでは、回転ドラムに堆積した繊維は不織布を形成したが、印加電圧が３０ｋＶでは、１８ｋＶ〜２８ｋＶにおけるよりも、繊維同士の付着傾向が強く繊維の形状が崩れていた。
ii) The state of the fibers deposited on the rotating drum and the applied voltage was 14 kV or less, the fibers deposited on the rotating drum did not form a nonwoven fabric.
-When the applied voltage was 18 kV to 30 kV, the fibers deposited on the rotating drum formed a nonwoven fabric, but when the applied voltage was 30 kV, the fibers tended to adhere to each other more strongly than at 18 kV to 28 kV, and the shape of the fibers was broken.
実験（紡糸溶液の送り出し速度と不織布の形成）
紡糸溶液をシリンジからノズルに送り出す速度を３ｍｌ／ｈ〜１５ｍｌ／ｈに変えることで、不織布の形成に及ぼす影響を観察した。
Experiment (Spinning solution delivery speed and nonwoven fabric formation)
The effect on the formation of the nonwoven fabric was observed by changing the speed at which the spinning solution was sent from the syringe to the nozzle from 3 ml / h to 15 ml / h.
実験結果
・送り出し速度３ｍｌ／ｈ〜１５ｍｌ／ｈで回転ドラムに堆積した繊維は網目構造を有するシートを形成した。しかし、送り出し速度１２ｍｌ／ｈ以上では、繊維同士の付着傾向が強く繊維の形状が崩れて、ドラムに平たく付着する傾向が強かった。
Experimental results: The fibers deposited on the rotating drum at a delivery speed of 3 ml / h to 15 ml / h formed a sheet having a network structure. However, at a feed rate of 12 ml / h or more, the fibers tended to adhere to each other strongly, the shape of the fibers collapsed, and the fibers tended to adhere flat to the drum.
細胞培養実験
実験１の条件で製造したマイクロ繊維からなる不織布シートを用いて間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養試験を実施した。培地に浸した不織布シートに懸濁液と共にＭＳＣを播種したところ、不織布シートの網目構造にＭＳＣが捕捉されて、ＭＳＣが繊維表面に接着して良好な細胞増殖が得られた。
Cell culture experiment A culture test of mesenchymal stem cells (MSC) was performed using a nonwoven fabric sheet made of microfibers manufactured under the conditions of Experiment 1. When MSC was seeded together with the suspension on the nonwoven sheet immersed in the medium, the MSC was trapped in the network structure of the nonwoven sheet, and the MSC was adhered to the fiber surface to obtain good cell growth.
以上本発明をエレクトロスピニング法を用いて紡糸した繊維からなる不織布シートの実施例に即して説明したが、本発明のシートは細胞培養基材として用いることができる限り必ずしも不織布に限定されず、細胞が侵入して接着することが可能な構造を有する限り、本発明の範囲に含まれる。 Although the present invention has been described with reference to the examples of nonwoven fabric sheets made of fibers spun using the electrospinning method, the sheets of the present invention are not necessarily limited to nonwoven fabrics as long as they can be used as a cell culture substrate, As long as it has a structure that allows cells to enter and adhere, it is included in the scope of the present invention.
１ エレクトロスピニング装置
１０ 筐体
１１ 前扉
２０ シリンジ
２１ チューブ
３０ ノズル
３１ レール
４０ 回転ドラム
1 electrospinning device 10 case
11 Front door
20 syringes
21 tubes
30 nozzle 31 rail 40 rotating drum
Claims (4)
前記不織布は、エレクトロスピニング法で紡糸された外径１０μｍ〜１００μｍの生分解性樹脂繊維からなり、
前記不織布は、エレクトロスピニング装置のノズルから繊維状に出射された無機フィラーを含まない紡糸溶液が、飛行中に飛行軌道の不安定化現象を生じることによって巻回して曲線状になった状態で、一定速度で回転するドラムコレクター上に堆積することによって形成され、
前記堆積した生分解性樹脂繊維が前記ドラムコレクター上でランダムな方向に配列して絡み合うことによって互いに接触する複数の箇所において付着して連結することによって網目構造が形成されており、前記網目構造は繊維で囲まれた繊維間距離１μｍ〜１００μｍの空隙を有しており、
前記不織布を構成する生分解性樹脂繊維の表面には無数の微細気孔が形成されている、
生分解性樹脂繊維からなる不織布を用いて作製された細胞培養基材。
A cell culture substrate produced using a nonwoven fabric made of biodegradable resin fibers,
The nonwoven fabric is made of biodegradable resin fibers having an outer diameter of 10 μm to 100 μm spun by an electrospinning method,
In the state in which the nonwoven fabric is in a spinning solution containing no inorganic filler emitted in a fibrous form from a nozzle of an electrospinning apparatus, and is wound by causing a phenomenon of destabilizing a flight trajectory during flight, and in a curved state, Formed by depositing on a drum collector rotating at a constant speed,
The deposited biodegradable resin fibers are arranged in a random direction on the drum collector and are attached and connected at a plurality of locations that come into contact with each other by being entangled, thereby forming a network structure. It has a space between fibers 1 μm to 100 μm surrounded by fibers,
Innumerable fine pores are formed on the surface of the biodegradable resin fiber constituting the nonwoven fabric,
A cell culture substrate manufactured using a nonwoven fabric made of biodegradable resin fibers.
The cell culture substrate according to claim 1, wherein the thickness of the nonwoven fabric is 0.5 mm to 1.0 mm.
The cell culture substrate according to claim 1, wherein the length of the biodegradable resin fiber is 20 cm to 100 cm.
The cell culture substrate according to any one of claims 1 to 3, wherein the biodegradable resin fiber contains a PLGA resin or a PLA resin having a molecular weight of 200,000 to 400,000.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019183498A JP6639035B1 (en) | 2019-10-04 | 2019-10-04 | Cell culture substrate prepared using nonwoven fabric made of biodegradable fiber and method for producing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019183498A JP6639035B1 (en) | 2019-10-04 | 2019-10-04 | Cell culture substrate prepared using nonwoven fabric made of biodegradable fiber and method for producing the same |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2019073453A Division JP6602999B1 (en) | 2019-04-08 | 2019-04-08 | Cell culture substrate produced using non-woven fabric made of biodegradable fiber and method for producing the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP6639035B1 true JP6639035B1 (en) | 2020-02-05 |
| JP2020165069A JP2020165069A (en) | 2020-10-08 |
Family
ID=69320869
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2019183498A Active JP6639035B1 (en) | 2019-10-04 | 2019-10-04 | Cell culture substrate prepared using nonwoven fabric made of biodegradable fiber and method for producing the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6639035B1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023100794A1 (en) * | 2021-12-01 | 2023-06-08 | Ｏｒｔｈｏｒｅｂｉｒｔｈ株式会社 | Cell culture substrate comprising nonwoven mat configured from biocompatible resin fibers, and method for producing same |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101328645B1 (en) * | 2011-02-28 | 2013-11-14 | 주식회사 원바이오젠 | Nano/micro hybrid fiber non-woven fabric using biodegradable polymers and method for preparing the same |
| BR112017020836A2 (en) * | 2015-03-31 | 2018-07-03 | Orthorebirth Co., Ltd. | A manufacturing method of the biodegradable fibrin material containing a medicine using electrospinning |
| WO2019168000A1 (en) * | 2018-02-27 | 2019-09-06 | 国立大学法人 琉球大学 | Method for isolating and extracting adipose-derived stem cells from adipose tissue and culturing same without using collagenase, and kit for isolating and extracting adipose-derived stem cells |
-
2019
- 2019-10-04 JP JP2019183498A patent/JP6639035B1/en active Active
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023100794A1 (en) * | 2021-12-01 | 2023-06-08 | Ｏｒｔｈｏｒｅｂｉｒｔｈ株式会社 | Cell culture substrate comprising nonwoven mat configured from biocompatible resin fibers, and method for producing same |
| JP7365533B1 (en) | 2021-12-01 | 2023-10-19 | Ｏｒｔｈｏｒｅｂｉｒｔｈ株式会社 | Cell culture substrate consisting of a non-woven mat composed of biocompatible resin fibers, and method for producing the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2020165069A (en) | 2020-10-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Almetwally et al. | Technology of nano-fibers: Production techniques and properties-Critical review | |
| Sun et al. | Self-assembly of a three-dimensional fibrous polymer sponge by electrospinning | |
| KR101201412B1 (en) | Preparation method for highly porous core-shell nanoweb | |
| US9139935B2 (en) | Electrostatic-assisted fiber spinning method and production of highly aligned and packed hollow fiber assembly and membrane | |
| JP5501249B2 (en) | Centrifugal solution spinning method of nanofiber | |
| KR101719377B1 (en) | Electrostatic spinning assembly | |
| JP4312090B2 (en) | Method for manufacturing fiber assembly and apparatus for manufacturing fiber assembly by electrostatic spinning | |
| JP6591817B2 (en) | Electrospinning device | |
| JP6602999B1 (en) | Cell culture substrate produced using non-woven fabric made of biodegradable fiber and method for producing the same | |
| US9713521B2 (en) | Electrostatic-assisted fiber spinning method and production of highly aligned and packed hollow fiber assembly and membrane | |
| US20110180951A1 (en) | Fiber structures and process for their preparation | |
| AK S et al. | Fabrication of poly (Caprolactone) nanofibers by electrospinning | |
| JP2009127150A (en) | Electrospinning apparatus | |
| KR20130125287A (en) | Apparatus, methods, and fluid compositions for electrostatically-driven solvent ejection or particle formation | |
| WO2008010307A1 (en) | Process for producing microfiber assembly | |
| JP6639035B1 (en) | Cell culture substrate prepared using nonwoven fabric made of biodegradable fiber and method for producing the same | |
| CN103170416A (en) | Electrostatic sprayer and using method thereof | |
| JP4602752B2 (en) | Twisted yarn, twisted yarn manufacturing method and twisted yarn manufacturing apparatus | |
| Kanawung et al. | Preparation and characterization of polycaprolactone/diclofenac sodium and poly (vinyl alcohol)/tetracycline hydrochloride fiber mats and their release of the model drugs | |
| KR101501383B1 (en) | Nanofiber scaffold with an aligned structure and method thereof | |
| JP2008190055A (en) | Electrospinning apparatus | |
| Kim et al. | The morphology of electrospun polystyrene fibers | |
| JP4383763B2 (en) | Cell culture substrate and method for producing the same | |
| Zhang | Mechanical and physical properties of electrospun nanofibers | |
| Huang et al. | Selective deposition of electrospun alginate-based nanofibers onto cell-repelling hydrogel surfaces for cell-based microarrays |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191204 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20191204 |
|
| A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20191204 |
|
| A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20191205 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20191218 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20191220 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6639035 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |