JP6636455B2 - Biomolecule sequencing apparatus, system and method - Google Patents
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Description
本発明は、生体分子を配列決定するための装置、システムおよび方法に関する。 The present invention relates to devices, systems and methods for sequencing biomolecules.
従来、配列決定（シークエンシング）は、生物学的分子、特に、バイオポリマー、例えば、タンパク質を構成するアミノ酸配列、核酸を構成するヌクレオチド配列、糖鎖を構成する単糖の配列等を構成する単量体（モノマー）の順序を決定するために使用されてきた。例えば、タンパク質配列は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析、Ｘ線結晶構造解析を、エドマン分解法などを用いて測定され、これは、酵素的分解に基づいていてもよい。 2. Description of the Related Art Conventionally, sequencing (sequencing) has been carried out using biological molecules, particularly biopolymers, such as amino acid sequences constituting proteins, nucleotide sequences constituting nucleic acids, and sequences of monosaccharides constituting sugar chains. It has been used to determine the order of the monomers. For example, protein sequences are determined using high performance liquid chromatography (HPLC), mass spectrometry, X-ray crystallography, using the Edman degradation method, etc., which may be based on enzymatic degradation.
トンネル電流を用いて単一分子を識別する単一分子電気的測定方法は、試料分子の局所的な状態密度を直接測定することによって単一分子を識別可能とするための方法である。しかし、本明細書においては、電気的測定方法に関連する種々の制限が認識される。試料分子の自然拡散に基づく方法では、従来の単一分子電気的測定法に、試料分子を導入する方法と同様に、試料分子の多くは、試料分子に関連する信号の測定中に感知電極を通過することなくコースや方向を変更して拡散できる。これは誤った結果および効率的な決定につながる可能性がある。１つの問題は、糖鎖、ペプチド鎖、核酸塩基を有するバイオポリマーの配列決定のために必要になりうる長いリード（ｒｅａｄ）は実行するのが困難で、配列決定が短いリードに限定されるということである。感知（センシング）電極間の分子の通過頻度が低く、分子検出の精度が低いという問題もある。 The single-molecule electrical measurement method for identifying a single molecule using a tunnel current is a method for enabling a single molecule to be identified by directly measuring the local density of states of a sample molecule. However, various limitations associated with electrical measurement methods are recognized herein. In methods based on spontaneous diffusion of sample molecules, many of the sample molecules use a sensing electrode during measurement of a signal related to the sample molecules, similar to the method of introducing sample molecules into a conventional single-molecule electrical measurement method. The course and direction can be changed without passing and spreading. This can lead to incorrect results and efficient decisions. One problem is that long reads, which may be required for sequencing biopolymers with sugar chains, peptide chains, nucleobases, are difficult to perform, and sequencing is limited to short reads. That is. There is also a problem that the frequency of passing molecules between sensing electrodes is low, and the accuracy of molecule detection is low.
溶媒に溶解した試料分子を導入するために、ポンプ、圧力、又は電気浸透流を用いて導入する方法があるが、これらの方法のどれもが分子スケールで制御することができる、安定した流れを誘導できない。電気泳動制御システムでは、分子はチャネル容量全体にわたって均一に拡散することがあるので、単に検出電極との間の通過頻度を増大させるには不十分である。トンネル電流を使用するいくつかの従来の単一分子電気測定方法を利用することの欠点は、このような方法は、高濃度の純粋試料溶液が利用可能である場合に再配列決定にのみ使用可能である点である。 There are methods to introduce sample molecules dissolved in a solvent using a pump, pressure, or electroosmotic flow.Each of these methods produces a stable flow that can be controlled on a molecular scale. I can't guide. In an electrophoresis control system, the molecules may diffuse evenly throughout the channel volume, and are simply not sufficient to increase the frequency of passage between the detection electrodes. The drawback of utilizing some conventional single-molecule electrical measurement methods that use tunneling current is that such methods can only be used for resequencing when highly concentrated pure sample solutions are available Is that
本開示は、生体分子配列決定のための装置（デバイス）、方法およびシステムが、現在利用可能な方法及びシステムで、種々の問題を解決することを提供する。本明細書に提供する方法およびシステムは、現在利用可能な実質的に高精度で生体分子および他の方法およびシステムと比較して、高スループットの配列決定を可能にする。本発明の方法およびシステムは、比較的長いリード長の配列決定を可能とし、他の方法及びシステムでの配列決定の実質的な増強を提供することを可能にする。 The present disclosure provides that devices, methods and systems for biomolecule sequencing solve various problems with currently available methods and systems. The methods and systems provided herein allow for high-throughput sequencing compared to currently available biomolecules and other methods and systems with substantially higher accuracy. The methods and systems of the present invention allow for the sequencing of relatively long reads, and provide for substantial enhancement of sequencing with other methods and systems.
一態様では、生体分子配列決定装置は以下を含む：少なくとも１つのナノギャップ電極対；少なくとも１つの電気泳動電極対；第１の流路；と第２流路。少なくとも一つナノギャップ電極対では、試料中に含まれる１つ以上の生体分子が、ナノギャップ電極対の電極間を通過するときにトンネル電流が流れるように電極が配置されている。生体分子は、少なくとも１種類の単一単量体が接続されて形成されている。少なくとも１つの電気泳動電極対は、電場を形成するために配置され、ナノギャップ電極対の電極間の生体分子を移動できるようにする。第１の流路は、少なくとも１つ以上のナノチャネルのナノギャップ電極対間に向かった方向に試料の一部を流す。第２の流路は、１つまたは複数のナノギャップ電極対を含む１つまたは複数のナノチャネルへの入口を通過する方向に試料の少なくとも一部を流す。生体分子配列決定装置はさらに、１つまたは複数の測定部と、識別部を含むことができる。１又は複数の測定部は、生体分子が電気泳動電極対間への電圧の印加によって前記生体分子を移動方向に移動するように形成された電界を利用して、第１の流路を通してナノギャップ電極対の電極間を通過するときに発生するトンネル電流を測定するように構成されている。識別部は、種類が知られている少なくとも１種の単量体の基準物理量と、測定部によって測定されたトンネル電流から得られた検出物理量に基づいて生体分子を含む少なくとも１種の単量体を識別するように構成される。 In one aspect, the biomolecule sequencing device comprises: at least one nanogap electrode pair; at least one electrophoresis electrode pair; a first flow path; and a second flow path. In at least one nanogap electrode pair, the electrodes are arranged such that a tunnel current flows when one or more biomolecules contained in the sample pass between the electrodes of the nanogap electrode pair. The biomolecule is formed by connecting at least one kind of single monomer. At least one electrophoresis electrode pair is arranged to create an electric field to allow movement of biomolecules between the electrodes of the nanogap electrode pair. The first flow path allows a part of the sample to flow in a direction toward between at least one or more nanochannel nanogap electrode pairs. The second channel flows at least a portion of the sample in a direction that passes through an entrance to one or more nanochannels that includes one or more nanogap electrode pairs. The biomolecule sequencing device can further include one or more measurement units and an identification unit. One or a plurality of measurement units utilize an electric field formed to move the biomolecules in the moving direction by applying a voltage between the electrophoretic electrode pairs, and the nanogap is passed through the first flow path. It is configured to measure a tunnel current generated when passing between the electrodes of the electrode pair. The identification unit includes at least one kind of monomer containing a biomolecule based on a reference physical quantity of at least one kind of monomer whose type is known and a detected physical quantity obtained from a tunnel current measured by the measurement unit. Is configured to identify
本発明によれば、生体分子配列決定装置は、１つ以上の電気泳動電極対と、ナノチャネルにおいて１つ以上のナノギャップ電極対との間に試料の少なくとも一部を流す第１の流路と、ナノチャネルへの入口通過方向に試料の少なくとも一部を流す１つ以上のナノギャップ電極対を含む第２の流路とを含んでもよい。従って、ナノギャップ電極対間を単一分子が移動する効率は、試料分子に印加される電界の増加の結果として向上させることができ、これは、高精度且つ高スループットで単量体の識別を可能にする。 According to the present invention, a biomolecule sequencing apparatus includes a first flow path for flowing at least a portion of a sample between one or more electrophoresis electrode pairs and one or more nanogap electrode pairs in a nanochannel. And a second flow path including one or more nanogap electrode pairs for flowing at least a portion of the sample in a direction of passage through the inlet to the nanochannel. Thus, the efficiency of single molecule transfer between nanogap electrode pairs can be improved as a result of the increase in the electric field applied to the sample molecules, which allows for accurate and high throughput monomer identification. enable.
生体分子配列決定装置は、試料の流れを方向付けるように構成されたフローディレクタを含んでよく、それは、流体試料が第１の流路と第２の流路を形成することができるように、第１の流路と第２の流路との間が流体連通できるようになっている。 The biomolecule sequencing device may include a flow director configured to direct the flow of the sample, such that the fluid sample can form a first flow path and a second flow path. Fluid communication can be established between the first flow path and the second flow path.
フローディレクタは、１つ以上のナノギャップ電極対を有し、ナノチャネルに含まれる任意の流体や他の分子を電気的に連通するナノチャネルへの入口に向かって延在する絶縁体であってもよい。 A flow director is an insulator that has one or more nanogap electrode pairs and extends toward the entrance to the nanochannel, which electrically communicates any fluids or other molecules contained in the nanochannel. Is also good.
ナノギャップ電極対および電気泳動電極対は、生体分子移動の方向に交差または垂直な方向に延在する。たとえば、チャネルの各側のナノギャップ電極と電気泳動電極は、互いに平行である。 The nanogap electrode pair and the electrophoresis electrode pair extend in a direction crossing or perpendicular to the direction of biomolecule movement. For example, the nanogap electrode and the electrophoresis electrode on each side of the channel are parallel to each other.
ナノギャップ電極対はナノチャネル中の生体分子の移動の方向と交差する方向に沿って配置されてもよく、電気泳動電極対は絶縁体上に配置されてもよい。 The nanogap electrode pair may be arranged along a direction intersecting the direction of movement of the biomolecule in the nanochannel, and the electrophoresis electrode pair may be arranged on an insulator.
長い生体分子は、自身で絡まりナノチャネルまたはナノギャップ電極での詰まりを引き起こす可能性がある。いくつかの実施形態では、多数の柱（ピラー）が第１の流路および第２の流路に生体分子が通過することができる間隔で配置されてもよく、生体ポリマーを直線化するために利用されてもよい。いくつかの実施形態では、柱（ピラー）は、１つ以上のナノチャネル内に設けられていてもよく、ナノチャネル内に生体ポリマーを直線化するまたは直線化を維持する。例えば、一本鎖ＤＮＡ断片は、２５ミリモル（ｍＭ）のＮａＣｌで３ナノメートル（ｎｍ）の長さを有し、幅、高さ、または直径の１つ以上で、１００ｎｍの最小寸法を有するナノチャネル内での有意な構造変化を可能にし、このような二次構造は、最小特徴サイズ２０ｎｍ以下のナノチャネルで変化し、従ってナノチャネル内の直線性を維持する必要性を再現することができる。 Long biomolecules can entangle themselves and cause plugging at nanochannel or nanogap electrodes. In some embodiments, a number of pillars (pillars) may be arranged in the first flow path and the second flow path at intervals that allow biomolecules to pass therethrough to linearize the biopolymer. May be used. In some embodiments, pillars may be provided in one or more nanochannels to linearize or maintain the biopolymer within the nanochannels. For example, a single-stranded DNA fragment has a length of 3 nanometers (nm) at 25 millimoles (mM) of NaCl, and has one or more of width, height, or diameter and a minimum dimension of 100 nm. Allowing significant structural changes within the channel, such secondary structures can change in nanochannels with a minimum feature size of 20 nm or less, thus reproducing the need to maintain linearity within the nanochannel. .
ナノギャップ電極対は、複数あり電極間距離が異なっていてもよい。 There may be a plurality of nanogap electrode pairs and the distance between the electrodes may be different.
本発明は、また生体分子配列決定装置によって実行されてもよい生体分子配列決定法を提供する。生体分子配列決定装置は、１つまたは複数のナノギャップ電極対と、１つまたは複数の電気泳動電極対と、第１流路および第２の流路とを含む。１つまたは複数のナノギャップ電極対は、試料に含まれる少なくとも１種の接続単量体から形成された生体分子が電極間を通り、トンネル電流が増加するように配置された電極を有する。電気泳動電極対は、ナノギャップ電極対の電極間を移動する生体分子の移動方向に電界を形成する。第１の流路は、ナノチャネルのナノギャップ電極対の間の方向に試料の少なくとも一部を流す。第２の流路は、少なくとも１つのナノギャップ電極対を含むナノチャネルへの入口を過ぎ去るように試料の少なくとも一部を流す。本方法は、トンネル電流を測定すること、および少なくとも１種の単量体の種類を識別することを含む。トンネル電流は、生体分子が電気泳動電極対間への電圧の印加によって生体分子を移動させるように形成された電界により、第１の流路を通してナノギャップ電極対の電極間を通過するときに生成される。少なくとも１種の単量体の種類は、種が知られている少なくとも１種の単量体の基準物理量と測定部によって測定されたトンネル電流から得られた検出物理量に基づいた生体分子を含む。 The present invention also provides a biomolecule sequencing method that may be performed by a biomolecule sequencing device. The biomolecule sequencing apparatus includes one or more nanogap electrode pairs, one or more electrophoresis electrode pairs, and a first flow path and a second flow path. One or more nanogap electrode pairs have electrodes arranged such that a biomolecule formed from at least one connecting monomer contained in the sample passes between the electrodes and a tunnel current is increased. The electrophoresis electrode pair forms an electric field in the moving direction of the biomolecule moving between the electrodes of the nanogap electrode pair. The first channel allows at least a portion of the sample to flow in a direction between the nanogap electrode pairs of the nanochannel. The second flow channel flows at least a portion of the sample past an entrance to a nanochannel that includes at least one nanogap electrode pair. The method includes measuring tunneling current and identifying at least one monomer type. A tunnel current is generated when the biomolecule passes between the electrodes of the nanogap electrode pair through the first flow path due to an electric field formed to move the biomolecule by applying a voltage between the electrophoresis electrode pair. Is done. The kind of at least one monomer includes a biomolecule based on a reference physical quantity of at least one kind of monomer whose species is known and a detected physical quantity obtained from a tunnel current measured by the measurement unit.
本発明はまた、コンピュータが生体分子配列決定装置の測定部と識別部として機能させるため生体分子決定のためのプログラムを提供する。 The present invention also provides a program for determining a biomolecule so that a computer can function as a measuring unit and a discriminating unit of a biomolecule sequencing apparatus.
本発明の生体分子の配列決定のための装置、方法、およびプログラムによれば、生体分子を構成する単量体を高精度に識別することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to the apparatus, method, and program for sequence determination of a biomolecule of this invention, the monomer which comprises a biomolecule can be identified with high precision.
別の態様において、本開示は、ナノチャネルと、ナノチャネルのナノギャップ電極の組と、電気泳動電極の組とを含む生体分子配列決定装置を提供する。ナノチャネルは、生体分子を含む試料がナノチャネルを通って移動できるようにする。複数のナノギャップ電極の各々の組は、試料中に含まれる生体分子がナノチャネルを通ってナノギャップ電極の複数の組に近接して通過するとき、電流の検出を可能にするように構成されている。ナノギャップ電極の複数の組の少なくとも２組は、ナノチャネルの幅に沿って異なる電極間隔を有する。電気泳動電極の組は、生体分子がナノチャネルを通ってナノチャネルのナノギャップ電極の複数の組に近接して動くように電界を提供する。 In another aspect, the present disclosure provides a biomolecule sequencing device that includes a nanochannel, a nanochannel nanogap electrode set, and an electrophoresis electrode set. Nanochannels allow a sample containing biomolecules to move through the nanochannel. Each set of the plurality of nanogap electrodes is configured to enable detection of a current when a biomolecule contained in the sample passes through the nanochannel and in close proximity to the plurality of sets of nanogap electrodes. ing. At least two of the plurality of sets of nanogap electrodes have different electrode spacings along the width of the nanochannel. The set of electrophoretic electrodes provides an electric field such that the biomolecules move through the nanochannel and into close proximity to the sets of nanogap electrodes in the nanochannel.
本明細書で提供される態様のいくつかの実施形態において、生体分子配列決定装置はさらに測定部と識別部とを含む。測定部は、生体分子がナノギャップ電極の複数の組に近接して通過するときに生成される電流を測定するように構成される。識別部は、測定部と連通している。測定部は、ナノギャップ電極の複数の組の各々と通信する。識別部は、生体分子またはその部分を識別するように構成される。 In some embodiments of the aspects provided herein, the biomolecule sequencing device further includes a measurement unit and an identification unit. The measurement unit is configured to measure a current generated when the biomolecule passes close to the plurality of sets of nanogap electrodes. The identification unit is in communication with the measurement unit. The measurement unit is in communication with each of the plurality of sets of nanogap electrodes. The identification unit is configured to identify a biomolecule or a portion thereof.
本明細書で提供される態様のいくつかの実施形態において、生体分子は複数の単量体を含む。識別部は、少なくとも１つの既知のタイプの単量体の基準物理量と測定部によって測定された電流から得られる物理量とに基づいて複数の単量体を識別するように構成されている。本明細書で提供される態様のいくつかの実施形態において、生体分子配列決定装置はさらに、第１の流路を生成するように構成されたフローディレクタおよびナノチャネルと流体連通する第２の流路を含む。フローディレクタは、第１の流路からナノチャネルへ試料の一部を方向付け、第１の流路から第２の流路へ試料の残りの部分を方向付ける。本明細書で提供される態様のいくつかの実施形態において、フローディレクタは、ナノチャネルを介して試料の移動方向に沿ってナノギャップ電極の複数の組に向かって延在する絶縁体である。本明細書で提供される態様のいくつかの実施形態において、生体分子配列決定装置はさらに、生体分子の直線化を可能にするために、第１の流路及び／又は第２の流路内に１つ以上の柱を含む。本明細書で提供される態様のいくつかの実施形態では、１つまたは２以上の柱は、複数の柱を含む。本明細書で提供される態様のいくつかの実施形態では、第１の流路、第２の流路およびナノチャネルは実質的に同じ面にある。本明細書で提供される態様のいくつかの実施形態において、電流は、トンネル電流を含む。本明細書で提供される態様のいくつかの実施形態において、ナノギャップ電極の複数の組のうちの所与の１組は、少なくとも２個の電極を有する。本明細書において提供する態様の一部の実施形態では、電気泳動電極の組は、少なくとも２個の電極を有する。本明細書において提供する態様の一部の実施形態において、ナノギャップ電極の複数の組と電気泳動電極の組が、単一ユニットとして一体化されている。本明細書で提供される態様のいくつかの実施形態において、ナノギャップ電極の複数の組のうちの所与の１組の電極は、少なくとも１つの固体絶縁体によって電気泳動電極から分離されている。本明細書で提供される態様のいくつかの実施形態において、生体分子配列決定装置はさらに、ナノチャネルに生体分子の直線化を可能にする１つまたは複数の柱を含む。本明細書で提供される態様のいくつかの実施形態では、１つまたは２以上の柱は、複数の柱を含む。本明細書で提供される態様のいくつかの実施形態において、ナノチャネルはナノギャップ電極の複数の組に向かってテーパ状である。本明細書で提供される態様のいくつかの実施形態において、ナノギャップ電極の複数の組のうちの所与の１組が生体分子の分子直径に等しいまたはそれ以下の電極間距離を有している。 In some embodiments of the aspects provided herein, the biomolecule comprises a plurality of monomers. The identification unit is configured to identify the plurality of monomers based on a reference physical quantity of at least one known type of monomer and a physical quantity obtained from the current measured by the measurement unit. In some embodiments of the aspects provided herein, the biomolecule sequencing device further comprises a second director in fluid communication with the flow director and the nanochannel configured to create the first channel. Including roads. The flow director directs a portion of the sample from the first channel to the nanochannel and directs the remaining portion of the sample from the first channel to the second channel. In some embodiments of the aspects provided herein, the flow director is an insulator that extends through the nanochannels along the direction of sample movement toward multiple sets of nanogap electrodes. In some embodiments of the aspects provided herein, the biomolecule sequencing device further comprises a first channel and / or a second channel in order to allow for linearization of the biomolecule. Includes one or more pillars. In some embodiments of the aspects provided herein, the one or more posts comprises a plurality of posts. In some embodiments of the aspects provided herein, the first channel, the second channel, and the nanochannel are substantially on the same plane. In some embodiments of the aspects provided herein, the current comprises a tunnel current. In some embodiments of the aspects provided herein, a given set of multiple sets of nanogap electrodes has at least two electrodes. In some embodiments of the aspects provided herein, the set of electrophoretic electrodes has at least two electrodes. In some embodiments of the aspects provided herein, multiple sets of nanogap electrodes and sets of electrophoretic electrodes are integrated as a single unit. In some embodiments of the aspects provided herein, a given set of electrodes of the plurality of sets of nanogap electrodes is separated from the electrophoretic electrodes by at least one solid insulator. . In some embodiments of the aspects provided herein, the biomolecule sequencing device further comprises one or more pillars that allow for linearization of the biomolecule into the nanochannel. In some embodiments of the aspects provided herein, the one or more posts comprises a plurality of posts. In some embodiments of the aspects provided herein, the nanochannels are tapered toward multiple sets of nanogap electrodes. In some embodiments of the aspects provided herein, a given set of the plurality of sets of nanogap electrodes has an interelectrode distance equal to or less than the molecular diameter of the biomolecule. I have.
本開示の別の態様は、ナノチャネルと、ナノチャネルのナノギャップ電極の少なくとも１つの組と、電気泳動電極の組を含む生体分子配列決定装置を提供する。ナノチャネルは、生体分子を含む試料がナノチャネルを通って移動できるようにする。ナノギャップ電極の組は、試料中に含まれる生体分子がナノチャネルを通してナノギャップ電極の組の近傍を通過するとき、電流の検出を可能にするように構成されている。ナノチャネルは、ナノギャップ電極の組に向かってテーパ状になっている。ナノチャネルは、ナノギャップ電極の組に向かってテーパ状である。ナノギャップ電極の組は、生体分子の分子直径と等しいまたはそれよりも小さい電極間距離を有する。電気泳動電極の組は、生体分子がナノチャネルを通ってナノチャネルのナノギャップ電極の組に近接して動くように電界を提供する。 Another aspect of the present disclosure provides a biomolecule sequencing device that includes a nanochannel, at least one set of nanochannel nanogap electrodes, and a set of electrophoretic electrodes. Nanochannels allow a sample containing biomolecules to move through the nanochannel. The set of nanogap electrodes is configured to enable detection of current when a biomolecule contained in the sample passes through the nanochannel and near the set of nanogap electrodes. The nanochannel tapers toward a set of nanogap electrodes. The nanochannel is tapered toward the set of nanogap electrodes. The set of nanogap electrodes has an interelectrode distance equal to or less than the molecular diameter of the biomolecule. The set of electrophoretic electrodes provides an electric field such that the biomolecules move through the nanochannel and close to the set of nanochannel nanogap electrodes.
本開示の別の態様は、生体分子配列決定装置を提供し、この生体分子配列決定装置は、ナノチャネルと、ナノチャネルのナノギャップ電極の少なくとも１組と、電気泳動電極の組と、ナノチャネルにまたはその近傍に１つまたは複数の柱を含む。ナノギャップ電極の組は、試料中に含まれる生体分子がナノチャネルを通ってナノギャップ電極組の近傍を通過するとき、電流の検出を可能にするように構成される。電気泳動電極の組は、生体分子がナノチャネルを通ってナノチャネルのナノギャップ電極の組に近接して動くように電界を提供する。１つ以上の柱は、ナノギャップ電極の組によって電流検出を用いて生体分子の個々のサブユニットの識別を可能にするため生体分子を直線化する。 Another aspect of the present disclosure provides a biomolecule sequencing device comprising a nanochannel, at least one set of nanochannel nanogap electrodes, a set of electrophoretic electrodes, and a nanochannel. At or near one or more posts. The set of nanogap electrodes is configured to allow detection of current as biomolecules contained in the sample pass through the nanochannel and in the vicinity of the set of nanogap electrodes. The set of electrophoretic electrodes provides an electric field such that the biomolecules move through the nanochannel and close to the set of nanochannel nanogap electrodes. The one or more pillars linearize the biomolecules to allow identification of individual subunits of the biomolecules using current sensing with a set of nanogap electrodes.
本開示の別の態様は、生体分子を配列決定するための方法を提供し、この生体分子を配列決定するための方法は、（ａ）生体分子を生体分子配列決定装置のナノチャネルへまたはナノチャネルを通って流すように方向付けること、（ｂ）ナノギャップ電極の複数の組で、ナノチャネルを通ってナノギャップ電極の複数の組に近接して生体分子が流れる間に発生した電流を検出すること、及び（ｃ）（ｂ）で検出された電流で生体分子またはその一部を配列決定することを含む。生体分子配列決定装置は、（ｉ）ナノチャネルのナノギャップ電極の複数の組と、（ｉｉ）電気泳動電極の組を含んでいる。複数ナノギャップ電極のそれぞれの組は、試料中に含まれる生体分子がナノチャネルを通ってナノギャップ電極の複数の組に近接して通過するとき、電流の検出を可能にするように構成されている。ナノギャップ電極の複数の組の少なくとも２組は、ナノチャネルの幅に沿って異なる電極間隔を有する。電気泳動電極の組は、ナノチャネルへ又はそれを介した及びナノチャネルのナノギャップ電極の複数の組に近接して生体分子を動かすように電界を提供する。 Another aspect of the present disclosure provides a method for sequencing a biomolecule, the method comprising: (a) transferring the biomolecule to a nanochannel or a nanochannel of a biomolecule sequencing device. Directing flow through the channel; (b) detecting currents generated during the flow of biomolecules in the plurality of sets of nanogap electrodes in proximity to the plurality of sets of nanogap electrodes through the nanochannel; And (c) sequencing the biomolecule or a portion thereof with the current detected in (b). The biomolecule sequencing device includes (i) a plurality of sets of nanochannel nanogap electrodes and (ii) a set of electrophoretic electrodes. Each set of the plurality of nanogap electrodes is configured to enable detection of a current when a biomolecule contained in the sample passes through the nanochannel and in close proximity to the plurality of sets of nanogap electrodes. I have. At least two of the plurality of sets of nanogap electrodes have different electrode spacings along the width of the nanochannel. The set of electrophoretic electrodes provides an electric field to move the biomolecules to or through the nanochannel and close to the plurality of sets of nanogap electrodes in the nanochannel.
本明細書で提供される態様のいくつかの実施形態において、生体分子は複数の単量体を含み、配列決定は、少なくとも１つの既知のタイプの単量体の基準物理量と、（ｂ）で検出された電流から得られた物理量に基づいて複数の単量体を識別することを含む。本明細書で提供される態様のいくつかの実施形態において、生体分子配列決定装置はさらに、ナノチャネルと流体連通する第１の流路を生成するように構成されたフローディレクタを含む。（ａ）は、試料の一部を第１の流路からナノチャネルへ、残りを第１の流路から第２の流路へ流すことを含む。本明細書で提供される態様のいくつかの実施形態では、方法はさらに、生体分子の直線化を可能にするために、第１の流路／第２の流路内に１つ以上の柱を含む。本明細書で提供される態様のいくつかの実施形態では、電流はトンネル電流含む。本明細書で提供される態様のいくつかの実施形態では、本方法はさらに、生体分子を直線化するナノチャネルに１つまたは複数の柱を含む。本明細書で提供される態様のいくつかの実施形態において、ナノチャネルはナノギャップ電極の複数の組に向かってテーパ状である。本明細書で提供される態様のいくつかの実施形態において、生体分子はポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。 In some embodiments of the aspects provided herein, the biomolecule comprises a plurality of monomers, and the sequencing comprises: (b) determining a reference physical quantity of at least one known type of monomer; Identifying a plurality of monomers based on a physical quantity obtained from the detected current. In some embodiments of the aspects provided herein, the biomolecule sequencing device further comprises a flow director configured to create a first flow path in fluid communication with the nanochannel. (A) involves flowing a portion of the sample from the first channel to the nanochannel and the remainder from the first channel to the second channel. In some embodiments of the aspects provided herein, the method further comprises providing one or more posts in the first / second flow path to allow for linearization of the biomolecule. including. In some embodiments of the aspects provided herein, the current comprises a tunnel current. In some embodiments of the aspects provided herein, the method further comprises one or more posts in the nanochannel that linearize the biomolecule. In some embodiments of the aspects provided herein, the nanochannels are tapered toward multiple sets of nanogap electrodes. In some embodiments of the aspects provided herein, the biomolecule is a polynucleotide or polypeptide.
本開示の別の態様は、生体分子を配列決定するための方法を提供し、この方法は、以下を含む。（ａ）生体分子を生体分子配列決定装置のナノチャネルを経由して流すように方向付けること；（ｂ）ナノギャップ電極の組で、生体分子がナノチャネルを通ってナノギャップ電極の組に近接して流れる間に発生した電流を検出すること、及び（ｃ）（ｂ）で検出された電流で生体分子またはその一部を配列決定すること。生体分子配列決定装置は、（ｉ）ナノチャネルに少なくとも１組のナノギャップ電極および（ｉｉ）ナノチャネルへの又はそれを介した及びナノギャップ電極の組に近接して生体分子を動かす電界を提供する電気泳動電極の組を含んでいる。ナノギャップ電極の組は、試料中に含まれる生体分子がナノチャネルを通ってナノギャップ電極の組の近傍を通過するとき、電流の検出を可能にするように構成されている。ナノチャネルは、ナノギャップ電極の組に向かってテーパ状になっている。ナノギャップ電極の組は、生体分子の分子直径と等しいまたはそれよりも小さい電極間距離を有している。 Another aspect of the present disclosure provides a method for sequencing a biomolecule, the method comprising: (A) directing the biomolecules to flow through the nanochannels of the biomolecule sequencing device; (b) in the set of nanogap electrodes, the biomolecules are in close proximity to the set of nanogap electrodes through the nanochannel. And (c) sequencing the biomolecule or a portion thereof with the current detected in (b). The biomolecule sequencing device provides (i) a nanochannel with at least one set of nanogap electrodes and (ii) an electric field that moves biomolecules to or through the nanochannel and in close proximity to the set of nanogap electrodes. And a set of electrophoretic electrodes. The set of nanogap electrodes is configured to enable detection of current as biomolecules contained in the sample pass through the nanochannel and near the set of nanogap electrodes. The nanochannel tapers toward a set of nanogap electrodes. The set of nanogap electrodes has an inter-electrode distance equal to or less than the molecular diameter of the biomolecule.
本開示の別の態様は、生体分子を配列決定するための方法を提供し、この方法は、以下を含む：（ａ）生体分子を生体分子配列決定装置のナノチャネルを経由して流すように方向付けること；（ｂ）ナノギャップ電極の組で、生体分子がナノチャネルを通してナノギャップ電極の組に近接して流れる間に発生した電流を検出すること、及び（ｃ）（ｂ）で検出された電流で生体分子またはその一部を配列決定すること。生体分子配列決定装置は、（ｉ）ナノチャネルに少なくとも１組のナノギャップ電極、（ｉｉ）電気泳動電極の組、および（ｉｉｉ）ナノチャネルにまたはその近傍に１つまたは複数の柱を含む。ナノギャップ電極の組は、試料中に含まれる生体分子がナノチャネルを通ってナノギャップ電極の組の近傍を通過するとき、電流の検出を可能にするように構成される。電気泳動電極の組は、ナノチャネルへの又はそれを介した及びナノチャネルにナノギャップ電極の組に近接して生体分子を動かす電界を提供する。１つまたは複数の柱は、生体分子を直線化し、ナノギャップ電極の組による電流検出を用いて生体分子の個々のサブユニットの識別を可能にする。 Another aspect of the present disclosure provides a method for sequencing a biomolecule, the method comprising: (a) flowing the biomolecule through a nanochannel of a biomolecule sequencing device. Directing; (b) detecting the current generated while the biomolecule flows through the nanochannel in close proximity to the nanogap electrode set; and (c) detecting the current detected in (b). Sequencing a biomolecule or a portion thereof with an applied current. The biomolecule sequencing device includes (i) at least one set of nanogap electrodes in the nanochannel, (ii) a set of electrophoretic electrodes, and (iii) one or more posts at or near the nanochannel. The set of nanogap electrodes is configured to allow for detection of current as biomolecules contained in the sample pass through the nanochannel and near the set of nanogap electrodes. The set of electrophoretic electrodes provides an electric field for moving biomolecules into or through the nanochannel and in proximity to the set of nanogap electrodes. The one or more pillars linearize the biomolecule and allow the identification of individual subunits of the biomolecule using current sensing with a set of nanogap electrodes.
本開示の別の態様は、１つ以上のコンピュータプロセッサによって実行される際、生体分子を配列決定するための方法を実行する機械によって実行可能なコードを備えるコンピュータ可読媒体を提供する。生体分子を配列決定するための方法は、以下を含む：（ａ）生体分子を生体分子配列決定装置のナノチャネルを経由して流すように方向付けること；（ｂ）ナノギャップ電極の複数のセットで、生体分子がナノチャネルを通してナノギャップ電極の複数のセットに近接して流れる間に発生した電流を検出すること、及び（ｃ）（ｂ）で検出された電流で生体分子またはその一部を配列決定すること。生体分子配列決定装置は、（ｉ）ナノチャネルのナノギャップ電極の複数の組、および（ｉｉ）ナノチャネルへの又はそれを介した及びナノチャネルにナノギャップ電極の複数の組に近接して生体分子を動かす電界を提供する電気泳動電極の組を含む。ナノギャップ電極の複数の組の各々は、試料中に含まれる生体分子がナノチャネルを通してナノギャップ電極の複数の組に近接して通過するとき、電流の検出を可能にするように構成されている。ナノギャップ電極の複数の組の少なくとも２組は、ナノチャネルの幅に沿って様々な電極間距離を有する。 Another aspect of the present disclosure provides a computer-readable medium comprising code executable by a machine that, when executed by one or more computer processors, performs a method for sequencing a biomolecule. Methods for sequencing biomolecules include: (a) directing biomolecules to flow through nanochannels of a biomolecule sequencing device; (b) multiple sets of nanogap electrodes. Detecting the current generated while the biomolecule flows in close proximity to the plurality of sets of nanogap electrodes through the nanochannel; and (c) detecting the biomolecule or a portion thereof with the current detected in (b). Sequencing. The biomolecule sequencer includes (i) a plurality of sets of nanogap electrodes in the nanochannel, and (ii) a biomolecule in proximity to the plurality of sets of nanogap electrodes to or through the nanochannel. It includes a set of electrophoretic electrodes that provide an electric field for moving molecules. Each of the plurality of sets of nanogap electrodes is configured to enable detection of current when a biomolecule contained in the sample passes through the nanochannel and in close proximity to the plurality of sets of nanogap electrodes. . At least two of the plurality of sets of nanogap electrodes have different inter-electrode distances along the width of the nanochannel.
本開示の別の態様は、１つ以上のコンピュータプロセッサによって実行される際、生体分子を配列決定するための方法を実行する機械によって実行可能なコードを備えるコンピュータ可読媒体を提供する。生体分子を配列決定するための方法は、以下を含む：（ａ）生体分子を生体分子配列決定装置のナノチャネルを経由して流すように方向付けること；（ｂ）ナノギャップ電極の組で、生体分子がナノチャネルを通してナノギャップ電極の組に近接して流れる間に発生した電流を検出すること、及び（ｃ）（ｂ）で検出された電流で生体分子またはその一部を配列決定すること。生体分子配列決定装置は、（ｉ）ナノチャネルに少なくとも１組のナノギャップ電極および（ｉｉ）ナノチャネルへの又はそれを介した及びナノチャネルにナノギャップ電極の組に近接して生体分子を動かす電界を提供する電気泳動電極の組を含む。ナノギャップ電極の組は、試料中に含まれる生体分子がナノギャップ電極の組に向かってテーパ状であるナノチャネルを通ってナノギャップ電極組の近傍を通過するときに流れる電流の検出を可能にするように構成されている。ナノギャップ電極の組は、生体分子の分子直径に等しいまたはそれより小さい電極間距離を有している。 Another aspect of the present disclosure provides a computer-readable medium comprising code executable by a machine that, when executed by one or more computer processors, performs a method for sequencing a biomolecule. Methods for sequencing biomolecules include: (a) directing biomolecules to flow through nanochannels of a biomolecule sequencing device; (b) with a set of nanogap electrodes; Detecting the current generated while the biomolecule flows through the nanochannel in close proximity to the set of nanogap electrodes; and sequencing the biomolecule or a portion thereof with the current detected in (c) and (b). . The biomolecule sequencing device moves (i) at least one set of nanogap electrodes to the nanochannel and (ii) a biomolecule to or through the nanochannel and close to the set of nanogap electrodes in the nanochannel. It includes a set of electrophoretic electrodes that provide an electric field. The nanogap electrode set allows for the detection of current flowing when a biomolecule contained in a sample passes near the nanogap electrode set through a nanochannel that is tapered toward the nanogap electrode set. It is configured to be. The set of nanogap electrodes has an interelectrode distance equal to or less than the molecular diameter of the biomolecule.
本開示の別の態様は、１つ以上のコンピュータプロセッサによって実行される際、生体分子を配列決定するための方法を実行する機械によって実行可能なコードを備えるコンピュータ可読媒体を提供する。生体分子を配列決定するための方法は、以下を含む：（ａ）生体分子を生体分子配列決定装置のナノチャネルを経由して流すように方向付けること；（ｂ）ナノギャップ電極の組で、生体分子がナノチャネルを通してナノギャップ電極の組に近接して流れる間に発生した電流を検出すること、及び（ｃ）（ｂ）で検出された電流で生体分子またはその一部を配列決定すること。生体分子配列決定装置は、（ｉ）ナノチャネルの少なくとも１組のナノギャップ電極と、（ｉｉ）電気泳動電極の組と、（ｉｉｉ）ナノチャネルにまたはその近傍に１つまたは複数の柱とを含む、ナノギャップ電極の組は、試料中に含まれる生体分子がナノチャネルを通ってナノギャップ電極の組の近傍を通過するとき、電流の検出を可能にするように構成される。電気泳動電極の組は、ナノチャネルへの又はそれを介した及びナノチャネルのナノギャップ電極の組に近接して生体分子を動かす電界を提供する。１つまたは複数の柱は、生体分子を直線化し、ナノギャップ電極の組によって電流検出を用いて生体分子の個々のサブユニットの識別を可能にする。 Another aspect of the present disclosure provides a computer-readable medium comprising code executable by a machine that, when executed by one or more computer processors, performs a method for sequencing a biomolecule. Methods for sequencing biomolecules include: (a) directing biomolecules to flow through nanochannels of a biomolecule sequencing device; (b) with a set of nanogap electrodes; Detecting the current generated while the biomolecule flows through the nanochannel in close proximity to the set of nanogap electrodes; and sequencing the biomolecule or a portion thereof with the current detected in (c) and (b). . The biomolecule sequencing device includes: (i) at least one set of nanogap electrodes of nanochannels, (ii) a set of electrophoretic electrodes, and (iii) one or more pillars at or near the nanochannel. The set of nanogap electrodes, including, is configured to allow for detection of current when a biomolecule contained in the sample passes through the nanochannel and near the set of nanogap electrodes. The set of electrophoretic electrodes provides an electric field that moves biomolecules to or through the nanochannel and in close proximity to the set of nanogap electrodes in the nanochannel. One or more pillars linearize the biomolecule and allow the identification of individual subunits of the biomolecule using current sensing with a set of nanogap electrodes.
本開示の追加の態様及び利点は、以下本発明の例示的実施の形態のみが示され説明される詳細な説明から当業者には容易に明らかになるであろう。本開示は、本開示から逸脱することなく他のおよび異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は種々の明らかな点での変更が可能である。図面および説明は本質的に例示的なものであり、制限的ではないとみなされるべきである。 Additional aspects and advantages of the present disclosure will be readily apparent to those skilled in the art from the detailed description that follows, when only exemplary embodiments of the invention are shown and described. The present disclosure is capable of other and different embodiments, and its several details are capable of modifications in various obvious respects, all without departing from the present disclosure. The drawings and description should be regarded as illustrative in nature and not restrictive.
本発明の新規な特徴は、特許請求の範囲に記述される。次のように本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用されている例示的な実施形態を記載し添付の図面を設定することにより、以下の詳細な説明を参照することによって得られる。 The novel features of the invention are set forth in the following claims. For a better understanding of the features and advantages of the present invention, reference is now made to the following detailed description, which describes exemplary embodiments in which the principles of the present invention are utilized and sets forth the accompanying drawings. Obtained by:
本発明の様々な実施形態を本明細書に図示し説明してきたが、そのような実施形態は例としてのみ提供されることは当業者には自明である。本発明から逸脱することなく、当業者の知識に基づいて数多くの変形、変更、および置換は、本明細書に記載した本発明の実施形態の種々の代替を使用してもよいことを理解すべきである。 While various embodiments of the invention have been illustrated and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. It is understood that numerous alterations, modifications, and substitutions may be made to various alternatives of the embodiments of the invention described herein without departing from the invention, based on the knowledge of those skilled in the art. Should.
「間隙（ギャップ）」という用語は、本明細書で使用される場合、一般的には、物体内のまたは物体間の切れ目または穴を意味している。物体は基板または電極のような固体物体である。ギャップは、検出回路または検出回路に結合された電極に隣接する又は近くに配置されている。いくつかの実施例において、ギャップは、０．１ナノメートル（ｎｍ）〜約１０００ｎｍの程度の特徴的な幅または直径を有する。ナノメートルのオーダーの幅を有するギャップは、「ナノギャップ」と呼ばれる。いくつかの状況において、ナノギャップは、約０．１ナノメートル（ｎｍ）〜５０ｎｍ、０．５ｎｍ〜３０ｎｍ、０．５ｎｍ、１０ｎｍ、０．５ｎｍ〜５ｎｍ、または０．５ｎｍ〜２ｎｍ以下、又は２ｎｍ以下、１ｎｍ以下、０．９ｎｍ以下、０．８ｎｍ以下、０．７ｎｍ以下、０．６ｎｍ以下、又は０．５ｎｍ以下である幅を有している。ナノギャップは、少なくとも約０．５ｎｍ、０．６ｎｍ、０．７ｎｍ、０．８ｎｍ、０．９ｎｍ、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、または５ｎｍである幅を有している。ナノギャップの幅は、生体分子または生体分子のサブユニット（例えば、単量体）の分子直径（例えば、平均直径）に等しくまたはそれより小さくすることができる。 The term "gap", as used herein, generally refers to a cut or hole in or between objects. The object is a solid object such as a substrate or an electrode. The gap is located adjacent to or near the detection circuit or an electrode coupled to the detection circuit. In some embodiments, the gap has a characteristic width or diameter on the order of 0.1 nanometers (nm) to about 1000 nm. Gaps having a width on the order of nanometers are called "nano gaps". In some situations, the nanogap is between about 0.1 nanometer (nm) and 50 nm, 0.5 nm and 30 nm, 0.5 nm, 10 nm, 0.5 nm and 5 nm, or 0.5 nm and 2 nm or less, or 2 nm. The width has a width of 1 nm or less, 0.9 nm or less, 0.8 nm or less, 0.7 nm or less, 0.6 nm or less, or 0.5 nm or less. The nanogap has a width that is at least about 0.5 nm, 0.6 nm, 0.7 nm, 0.8 nm, 0.9 nm, 1 nm, 2 nm, 3 nm, 4 nm, or 5 nm. The width of the nanogap can be equal to or smaller than the molecular diameter (eg, average diameter) of the biomolecule or a subunit of the biomolecule (eg, monomer).
「チャネル」という用語は、本明細書で使用されるように、形成されるか、または他の材料で提供される孔、通路または導管を一般的に指す。材料は基板のような固体材料である。いくつかの実施例では、チャネルは、０．１ナノメートル（ｎｍ）〜約１０００ｎｍのオーダーの特徴的な幅または直径を有する。ナノメートルのオーダーの幅を有するチャネルは、「ナノチャネル」と呼ばれる。いくつかの状況において、ナノチャネルは約０．１ナノメートル（ｎｍ）〜５０ｎｍ、０．５ｎｍ〜３０ｎｍ、０．５ｎｍ、１０ｎｍ、０．５ｎｍ〜５ｎｍ、または０．５ｎｍ〜２ｎｍ、又は２ｎｍ以下、１ｎｍ以下、０．９ｎｍ以下、０．８ｎｍ以下、０．７ｎｍ以下、０．６ｎｍ以下、又は０．５ｎｍ以下である幅を有している。ナノチャネルは、少なくとも約０．５ｎｍ、０．６ｎｍ、０．７ｎｍ、０．８ｎｍ、０．９ｎｍ、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、または５ｎｍである幅を有している。ナノチャネルまたはナノチャネル（例えばナノチャネルのテーパ部）の部分の幅は、生体分子または生体分子のサブユニット（例えば、単量体）の分子直径（例えば、平均直径）に等しくまたはそれより小さくすることができる。 The term "channel" as used herein generally refers to a hole, passage or conduit formed or provided with other materials. The material is a solid material such as a substrate. In some embodiments, the channel has a characteristic width or diameter on the order of 0.1 nanometers (nm) to about 1000 nm. Channels having a width on the order of nanometers are called "nanochannels". In some situations, the nanochannel is about 0.1 nanometer (nm) to 50 nm, 0.5 nm to 30 nm, 0.5 nm, 10 nm, 0.5 nm to 5 nm, or 0.5 nm to 2 nm, or 2 nm or less; It has a width of 1 nm or less, 0.9 nm or less, 0.8 nm or less, 0.7 nm or less, 0.6 nm or less, or 0.5 nm or less. The nanochannel has a width that is at least about 0.5 nm, 0.6 nm, 0.7 nm, 0.8 nm, 0.9 nm, 1 nm, 2 nm, 3 nm, 4 nm, or 5 nm. The width of the nanochannel or portion of the nanochannel (eg, the tapered portion of the nanochannel) is equal to or smaller than the molecular diameter (eg, average diameter) of the biomolecule or subunit (eg, monomer) of the biomolecule. be able to.
「電流」という用語は、本明細書で使用されるように、一般的に電流を意味する。マイクロまたはナノ・アンペアのオーダーの電流は、「ナノ電流」と称することがある。いくつかの実施例において、電流はトンネル電流でありまたはトンネル電流を含む。 The term "current", as used herein, generally means current. Currents on the order of micro or nano amps are sometimes referred to as "nano currents." In some embodiments, the current is or includes a tunnel current.
「電極」という用語は、本明細書で使用される場合、一般的に電流を測定するために使用することができる材料を意味している。電極は、他の電極へまたは他の電極からの電流を測定するために使用することができる。いくつかの状況においては、電極は、チャンネル（例えば、ナノギャップ）に配置されて、チャネルを通る電流を測定するために使用することができる。電流は、トンネル電流でもよい。そのような電流は、ナノギャップを通って生体分子（例えば、タンパク質）を流れることによりを検出可能である。いくつかの場合には、電極に接続された検出回路は、電流を発生させるために電極間に印加される電圧を提供する。その代わりに、またはそれに加えて、電極は、生体分子（例えば、タンパク質のアミノ酸サブユニットまたは単量体）に関連した電気的コンダクタンスを測定および／または識別するために使用することができる。この場合、トンネル電流は電気的コンダクタンスに関連させることができる。 The term "electrode" as used herein generally refers to a material that can be used to measure current. The electrodes can be used to measure current to or from other electrodes. In some situations, electrodes can be placed in a channel (eg, a nanogap) and used to measure current through the channel. The current may be a tunnel current. Such currents can be detected by flowing biomolecules (eg, proteins) through the nanogap. In some cases, a detection circuit connected to the electrodes provides a voltage that is applied between the electrodes to generate a current. Alternatively, or in addition, the electrodes can be used to measure and / or identify the electrical conductance associated with a biomolecule (eg, an amino acid subunit or monomer of a protein). In this case, the tunnel current can be related to the electrical conductance.
「生体分子」という用語は、本明細書で使用されるように、一般に、ナノギャップ電極間の電流及び／又は電位を調査することのできる任意の生物学的材料を意味する。生体分子は、核酸分子、タンパク質、または炭水化物であることができる。生体分子は、１つまたはそれ以上のサブユニット、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸を含むことができる。生体分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、またはその誘導体であることができる。生体分子は、ＤＮＡ試料のＤＮＡ断片などの断片であり得る。 The term "biomolecule," as used herein, generally refers to any biological material capable of examining the current and / or potential between nanogap electrodes. Biomolecules can be nucleic acid molecules, proteins, or carbohydrates. Biomolecules can include one or more subunits, for example, nucleotides or amino acids. The biomolecule can be deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA), or a derivative thereof. Biomolecules can be fragments, such as DNA fragments of a DNA sample.
「核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に、１つまたは複数の核酸のサブユニットを含む分子を意味している。核酸は、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）、またはそれらの変異体から選択される１つ以上のサブユニットを含むことができる。ヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ、またはそれらの変異体を含むことができる。ヌクレオチドは、伸長する核酸鎖に取り込まれることができる任意のサブユニットを含むことができる。このようなサブユニットは、１つまたはそれ以上の相補的なＡ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵに固有であるか、又はプリン（すなわち、ＡまたはＧ、またはそれらの変異体）またはピリミジン（Ｃ、Ｔ、もしくはＵ、またはその変異体）に相補的なＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＵ、または任意の他のサブユニットであることができる。サブユニットは、塩基（例えば、ＡＡ、ＴＡ、ＡＴ、ＧＣ、ＣＧ、ＣＴ、ＧＴ、ＴＧ、ＡＣ、ＣＡ、またはこれらのウラシルカウンターパート）の個々の核酸塩基または塩基のグループを可能にすることができる。いくつかの実施例において、核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの誘導体である。核酸は、一本鎖または二本鎖であってもよい。 The term "nucleic acid", as used herein, generally refers to a molecule comprising one or more nucleic acid subunits. The nucleic acid can include one or more subunits selected from adenosine (A), cytosine (C), guanine (G), thymine (T) and uracil (U), or variants thereof. Nucleotides can include A, C, G, T or U, or variants thereof. Nucleotides can include any subunit that can be incorporated into a growing nucleic acid strand. Such subunits may be unique to one or more complementary A, C, G, T or U, or may be purine (ie, A or G, or a variant thereof) or pyrimidine (C , T, or U, or variants thereof), can be A, C, G, T, or U, or any other subunit. Subunits can allow individual nucleobases or groups of bases (eg, AA, TA, AT, GC, CG, CT, GT, TG, AC, CA, or their uracil counterparts). it can. In some embodiments, the nucleic acid is DNA or RNA, or a derivative thereof. Nucleic acids can be single-stranded or double-stranded.
「タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、一般的に１またはそれ以上のアミノ酸単量体、サブユニットまたは残基を有する生物学的分子又は巨大分子を意味する。たとえば、５０個以下のアミノ酸を含有するたんぱく質は「ペプチド」と呼ばれる。アミノ酸単量体は、任意の天然および／または合成アミノ酸単量体から選択でき、例えば、２０、２１、または２２種類の天然に存在するアミノ酸を使用することができる。いくつかの場合には、２０種類のアミノ酸は遺伝子コードでコードされている。一部のタンパク質は、約５００種類の天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸を含んでもよい。いくつかの状況において、タンパク質は、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファンおよびバリン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セリン及びチロシンから選択される１つ以上のアミノ酸を含むことができる。 The term "protein" as used herein generally refers to a biological or macromolecule having one or more amino acid monomers, subunits or residues. For example, proteins containing up to 50 amino acids are called "peptides". The amino acid monomer can be selected from any natural and / or synthetic amino acid monomer, and for example, 20, 21, or 22 naturally occurring amino acids can be used. In some cases, the 20 amino acids are encoded in the genetic code. Some proteins may include amino acids selected from about 500 natural and unnatural amino acids. In some situations, the protein is from isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan and valine, arginine, histidine, alanine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, proline, serine and tyrosine. It can include one or more selected amino acids.
「組」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に、要素のグループまたは集合を意味する。組は、複数の要素を含むことができる。組は「ペア」であるか、または２つを含むことができる。例えば、電極の組は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の電極を含むことができる。 The term "set", as used herein, generally refers to a group or set of elements. A set can include multiple elements. The set can be a "pair" or include two. For example, a set of electrodes can include at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 electrodes.
「配列決定」という用語は、本明細書で使用されるように、一般に生体分子の配列、例えば１つまたは複数のポリヌクレオチドのヌクレオチド塩基の配列、またはポリペプチドにおけるアミノ酸の配列を決定するための方法および技術を指す。 The term "sequencing", as used herein, generally refers to the sequence of a biomolecule, for example, the sequence of nucleotide bases of one or more polynucleotides, or the sequence of amino acids in a polypeptide. Refers to methods and techniques.
「リード」または「ｒｅａｄ」という用語は、本明細書で使用されるように、一般に配列決定装置またはシステムによって生成された生体分子または生体分子の部分の配列を意味する。このような配列は、十分な長さ（例えば、少なくとも約３０塩基対（ｂｐ））であってもよく、これを使用して、例えば、染色体またはゲノム領域または遺伝子上の位置に位置合わせすることができるより大きな配列または配列領域を識別することができる。
配列決定装置およびシステムThe terms "read" or "read", as used herein, generally refer to the sequence of a biomolecule or portion of a biomolecule produced by a sequencing device or system. Such a sequence may be of sufficient length (eg, at least about 30 base pairs (bp)) and used to align, for example, to a position on a chromosome or genomic region or gene. Larger sequences or sequence regions than can be identified.
Sequencing device and system
本開示は、生体分子配列決定装置を提供する。配列決定装置は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１００、１０００、または１００００チャネルを含むことができる。チャネルは、チャネルのナノギャップ電極の中に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０組を含むことが可能である。チャネルは、ナノチャネルであってもよい。ナノギャップ電極の組の電極は、チャネルの反対側に位置することができる。 The present disclosure provides a biomolecule sequencing device. A sequencing device can include at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 100, 1000, or 10,000 channels. The channel can include at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 sets in the nanogap electrode of the channel. The channel may be a nanochannel. The electrodes of the set of nanogap electrodes can be located on opposite sides of the channel.
生体分子（例えば、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはタンパク質）は、チャネル内またはチャネルを通った流れに供することができるが、電流、いくつかの場合においてトンネル電流は、ナノギャップ電極の所与の組のチャネルを用いて電極間で測定することができる。電流は、トンネル電流でありまたはトンネル電流を含むことができる。生体分子は、電気泳動電極のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の組によって生成される電界を使用して、チャネル内をまたはチャネルを通って流れることになる。 Biomolecules (eg, single-stranded DNA or RNA, double-stranded DNA or RNA, or proteins) can be subjected to flow in or through a channel, but the current, in some cases, the tunnel current, Measurements can be made between electrodes using a given set of channels of nanogap electrodes. The current can be or include a tunnel current. The biomolecules are moved into or through the channel using an electric field generated by at least one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, or ten of the electrophoretic electrodes. Will flow.
チャネルは、ナノ細孔の一部であることが可能であるナノ細孔は、固体膜などの膜で形成することができる。 The channel can be part of a nanopore. Nanopores can be formed in membranes, such as solid membranes.
ナノギャップ電極の組は、生体分子がチャネルを通ってナノギャップ電極の組の近傍を通過するとき電流を検出するように構成することができる。ナノギャップ電極の組は、異なる電極間隔を有することができる。 The set of nanogap electrodes can be configured to detect a current as a biomolecule passes through the channel and near the set of nanogap electrodes. The set of nanogap electrodes can have different electrode spacing.
電気泳動電極の組は、ナノチャネルを通してナノチャネルのナノギャップ電極の複数の組に近接して生体分子を動かす電界を提供することが可能である。電界は、電気泳動電極を電圧または電圧パルスの印加の際に発生することができる。いくつかの実施例において、電界は、約０．１Ｎ（ニュートン）／クーロン（Ｃ）〜５０００（Ｎ／Ｃ）、１Ｎ／Ｃから２５０Ｎ／Ｃ、１０Ｎ／Ｃから５０Ｎ／Ｃの強度を有している。 The set of electrophoretic electrodes is capable of providing an electric field that moves biomolecules through the nanochannel and in close proximity to multiple sets of nanochannel nanogap electrodes. The electric field can be generated upon application of a voltage or voltage pulse to the electrophoretic electrode. In some embodiments, the electric field has an intensity of about 0.1 N (Newton) / Coulomb (C) to 5000 (N / C), 1 N / C to 250 N / C, 10 N / C to 50 N / C. ing.
電気泳動電極の組は、チャンネルの外部に配置することができる。代わりに、電気泳動電極の組及びナノギャップ電極の組は、単一ユニットとして一体化することができる。例えば、ナノギャップ電極の電極は、少なくとも１つの固体絶縁体によって電気泳動電極の組の中で、電気泳動電極から分離することができる。 The set of electrophoresis electrodes can be located outside the channel. Alternatively, the set of electrophoretic electrodes and the set of nanogap electrodes can be integrated as a single unit. For example, the electrodes of the nanogap electrode can be separated from the electrophoretic electrode in the set of electrophoretic electrodes by at least one solid insulator.
生体分子は、コンピュータ制御装置を使用して、識別または配列決定することができる。コンピュータ制御部は、配列決定装置の一部または配列決定装置を含む配列決定システムであることが可能である。コンピュータ制御部は、ナノギャップ電極の組と通信する測定部を含むことが可能である。識別部は、生体分子またはその部分を識別するように構成される。測定部は、生体分子がナノギャップ電極の複数の組に近接して通過するときに生成される電流を測定するように構成される。コンピュータ制御部は、さらに、測定部と通信する識別部を含むことが可能である Biomolecules can be identified or sequenced using a computer controller. The computer control can be a part of the sequencing device or a sequencing system including the sequencing device. The computer control can include a measurement in communication with the set of nanogap electrodes. The identification unit is configured to identify a biomolecule or a portion thereof. The measurement unit is configured to measure a current generated when the biomolecule passes close to the plurality of sets of nanogap electrodes. The computer control may further include an identification in communication with the measurement.
いくつかの場合において、生体分子は複数の単量体（又はサブユニット）を含んでいる。識別部は、少なくとも１つの既知のタイプの単量体の基準物理量と測定部によって測定された電流から得られる物理量とに基づいて複数の単量体を識別するように構成することができる。 In some cases, a biomolecule includes multiple monomers (or subunits). The identification unit can be configured to identify the plurality of monomers based on a reference physical quantity of at least one known type of monomer and a physical quantity obtained from the current measured by the measurement unit.
配列決定装置は、チャネルと流体連通する少なくとも第１の流路と第２の流路を生成するように構成されたフローディレクタを含むことができる。フローディレクタは、第１の流路からチャネルへ試料の一部を方向付け、第１の流路から第２の流路へ試料の残りの部分を方向付ける。フローディレクタは、ナノチャネルを介して試料の移動方向に沿ってナノギャップ電極の組に向かって延在する絶縁体とすることができる。 The sequencing device can include a flow director configured to create at least a first flow path and a second flow path in fluid communication with the channel. The flow director directs a portion of the sample from the first flow path to the channel and directs the remaining portion of the sample from the first flow path to the second flow path. The flow director can be an insulator that extends through the nanochannels along the direction of sample movement toward the set of nanogap electrodes.
配列決定装置は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１００個の柱を含むことができる。柱は、第１の流路及び／または第２の流路のようなチャネルの中にまたはチャネルの外部にあることができる。柱は、効果的にその生体分子またはその一部（例えば、サブユニット）の配列決定または識別を助けることを可能にするように生体分子を直線化することができる。 The sequencing device can include at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or 100 columns. The post can be in or outside the channel, such as the first flow path and / or the second flow path. The pillars can linearize the biomolecule to allow it to effectively assist in sequencing or discriminating the biomolecule or a portion thereof (eg, a subunit).
第１の流路、第２の流路およびナノチャネルは実質的に同じ平面（すなわち、同一平面）であることが可能である。代わりに、第１の流路、第２の流路とナノチャネルは同一平面にはなくてもよい。 The first channel, the second channel and the nanochannel can be substantially coplanar (ie, coplanar). Alternatively, the first channel, the second channel and the nanochannel may not be on the same plane.
チャネルは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のテーパ部を含むことができる。このようなテーパ部は、ナノギャップ電極の組に隣接するチャンネルの部分に存在することができる。 The channel may include at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 tapers. Such a taper may be in a portion of the channel adjacent to the set of nanogap electrodes.
ナノギャップ電極の組は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の電極を含むことが可能である。電極は、０．１ナノメートル（ｎｍ）〜５０ｎｍ、０．５ｎｍ〜３０ｎｍ、０．５ｎｍ〜１０ｎｍ、０．５ｎｍ〜５ｎｍ、または０．５ｎｍ〜２ｎｍ、または２ｎｍ以下、１ｎｍ以下、０．９ｎｍ以下、０．８ｎｍ以下、０．７ｎｍ以下、０．６ｎｍ以下、または０．５ｎｍ以下の電極間の間隔（または距離）を有することが可能である。幾つかのケースでは、間隔は、少なくとも約０．５ｎｍ、０．６ｎｍ、０．７ｎｍ、０．８ｎｍ、０．９ｎｍ、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、または５ｎｍである。いくつかの実施例において、間隔は、生体分子の分子直径と等しいまたはそれより小さい。 The set of nanogap electrodes can include at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 electrodes. The electrodes are 0.1 nanometers (nm) to 50 nm, 0.5 nm to 30 nm, 0.5 nm to 10 nm, 0.5 nm to 5 nm, or 0.5 nm to 2 nm, or 2 nm or less, 1 nm or less, 0.9 nm or less , 0.8 nm or less, 0.7 nm or less, 0.6 nm or less, or 0.5 nm or less. In some cases, the spacing is at least about 0.5 nm, 0.6 nm, 0.7 nm, 0.8 nm, 0.9 nm, 1 nm, 2 nm, 3 nm, 4 nm, or 5 nm. In some embodiments, the spacing is less than or equal to the molecular diameter of the biomolecule.
図１は、いくつかの実施形態の生体分子配列決定装置１０を示す。生体分子配列決定装置１０は、ナノギャップ電極対１２（１２Ａ、１２Ｂ）、測定電源装置１８、電気泳動のための電極対（以下、「電気泳動電極対」と称する）２０（２０Ａ，２０Ｂ）、電気泳動用電源装置２２、電流計２４、及びシステム制御部２６を有している。構成要素の各々について以下に説明する。 FIG. 1 illustrates a biomolecule sequencing device 10 of some embodiments. The biomolecule sequencing apparatus 10 includes a nanogap electrode pair 12 (12A, 12B), a measurement power supply 18, an electrode pair for electrophoresis (hereinafter, referred to as “electrophoresis electrode pair”) 20 (20A, 20B), It has an electrophoresis power supply device 22, an ammeter 24, and a system control unit 26. Each of the components will be described below.
ナノギャップ電極対１２は、一対の対向するナノギャップ電極１２Ａと１２Ｂを具備している。ナノギャップ電極１２Ａ及び１２Ｂは、試料５０に含まれる生体分子の単量体５２が電極間を通過するときにそれらがトンネル電流量になるような距離で配置することができる。生体分子には、タンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖などが挙げられる。生体分子を含む単量体は、限定されないが、タンパク質を構成するアミノ酸またはペプチド、核酸を構成するヌクレオチド、多糖または糖鎖を含む糖などを含んでもよい。 The nanogap electrode pair 12 includes a pair of opposing nanogap electrodes 12A and 12B. The nanogap electrodes 12A and 12B can be arranged at such a distance that when the biomolecule monomers 52 contained in the sample 50 pass between the electrodes, they become the amount of tunnel current. Biomolecules include proteins, peptides, nucleic acids, sugar chains, and the like. The monomer containing a biomolecule may include, but is not limited to, an amino acid or peptide constituting a protein, a nucleotide constituting a nucleic acid, a saccharide including a polysaccharide or a sugar chain, and the like.
一対のナノギャップ電極１２Ａ，１２Ｂは、図示し説明しているが、装置１０は、２個以上の電極を含むことができる。例えば、装置１０は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の電極を含む組でナノギャップ電極の組を含む。 Although a pair of nanogap electrodes 12A, 12B are shown and described, the device 10 can include more than one electrode. For example, device 10 includes a set of nanogap electrodes in a set including at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 electrodes.
電極間距離が単一分子５２の分子直径よりも長い場合、トンネル電流はナノギャップ電極対１２の電極間を容易に流れることができない、または２以上の単一分子５２が同時にナノギャップ電極対１２の間に進入する。これに対して、電極間距離が単一分子５２の分子径よりも非常に短い場合、単一分子５２はナノギャップ電極対１２の間に入ることができない。 If the distance between the electrodes is longer than the molecular diameter of the single molecule 52, the tunnel current cannot easily flow between the electrodes of the nanogap electrode pair 12, or two or more single molecules 52 may be simultaneously In between. On the other hand, if the distance between the electrodes is much shorter than the molecular diameter of the single molecule 52, the single molecule 52 cannot enter between the nanogap electrode pair 12.
電極間距離が単一分子５２の分子径よりも非常に長い又は非常に短い場合、単一分子５２を通過するトンネル電流を検出することが困難である。したがって、電極間距離は、単一分子５２の分子径よりもわずかに短いまたは同一にまたはわずかに長く形成されることが好ましい。電極間距離は、単一分子５２の直径の０．５倍〜２倍、オプションとして分子直径の０．５〜１倍の長さ、または分子直径の長さの０．７〜０．９倍に設定することができる。 If the distance between the electrodes is very long or very short than the molecular diameter of the single molecule 52, it is difficult to detect a tunnel current passing through the single molecule 52. Therefore, it is preferable that the inter-electrode distance is formed to be slightly shorter, equal to, or slightly longer than the molecular diameter of the single molecule 52. The distance between the electrodes is 0.5 to 2 times the diameter of the single molecule 52, optionally 0.5 to 1 times the molecular diameter, or 0.7 to 0.9 times the length of the molecular diameter. Can be set to
ナノギャップ電極１２を製造する具体的な方法は特に限定されないが、このような製造方法の一例について説明する。 Although a specific method of manufacturing the nanogap electrode 12 is not particularly limited, an example of such a manufacturing method will be described.
上記ナノギャップ電極１２の対は、公知のナノ機械的制御破断接合方法（ＭＣＢＪ法）を用いて製造することができる。ナノ機械的制御破断接合方法は、ピコメートルレベルまたはより細かい解像度で優れた機械的安定性と電極間距離を制御することが可能な優れた方法である。ナノ機械的制御破断接合方法を用いた電極の製造方法は、例えば、Ｔ．Ｍ．ｖａｎ Ｒｕｉｔｅｎｂｅｅｋ，Ａ．Ａｌｖａｒｅｚ、Ｐｉｎｅｙｒｏ、Ｇｒａｈｍａｎｎ、Ｊｏｙｅｚ，Ｍ．Ｈ．Ｄｅｖｏｒｅｔ、Ｅｓｔｅｖｅ，Ｃ−は、Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍ、１０８（１９９６）、およびＭ．Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｋ．Ｓｈｏｊｉ，Ｍ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．Ｋａｗａｉ，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，３４５（２００８）に記載がある。電極材料は、金、白金、銀、パラジウム、タングステン、および適切な合金もしくは複合材料のような任意の適切な金属を含む。 The pair of nanogap electrodes 12 can be manufactured by using a known nanomechanical controlled break joining method (MCBJ method). The nanomechanical controlled fracture joining method is an excellent method that can control the mechanical stability and the distance between the electrodes at picometer level or finer resolution. A method for manufacturing an electrode using the nanomechanical controlled fracture joining method is described in, for example, T.S. M. van Ruitenbeek, A .; Alvarez, Pineyro, Grahmann, Joyez, M .; H. Deboret, Esteve, C- is Rev. Sci. Instrum, 108 (1996), and M.E. Tsutsui, K .; Shoji, M .; Taniguchi, T .; Kawai, Nano Lett. , 345 (2008). Electrode materials include any suitable metal, such as gold, platinum, silver, palladium, tungsten, and suitable alloys or composites.
例えば、ナノギャップ電極対１２は、以下の手順を用いて製造することができる。 For example, the nanogap electrode pair 12 can be manufactured using the following procedure.
第一に、電子ビームリソグラフィー及びリフトオフ技術を用いて、ナノスケールの金接合は、電子ビーム描画装置（例えば、日本電子製、カタログ番号：ＪＳＭ６５００Ｆ）を用いてポリイミドで被覆された可撓性金属基板上にパターン化されてもよい。接合部の下のポリイミドは、例えば、反応性イオンエッチングプロセス、エッチングプロセス、例えば、反応性イオンエッチング装置（例えば、Ｓａｍｃｏ Ｉｎｃ．、カタログ番号：１０ＮＲ）を用いてエッチングにより除去してもよい。 First, using electron beam lithography and lift-off techniques, nanoscale gold bonding is performed using a flexible metal substrate coated with polyimide using an electron beam lithography system (eg, JEOL, catalog number: JSM6500F). It may be patterned on top. The polyimide under the junction may be removed by, for example, a reactive ion etching process, an etching process, for example, using a reactive ion etching apparatus (eg, Samco Inc., catalog number: 10NR).
この後、３点曲げ構造を有するナノスケール金ブリッジ構造は、基板を折り曲げることによって形成することができる。このとき電極対の電極間の距離は、圧電アクチュエータ（ＣＥＤＲＡＴ、カタログ番号：ＡＰＡ（１５０ｍ）を使用して、基板の正確な曲げ加工を制御することにより、ピコメートルレベルまたは細かい分解能で制御することができる。 Thereafter, a nanoscale gold bridge structure having a three-point bending structure can be formed by bending the substrate. At this time, the distance between the electrodes of the electrode pair is controlled at the picometer level or fine resolution by controlling the accurate bending of the substrate using a piezoelectric actuator (CEDLAT, catalog number: APA (150 m)). Can be.
いくつかの実施形態では、このような製造方法およびプロセスを用いて、実質的に平面状であるデバイスを実現することができる。１ナノチャネルは、ナノチャネルが基板上に作製することができるように製造されてもよい。中央領域４４Ｍは、中央領域４４Ｍの底部が同じまたは複数のナノチャネルの底部と基板上において実質的に同じ垂直距離となるように１つ以上のナノチャネルの両端に配置されてもよい。１つ以上のナノチャネルの端部は、前記中央領域に隣接するように配置されてもよい。 In some embodiments, such manufacturing methods and processes can be used to achieve devices that are substantially planar. One nanochannel may be manufactured such that the nanochannel can be created on a substrate. The central region 44M may be positioned at one or more ends of one or more nanochannels such that the bottom of the central region 44M is at substantially the same vertical distance on the substrate as the bottom of the same or multiple nanochannels. One or more nanochannel ends may be positioned adjacent to the central region.
さらなる実施形態において、中央領域４４Ｍは、中央領域４４Ｍの頂部が同じまたは複数のナノチャネルの頂部と基板上において実質的に同じ垂直距離となるように１つ以上のナノチャネルの両端に配置されてもよい。１つ以上のナノチャネルの端部は、前記中央領域に隣接するように配置されてもよい。 In a further embodiment, the central region 44M is positioned at both ends of one or more nanochannels such that the top of the central region 44M has substantially the same vertical distance on the substrate as the top of the same or multiple nanochannels. Is also good. One or more nanochannel ends may be positioned adjacent to the central region.
いくつかの実施形態では、正確に同じであることを可能にすることができる製造公差の範囲内であれば、垂直方向の寸法が同じまたは実質的に同じ、または同一平面であってもよい。 In some embodiments, the vertical dimensions may be the same or substantially the same, or even coplanar, within manufacturing tolerances that can allow them to be exactly the same.
他の実施形態では、ナノチャネルの開放端は、１つまたはそれ以上のナノチャネルの両端で中央領域と交差する場合、１つ以上のナノチャネルは、同一または実質的に同一の、又は同一平面上である垂直方向の寸法を有していてもよい。この場合、ナノチャネルの全体の縦寸法は、中央領域の垂直方向の寸法内に収容されている。 In other embodiments, the one or more nanochannels are identical or substantially identical, or coplanar if the open ends of the nanochannels intersect the central region at both ends of the one or more nanochannels. It may have a vertical dimension that is above. In this case, the overall vertical dimension of the nanochannel is contained within the vertical dimension of the central region.
さらなる実施形態において、ナノチャネルの開放端は、１つまたはそれ以上のナノチャネルの両端でナノチャネルの垂直方向寸法の少なくとも半分が中央領域の垂直方向の寸法内に収容される中央領域と交差する場合、１つ以上のナノチャネルは、同一または実質的に同一の、または同一平面である垂直方向の寸法を有することができる。 In a further embodiment, the open end of the nanochannel intersects a central region where at least half of the vertical dimension of the nanochannel is contained within the vertical dimension of the central region at one or more nanochannel ends. In that case, the one or more nanochannels can have the same or substantially the same or the same planar vertical dimension.
その結果、そのように提供されたブリッジは、引っ張られてもよく、ブリッジは部分的に破壊されるようにする。ブリッジをさらに引っ張ることができ、切れ目によって生じるナノギャップ（電極間距離）の大きさが標的単一分子５２の検出に応じて所望の長さに設定できる。例えば、単一分子５２が、生体分子のタンパク質を切断し、一定の長さにされたペプチドを構成するアミノ酸分子である場合、単一分子５２の単量体の側鎖の長さは、約０．３ｎｍ〜約１ｎｍであってもよい。この場合には、電極対の電極間距離は、自己破壊技術（例えばＭ．Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｋ．，Ｓｈｏｊｉ，Ｍ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．Ｋａｗａｉ，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．、３４５（２００８）、およびＭ．Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｍ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．Ｋａｗａｉ，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．９３、１６３１１５（２００８）を参照）を使用してブリッジの引張りを調整することによって正確に制御することができる。 As a result, the bridge so provided may be pulled, causing the bridge to be partially broken. The bridge can be further pulled, and the size of the nanogap (distance between electrodes) caused by the cut can be set to a desired length according to the detection of the target single molecule 52. For example, when the single molecule 52 is an amino acid molecule that cleaves a protein of a biomolecule and forms a peptide of a fixed length, the length of the side chain of the monomer of the single molecule 52 is about It may be from 0.3 nm to about 1 nm. In this case, the distance between the electrodes of the electrode pair may be determined by a self-destructive technique (for example, M. Tsutsui, K., Shoji, M. Taniguchi, T. Kawai, Nano Lett., 345 (2008), and M. Tsutsui, M. Taniguchi, T. Kawai, Appl. Phys. Lett. 93, 163115 (2008)) can be used to control precisely by adjusting the tension of the bridge.
具体的には、０．１Ｖまたは０．０５０Ｖから０．４Ｖの直流のバイアス電圧（Ｖｂ）は、１０ｋΩの直列抵抗及びプログラムされた接合延伸速度で延伸された金ナノ接合を使用してブリッジに印加することができる。それによって、例えば、抵抗フィードバック方法（Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｋ．，Ｓｈｏｊｉ，Ｍ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．Ｋａｗａｉ，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．、３４５（２００８）、およびＭ．Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｍ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．Ｋａｗａｉ，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．９３、１６３１〜１５（２００８）を参照）を利用することにより、データ収集ボード（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、カタログ番号：ＮＩ ＰＣＩｅ６３２１）を用いて、ブリッジを破壊する。ブリッジはさらに引っ張られてもよく、また、切れ目によって生じるナノギャップ（電極間距離）の大きさは、意図する長さに設定することができ、ナノギャップ電極対１２が形成できる。 Specifically, a DC bias voltage (Vb) of 0.1 V or 0.050 V to 0.4 V is applied to the bridge using a 10 kΩ series resistance and a gold nanojunction stretched at a programmed junction stretch rate. Can be applied. Thereby, for example, the resistance feedback method (Tstsui, K., Shoji, M. Taniguchi, T. Kawai, Nano Lett., 345 (2008), and M. Tsutsui, M. Taniguchi, T. Kawai, Appl. Phys. Lett. 93, 1631-15 (2008)) to break the bridge using a data acquisition board (National Instruments, catalog number: NI PCIe6321). The bridge may be further pulled, and the size of the nanogap (distance between electrodes) generated by the cut can be set to an intended length, and the nanogap electrode pair 12 can be formed.
電圧は、測定電源装置１８によりナノギャップ電極対１２間に印加される。測定電源装置１８によってナノギャップ電極対１２に印加される電圧は、特に限定されず、例えば、０．２５Ｖから０．７５Ｖ、０．１Ｖから０．４Ｖ、または０．０５０Ｖから０．０２Ｖとすることができる。測定電源装置１８の具体的な構成は特に限定されるものではないが、適切な周知の電源装置を使用することができる。 A voltage is applied between the nanogap electrode pair 12 by the measurement power supply 18. The voltage applied to the nanogap electrode pair 12 by the measurement power supply 18 is not particularly limited, and is, for example, 0.25 V to 0.75 V, 0.1 V to 0.4 V, or 0.050 V to 0.02 V. be able to. The specific configuration of the measurement power supply device 18 is not particularly limited, but an appropriate known power supply device can be used.
電気泳動電極対２０は、一対の泳動電極２０Ａおよび２０Ｂを含むことがある。電気泳動電極２０Ａ、２０Ｂは、電界が、試料５０に含有される単一分子５２が（図１の矢印Ａ方向に）移動することができるように形成することができるように配置されてもよい。いくつかの実施形態では、一例として、電気泳動電極２０Ａ、２０Ｂは、試料分子が、絶縁体１４を挟んでナノギャップ電極対１２に対して移動できるように配置されてもよい。絶縁体１４の幅は、十分な幅（例えば、約３００ｎｍ）に設定されてもよく、電気泳動電極対２０に流れる電流およびナノギャップ電極対１２を流れる電流との間に干渉が発生しないようになっている。 The electrophoresis electrode pair 20 may include a pair of electrophoresis electrodes 20A and 20B. The electrophoresis electrodes 20A, 20B may be arranged such that an electric field can be formed such that a single molecule 52 contained in the sample 50 can move (in the direction of arrow A in FIG. 1). . In some embodiments, as an example, the electrophoresis electrodes 20A, 20B may be arranged such that the sample molecules can move with respect to the nanogap electrode pair 12 with the insulator 14 interposed therebetween. The width of the insulator 14 may be set to a sufficient width (for example, about 300 nm) so that no interference occurs between the current flowing through the electrophoresis electrode pair 20 and the current flowing through the nanogap electrode pair 12. Has become.
図１の例では、電気泳動電極２０Ａは２分割された電極であってもよいが、分離する必要はなく、単一の電極であってもよい。これは、この電気泳動電極２０Ｂにも適用される。 In the example of FIG. 1, the electrophoresis electrode 20 </ b> A may be a two-part electrode, but need not be separated, and may be a single electrode. This also applies to the electrophoresis electrode 20B.
電気泳動電極２０Ａと電気泳動電極２０Ｂとの間に電界が形成される場合、単一分子５２を電気泳動あるいは電気浸透による電界によって移動させることができる。換言すれば、単一分子５２は、ナノギャップ電極対１２の電極間を通過するように移動することができる。 When an electric field is formed between the electrophoresis electrode 20A and the electrophoresis electrode 20B, the single molecule 52 can be moved by an electric field due to electrophoresis or electroosmosis. In other words, the single molecule 52 can move so as to pass between the electrodes of the nanogap electrode pair 12.
電圧は、電気泳動電源装置２２により電気泳動電極対２０間に印加される。電気泳動電源装置２２によって電気泳動電極対２０に印加される電圧は、特に限定されないが、単一分子５２がナノギャップ電極対１２の電極間を通過する速度を制御することが可能な電圧の値を適宜の設定することができる。電気泳動電極対２０の電極との間に形成される電界の方向を切り替えることができるように、電気泳動電源２２は電気泳動電極対２０に電圧を印加することができる。したがって、電気泳動電極対２０の電極間を移動する単一分子５２の移動方向を切り替えることができる。電気泳動電源装置２２の具体的な構成は特に限定されるものではなく、適宜公知の電源装置を使用することができる。 The voltage is applied between the electrophoresis electrode pair 20 by the electrophoresis power supply device 22. The voltage applied to the electrophoresis electrode pair 20 by the electrophoresis power supply device 22 is not particularly limited, but is a voltage value capable of controlling the speed at which the single molecule 52 passes between the electrodes of the nanogap electrode pair 12. Can be set appropriately. The electrophoresis power supply 22 can apply a voltage to the electrophoresis electrode pair 20 so that the direction of the electric field formed between the electrodes of the electrophoresis electrode pair 20 can be switched. Therefore, the moving direction of the single molecule 52 moving between the electrodes of the electrophoresis electrode pair 20 can be switched. The specific configuration of the electrophoresis power supply device 22 is not particularly limited, and a known power supply device can be used as appropriate.
電流計２４は、単量体５２が測定電源装置１８により電圧が印加されるナノギャップ電極対１２の電極との間を通過するときに発生するトンネル電流の増加を測定する。電流計２４の具体的な構成は特に限定されるものではなく、トランスインピーダンス増幅器のような適当な公知の電流測定装置を使用することができる。 The ammeter 24 measures an increase in tunnel current generated when the monomer 52 passes between the electrodes of the nanogap electrode pair 12 to which a voltage is applied by the measurement power supply 18. The specific configuration of the ammeter 24 is not particularly limited, and an appropriate known current measuring device such as a transimpedance amplifier can be used.
次に、ナノギャップ電極対１２及び生体分子配列決定装置１０の電気泳動電極対２０に関連する具体的な構成について説明する。 Next, a specific configuration related to the nanogap electrode pair 12 and the electrophoresis electrode pair 20 of the biomolecule sequencing apparatus 10 will be described.
図２はナノギャップ電極対１２および電気泳動電極対２０の周辺の拡大図である。図２に示すように、多数のナノ柱４０は、単一分子５２がナノ柱の周りを通過しナノギャップ電極対１２及び電気泳動電極対２０に到達することができるように、間隔をおいて設けられていてもよい。本明細書で使用されるとき、「ナノ柱」は、直径又は幅がナノメートル以下の規模の柱であってもよい。 FIG. 2 is an enlarged view of the vicinity of the nanogap electrode pair 12 and the electrophoresis electrode pair 20. As shown in FIG. 2, the multiple nanoposts 40 are spaced so that a single molecule 52 can pass around the nanoposts and reach the nanogap electrode pair 12 and the electrophoresis electrode pair 20. It may be provided. As used herein, a “nanopost” may be a post with a diameter or width on the order of nanometers or less.
ナノ柱４０は、図２の左上に示すように、矢印Ｂによって示された領域に設けられ、試料５０は、左領域４４Ｌから誘導されることができる。試料５０は、電気泳動、電気浸透、圧力、表面張力、及びそれらの組み合わせのうちの１つによって移動させることができる。試料５０中に含まれるＤＮＡ等のような複雑な交絡生体分子は、溝に竹の茎等が配置されているような多数のナノ柱４０により他のＤＮＡ分子から分離して、もつれをほどきまたは直線化することができる。 The nanopost 40 is provided in a region indicated by an arrow B, as shown in the upper left of FIG. 2, and the sample 50 can be guided from the left region 44L. The sample 50 can be moved by one of electrophoresis, electroosmosis, pressure, surface tension, and combinations thereof. Complex entangled biomolecules such as DNA contained in the sample 50 are separated from other DNA molecules by a large number of nano-columns 40 such as bamboo stalks arranged in grooves, and entangled. Or it can be linearized.
いくつかの実施形態では、流体試料であってもよい試料は、毛細管作用を試料に生じさせる方法で装置に導入されてもよい。例えば、左領域４４Ｌから、中央領域４４Ｍへまたはこれを通って、右側領域４４Ｒへ吸引されることができる。勿論、試料は、右側領域４４Ｒから導入され、中間領域４４Ｍに毛管作用により吸引され、左の領域４４Ｌに供給されてもよい。 In some embodiments, a sample, which may be a fluid sample, may be introduced into the device in a manner that causes capillary action to occur in the sample. For example, suction may be from the left region 44L to or through the central region 44M to the right region 44R. Of course, the sample may be introduced from the right area 44R, aspirated by the capillary action into the intermediate area 44M, and supplied to the left area 44L.
いくつかの実施形態では、第２の流体は、同様に試料が導入されてもよい反対の１つ以上ナノチャネルの端で標識されていない領域に同様に配置された領域の一方の側に導入されてもよく、毛管作用によって対応する中央領域に吸引されてもよいし、毛管作用により吸引され、前記第２の流体が導入され得る領域に対向する側の領域にも至ってもよい In some embodiments, the second fluid is introduced on one side of a region that is also located in an unlabeled region at the opposite end of one or more nanochannels where the sample may also be introduced. May be drawn into the corresponding central area by capillary action, or may reach the area on the side opposite to the area where the second fluid can be introduced by suction by capillary action.
いくつかの実施形態において、試料は、第２の流体を導入する前に、導入することができるが、その試料は、１つ又はそれ以上のナノチャネルの第１の端部から、前記１つ以上のナノチャネルの第２の端部を通って中に吸引することができるようにする。第２の流体は、そこから１つまたは複数のナノチャネルの第２の端部と交差する中間領域に隣接する領域に適用することが可能である。このようにして、流体がナノチャネルの両端に同時に印加され、これにより１つ以上のナノチャネルを通しての流体アクセスを可能にされる場合に生じ得る空気ギャップ又は気泡は、１つ以上のナノチャネル内の試料と第２流体の間で形成されるのを回避できる。同様に、第２流体は、最初に提供され、試料流体の導入に先立ち毛細管現象によりナノチャネルを通して吸引されてもよい。 In some embodiments, the sample can be introduced prior to the introduction of the second fluid, wherein the sample is removed from the first end of one or more nanochannels by the one or more nanochannels. Through the second end of the above nanochannel is allowed to be sucked into. The second fluid can be applied to an area adjacent to an intermediate area from which the second end of the one or more nanochannels intersects. In this way, air gaps or bubbles that may occur if a fluid is simultaneously applied to both ends of a nanochannel, thereby allowing fluid access through the one or more nanochannels, are created within the one or more nanochannels. Formation between the sample and the second fluid can be avoided. Similarly, the second fluid may be provided first and aspirated through the nanochannel by capillary action prior to introduction of the sample fluid.
このような空気のギャップまたは泡の形成は、ナノチャネルの端部間の距離が幅、高さ、または直径、またはナノチャネルの断面に関連する他の測定に比べて長い場合に形成される可能性がより高い。いくつかの実施形態において、ナノチャネルの長さがナノチャネルの高さ、幅または直径であってもよい断面の最小寸法の１０倍であることができる。別の実施形態では、ナノチャネルの長さがナノチャネルの高さ、幅または直径であってもよい。断面の最小寸法の１００倍であることができる。 The formation of such air gaps or bubbles can occur when the distance between the ends of the nanochannel is long compared to the width, height, or diameter, or other measurements related to the cross section of the nanochannel. More likely. In some embodiments, the length of the nanochannel can be ten times the smallest dimension of the cross-section, which can be the height, width or diameter of the nanochannel. In another embodiment, the length of the nanochannel may be the height, width or diameter of the nanochannel. It can be 100 times the smallest dimension of the cross section.
さらなる実施形態において、ナノチャネルの長さは、試料ＤＮＡオリゴが前記ナノチャネル内に完全に適合することのできるように、試料ＤＮＡオリゴよりも長くてもよい。当該試料ＤＮＡオリゴは、長さ１００から２００塩基、又は１５０塩基〜５００塩基の長さであってもよく、３００〜１０００塩基長、８００〜４０００塩基長、または３０００〜１０，０００塩基長であることができる、または８，０００〜１００，０００塩基の長さであってもよいし、長さ１００，０００よりも大きい塩基であることができる。 In a further embodiment, the length of the nanochannel may be longer than the sample DNA oligo so that the sample DNA oligo can fit completely within said nanochannel. The sample DNA oligo may be 100 to 200 bases in length, or 150 to 500 bases in length, 300 to 1000 bases in length, 800 to 4000 bases in length, or 3000 to 10,000 bases in length. Or can be from 8,000 to 100,000 bases in length, or can be more than 100,000 bases in length.
さらに、１つまたは複数のフローディレクタ４２のそれぞれは、ナノチャネルの入口に向かって延びている。したがって、チャネルの幅は、ナノチャネル５２に直ぐに隣接するチャンネルのエリアの領域において低減することができる。これは、ナノチャネル５２の端部にフローディレクタをナノギャップ電極対１２が配置されるように提供する。したがって、このフローディレクタ４２は、対向配置されている、またはナノチャネルの一方の端部が流量制御器の絶縁の一部に関連を有するように配置され、他の端部がこのような特徴を有しないように配置されてもよい。フローディレクタ４２は、試料分子を、ナノチャネルの一端部に接近するように流れを導くように機能して、させることができ、試料分子をより高い割合でナノチャネルに導入することを可能にするようにしてもよく、試料分子は、より迅速に導入することができる。そのようなものとして、試料５０ための２つの流路が形成され、すなわち左領域４４Ｌからナノギャップ電極対１２の電極間の領域に延在する流路４６Ａと、図２で見て左領域４４Ｌからナノ柱４０を含む右上領域に延在する流路４６Ｂとが形成されている。換言すれば、フローディレクタ４２は、ナノギャップ電極対１２に向かって試料５０を流すための流路４６Ａとナノギャップ電極対１２から離れる方向において試料５０を流すための流路４６Ｂとを含み、様々な流路を形成することにより試料５０の移動を方向付ける機能を果たし得る。 Further, each of the one or more flow directors 42 extends toward the entrance of the nanochannel. Thus, the width of the channel can be reduced in the area of the area of the channel immediately adjacent to the nanochannel 52. This provides a flow director at the end of the nanochannel 52 such that the nanogap electrode pair 12 is located. Thus, the flow director 42 is opposed or arranged such that one end of the nanochannel is associated with a portion of the flow controller insulation and the other end has such features. You may arrange so that it may not have. The flow director 42 can function to direct the sample molecules closer to one end of the nanochannel, allowing the sample molecules to be introduced into the nanochannel at a higher rate. Alternatively, the sample molecules can be introduced more quickly. As such, two flow paths for the sample 50 are formed, a flow path 46A extending from the left region 44L to a region between the electrodes of the nanogap electrode pair 12, and a left region 44L as viewed in FIG. And a flow channel 46 </ b> B extending to the upper right area including the nanopost 40. In other words, the flow director 42 includes a flow path 46A for flowing the sample 50 toward the nanogap electrode pair 12 and a flow path 46B for flowing the sample 50 in a direction away from the nanogap electrode pair 12; The function of directing the movement of the sample 50 can be achieved by forming a simple flow path.
いくつかの実施形態において、ナノチャネル、第１および第２のチャネル、柱、およびナノ電極対は、実質的に同一平面上にリソグラフィで作ることができる。 In some embodiments, the nanochannels, first and second channels, pillars, and nanoelectrode pairs can be lithographically made substantially coplanar.
このようなフローディレクタ４２が存在しない場合には、従来のように、試料５０の流路は、矢印Ｂ方向、すなわち、ナノギャップ電極対１２に向かう方向にのみ向けられているので、試料５０がナノギャップ電極対１２に近接した領域に連結する流路は、幅が狭くなっている。これに対して、いくつかの実施形態において、２流路４６Ａ，４６Ｂはフローディレクタ４２を配置することによって形成されているので、過剰の試料５０は流路４６Ｂを介して領域４４Ｒに流れることができ、ナノギャップ電極対１２の近傍で試料５０の詰まりを軽減することができるので、単一分子５２の高精度な識別が可能となる。 When such a flow director 42 does not exist, the flow path of the sample 50 is directed only in the direction of the arrow B, that is, in the direction toward the nanogap electrode pair 12, as in the related art. The flow path connected to the region close to the nanogap electrode pair 12 has a narrow width. In contrast, in some embodiments, since the two flow paths 46A and 46B are formed by disposing the flow director 42, excess sample 50 may flow to the region 44R via the flow path 46B. Since the clogging of the sample 50 can be reduced in the vicinity of the nanogap electrode pair 12, the single molecule 52 can be identified with high accuracy.
図３は、図２の破線で囲まれた領域５４の拡大図である。図３に示すように、ナノチャネル５６は１つ以上の絶縁体１４の近くに、及び中央領域４４Ｍに直接隣接して形成されてもよく、ナノチャネル５２の反対側の端部になるように構成することが可能である。ナノチャネル５６は、ナノ柱４０が設けられた中央領域４４Ｍからナノギャップ電極対１２の電極へ向かってテーパ状を有していてもよい。このようなテーパは、ナノチャネル５６を通過する流れによって生体分子を直線化することができる。また、中央領域４４Ｍに近い位置にあるナノチャネル５６の幅Ｄ１は、約１２０ｎｍであり、例としてであるが、任意の適切な幅、２０ｎｍ〜１００ｎｍ、５０ｎｍ〜２５０ｎｍ、または２００ｎｍ〜１０００ｎｍであってもよい。以上説明したように、これは、テーパ状の点でのナノチャネル５６の幅、すなわち、ナノギャップ電極対１２の電極間距離Ｄ２は、単一分子５２の分子直径よりもわずかに短いか、等しいか、またはわずかに長いことが望ましい。例えば単一分子は、数１００ピコメートル（ｐｍ）〜１．０ｎｍまたはそれ以上の直径を有していてもよい。 FIG. 3 is an enlarged view of a region 54 surrounded by a broken line in FIG. As shown in FIG. 3, the nanochannel 56 may be formed near one or more insulators 14 and directly adjacent to the central region 44M, such that it is at the opposite end of the nanochannel 52. It is possible to configure. The nanochannel 56 may have a tapered shape from the central region 44M where the nanopost 40 is provided to the electrode of the nanogap electrode pair 12. Such a taper can straighten the biomolecules by the flow through the nanochannel 56. Also, the width D1 of the nanochannel 56 near the central region 44M is about 120 nm, and by way of example, any suitable width, 20 nm to 100 nm, 50 nm to 250 nm, or 200 nm to 1000 nm. Is also good. As described above, this is because the width of the nanochannel 56 at the tapered point, that is, the inter-electrode distance D2 of the nanogap electrode pair 12 is slightly shorter than or equal to the molecular diameter of the single molecule 52. Or slightly longer. For example, a single molecule may have a diameter of a few hundred picometers (pm) to 1.0 nm or more.
図２に示すように、電気泳動電極対２０は、ナノチャネル５６と流体連通して配置されてもよい。これは、各単一分子の一貫した電気泳動移動度を可能にし、高精度且つ高スループットで単一分子の識別を可能にする。 As shown in FIG. 2, the electrophoresis electrode pair 20 may be placed in fluid communication with the nanochannel 56. This allows for consistent electrophoretic mobility of each single molecule, and allows for single molecule identification with high accuracy and high throughput.
システム制御部２６は、生体分子配列決定装置１０の各構成要素を制御し、測定されたトンネル信号の変化に応じた信号に基づいて標的単一分子５２の種類（またはタイプ）を識別することができる。 The system control unit 26 controls each component of the biomolecule sequencing apparatus 10 to identify the type (or type) of the target single molecule 52 based on a signal corresponding to the measured change in the tunnel signal. it can.
システム制御部２６は、中央処理装置（ＣＰＵ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、生体分子配列決定プログラム（後述）が格納されてもよい。読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）などを有するコンピュータであってよい。システム制御装置２６は、本明細書の他の箇所に記載されるように、図１５および対応するテキストのようなコンピュータを含んでいてもよく、電気泳動制御部３０と、測定制御部３２と、識別部３４と、を含むものとして機能的に表されることもある。以下に、各成分について詳細に説明する。 The system control unit 26 may store a central processing unit (CPU), a random access memory (RAM), and a biomolecule sequence determination program (described later). It may be a computer having a read-only memory (ROM) or the like. The system controller 26 may include a computer such as FIG. 15 and corresponding text, as described elsewhere herein, including an electrophoresis controller 30, a measurement controller 32, And may be functionally represented as including the identification unit 34. Hereinafter, each component will be described in detail.
制御部３０は、単一分子５２がナノギャップ電極対１２の電極間を通過することができるように、１つ以上の電気泳動用電源装置２２による電圧の印加を制御することができる。 The control unit 30 can control the application of the voltage by one or more power supplies for electrophoresis 22 so that the single molecule 52 can pass between the electrodes of the nanogap electrode pair 12.
測定制御部３２は、電流計２４を制御して、電流計２４は、ナノギャップ電極対１２の電極間トンネル電流の流れを測定することができる。トンネル電流を測定するための時間には特に制限はなく、その可能な値は、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、１、２、３、４時間又はそれ以上の時間である。測定時間は、単一分子５２の長さ、配列決定される単一分子の数、配列決定の誤り率、単一分子が配列決定されるカバレッジ、配列決定のために利用されるナノチャネルおよびセンサの数、他の因子から適切に設定される。 The measurement control unit 32 controls the ammeter 24, and the ammeter 24 can measure the flow of the tunnel current between the electrodes of the nanogap electrode pair 12. There is no particular limitation on the time for measuring the tunnel current, the possible values being 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, 40 minutes, 50 minutes, 1, 2, 3, 4 hours or more. is there. The measurement time is determined by the length of the single molecule 52, the number of single molecules to be sequenced, the error rate of sequencing, the coverage by which the single molecule is sequenced, the nanochannels and sensors utilized for sequencing. The number is appropriately set based on other factors.
また、測定制御部３２は、電流計２４によって測定されたトンネル電流の現在値を取得し、取得した電流値を用いてコンダクタンスを計算し、コンダクタンスの時間プロファイルを作成することができる。トンネル電流が測定されるときにコンダクタンスは、ナノギャップ電極対１２に印加された電圧Ｖによってトンネル電流の電流値を割ることで計算することができる。コンダクタンスを用いて、ナノギャップ電極対１２との間に印加される電圧が異なる測定のために異なる場合であっても、統一された基準プロファイルの取得を可能にする。ナノギャップ電極対１２に印加される電圧値は、各測定に対して一定であるとき、トンネル電流及びコンダクタンスの値は、同様の方法で処理することができる。 Further, the measurement control unit 32 can obtain the current value of the tunnel current measured by the ammeter 24, calculate the conductance using the obtained current value, and create a time profile of the conductance. When the tunnel current is measured, the conductance can be calculated by dividing the current value of the tunnel current by the voltage V applied to the nanogap electrode pair 12. The conductance is used to enable the acquisition of a unified reference profile, even if the voltage applied between the nanogap electrode pair 12 is different for different measurements. When the voltage value applied to the nanogap electrode pair 12 is constant for each measurement, the values of tunnel current and conductance can be handled in a similar manner.
測定制御部３２は、電流増幅器を使用し、電流計２４によって測定されたトンネル電流を増幅し増幅トンネル電流を得ることができる。電流増幅器を用いると弱いトンネル電流値の増幅を可能にする。したがって、高い感度でトンネル電流を測定可能である。電流増幅器は、例えば、市販されている可変利得高速電流増幅器（カタログ番号：ＤＨＰＣＡ１００、ＦＥＭＴＯ Ｍｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ社製）を用いてもよい。 The measurement control unit 32 can use a current amplifier to amplify the tunnel current measured by the ammeter 24 to obtain an amplified tunnel current. The use of a current amplifier enables amplification of a weak tunnel current value. Therefore, the tunnel current can be measured with high sensitivity. As the current amplifier, for example, a commercially available variable gain high speed current amplifier (catalog number: DHPCA100, manufactured by FEMTO Messtechnik GmbH) may be used.
識別部３４は、種類（またはタイプ）が既知であり、相対コンダクタンステーブル３６に格納されている単一分子５２の単量体に対して、相対コンダクタンスを利用して、測定制御部３２が作成したコンダクタンス時間プロファイルから得られた検出物理量を比較することができ、それにより、単一分子５２の標的単量体の種類を識別する。いくつかの実施形態において、検出された物理量は、測定制御部３２により調製されたコンダクタンスの時間プロファイルの各測定点についてのコンダクタンスである。本明細書で使用されるように、相対コンダクタンスは、種類が知られている単一分子５２の単量体を測定して得られた単一分子の各単量体のコンダクタンスである。相対コンダクタンスは、単一分子５２の単量体に関連する測定されたコンダクタンスを単一分子５２の全ての単量体のために測定された最大の測定されたコンダクタンス値で割ることで算定することも可能である。いくつかの実施形態において、測定されたコンダクタンスは最大のまたはモーダル（最頻値）コンダクタンスであってもよい。 The identification unit 34 has a known type (or type), and is created by the measurement control unit 32 using the relative conductance for the monomer of the single molecule 52 stored in the relative conductance table 36. The detected physical quantities obtained from the conductance time profiles can be compared, thereby identifying the type of target monomer of the single molecule 52. In some embodiments, the detected physical quantity is the conductance for each measurement point of the time profile of the conductance prepared by the measurement control unit 32. As used herein, relative conductance is the conductance of each monomer of a single molecule obtained by measuring a monomer of a single molecule 52 of a known type. Relative conductance is calculated by dividing the measured conductance associated with a monomer of single molecule 52 by the maximum measured conductance value measured for all monomers of single molecule 52. Is also possible. In some embodiments, the measured conductance may be a maximum or a modal conductance.
いくつかの実施形態において、識別されるべき少なくとも１つの単一分子５２は、溶媒に溶解することができる。溶媒は、特に限定されない。超純水が使用されている超純水は、例えば、ＥＭＤミリポア社（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）Ｉｎｔｅｇｒａｌ３３／５／１０１５（カタログ番号））によって製造されたＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）Ｉｎｔｅｇｒａｌ３（装置名）を用いて製造することができる。溶液中の単一分子５２の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．０１〜１．０μＭ、または０．５〜５．０μＭ、または２〜２０μＭ、または１０〜１００μＭであってもよい。 In some embodiments, at least one single molecule 52 to be identified can be dissolved in a solvent. The solvent is not particularly limited. Ultrapure water in which ultrapure water is used is, for example, Milli-Q (registered trademark) Integral3 (device) manufactured by EMD Millipore (Milli-Q (registered trademark) Integral 33/5/1015 (catalog number)). ). The concentration of the single molecule 52 in the solution is not particularly limited, but may be, for example, 0.01 to 1.0 μM, or 0.5 to 5.0 μM, or 2 to 20 μM, or 10 to 100 μM.
そして、ナノギャップ電極対１２は、試料に浸漬され、測定電源装置１８は、ナノギャップ電極対１２に電圧を加えるために使用されてもよいし、電気泳動電極対２０に電圧を加えるために使用することができる。制御部を構成するコンピュータのＣＰＵは、電気泳動電源装置２２を読み出し、ＲＯＭまたは他の不揮発性記憶装置に記憶された生体分子配列決定プログラムを実行することができる。生体分子配列決定装置１０は図５に示されるような生体分子配列決定処理を実行させてもよい。 Then, the nanogap electrode pair 12 is immersed in the sample, and the measurement power supply 18 may be used to apply a voltage to the nanogap electrode pair 12 or may be used to apply a voltage to the electrophoresis electrode pair 20. can do. The CPU of the computer constituting the control unit can read out the electrophoresis power supply device 22 and execute the biomolecule sequence determination program stored in the ROM or another nonvolatile storage device. The biomolecule sequencing apparatus 10 may execute a biomolecule sequencing process as shown in FIG.
ステップＳ１０において、電流計２４は、単一分子５２がナノギャップ電極対１２の電極間を通過するとき生成されるトンネル電流を測定するように、測定制御部３２は、電流計２４を制御してもよい。 In step S10, the measurement controller 32 controls the ammeter 24 so that the ammeter 24 measures a tunnel current generated when the single molecule 52 passes between the electrodes of the nanogap electrode pair 12. Is also good.
ステップＳ１２において、測定制御部３２は、測定トンネル電流の電流値を求め、各測定点について、コンダクタンスを計算し、コンダクタンスの時間プロファイルを作成する。 In step S12, the measurement control unit 32 obtains the current value of the measured tunnel current, calculates the conductance for each measurement point, and creates a time profile of the conductance.
ステップＳ１４において、識別部３４は、相対コンダクタンステーブル３６から標的単一分子５２の異なる単量体の相対コンダクタンスを得る。 In step S14, the identification unit 34 obtains the relative conductance of different monomers of the target single molecule 52 from the relative conductance table 36.
ステップＳ１６において、識別部３４は、上記ステップＳ１４で得られた相対コンダクタンスと、上記ステップＳ１２で作成されたコンダクタンスの時間プロファイルと、を比較し、各信号が示す単量体の種類を識別する。ステップＳ１８において、識別部３４は、識別結果を出力することができる。単一分子の単量体識別処理は終了してもよい。 In step S16, the identification unit 34 compares the relative conductance obtained in step S14 with the time profile of the conductance created in step S12, and identifies the type of monomer indicated by each signal. In step S18, the identification unit 34 can output an identification result. The single molecule monomer identification process may be terminated.
以上説明したように、本明細書に記載されるように、生体分子配列決定装置のいくつかの実施形態において、電気泳動電極対２０は、ナノチャネル５６と、ナノチャネル５６を通してナノギャップ電極対１２の方向に試料５０を移動させるための流路４６Ａと、ナノギャップ電極対１２の一つまたは複数を含んでいてもよいナノチャネル５６への入口を通る方向に試料５０を流すための流路４６Ｂとの近傍に配置されてもよい。これにより、ナノギャップ電極対１２の電極間を通過するトンネル電流の測定に基づいた高い信号頻度が可能となる。図６は、電気泳動電極対２０は、従来の方法では提供されないデバイスが検出した信号波形を示しており、従って、ブラウン運動を利用しただけであり、図７は、本発明のいくつかの実施形態において生体分子配列決定装置１０の電気泳動電極対２０装置で検出された信号波形を示す図である。図６及び図７は、コンダクタンスと時間との両方において同じスケールで示されている。図からわかるように、図７には、より長い時間（パルス）でのコンダクタンスの増加が示されている。増加したコンダクタンスは、ナノ電極対間ギャップ中のＤＮＡの存在と関連している。図６および図７に示すように、いくつかの実施形態では生体分子配列決定装置１０は、従来の方法と比較して、高い信号頻度を示すことが理解される。 As described above, as described herein, in some embodiments of the biomolecule sequencing device, the electrophoresis electrode pair 20 comprises a nanochannel 56 and a nanogap electrode pair 12 through the nanochannel 56. And a flow path 46B for flowing the sample 50 in a direction passing through an inlet to a nanochannel 56 which may include one or more of the nanogap electrode pairs 12. May be arranged in the vicinity. This enables a high signal frequency based on the measurement of the tunnel current passing between the electrodes of the nanogap electrode pair 12. FIG. 6 shows a signal waveform detected by a device that is not provided in a conventional manner, and thus only utilizes Brownian motion, and FIG. 7 shows some implementations of the present invention. FIG. 4 is a diagram showing a signal waveform detected by the electrophoresis electrode pair 20 device of the biomolecule sequencing device 10 in the embodiment. Figures 6 and 7 are shown on the same scale in both conductance and time. As can be seen, FIG. 7 shows the increase in conductance over a longer time (pulse). Increased conductance is associated with the presence of DNA in the gap between the nanoelectrode pairs. As shown in FIGS. 6 and 7, it is understood that in some embodiments, the biomolecule sequencing device 10 exhibits a higher signal frequency as compared to conventional methods.
図８は電気泳動電極対２０に印加される電圧と１秒当たりの検出信号の数（信号頻度）の関係を測定した結果を示すグラフである。図８から分かるように、この例示的な構成において、電気泳動電極対２０に印加される電圧が約０．７Ｖに増加するまで、信号頻度は、電気泳動電圧の増加に伴って増加することが理解される。 FIG. 8 is a graph showing the results of measuring the relationship between the voltage applied to the electrophoresis electrode pair 20 and the number of detection signals per second (signal frequency). As can be seen in FIG. 8, in this exemplary configuration, the signal frequency may increase with increasing electrophoresis voltage until the voltage applied to the electrophoresis electrode pair 20 increases to about 0.7V. Understood.
図９は、複数の異なる種類の単一分子に対する、そこに印加された電圧電気泳動電極対２０が設けられている場合と電気泳動電極対２０は設けられていない場合における、複数の異なるフラグメント読み取り長さ（リード長）のフラグメントの数の測定結果を示す。図９から分かるように、そこに印加された電圧電気泳動電極対２０が設けられている場合のリードの数は、電気泳動電極対２０を設けない場合と比し多い。 FIG. 9 shows a plurality of different fragment readings for a plurality of different types of single molecules, when the voltage electrophoresis electrode pair 20 applied thereto is provided and when the electrophoresis electrode pair 20 is not provided. The measurement results of the number of fragments having a length (read length) are shown. As can be seen from FIG. 9, the number of leads when the voltage electrophoresis electrode pair 20 applied is provided is larger than that when the electrophoresis electrode pair 20 is not provided.
図１０は、電気泳動電極対２０が設けられていない場合（ＮＥ）と電気泳動電極対２０が電圧が印加された状態で設けられている場合（Ｎ）における、異なるリード長のリードの数を測定した結果を示す。図１０から見てとれるように、電気泳動電極対２０はそこに印加された電圧が提供されるときのリードの数は、電気泳動電極対は１．０ｍｓ／ｂａｓｅ以下の範囲で供給されないシステム（ＮＥ）に対して相対的に大きいことが分かる。 FIG. 10 shows the number of leads having different lead lengths when the electrophoresis electrode pair 20 is not provided (NE) and when the electrophoresis electrode pair 20 is provided with a voltage applied (N). The result of the measurement is shown. As can be seen from FIG. 10, the electrophoresis electrode pair 20 is provided with a voltage applied thereto, and the number of leads is such that the electrophoresis electrode pair is not supplied in a range of 1.0 ms / base or less. NE) is relatively large with respect to NE).
以下の表１は、単一分子に対するリードの平均数および最大数、信号頻度、および試料の必要量を測定した結果を示している。試料５０の濃度は１０−７Ｍ（モル）である場合に、信号の頻度が測定される。 Table 1 below shows the results of measuring the average and maximum number of reads for a single molecule, signal frequency, and required amount of sample. When the concentration of the sample 50 is 10-7 M (mole), the frequency of the signal is measured.
表１に示すように、本発明は、従来技術と比較して、単一分子に対するリードの平均および最大数、信号頻度、および必要試料の少量性すべてにおいて優れている。 As shown in Table 1, the present invention is superior to the prior art in all of the average and maximum number of reads for a single molecule, signal frequency, and smallness of required sample.
以上説明したように、いくつかの実施形態では、生体分子配列決定装置は、電気泳動電極対２０が、ナノチャネル５６内へその中に含まれるナノギャップ電極対１２に向けて試料５０を流す流路４６Ａと、ナノギャップ電極対１２の方向へナノチャネル５６から離れる方向に試料５０を流す流路４６Ｂとの両方の近傍に配置されるように構成されてもよい。そうすると、単一分子５２に印加される電界の増加を向上させることができる。これにより、ブラウン運動の場合に比して、１つまたは複数のナノ電極対に対する単一分子の通過速度をより安定化させることができる。これにより、単一分子の長いリードと識別を、高精度かつ高スループットで行うことが可能になる。 As described above, in some embodiments, the biomolecule sequencing device may include a method in which the electrophoresis electrode pair 20 flows the sample 50 into the nanochannel 56 toward the nanogap electrode pair 12 contained therein. It may be configured to be disposed near both the channel 46A and the channel 46B for flowing the sample 50 in the direction away from the nanochannel 56 in the direction of the nanogap electrode pair 12. Then, the increase in the electric field applied to the single molecule 52 can be improved. As a result, the passing speed of a single molecule to one or a plurality of nanoelectrode pairs can be further stabilized as compared with the case of Brownian motion. This makes it possible to perform long read and identification of a single molecule with high accuracy and high throughput.
いくつかの実施形態において、ナノギャップ電極対１２と並列に配置されている電気泳動電極対２０の構成について説明する。図１１に示すように、電気泳動電極対２０は電極がフローディレクタ４２の上にまたは直ぐ隣接して配置されてもよい。電気泳動電極対２０は、試料５０の導入の方向に沿って、電極対１２を含んでいてもよいナノチャネル５６の近くまで延在していてもよい。電気泳動電極対２０の電極は、それぞれナノチャネル５６のすぐ上およびすぐ下に配置されてもよい。これにより、単一分子５２に印加される電界のさらなる増加と、高精度かつ高スループットでの単一分子の単量体の識別が向上する。 In some embodiments, a configuration of the electrophoresis electrode pair 20 arranged in parallel with the nanogap electrode pair 12 will be described. As shown in FIG. 11, the electrophoresis electrode pair 20 may have the electrodes disposed on or immediately adjacent to the flow director 42. The electrophoresis electrode pair 20 may extend along the direction of introduction of the sample 50 to near the nanochannel 56, which may include the electrode pair 12. The electrodes of the electrophoresis electrode pair 20 may be located just above and just below the nanochannel 56, respectively. This further improves the electric field applied to the single molecule 52 and improves the accuracy of single molecule monomer identification with high accuracy and high throughput.
次に、本発明の追加の実施形態は、複数の異なるナノギャップ間隔を利用することができる方法を説明する。図１の生体分子配列決定装置１０のそれらに対応するまたは同様の構成要素または部品には、同一の参照符号を付して、説明を省略する。 Next, additional embodiments of the present invention describe how a plurality of different nanogap spacings can be utilized. Corresponding or similar components or parts of the biomolecule sequencing apparatus 10 of FIG. 1 are denoted by the same reference numerals, and description thereof will be omitted.
図１２に示すように、いくつかの実施形態によれば生体分子配列決定装置２１０は、ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃ、測定のための１つまたは複数の測定電源装置１８、１つ以上の電気泳動電極対２０、電気泳動のための１つ以上の電気泳動電源装置２２、電流計２４、及び１つ以上のシステム制御部２２６を備えている。 As shown in FIG. 12, according to some embodiments, the biomolecule sequencing device 210 includes a nanogap electrode pair 12A, 12B and 12C, one or more measurement power supplies 18 for measurement, one or more. , An electrophoresis electrode pair 20, one or more electrophoresis power supply devices 22 for electrophoresis, an ammeter 24, and one or more system control units 226.
ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの構成は、図１に関して説明したようにナノギャップ電極対１２と同様とすることができる。各ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの電極は、電極対の間の中心線が同一の軸上に位置合わせされるように位置合わせされてもよい。ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃとの電極間空間によって単一分子５２が通過する単一パスが部分的に画定されてもよい。ナノギャップ電極対１２Ａの電極間距離は、ｄ１であってもよく、ナノギャップ電極対１２Ｂ間距離はｄ２であり、ナノギャップ電極１２Ｃとの電極間距離は、ｄ３と互いに異なっていてもよい。図１２に示す例では、その関係はｄ１＞ｄ２＞ｄ３である。これらの距離は、ｄ１＝１．０ｎｍ、ｄ２＝０．７ｎｍ、ｄ３＝０．５ｎｍとすることができるが、応用に応じて必要な任意の距離であってもよい。例えば、アミノ酸を測定することが望まれる場合には、１つの電極間距離は、０．２５ｎｍであってもよい。一方、別の電極間距離は、１．０ｎｍより大きくてもよく、それぞれが異なるアミノ酸の側鎖の分子径よりも２０％未満であってもよい。いくつかの実施形態において、電極間の距離のいくつかは、同じ又は実質的に同じであってもよい。 The configuration of the nanogap electrode pair 12A, 12B, 12C can be similar to the nanogap electrode pair 12 as described with reference to FIG. The electrodes of each nanogap electrode pair 12A, 12B, 12C may be aligned such that the centerline between the electrode pairs is aligned on the same axis. A single path through which the single molecule 52 passes may be partially defined by the interelectrode space between the nanogap electrode pairs 12A, 12B, 12C. The distance between the nanogap electrode pair 12A may be d1, the distance between the nanogap electrode pair 12B is d2, and the distance between the nanogap electrode 12C and the nanogap electrode 12C may be different from each other. In the example shown in FIG. 12, the relationship is d1> d2> d3. These distances can be d1 = 1.0 nm, d2 = 0.7 nm, and d3 = 0.5 nm, but may be any necessary distances depending on the application. For example, if it is desired to measure amino acids, the distance between one electrode may be 0.25 nm. On the other hand, another inter-electrode distance may be greater than 1.0 nm, and each may be less than 20% less than the side chain molecular diameter of a different amino acid. In some embodiments, some of the distances between the electrodes may be the same or substantially the same.
図１３に示すように、システム制御部２２６は、制御部３０と、測定制御部２３２と、識別部２３４とを含むシステムとして表すことができる。 As shown in FIG. 13, the system control unit 226 can be represented as a system including a control unit 30, a measurement control unit 232, and an identification unit 234.
測定制御部２３２は、電流計２４に、ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃとの間に生じるトンネル電流を測定させるように制御している。測定制御部２３２は、電流計２４により測定された各電極間距離トンネル電流の現在値を取得し、コンダクタンスを計算し、それぞれの電極間距離のコンダクタンスの時間プロファイルを作成することができる。 The measurement control unit 232 controls the ammeter 24 to measure a tunnel current generated between the nanogap electrode pair 12A, 12B, and 12C. The measurement control unit 232 can acquire the current value of each inter-electrode distance tunnel current measured by the ammeter 24, calculate the conductance, and create a time profile of the conductance of each inter-electrode distance.
識別部２３４は、種類が既知の単一分子５２の単量体に関して、相対コンダクタンステーブル２３６に記憶された相対コンダクタンスと、測定制御部３２によって決定されたそれぞれの電極間距離のコンダクタンスの時間プロファイルから得られた検出物理量を比較する。これにより、標的単一分子５２の単量体の種類を識別することができる。 The identification unit 234 calculates the relative conductance stored in the relative conductance table 236 and the time profile of the conductance of the distance between the electrodes determined by the measurement control unit 32 for the monomer of the single molecule 52 whose type is known. The obtained detected physical quantities are compared. Thereby, the type of the monomer of the target single molecule 52 can be identified.
いくつかの実施形態では、上記のように識別された少なくとも１つの単一分子５２は、溶媒に溶解していてもよい。ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃは、試料中に浸漬されてもよい。測定装置１８は、ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃのそれぞれの両端に電圧を印加するために使用されている。電気泳動電源装置２２は、電気泳動電極対２０Ａ，２０Ｂに電圧を加えるために使用することができる。システム制御装置２２６を構成するコンピュータのＣＰＵが、ＲＯＭまたは他の不揮発性メモリに格納されていてもよい生体分子配列決定プログラムを実行する。これは、この生体分子配列決定装置２１０に、図１４に示すように生体分子シーケンス処理を実行させてもよい。 In some embodiments, at least one single molecule 52 identified as above may be dissolved in a solvent. The nanogap electrode pairs 12A, 12B, 12C may be immersed in the sample. The measurement device 18 is used to apply a voltage to both ends of each of the nanogap electrode pairs 12A, 12B, and 12C. The electrophoresis power supply 22 can be used to apply a voltage to the electrophoresis electrode pair 20A, 20B. A CPU of a computer constituting the system control device 226 executes a biomolecule sequence determination program which may be stored in a ROM or another nonvolatile memory. This may cause the biomolecule sequence determination device 210 to execute biomolecule sequence processing as shown in FIG.
ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃは、異なるギャップサイズを有することができる。ギャップサイズは生体分子の単量体（又はサブユニット）の異なるタイプの識別を可能にするように選択することができる。例えば、ナノギャップ電極対１２Ａは、１つの型のヌクレオチド（例えば、アデノシン）の識別を可能にするように選択される幅を有することができ、ナノギャップ電極対１２Ｂは別の型のヌクレオチド（例えば、チミン）の識別を可能にするように選択される幅を有することができる。 The nanogap electrode pairs 12A, 12B and 12C can have different gap sizes. The gap size can be selected to allow for different types of monomers (or subunits) of the biomolecule. For example, nanogap electrode pair 12A can have a width that is selected to allow discrimination of one type of nucleotide (eg, adenosine), and nanogap electrode pair 12B can be a different type of nucleotide (eg, adenosine). , Thymine) can be selected to allow identification.
ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃは、ナノチャネル内に配置することができる。ナノチャネルは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ナノギャップ電極対を含むことができる。少なくとも幾つか又はすべてのナノギャップ電極対は、異なる幅を有することができる。 The nanogap electrode pairs 12A, 12B, 12C can be located in a nanochannel. Nanochannels can include at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 nanogap electrode pairs. At least some or all of the nanogap electrode pairs can have different widths.
ステップＳ２０において、測定制御部２３２は、単一分子５２がナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの電極との間に形成されたナノチャネル５６を通過する際に発生するトンネル電流を測定する電流計２４を制御する。 In step S20, the measurement controller 232 measures the tunnel current generated when the single molecule 52 passes through the nanochannel 56 formed between the nanogap electrode pair 12A, 12B, and 12C. 24 is controlled.
ステップＳ２２において、測定制御部２３２は、測定されたトンネル電流の電流値を取得することで、測定点毎にコンダクタンスを計算し、それぞれの電極間距離のコンダクタンスの時間プロファイルを作成することができる。 In step S22, the measurement control unit 232 acquires the current value of the measured tunnel current, calculates the conductance for each measurement point, and can create a time profile of the conductance of each inter-electrode distance.
ステップＳ２４では、識別部２３４は、変数「ｉ」を１にセットする。 In step S24, the identification unit 234 sets the variable “i” to 1.
ステップＳ２６において、識別部２３４は、電極間距離ｄに対応する単一分子５２の単量体の相対コンダクタンスを、すなわち、電極間距離ｄｊで識別することができる標的単一分子５２単量体の相対コンダクタンスを得る。 In step S26, the identification unit 234 determines the relative conductance of the monomer of the single molecule 52 corresponding to the inter-electrode distance d, that is, the target single molecule 52 monomer that can be identified by the inter-electrode distance dj. Get relative conductance.
ステップＳ２８では、識別部２３４は、ステップＳ２６で得られた相対値と、上記ステップＳ２２で調製した電極間距離のコンダクタンスの時間プロファイルとを比較し、各信号が示す単一分子の単量体の種類を識別する。 In step S28, the identification unit 234 compares the relative value obtained in step S26 with the time profile of the conductance of the inter-electrode distance prepared in step S22, and determines the single molecule monomer represented by each signal. Identify the type.
ステップＳ３０において、識別部２３４が以上の処理を全ての電極間距離ｄｊについて完了したか否かを判定する。未処理電極間距離ｄｊである場合、処理は、ステップＳ３２に進み、「ｉ」を１だけインクリメントして、ステップＳ２６に戻る。すべての電極間距離ｄｉについて完了した場合、処理は、ステップＳ３４に進み、識別部２３４は、識別結果を出力することができ、生体分子配列決定処理を終了する。 In step S30, the identification unit 234 determines whether the above processing has been completed for all the inter-electrode distances dj. If it is the unprocessed electrode distance dj, the process proceeds to step S32, increments “i” by 1, and returns to step S26. If the processing has been completed for all the inter-electrode distances di, the process proceeds to step S34, where the identification unit 234 can output the identification result, and ends the biomolecule sequence determination process.
上述したように、いくつかの実施形態においては、コンダクタンスは電極間距離が異なるナノギャップ電極対の間に発生する電流（例えば、トンネル電流）を利用して得られるものを使用することができる、単一ナノギャップ電極対または複数ナノギャップ電極対の使用によって、同じまたは実質的に類似のナノギャップ間隔という効果に加えて、より正確な識別が可能である電極間の距離が異なるナノギャップ電極対の複数だけでなく、単一ナノギャップ電極対の電極間の距離を変化させることができる構造が可能である。 As described above, in some embodiments, the conductance can be obtained by utilizing a current (for example, a tunnel current) generated between a pair of nanogap electrodes having different electrode-to-electrode distances. The use of a single nanogap electrode pair or multiple nanogap electrode pairs, in addition to the effect of the same or substantially similar nanogap spacing, nanogap electrode pairs with different distances between the electrodes that allow more accurate discrimination In addition to the above, a structure capable of changing the distance between the electrodes of a single nanogap electrode pair is possible.
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、電極間距離が異なる複数のナノギャップ電極対について説明されてきた。しかし、単一のナノギャップ電極対の電極間の距離を変化させることが可能である。電極間の距離は、力点、支点と、作用点の幾何学的配置をてこの原理を用いて調整することで、変化させることができる。具体的には、電極間の距離は、圧電素子を用いたナノギャップ電極対の一部を押し上げることにより、作用点として機能する電極の端部を移動させることによって変更することができる。電極間の距離は、圧電素子によって押し上げた距離と電極間距離との対応関係に基づいて所望に応じてセットすることができる。 In some embodiments described herein, multiple nanogap electrode pairs with different interelectrode distances have been described. However, it is possible to vary the distance between the electrodes of a single nanogap electrode pair. The distance between the electrodes can be changed by adjusting the geometrical arrangement of the force point, the fulcrum and the point of action using this principle. Specifically, the distance between the electrodes can be changed by pushing up a part of the nanogap electrode pair using the piezoelectric element, thereby moving the end of the electrode functioning as an action point. The distance between the electrodes can be set as desired based on the correspondence between the distance pushed up by the piezoelectric element and the distance between the electrodes.
生体分子配列決定装置は、電気泳動電極対２０が、ナノチャネル５６内へナノギャップ電極対１２に向けて試料５０を流す流路４６Ａと、ナノギャップ電極対１２の方向へナノチャネル５６から離れる方向に試料５０を流す流路４６Ｂとの両方の近傍に配置されるように構成されてもよく、単一分子５２がみる電界の増加を向上させることが可能である。これは、高精度かつ高スループットでの単一分子識別を可能にする。いくつかの実施形態では、生体分子配列決定装置は、プロテオミクスシーケンサとして使用することも可能であり、例えば、高速、高感度、および低コストでのアレルゲン試験、疾患の診断等にも適用可能であり、公衆衛生、安全性、セキュリティ、および環境の分野で使用することができる。 In the biomolecule sequencing apparatus, the electrophoresis electrode pair 20 includes a flow path 46A in which the sample 50 flows into the nanochannel 56 toward the nanogap electrode pair 12, and a direction away from the nanochannel 56 in the direction of the nanogap electrode pair 12. May be arranged near both of the flow path 46 </ b> B through which the sample 50 flows, and it is possible to improve the increase of the electric field seen by the single molecule 52. This allows for single molecule identification with high accuracy and high throughput. In some embodiments, the biomolecule sequencer can also be used as a proteomics sequencer, e.g., for high-speed, high-sensitivity, and low-cost allergen testing, disease diagnosis, and the like. , Can be used in the fields of public health, safety, security, and environment.
本開示は、ナノギャップ電極の「対」に関してなされているが、本開示の装置およびシステムは、任意の数のナノギャップ電極を含むことができることが理解されよう。例えば、装置は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の電極を含む組で、ナノギャップ電極の組を含むことができる。
コンピュータ制御システムAlthough the present disclosure has been made with respect to a “pair” of nanogap electrodes, it will be appreciated that the devices and systems of the present disclosure can include any number of nanogap electrodes. For example, the device can include a set of nanogap electrodes, with a set including at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 electrodes.
Computer control system
本開示は、本開示の方法を実施するようにプログラムされたコンピュータ制御システムを提供する。図１５は、タンパク質のような生体分子を配列決定するように、プログラムされまたはさもなければ順序付けるように構成されている、コンピュータシステム１５０１を示している。コンピュータシステム１５０１は、中央処理装置（ＣＰＵはまた、本明細書において「プロセッサ」、および「コンピュータプロセッサ」）１５０５であり、シングルコアまたはマルチコアのプロセッサ、または、並列処理のための複数のプロセッサを含む。コンピュータシステム１５０１は、メモリあるいはメモリの場所１５１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み出し専用メモリ、フラッシュメモリ）と、電子記憶部１５１５（例えばハードディスク）と、１つまたは複数の他のシステムと通信するための通信インターフェース１５２０（例えば、ネットワークアダプタ）と、キャッシュ、メモリ、データ記憶装置及び／又は電子表示アダプタなどを含む周辺装置１５２５と、を含む。コンピュータシステム１５０１は、本明細書の他の箇所で説明された制御部２６、２２６とすることができる。メモリ１５１０、記憶部１５１５、インターフェース１５２０及び周辺装置１５２５は、マザーボードなどの通信バス（線）を介して中央処理装置１５０５に接続されている。記憶部１５１５は、データを保存するデータ保存部（データリポジトリ）であってもよい。コンピュータシステム１５０１は、通信インターフェース１５２０を用いてコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）１５３０に動作可能に結合することができる。ネットワーク１５３０は、インターネット、インターネット、エクストラネット、又はインターネットと通信するイントラネット及び／又はエクストラネットがある。ネットワーク１５３０は、電気通信網および／またはデータネットワークである。ネットワーク１５３０は、１つまたは複数のコンピュータサーバ、分散コンピューティングを可能にすることができ、クラウドコンピューティングなどを含むことができる。ネットワーク１５３０と、コンピュータシステム１５０１を用いて、いくつかの場合では、コンピュータシステム１５０１に結合されたデバイスがクライアントまたはサーバとして動作することを可能にするピア・ツー・ピア・ネットワークを実現することができる。 The present disclosure provides a computer control system programmed to perform the methods of the present disclosure. FIG. 15 shows a computer system 1501 that is programmed or otherwise configured to sequence biomolecules, such as proteins. Computer system 1501 is a central processing unit (CPU is also referred to herein as a “processor” and “computer processor”) 1505 and includes a single-core or multi-core processor or multiple processors for parallel processing. . Computer system 1501 includes a memory or memory location 1510 (eg, a random access memory, a read-only memory, a flash memory), an electronic storage 1515 (eg, a hard disk), and one or more other systems for communicating with the system. It includes a communication interface 1520 (eg, a network adapter) and a peripheral device 1525 including a cache, memory, data storage, and / or an electronic display adapter, and the like. The computer system 1501 can be the control units 26, 226 described elsewhere in this specification. The memory 1510, the storage unit 1515, the interface 1520, and the peripheral device 1525 are connected to the central processing unit 1505 via a communication bus (line) such as a motherboard. The storage unit 1515 may be a data storage unit (data repository) that stores data. Computer system 1501 can be operatively coupled to a computer network (“network”) 1530 using communication interface 1520. Network 1530 includes the Internet, the Internet, an extranet, or an intranet and / or extranet that communicates with the Internet. Network 1530 is a telecommunications network and / or a data network. Network 1530 can include one or more computer servers, distributed computing, cloud computing, and the like. With network 1530 and computer system 1501, in some cases, a peer-to-peer network can be implemented that allows devices coupled to computer system 1501 to operate as clients or servers. .
中央処理装置１５０５は、プログラムまたはソフトウェアで具体化した機械可読命令のシーケンスを実行することができる。命令は、メモリ１５１０のようなメモリ位置に記憶される。命令がＣＰＵ１５０５に向けられると、続いて、本開示の方法を実施するＣＰＵ１５０５を構成するプログラムで、または、ＣＰＵ１５０５によって実行される。動作の例は、フェッチ、デコード、実行、およびライトバックを含むことができる。 Central processing unit 1505 can execute a sequence of machine-readable instructions embodied in a program or software. Instructions are stored in a memory location such as memory 1510. When the instructions are directed to CPU 1505, it is subsequently executed by, or by, a program comprising CPU 1505 that implements the methods of the present disclosure. Examples of operations may include fetch, decode, execute, and write back.
ＣＰＵ１５０５は、集積回路のような回路の一部である。システム１５０１の他の１つ以上の構成要素は、回路に含まれることが可能である。幾つかのケースでは、回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。 The CPU 1505 is a part of a circuit such as an integrated circuit. One or more other components of the system 1501 can be included in the circuit. In some cases, the circuit is an application specific integrated circuit (ASIC).
記憶部１５１５は、ドライバ、ライブラリ、およびプログラムなどのファイルを記憶する。記憶部１５１５は、ユーザデータ、例えば、ユーザプリファランスおよびユーザプログラムが格納されている。コンピュータシステム１５０１は、インターネットやイントラネットを介してコンピュータシステム１５０１と通信する遠隔サーバに配置されている、コンピュータシステム１５０１の外部にある１つまたは複数の追加のデータ記憶装置を含むことができる。 The storage unit 1515 stores files such as drivers, libraries, and programs. The storage unit 1515 stores user data, for example, user preferences and user programs. Computer system 1501 can include one or more additional data storage devices external to computer system 1501, located on a remote server that communicates with computer system 1501 via the Internet or an intranet.
コンピュータシステム１５０１は、ネットワーク１５３０を介して１つまたは複数の遠隔コンピュータシステムと通信することができる。例えばコンピュータシステム１５０１は、ユーザのリモートコンピュータシステムと通信することができる。ユーザは、ネットワーク１５３０を介してコンピュータシステム１５０１にアクセスすることができる。 Computer system 1501 can communicate with one or more remote computer systems via network 1530. For example, computer system 1501 can communicate with a user's remote computer system. A user can access the computer system 1501 via the network 1530.
本明細書に記載の方法は、コンピュータシステム１５０１の記憶場所に記憶され、機械（例えば、コンピュータのプロセッサ）実行可能なコードにより実現され、例えば、メモリ１５１０や記憶部１５１５に記憶することができる。使用中、コードは、プロセッサ１５０５によって実行することが可能である。いくつかの場合には、コードは、記憶部１５１５から検索し、プロセッサ１５０５による素早いアクセスのために、メモリ１５１０に記憶することができるマシン実行可能または機械可読コードはソフトウェアの形態で提供することができる。いくつかの状況では、電子記憶部１５１５が排除されることができ、機械実行可能な命令は、メモリ１５１０に格納されている。 The methods described herein may be stored in a storage location on computer system 1501 and implemented by machine (eg, a processor of a computer) executable code, for example, stored in memory 1510 or storage 1515. In use, the code may be executed by the processor 1505. In some cases, the code may be retrieved from storage 1515 and machine executable or machine readable code that may be stored in memory 1510 for quick access by processor 1505 may be provided in software form. it can. In some situations, electronic storage 1515 may be eliminated and machine-executable instructions are stored in memory 1510.
コードは、コードを実行するように適合されたプロセッサを有する機械に使用するため、予めコンパイルされて構成する、またはランタイム時にコンパイルすることができる。コードは、予めコンパイルされたまたはコンパイルされた形態で実行することを可能にするように選択することができるプログラミング言語で供給することができる。 The code can be pre-compiled and configured, or compiled at run-time, for use on a machine having a processor adapted to execute the code. The code may be provided in a programming language that may be selected to allow execution in pre-compiled or compiled form.
本明細書で提供されるシステム及び方法の態様では、コンピュータシステム１５０１は、プログラミングにおいて具体化することができる技術の種々の態様、典型的に機械（プロセッサ）実行可能なコード及び／又は機械可読媒体の種類において実施される関連データの形態の「製品」または「製造品」であると考えることができる。マシン実行可能コードは、電子的記憶部、例えばメモリ（例えば、リードオンリーメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスクに記憶することができる。「記憶装置」型媒体は、コンピュータのメモリのすべてが、プロセッサ等、又はそれらに関連するモジュール、各種半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどのような、ソフトウェアプログラミングのために任意の時点で非一時的な記憶を提供することができる。ソフトウェアのすべて又は一部は、インターネット又は他の各種通信ネットワークを介し通信されてもよい。このような通信は、例えば、管理サーバまたはホスト・コンピュータ、アプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームから別のコンピュータまたはプロセッサへのソフトウェアのローディングを可能にすることができる。ソフトウェア要素を担う別のタイプの媒体は、有線および光地上線ネットワークを介しておよび種々のエアリンクを介してローカルデバイス間で物理インターフェースにわたって使用されるような、光、電気及び電磁波を含む。有線または無線リンク、光リンクなどの、このような波を搬送する物理要素はまた、ソフトウェアを有する媒体とみなされ得る。本明細書で使用されるとき、非一時的、有形「記憶」メディアに限定されない限り、コンピュータまたは機械「可読媒体」などの用語は、実行のためにプロセッサに命令を与えることに関与する任意の媒体を指す。 In the system and method aspects provided herein, computer system 1501 implements various aspects of techniques that can be embodied in programming, typically machine (processor) executable code and / or machine-readable media. May be considered a "product" or a "manufactured product" in the form of related data implemented in the type. The machine-executable code can be stored in an electronic storage, for example, a memory (eg, a read-only memory, a random access memory, a flash memory) or a hard disk. A “storage device” type medium is one in which all of the computer's memory is non-transitory at any time for software programming, such as a processor or related modules, various semiconductor memories, tape drives, disk drives, etc. Can provide a memorable memory. All or part of the software may be communicated over the Internet or various other communication networks. Such communications may, for example, allow for the loading of software from a management server or host computer, a computer platform of an application server, to another computer or processor. Another type of medium that carries the software components includes optical, electrical and electromagnetic waves, such as those used over physical interfaces between local devices over wired and optical landline networks and over various air links. Physical elements that carry such waves, such as wired or wireless links, optical links, etc., may also be considered as media with software. As used herein, unless limited to non-transitory, tangible, "storage" media, terms such as computer or machine "readable medium" refer to any term involved in providing instructions to a processor for execution. Refers to the medium.
従って、コンピュータ実行可能コード（即ち、コンピュータプログラム）のような機械（またはコンピュータ）可読媒体は、有形の記憶媒体、搬送波媒体または物理伝送媒体を含むがこれらに限定されない多くの形態をとることができる。非揮発性記憶媒体は、任意のコンピュータなどにおける記憶デバイスのいずれか（１つまたは複数の）であり、図に示すようなデータベースを実現するために使用することができる例えば、光ディスクまたは磁気ディスクを含む。不揮発性記憶媒体は、コンピュータプラットフォームのメインメモリなどの動的メモリが挙げられる。有形伝送媒体は、同軸ケーブル、銅線および光ファイバを含み、コンピュータシステム内のバスを構成するワイヤを含んでいる。搬送波伝送媒体は電気信号又は電磁信号、或いは無線周波数（ＲＦ）および赤外線（ＩＲ）データ通信などの音響波または光波の形態をとることができる。コンピュータ可読媒体の一般的形式は、例えばフロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、他の光学媒体、パンチカード、紙テープ、穴のパターンを有する任意の物理的媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、他のメモリチップもしくはカートリッジ、搬送波、データ又は命令は、そのような波を搬送するケーブルまたはリンク、またはコンピュータプログラミングコードおよび／またはデータを読み取ることができる任意の他の媒体を含んでいる。コンピュータ可読媒体のこれらの形態の多くは、実行のためにプロセッサに１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスを搬送することに関与してもよい。 Thus, a machine (or computer) readable medium, such as computer-executable code (ie, a computer program), may take many forms, including but not limited to, tangible storage media, carrier media, or physical transmission media. . The non-volatile storage medium is any storage device (s) in any computer or the like, for example, an optical disk or a magnetic disk that can be used to implement a database as shown in the figures. Including. Non-volatile storage media includes dynamic memory, such as the main memory of a computer platform. Tangible transmission media include coaxial cables, copper wire and fiber optics, including the wires that comprise a bus within a computer system. The carrier transmission medium may take the form of electrical or electromagnetic signals, or acoustic or light waves such as radio frequency (RF) and infrared (IR) data communications. Common forms of computer readable media include, for example, floppy disks, flexible disks, hard disks, magnetic tapes, other magnetic media, CD-ROMs, DVD-ROMs, DVD-ROMs, other optical media, punch cards, Paper tape, any physical medium with a pattern of holes, RAM, ROM, PROM, EPROM, FLASH-EPROM, other memory chips or cartridges, carrier waves, data or instructions, cables or links carrying such waves, Or any other medium that can read computer programming code and / or data. Many of these forms of computer readable media may be involved in carrying one or more sequences of one or more instructions to a processor for execution.
上述したように、いくつかの実施形態では、本発明の生体分子配列決定システムは、予めインストールされたプログラムを含むとして説明されているが、外部のメモリや外部の記録媒体に格納されたプログラムは、実行のために任意の時点でインターネットを介して読み出されるか、ダウンロードされる。このプログラムは、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納されて提供されてもよい。 As described above, in some embodiments, the biomolecule sequencing system of the present invention is described as including a program installed in advance, but a program stored in an external memory or an external recording medium is , Read or downloaded over the Internet at any time for execution. This program may be stored in a computer-readable recording medium and provided.
本発明の好ましい実施形態を本明細書に図示し説明してきたが、このような実施形態は例としてのみ提供されることは当業者には明らかである。本発明は、本明細書中に提供される特定の例によって限定されることを意図しない。本発明は、前述の明細書を参照して説明してきたが、本明細書の実施形態の説明および例示は、限定的な意味で解釈されるものでない。多数の変形、変更および置換が、本発明から逸脱することなく当業者に思いつくであろう。また、様々な条件および変数に依存する、本発明の全ての態様は、本明細書に記載される具体的描写、構成、または相対的割合の組に限定されないことが理解されるべきである。本明細書に記載する本発明の実施形態の種々の代替は、本発明を実施するのに使用できることが理解されるべきである。従って本発明はまた、任意のこのような代替、修正、変形、又は均等物を包含することを意図している。特許請求の範囲が発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲およびそれらの同等物の範囲内の方法及び構造がそれによって包含されることが意図される。 While preferred embodiments of the present invention have been illustrated and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. The present invention is not intended to be limited by the specific examples provided herein. Although the present invention has been described with reference to the foregoing specification, the description and examples of embodiments herein are not to be construed in a limiting sense. Numerous variations, changes, and substitutions will now occur to those skilled in the art without departing from the invention. It is also to be understood that all aspects of the invention, which are dependent on various conditions and variables, are not limited to the specific depictions, configurations, or sets of relative proportions described herein. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the invention described herein can be used to practice the invention. Accordingly, the invention is also intended to cover any such alternatives, modifications, variations, or equivalents. It is intended that the following claims define the scope of the invention and that methods and structures within the scope of these claims and their equivalents be covered thereby.
この出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる日本国の特許出願番号２０１４−０１１４３０、２０１４年１月２４日出願の優先権を主張する。 This application claims the priority of Japanese Patent Application No. 2014-01430, filed on January 24, 2014, which is incorporated herein by reference in its entirety.
本明細書において言及した全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の各刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されたかのように本明細書に参照により組み込まれる。 All publications, patents, and patent applications mentioned herein are hereby incorporated by reference as if each individual publication, patent, or patent application was specifically and individually indicated to be incorporated by reference. Incorporated by reference.
Claims (29)
前記ナノチャネルのナノギャップ電極の複数の組であって、前記ナノギャップ電極の複数の組のそれぞれが、前記試料に含まれる前記生体分子が前記ナノチャネルを通って前記ナノギャップ電極の複数の組の近傍を通過するときに、電流を検出することを可能にするように構成され、前記ナノギャップ電極の複数の組の少なくとも２つの組が、前記ナノチャネルの幅に沿って異なる電極間距離を有するナノギャップ電極の複数の組と、
前記生体分子が前記ナノチャネルを通って前記ナノチャネルの前記ナノギャップ電極の複数の組に近接して動くように電界を提供する電気泳動電極の組と、
前記ナノチャネルを通って前記試料の移動方向に沿って前記ナノギャップ電極の複数の組の方へ延在する絶縁体であるフローディレクタと、
を備え、
前記フローディレクタは、前記ナノチャネルと流体連通している第１の流路と第２の流路を生成するように構成され、
前記フローディレクタによって、前記試料の一部が前記第１の流路から前記ナノチャネルへ流され、前記試料の残りの部分が前記第１の流路から前記第２の流路へ流される、生体分子配列決定装置。 A nanochannel that allows a sample containing biomolecules to move through the nanochannel;
A plurality of sets of the nanogap electrodes of the nanochannel, wherein each of the plurality of sets of the nanogap electrodes includes a plurality of sets of the nanogap electrodes through which the biomolecules contained in the sample pass through the nanochannels. At least two sets of the plurality of sets of nanogap electrodes are configured to allow different inter-electrode distances along the width of the nanochannel when passing near the A plurality of sets of nanogap electrodes having
A set of electrophoretic electrodes that provide an electric field such that the biomolecules move through the nanochannels and in close proximity to the sets of nanogap electrodes of the nanochannels;
A flow director that is an insulator that extends through the nanochannels along the direction of movement of the sample toward the plurality of sets of nanogap electrodes;
Equipped with a,
The flow director is configured to create a first flow path and a second flow path in fluid communication with the nanochannel,
The flow director allows a portion of the sample to flow from the first channel to the nanochannel and a remaining portion of the sample to flow from the first channel to the second channel. Molecular sequencing equipment.
前記測定部と連通し、前記生体分子またはその一部を識別するように構成された識別部と、
をさらに備える、請求項１に記載の生体分子配列決定装置。 A measurement unit that communicates with each of the plurality of sets of the nanogap electrodes and is configured to detect the current generated when the biomolecule passes near the plurality of sets of the nanogap electrodes;
An identification unit that communicates with the measurement unit and is configured to identify the biomolecule or a part thereof;
The biomolecule sequencing device according to claim 1, further comprising:
前記ナノチャネルのナノギャップ電極の少なくとも１つの組であって、前記ナノギャップ電極の組が、前記試料に含まれる前記生体分子が前記ナノチャネルを通って前記ナノギャップ電極の組の近傍を通過するときに、電流を検出することを可能にするように構成され、前記ナノチャネルは、前記ナノギャップ電極の組の方へテーパ状となり、前記ナノギャップ電極の組は、前記生体分子の分子直径より小さいまたは等しい電極間距離を有するナノギャップ電極の少なくとも１つの組と、
前記ナノチャネルを通って、前記ナノチャネルの前記ナノギャップ電極の組に近接して前記生体分子を動かす電界を提供する電気泳動電極の組と、
前記ナノチャネルを通って前記試料の移動方向に沿って前記ナノギャップ電極の組の方へ延在する絶縁体であるフローディレクタと、
を備え、
前記フローディレクタは、前記ナノチャネルと流体連通している第１の流路と第２の流路を生成するように構成され、
前記フローディレクタによって、前記試料の一部が前記第１の流路から前記ナノチャネルへ流され、前記試料の残りの部分が前記第１の流路から前記第２の流路へ流される、生体分子配列決定装置。 A nanochannel that allows a sample containing biomolecules to move through the nanochannel;
At least one set of nanogap electrodes of the nanochannels, wherein the set of nanogap electrodes is such that the biomolecules contained in the sample pass through the nanochannels in the vicinity of the set of nanogap electrodes. Sometimes, the nanochannels are configured to allow current to be sensed, the nanochannels tapering toward the set of nanogap electrodes, and the set of nanogap electrodes is larger than the molecular diameter of the biomolecule. At least one set of nanogap electrodes having a small or equal inter-electrode distance;
A set of electrophoretic electrodes that provide an electric field that moves the biomolecule through the nanochannel and in proximity to the set of nanogap electrodes of the nanochannel;
A flow director that is an insulator extending through the nanochannels along the direction of movement of the sample toward the set of nanogap electrodes;
Equipped with a,
The flow director is configured to create a first flow path and a second flow path in fluid communication with the nanochannel,
The flow director allows a portion of the sample to flow from the first channel to the nanochannel and a remaining portion of the sample to flow from the first channel to the second channel. Molecular sequencing equipment.
前記ナノチャネルのナノギャップ電極の少なくとも１つの組であって、前記ナノギャップ電極の組が、前記試料に含まれる前記生体分子が前記ナノチャネルを通って前記ナノギャップ電極の組の近傍を通過するときに、電流を検出することを可能にするように構成されたナノギャップ電極の少なくとも１つの組と、
前記ナノチャネルを通って、前記ナノチャネルの前記ナノギャップ電極の組に近接して前記生体分子を動かす電界を提供する電気泳動電極の組と、
前記ナノチャネルのまたは近傍の１つまたは複数の柱であって、前記ナノギャップ電極の組による電流検出を使用し前記生体分子の個々のサブユニットの識別を可能にするために前記生体分子を直線化する１つまたは複数の柱と、
前記ナノチャネルを通って前記試料の移動方向に沿って前記ナノギャップ電極の組の方へ延在する絶縁体であるフローディレクタと、
を備え、
前記フローディレクタは、前記ナノチャネルと流体連通している第１の流路と第２の流路を生成するように構成され、
前記フローディレクタによって、前記試料の一部が前記第１の流路から前記ナノチャネルへ流され、前記試料の残りの部分が前記第１の流路から前記第２の流路へ流される、生体分子配列決定装置。 A nanochannel that allows a sample containing biomolecules to move through the nanochannel;
At least one set of nanogap electrodes of the nanochannels, wherein the set of nanogap electrodes is such that the biomolecules contained in the sample pass through the nanochannels in the vicinity of the set of nanogap electrodes. Sometimes, at least one set of nanogap electrodes configured to allow sensing of current;
A set of electrophoretic electrodes that provide an electric field that moves the biomolecule through the nanochannel and in proximity to the set of nanogap electrodes of the nanochannel;
One or more pillars at or near the nanochannel, wherein the biomolecules are straightened to allow identification of individual subunits of the biomolecules using current sensing with the set of nanogap electrodes. One or more pillars,
A flow director that is an insulator extending through the nanochannels along the direction of movement of the sample toward the set of nanogap electrodes;
Equipped with a,
The flow director is configured to create a first flow path and a second flow path in fluid communication with the nanochannel,
The flow director allows a portion of the sample to flow from the first channel to the nanochannel and a remaining portion of the sample to flow from the first channel to the second channel. Molecular sequencing equipment.
（ｂ） 前記ナノギャップ電極の複数の組で、前記生体分子が前記ナノチャネルを通って前記ナノギャップ電極の複数の組の近傍を通過するときに生成される電流を検出することと、
（ｃ） （ｂ）で検出した前記電流で、前記生体分子またはその一部を配列決定することと、
を含み、
前記生体分子配列決定装置は、前記ナノチャネルを通って前記試料の移動方向に沿って前記ナノギャップ電極の複数の組の方へ延在する絶縁体であるフローディレクタをさらに備え、
前記フローディレクタは、前記ナノチャネルと流体連通している第１の流路と第２の流路を生成するように構成され、
（ａ）は、前記フローディレクタによって、前記試料の一部を前記第１の流路から前記ナノチャネルへ流し、前記試料の残りの部分を前記第１の流路から前記第２の流路へ流すことを含む、生体分子配列決定方法。 (A) directing a biomolecule flowing to or through a nanochannel of a biomolecule sequencing device, the biomolecule sequencing device comprising: (i) a plurality of sets of nanogap electrodes of the nanochannel. Wherein each of the plurality of sets of nanogap electrodes detects a current when the biomolecules contained in the sample pass through the nanochannel and in the vicinity of the plurality of sets of nanogap electrodes. And wherein at least two sets of the plurality of sets of nanogap electrodes have different inter-electrode distances along the width of the nanochannel; and ii) electrophoresis that provides an electric field that moves the biomolecule through the nanochannel and in proximity to the plurality of sets of nanogap electrodes of the nanochannel. Orienting a biomolecule, including a set of electrodes;
(B) detecting, at the plurality of sets of nanogap electrodes, a current generated when the biomolecule passes through the nanochannel and near the plurality of sets of nanogap electrodes;
(C) sequencing the biomolecule or a part thereof with the current detected in (b);
Only including,
The biomolecule sequencing device further comprises a flow director, which is an insulator extending toward the plurality of sets of the nanogap electrodes along the movement direction of the sample through the nanochannel,
The flow director is configured to create a first flow path and a second flow path in fluid communication with the nanochannel,
(A) using the flow director to allow a part of the sample to flow from the first flow path to the nanochannel, and the remaining part of the sample to flow from the first flow path to the second flow path. A method for sequencing biomolecules , comprising flowing .
（ｂ） 前記ナノギャップ電極の組で、前記生体分子が前記ナノチャネルを通って前記ナノギャップ電極の組の近傍を通過するときに生成される電流を検出することと、
（ｃ） （ｂ）で検出した前記電流で、前記生体分子またはその一部を配列決定することと、
を備え、
前記生体分子配列決定装置は、前記ナノチャネルを通って前記試料の移動方向に沿って前記ナノギャップ電極の組の方へ延在する絶縁体であるフローディレクタをさらに備え、
前記フローディレクタは、前記ナノチャネルと流体連通している第１の流路と第２の流路を生成するように構成され、
（ａ）は、前記フローディレクタによって、前記試料の一部を前記第１の流路から前記ナノチャネルへ流し、前記試料の残りの部分を前記第１の流路から前記第２の流路へ流すことを含む、生体分子配列決定方法。 (A) directing a biomolecule flowing to or through a nanochannel of a biomolecule sequencing device, the biomolecule sequencing device comprising: (i) at least one of a nanogap electrode of the nanochannel. A set, wherein the set of nanogap electrodes enables to detect a current when the biomolecule contained in the sample passes through the nanochannel and in the vicinity of the set of nanogap electrodes. A set of nanogap electrodes, wherein the nanochannels are tapered toward the set of nanogap electrodes and have an inter-electrode distance smaller than or equal to the molecular diameter of the biomolecule; and (ii) Electrophoresis that provides an electric field that moves the biomolecule through the nanochannel and in close proximity to the set of nanogap electrodes of the nanochannel A set of moving electrodes, and directing biomolecules; and
(B) detecting, at the set of nanogap electrodes, a current generated when the biomolecule passes through the nanochannel and near the set of nanogap electrodes;
(C) sequencing the biomolecule or a part thereof with the current detected in (b);
Equipped with a,
The biomolecule sequencing device further comprises a flow director, which is an insulator extending toward the set of nanogap electrodes along the direction of movement of the sample through the nanochannel,
The flow director is configured to create a first flow path and a second flow path in fluid communication with the nanochannel,
(A) using the flow director to allow a part of the sample to flow from the first flow path to the nanochannel, and the remaining part of the sample to flow from the first flow path to the second flow path. A method for sequencing biomolecules , comprising flowing .
（ｂ） 前記ナノギャップ電極の組で、前記生体分子が前記ナノチャネルを通って前記ナノギャップ電極の組の近傍を通過するときに生成される電流を検出することと、
（ｃ） （ｂ）で検出した前記電流で、前記生体分子またはその一部を配列決定することと、
を備え、
前記生体分子配列決定装置は、前記ナノチャネルを通って前記試料の移動方向に沿って前記ナノギャップ電極の組の方へ延在する絶縁体であるフローディレクタをさらに備え、
前記フローディレクタは、前記ナノチャネルと流体連通している第１の流路と第２の流路を生成するように構成され、
（ａ）は、前記フローディレクタによって、前記試料の一部を前記第１の流路から前記ナノチャネルへ流し、前記試料の残りの部分を前記第１の流路から前記第２の流路へ流すことを含む、生体分子配列決定方法。 (A) directing a biomolecule flowing to or through a nanochannel of a biomolecule sequencing device, the biomolecule sequencing device comprising: (i) at least one of a nanogap electrode of the nanochannel. A nanogap configured to enable a current to be detected as the biomolecule contained in the sample passes through the nanochannel and near the nanogap electrode set. A set of electrodes, and (ii) a set of electrophoretic electrodes that provide an electric field to move the biomolecule into or through the nanochannel and in proximity to the set of nanogap electrodes of the nanochannel; (Iii) one or more pillars at or near the nanochannel, wherein the biological body uses current sensing with the set of nanogap electrodes. Orienting the biomolecule, comprising one or more pillars that linearize the biomolecule to enable identification of individual subunits of the molecule;
(B) detecting, at the set of nanogap electrodes, a current generated when the biomolecule passes through the nanochannel and near the set of nanogap electrodes;
(C) sequencing the biomolecule or a part thereof with the current detected in (b);
Equipped with a,
The biomolecule sequencing device further comprises a flow director, which is an insulator extending toward the set of nanogap electrodes along the direction of movement of the sample through the nanochannel,
The flow director is configured to create a first flow path and a second flow path in fluid communication with the nanochannel,
(A) using the flow director to allow a part of the sample to flow from the first flow path to the nanochannel, and the remaining part of the sample to flow from the first flow path to the second flow path. A method for sequencing biomolecules , comprising flowing .
（ｂ） 前記ナノギャップ電極の複数の組で、前記生体分子が前記ナノチャネルを通って前記ナノギャップ電極の複数の組の近傍を通過するときに生成される電流を検出することと、
（ｃ） （ｂ）で検出した前記電流で、前記生体分子またはその一部を配列決定することと、
を含む生体分子配列決定方法を実行する１つ以上のコンピュータプロセッサによって実行可能なコードを備え、
前記生体分子配列決定装置は、前記ナノチャネルを通って前記試料の移動方向に沿って前記ナノギャップ電極の複数の組の方へ延在する絶縁体であるフローディレクタをさらに備え、
前記フローディレクタは、前記ナノチャネルと流体連通している第１の流路と第２の流路を生成するように構成され、
（ａ）は、前記フローディレクタによって、前記試料の一部を前記第１の流路から前記ナノチャネルへ流し、前記試料の残りの部分を前記第１の流路から前記第２の流路へ流すことを含む、コンピュータ可読媒体。 (A) directing a biomolecule flowing to or through a nanochannel of a biomolecule sequencing device, the biomolecule sequencing device comprising: (i) a plurality of sets of nanogap electrodes of the nanochannel. Wherein each of the plurality of sets of nanogap electrodes detects a current when the biomolecules contained in the sample pass through the nanochannel and in the vicinity of the plurality of sets of nanogap electrodes. And wherein at least two sets of the plurality of sets of nanogap electrodes have different inter-electrode distances along the width of the nanochannel; and ii) moving the biomolecule into or through the nanochannel and in proximity to the plurality of sets of nanogap electrodes of the nanochannel. Directing biomolecules, including a set of electrophoretic electrodes that provide an electric field;
(B) detecting, at the plurality of sets of nanogap electrodes, a current generated when the biomolecule passes through the nanochannel and near the plurality of sets of nanogap electrodes;
(C) sequencing the biomolecule or a part thereof with the current detected in (b);
Bei example executable code by one or more computer processors to perform the biomolecular sequencing method including,
The biomolecule sequencing device further comprises a flow director, which is an insulator extending toward the plurality of sets of the nanogap electrodes along the movement direction of the sample through the nanochannel,
The flow director is configured to create a first flow path and a second flow path in fluid communication with the nanochannel,
(A) using the flow director to allow a part of the sample to flow from the first flow path to the nanochannel, and the remaining part of the sample to flow from the first flow path to the second flow path. Computer readable media , including streaming .
（ｂ） 前記ナノギャップ電極の組で、前記生体分子が前記ナノチャネルを通って前記ナノギャップ電極の組の近傍を通過するときに生成される電流を検出することと、
（ｃ） （ｂ）で検出した前記電流で、前記生体分子またはその一部を配列決定することと、
を含む生体分子配列決定方法を実行する１つ以上のコンピュータプロセッサによって実行可能なコードを備え、
前記生体分子配列決定装置は、前記ナノチャネルを通って前記試料の移動方向に沿って前記ナノギャップ電極の組の方へ延在する絶縁体であるフローディレクタをさらに備え、
前記フローディレクタは、前記ナノチャネルと流体連通している第１の流路と第２の流路を生成するように構成され、
（ａ）は、前記フローディレクタによって、前記試料の一部を前記第１の流路から前記ナノチャネルへ流し、前記試料の残りの部分を前記第１の流路から前記第２の流路へ流すことを含む、コンピュータ可読媒体。 (A) directing a biomolecule flowing to or through a nanochannel of a biomolecule sequencing device, the biomolecule sequencing device comprising: (i) at least one of a nanogap electrode of the nanochannel. A set, wherein the set of nanogap electrodes enables to detect a current when the biomolecule contained in the sample passes through the nanochannel and in the vicinity of the set of nanogap electrodes. A set of nanogap electrodes, wherein the nanochannels are tapered toward the set of nanogap electrodes and have a distance between the electrodes that is less than or equal to the molecular diameter of the biomolecule; and (ii) Electricity to provide an electric field that moves the biomolecule through the nanochannel and in close proximity to the set of nanogap electrodes of the nanochannel Orienting biomolecules, including a set of electrophoretic electrodes;
(B) detecting, at the set of nanogap electrodes, a current generated when the biomolecule passes through the nanochannel and near the set of nanogap electrodes;
(C) sequencing the biomolecule or a part thereof with the current detected in (b);
Includes executable code by one or more computer processors to perform the biomolecular sequencing method including,
The biomolecule sequencing device further comprises a flow director, which is an insulator extending toward the set of nanogap electrodes along the direction of movement of the sample through the nanochannel,
The flow director is configured to create a first flow path and a second flow path in fluid communication with the nanochannel,
(A) using the flow director to allow a part of the sample to flow from the first flow path to the nanochannel, and the remaining part of the sample to flow from the first flow path to the second flow path. Computer readable media , including streaming .
（ｂ） 前記ナノギャップ電極の組で、前記生体分子が前記ナノチャネルを通って前記ナノギャップ電極の組の近傍を通過するときに生成される電流を検出することと、
（ｃ） （ｂ）で検出した前記電流で、前記生体分子またはその一部を配列決定することと、
を含む生体分子配列決定方法を実行する１つ以上のコンピュータプロセッサによって実行可能なコードを備え、
前記生体分子配列決定装置は、前記ナノチャネルを通って前記試料の移動方向に沿って前記ナノギャップ電極の組の方へ延在する絶縁体であるフローディレクタをさらに備え、
前記フローディレクタは、前記ナノチャネルと流体連通している第１の流路と第２の流路を生成するように構成され、
（ａ）は、前記フローディレクタによって、前記試料の一部を前記第１の流路から前記ナノチャネルへ流し、前記試料の残りの部分を前記第１の流路から前記第２の流路へ流すことを含む、コンピュータ可読媒体。
(A) directing a biomolecule flowing to or through a nanochannel of a biomolecule sequencing device, the biomolecule sequencing device comprising: (i) at least one of a nanogap electrode of the nanochannel. A nanogap configured to enable a current to be detected as the biomolecule contained in the sample passes through the nanochannel and near the nanogap electrode set. A set of electrodes, and (ii) a set of electrophoretic electrodes that provide an electric field to move the biomolecule into or through the nanochannel and in proximity to the set of nanogap electrodes of the nanochannel; (Iii) one or more pillars at or near the nanochannel, wherein the biological body uses current sensing with the set of nanogap electrodes. Orienting the biomolecule, comprising one or more pillars that linearize the biomolecule to enable identification of individual subunits of the molecule;
(B) detecting, at the set of nanogap electrodes, a current generated when the biomolecule passes through the nanochannel and near the set of nanogap electrodes;
(C) sequencing the biomolecule or a part thereof with the current detected in (b);
Includes executable code by one or more computer processors to perform the biomolecular sequencing method including,
The biomolecule sequencing device further comprises a flow director, which is an insulator extending toward the set of nanogap electrodes along the direction of movement of the sample through the nanochannel,
The flow director is configured to create a first flow path and a second flow path in fluid communication with the nanochannel,
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