JP6626245B2 - 再構成皮膚の作製用の組成物および方法 - Google Patents
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Description
「同種間」という語は、同じ種に属するか、または同じ種から得られるが、遺伝的に異なる移植組織片を指す。
細胞の供給源
皮膚前駆細胞は、典型的に、ヒト真皮および表皮細胞である。
人工培養組織またはドナー組織から分離した真皮細胞および表皮細胞の集団を、個々の細胞または少数の細胞を含む凝集体に解離する。任意の公知の方法、例えばトリプシンおよびコラゲナーゼのような酵素による処理または、鈍器を用いるか、もしくはメスで頭皮を刻むといったような物理的な方法で解離を行い、組織から特定の種類の細胞を増殖させてよい。
増殖させた真皮細胞と表皮細胞を、例えば1:1の比で組み合わせ、細胞スラリーを、例えばDMEM/F12 (1:1) (Gibco, カタログ番号11039)のような培養培地中で作製した。表皮細胞の真皮細胞に対する比率として、1:2〜1:10の範囲の他の比率を用いてもよい。次に、該細胞スラリーを、不活性の生体適合性基質上に移す。該基質は、ヒト皮膚が再構成すると、容易に取り除かれるのが好ましい。該基質としては、生体適合性の様々な材料、例えばポリ乳酸およびポリグリコール酸のようなポリエステル、コラーゲン、ゼラチン、フィブリンおよびアルブミンのような蛋白質を用い得る。非生体分解性の基質材料の他の例としては、カーボン、シリコンまたはポリテトラフルオロエチレンが挙げられる。好ましい基質としては、シリコン膜、ポリエチレンテレフタラート(PET) 膜 (Invitrogen)または、ポアの大きさが3.0μmの、BD Falconセルカルチャーインサートが挙げられる。
培養細胞を移植して、毛嚢を形成する領域は、典型的には、1〜2 mmの生検パンチを用いて調製する。細胞を移植する領域は、0.5〜2cm2の大きさで、0.6〜0.8cmの深さであってよい。あるいは、継代培養した細胞の混合懸濁物を、毛髪を望む部位に直接注入してもよい。
該再構成ヒト皮膚は、正常な色素性毛幹を産生する、周期上の成熟したヒト毛嚢を含む。特定の態様において、再構成ヒト皮膚は、全層の皮下組織を含み、そこで形成される毛嚢は、特徴的なパターンで成長する; すなわち、該毛嚢は、ランダムに形成するのではなく、お互いに明確に関連しているように見られる。
1. 皮膚の付属器の近位末端は、上皮フィラメントが毛嚢の遠位末端から出ており、真皮乳頭が毛嚢の基部に位置する、毛嚢の構造を示す。
2. 該移植片は、近位に増殖細胞 (TA(Transient Amplifying)細胞)、遠位に分化中の細胞が位置し、PD(近位−遠位)増殖様式が形成される。
3. 該毛嚢は、外毛根鞘および内毛根鞘、キューティクル、皮質および髄質の同心円状の層からなる。毛の種類が異なれば、基本デザインに変化がある場合もあるが、全ての毛嚢は、特徴的な内毛根鞘(ヘンレ層およびハクスリー層) およびコンパニオン層を持つ。
4. 毛嚢の産物である毛幹は、特異的な分子構成からなる。
5. 毛嚢は脂腺と結合している。
6. 毛嚢は、次の周期用の幹細胞とDPを保持しながら、古い毛幹を脱落させる機構を持つ。
7. 毛嚢中には、毛周期が繰り返されている間、新しく毛髪器官を再生する能力が固有に備わっている。
材料と方法
動物
「ヌード/ヌード」 (または「nu/nu」) マウスは、主にT細胞の数を大幅に減少させることにより、免疫系を機能しないようにする遺伝的変異についてホモ接合型である。また、この変異により、該マウスは無毛の表現型を示すが、同時に、免疫不全により、移植片の拒絶が防止されるため、様々な非自己型の組織および腫瘍移植片用のレシピエントとして適当なものとなっている。
解離表皮細胞は、ヒト胎児および成人の頭皮ならびにヒト新生児の***より得た。真皮細胞は、ヒト胎児および成人の頭皮より得た。細胞を組織より単離した後、真皮細胞を含む初代培養細胞を培養で維持した。表皮細胞の初代培養細胞は、Rho-関連キナーゼ(ROCK)阻害剤であるY27632を添加した市販の培地中で維持した。真皮細胞および表皮細胞両方を、3週間までの期間で3回目の継代を行うまで別々に増殖させ、次に、1:1の比率で混合して、総体積 150μlのDMEM/F12 (1:1) (Gibco、カタログ番号11039)中の細胞スラリーを作製した。次に、該細胞スラリーをシリコン膜(Invitrogen)上に移し、細胞培養インキュベーター中で1〜1.5時間、37℃にてインキュベーションし、細胞を該膜に接着させた。
全層の皮膚を免疫不全である、ヌード/ヌードまたはNOD/SCIDマウスの背中から取り除いて外科創傷を作製し、細胞が接着した上述のシリコン膜を、創部の底部の損傷を受けていない筋系の筋膜面上に、細胞が創部に接触し、膜が上になるように置いた。1つまたは2つの移植片を各マウスに置き、次いで、該膜をホストの皮膚に縫合した。創部の上に、軟膏剤とともに無菌包帯を適用し、該マウスを、無菌テープで包み、その後12〜14週間の間モニターした。
この期間の最後に、該再生組織を解剖光学顕微鏡法により検討した後、ヘマトキシリン・エオジン染色を用いて、高倍率の光学顕微鏡法用に切片を作製した。H&E染色(組織的解析)は、標準のプロトコルにしたがって行った。端的には、凍結ブロックから作製した、10μmの切片を10%ホルマリンで固定し、1xPBSで洗浄し、ヘマトキシリンとともに3分間インキュベーションし、蒸留水で洗浄した後、エオジンとともに30秒間インキュベーションした。染色切片を洗浄し、70%、90%および100%エタノールとともにそれぞれ3分間インキュベーションすることにより脱水した。脱水切片をキシレンですすぎ、キシレンベースのマウンティング媒体を用いてマウントした後、光学顕微鏡法により試験した。
AP染色は、マニュアルにしたがって、6週間および12週間目の移植片について行った (Roche NBT/BCIPストック溶液、カタログ番号11 681 451 001)。端的には、凍結ブロックから作製した10μmの切片をPBS中ですすぎ、氷冷アセトン中で10分間固定した。該固定切片を1x PBS溶液で、それぞれ5分間、2回洗浄し、次にAPバッファー(0.1M Tris-HCL (pH 9.5)、0.1M NaCl、0.05M MgCl2) 中に5分間静置した。新しく調製した染色溶液(APバッファー10ml中NBT/BCIPストック溶液200μl)を、該固定切片に5〜30分間アプライした。陽性のAP反応が起こると、濃青色の染色が見られ、これは、インキュベーション時間を決定するために、5分間毎に顕微鏡でモニターしなければならない。濃青色の染色が見られると、該染色溶液を除き、切片を洗浄した。その後、該切片をエオジンで30秒間対比染色した後、エタノールで脱水し、キシレンベースのマウンティング媒体を用いてカバーガラスをマウントした。
GFP発現ウイルスの作製のために、80%コンフルエントの状態で、Fugene HD遺伝子導入試薬を用いて、GFP発現レトロウイルスベクターで293細胞に遺伝子導入した。該ウイルス含有培地を24時間毎に3日間回収し、−80℃で保存した。感染用に該凍結培地を融解し、5分間1500 rpmにて遠心分離し、次に、得られた上清をポリブレン (8μg/ml)と混合した。この混合物を用いて、T75フラスコあたりウイルス6mlで、80%コンフルエントの、培養***ケラチノサイトまたは培養胎児頭皮の真皮細胞に感染させた。3時間インキュベーションした後、該感染培地を除き、通常の増殖培地に置きかえた。
免疫蛍光解析は、標準的なプロトコルにより行った。凍結ブロックから作製した10μmの切片を4% パラホルムアルデヒド/PBSで10分間固定し、PBSで洗浄し、ブロッキングバッファー (PBS中、10% ロバ血清+ 2% BSA) 中で、室温にて1時間インキュベーションした。基底膜マーカー (ラット抗-FITC 結合型(CD49) α6-インテグリン (Stem Cell、カタログ番号10111))、表皮細胞または基底細胞層のマーカー(マウス抗ヒト パン−サイトケラチン (BD, カタログ番号550951))または間葉(真皮) 細胞マーカー (ウサギ抗-ビメンチン(Cell Signaling、カタログ番号3932)) に対する一次抗体を添加して、4℃にて一晩インキュベーションした。次の日に、該切片をPBSで洗浄し、二次抗体で1時間インキュベーションした。該切片を、DAPIを含有するマウンティング媒体(Vector Laboratory)を用いてマウンティングし、共焦点顕微鏡により発現を解析した。
解離した組織の培養増殖させたヒト細胞由来の皮膚移植片は、毛嚢を形成する
1. 手術後、マウスをモニターした。移植の4週間後に、色素性の皮膚が形成した。12週間目には、毛幹が皮膚表面から生じている様子が、肉眼により明確に確認でき、移植後14週間後まで成長を続けた。新しい皮膚および毛嚢は、該期間の80%時点で形成し、形成した皮膚は、0.5〜2cm2の範囲の領域を覆い、50〜1000個の成熟した毛嚢を有していた。頑強な色素性毛髪が、移植領域に明確に見られた。NOD/SCIDホストマウスは、色素性の髪を産生せず、ヌード/ヌードマウスは毛を全く産生しないため、かかる毛髪が色素性であることは、該表皮細胞培養物がメラノサイトを含み、該再構成毛嚢が、移植ヒト細胞より生じたものであることを直接示すものである。
再構成した毛幹をさらに特徴づけるために、解剖顕微鏡にて個々の毛嚢を単離した。該再生毛嚢は、成熟した特徴、すなわち、色素性毛幹、外毛根鞘および内毛根鞘を含む様々な層を示す。該毛嚢は、脂腺および真皮乳頭と結合していた。カップ状に支持された真皮乳頭に接着した、強い色素性毛幹の毛球領域を有する成長期の毛嚢、ならびに、色素性の弱い毛幹および毛嚢の先端に位置する真皮乳頭を有する休止期様の毛嚢が観察された。同一の移植片中に成長期および休止期の細胞の両方が存在することにより、再生した毛嚢が周期上にあることが有意に示唆される。毛嚢を含む領域の切片をさらにヘマトキシリン・エオジン(H&E) 染色により解析し、これにより、周期上の毛嚢が、脂腺および成熟した真皮乳頭を形成することが示された。
アルカリンホスファターゼ (AP)は、他の真皮線維芽細胞から真皮乳頭を区別するマーカーである。再生毛髪および皮膚をさらに特徴づけるために、6週間目および12週間目の移植片においてAP染色を行った。AP陽性の青色に染色された真皮乳頭は、6週間目の移植片中の、早期ステージ(ステージ3)の毛嚢の近位先端に位置し、12週目の移植片においては、カップ状の成熟した成長期の毛嚢に支持されていた。これらのデータを合わせると、再構成毛嚢は、脂腺および真皮乳頭と結合した、成熟した毛幹を持つことが示唆される。
再生毛嚢が、移植した細胞から形成したものであることを示すために、移植の前に、培養した***ケラチノサイトを、GFP発現レトロウイルスベクターで感染させ、移植した細胞が蛍光顕微鏡法によってトレースできるようにした。移植の2週間後、薄層の皮膚を該移植片から切り出し、蛍光顕微鏡法により解析した。脂腺と結合した、成熟した毛嚢が、位相差像から見られた。毛嚢、脂腺および毛嚢内表皮を含む全ての表皮細胞が蛍光の緑色であり、このことから、これらの細胞がGFP発現ケラチノサイト由来であることが示唆された。対照的に、真皮乳頭を含む真皮部分は全てGFP陰性であった。
成熟したヒト毛嚢に特徴的な蛋白質マーカーの有無を免疫蛍光顕微鏡法により解析し、再生した毛嚢および表皮がヒト由来のものであることを再確認した。サイトケラチンは、典型的には、上皮組織の細胞質内細胞骨格に発現する蛋白質である。具体的には、Pan-cKは、ヒト表皮細胞の同定に有用なサイトケラチンマーカーである。ビメンチンは、間葉細胞に発現する中間径フィラメントであり、ヒト真皮細胞の同定に有用なマーカーである。インテグリンは、細胞とその周辺の組織の接着を促進する受容体である。DAPIは、DNAのA−Tリッチ領域に強く結合する蛍光染色剤である。6ヶ月目の移植片由来の皮膚切片を、Pan-cKおよびビメンチンに対する抗体に曝した。抗α6-インテグリン抗体を用いて、表皮と真皮の間の境界を標識し、DAPIは、核を標識するのに用いた。マウス移植片における2つのヒト特異的なマーカー(Pan-cK およびビメンチン) の発現により、該マウスから回収した再生毛嚢および表皮がヒト細胞由来であることが示唆された。
Claims (8)
- 創傷への適用に適した不活性の生体適合性の基質に接着された、培養して継代培養した細胞の混合懸濁物を含む、毛嚢を対象の生体上にて形成させるための組成物であって、
該細胞の混合懸濁物はヒト成人頭皮由来の分化した表皮および真皮細胞を含み、ヒト胎児頭皮またはヒト新生児***由来の複能性の表皮および真皮細胞を含む、
該組成物は毛嚢を望む部位に作成された創傷上に、細胞−基質を、細胞が創部側になるように適用される組成物。 - 細胞が対象と異なる個体由来である、請求項1記載の組成物。
- 基質が半透過性のポリマー性膜またはシリコン膜である、請求項1または2記載の組成物。
- 継代培養した真皮および表皮細胞が、約1:1の比率で組み合わされている、請求項1〜3いずれかに記載の組成物。
- 複能性細胞の、分化した表皮細胞に対する比率が、1:1〜10:1の範囲内である、請求項1〜4いずれかに記載の組成物。
- 基質に接着した細胞中に、継代培養した細胞とともに、黒色細胞をさらに含む、請求項1〜5いずれかに記載の組成物。
- 基質が適用部位に固定される、請求項1〜6いずれかに記載の組成物。
- 対象の毛嚢形成を希望する部位に適用される免疫抑制剤と組み合わせて用いられる、請求項1〜7いずれかに記載の組成物。
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