JP6622591B2 - TNFαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞の、治療法における使用 - Google Patents
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Description
タンパク質およびペプチド系投与の最も一般的な方法は、侵襲的な薬物送達方法、例えば、注入および点滴による。これらは、全身性疾患のための高分子薬物の主な投与方法であるが、患者および開業医にとっては最も望ましくない方法でもある。この送達方法の明らかな否定的側面は、患者の承諾およびコンプライアンスであり、ほとんどの高分子の開発は、関連する費用または不都合が侵襲的な投与経路を使用する必要性を上回らない適応症に限定される。薬物を全身的に送達するための簡単で非侵襲的な方法として、経口投与は多くの利点を提供する:使用の容易さおよび簡便性、吸収面の広範囲な体積への接近、高い血管新生度、比較的長期にわたる滞留時間、不活性な非代謝成分の自然な除去など。
(i)TNF受容体のTNFα結合ドメインを含む第1のドメインと、
(ii)免疫グロブリンのFcドメインを含む第2のドメインと
を含むキメラポリペプチドであって、第1のドメインと第2のドメインがそれぞれ、N末端からC末端に連続的翻訳によって融合されており、キメラポリペプチドがTNFαに特異的に結合するキメラポリペプチドである。
本発明の一部の側面の一部の態様によれば、組換えTNFαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞を含む本発明の組成物を使用して、血液中のいずれかのまたは全ての脂質および/またはリポタンパク質の異常に高いレベルを伴う高脂血症(高リポタンパク血症または高脂血症とも称する)を予防、治療および制御するために使用することができる。[1]これは、脂質異常症(いずれかの異常な脂質レベルを含む)の最も一般的な形態である。高脂血症はまた、どの型の脂質が上昇しているかによって、すなわち、高コレステロール血、高トリグリセリド血または複合型高脂血症においては両者であるかによって分類される。また、高いリポタンパク質(a)レベルもまた、高脂血症の一形態に分類される。この用語には、I型高リポタンパク血症、II型高リポタンパク血症、III型高リポタンパク血症、IV型高リポタンパク血症およびV型高リポタンパク血症、ならびに分類されていない家族型および獲得型の高脂血症も含まれる。
本発明の一部の側面の一部の態様によれば、組換えTNFαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞を含む本発明の組成物を使用して、肝炎、肝硬変、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)(非アルコール性脂肪肝疾患−NAFLDとしても知られる)、肝毒性および慢性肝臓疾患を含む肝臓疾患および障害を予防、治療および制御することができる。一般に、用語「予防する」、「制御する」および「治療(処置)する」は、疾患または症状の素因を有する可能性があるがその疾患または症状を有するとまだ診断されていない患者からのその疾患またはその症状の発現の予防;疾患の症状の阻害、すなわち、その進行の阻害または遅延;ならびに疾患の症状の軽減、すなわち、疾患もしくは症状の退行または症状の進行の逆転を包含する。
(1)血清酵素、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)、アルカリホスファターゼ(ALP)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)およびアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)のレベルを決定するためのアッセイであって、酵素レベルの増加が肝臓疾患を示すもの。当業者ならば、これらの酵素アッセイは、肝臓が損傷されていることのみを示すことが当然分かるであろう。これらは、肝臓の機能する能力を査定しない。肝臓の機能する能力をアッセイするためには他の検査を使用できる。
慢性肝不全は、数カ月から数年にわたって起き、最も一般的には、ウイルス(例えば、HBVおよびHCV)、長期の/過度の飲酒、肝硬変、血色素症および栄養失調症によって引き起こされる。急性肝不全は、肝臓疾患(例えば、黄疸)の最初の徴候後における重症合併症の出現であり、多くの状態を含み、その状態の全てが、重度の肝細胞傷害または壊死を伴う。一部の態様において、ここに記載する組成物および方法は、超急性、急性および亜急性の肝不全、劇症肝不全ならびに遅発性劇症肝炎(これらは全て、ここでは「急性肝不全」と称する)の治療に特に好適である。急性肝不全の一般的な原因としては、例えば、ウイルス性肝炎、特定の薬物および毒素(例えば、フッ素化炭化水素(例えば、トリクロルエチレンおよびテトラクロルエタン)、タマゴテングダケ(amanita phalloides)(例えば、一般に「デスカップマッシュルーム(death-cap mushroom)」に見られる)、アセトアミノフェン(パラセタモール)、ハロタン、スルホンアミド、ヘニトイン(henytoin))への曝露、心臓と関連する肝虚血(例えば、心筋梗塞、心停止、心筋症および肺塞栓症)、腎不全、肝静脈流出路閉塞(occlusion of hepatic venous outflow)(例えば、バッド−キアリ症候群)、ウィルソン病、妊娠性急性脂肪肝、アメーバ性膿瘍および播種性結核が挙げられる。
TNFαポリペプチド阻害薬は、
(i)TNF受容体のTNFα結合ドメインを含む第1のドメインと、
(ii)免疫グロブリンのFcドメインを含む第2のドメインと
を含むキメラポリペプチドであって、第1のドメインと第2のドメインがそれぞれ、N末端からC末端に逐次連続的翻訳によって融合されており、キメラポリペプチドがTNFαに特異的に結合するキメラポリペプチドである。
(i)TNF受容体のTNFα結合ドメインを含む第1のドメインと、
(ii)免疫グロブリンのFcドメインを含む第2のドメインと、
(iii)小胞体保留シグナルを含む第3のドメインと
を含み、第1のドメインと第2のドメインと第3のドメインがそれぞれ、N末端からC末端に連続的翻訳によって融合されており、キメラポリペプチドがTNFαに特異的に結合する。
次に、以下の実施例に言及するが、これらの実施例は、上記記載と共に本発明の一部の態様を非限定的に説明するものである。
材料および実験手順
発現構築物および発現
prh TNFR2:FcをコードするcDNAは、GENEART AG(Regensburg、ドイツ)によって最適化および合成されたものである。コドン使用頻度は、ニコチアナ・タバカム遺伝子のコドンバイアスに適合させた。IgG1部分は、Fc IgG1重鎖定常領域[ホモサピエンス(Homo sapiens)]ACCESSION AEV43323からクローニングした。
アグロバクテリウム媒介形質転換は、外来遺伝子を植物細胞ゲノムに導入するために広範に使用されている。この手法を用いて、外来遺伝子およびその調節エレメントからなるT−DNA分子を、植物ゲノム中にランダムに導入する。組込み部位および遺伝子挿入物のコピー数は制御できないので、形質転換プロセスは、種々の導入遺伝子発現レベルを有する細胞から構成される非常に不均一なトランスジェニック「プール」をもたらす。トランスジェニック「プール」を、続いてクローン単離に使用する。形質転換プロセスにより、それぞれが個別の形質転換イベントを示す多数の単細胞株が確立され、それから外来遺伝子の発現レベルが最も高いクローンを選択する。prh TNFR2:Fc(PRH TNFR2:FC)に関して、prh TNFR2:Fcカセットを有するプラスミドを用いて、形質転換を行った(図1 配列番号7および8)。その結果、組換えタンパク質は、細胞の小胞体(ER)を標的にする。PRH TNFR2:FC−ER発現ベクターによるBY2細胞の形質転換を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)媒介植物形質転換手順によって以下のようにして行った:BY2(ブライトイエロー2)懸濁培養物を、prh TNFR2:FC−遺伝子およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(NPTII)選択遺伝子を内包しているベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス(tumefactiens)株と共に48時間共培養した。続いて、50mg/Lカナマイシン(Kanamaycin)および250mg/Lセフォタキシムが補充された培地中に、細胞を維持した。NPTII遺伝子は、カナマイシンに対する耐性を与え、したがって、NPTII陽性BY2細胞のみが、この選択培地中で生き残る。セフォタキシムは、アグロバクテリウムを選択的に死滅させるのに使用した。植物細胞は、この抗生物質に対して耐性を示す。
個々の細胞株を選択するために、高希釈細胞懸濁液のアリコートを固形BY−2培地上に広げた(Toshiyuki NagataおよびFumi Kumagai Methods in Cell Science 21:123〜127、1999)。次いで、小さいカルスが発生するまで、細胞を成長させた。次に、各カルスを培養液中に再懸濁させた。それから、細胞をサンプリングし、PRH TNFR2:FCについて評価した。約500種の細胞株を、変性条件下でウエスタンブロットによってスクリーニングした(図4)。高発現レベルを有する細胞株を、同一方法でさらに再分析して、prh TNFR2:FC産生クローンの最高発現クローンを選択した。
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)は、電場上でタンパク質をそのサイズによって分離する。タンパク質は、界面活性剤SDSの存在下で、それらの分子量の対数の一次関数として泳動する。SDS−PAGE上におけるPRH TNFR2:FCの泳動パターンおよび同定を、市販の分子量標準タンパク質(New England BioLabs;cat No.P7708S)および商業的に入手可能な、CHO細胞で発現される哺乳類細胞由来のEnbrel(登録商標)(エンタネルセプト(Entanercept);Wyeth)と比較した。PRH TNFR2:FCを、β−メルカプトエタノールを含有する還元試料緩衝液によってまたはネイティブ抽出緩衝液によって、細胞から抽出した。ネイティブな抽出上清を、分析の前に非還元試料緩衝液と混合した。Criterion(商標)細胞垂直電気泳動装置(Bio−Rad Lab.)を使用して、予備混合された電気泳動用のTris−グリシン−SDS泳動緩衝液(Bio−Rad Laboratories)を用いて、電気泳動を行った。電気泳動後、タンパク質を、ポリアクリルアミドゲルからタンパク結合ニトロセルロース膜(iBlot(商標))に移した。膜を、0.1% Tween 20を含有す5%のミルク緩衝液でRTにおいて1時間ブロッキングした。分子のFc部分の同定には、HRPにコンジュゲートされたヤギ抗ヒトIgG(cat#109−035−098、Jackson)を使用した。TNFR2の検出には、ウサギ抗TNFRII(ID:ab109853、Abcam)、続いてヤギ抗ウサギHRP(cat#111−035−003、Jackson)を用いた。検出は、ECL検出キット(Pierce)を用いて行った。PRH TNFR2:FCの免疫反応性を、市販Enbrel(登録商標)(エンタネルセプト(Entanercept);Wyeth)の免疫反応性と比較した。バンドを、Molecular Imager Gel Doc XR System(Bio−Rad Laboratories)を使用して検出した。
prhTNFR2:FCは、Technion−Israel Institute of TechnologyのSmoler Proteomics Center(Haifa、イスラエル)で配列解析する。タンパク質をゲルから抽出し、2.8mM DTTで還元し(60℃で30分間)、100mM炭酸水素アンモニウム中8.8mMヨードアセトアミドを用いて変性させ(暗所において室温で30分間)、10%ACNおよび10mM炭酸水素アンモニウム中で変性トリプシン(Promega)またはキモトリプシンにより1:50の酵素対基質比で37℃において一晩消化させる。得られたペプチドの3%を、Reprosil逆相材料(Dr Maisch GmbH、ドイツ)が充填された0.075×200mm溶融シリカ毛細管(J&W)上での逆相クロマトグラフィーによって分離する。ペプチドは、0.1%ギ酸水溶液を含む5から45%のアセトニトリルの直線勾配で60分間および0.1%ギ酸水溶液を含む95%アセトニトリルで15分間、流速0.25μl/分で溶離させる。イオントラップ質量分析計(Orbitrap、Thermo)によってポジティブモードでMSフルスキャンと、それに続く、1回目のMSスキャンから選択された7つの最もドミナントなイオンの衝突誘起解離(collision induces dissociation)(CID)を繰り返し使用して、オンライン質量分析を行う。
Chinese Hamster Ovary(CHO)細胞と植物細胞系において産生される糖タンパク質の間の大きな違いは、グリコシル化プロファイルおよびグリカン構造である。タンパク質に結合した種々のN−結合型グリカン構造を特性決定するために、予備分析を行った。これらの結果を、市販Enbrel(登録商標)で見られるN−グリコシル化プロファイルの結果と比較する。O−結合型グリカンの存在およびグリカン部位分析を判定する。
結合ELISA: TNFα結合ELISAは、市販TNFα検出ELISAキット(ヒトTNF−α;Hycult Biotech Inc.#HK307)と市販抗ヒトIgG抗体(ヤギ抗ヒトIgG FC特異的HRP;Sigma)の組合せである。このアッセイは、prhTNFR2:FC結合活性の定量的非放射性アッセイである。この結合ELISAは、TNFRとIgGドメインの両方を含む機能性(TNFαと結合することができる)分子の検出を可能にする。
A375細胞(ヒトメラノーマ細胞)を、培地(ATCC、#30−2002、10%FBSを補充)中に懸濁させて成長させた。104個/ウェルの細胞を、96ウェルアッセイプレート中に蒔き、アッセイ培地(ATCC、#30−2002、5%FBSを補充)中で一晩インキュベートした。組換えTNFα(2ng/ml、ProSpec、Rehovot、イスラエル)を、種々の濃度(1.562〜100ng/ml)のprhTNFR2:FCまたは市販Enbrel(エンタネルセプト(Entanercept);Wyeth)の存在下で37℃において2時間インキュベートした。インキュベート後、混合溶液を、アクチノマイシンD(0.8μg/ml)の存在下でA375細胞に加え、加湿インキュベーター中で37℃、CO2 5%においてさらに24時間インキュベートし、MTTアッセイ(Sigma Cat.No.M5655)によってアポトーシスの定量化を判定した。プレートを570〜650nmで読み取り、TNF−α誘導細胞毒性の阻害(%)を算出した。
タンパク質分析
prhTNFR2:FCを、還元条件(図2A)および非還元条件(図2Bのネイティブ抽出)下で分析した。prhTNFR2:FC(レーン1)および市販Enbrel(レーン2)を、抗Fc抗体(上部パネル)および抗TNFR2抗体(下部パネル)を用いて検出した。2つのタンパク質は、おそらく植物細胞発現酵素と哺乳類細胞発現酵素とのグリコシル化パターンにおける差のため、移動特性にわずかな差を示している。
組換えTNFR2:Fcを発現する植物細胞の経口投与は、Con A免疫介在性肝炎(hepatatis)モデルにおいて肝毒性を効果的に低減する
コンカナバリンA(Con A)モデルは、T細胞、ナチュラルキラー(NK)T細胞(NKT)およびマクロファージ依存性肝傷害を研究するための確立した動物モデルであり、免疫介在性肝炎に特有の病態形成および病理学的変化に近い模倣をする。この免疫介在性肝炎モデルにおける、組換えTNFR2:Fcを発現する植物細胞の経口投与による肝毒性の寛解は、組換えTNFR2:Fcを発現する植物細胞の有効な抗炎症能力の証拠を提供する。
動物: 全実験で、C57Bl/6マウス雄、11〜12週齢を使用した。各実験群に5〜8匹のマウスを含めた。
3つの別個の一連の実験において、低用量(TNFR2:Fcタンパク質0.5μg「X1」に相当する)およびより高用量(TNFR2:Fcタンパク質5μg「X10」に相当する)での、組換えTNFR2:Fcを発現する植物細胞の経口投与はいずれも、Con Aの肝毒性作用を有意に低減した。肝損傷の血清酵素マーカー(AST、ALT)の上昇は、3つの実験全てにおいてほとんど予防され(図7A、7Bおよび7Cを参照のこと)、有効性は、経口ステロイド処置に近かった(例えば、図8A、8Bおよび8C、Dex.)。
組換えTNFR2:Fcを発現する植物細胞の経口投与は、高脂肪食(HFD)によってモデル化された脂肪肝疾患において免疫原性を効果的に寛解させる
広く受け入れられている脂肪肝疾患の動物モデルを、高脂肪食(HFD)によって誘導する。食餌性肥満を有するマウスは、高い血清脂質プロファイル、増加した肝臓トリグリセリドおよび免疫系変化を特徴とする。
動物: 全実験で、C57bl/6マウス雄、6〜7週齢を使用した。各実験群に10匹のマウスを含めた。マウスは、Harlan Laboratories、Jerusalem、イスラエルから購入した。全てのマウスに、0日から24週間後の屠殺まで、HFD(Harlan、TD88137、カロリーの42%が脂肪由来)を与えた。
1.体重
月1回ベースで測定した評価項目
1.空腹時血中グルコースレベル
2.血清ALT、ASTレベル*
3.血清トリグリセリドレベル*
*血清肝臓酵素およびトリグリセリドの監視は、Reflovet Plus臨床化学分析システム(Roche Diagnostics、Mannheim、ドイツ)の測定によって行った。
1.1日目および24週目における空腹時血清インスリンレベル(ELISA)。
3.肝臓脂肪含有量(トリグリセリド);屠殺後
4.肝臓組織像、屠殺後
5.血清サイトカインレベル(TNF−α)、屠殺後(ELISA)。
8.CD3−FITC/NK 1.1−APC
マウス屠殺(24週目)の後:
サイトカイン分泌: サイトカイン(TNF−α)レベルを、処置マウスおよび対照マウスの血清中で、ELISAによってQuantikine Sandwich ELISAキット(R&D Systems、Minneapolis MN、米国)を使用して測定した。
経口投与した、組換えTNFR2:Fcを発現する植物細胞の、血清酵素に対する効果を試験した。図11において分かるように、阻害薬を発現する細胞の経口投与は、屠殺日(24週目)において測定された場合、処置マウスにおいてASTレベルの減少をもたらした。ALTレベルの減少の傾向も、明白であった(データは示さず)。
マウスにおける毒性研究
方法
動物
試験開始時に8週の雄および雌のSDラット(Harlan Laboratories、イスラエル)を、標準実験室条件下で飼育した。試験開始時の平均体重はおおよそ、雄で6.8g、雌で6.3gであった。動物は、市販のげっ歯類用飼料(Teklad Certified Global 18% Protein Diet cat#:2018SC)を摂餌させ、加圧滅菌して酸性化した飲料水(pH2.5〜3.5)を自由に利用できるようにした。
1群当たり12匹のラット(雄6匹および雌6匹)を含む3つの投薬群および1群当たり6匹のラット(雄3匹および雌3匹)を含む対照群の4つの群に割り当てた。各性において、対照群には希釈緩衝液(0.2Mマンニトール)を、3つの処置群にはTNFR2:Fcを発現する細胞をTNFR2:Fc 0.1、0.5および1mg/Kg体重の用量レベルで投与した。細胞を、要求される発現タンパク質の量に応じてアリコートとして分取した。各アリコートを、30gの市販のげっ歯類用飼料粉末および希釈緩衝液と混合して、ペレットを作製した。対照ペレットは、希釈緩衝液および市販のげっ歯類用飼料粉末のみで作製した。全ての動物に、14日間にわたって毎日、ペレットを経口的に摂餌させた。研究中に、死亡率および一般的な臨床観察を行い、体重を毎日監視した。研究終了時(15日目)に、二酸化炭素吸入による浅麻酔の後、全ての動物の後眼窩洞全体から3つの血液試料を抜き取った。その後に、動物を屠殺し、病理診断を行い、選択された器官を収集した。
14日間の安全性研究全体を通じて、有害な臨床症状は記録されなかった。全ての血液パラメーターは、正常な範囲内であって、有意な偏差はなかった。体重増加は、持続し、正常であり、群間(処置群または対照群)に有意差はなかった。細胞の発現は、安全であり、忍容性が良好であり、有害作用がないことが分かった。生化学パラメーターまたは臨床症状に対する影響は、認められなかった。肉眼的剖検観察により、病理所見は認められなかった。瀕死状態または重度の窮迫状態にある動物は、認められなかった。激痛または体重減少を示す動物は、観察されなかった。
PRX−106の配列決定
Edman分解によるN末端配列決定
分析は、Alphalyse(デンマーク)uainf、ABI Procise 494配列決定装置で行った。この手順は、エドマン分解化学反応によってタンパク質およびペプチドのN末端アミノ酸配列を決定するものである。エドマン分解は、アミノ酸残基を1つずつ切断してクロマトグラフィーによって同定する周期的な手順である。ここでは周期的手順の工程は3つである。工程1において、PITC試薬を、アルカリ性条件下でN末端アミノ基にカップリングさせる。工程2において、N末端残基を、酸性媒体中で切断する。工程3において、PITCとカップリングした残基をフラスコに移し、PTH残基に変換し、HPLCクロマトグラフィーによって同定する。次いで、次の周期を、次のN末端残基の同定のために開始する。
配列は、LPAQV(配列番号18)と決定された。
タンパク質分解
分析試料を8M尿素、100mM炭酸水素アンモニウム(ABC)中に再懸濁させ、続いて2.8mM DDTで還元し(60℃で30分間)、暗所で周囲温度においてさらに30分間、100mM ABC中8.8mMヨードアセトアミドを用いて変性させた。2M尿素、25mM ABC中で変性トリプシン(Promega)を1:50の酵素対基質比で使用して、タンパク質を37℃において一晩消化させた。
トリプシンまたはキモトリプシンペプチドを、ステージチップ(手製C18)を使用して脱塩し、残留緩衝液を蒸発させ、ペレットを0.1%(v/v)ギ酸に再懸濁させた。得られたペプチド20ngを、Reprosil逆相材料(Dr Maisch GmbH、ドイツ)が充填された0.075×200mm溶融シリカ毛細管(J and W)上での逆相クロマトグラフィーによって分離した。ペプチドを0.1%ギ酸水溶液を含む5から45%のアセトニトリルの直線勾配で60分間、続いて0.1%ギ酸水溶液を含む95%アセトニトリルで15分間、流速0.25μl/分で溶離させた。イオントラップ質量分析計(Orbitrap、Thermo)においてポジティブモードでMSフルスキャンとそれに続く、1回目のMSスキャンから選択された7つの最もドミナントなイオンの衝突誘起解離(CID)を繰り返し使用して、オンライン質量分析を行った。質量分析データは、特異タンパク質由来データベースを使用するDiscovererソフトウェアバージョン1.3ソフトウェアを使用して分析した。
配列を、エタネルセプト配列のペプチド配列と比較した。特定された配列を、以下の表Vに示す。参照配列の84.8%のカバレッジが提示される(図20、緑色を参照のこと)。
以下に、出願当初の請求項を実施の態様として付記する。
[1] 肥満、メタボリックシンドローム、糖尿病、高脂血症および肝臓疾患または障害からなる群から選択される、TNFαと関連する医学的状態を治療する方法であって、それを必要とする対象に、TNFαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞の治療有効量を経腸的に投与し、それによってTNFαと関連する前記医学的状態を治療することを含む方法。
[2] 肥満、メタボリックシンドローム、糖尿病、高脂血症および肝臓疾患または障害からなる群から選択される、TNFαと関連する医学的状態の経腸的治療のための、TNFαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞の使用。
[3] 前記経腸投与が経口投与である、[1]に記載の方法または[2]に記載の使用。
[4] 前記TNFαポリペプチド阻害薬が抗TNFα抗体である、[1]に記載の方法または[2]に記載の使用。
[5] 前記抗TNFα抗体が、インフリキシマブ、アダリムマブまたはゴリムマブである、[4]に記載の方法または使用。
[6] 前記TNFαポリペプチド阻害薬が、
(i)TNF受容体のTNFα結合ドメインを含む第1のドメインと、
(ii)免疫グロブリンのFcドメインを含む第2のドメインと
を含むキメラポリペプチドであって、前記第1のドメインと前記第2のドメインがそれぞれ、N末端からC末端に連続的翻訳によって融合されており、キメラポリペプチドがTNFαに特異的に結合するキメラポリペプチドである、[1]に記載の方法または[2]に記載の使用。
[7] 前記キメラポリペプチドが、小胞体保留シグナルを含む第3のドメインをさらに含み、前記第1のドメイン、第2のドメインおよび第3のドメインがそれぞれ、N末端からC末端に連続的翻訳によって融合されている、[6]に記載の方法または使用。
[8] 前記第1のドメインのN末端に翻訳によって融合されている、小胞体シグナルペプチドをコードする追加のドメインを含む、[6]または[7]に記載の方法または使用。
[9] 前記シグナルペプチドが植物シグナルペプチドである、[8]に記載の方法または使用。
[10] 前記植物シグナルペプチドが、配列番号4に示した通りである、[9]に記載の方法または使用。
[11] 前記第1のドメインが、200〜250アミノ酸長である、[6]または[7]に記載の方法または使用。
[12] 前記第1のドメインが、アミノ酸配列LCAP(配列番号11)およびVFCT(配列番号12)を含む、[11]に記載の方法または使用。
[13] 前記第1のドメインが、アミノ酸配列LPAQVAFXPYAPEPGSTC(配列番号13)をさらに含む、[12]に記載の方法または使用。
[14] 前記第1のドメインが、配列番号2に示した通りである、[13]に記載の方法または使用。
[15] 前記免疫グロブリンがIgG1である、[6]または[7]に記載の方法または使用。
[16] 前記第2のドメインが、配列番号9に示した通りである、[6]または[7]に記載の方法または使用。
[17] 前記キメラポリペプチドが、配列番号6に示した通りである、[6]または[7]に記載の方法または使用。
[18] 前記キメラポリペプチドが、配列番号7、204または205に示した通りである、[7]に記載の方法または使用。
[19] 前記キメラポリペプチドが、TNFαによって誘導されるアポトーシスを阻害することができる、[6]または[7]に記載の方法または使用。
[20] 前記TNFαポリペプチド阻害薬が、植物特異的グリカンを含む、[1]または[2]に記載の方法または使用。
[21] 前記植物特異的グリカンが、コアキシロースおよびコアα−(1,3)フコースからなる群から選択される、[20]に記載の方法または使用。
[22] 前記植物細胞が、ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)植物細胞である、[1]または[2]に記載の方法または使用。
[23] 前記ニコチアナ・タバカム植物細胞が、ブライトイエロー(BY−2)細胞である、[22]に記載の方法または使用。
[24] 前記植物細胞が凍結乾燥されている、[1]または[2]に記載の方法または使用。
[25] 前記植物細胞が懸濁液中で成長させられる、[1]または[2]に記載の方法または使用。
[26] 前記肝臓疾患または障害が、肝炎、肝硬変、肝臓がん、肝毒性、慢性肝臓疾患、脂肪肝疾患および非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)からなる群から選択される、[1]または[2]に記載の方法または使用。
[27] 前記肝毒性が、アセトアミノフェン、NSAIDS、グルココルチコイド、イスニアゼド(isniazed)、ヒ素、四塩化炭素および塩化ビニルからなる群から選択される化学薬剤によって誘導される、[26]に記載の方法または使用。
[28] 前記糖尿病が、I型糖尿病、II型糖尿病およびLADA疾患からなる群から選択される、[26]に記載の方法または使用。
[29] 前記植物細胞が、経口栄養形態で提供される、[1]または[2]に記載の方法または使用。
[30] 前記経口栄養形態が、完全食、溶解用粉末、バー、ベークド製品、シリアルバー、デイリーバー、スナック食品、朝食用シリアル、ミューズリー、キャンディ、タブ、クッキー、ビスケット、クラッカー、チョコレートおよび乳製品である、[29]に記載の方法または使用。
[31] 前記肝臓疾患または障害が脂肪肝疾患である、[1]〜[27]、[29]または[30]の何れか一項に記載の方法または使用。
[32] 前記TNFαポリペプチド阻害薬が、肝臓および脾臓のT細胞分布を変える、[30]に記載の方法または使用。
[33] 前記TNFαポリペプチド阻害薬が、血清酵素または代謝産物を低減する、[30]に記載の方法または使用。
[34] 前記血清酵素が、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)またはアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)である、[30]に記載の方法または使用。
[35] 前記代謝産物がトリグリセリドである、[30]に記載の方法または使用。
Claims (17)
- 肥満、メタボリックシンドローム、糖尿病、高脂血症および肝臓疾患または障害からなる群から選択される、TNFαと関連する医学的状態の経口治療における使用のための、TNFαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞を含む医薬組成物であって、前記TNFαポリペプチド阻害薬が、TNFαを特異的に結合しTNFα活性を阻害する配列番号10に記載のキメラポリペプチドを含む、医薬組成物。
- 前記医学的状態が、肥満、メタボリックシンドローム、高脂血症および肝臓疾患または障害からなる群から選択される、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記キメラポリペプチドが、C末端の小胞体保留シグナルをさらに含む、請求項1または2に記載の医薬組成物。
- 前記植物細胞が、追加のN末端の植物の小胞体シグナルペプチドを含む前記キメラポリペプチドを発現する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記植物シグナルペプチドが、配列番号4に示した通りである、請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記小胞体保留シグナルがSEKDEL(配列番号16)である、請求項3〜5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 追加のN−末端の植物の小胞体シグナルペプチドを含む前記キメラポリペプチドが、配列番号6に示した通りである、請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記キメラポリペプチドが、配列番号7に示した通りである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記TNFαポリペプチド阻害薬が、植物特異的グリカンを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記植物細胞が懸濁液中で成長させられる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記植物細胞が、ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)植物細胞である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記ニコチアナ・タバカム植物細胞が、ブライトイエロー(BY−2)細胞である、請求項11に記載の医薬組成物。
- 前記植物細胞が凍結乾燥されている、請求項1〜12のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記肝臓疾患または障害が、肝炎、肝硬変、肝臓がん、肝毒性、慢性肝臓疾患、脂肪肝疾患および非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)からなる群から選択される、請求項1〜13のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記植物細胞が、経口栄養形態で提供される、請求項1〜14のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記経口栄養形態が、完全食、溶解用粉末、バー、ベークド製品、シリアルバー、デイリーバー、スナック食品、朝食用シリアル、ミューズリー、キャンディ、タブ、クッキー、ビスケット、クラッカー、チョコレートおよび乳製品である、請求項15に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜16のいずれか1項に記載の組成物に、さらに薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
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