JP6618191B2 - Diagnosis and treatment of brain malaria - Google Patents
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Description
本発明は、脳マラリア(本明細書中「CM」と称することがある。)の診断および治療に関する。 The present invention relates to the diagnosis and treatment of cerebral malaria (sometimes referred to herein as “CM”).
脳マラリア(CM)は、突然の昏睡状態、死、または、神経障害によって特徴づけられる、Plasmodium falciparum(P.falciparum)感染の最も致命的な合併症である。脳が重度に冒されるが、CMがどのように生じるかについて、脳の位置と空間時間的機構はあまり理解されていない。 Cerebral malaria (CM) is the most deadly complication of Plasmodium falciparum (P. falciparum) infection, characterized by sudden coma, death, or neuropathy. Although the brain is severely affected, the location and spatiotemporal mechanisms of the brain are not well understood as to how CM occurs.
脳マラリア(CM)は、P.falciparum寄生虫によって引き起こされるヒトにおけるマラリア感染症の重篤な合併症であり、高い死亡率または長期の身体障害を伴う痙攣や昏睡状態のような突然の臨床症状によって特徴づけられる(非特許文献1=Idro,R.ら(2010).Pediatr Res 68,267−274.;非特許文献2=Taylor,T.E.ら(2004).Nat Med 10,143−145.)。CMは非特異的な症状を呈するため、CMの早期診断は容易でなく、しばしば、CM治療があまり効果的でない時点で疾患の症状が顕在化する(非特許文献3=Miller,L.H.ら(2013).Nat Med 19,156−167.)。それゆえ、適時のインターベンションを可能にする、CMの早期の迅速かつ安価な診断が必要とされている。 Cerebral malaria (CM) It is a serious complication of malaria infection in humans caused by falciparum parasites and is characterized by sudden clinical symptoms such as convulsions and coma with high mortality or long-term disability (Non-Patent Document 1) = Idro, R. et al. (2010) .Pediatr Res 68, 267-274.; Non-Patent Document 2 = Taylor, TE et al. (2004). Nat Med 10, 143-145.). Since CM presents non-specific symptoms, early diagnosis of CM is not easy, and often symptoms of the disease become apparent when CM treatment is not very effective (Non-Patent Document 3 = Miller, L. H. et al. (2013). Nat Med 19, 156-167.). Therefore, there is a need for early, quick and inexpensive diagnosis of CM that allows timely intervention.
脳マラリア(CM)の病理を理解するために、P.berghei ANKA(PbA)寄生虫を使用したCMのマウスモデル(実験的脳マラリア、ECMとして知られる)が広く用いられている(非特許文献4=Langhorne,J.ら(2011).Malar J 10,23.)。脳は、密な内皮細胞が特定の血管にしっかりと固定された血液脳関門(BBB)を形成しており、外来性病原体の侵入を防止する特権的な部位であるが、ECMは、BBBの破壊と、その後の炎症性応答および脳内の細胞蓄積から生じると考えられている。実際、多数の研究が、様々な細胞(その大部分は白血球)が、脳の血管に多数蓄積し、そこで、感染赤血球(iRBC)と、CD8α+樹状細胞(DC)によってクロスプライミングされた寄生虫特異的な病原性CD8 T細胞がECMの発病において重要な役割を担うことに言及している(非特許文献5=Baptista,F.G.ら(2010).InfectImmun 78,4033−4039.;非特許文献6=Haque,A.ら(2011).J Immunol 186,6148−6156.;非特許文献7=Howland,S.W.ら(2013).Brainmicrovessel cross−presentation is a hallmark of experimental cerebral malaria.EMBO Mol Med.(2013年5月16日オンライン版公開,doi:10.1002/emmm.201202273);非特許文献8=Lundie,R.J.ら(2008).Proc NatlAcad Sci U S A 105,14509−14514.;非特許文献9=McQuillan,J.A.ら(2011).Int J Parasitol 41,155−163.;非特許文献10=Renia,L.ら(2012).Virulence 3,193−201.;非特許文献11=Yui,K.(2013).EMBO Mol Med.(2013年6月5日オンライン版公開,doi:10.1002/emmm.201302849))。さらに、最近の研究は、PbA感染中の活性化CD8 T細胞におけるCD11cの発現を報告しているが、ECMの間のその正確な役割については十分に研究されていない(非特許文献12=Tamura,T.ら、(2011).Infect Immun 79,3947−3956.)。BBB機能不全は、ECMの主な特徴であり、全身性ならびに局所性の事象がこれに寄与している(非特許文献13=Combes,V.ら、(2012).Trends Parasitol 28,311−319.;非特許文献14=Nacer,A.ら、(2012).PLoS Pathog 8,e1002982.)。 To understand the pathology of cerebral malaria (CM), A mouse model of CM (known as experimental brain malaria, ECM) using the berghei ANKA (PbA) parasite is widely used (Non-patent Document 4 = Langhorne, J. et al. (2011). Malar J 10, 23.). The brain forms a blood-brain barrier (BBB) in which dense endothelial cells are firmly anchored in specific blood vessels, and is a privileged site that prevents the invasion of exogenous pathogens. It is thought to result from destruction and subsequent inflammatory responses and cellular accumulation in the brain. In fact, many studies have shown that various cells (mostly white blood cells) accumulate in large numbers in the blood vessels of the brain, where parasites are cross-primed by infected red blood cells (iRBC) and CD8α + dendritic cells (DC). Mention that specific pathogenic CD8 T cells play an important role in the pathogenesis of ECM (non-patent document 5 = Baptista, FG et al. (2010). InfectImmun 78, 4033-4039 .; Patent Document 6 = Haque, A. et al. (2011) .J Immunol 186,6148-6156.; Non-patent Document 7 = Howland, SW et al. (2013). aria.EMBO Mol Med. (May 16, 2013 online version release, doi: 10.1002 / emmm.201202273); Non-patent document 8 = Lundie, R.J. Non-patent document 9 = McQuillan, JA et al. (2011) .Int J Parasitol 41,155-163.; Non-patent document 10 = Renia, L. et al. (2012). 193-201 .; Non-Patent Document 11 = Yui, K. (2013) .EMBO Mol Med. (Online release on June 5, 2013, doi: 10.1002 / emmm.201302849)). In addition, recent studies have reported the expression of CD11c in activated CD8 T cells during PbA infection, but their exact role during ECM has not been well studied (12). , T. et al. (2011) .Infect Immun 79, 3947-3956.). BBB dysfunction is a major feature of ECM, and systemic as well as local events contribute to this (Non-Patent Document 13 = Combes, V. et al. (2012). Trends Parasitol 28, 311-319. Non-Patent Document 14 = Nacer, A. et al. (2012). PLoS Pathog 8, e1002982.).
本発明者らは、最初のBBB破壊が、脳全体の血管において同時に生じるのか、脳内にBBBをiRBCおよび病原性免疫細胞に対して寛容にさせる特定の場所が存在するのかは、理解するために鋭意研究を進めた。同様に、特定の脳領域および/または細胞における免疫応答の空間時間的制御についても解明するために鋭意研究を進めた。 We understand whether the initial BBB disruption occurs simultaneously in blood vessels throughout the brain or whether there is a specific place in the brain that makes the BBB tolerant to iRBC and pathogenic immune cells. Research has been advanced. Similarly, extensive research has been conducted to elucidate the spatiotemporal control of immune responses in specific brain regions and / or cells.
本発明者らは、強力なイメージング技術である、超高磁場11.7T MRIおよび多光子(MP)顕微鏡法の組み合わせを用いて、マウスならびに非ヒト霊長類のCMの病態生理学的機構および免疫学的機構の空間時間的制御を調べた。本発明者らは、PbA(マウスCMモデル)およびP.coatneyi(サルCMモデル)による全身感染の間にBBBが破壊され、寛容となる、基礎的な機構を解明した。本発明者らは、独特な放射状および接線方向に密な微小毛細管構造から構成される嗅球(OLF)が、寄生虫ならびに細胞の移動に適切な環境として機能し、マラリア感染を最初に検知する場所であり、そして、脳と活性化された免疫系との間の「クロストーク」を可能にすることを見出した。このことは、OLFを、嗅覚の喪失、高熱、星状細胞、CCL21、CCR7、CXCR3およびCD8 T細胞と関連づける。 The inventors have used the powerful imaging technique, a combination of ultrahigh magnetic field 11.7T MRI and multiphoton (MP) microscopy, the pathophysiological mechanism and immunology of mouse and non-human primate CM. The spatiotemporal control of the mechanical mechanism was investigated. We have identified PbA (mouse CM model) and P.A. The basic mechanism by which BBB is destroyed and tolerated during systemic infection with coatneyi (monkey CM model) was elucidated. We find that the olfactory bulb (OLF), composed of a unique radial and tangentially dense microcapillary structure, serves as a suitable environment for parasite and cell migration and is the first location to detect malaria infection And found to allow "crosstalk" between the brain and the activated immune system. This links OLF with olfactory loss, hyperthermia, astrocytes, CCL21, CCR7, CXCR3 and CD8 T cells.
本明細書において、発明者らは、CMのマウスモデルならびにサルモデルにおいて、嗅球(OLF)がPlasmodium寄生虫によって物理的に破壊され、機能的に障害を受ける(嗅覚の喪失)領域であり(嗅覚の喪失)、次いで高熱が生じることを明らかにした。2つの強力な画像化技術、超高磁場MRIと生体内多光子顕微鏡法によって、OLFが寄生虫の蓄積および細胞閉塞を受け、その後、柵状微小毛細血管構造に起因した微小出血が生じる様子が可視化された。OLFの血管内を循環する寄生虫は、OLFの糸球および血管周囲の星状細胞によって、感染の初期段階で検知され、CXCR3を介してCD11c+CD8 T細胞を誘引し得るCCL21を放出する。このように、嗅覚喪失の早期検出と、病理学的な細胞の補充の即時妨害は、ECMのための新規治療を提供し得る。したがって、本発明は以下をも提供する。
(1)被験体の嗅球(OLF)の状態を脳マラリアの指標とする方法。
(2)前記状態は、嗅覚異常、細胞検査および嗅球の診断画像から選択される少なくとも1つにより判定されることを特徴とする、項目1に記載の方法。
(3)前記嗅覚異常は、基準嗅覚検査および静脈的嗅覚検査からなる群より選択される試験における異常である、項目2に記載の方法。(4)前記診断画像は、核磁気共鳴映像法(MRI)によるものである、項目2または3に記載の方法。
(5)前記MRIは、7T以上の磁力で撮影される、項目4に記載の方法。
(6)前記診断画像において、スポットが観察されることは脳マラリアの指標である、項目2〜5のいずれか1項に記載の方法。
(7)前記細胞検査は、染色または免疫組織化学法で検査される、項目2〜6のいずれか1項に記載の方法。
(8)前記被験体の嗅球の異常は、罹患早期の指標である、項目1〜7のいずれか1項に記載の検出法。
(9)被験体の嗅球(OLF)の状態を測定することを包含する、脳マラリアを診断する方法。
(10)前記被験体の嗅球が異常であることは、該被験体が脳マラリアに罹患していることの指標である、項目9に記載の方法。
(11)嗅球の状態を測定する手段を含む、脳マラリアの検出または診断のための装置。
(12)前記手段は磁気共鳴画像化(MRI)手段である、項目11に記載の装置。
(13)前記MRIは、7T以上のMRIである、項目12に記載の装置。
(14)CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の少なくとも1つの因子の阻害剤を含む、脳マラリアの予防または治療剤。
(15)前記CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の少なくとも1つの因子の阻害剤は、CCL21、CXCR3およびCCR7、ならびにこれらをコードする核酸からなる群より選択される少なくとも1つ因子の阻害剤を含む、項目14に記載の脳マラリアの予防または治療剤。
(16)前記阻害剤は、低分子化合物、抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、siRNA、shRNA、アンチセンス核酸、アプタマー、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも1種含む、項目14または15に記載の脳マラリアの予防または治療剤。
(17)前記阻害剤は、抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、および抗CCR7抗体からなる群より選択される少なくとも1種の抗体、またはそのフラグメントもしくは機能的等価物を含む、項目14〜16のいずれか1項に記載の脳マラリアの予防または治療剤。
(18)前記阻害剤は、抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体および抗CCR7抗体からなる群より選択される少なくとも2種の抗体、またはそのフラグメントもしくは機能的等価物を含む、項目14〜17のいずれか1項に記載の脳マラリアの予防または治療剤。
(19)前記阻害剤は、抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体および抗CCR7抗体の3種の抗体、またはそのフラグメントもしくは機能的等価物を含む、項目14〜18のいずれか1項に記載の脳マラリアの予防または治療剤。
(20)脳マラリアの予防または治療のための、CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の少なくとも1つの因子の阻害剤。
(21)項目15〜19のいずれか1項または複数の項における特徴をさらに含む、項目20に記載の阻害剤。
(22)有効量のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の少なくとも1つの因子の阻害剤を、必要とする被験者に投与することを含む、該被験者の脳マラリアを予防または治療するための方法。
(23)CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の少なくとも1つの因子を含む、脳マラリアのマーカー。
(24)前記CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の少なくとも1つの因子は、CCL21、CXCR3、CCR7、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも1つを含む、項目23に記載の脳マラリアのマーカー。
(25)前記CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の少なくとも1つの因子は、(1)IP−10(CXCR3リガンド)、CXCL11(I−TAC)、およびCXCL9(MIG)からなる群より選択される少なくとも1つの炎症性サイトカイン、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも1つ;
(2)CCL21および/またはCCL19
(3)CD8α樹状細胞および他の樹状細胞;ならびに
(4)CD8T細胞および他のT細胞
からなる群より選択される、少なくとも1つの因子を含む、
項目23または24に記載の脳マラリアのマーカー。
(26)(A)嗅球におけるCCL21および/またはCCL19の発現上昇;
(B)皮質におけるIFN−γの発現上昇;
(C)前記CD8α樹状細胞は、CCR7依存的にプライミングされるものが観察されること;および/または
(D)脳または脾臓において活性化CD8T細胞が観察されること
を脳マラリアの発症の指標とする、項目23〜25のいずれか1項に記載の脳マラリアのマーカー。
(27)前記脳マラリアは、P.falciparumからなる群より選択されるマラリア原虫に対応するヒトマラリア原虫によって生じる、項目23〜26のいずれか1項に記載の脳マラリアのマーカー。
(28)前記脳マラリアはげっ歯類または霊長類のものである、項目23〜27のいずれか1項に記載のマーカー。
(29)前記CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の少なくとも1つの因子は、配列番号1、3または5に記載の核酸配列もしくはそのフラグメントもしくは改変体または配列番号2、4または6に記載のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントもしくは改変体を含む、項目23〜28のいずれか1項に記載のマーカー。
(30)(1)CCL21タンパク質またはこれをコードする核酸;
(2)CXCR3またはこれをコードする核酸;および/または
(3)CCR7タンパク質またはこれをコードする核酸
を含む項目23〜29のいずれか1項に記載のマーカー。
(31)CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の少なくとも1つの因子、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも1つに結合する物質を含む、脳マラリアの検出剤または診断剤。
(32)前記検出剤は、抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、あるいは核酸である、項目31に記載の検出剤または診断剤。
(33)前記検出剤または診断剤は、標識されたものである、項目31または32に記載の検出剤または診断剤。
(34)前記検出剤または診断剤は、核酸であり、該核酸はプローブまたはプライマーである、項目31〜33のいずれか1項に記載の検出剤または診断剤。
(35)CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の少なくとも1つの因子のいずれかまたはその発現産物に結合する物質を用いる、脳マラリアを識別する方法。
(36)対象検体のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の少なくとも1つの因子のいずれかの発現が正常検体のものに比べて上昇している場合、該対象検体は脳マラリアを有すると診断されることを特徴とする、項目35に記載の方法。
(37)前記識別は、項目31〜34のいずれか1項に記載の検出剤または診断剤を用いて行われる、項目35または36に記載の方法。In the present specification, the inventors are a region in which the olfactory bulb (OLF) is physically damaged by the Plasmodium parasite and functionally impaired (loss of olfaction) in the mouse model and monkey model of CM (olfaction). It was revealed that high fever occurred. Two powerful imaging technologies, ultra-high magnetic field MRI and in vivo multiphoton microscopy, show that OLF undergoes parasite accumulation and cell blockage, followed by microbleeding due to palisade microcapillary structures. Visualized. Parasites that circulate in the OLF blood vessels release CCL21 that can be detected by OLF glomeruli and perivascular astrocytes at an early stage of infection and can attract CD11c + CD8 T cells via CXCR3. Thus, early detection of olfactory loss and immediate disturbance of pathological cell recruitment may provide a novel treatment for ECM. Accordingly, the present invention also provides the following.
(1) A method in which the state of the subject's olfactory bulb (OLF) is used as an index of brain malaria.
(2) The method according to item 1, wherein the state is determined by at least one selected from abnormal olfaction, cell examination, and diagnostic image of the olfactory bulb.
(3) The method according to item 2, wherein the olfactory abnormality is an abnormality in a test selected from the group consisting of a reference olfactory test and a vein olfactory test. (4) The method according to item 2 or 3, wherein the diagnostic image is obtained by nuclear magnetic resonance imaging (MRI).
(5) The method according to item 4, wherein the MRI is taken with a magnetic force of 7 T or more.
(6) The method according to any one of Items 2 to 5, wherein a spot is observed in the diagnostic image is an index of cerebral malaria.
(7) The method according to any one of Items 2 to 6, wherein the cell test is performed by staining or immunohistochemistry.
(8) The detection method according to any one of items 1 to 7, wherein the abnormality of the subject's olfactory bulb is an early indicator of morbidity.
(9) A method of diagnosing cerebral malaria, comprising measuring the state of a subject's olfactory bulb (OLF).
(10) The method according to item 9, wherein the abnormality of the subject's olfactory bulb is an indicator that the subject is suffering from cerebral malaria.
(11) A device for detecting or diagnosing cerebral malaria, including means for measuring the state of the olfactory bulb.
(12) The apparatus according to item 11, wherein the means is a magnetic resonance imaging (MRI) means.
(13) The apparatus according to item 12, wherein the MRI is an MRI of 7T or more.
(14) A preventive or therapeutic agent for cerebral malaria comprising an inhibitor of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system.
(15) The inhibitor of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system includes an inhibitor of at least one factor selected from the group consisting of CCL21, CXCR3 and CCR7, and nucleic acids encoding them. Item 15. The preventive or therapeutic agent for cerebral malaria according to Item 14.
(16) The inhibitor is a low molecular compound, an antibody or a fragment or functional equivalent thereof, siRNA, shRNA, antisense nucleic acid, aptamer, pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, or pharmaceutical thereof Item 16. The preventive or therapeutic agent for cerebral malaria according to Item 14 or 15, comprising at least one solvate of a salt acceptable in.
(17) Any of items 14 to 16, wherein the inhibitor comprises at least one antibody selected from the group consisting of an anti-CCL21 antibody, an anti-CXCR3 antibody, and an anti-CCR7 antibody, or a fragment or functional equivalent thereof The preventive or therapeutic agent for cerebral malaria according to claim 1.
(18) The inhibitor is any one of items 14 to 17, comprising at least two antibodies selected from the group consisting of an anti-CCL21 antibody, an anti-CXCR3 antibody, and an anti-CCR7 antibody, or a fragment or functional equivalent thereof The preventive or therapeutic agent for cerebral malaria according to item 1.
(19) The brain malaria according to any one of items 14 to 18, wherein the inhibitor comprises three types of antibodies, anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody and anti-CCR7 antibody, or fragments or functional equivalents thereof. Preventive or therapeutic agent.
(20) An inhibitor of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system for the prevention or treatment of cerebral malaria.
(21) The inhibitor according to item 20, further comprising the feature according to any one or more of items 15 to 19.
(22) A method for preventing or treating brain malaria in a subject, comprising administering an effective amount of an inhibitor of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system to the subject in need thereof.
(23) A marker for cerebral malaria comprising at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system.
(24) At least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system is at least one selected from the group consisting of CCL21, CXCR3, CCR7, and nucleic acids encoding them, their expression products and their derivatives. 24. The marker for brain malaria according to item 23.
(25) At least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system is at least selected from the group consisting of (1) IP-10 (CXCR3 ligand), CXCL11 (I-TAC), and CXCL9 (MIG) One inflammatory cytokine and at least one selected from the group consisting of nucleic acids encoding them, their expression products and their derivatives;
(2) CCL21 and / or CCL19
(3) comprising at least one factor selected from the group consisting of: CD8α dendritic cells and other dendritic cells; and (4) CD8 T cells and other T cells.
Item 25. The marker for brain malaria according to item 23 or 24.
(26) (A) Increased expression of CCL21 and / or CCL19 in the olfactory bulb;
(B) Increased expression of IFN-γ in the cortex;
(C) that the CD8α dendritic cells are observed to be primed in a CCR7-dependent manner; and / or (D) that activated CD8 T cells are observed in the brain or spleen. The marker for brain malaria according to any one of items 23 to 25.
(27) The cerebral malaria is 27. The marker for brain malaria according to any one of items 23 to 26, which is caused by a human malaria parasite corresponding to a malaria parasite selected from the group consisting of falciparum.
(28) The marker according to any one of items 23 to 27, wherein the brain malaria is a rodent or a primate.
(29) The at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system is a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3 or 5, or a fragment or variant thereof, or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6. Alternatively, the marker according to any one of items 23 to 28, comprising a fragment or a variant thereof.
(30) (1) CCL21 protein or a nucleic acid encoding the same;
30. The marker according to any one of items 23 to 29, comprising (2) CXCR3 or a nucleic acid encoding the same; and / or (3) CCR7 protein or a nucleic acid encoding the same.
(31) Brain malaria comprising a substance that binds to at least one factor selected from the group consisting of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system and a nucleic acid encoding them, an expression product thereof, and a derivative thereof. Detection agent or diagnostic agent.
(32) The detection agent or diagnostic agent according to item 31, wherein the detection agent is an antibody, a fragment or functional equivalent thereof, or a nucleic acid.
(33) The detection agent or diagnostic agent according to item 31 or 32, wherein the detection agent or diagnostic agent is labeled.
(34) The detection agent or diagnostic agent according to any one of items 31 to 33, wherein the detection agent or diagnostic agent is a nucleic acid, and the nucleic acid is a probe or a primer.
(35) A method for identifying cerebral malaria using a substance that binds to any of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system or an expression product thereof.
(36) If the expression of any of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system of the target sample is increased compared to that of a normal sample, the target sample is diagnosed as having brain malaria 36. The method according to item 35.
(37) The method according to item 35 or 36, wherein the identification is performed using the detection agent or diagnostic agent according to any one of items 31 to 34.
本発明において、上記1または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。 In the present invention, it is contemplated that the one or more features may be provided in further combinations in addition to the explicit combinations. Still further embodiments and advantages of the present invention will be recognized by those of ordinary skill in the art upon reading and understanding the following detailed description as necessary.
本発明は従来存在しなかった、脳マラリアの診断および治療技術を提供する。 The present invention provides a diagnosis and treatment technique for cerebral malaria that has not existed previously.
以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞(例えば、英語の場合は「a」、「an」、「the」など)は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書(定義を含めて)が優先する。 Hereinafter, the present invention will be described with reference to the best mode. Throughout this specification, it should be understood that the singular forms also include the plural concept unless specifically stated otherwise. Thus, it should be understood that singular articles (eg, “a”, “an”, “the”, etc. in the case of English) also include the plural concept unless otherwise stated. In addition, it is to be understood that the terms used in the present specification are used in the meaning normally used in the art unless otherwise specified. Thus, unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を適宜説明する。 Hereinafter, definitions of terms particularly used in the present specification will be described as appropriate.
本明細書において「脳マラリア」とは、Plasmodium falciparum(P.falciparum)マラリアの最も致命的な合併症であり、血液脳関門(BBB)の破壊に起因して生じるとされる。意識低下、言語のもつれなどの神経症状が起こるとされており、進行すると昏睡状態に陥り、死亡するとされている。脳マラリア(CM)の病理を理解するために、P.berghei ANKA(PbA)寄生虫を使用したCMのマウスモデルが広く用いられており(Langhorne,J.ら(2011).Malar J 10,23.)、このマウスモデルにおける結果は、当該分野においてヒトに外挿可能であるとされている。 As used herein, “brain malaria” is the most lethal complication of Plasmodium falciparum (P. falciparum) malaria and is attributed to the destruction of the blood brain barrier (BBB). It is said that neurological symptoms such as decreased consciousness and language tangles occur, and if it progresses, it falls into a coma and is said to die. To understand the pathology of cerebral malaria (CM), The mouse model of CM using the berghei ANKA (PbA) parasite has been widely used (Langhorne, J. et al. (2011). Malar J 10, 23.), and the results in this mouse model are It can be extrapolated.
本明細書において「嗅球(OLFと略称することがある)」とは、当該分野で慣用されるのと同じ意味で用いられ、嗅葉前端の***であり、終脳の前端に位置し球状に突出した構造をしている。内部は層構造を示す主嗅球および副嗅球があり、それぞれ化学感覚受容器である嗅覚器からの嗅神経と鋤鼻器官からの鋤鼻神経が終始するとされている。嗅覚情報処理において重要な役割を果たすとされる。 As used herein, “olfactory bulb (sometimes abbreviated as OLF)” is used in the same meaning as is commonly used in the art, and is a bulge at the front end of the olfactory lobe, located at the front end of the telencephalon and spherical. Has a protruding structure. Inside, there are the main olfactory bulb and the accessory olfactory bulb showing a layer structure, and it is said that the olfactory nerve from the olfactory organ, which is a chemosensory receptor, and the vomeronasal nerve from the vomeronasal organs are all over. It is said to play an important role in olfactory information processing.
本明細書において「嗅球の状態」は、嗅球の外見上、構造上または機能上の状態を包含する。より詳細には、嗅球の状態は、嗅覚異常、細胞検査および嗅球の診断画像等によって判定することができるが、これに限定されない。 In the present specification, “the state of the olfactory bulb” includes an appearance, a structure or a functional state of the olfactory bulb. More specifically, the state of the olfactory bulb can be determined by an olfactory abnormality, a cell examination, a diagnostic image of the olfactory bulb, and the like, but is not limited thereto.
本明細書において「超高磁場」の核磁気共鳴画像法(MRI)とは、現在臨床用として使用されている3テスラの磁場を超える高い磁場でのMRIをいい、例えば、約4テスラ以上、約5テスラ以上、約6テスラ以上、約7テスラ以上などをさす。実施例では、11.7テスラのものが使用され、嗅球の状態を判定することができている。 As used herein, “ultra high magnetic field” nuclear magnetic resonance imaging (MRI) refers to MRI at a high magnetic field exceeding the magnetic field of 3 Tesla currently used for clinical use, for example, about 4 Tesla or more, About 5 Tesla or more, about 6 Tesla or more, about 7 Tesla or more. In the embodiment, 11.7 Tesla is used, and the state of the olfactory bulb can be determined.
本明細書において診断画像における「スポット」とは、正常な状態で見出される嗅球においては密に詰まった映像において、斑点状のものが見えることをいう。機能不全が推定される。 In this specification, a “spot” in a diagnostic image means that a spot-like image can be seen in a densely packed image in an olfactory bulb found in a normal state. Dysfunction is presumed.
本明細書において、「細胞検査」は当該分野において慣用されるのと同じ意味を持ち、染色(例えば、HE染色)や免疫組織化学法等の染色が含まれる。 In the present specification, “cell examination” has the same meaning as commonly used in the art, and includes staining such as staining (for example, HE staining) and immunohistochemistry.
本明細書において、「CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系」または「CCL21−CXCR3−CCR7軸」とは、CCL21、CXCR3およびCCR7を経路とするシグナルの伝達経路をいい、脳マラリアの発症メカニズムのことをいう。その模式図は図7に示される。「CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系」の因子は、CCL21、CXCR3およびCCR7のほか、IP−10(CXCR3リガンド)、CXCL11(I−TAC),CXCL9(MIG)、インターロイキン(IL)−6、IL−12p40、インターフェロン(IFN)−γ、KC、MCP−1(CCR2リガンド)、MIP−1α、MIP−1β、およびRANTESからなる群より選択される少なくとも1つの炎症性サイトカイン、CD8α樹状細胞(DC)、CD11c+ CD8T細胞などもこの因子として考慮することができる。いったん宿主がマラリア原虫に感染すると、血液や脾臓などの末梢において免疫細胞が活性化される。脾臓における感染により活性化されたCD8α+樹状細胞が、CCR7の発現を介してCD8 T細胞に対して抗原をクロスプライミングする能力を獲得する。活性化されたCD8 T細胞の一部は、CD11cおよび/またはCXCR3を発現することによって、エフェクターの表現型となる。これらの活性化された免疫細胞、感染赤血球(iRBC)または寄生虫の産生物が、OLFの糸球内の血管付近の星状細胞およびその周囲のエンドフィートによって感知され、これにより、星状細胞からの段階的なCCL21分泌を誘導し、プライムされた免疫細胞に対するBBB出入口を開口すると考えられる。活性化されたCD8 T細胞は、OLFへと特異的に移動し、ここでCCL21が分泌され、OLFにおける発熱および出血につながると考えられる。In this specification, “CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system” or “CCL21-CXCR3-CCR7 axis” refers to the signal transduction pathway of CCL21, CXCR3 and CCR7, and refers to the pathogenesis mechanism of brain malaria. Say. The schematic diagram is shown in FIG. Factors of “CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system” include CCL21, CXCR3 and CCR7, as well as IP-10 (CXCR3 ligand), CXCL11 (I-TAC), CXCL9 (MIG), interleukin (IL) -6, At least one inflammatory cytokine selected from the group consisting of IL-12p40, interferon (IFN) -γ, KC, MCP-1 (CCR2 ligand), MIP-1α, MIP-1β, and RANTES, CD8α dendritic cells ( DC), CD11c + CD8 T cells, etc. can also be considered as this factor. Once the host is infected with Plasmodium, immune cells are activated in the periphery such as blood and spleen. CD8α + dendritic cells activated by infection in the spleen acquire the ability to cross-prime antigen to CD8 T cells via CCR7 expression. Some activated CD8 T cells become effector phenotypes by expressing CD11c and / or CXCR3. The products of these activated immune cells, infected red blood cells (iRBCs) or parasites are sensed by the astrocytes near the blood vessels in the OLF glomerulus and their surrounding end feet, thereby It is thought to induce gradual CCL21 secretion from and open the BBB entry / exit for primed immune cells. Activated CD8 T cells migrate specifically to OLF, where CCL21 is secreted, which is thought to lead to fever and bleeding in the OLF.
本明細書において「CCL21」とは、CCR7の内因性リガンドであり、高内皮細静脈(そこを通ってリンパ球が血液を離れリンパ節に入るように特化した血管)にみられるとされるケモカインリガンドであり、CCサブファミリーのメンバーである。6Ckine、CKb9、ECL、SCYA21、SLC、TCA4ともいわれる。ヒトCCL21の核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれNCBI登録番号NM_002989(配列番号1)およびNP_002980(配列番号2)に開示されており、マウスの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、NM_011124およびNP_035254に開示されており、本明細書でもこれらの情報を援用する。CCL21としては、OMIM:602737とのアクセッション番号で同定されうる。本明細書の目的で使用される場合は、「CCL21」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質(あるいはそれをコードする核酸)のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。 As used herein, “CCL21” is an endogenous ligand for CCR7 and is found in high endothelial venules (specialized blood vessels through which lymphocytes leave the blood and enter lymph nodes) It is a chemokine ligand and a member of the CC subfamily. It is also called 6Ckine, CKb9, ECL, SCYA21, SLC, TCA4. The nucleic acid sequence and amino acid sequence of human CCL21 are disclosed in NCBI accession numbers NM_002989 (SEQ ID NO: 1) and NP_002980 (SEQ ID NO: 2), respectively, and the mouse nucleic acid sequence and amino acid sequence are disclosed in NM_011124 and NP_035254, respectively. This information is also incorporated herein. The CCL 21 can be identified by an accession number with OMIM: 602737. When used for the purposes of this specification, “CCL21” is not only a protein having an amino acid sequence described in a specific sequence number or accession number (or a nucleic acid encoding it), but also functionally active. Derivatives thereof, or functionally active fragments thereof, or homologues thereof, or variants encoded by nucleic acids that hybridize to nucleic acids encoding this protein under high or low stringency conditions. , Understood to mean.
なお、本発明で挙げる他のタンパク質すべてにも同じことがあてはまる。従って、既定のタンパク質または核酸の名称は、配列表に示すようなタンパク質または核酸を指すだけでなく、機能的に活性な誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシー条件下で、好ましくは上述のような条件下で、前記タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、指す。本明細書で使用される「誘導体」または「構成要素タンパク質の類似体」または「変異体」は、好ましくは、限定を意図するものではないが、構成要素タンパク質に実質的に相同な領域を含む分子を含み、このような分子は、種々の実施形態において、同一サイズのアミノ酸配列にわたり、または当該分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによってアラインメントを行ってアラインされる配列と比較した際、少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%同一であるか、あるいはこのような分子をコードする核酸は、ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、またはストリンジェントでない条件下で、構成要素タンパク質をコードする配列にハイブリダイズ可能である。これは、それぞれ、アミノ酸置換、欠失および付加によって、天然存在タンパク質を修飾した所産であり、その誘導体がなお天然存在タンパク質の生物学的機能を、必ずしも同じ度合いでなくてもよいが示すタンパク質を意味する。例えば、本明細書において記載されあるいは当該分野で公知の適切で利用可能なin vitroアッセイによって、このようなタンパク質の生物学的機能を調べることも可能である。 The same applies to all other proteins mentioned in the present invention. Thus, a given protein or nucleic acid name refers not only to a protein or nucleic acid as shown in the sequence listing, but also to a functionally active derivative, or a functionally active fragment thereof, or a homologue thereof, or a high stringency. It also refers to a variant encoded by a nucleic acid that hybridizes to a nucleic acid encoding said protein under conditions of genency or low stringency, preferably under conditions as described above. As used herein, a “derivative” or “analog of a component protein” or “variant” preferably includes, but is not intended to be limited, a region that is substantially homologous to the component protein. Such molecules, in various embodiments, at least 30% when compared to sequences aligned over amino acid sequences of the same size, or aligned by computer homology programs known in the art. , 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% or 99% identical or a nucleic acid encoding such a molecule is moderately stringent under stringent conditions Hybridize to sequences encoding component proteins under mild or non-stringent conditionsThis is a product of a naturally occurring protein modified by amino acid substitutions, deletions and additions, respectively, and derivatives thereof that do not necessarily exhibit the same degree of biological function of the naturally occurring protein. means. For example, the biological function of such proteins can be examined by suitable and available in vitro assays described herein or known in the art.
ヒト以外の多くの哺乳動物が本発明のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子(例えば、CCL21タンパク質)を発現していることが知られているため、これらの哺乳動物についても、本発明の範囲内に入ることが理解される。 Since many mammals other than humans are known to express the CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system factor (for example, CCL21 protein) of the present invention, these mammals are also of the present invention. It is understood that it falls within the scope.
本明細書で使用される「機能的に活性な」は、本明細書において、本発明のポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体が関連する態様に従って、生物学的活性などの、タンパク質の構造的機能、制御機能、または生化学的機能を有する、ポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体を指す。本発明において、CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子(例えば、CCL21)のフラグメントとは、タンパク質または核酸の場合、CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の任意の領域を含むポリペプチドであり、本発明の目的を達成し得る限り天然のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の生物学的機能を有していなくてもよい。 As used herein, “functionally active” as used herein refers to the structural function of a protein, such as biological activity, according to the embodiment to which the polypeptide of the invention, ie, fragment or derivative, relates. Refers to a polypeptide, ie fragment or derivative, having a regulatory or biochemical function. In the present invention, a CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factor fragment (for example, CCL21) is a polypeptide containing any region of a CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factor in the case of a protein or nucleic acid. As long as the object of the present invention can be achieved, it does not have to have a biological function of a natural CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system factor.
CCL21の代表的なヌクレオチド配列は、
(a)配列番号1に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(d)配列番号1に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド;
(e)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド;
(f)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または
(g)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも70%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、CCL21の有する活性をいう。A typical nucleotide sequence of CCL21 is:
(A) a polynucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a fragment sequence thereof;
(B) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof;
(C) a variant polypeptide or fragment thereof in which one or more amino acids have one mutation selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, A polynucleotide that encodes a variant polypeptide having functional activity;
(D) a polynucleotide which is a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof;
(E) a polynucleotide encoding a species homologue of the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof;
(F) a polynucleotide that hybridizes to a polynucleotide of any one of (a) to (e) under stringent conditions and encodes a polypeptide having biological activity; or (g) (a) to The polynucleotide may be a polynucleotide that consists of a base sequence that is at least 70% identical to any one polynucleotide of (e) or a complementary sequence thereof, and encodes a polypeptide having biological activity. Here, biological activity typically refers to the activity of CCL21.
CCL21のアミノ酸配列としては、
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が置換、付加および
欠失からなる群より選択される1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド;
(c)配列番号1に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド;
(d)配列番号2に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド;または
(e)(a)〜(d)のいずれか1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70%であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、CCL21の有する活性をいう。As the amino acid sequence of CCL21,
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof;
(B) a polypeptide having one mutation in which one or more amino acids are selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and having biological activity;
(C) a polypeptide encoded by a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(D) a polypeptide that is a species homologue of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2; or (e) an amino acid sequence that is at least 70% identical to any one polypeptide of (a)-(d) And a polypeptide having biological activity. Here, biological activity typically refers to the activity of CCL21.
本明細書において「CXCR3」とは、当該分野で慣用されるのと同じ意味を有し、Gタンパク質共役受容体であるCXCケモカインレセプターファミリーの1つである。Gタンパク質共役受容体9(GPR9)やCD183のほか、CD182;CKR−L2;CMKAR3;IP10−R;Mig−R;MigRなどとも呼ばれることがある。2つの変異体があるとされており、CXCR3−AおよびCXCR3−Bの二種類がある。CXCR3−Aは、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP−10)およびCXCL11(I−TAC)に結合するとされており、CXCR3−Bは、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP−10)およびCXCL11 (I−TAC)に加えてCXCL4にも結合し得るとされている。ヒトCXCR3の核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれNCBI登録番号NM_001142797(配列番号3)およびNP_001136269(配列番号4)に開示されており、マウスの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、NM_009910およびNP_034040に開示されており、本明細書でもこれらの情報を援用する。CXCR3としては、OMIM:300574とのアクセッション番号で同定されうる。本明細書の目的で使用される場合は、「CXCR3」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質(あるいはそれをコードする核酸)のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。 In the present specification, “CXCR3” has the same meaning as commonly used in the art, and is one of the CXC chemokine receptor family that is a G protein-coupled receptor. In addition to G protein-coupled receptor 9 (GPR9) and CD183, CD182; CKR-L2; CMKAR3; IP10-R; Mig-R; There are two variants, and there are two types: CXCR3-A and CXCR3-B. CXCR3-A is supposed to bind to CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP-10) and CXCL11 (I-TAC), and CXCR3-B is CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP-10) and CXCL11 (I -TAC) and CXCL4. The nucleic acid sequence and amino acid sequence of human CXCR3 are disclosed in NCBI accession numbers NM_001142797 (SEQ ID NO: 3) and NP_001136269 (SEQ ID NO: 4), respectively, and the mouse nucleic acid sequence and amino acid sequence are disclosed in NM_009910 and NP_034040, respectively. This information is also incorporated herein. CXCR3 can be identified by an accession number with OMIM: 300574. As used herein, “CXCR3” is not only a protein having an amino acid sequence described in a specific SEQ ID NO or accession number (or a nucleic acid encoding it), but also functionally active. Derivatives thereof, or functionally active fragments thereof, or homologues thereof, or variants encoded by nucleic acids that hybridize to nucleic acids encoding this protein under high or low stringency conditions. , Understood to mean.
CXCR3の代表的なヌクレオチド配列は、
(a)配列番号3に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号4に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(d)配列番号3に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド;
(e)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド;
(f)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または
(g)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも70%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、CXCR3の有する活性をいう。A typical nucleotide sequence of CXCR3 is:
(A) a polynucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or a fragment sequence thereof;
(B) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or a fragment thereof;
(C) a variant polypeptide or fragment thereof in which one or more amino acids have one mutation selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, A polynucleotide that encodes a variant polypeptide having functional activity;
(D) a polynucleotide which is a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or a fragment thereof;
(E) a polynucleotide encoding a species homologue of the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or a fragment thereof;
(F) a polynucleotide that hybridizes to a polynucleotide of any one of (a) to (e) under stringent conditions and encodes a polypeptide having biological activity; or (g) (a) to The polynucleotide may be a polynucleotide that consists of a base sequence that is at least 70% identical to any one polynucleotide of (e) or a complementary sequence thereof, and encodes a polypeptide having biological activity. Here, the biological activity typically means the activity of CXCR3.
CXCR3のアミノ酸配列としては、
(a)配列番号4に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド;
(b)配列番号4に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド;
(c)配列番号3に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド;
(d)配列番号4に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド;または
(e)(a)〜(d)のいずれか1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70%であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、CXCR3の有する活性をいう。As the amino acid sequence of CXCR3,
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or a fragment thereof;
(B) a polypeptide having one mutation in which one or more amino acids are selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and having biological activity;
(C) a polypeptide encoded by a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3;
(D) a polypeptide that is a species homologue of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4; or (e) an amino acid sequence that is at least 70% identical to any one polypeptide of (a)-(d) And a polypeptide having biological activity. Here, the biological activity typically refers to the activity of CXCR3.
本明細書において「CCR7」とは、当該分野で慣用されるのと同じ意味を有し、chemokine(C−C motif)receptor 7の略称であり、ケモカインレセプターの一つである。CCR7には2種類の内因性リガンドが存在する。1つはCCL21で、これは高内皮細静脈(そこを通ってリンパ球が血液を離れリンパ節に入るように特化した血管)にみられる。もう1つはCCL19で、これはリンパ節のT細胞域(T細胞がB細胞とは分かれて集合している部位)に存在するとされている。BLR2;CD197;CDw197;CMKBR7;EBI1などとも呼ばれることがある。ヒトCCR7の核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれNCBI登録番号NM_001838(配列番号5)およびNP_001829(配列番号6)に開示されており、マウスの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、NM_007719およびNP_031745に開示されており、本明細書でもこれらの情報を援用する。CCR7としては、OMIM:600242とのアクセッション番号で同定されうる。本明細書の目的で使用される場合は、「CCR7」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質(あるいはそれをコードする核酸)のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。 In the present specification, “CCR7” has the same meaning as commonly used in the art, is an abbreviation for chemokine (C-C motif) receptor 7, and is one of chemokine receptors. There are two types of endogenous ligands in CCR7. One is CCL21, which is found in high endothelial venules (specialized blood vessels through which lymphocytes leave the blood and enter lymph nodes). The other is CCL19, which is said to be present in the T cell region of lymph nodes (site where T cells are separated from B cells and gather). BLR2; CD197; CDw197; CMKBR7; EBI1, etc. The nucleic acid sequence and amino acid sequence of human CCR7 are disclosed in NCBI accession numbers NM_001838 (SEQ ID NO: 5) and NP_001829 (SEQ ID NO: 6), respectively, and the mouse nucleic acid sequence and amino acid sequence are disclosed in NM_007719 and NP_031745, respectively. This information is also incorporated herein. CCR7 can be identified by an accession number with OMIM: 60000242. As used herein, “CCR7” is not only a protein having an amino acid sequence described in a specific sequence number or accession number (or a nucleic acid encoding it), but also functionally active. Derivatives thereof, or functionally active fragments thereof, or homologues thereof, or variants encoded by nucleic acids that hybridize to nucleic acids encoding this protein under high or low stringency conditions. , Understood to mean.
CCR7の代表的なヌクレオチド配列は、
(a)配列番号5に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号6に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(d)配列番号5に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド;
(e)配列番号6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド;
(f)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または
(g)(a)〜(e)のいずれか1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも70%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、CCR7の有する活性をいう。A typical nucleotide sequence of CCR7 is:
(A) a polynucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or a fragment sequence thereof;
(B) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or a fragment thereof;
(C) a variant polypeptide or fragment thereof in which one or more amino acids have one mutation selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, A polynucleotide that encodes a variant polypeptide having functional activity;
(D) a polynucleotide which is a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or a fragment thereof;
(E) a polynucleotide encoding a species homologue of the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or a fragment thereof;
(F) a polynucleotide that hybridizes to a polynucleotide of any one of (a) to (e) under stringent conditions and encodes a polypeptide having biological activity; or (g) (a) to The polynucleotide may be a polynucleotide that consists of a base sequence that is at least 70% identical to any one polynucleotide of (e) or a complementary sequence thereof, and encodes a polypeptide having biological activity. Here, the biological activity typically means the activity of CCR7.
CCR7のアミノ酸配列としては、
(a)配列番号6に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド;
(b)配列番号6に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド;
(c)配列番号5に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド;
(d)配列番号6に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド;または
(e)(a)〜(d)のいずれか1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70%であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、CCR7の有する活性をいう。As an amino acid sequence of CCR7,
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or a fragment thereof;
(B) a polypeptide having one mutation in which one or more amino acids are selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 and having biological activity;
(C) a polypeptide encoded by a splice variant or allelic variant of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5;
(D) a polypeptide that is a species homologue of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6; or (e) an amino acid sequence that is at least 70% identical to any one polypeptide of (a)-(d) And a polypeptide having biological activity. Here, the biological activity typically means the activity of CCR7.
このほかにも、CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子は存在し、例えば、以下を挙げることができる:
(1)IP−10(CXCR3リガンド)、CXCL11(I−TAC)、およびCXCL9(MIG)からなる群より選択される少なくとも1つの炎症性サイトカイン、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも1つ;
(2)CCL21および/またはCCL19(3)CD8α樹状細胞および他の樹状細胞;ならびに
(4)CD8T細胞および他のT細胞。In addition, there are other factors of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system, and examples thereof include the following:
(1) At least one inflammatory cytokine selected from the group consisting of IP-10 (CXCR3 ligand), CXCL11 (I-TAC), and CXCL9 (MIG), and a nucleic acid encoding them, its expression product and its origin At least one selected from the group consisting of:
(2) CCL21 and / or CCL19 (3) CD8α dendritic cells and other dendritic cells; and (4) CD8 T cells and other T cells.
これらはいずれも、当該分野で公知の手法を用いて同定することができる。そのような手法として参考にできる文献として本明細書において他に言及した文献等を挙げることができる。 Any of these can be identified using techniques known in the art. Examples of documents that can be referred to as such a technique include documents mentioned elsewhere in this specification.
本発明の関連において、「CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子に結合する物質」または「CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の相互作用分子」は、少なくとも一時的にCCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子に結合し、そして好ましくは、結合したことを表示しうる(例えば標識されるか標識可能な状態である)、分子または物質である。CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子(例えば、CCL21、CXCR3、CCR7等)に結合する物質はCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子(例えば、CCL21、CXCR3、CCR7等)の阻害剤であってもよく、その例としては、抗体、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、siRNA、低分子量分子(LMW)、結合性ペプチド、アプタマー、リボザイムおよびペプチド模倣体(peptidomimetic)等を挙げることができ、CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子(例えば、CCL21、CXCR3、CCR7等)に対して向けられる、特にCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子(例えば、CCL21、CXCR3、CCR7等)の活性部位に対して指向される、結合性タンパク質または結合性ペプチド、並びにCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子(例えば、CCL21、CXCR3、CCR7等)の遺伝子(核酸)に対して指向される核酸も含まれる。CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子(例えば、CCL21、CXCR3、CCR7等)に対する核酸は、例えばCCL21遺伝子の発現またはCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子(例えば、CCL21、CXCR3、CCR7等)の活性を阻害する、二本鎖または一本鎖DNAまたはRNA、あるいはその修飾物または誘導体を指し、そして限定なしに、アンチセンス核酸、アプタマー、siRNA(低分子干渉RNA)およびリボザイムを含む。本明細書において、CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子(例えば、CCL21、CXCR3、CCR7等)について「結合性タンパク質」または「結合性ペプチド」とは、CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子に結合する種類のタンパク質またはペプチドを指し、そしてCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子(例えば、CCL21、CXCR3、CCR7等)に対して指向されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、抗体フラグメントおよびタンパク質骨格を含むがこれらに限定されない。 In the context of the present invention, “a substance that binds to a factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system” or “an interacting molecule of a factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system” at least temporarily refers to CCL21, CXCR3, CCR7. It is a molecule or substance that binds to a factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system, such as, and is preferably capable of indicating that it is bound (eg, labeled or labelable). A substance that binds to a CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factor (eg, CCL21, CXCR3, CCR7, etc.) is an inhibitor of a CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factor (eg, CCL21, CXCR3, CCR7, etc.). Examples thereof may include antibodies, antisense oligonucleotides, siRNA, low molecular weight molecules (LMW), binding peptides, aptamers, ribozymes and peptidomimetics, etc. CCL21-CXCR3 -Activity of factors of CCR21-CXCR3-CCR7 signaling system (for example, CCL21, CXCR3, CCR7, etc.) directed against CCR7 signaling system factors (for example, CCL21, CXCR3, CCR7, etc.) A binding protein or binding peptide that is directed to a position, and a nucleic acid directed to a gene (nucleic acid) of a CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system factor (eg, CCL21, CXCR3, CCR7, etc.) included. Nucleic acids for CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system factors (for example, CCL21, CXCR3, CCR7, etc.) include, for example, CCL21 gene expression or CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system factors (for example, CCL21, CXCR3, CCR7, etc.) Refers to double- or single-stranded DNA or RNA, or a modification or derivative thereof, and includes, without limitation, antisense nucleic acids, aptamers, siRNA (small interfering RNA) and ribozymes. In the present specification, the term “binding protein” or “binding peptide” refers to a factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system with respect to factors of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system (for example, CCL21, CXCR3, CCR7, etc.). Polyclonal or monoclonal antibodies, antibody fragments and protein backbones that are directed against the type of protein or peptide that binds to CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system factors (eg, CCL21, CXCR3, CCR7, etc.) Including but not limited to.
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変(例えば、標識成分との結合体化)が包含される。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の1または2以上のアナログを含むポリペプチド(例えば、非天然アミノ酸などを含む)、ペプチド様化合物(例えば、ペプトイド)および当該分野において公知の他の改変が包含される。本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。 As used herein, “protein”, “polypeptide”, “oligopeptide” and “peptide” are used interchangeably herein and refer to a polymer of amino acids of any length. This polymer may be linear, branched, or cyclic. The amino acid may be natural or non-natural and may be a modified amino acid. The term can also encompass one assembled into a complex of multiple polypeptide chains. This term also encompasses natural or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component). This definition also includes, for example, polypeptides containing one or more analogs of amino acids (eg, including unnatural amino acids, etc.), peptide-like compounds (eg, peptoids) and other modifications known in the art. Is done. In the present specification, the “amino acid” may be natural or non-natural as long as the object of the present invention is satisfied.
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、2’−0−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がN3’−P5’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC−5プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC−5チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがC−5プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン(phenoxazine−modified cytosine)で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、DNA中のリボースが2’−0−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが2’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体(例えば、縮重コドン置換体)および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、1またはそれ以上の選択された(または、すべての)コドンの3番目の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る(Batzeret al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605−2608(1985);Rossoliniet al.,Mol.Cell.Probes 8:91−98(1994))。本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。 As used herein, “polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” are used interchangeably herein and refer to a polymer of nucleotides of any length. The term also includes “oligonucleotide derivatives” or “polynucleotide derivatives”. “Oligonucleotide derivatives” or “polynucleotide derivatives” refer to oligonucleotides or polynucleotides that include derivatives of nucleotides or that have unusual linkages between nucleotides, and are used interchangeably. Specific examples of such an oligonucleotide include, for example, 2′-0-methyl-ribonucleotide, an oligonucleotide derivative in which a phosphodiester bond in an oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, and a phosphodiester bond in an oligonucleotide. Is an N3′-P5 ′ phosphoramidate bond oligonucleotide derivative, an oligonucleotide derivative in which the ribose and phosphodiester bonds in the oligonucleotide are converted to peptide nucleic acid bonds, and the uracil in the oligonucleotide is C- Oligonucleotide derivatives substituted with 5-propynyluracil, oligonucleotide derivatives wherein uracil in oligonucleotide is substituted with C-5 thiazole uracil, cytosine in oligonucleotide is C-5 propynylcytosine Substituted oligonucleotide derivatives, oligonucleotide derivatives in which the cytosine in the oligonucleotide is replaced with phenoxazine-modified cytosine, oligonucleotide derivatives in which the ribose in the DNA is replaced with 2'-0-propylribose Examples thereof include oligonucleotide derivatives in which the ribose in the oligonucleotide is substituted with 2′-methoxyethoxyribose. Unless otherwise indicated, a particular nucleic acid sequence may also be conservatively modified (eg, degenerate codon substitutes) and complementary sequences, as well as explicitly indicated sequences. Is contemplated. Specifically, a degenerate codon substitute creates a sequence in which the third position of one or more selected (or all) codons is replaced with a mixed base and / or deoxyinosine residue. (Batzeret al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes). 8: 91-98 (1994)). As used herein, “nucleic acid” is also used interchangeably with gene, cDNA, mRNA, oligonucleotide, and polynucleotide. In the present specification, the “nucleotide” may be natural or non-natural.
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいい、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」をさすことがある。 As used herein, “gene” refers to a factor that defines a genetic trait, and “gene” may refer to “polynucleotide”, “oligonucleotide”, and “nucleic acid”.
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。従って、ある2つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。2種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。2つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でDNA配列が、代表的には少なくとも50%同一である場合、好ましくは少なくとも70%同一である場合、より好ましくは少なくとも80%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。従って本明細書において「相同体」または「相同遺伝子産物」は、本明細書にさらに記載する複合体のタンパク質構成要素と同じ生物学的機能を発揮する、別の種、好ましくは哺乳動物におけるタンパク質を意味する。こうような相同体はまた、「オルソログ遺伝子産物」とも称されることもある。本発明の目的に合致する限り、このような相同体、相同遺伝子産物、オルソログ遺伝子産物等も用いることができることが理解される。 As used herein, “homology” of a gene refers to the degree of identity of two or more gene sequences to each other, and generally “having homology” means that the degree of identity or similarity is high. Say. Therefore, the higher the homology between two genes, the higher the sequence identity or similarity. Whether two genes have homology can be determined by direct comparison of the sequences or, in the case of nucleic acids, hybridization methods under stringent conditions. When directly comparing two gene sequences, the DNA sequence between the gene sequences is typically at least 50% identical, preferably at least 70% identical, more preferably at least 80%, 90% , 95%, 96%, 97%, 98% or 99% are identical, the genes have homology. Thus, as used herein, a “homologue” or “homologous gene product” is a protein in another species, preferably a mammal, that performs the same biological function as the protein component of the complex further described herein. Means. Such homologues may also be referred to as “ortholog gene products”. It will be appreciated that such homologues, homologous gene products, orthologous gene products and the like can be used as long as they meet the objectives of the present invention.
アミノ酸は、その一般に公知の3文字記号か、またはIUPAC−IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨される1文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された1文字コードにより言及され得る。本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるBLASTを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、NCBIのBLAST2.2.28(2013.4.2発行)を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記BLASTを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。類似性は、同一性に加え、類似のアミノ酸についても計算に入れた数値である。 Amino acids may be referred to herein by either their commonly known three letter symbols or by the one-letter symbols recommended by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nucleotides may also be referred to by the generally recognized one letter code. In this specification, the comparison of similarity, identity and homology between amino acid sequences and base sequences is calculated using default parameters using BLAST, which is a sequence analysis tool. The identity search can be performed using, for example, NCBI BLAST 2.2.28 (issued 2013.4.2). In the present specification, the identity value usually refers to a value when the BLAST is used and aligned under default conditions. However, if a higher value is obtained by changing the parameter, the highest value is taken as the identity value. When identity is evaluated in a plurality of regions, the highest value among them is set as the identity value. Similarity is a numerical value calculated for similar amino acids in addition to identity.
本発明の一実施形態において「数個」は、例えば、10、8、6、5、4、3、または2個であってもよく、それらいずれかの値以下であってもよい。1または数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、または他のアミノ酸による置換を受けたポリペプチドが、その生物学的活性を維持することは知られている(Market al.,Proc Natl Acad Sci U S A.1984 Sep;81(18):5662−5666.、Zoller et al.,Nucleic Acids Res.1982 Oct 25;10(20):6487−6500.、Wang et al.,Science.1984 Jun29;224(4656):1431−1433.)。欠失等がなされた抗体は、例えば、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、または抗体ファージライブラリを用いたバイオパニング等によって作製できる。部位特異的変異導入法としては、例えばKOD−Plus−Mutagenesis Kit(TOYOBO CO.,LTD.)を使用できる。欠失等を導入した変異型抗体から、野生型と同様の活性のある抗体を選択することは、FACS解析やELISA等の各種キャラクタリゼーションを行うことで可能である。 In one embodiment of the present invention, “several” may be, for example, 10, 8, 6, 5, 4, 3, or 2, or may be any value or less. Polypeptides that have undergone deletion, addition, insertion, or substitution with other amino acids of one or several amino acid residues are known to retain their biological activity (Market al., Proc Natl. Acad Sci USA 1984 Sep; 81 (18): 5662-5666., Zoller et al., Nucleic Acids Res.1982 Oct 25; 10 (20): 6487-6500., Wang et al., Science.1984. Jun 29; 224 (4656): 1431-1433.). An antibody having a deletion or the like can be produced by, for example, a site-specific mutagenesis method, a random mutagenesis method, or biopanning using an antibody phage library. As a site-specific mutagenesis method, for example, KOD-Plus-Mutageness Kit (TOYOBO CO., LTD.) Can be used. It is possible to select an antibody having the same activity as the wild type from mutant antibodies into which deletion or the like has been introduced by performing various characterizations such as FACS analysis and ELISA.
本発明の一実施形態において「90%以上」は、例えば、90、95、96、97、98、99、または100%以上であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。上記「相同性」は、2つもしくは複数間のアミノ酸配列において相同なアミノ酸数の割合を、当該技術分野で公知の方法に従って算定してもよい。割合を算定する前には、比較するアミノ酸配列群のアミノ酸配列を整列させ、同一アミノ酸の割合を最大にするために必要である場合はアミノ酸配列の一部に間隙を導入する。整列のための方法、割合の算定方法、比較方法、およびそれらに関連するコンピュータプログラムは、当該技術分野で従来からよく知られている(例えば、BLAST、GENETYX等)。本明細書において「相同性」は、特に断りのない限りNCBIのBLASTによって測定された値で表すことができる。BLASTでアミノ酸配列を比較するときのアルゴリズムには、Blastpをデフォルト設定で使用できる。測定結果はPositivesまたはIdentitiesとして数値化される。 In one embodiment of the present invention, “90% or more” may be, for example, 90, 95, 96, 97, 98, 99, or 100% or more, and is within the range of any two of them. Also good. The above-mentioned “homology” may be calculated according to a method known in the art, based on the ratio of the number of amino acids homologous in the amino acid sequence between two or more amino acids. Before calculating the ratio, the amino acid sequences of the group of amino acid sequences to be compared are aligned, and a gap is introduced into a part of the amino acid sequence when necessary to maximize the ratio of identical amino acids. Methods for alignment, percentage calculation, comparison methods, and related computer programs are well known in the art (eg, BLAST, GENETYX, etc.). In the present specification, “homology” can be represented by a value measured by BLAST of NCBI unless otherwise specified. Blastp can be used with the default setting for the algorithm when comparing amino acid sequences with BLAST. Measurement results are quantified as Positives or Identities.
本明細書において「ストリンジェント(な)条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のDNAを固定化したフィルターを用いて、0.7〜1.0MのNaCl存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC(saline−sodiumcitrate)溶液(1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウムである)を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。「ストリンジェントな条件」は、例えば、以下の条件を採用することができる。(1)洗浄のために低イオン強度および高温度を用いる(例えば、50℃で、0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1%のドデシル硫酸ナトリウム)、(2)ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いる(例えば、42℃で、50%(v/v)ホルムアミドと0.1%ウシ血清アルブミン/0.1%フィコール/0.1%のポリビニルピロリドン/50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、および750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウム)、または(3)20%ホルムアミド、5×SSC、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハード液、10%硫酸デキストラン、および20mg/mlの変性剪断サケ***DNAを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベーションし、次に約37−50℃で1×SSCでフィルターを洗浄する。なお、ホルムアミド濃度は50%またはそれ以上であってもよい。洗浄時間は、5、15、30、60、もしくは120分、またはそれら以上であってもよい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに影響する要素としては温度、塩濃度など複数の要素が考えられ、詳細はAusubelet al.,Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience Publishers,(1995)を参照することができる。「高度にストリンジェントな条件」の例は、0.0015M塩化ナトリウム、0.0015Mクエン酸ナトリウム、65〜68℃、または0.015M塩化ナトリウム、0.0015Mクエン酸ナトリウム、および50%ホルムアミド、42℃である。ハイブリダイゼーション、Molecular Cloning2nd ed.,Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1−38,DNA Cloning1:Core Techniques,A Practical Approach,Second Edition,Oxford UniversityPress(1995)などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、A配列のみまたはT配列のみを含む配列が除外される。中程度のストリンジェントな条件は、例えば、DNAの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することができ、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第3版、Vol.1、7.42−7.45 Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、5×SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)の前洗浄溶液、約40−50°Cでの、約50%ホルムアミド、2×SSC−6×SSC(または約42°Cでの約50%ホルムアミド中の、スターク溶液(Stark’s solution)などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液)のハイブリダイゼーション条件、および約60°C、0.5×SSC、0.1% SDSの洗浄条件の使用が含まれる。従って、本発明において使用されるポリペプチドには、本発明で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、高度または中程度でストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。 As used herein, “polynucleotide hybridizing under stringent conditions” refers to well-known conditions commonly used in the art. Such a polynucleotide can be obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like using a polynucleotide selected from among the polynucleotides of the present invention as a probe. Specifically, hybridization was performed at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter on which DNA derived from colonies or plaques was immobilized, and then 0.1 to 2 times the concentration. It means a polynucleotide that can be identified by washing a filter under conditions of 65 ° C. using a SSC (saline-sodium citrate) solution (composition of 1-fold concentration of SSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate). . As the “stringent conditions”, for example, the following conditions can be adopted. (1) Use low ionic strength and high temperature for washing (eg, 0.015 M sodium chloride / 0.0015 M sodium citrate / 0.1% sodium dodecyl sulfate at 50 ° C.), (2) Use denaturing agents such as formamide during hybridization (eg, at 42 ° C., 50% (v / v) formamide and 0.1% bovine serum albumin / 0.1% Ficoll / 0.1% polyvinylpyrrolidone / 50 mM PH 6.5 sodium phosphate buffer and 750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate), or (3) 20% formamide, 5 × SSC, 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5 × Denhardt's solution, 10 37% in a solution containing dextran sulfate and 20 mg / ml denatured sheared salmon sperm DNA Incubate overnight at 0 ° C, then wash the filter with 1X SSC at about 37-50 ° C. It should be noted that the formamide concentration may be 50% or higher. The cleaning time may be 5, 15, 30, 60, or 120 minutes, or longer. As factors affecting the stringency of the hybridization reaction, a plurality of factors such as temperature and salt concentration can be considered. , Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995). Examples of “highly stringent conditions” are 0.0015 M sodium chloride, 0.0015 M sodium citrate, 65-68 ° C., or 0.015 M sodium chloride, 0.0015 M sodium citrate, and 50% formamide, 42 ° C. Hybridization, Molecular Cloning 2nd ed. , Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford Universe. Here, the sequence containing only the A sequence or only the T sequence is preferably excluded from the sequences that hybridize under stringent conditions. Moderate stringent conditions can be readily determined by those skilled in the art based on, for example, the length of the DNA, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Vol. 1, 7.42-7.45 Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, and for nitrocellulose filters, 5 × SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0) pre-wash solution, About 50% formamide at about 40-50 ° C., 2 × SSC-6 × SSC (or other similar, such as Stark's solution in about 50% formamide at about 42 ° C. Hybridization conditions) and washing conditions of about 60 ° C., 0.5 × SSC, 0.1% SDS. Thus, a polypeptide used in the present invention is encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under highly or moderately stringent conditions to a nucleic acid molecule encoding a polypeptide specifically described in the present invention. Are also included.
本明細書において「精製された」物質または生物学的因子(例えば、核酸またはタンパク質など)とは、その物質または生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。従って、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い(すなわち濃縮されている)。本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも75重量%、より好ましくは少なくとも85重量%、よりさらに好ましくは少なくとも95重量%、そして最も好ましくは少なくとも98重量%の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本発明で用いられる物質または生物学的因子は、好ましくは「精製された」物質である。本明細書で使用される「単離された」物質または生物学的因子(例えば、核酸またはタンパク質など)とは、その物質または生物学的因子に天然に随伴する因子が実質的に除去されたものをいう。本明細書中で使用される用語「単離された」は、その目的に応じて変動するため、必ずしも純度で表示される必要はないが、必要な場合、好ましくは少なくとも75重量%、より好ましくは少なくとも85重量%、よりさらに好ましくは少なくとも95重量%、そして最も好ましくは少なくとも98重量%の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本発明で用いられる物質は、好ましくは「単離された」物質または生物学的因子である。 As used herein, a “purified” substance or biological factor (such as a nucleic acid or protein) refers to a substance from which at least a part of the factor naturally associated with the substance or biological factor has been removed. . Thus, typically, the purity of a biological agent in a purified biological agent is higher (ie, enriched) than the state in which the biological agent is normally present. The term “purified” as used herein is preferably at least 75% by weight, more preferably at least 85% by weight, even more preferably at least 95% by weight, and most preferably at least 98% by weight, It means that there is a biological agent of the same type. The substance or biological agent used in the present invention is preferably a “purified” substance. As used herein, an “isolated” substance or biological agent (such as a nucleic acid or protein) is substantially free of the factors that naturally accompany the substance or biological agent. Say things. The term “isolated” as used herein does not necessarily have to be expressed in purity, as it will vary depending on its purpose, but is preferably at least 75% by weight, more preferably if necessary. Means that there is at least 85%, more preferably at least 95%, and most preferably at least 98% by weight of the same type of biological agent. The materials used in the present invention are preferably “isolated” materials or biological agents.
本明細書において「対応する」アミノ酸または核酸あるいは部分とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子(例えば、CCL21、CXCR3、CCR7)において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸またはヌクレオチドあるいは部分と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドをいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいい、複合分子にあっては対応する部分(例えば、ヘパラン硫酸等)をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。対応するアミノ酸は、例えば、システイン化、グルタチオン化、S−S結合形成、酸化(例えば、メチオニン側鎖の酸化)、ホルミル化、アセチル化、リン酸化、糖鎖付加、ミリスチル化などがされる特定のアミノ酸であり得る。あるいは、対応するアミノ酸は、二量体化を担うアミノ酸であり得る。このような「対応する」アミノ酸または核酸は、一定範囲にわたる領域またはドメインであってもよい。従って、そのような場合、本明細書において「対応する」領域またはドメインと称される。このような対応する領域またはドメインは、本発明において複合分子を設計する場合に有用である。 As used herein, a “corresponding” amino acid or nucleic acid or moiety refers to a predetermined amino acid or polypeptide in a reference polypeptide or polynucleotide for comparison in a polypeptide molecule or polynucleotide molecule (eg, CCL21, CXCR3, CCR7). An amino acid or nucleotide that has, or is predicted to have, the same action as a nucleotide or moiety, especially in the case of enzyme molecules, present at the same position in the active site and make a similar contribution to catalytic activity It refers to an amino acid, and in the case of a complex molecule, it refers to the corresponding part (eg heparan sulfate). For example, an antisense molecule can be a similar part in an ortholog corresponding to a particular part of the antisense molecule. Corresponding amino acids, for example, cysteinylation, glutathioneation, SS bond formation, oxidation (eg methionine side chain oxidation), formylation, acetylation, phosphorylation, glycosylation, myristylation, etc. Of amino acids. Alternatively, the corresponding amino acid can be an amino acid responsible for dimerization. Such “corresponding” amino acids or nucleic acids may be regions or domains spanning a range. Thus, in such cases, it is referred to herein as a “corresponding” region or domain. Such corresponding regions or domains are useful when designing complex molecules in the present invention.
本明細書において「対応する」遺伝子(例えば、ポリヌクレオチド配列または分子)とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子(例えば、ポリヌクレオチド配列または分子)をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。従って、ヒトのCCL21、CXCR3、CCR7は、それぞれ、他の動物(特に哺乳動物)において、対応するCCL21、CXCR3、CCR7を見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。従って、例えば、ある動物(例えば、マウス)における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子(例えば、CCL21、CXCR3、CCR7等)は、配列番号1、3、5または配列番号2、4、6等の配列をクエリ配列として用いてその動物の配列を含むデータベースを検索することによって見出すことができる。 As used herein, a “corresponding” gene (eg, a polynucleotide sequence or molecule) has, or is expected to have, in a given species, the same effect as a given gene in the species that is the basis for comparison. A gene (for example, a polynucleotide sequence or molecule) refers to a gene that has the same evolutionary origin when there are a plurality of genes having such an action. Thus, a gene corresponding to a gene can be an ortholog of that gene. Accordingly, human CCL21, CXCR3, and CCR7 can find the corresponding CCL21, CXCR3, and CCR7 in other animals (particularly mammals), respectively. Such corresponding genes can be identified using techniques well known in the art. Therefore, for example, a corresponding gene in an animal (for example, mouse) is a reference gene of the corresponding gene (for example, CCL21, CXCR3, CCR7, etc.) is SEQ ID NO: 1, 3, 5 or SEQ ID NO: 2, 4 , 6 etc. as a query sequence and can be found by searching a database containing the animal's sequence.
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド(長さがn)に対して、1〜n−1までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ(例えば、11など)もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ(例えば、11など)もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、このようなフラグメントは、例えば、全長のものがマーカーまたは標的分子として機能する場合、そのフラグメント自体もまたマーカーまたは標的分子としての機能を有する限り、本発明の範囲内に入ることが理解される。 As used herein, “fragment” refers to a polypeptide or polynucleotide having a sequence length of 1 to n−1 with respect to a full-length polypeptide or polynucleotide (length is n). The length of the fragment can be appropriately changed according to the purpose. For example, the lower limit of the length is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 and more amino acids, and lengths expressed in integers not specifically listed here (eg, 11 etc.) are also suitable as lower limits obtain. In the case of polynucleotides, examples include 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 and more nucleotides. Non-integer lengths (eg, 11 etc.) may also be appropriate as a lower limit. In the present specification, such a fragment falls within the scope of the present invention, for example, when the full-length fragment functions as a marker or target molecule, as long as the fragment itself also functions as a marker or target molecule. Is understood.
本発明に従って、用語「活性」は、本明細書において、最も広い意味での分子の機能を指す。活性は、限定を意図するものではないが、概して、分子の生物学的機能、生化学的機能、物理的機能または化学的機能を含む。活性は、例えば、酵素活性、他の分子と相互作用する能力、および他の分子の機能を活性化するか、促進するか、安定化するか、阻害するか、抑制するか、または不安定化する能力、安定性、特定の細胞内位置に局在する能力を含む。適用可能な場合、この用語はまた、最も広い意味でのタンパク質複合体の機能にも関する。本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な抗体の生成、酵素活性、抵抗性の付与等を挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子(例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など)が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能(例えば、転写促進活性)を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。2つの因子が相互作用する場合、その生物学的活
性は、その二分子の間の結合およびそれによって生じる生物学的変化であり得、そして、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、2分子は結合していると考えられる。従って、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。従って、「活性」は、結合(直接的または間接的のいずれか)を示すかまたは明らかにするか;応答に影響する(すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する)、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が挙げられる。In accordance with the present invention, the term “activity” refers herein to the function of a molecule in the broadest sense. Activity is not intended to be limiting, but generally includes the biological function, biochemical function, physical function or chemical function of a molecule. Activity activates, promotes, stabilizes, inhibits, suppresses, or destabilizes, for example, enzyme activity, the ability to interact with other molecules, and the function of other molecules Ability, stability, and ability to localize to specific intracellular locations. Where applicable, the term also relates to the function of the protein complex in the broadest sense. As used herein, “biological function” refers to a specific function that a gene, nucleic acid molecule or polypeptide may have in vivo when referring to a gene or a nucleic acid molecule or polypeptide related thereto. Examples of the antibody include, but are not limited to, generation of specific antibodies, enzyme activity, and imparting resistance. As used herein, “biological activity” refers to the activity that a factor (eg, polynucleotide, protein, etc.) may have in vivo, and exhibits various functions (eg, transcription promoting activity). For example, an activity in which another molecule is activated or inactivated by interaction with one molecule. When two factors interact, the biological activity can be the binding between the two molecules and the resulting biological change, and for example, one molecule was precipitated using an antibody Sometimes two molecules are considered bound when other molecules co-precipitate. Therefore, seeing such coprecipitation is an example of a judgment method. For example, when a factor is an enzyme, the biological activity includes the enzyme activity. In another example, when an agent is a ligand, the ligand includes binding to the corresponding receptor. Such biological activity can be measured by techniques well known in the art. Thus, “activity” indicates or reveals binding (either direct or indirect); affects the response (ie, has a measurable effect in response to some exposure or stimulus); Refers to various measurable indicators, such as the affinity of a compound that directly binds to a polypeptide or polynucleotide of the invention, or the amount of protein upstream or downstream after some stimulation or event or other A measure of similar function.
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてmRNAが作製されることもまた発現の一態様である。したがって、本明細書において「発現産物」とは、このようなポリペプチドもしくはタンパク質、またはmRNAを含む。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。例えば、CCL21、CXCR3、CCR7等の発現レベルは、任意の方法によって決定することができる。具体的には、CCL21、CXCR3、CCR7等のmRNAの量、CCL21、CXCR3、CCR7等タンパク質の量、そしてCCL21、CXCR3、CCR7等タンパク質の生物学的な活性を評価することによって、CCL21、CXCR3、CCR7等の発現レベルを知ることができる。このような測定値はコンパニオン診断において使用し得る。CCL21、CXCR3、CCR7等のmRNAやタンパク質の量は、本明細書の他の箇所に詳述したような方法あるいは他の当該分野において公知の方法によって決定することができる。 In the present specification, “expression” of a gene, polynucleotide, polypeptide or the like means that the gene or the like undergoes a certain action in vivo to take another form. Preferably, a gene, a polynucleotide or the like is transcribed and translated into a polypeptide form. However, transcription and production of mRNA are also an aspect of expression. Accordingly, “expression product” as used herein includes such a polypeptide or protein, or mRNA. More preferably, such polypeptide forms may be post-translationally processed. For example, the expression levels of CCL21, CXCR3, CCR7, etc. can be determined by any method. Specifically, by evaluating the amount of mRNA such as CCL21, CXCR3, and CCR7, the amount of protein such as CCL21, CXCR3, and CCR7, and the biological activity of the protein such as CCL21, CXCR3, and CCR7, CCL21, CXCR3, The expression level of CCR7 etc. can be known. Such measurements can be used in companion diagnostics. The amount of mRNA or protein such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc. can be determined by the method as described in detail elsewhere in this specification or other methods known in the art.
本明細書において「機能的等価物」とは、対象となるもとの実体に対して、目的となる機能が同じであるが構造が異なる任意のものをいう。従って、「CCL21、CXCR3、CCR7等」またはその抗体の機能的等価物は、CCL21、CXCR3、CCR7等またはその抗体自体ではないが、CCL21、CXCR3、CCR7等またはその抗体の変異体または改変体(例えば、アミノ酸配列改変体等)であって、CCL21、CXCR3、CCR7等またはその抗体の持つ生物学的作用を有するもの、ならびに、作用する時点において、CCL21、CXCR3、CCR7等またはその抗体自体またはこのCCL21、CXCR3、CCR7等またはその抗体の変異体もしくは改変体に変化することができるもの(例えば、CCL21、CXCR3、CCR7等またはその抗体自体またはCCL21、CXCR3、CCR7等またはその抗体の変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む)が包含されることが理解される。本発明において、CCL21、CXCR3、CCR7等またはその抗体の機能的等価物は、格別に言及していなくても、CCL21、CXCR3、CCR7等またはその抗体と同様に用いられうることが理解される。機能的等価物は、データベース等を検索することによって、見出すことができる。本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および/または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、BLAST(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403−410(1990))、FASTA(Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 85:2444−2448(1988))、Smith and Waterman法(Smithand Waterman,J.Mol.Biol.147:195−197(1981))、およびNeedlemanand Wunsch法(Needlemanand Wunsch,J.Mol.Biol.48:443−453(1970))などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索として
は、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムDNAをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ(マイクロアレイアッセイ)、PCRおよびinsituハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。In this specification, the “functional equivalent” refers to any target having the same target function but a different structure from the original target entity. Therefore, “CCL21, CXCR3, CCR7, etc.” or a functional equivalent of an antibody thereof is not CCL21, CXCR3, CCR7, etc. or the antibody itself, but CCL21, CXCR3, CCR7 etc. or a variant or variant of the antibody ( (For example, amino acid sequence variants) having the biological action of CCL21, CXCR3, CCR7, etc. or an antibody thereof, and CCL21, CXCR3, CCR7, etc. Those that can be changed to CCL21, CXCR3, CCR7, etc. or a variant or modification of the antibody thereof (for example, CCL21, CXCR3, CCR7, etc. or the antibody itself, or CCL21, CXCR3, CCR7, etc., or a variant or modification of the antibody thereof) Body Vectors containing nucleic acids, and the nucleic acids, including cells, etc.) are understood to be included. In the present invention, it is understood that CCL21, CXCR3, CCR7 or the like or a functional equivalent thereof can be used in the same manner as CCL21, CXCR3, CCR7 or the like or an antibody thereof, even if not specifically mentioned. Functional equivalents can be found by searching a database or the like. As used herein, “search” refers to finding another nucleobase sequence having a specific function and / or property using a nucleobase sequence electronically or biologically or by other methods. Say. Electronic searches include BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)), FASTA (Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 2444-2448 ( 1988), Smith and Waterman method (Smith and Waterman, J. Mol. Biol. 147: 195-197 (1981)), and Needleman and Wunsch method (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)). ) And the like, but is not limited thereto. Biological searches include stringent hybridization, macroarrays with genomic DNA affixed to nylon membranes, microarrays affixed to glass plates (microarray assays), PCR and in situ hybridization. It is not limited. In the present specification, it is intended that the gene used in the present invention should include a corresponding gene identified by such an electronic search or biological search.
本発明の機能的等価物としては、アミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加されたものを用いることができる。本明細書において、「アミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、あるいは天然の変異により、天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされていることを意味する。改変アミノ酸配列は、例えば1〜30個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜9個、さらに好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜2個のアミノ酸の挿入、置換、もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされたものであることができる。改変アミノ酸配列は、好ましくは、そのアミノ酸配列が、CCL21、CXCR3、CCR7等のアミノ酸配列において1または複数個(好ましくは1もしくは数個または1、2、3、もしくは4個)の保存的置換を有するアミノ酸配列であってもよい。ここで「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、1または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該分野において公知である。具体例を挙げると、非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性(中性)アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。 As a functional equivalent of the present invention, an amino acid sequence having one or more amino acid insertions, substitutions or deletions, or those added to one or both ends can be used. In the present specification, “insertion, substitution or deletion of one or a plurality of amino acids, or addition to one or both ends thereof in an amino acid sequence” means a well-known technical method such as site-directed mutagenesis. It means that a modification has been made by substitution of a plurality of amino acids to the extent that can occur naturally by a method or by natural mutation. The modified amino acid sequence has, for example, 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 9, more preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 2 amino acid insertions, substitutions, or deletions. Lost or added to one or both ends thereof. The modified amino acid sequence preferably has one or more (preferably 1 or several or 1, 2, 3, or 4) conservative substitutions in the amino acid sequence such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc. It may have an amino acid sequence. As used herein, “conservative substitution” means substitution of one or more amino acid residues with another chemically similar amino acid residue so as not to substantially alter the function of the protein. For example, when a certain hydrophobic residue is substituted by another hydrophobic residue, a certain polar residue is substituted by another polar residue having the same charge, and the like. Functionally similar amino acids that can make such substitutions are known in the art for each amino acid. Specific examples include non-polar (hydrophobic) amino acids such as alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, and methionine. Examples of polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, and cysteine. Examples of positively charged (basic) amino acids include arginine, histidine, and lysine. Examples of negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
本明細書において「阻害剤」とは、対象となる実体(例えば、レセプターまたは細胞)に対してそのレセプターまたは細胞の生物学的作用を阻害する物質または因子をいい、抑制剤等ともいう。本発明のCCL21、CXCR3、CCR7等の阻害剤としては、対象となるCCL21、CXCR3、CCR7等またはCCL21、CXCR3、CCR7等を発現する細胞等の機能を一時的または永久に低下または消失させることができる因子である。このような因子には、抗体、その抗原結合フラグメント、それらの誘導体、機能的等価物、アンチセンス、siRNA等のRNAi因子等の核酸の形態のもの等を挙げることができるがこれらに限定されない。
本明細書において「アゴニスト」とは、対象となる実体(例えば、レセプター)に対してそのレセプターの生物学的作用を発現またはそれを増強する物質をいう。天然のアゴニスト(リガンドとも称される)のほか、合成されたものや改変されたもの等を挙げることができる。
本明細書において「アンタゴニスト」とは、対象となる実体(例えば、レセプター)に対してそのレセプターの生物学的作用の発現を抑制または阻害する物質をいう。天然のアンタゴニストのほか、合成されたものや改変されたもの等を挙げることができる。アゴニスト(またはリガンド)と競合的に抑制または阻害するもののほか、非競合的に抑制または阻害するもの等がある。アゴニストを改変することによっても得られうる。生理現象を抑制または阻害することから、アンタゴニストは阻害剤(抑制剤)または阻害(抑制)(する)因子の概念に包含されうる。したがって、本明細書においては実質的にアンタゴニストは「阻害剤」と同義で用いられる。As used herein, the term “inhibitor” refers to a substance or factor that inhibits the biological action of a target entity (eg, receptor or cell) of the receptor or cell, and is also referred to as an inhibitor or the like. The inhibitor of CCL21, CXCR3, CCR7, etc. of the present invention may temporarily or permanently reduce or eliminate the function of the target CCL21, CXCR3, CCR7, etc. or cells expressing CCL21, CXCR3, CCR7, etc. It is a possible factor. Examples of such factors include, but are not limited to, antibodies, antigen-binding fragments thereof, derivatives thereof, functional equivalents, antisense, and nucleic acid forms such as RNAi factors such as siRNA.
As used herein, the term “agonist” refers to a substance that expresses or enhances the biological action of a target entity (eg, receptor). In addition to natural agonists (also called ligands), synthesized ones and modified ones can be mentioned.
As used herein, the term “antagonist” refers to a substance that suppresses or inhibits the expression of a biological action of a target entity (for example, a receptor). In addition to natural antagonists, those synthesized and modified can be mentioned. In addition to those that inhibit or inhibit competitively with agonists (or ligands), there are those that inhibit or inhibit non-competitively. It can also be obtained by modifying the agonist. An antagonist can be included in the concept of an inhibitor (suppressor) or an inhibitory (suppressing) factor because it suppresses or inhibits a physiological phenomenon. Accordingly, as used herein, an antagonist is used interchangeably with “inhibitor”.
本発明の一実施形態において「抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等」は、CCL21、CXCR3、CCR7等に結合性を有する抗体を含む。この抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等の生産方法は特に限定されないが、例えば、CCL21、CXCR3、CCR7等を哺乳類または鳥類に免疫することによって生産してもよい。 In one embodiment of the present invention, “anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like” includes an antibody having binding properties to CCL21, CXCR3, CCR7 and the like. The production method of the anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like is not particularly limited.
また、「CCL21、CXCR3、CCR7等に対する抗体(抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等)、または、そのフラグメント」の「機能的等価物」は、例えば、抗体の場合、CCL21、CXCR3、CCR7等の結合活性、必要であれば抑制活性を有する抗体自体およびそのフラグメント自体のほか、キメラ抗体、ヒト化抗体、多機能抗体、二重特異性またはオリゴ特異性(oligospecific)抗体、単鎖抗体、scFV、ダイアボディー、sc(Fv)2(single chain(Fv)2)、scFv−Fcなども包含されることが理解される。Further, the “functional equivalent” of “an antibody against CCL21, CXCR3, CCR7, etc. (anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody, etc.) or fragment thereof” is, for example, CCL21, CXCR3, In addition to binding activity such as CCR7, if necessary, antibody itself and its fragment itself, chimeric antibody, humanized antibody, multifunctional antibody, bispecific or oligospecific antibody, single chain antibody , ScFV, diabody, sc (Fv) 2 (single chain (Fv) 2 ), scFv-Fc and the like are also encompassed.
本発明の一実施形態に係る抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等は、悪性腫瘍の増殖が特に強く抑制される観点からは、CCL21、CXCR3、CCR7等の特定のエピトープに特異的に結合する抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等であることが好ましい。 The anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody, and the like according to one embodiment of the present invention are specific to specific epitopes such as CCL21, CXCR3, and CCR7 from the viewpoint of particularly strongly suppressing the growth of malignant tumors. Anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like that bind are preferable.
本発明の一実施形態に係る抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等は、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体であれば、ポリクローナル抗体に比べて、効率的にCCL21、CXCR3、CCR7等に対して作用させることができる。抗CCL21モノクローナル抗体、抗CXCR3モノクローナル抗体、抗CCR7モノクローナル抗体等を効率的に生産する観点からは、CCL21、CXCR3、CCR7等をニワトリに免疫することが好ましい。 The anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like according to one embodiment of the present invention may be monoclonal antibodies. If it is a monoclonal antibody, it can be made to act on CCL21, CXCR3, CCR7, etc. efficiently compared with a polyclonal antibody. From the viewpoint of efficiently producing anti-CCL21 monoclonal antibody, anti-CXCR3 monoclonal antibody, anti-CCR7 monoclonal antibody and the like, it is preferable to immunize chickens with CCL21, CXCR3, CCR7 and the like.
本発明の一実施形態に係る抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等の抗体クラスは特に限定されないが、例えばIgM、IgD、IgG、IgA、IgE、またはIgYであってもよい。 The antibody class such as anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, and anti-CCR7 antibody according to an embodiment of the present invention is not particularly limited, and may be, for example, IgM, IgD, IgG, IgA, IgE, or IgY.
本発明の一実施形態に係る抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等は、抗原結合活性を有する抗体フラグメント(以下、「抗原結合性フラグメント」と称することもある)であっても良い。この場合、安定性または抗体の生産効率が上昇する等の効果がある。 The anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like according to an embodiment of the present invention may be an antibody fragment having an antigen-binding activity (hereinafter also referred to as “antigen-binding fragment”). In this case, there are effects such as an increase in stability or antibody production efficiency.
本発明の一実施形態に係る抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等は、融合タンパク質であってもよい。この融合タンパク質は、抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等のNまたはC末端に、ポリペプチドまたはオリゴペプチドが結合したものであってもよい。ここで、オリゴペプチドは、Hisタグであってもよい。また融合タンパク質は、マウス、ヒト、またはニワトリの抗体部分配列を融合したものであってもよい。それらのような融合タンパク質も、本実施形態に係る抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等の一形態に含まれる。 The anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like according to one embodiment of the present invention may be a fusion protein. This fusion protein may be a polypeptide or oligopeptide bound to the N- or C-terminus of anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody or the like. Here, the oligopeptide may be a His tag. The fusion protein may be a fusion of a mouse, human, or chicken antibody partial sequence. Such fusion proteins are also included in one form of the anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like according to this embodiment.
本発明の一実施形態に係る抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等は、例えば、精製CCL21、CXCR3、CCR7等、CCL21、CXCR3、CCR7等の発現細胞、またはCCL21、CXCR3、CCR7等の含有脂質膜で生物を免疫する工程を経て得られる抗体であってもよい。CCL21、CXCR3、CCR7等の陽性悪性腫瘍に対する治療効果を高める観点からは、CCL21、CXCR3、CCR7等の発現細胞を免疫に使用することが好ましい。 The anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like according to one embodiment of the present invention include, for example, purified CCL21, CXCR3, CCR7, etc., expressed cells such as CCL21, CXCR3, CCR7, or CCL21, CXCR3, CCR7, etc. It may be an antibody obtained through a step of immunizing an organism with the containing lipid membrane. From the viewpoint of enhancing the therapeutic effect on positive malignant tumors such as CCL21, CXCR3, CCR7, it is preferable to use cells expressing CCL21, CXCR3, CCR7, etc. for immunization.
本発明の一実施形態に係る抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等は、精製CCL21、CXCR3、CCR7等、CCL21、CXCR3、CCR7等の発現細胞またはCCL21、CXCR3、CCR7等含有脂質膜で生物を免疫する工程を経て得られる抗体の、CDRセットを有する抗体であってもよい。CCL21、CXCR3、CCR7等の陽性悪性腫瘍に対する治療効果を高める観点からは、CCL21、CXCR3、CCR7等の発現細胞を免疫に使用することが好ましい。CDRセットとは、重鎖CDR1、2、および3、並びに、軽鎖CDR1、2、および3のセットである。 The anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody, etc. according to one embodiment of the present invention are purified CCL21, CXCR3, CCR7, etc., expressed cells such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc. or lipid membranes containing CCL21, CXCR3, CCR7, etc. It may be an antibody having a CDR set of an antibody obtained through a step of immunizing an organism. From the viewpoint of enhancing the therapeutic effect on positive malignant tumors such as CCL21, CXCR3, CCR7, it is preferable to use cells expressing CCL21, CXCR3, CCR7, etc. for immunization. A CDR set is a set of heavy chain CDRs 1, 2, and 3 and light chain CDRs 1, 2, and 3.
本発明の一実施形態において「CCL21、CXCR3、CCR7等の発現細胞」は、例えば、CCL21、CXCR3、CCR7等をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入後、CCL21、CXCR3、CCR7等を発現させることによって得てもよい。ここでCCL21、CXCR3、CCR7等は、CCL21、CXCR3、CCR7等のフラグメントを含む。また本発明の一実施形態において「CCL21、CXCR3、CCR7等含有脂質膜」は、例えば、CCL21、CXCR3、CCR7等と脂質二重膜を混合することによって得てもよい。ここでCCL21、CXCR3、CCR7等は、CCL21、CXCR3、CCR7等のフラグメントを含む。また本発明の一実施形態に係る抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等は、CCL21、CXCR3、CCR7等の陽性悪性腫瘍に対する治療効果を高める観点からは、抗原をニワトリに免疫する工程を経て得られる抗体、またはその抗体のCDRセットを有する抗体が好ましい。 In one embodiment of the present invention, “expressing cells such as CCL21, CXCR3, CCR7” are expressed by, for example, expressing CCL21, CXCR3, CCR7, etc. after introducing a polynucleotide encoding CCL21, CXCR3, CCR7, etc. May be obtained. Here, CCL21, CXCR3, CCR7 and the like include fragments such as CCL21, CXCR3 and CCR7. In one embodiment of the present invention, “a lipid membrane containing CCL21, CXCR3, CCR7, etc.” may be obtained, for example, by mixing a lipid bilayer with CCL21, CXCR3, CCR7, etc. Here, CCL21, CXCR3, CCR7 and the like include fragments such as CCL21, CXCR3 and CCR7. Further, the anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like according to one embodiment of the present invention include a step of immunizing a chicken with an antigen from the viewpoint of enhancing the therapeutic effect on positive malignant tumors such as CCL21, CXCR3, and CCR7. An antibody obtained via the antibody or an antibody having a CDR set of the antibody is preferable.
本発明の一実施形態に係る抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等は、目的を達成する限り、どのような結合力を有していてもよく、例えば、少なくとも1.0×106以上、2.0×106以上、5.0×106以上、1.0×107以上を挙げることができるがこれらに限定されず、通常は、KD値が、1.0×107以上であってもよい。The anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like according to an embodiment of the present invention may have any binding force as long as the object is achieved, for example, at least 1.0 × 10 6. As mentioned above, 2.0 × 10 6 or more, 5.0 × 10 6 or more, 1.0 × 10 7 or more can be mentioned, but it is not limited to these, and usually the KD value is 1.0 × 10 7. It may be the above.
本発明の一実施形態に係る抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等は、ADCCまたはCDC活性を有していてもよい。 The anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like according to one embodiment of the present invention may have ADCC or CDC activity.
本発明の一実施形態に係る抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等は、CCL21、CXCR3、CCR7等の野生型または変異型に結合する抗体であってもよい。変異型とは、個体間のDNA配列の差異に起因するものを含む。野生型または変異型のCCL21、CXCR3、CCR7等のアミノ酸配列は、配列番号2、4、6等に示すアミノ酸配列に対し、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上の相同性を有している。 The anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody, and the like according to one embodiment of the present invention may be antibodies that bind to wild-type or mutant types such as CCL21, CXCR3, and CCR7. Variants include those resulting from differences in DNA sequences between individuals. The amino acid sequence of wild-type or mutant CCL21, CXCR3, CCR7, etc. is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, etc. As described above, the homology is particularly preferably 98% or more.
本明細書において「抗体」は、抗原上の特定のエピトープに特異的に結合することができる分子またはその集団を含む。また抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、様々な形態で存在することができ、例えば、全長抗体(Fab領域とFc領域を有する抗体)、Fv抗体、Fab抗体、F(ab’)2抗体、Fab’抗体、diabody、一本鎖抗体(例えば、scFv)、dsFv、多価特異的抗体(例えば、二価特異的抗体)、抗原結合性を有するペプチドまたはポリペプチド、キメラ抗体(例えば、マウス−ヒトキメラ抗体、ニワトリ−ヒトキメラ抗体等)、マウス抗体、ニワトリ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはそれらの同等物(または等価物)からなる群から選ばれる1種以上の形態であってもよい。また抗体は、抗体修飾物または抗体非修飾物を含む。抗体修飾物は、抗体と、例えばポリエチレングリコール等の各種分子が結合していてもよい。抗体修飾物は、抗体に公知の手法を用いて化学的な修飾を施すことによって得ることができる。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。本発明で用いられる抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等は、CCL21、CXCR3、CCR7等のタンパク質に結合すればよく、その由来、種類、形状などは問われない。具体的には、非ヒト動物の抗体(例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体)、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体が使用できる。本発明においては、モノクローナル、あるいはポリクローナルを抗体として利用することができるが好ましくはモノクローナル抗体である。抗体のCCL21、CXCR3、CCR7等タンパク質への結合は特異的な結合であることが好ましい。また抗体は、抗体修飾物または抗体非修飾物を含む。抗体修飾物は、抗体と、例えばポリエチレングリコール等の各種分子が結合していてもよい。抗体修飾物は、抗体に公知の手法を用いて化学的な修飾を施すことによって得ることができる。As used herein, “antibody” includes a molecule or population thereof that can specifically bind to a particular epitope on an antigen. The antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. The antibody can exist in various forms, for example, full-length antibody (antibody having Fab region and Fc region), Fv antibody, Fab antibody, F (ab ′) 2 antibody, Fab ′ antibody, diabody, single Chain antibodies (for example, scFv), dsFv, multivalent specific antibodies (for example, bivalent specific antibodies), peptides or polypeptides having antigen binding properties, chimeric antibodies (for example, mouse-human chimeric antibodies, chicken-human chimeric antibodies, etc.) ), One or more forms selected from the group consisting of mouse antibodies, chicken antibodies, humanized antibodies, human antibodies, or their equivalents (or equivalents). The antibody includes an antibody modified product or an antibody unmodified product. In the modified antibody, an antibody and various molecules such as polyethylene glycol may be bound. The modified antibody can be obtained by chemically modifying the antibody using a known technique. In addition, such antibodies may be covalently linked or recombinantly fused to enzymes such as alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, alpha galactosidase, and the like. The anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody, etc. used in the present invention may be bound to proteins such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc., and their origin, type, shape, etc. are not questioned. Specifically, known antibodies such as non-human animal antibodies (eg, mouse antibodies, rat antibodies, camel antibodies), human antibodies, chimeric antibodies, and humanized antibodies can be used. In the present invention, monoclonal or polyclonal antibodies can be used as antibodies, but monoclonal antibodies are preferred. The binding of the antibody to a protein such as CCL21, CXCR3, CCR7 is preferably specific binding. The antibody includes an antibody modified product or an antibody unmodified product. In the modified antibody, an antibody and various molecules such as polyethylene glycol may be bound. The modified antibody can be obtained by chemically modifying the antibody using a known technique.
本発明の一実施形態において「ポリクローナル抗体」は、例えば、抗原に特異的なポリクローナル抗体の産生を誘導するために、哺乳類(例えば、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、サル等)、鳥類等に、目的の抗原を含む免疫原を投与することによって生成することが可能である。免疫原の投与は、1つ以上の免疫剤、および所望の場合にはアジュバントの注入をしてもよい。アジュバントは、免疫応答を増加させるために使用されることもあり、フロイントアジュバント(完全または不完全)、ミネラルゲル(水酸化アルミニウム等)、または界面活性物質(リゾレシチン等)等を含んでいてもよい。免疫プロトコールは、当該技術分野で公知であり、選択する宿主生物に合わせて、免疫応答を誘発する任意の方法によって実施される場合がある(タンパク質実験ハンドブック,羊土社(2003):86−91.)。 In one embodiment of the present invention, a “polyclonal antibody” refers to, for example, mammals (eg, rats, mice, rabbits, cows, monkeys, etc.), birds, etc. in order to induce the production of polyclonal antibodies specific to the antigen. It can be generated by administering an immunogen containing the antigen of interest. Administration of the immunogen may involve infusion of one or more immunizing agents and, if desired, an adjuvant. An adjuvant may be used to increase the immune response and may include Freund's adjuvant (complete or incomplete), mineral gel (such as aluminum hydroxide), or a surfactant (such as lysolecithin). . Immunization protocols are known in the art and may be performed by any method that elicits an immune response, depending on the host organism chosen (Protein Experiment Handbook, Yodosha (2003): 86-91). .).
本発明の一実施形態において「モノクローナル抗体」は、集団を構成する個々の抗体が、少量自然に生じることが可能な突然変異を有する抗体を除いて、実質的に単一のエピトープに対応する抗体である場合を含む。または、集団を構成する個々の抗体が、少量自然に生じることが可能な突然変異を有する抗体を除いて、実質的に同一である抗体であってもよい。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、異なるエピトープに対応する異なる抗体を典型的に含むような、通常のポリクローナル抗体とは異なる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養から合成できる点で有用である。「モノクローナル」という形容は、実質的に均一な抗体集団から得られるという特徴を示していてもよいが、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、モノクローナル抗体は、″Kohler G,Milstein C.,Nature.1975 Aug7;256(5517):495−497.″に掲載されているようなハイブリドーマ法と同様の方法によって作製してもよい。あるいは、モノクローナル抗体は、米国特許第4816567号に記載されているような組換え法と同様の方法によって作製してもよい。または、モノクローナル抗体は、″Clacksonet al.,Nature.1991 Aug 15;352(6336):624−628.″、または″Markset al.,JMol Biol.1991 Dec 5;222(3):581−597.″に記載されているような技術と同様の方法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。または、″タンパク質実験ハンドブック,羊土社(2003):92−96.″に掲載されている方法でよって作製してもよい。 In one embodiment of the present invention, a “monoclonal antibody” is an antibody in which the individual antibodies constituting the population substantially correspond to a single epitope, except for antibodies having mutations that can naturally occur in small amounts. Including the case. Alternatively, the individual antibodies that make up the population may be antibodies that are substantially identical except for antibodies that have mutations that can occur naturally in small amounts. Monoclonal antibodies are highly specific and differ from normal polyclonal antibodies, which typically include different antibodies corresponding to different epitopes. In addition to its specificity, monoclonal antibodies are useful in that they can be synthesized from hybridoma cultures that are not contaminated by other immunoglobulins. The form “monoclonal” may be characterized as being derived from a substantially homogeneous population of antibodies, but does not mean that the antibodies must be produced in any particular way. For example, the monoclonal antibody may be produced by a method similar to the hybridoma method as described in “Kohler G, Milstein C., Nature. 1975 Aug7; 256 (5517): 495-497.”. Alternatively, monoclonal antibodies may be made by methods similar to recombinant methods such as those described in US Pat. No. 4,816,567. Alternatively, monoclonal antibodies can be prepared according to “Clackson et al., Nature. 1991 Aug 15; 352 (6336): 624-628.” Or “Markset al., J Mol Biol. 1991 Dec 5; It may be isolated from a phage antibody library using methods similar to those described in “. Alternatively, it may be prepared by the method described in “Protein Experiment Handbook, Yodosha (2003): 92-96”.
抗体の大量生産については、当該分野で公知の任意の手法を用いることができるが、例えば、代表的な抗体の大量生産系の構築および抗体製造としては、以下を例示することができる。すなわち、CHO細胞にH鎖抗体発現ベクターおよびL鎖抗体発現ベクターをトランスフェクションし、選択試薬であるG418およびZeocinを用いて培養を行い、限界希釈法によるクローニングを行う。クローニング後、安定的に抗体を発現しているクローンをELISA法により選択する。選択したCHO細胞を用いて拡大培養し、抗体を含む培養上清を回収する。回収した培養上清からProteinAもしくはProtein G精製により抗体を精製することができる。 For the mass production of antibodies, any technique known in the art can be used. For example, the following can be exemplified as the construction of a typical antibody mass production system and antibody production. That is, CHO cells are transfected with an H chain antibody expression vector and an L chain antibody expression vector, cultured using selection reagents G418 and Zeocin, and cloned by limiting dilution. After cloning, clones that stably express the antibody are selected by ELISA. The selected CHO cells are expanded and cultured, and the culture supernatant containing the antibody is collected. The antibody can be purified from the collected culture supernatant by Protein A or Protein G purification.
本発明の一実施形態において「Fv抗体」は、抗原認識部位を含む抗体である。この領域は、非共有結合による1つの重鎖可変ドメインおよび1つの軽鎖可変ドメインの二量体を含む。この構成において、各可変ドメインの3つのCDRは相互に作用してVH−VL二量体の表面に抗原結合部位を形成することができる。 In one embodiment of the present invention, an “Fv antibody” is an antibody containing an antigen recognition site. This region contains a dimer of one heavy chain variable domain and one light chain variable domain by non-covalent bonds. In this configuration, the three CDRs of each variable domain can interact to form an antigen binding site on the surface of the VH-VL dimer.
本発明の一実施形態において「Fab抗体」は、例えば、Fab領域およびFc領域を含む抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られるフラグメントのうち、H鎖のN末端側約半分とL鎖全体が一部のジスルフィド結合を介して結合した抗体である。Fabは、例えば、Fab領域およびFc領域を含む本発明の実施形態に係る抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等を、タンパク質分解酵素パパインで処理して得ることができる。 In one embodiment of the present invention, the “Fab antibody” refers to, for example, a fragment obtained by treating an antibody containing a Fab region and an Fc region with the proteolytic enzyme papain, about the N-terminal side of the H chain and the entire L chain. Is an antibody bound through some disulfide bonds. The Fab can be obtained, for example, by treating the anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like according to the embodiment of the present invention containing the Fab region and the Fc region with the proteolytic enzyme papain.
本発明の一実施形態において「F(ab’)2抗体」は、例えば、Fab領域およびFc領域を含む抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られるフラグメントのうち、Fabに相当する部位を2つ含む抗体である。F(ab’)2は、例えば、Fab領域およびFc領域を含む本発明の実施形態に係る抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等を、タンパク質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。また、例えば、下記のFab’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させることで、作製することができる。In one embodiment of the present invention, “F (ab ′) 2 antibody” refers to, for example, 2 sites corresponding to Fab in a fragment obtained by treating an antibody containing a Fab region and an Fc region with proteolytic enzyme pepsin. One antibody. F (ab ′) 2 can be obtained, for example, by treating an anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody, etc. according to an embodiment of the present invention containing a Fab region and an Fc region with a proteolytic enzyme pepsin. . Further, for example, it can be produced by linking the following Fab ′ with a thioether bond or a disulfide bond.
本発明の一実施形態において「Fab’抗体」は、例えば、F(ab’)2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断して得られる抗体である。例えば、F(ab’)2を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。In one embodiment of the present invention, “Fab ′ antibody” is, for example, an antibody obtained by cleaving a disulfide bond in the hinge region of F (ab ′) 2 . For example, F (ab ′) 2 can be obtained by treating with a reducing agent dithiothreitol.
本発明の一実施形態において「scFv抗体」は、VHとVLとが適当なペプチドリンカーを介して連結した抗体である。scFv抗体は、例えば、本発明の実施形態に係る抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、VH−ペプチドリンカー−VLをコードするポリヌクレオチドを構築し、そのポリヌクレオチドをベクターに組み込み、発現用の細胞を用いて生産できる。 In one embodiment of the present invention, an “scFv antibody” is an antibody in which VH and VL are linked via an appropriate peptide linker. The scFv antibody obtains cDNA encoding VH and VL, such as anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, and anti-CCR7 antibody according to the embodiment of the present invention, and constructs a polynucleotide encoding VH-peptide linker-VL. Then, the polynucleotide can be incorporated into a vector and produced using expression cells.
本発明の一実施形態において「diabody」は、二価の抗原結合活性を有する抗体である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。diabodyは、例えば、scFvをコードするポリヌクレオチドをペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが8残基以下となるように構築し、得られたポリヌクレオチドをベクターに組み込み、発現用の細胞を用いて生産できる。 In one embodiment of the present invention, “diabody” is an antibody having a bivalent antigen binding activity. The bivalent antigen binding activity can be the same, or one can be a different antigen binding activity. Diabody, for example, constructs a polynucleotide encoding scFv so that the length of the amino acid sequence of the peptide linker is 8 residues or less, incorporates the obtained polynucleotide into a vector, and produces it using cells for expression. it can.
本発明の一実施形態において「dsFv」は、VHおよびVL中にシステイン残基を導入したポリペプチドを、上記システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させた抗体である。システイン残基に導入する位置はReiterらにより示された方法(Reiteret al.,Protein Eng.1994 May;7(5):697−704.)に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。 In one embodiment of the present invention, “dsFv” is an antibody in which a polypeptide in which a cysteine residue is introduced into VH and VL is bound via a disulfide bond between the cysteine residues. The position to be introduced into the cysteine residue can be selected based on the three-dimensional structure prediction of the antibody according to the method shown by Reiter et al. (Reiter et al., Protein Eng. 1994 May; 7 (5): 697-704.). it can.
本発明の一実施形態において「抗原結合性を有するペプチドまたはポリペプチド」は、抗体のVH、VL、またはそれらのCDR1、2、もしくは3を含んで構成される抗体である。複数のCDRを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。 In one embodiment of the present invention, an “antigen-binding peptide or polypeptide” is an antibody comprising an antibody VH, VL, or CDR1, 2, or 3 thereof. Peptides containing multiple CDRs can be linked directly or via a suitable peptide linker.
上記のFv抗体、Fab抗体、F(ab’)2抗体、Fab’抗体、scFv抗体、diabody、dsFv抗体、抗原結合性を有するペプチドまたはポリペプチド(以下、「Fv抗体等」と称することもある)の生産方法は特に限定しない。例えば、本発明の実施形態に係る抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等におけるFv抗体等の領域をコードするDNAを発現用ベクターに組み込み、発現用細胞を用いて生産できる。または、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBOC法(t−ブチルオキシカルボニル法)などの化学合成法によって生産してもよい。なお本発明の一実施形態に係る抗原結合性フラグメントは、上記Fv抗体等の1種以上であってもよい。Fv antibody, Fab antibody, F (ab ′) 2 antibody, Fab ′ antibody, scFv antibody, diabody, dsFv antibody, peptide or polypeptide having antigen binding properties (hereinafter also referred to as “Fv antibody etc.”) ) Production method is not particularly limited. For example, DNA encoding a region such as an Fv antibody in the anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like according to an embodiment of the present invention can be incorporated into an expression vector and produced using an expression cell. Alternatively, it may be produced by a chemical synthesis method such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or tBOC method (t-butyloxycarbonyl method). The antigen-binding fragment according to one embodiment of the present invention may be one or more of the above Fv antibodies.
本発明の一実施形態において「キメラ抗体」は、例えば、異種生物間における抗体の可変領域と、抗体の定常領域とを連結したもので、遺伝子組換え技術によって構築できる。マウス−ヒトキメラ抗体は、例えば、″Roguska et al.,ProcNatl Acad Sci U S A.1994Feb 1;91(3):969−973.″に記載の方法で作製できる。マウス−ヒトキメラ抗体を作製するための基本的な方法は、例えば、クローン化されたcDNAに存在するマウスリーダー配列および可変領域配列を、哺乳類細胞の発現ベクター中にすでに存在するヒト抗体定常領域をコードする配列に連結する。または、クローン化されたcDNAに存在するマウスリーダー配列および可変領域配列をヒト抗体定常領域をコードする配列に連結した後、哺乳類細胞発現ベクターに連結してもよい。ヒト抗体定常領域のフラグメントは、任意のヒト抗体のH鎖定常領域およびヒト抗体のL鎖定常領域のものとすることができ、例えばヒトH鎖のものについてはCγ1、Cγ2、Cγ3またはCγ4を、L鎖のものについてはCλまたはCκを各々挙げることができる。 In one embodiment of the present invention, a “chimeric antibody” is, for example, a combination of an antibody variable region and an antibody constant region between different organisms, and can be constructed by a gene recombination technique. A mouse-human chimeric antibody can be prepared, for example, by the method described in “Roguska et al., ProcNatl Acad Sci USA A. 1994 Feb 1; 91 (3): 969-973.”. The basic method for making a mouse-human chimeric antibody is, for example, encoding the mouse leader and variable region sequences present in the cloned cDNA and the human antibody constant region already present in the expression vector of a mammalian cell. To the array to be Alternatively, the mouse leader sequence and variable region sequence present in the cloned cDNA may be linked to a sequence encoding a human antibody constant region and then linked to a mammalian cell expression vector. The fragment of the human antibody constant region can be of any human antibody heavy chain constant region and human antibody light chain constant region, eg, Cγ1, Cγ2, Cγ3 or Cγ4 for human heavy chain, For the light chain, Cλ or Cκ can be mentioned, respectively.
本発明の一実施形態において「ヒト化抗体」は、例えば、非ヒト種由来の1つ以上のCDR、およびヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域(FR)、さらにヒト免疫グロブリン由来の定常領域を有し、所望の抗原に結合する抗体である。抗体のヒト化は、当該技術分野で既知の種々の手法を使用して実施可能である(Almagroet al.,FRont Biosci.2008 Jan 1;13:1619−1633.)。例えば、CDRグラフティング(Ozaki et al.,Blood.1999 Jun 1;93(11):3922−3930.)、Re−surfacing(Roguska et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.1994 Feb1;91(3):969−973.)、またはFRシャッフル(Damschroder et al.,Mol Immunol.2007 Apr;44(11):3049−3060.Epub 2007 Jan 22.)などが挙げられる。抗原結合を改変するために(好ましくは改善するために)、ヒトFR領域のアミノ酸残基は、CDRドナー抗体からの対応する残基と置換してもよい。このFR置換は、当該技術分野で周知の方法によって実施可能である(Riechmann et al.,Nature.1988 Mar 24;332(6162):323−327.)。例えば、CDRとFR残基の相互作用のモデリングによって抗原結合に重要なFR残基を同定してもよい。または、配列比較によって、特定の位置で異常なFR残基を同定してもよい。 In one embodiment of the present invention, a “humanized antibody” has, for example, one or more CDRs derived from a non-human species, a framework region (FR) derived from a human immunoglobulin, and a constant region derived from a human immunoglobulin. And an antibody that binds to the desired antigen. Antibody humanization can be performed using a variety of techniques known in the art (Almagro et al., FRont Biosci. 2008 Jan 1; 13: 1619-1633.). For example, CDR grafting (Ozaki et al., Blood. 1999 Jun 1; 93 (11): 3922-3930.), Re-surfacing (Roguska et al., Proc Natl Acad Sci US A. 1994 Feb 1; 91 ( 3): 969-973.), Or FR shuffle (Damschroder et al., Mol Immunol. 2007 Apr; 44 (11): 3049-3060.Epub 2007 Jan 22.). To alter (preferably improve) antigen binding, amino acid residues of the human FR region may be substituted with corresponding residues from the CDR donor antibody. This FR substitution can be performed by methods well known in the art (Riechmann et al., Nature. 1988 Mar 24; 332 (6162): 323-327.). For example, FR residues important for antigen binding may be identified by modeling the interaction of CDR and FR residues. Alternatively, an unusual FR residue at a particular position may be identified by sequence comparison.
本発明の一実施形態において「ヒト抗体」は、例えば、抗体を構成する重鎖の可変領域および定常領域、軽鎖の可変領域および定常領域を含む領域が、ヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来する抗体である。主な作製方法としてはヒト抗体作製用トランスジェニックマウス法、ファージディスプレイ法などがある。ヒト抗体作製用トランスジェニックマウス法では、内因性Igをノックアウトしたマウスに機能的なヒトのIg遺伝子を導入すれば、マウス抗体の代わりに多様な抗原結合能を持つヒト抗体が産生される。さらにこのマウスを免疫すればヒトモノクローナル抗体を従来のハイブリドーマ法で得ることが可能である。例えば、″Lonberget al.,Int Rev Immunol.1995;13(1):65−93.″に記載の方法で作製できる。ファージディスプレイ法は、典型的には大腸菌ウイルスの一つであるM13やT7などの繊維状ファージのコートタンパク質(g3p、g10p等)のN末端側にファージの感染性を失わないよう外来遺伝子を融合タンパク質として発現させるシステムである。例えば、″Vaughanet al.,Nat Biotechnol.1996Mar;14(3):309−314.″に記載の方法で作製できる。 In one embodiment of the present invention, a “human antibody” is derived from a gene encoding a human immunoglobulin, for example, a variable region and a constant region of a heavy chain, and a variable region and a constant region of a light chain that constitute the antibody. Antibody. The main production methods include a transgenic mouse method for producing human antibodies, a phage display method, and the like. In the transgenic mouse method for producing human antibodies, if a functional human Ig gene is introduced into a mouse in which endogenous Ig has been knocked out, human antibodies having various antigen-binding abilities can be produced instead of the mouse antibody. Furthermore, if this mouse is immunized, a human monoclonal antibody can be obtained by a conventional hybridoma method. For example, it can be produced by the method described in “Lonberg et al., Int Rev Immunol. 1995; 13 (1): 65-93.”. In the phage display method, a foreign gene is fused to the N-terminal side of the coat protein (g3p, g10p, etc.) of filamentous phages such as M13 and T7, which are typically E. coli viruses. It is a system that expresses as protein. For example, it can be prepared by the method described in “Vaughane et al., Nat Biotechnol. 1996 Mar; 14 (3): 309-314.”.
また抗体は、CDR−grafting(Ozaki et al.,Blood.1999 Jun 1;93(11):3922−3930.)によって任意の抗体に本発明の実施形態に係る抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等の重鎖CDRまたは軽鎖CDRをグラフティングすることで作製してもよい。または、本発明の実施形態に係る抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等の重鎖CDRまたは軽鎖CDRをコードするDNAと、公知のヒトまたはヒト以外の生物由来の抗体の、重鎖CDRまたは軽鎖CDRを除く領域をコードするDNAとを、当該技術分野で公知の方法に従ってベクターに連結後、公知の細胞を使用して発現させることによって得ることができる。このとき、抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等の標的抗原への作用効率を上げるために、当該分野で公知の方法(例えば、抗体のアミノ酸残基をランダムに変異させ、反応性の高いものをスクリーニングする方法、またはファージディスプレイ法等)を用いて、重鎖CDRまたは軽鎖CDRを除く領域を最適化してもよい。また、例えば、FRシャッフル(Damschroderet al.,Mol Immunol.2007 Apr;44(11):3049−3060.Epub 2007 Jan 22.)、またはバーニヤゾーンのアミノ酸残基またはパッケージング残基を置換する方法(特開2006−241026、またはFooteet al.,J Mol Biol.1992 Mar 20;224(2):487−499.)を用いて、FR領域を最適化してもよい。 The antibody may be any antibody by CDR-grafting (Ozaki et al., Blood. 1999 Jun 1; 93 (11): 3922-3930.), And the anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CXCR3 antibody, You may produce by grafting heavy chain CDR or light chain CDR, such as CCR7 antibody. Alternatively, a heavy chain of a DNA encoding a heavy chain CDR or a light chain CDR such as an anti-CCL21 antibody, an anti-CXCR3 antibody, or an anti-CCR7 antibody according to an embodiment of the present invention, and an antibody derived from a known human or non-human organism A DNA encoding a region excluding the CDR or light chain CDR can be obtained by ligation to a vector according to a method known in the art and then expression using a known cell. At this time, in order to increase the action efficiency on the target antigen such as anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody, etc., a method known in the art (for example, by randomly mutating the amino acid residue of the antibody, The region excluding the heavy chain CDR or the light chain CDR may be optimized using a method of screening for a higher one or a phage display method. In addition, for example, FR shuffle (Damschroderet al., Mol Immunol. 2007 Apr; 44 (11): 3049-3060.Epub 2007 Jan 22.), or a method of substituting amino acid residues or packaging residues of vernier zones ( The FR region may be optimized using JP-A-2006-241026, or Foote et al., J Mol Biol. 1992 Mar 20; 224 (2): 487-499.).
本発明の一実施形態において「重鎖」は、典型的には、全長抗体の主な構成要素である。重鎖は、通常、軽鎖とジスルフィド結合および非共有結合によって結合している。重鎖のN末端側のドメインには、同種の同一クラスの抗体でもアミノ酸配列が一定しない可変領域(VH)と呼ばれる領域が存在し、一般的に、VHが抗原に対する特異性、親和性に大きく寄与していることが知られている。例えば、″Reiteret al.,J Mol Biol.1999 Jul 16;290(3):685−98.″にはVHのみの分子を作製したところ、抗原と特異的に、高い親和性で結合したことが記載されている。さらに、″Wolfson W,Chem Biol.2006 Dec;13(12):1243−1244.″には、ラクダの抗体の中には、軽鎖を持たない重鎖のみの抗体が存在していることが記載されている。 In one embodiment of the invention, the “heavy chain” is typically the major component of a full-length antibody. The heavy chain is usually linked to the light chain by disulfide bonds and non-covalent bonds. The domain on the N-terminal side of the heavy chain has a region called a variable region (VH) in which the amino acid sequence is not constant even with antibodies of the same type and the same class. Generally, VH has a large specificity and affinity for an antigen. It is known to contribute. For example, in “Reiter et al., J Mol Biol. 1999 Jul 16; 290 (3): 685-98.”, A VH-only molecule was produced, and it was found that it bound specifically to the antigen with high affinity. Has been described. Further, in “Wolfson W, Chem Biol. 2006 Dec; 13 (12): 1243-1244.”, It is found that among the camel antibodies, only a heavy chain antibody having no light chain exists. Has been described.
本発明の一実施形態において「CDR(相補性決定領域)」は、抗体において、実際に抗原に接触して結合部位を形成している領域である。一般的にCDRは、抗体のFv(可変領域:重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含む)上に位置している。また一般的にCDRは、5〜30アミノ酸残基程度からなるCDR1、CDR2、CDR3が存在する。そして、特に重鎖のCDRが抗体の抗原への結合に寄与していることが知られている。またCDRの中でも、CDR3が抗体の抗原への結合における寄与が最も高いことが知られている。例えば、″Willy et al.,Biochemicaland Biophysical Research Communications Volume 356,Issue1,27 April2007,Pages 124−128″には、重鎖CDR3を改変させることで抗体の結合能を上昇させたことが記載されている。CDR以外のFv領域はフレームワーク領域(FR)と呼ばれ、FR1、FR2、FR3およびFR4からなり、抗体間で比較的よく保存されている(Kabatet al.,「Sequence of Proteins of Immunological Interest」USDept.Health andHuman Services,1983.)。即ち、抗体の反応性を特徴付ける要因はCDRにあり、特に重鎖CDRにあるといえる。 In one embodiment of the present invention, a “CDR (complementarity determining region)” is a region in an antibody that is actually in contact with an antigen to form a binding site. Generally, the CDRs are located on the Fv (variable region: including heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL)) of the antibody. In general, CDRs include CDR1, CDR2, and CDR3 consisting of about 5 to 30 amino acid residues. In particular, it is known that CDRs of heavy chains contribute to the binding of antibodies to antigens. Among CDRs, it is known that CDR3 contributes most to the binding of an antibody to an antigen. For example, “Willy et al., Biochemical and Biophysical Research Communications Volume 356, Issue 1, 27 April 2007, Pages 124-128” describes that the binding ability of the antibody was increased by modifying heavy chain CDR3. . Fv regions other than CDRs are called framework regions (FR) and consist of FR1, FR2, FR3, and FR4 and are relatively well conserved among antibodies (Kabatet al., “Sequence of Proteins of Immunological Interest” USDept. Health and Human Services, 1983.). That is, it can be said that the factor characterizing the reactivity of the antibody is in the CDR, particularly in the heavy chain CDR.
CDRの定義およびその位置を決定する方法は複数報告されている。例えば、Kabatの定義(Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public HealthService,
National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))、またはChothiaの定義(Chothiaet al.,J.Mol.Biol.,1987;196:901−917)を採用してもよい。本発明の一実施形態においては、Kabatの定義を好適な例として採用するが、必ずしもこれに限定されない。また、場合によっては、Kabatの定義とChothiaの定義の両方を考慮して決定しても良く、例えば、各々の定義によるCDRの重複部分を、または各々の定義によるCDRの両方を含んだ部分をCDRとすることもできる。そのような方法の具体例としては、Kabatの定義とChothiaの定義の折衷案である、Oxford Molecular’s AbM antibody modeling softwareを用いたMartinらの方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989;86:9268−9272)がある。このようなCDRの情報を用いて、本発明に使用されうる変異体を生産することができる。このような抗体の変異体では、もとの抗体のフレームワークに1または数個(例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個)の置換、付加もしくは欠失を含むが、該CDRには変異を含まないように生産することができる。Several methods have been reported for defining CDRs and their locations. For example, the definition of Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Intersect, 5th ed., Public Health Service,
National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)), or Chothia's definition (Chothia et al., J. Mol. Biol., 1987; 196: 901-917). In one embodiment of the present invention, the Kabat definition is adopted as a preferred example, but is not necessarily limited thereto. In some cases, it may be determined in consideration of both the Kabat definition and the Chothia definition. For example, an overlapping part of CDRs according to each definition or a part including both CDRs according to each definition It can also be a CDR. A specific example of such a method is the method of Martin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 9268-9272). Such CDR information can be used to produce mutants that can be used in the present invention. In such antibody variants, one or several (eg, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 in the framework of the original antibody). ) Substitutions, additions or deletions, but the CDRs can be produced without mutations.
本明細書において「抗原」(antigen)とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」(immunogen)とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。本明細書において「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体またはリンパ球レセプターが結合する抗原分子中の部位をいう。エピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。本発明の抗体は、エピトープが同じであれば、他の配列を有する抗体であっても同様に利用することができることが理解される。 As used herein, “antigen” refers to any substrate that can be specifically bound by an antibody molecule. As used herein, “immunogen” refers to an antigen capable of initiating lymphocyte activation that produces an antigen-specific immune response. As used herein, “epitope” or “antigenic determinant” refers to a site in an antigen molecule to which an antibody or lymphocyte receptor binds. Methods for determining epitopes are well known in the art, and such epitopes can be determined by those skilled in the art using such well known techniques once the primary sequence of the nucleic acid or amino acid is provided. It will be understood that the antibodies of the present invention can be used in the same manner even if they have the same epitope, even antibodies having other sequences.
本明細書において使用される抗体は、擬陽性が減じられる限り、どのような特異性の抗体を用いても良いことが理解される。従って、本発明において用いられる抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。 It will be appreciated that antibodies of any specificity may be used as long as false positives are reduced. Therefore, the antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
本明細書において「手段」とは、ある目的(例えば、検出、診断、治療)を達成する任意の道具となり得るものをいい、特に、本明細書では、「選択的に認識する手段」とは、ある対象を他のものとは異なって認識することができる手段をいう。 As used herein, “means” refers to any tool that can achieve a certain purpose (for example, detection, diagnosis, treatment). A means by which one object can be recognized differently from another.
本明細書において「マーカー(物質または遺伝子)」とは、ある状態(例えば、脳マラリアの疾患状態、障害状態、あるいは悪性状態のレベル、有無等)にあるかまたはその危険性があるかどうかを追跡する示標となる物質をいう。このようなマーカーとしては、遺伝子、遺伝子産物、代謝物質、酵素などを挙げることができる。本発明において、ある状態(例えば、脳マラリア等の疾患の状態)についての検出、診断、予備的検出、予測または事前診断は、その状態に関連するマーカーに特異的な薬剤、剤、因子または手段、あるいはそれらを含む組成物、キットまたはシステム等を用いて実現することができる。本明細書において、「発現産物」(遺伝子産物ともいう)とは、遺伝子によってコードされるタンパク質またはmRNAをいう。本明細書では、脳マラリアへの関連が示されていない遺伝子産物(CCL21、CXCR3、CCR7等)が脳マラリアの指標として使用可能であることが見出された。 As used herein, the term “marker (substance or gene)” indicates whether or not a certain state (for example, the level of disease state, disorder state, or malignant state of cerebral malaria, or the risk thereof) This refers to the substance that will be tracked. Such markers can include genes, gene products, metabolites, enzymes, and the like. In the present invention, detection, diagnosis, preliminary detection, prediction or pre-diagnosis for a certain state (for example, a disease state such as cerebral malaria) is a drug, agent, factor or means specific for the marker associated with the state. Or a composition, kit or system containing the same. As used herein, “expression product” (also referred to as gene product) refers to a protein or mRNA encoded by a gene. In the present specification, it has been found that gene products (CCL21, CXCR3, CCR7, etc.) that have not been shown to be associated with cerebral malaria can be used as indicators of cerebral malaria.
本明細書において「被験体(者)」とは、本発明の診断または検出、あるいは治療等の対象となる対象(例えば、ヒト等の生物または生物から取り出した細胞、血液、血清等)をいう。 In the present specification, the “subject (person)” refers to a subject to be diagnosed or detected or treated according to the present invention (eg, a living organism such as a human or a cell, blood, serum, etc. taken from the living organism). .
本明細書において「試料」とは、被験体等から得られた任意の物質をいい、例えば、血清等が含まれる。当業者は本明細書の記載をもとに適宜好ましい試料を選択することができる。 As used herein, “sample” refers to any substance obtained from a subject or the like, and includes, for example, serum and the like. Those skilled in the art can appropriately select a preferable sample based on the description of the present specification.
本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」(いずれも英語ではagentに相当する)は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素(例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー)でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸(例えば、cDNA、ゲノムDNAのようなDNA、mRNAのようなRNAを含む)、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子(例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子(例えば、低分子リガンドなど)など)、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を(例えば、70%以上の配列同一性)もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物(例えば、単鎖抗体)、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。 In the present specification, “drug”, “agent” or “factor” (both corresponding to “agent” in English) are used interchangeably in a broad sense, and so long as they can achieve their intended purpose. It may also be a substance or other element (eg energy such as light, radioactivity, heat, electricity). Examples of such substances include proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (eg, DNA such as cDNA and genomic DNA, RNA such as mRNA), poly Saccharides, oligosaccharides, lipids, small organic molecules (for example, hormones, ligands, signaling substances, small organic molecules, molecules synthesized by combinatorial chemistry, small molecules that can be used as pharmaceuticals (for example, small molecule ligands, etc.)) , These complex molecules, but not limited to. As a factor specific to a polynucleotide, typically, a polynucleotide having a certain sequence homology to the sequence of the polynucleotide (for example, 70% or more sequence identity) and a complementarity, Examples include, but are not limited to, a polypeptide such as a transcription factor that binds to the promoter region. Factors specific for a polypeptide typically include an antibody specifically directed against the polypeptide or a derivative or analog thereof (eg, a single chain antibody), and the polypeptide is a receptor. Alternatively, specific ligands or receptors in the case of ligands, and substrates thereof when the polypeptide is an enzyme include, but are not limited to.
本明細書において「診断」とは、被験体における疾患、障害、状態(例えば、脳マラリア)などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような疾患、障害、状態の現状または未来を判定することをいう。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、体内の状態を調べることができ、そのような情報を用いて、被験体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。本明細書において、狭義には、「診断」は、現状を診断することをいうが、広義には「早期診断」、「予測診断」、「事前診断」等を含む。本発明の診断方法は、原則として、身体から出たものを利用することができ、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。本明細書において、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることを明確にするために、特に「予測診断、事前診断もしくは診断」を「支援」すると称することがある。 As used herein, “diagnosis” identifies various parameters associated with a disease, disorder, condition (eg, cerebral malaria), etc. in a subject, and determines the current state or future of such a disease, disorder, or condition. That means. By using the methods, devices, and systems of the present invention, conditions in the body can be examined, and such information can be used to formulate a disease, disorder, condition, treatment to be administered or prevention in a subject. Alternatively, various parameters such as methods can be selected. In this specification, “diagnosis” in a narrow sense means diagnosis of the current state, but in a broad sense includes “early diagnosis”, “predictive diagnosis”, “preliminary diagnosis”, and the like. The diagnostic method of the present invention is industrially useful because, as a general rule, the diagnostic method of the present invention can be used from the body and can be performed away from the hands of medical personnel such as doctors. In this specification, in order to clarify that it can be performed away from a medical staff such as a doctor, “predictive diagnosis, pre-diagnosis or diagnosis” may be referred to as “support”.
本明細書において「検出薬(剤)」または「検査薬(剤)」とは、広義には、目的の対象を検出または検査することができるあらゆる薬剤をいう。 In this specification, “detection drug (agent)” or “test drug (agent)” refers to any drug that can detect or test a target object in a broad sense.
本明細書において「診断薬(剤)」とは、広義には、目的の状態(例えば、脳マラリア等の疾患など)を診断できるあらゆる薬剤をいう。 In this specification, the term “diagnostic agent (agent)” refers to any agent that can diagnose a target condition (for example, a disease such as cerebral malaria) in a broad sense.
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害(例えば、脳マラリア)について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消退させることをいい、患者の疾患、もしくは疾患に伴う1つ以上の症状の、症状改善効果あるいは予防効果を発揮しうることを含む。事前に診断を行って適切な治療を行うことは「コンパニオン治療」といい、そのための診断薬を「コンパニオン診断薬」ということがある。 As used herein, “treatment” refers to prevention of worsening of a disease or disorder when it becomes such a condition or disease (eg, cerebral malaria), Preferably, it refers to reduction, more preferably elimination, and includes the ability to exert a symptom improving effect or a preventive effect on one or more symptoms associated with the patient's disease or disease. Diagnosing in advance and performing appropriate treatment is referred to as “companion treatment”, and the diagnostic agent for this is sometimes referred to as “companion diagnostic agent”.
本明細書において「治療薬(剤)」とは、広義には、目的の状態(例えば、脳マラリア等の疾患など)を治療できるあらゆる薬剤をいい、本発明が提供するような阻害剤(例えば、抗体)をいう。本発明の一実施形態において「治療薬」は、有効成分と、薬理学的に許容される1つもしくはそれ以上の担体とを含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、例えば有効成分と上記担体とを混合し、製剤学の技術分野において知られる任意の方法により製造できる。また治療薬は、治療のために用いられる物であれば使用形態は限定されず、有効成分単独であってもよいし、有効成分と任意の成分との混合物であってもよい。また上記担体の形状は特に限定されず、例えば、固体または液体(例えば、緩衝液)であってもよい。 In the present specification, the term “therapeutic agent (agent)” broadly refers to any drug that can treat a target condition (for example, a disease such as cerebral malaria), and an inhibitor (for example, provided by the present invention) Antibody). In one embodiment of the present invention, a “therapeutic agent” may be a pharmaceutical composition comprising an active ingredient and one or more pharmaceutically acceptable carriers. The pharmaceutical composition can be produced by any method known in the technical field of pharmaceutics, for example, by mixing the active ingredient and the carrier. In addition, as long as the therapeutic agent is used for treatment, the form of use is not limited, and the active agent may be an active ingredient alone or a mixture of an active ingredient and an arbitrary ingredient. The shape of the carrier is not particularly limited, and may be, for example, a solid or a liquid (for example, a buffer solution).
本明細書において「予防」とは、ある疾患または障害(例えば、脳マラリア)について、そのような状態になる前に、そのような状態にならないようにすることをいう。本発明の薬剤を用いて、診断を行い、必要に応じて本発明の薬剤を用いて例えば、脳マラリア等の予防をするか、あるいは予防のための対策を講じることができる。 As used herein, “prevention” refers to preventing a certain disease or disorder (for example, cerebral malaria) from entering such a state before it enters such a state. Diagnosis can be performed using the drug of the present invention, and for example, cerebral malaria can be prevented or a preventive measure can be taken using the drug of the present invention as necessary.
本明細書において「予防薬(剤)」とは、広義には、目的の状態(例えば、脳マラリア等の疾患など)を予防できるあらゆる薬剤をいう。 As used herein, the term “prophylactic agent (agent)” refers to any agent that can prevent a target condition (for example, a disease such as cerebral malaria) in a broad sense.
本明細書において「相互作用」とは、2つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力(例えば、分子間力(ファンデルワールス力)、水素結合、疎水性相互作用など)を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした2つの物質は、会合または結合している状態にある。本発明の検出、検査および診断は、このような相互作用を利用して実現することができる。 In this specification, “interaction” refers to two substances, and forces (for example, intermolecular force (van der Waals force), hydrogen bond, hydrophobic interaction between one substance and the other substance. Etc.). Usually, two interacting substances are in an associated or bound state. The detection, inspection and diagnosis of the present invention can be realized by utilizing such interaction.
本明細書中で使用される用語「結合」は、2つの物質の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用(結合)は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。 As used herein, the term “bond” means a physical or chemical interaction between two substances or a combination thereof. Bonds include ionic bonds, non-ionic bonds, hydrogen bonds, van der Waals bonds, hydrophobic interactions, and the like. A physical interaction (binding) can be direct or indirect, where indirect is through or due to the effect of another protein or compound. Direct binding refers to an interaction that does not occur through or due to the effects of another protein or compound and does not involve other substantial chemical intermediates.
従って、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に」相互作用する(または結合する)「因子」(または、薬剤、検出剤等)とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の(特に、同一性が30%未満の)ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に(例えば、統計学的に有意に)高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。 Therefore, as used herein, a “factor” (or drug, detection agent, etc.) that interacts (or binds) “specifically” to a biological agent such as a polynucleotide or polypeptide refers to that poly The affinity for a biological agent such as a nucleotide or polypeptide thereof is typically equal or greater than the affinity for other unrelated (especially less than 30% identity) polynucleotides or polypeptides. Includes those that are high or preferably significantly (eg, statistically significant). Such affinity can be measured, for example, by hybridization assays, binding assays, and the like.
本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する(または結合する)とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子(特に、第二の物質または因子を含む試料中に存在する他の物質または因子)に対するよりも高い親和性で相互作用する(または結合する)ことをいう。物質または因子について特異的な相互作用(または結合)としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の反応、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する(または結合する)こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。2種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する(または結合する)ことには、抗体と、その抗原との間の相互作用(または結合)が包含される。このような特異的な相互作用または結合の反応を利用することにより、試料中の対象物の検出または定量を行うことができる。 As used herein, a first substance or factor interacts (or binds) “specifically” to a second substance or factor means that the first substance or factor has a relationship to the second substance or factor. Interact (or bind) with a higher affinity than a substance or factor other than the second substance or factor (especially other substances or factors present in the sample containing the second substance or factor) That means. Specific interactions (or bindings) for substances or factors include, for example, hybridization in nucleic acids, antigen-antibody reactions in proteins, enzyme-substrate reactions, nucleic acid and protein reactions, protein-lipid interactions, nucleic acid-lipids Examples include, but are not limited to, interactions. Thus, when both a substance or factor is a nucleic acid, the first substance or factor “specifically interacts” with the second substance or factor means that the first substance or factor has the second substance Or having at least a part of complementarity to the factor. Also, for example, when both substances or factors are proteins, the fact that the first substance or factor interacts (or binds) “specifically” to the second substance or factor is, for example, by antigen-antibody reaction Examples include, but are not limited to, interaction by receptor-ligand reaction, enzyme-substrate interaction, and the like. Where the two substances or factors include proteins and nucleic acids, the first substance or factor interacts (or binds) “specifically” to the second substance or factor by means of an antibody and its antigen Interaction (or binding) between is included. By utilizing such a specific interaction or binding reaction, an object in a sample can be detected or quantified.
本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現の「検出」または「定量」は、例えば、検出剤、検査剤または診断剤への結合または相互作用を含む、mRNAの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはPCR法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるELISA法、RIA法、蛍光抗体法、発光イムノアッセイ(LIA)、免疫沈降法(IP)、免疫拡散法(SRID)、免疫比濁法(TIA)、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ELISA法またはRIA法などが例示される。アレイ(例えば、DNAアレイ、プロテインアレイ)を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。DNAアレイについては、(秀潤社編、細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新PCR法」)に広く概説されている。プロテインアレイについては、NatGenet.2002 Dec;32 Suppl:526−532に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、RT−PCR、RACE法、SSCP法、免疫沈降法、two−hybridシステム、invitro翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔羊土社(2002)などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。 As used herein, “detection” or “quantification” of polynucleotide or polypeptide expression includes mRNA measurement and immunological measurement methods, including, for example, binding or interaction with a detection agent, test agent or diagnostic agent. It can be achieved using any suitable method. Examples of molecular biological measurement methods include Northern blotting, dot blotting, and PCR. Examples of immunological measurement methods include ELISA using a microtiter plate, RIA, fluorescent antibody, luminescence immunoassay (LIA), immunoprecipitation (IP), immunodiffusion (SRID), immunization Examples are turbidimetry (TIA), Western blotting, immunohistochemical staining, and the like. Examples of the quantification method include an ELISA method and an RIA method. It can also be performed by a gene analysis method using an array (eg, DNA array, protein array). The DNA array is widely outlined in (edited by Shujunsha, separate volume of cell engineering "DNA microarray and latest PCR method"). For protein arrays, see NatGenet. 2002 Dec; 32 Suppl: 526-532. Examples of gene expression analysis methods include, but are not limited to, RT-PCR, RACE method, SSCP method, immunoprecipitation method, two-hybrid system, in vitro translation and the like. Such further analysis methods are described in, for example, Genome Analysis Experimental Method / Yusuke Nakamura Laboratory Manual, Editing / Yusuke Nakamura Yodosha (2002), etc., all of which are incorporated herein by reference. Is done.
本明細書において「発現量」とは、目的の細胞、組織などにおいて、ポリペプチドまたはmRNA等が発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてELISA法、RIA法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、PCR法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのmRNAレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのタンパク質レベルまたはmRNAレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。あるマーカーの発現量を測定することによって、マーカーに基づく種々の検出または診断を行うことができる。 In the present specification, the “expression amount” refers to an amount in which a polypeptide or mRNA is expressed in a target cell, tissue or the like. Such expression level is evaluated by any appropriate method including immunoassay methods such as ELISA, RIA, fluorescent antibody, Western blot, and immunohistochemical staining using the antibody of the present invention. The amount of expression of the polypeptide of the present invention at the protein level, or the polypeptide used in the present invention evaluated by any suitable method including molecular biological measurement methods such as Northern blotting, dot blotting, and PCR. The expression level of the peptide at the mRNA level is mentioned. “Change in expression level” means expression at the protein level or mRNA level of the polypeptide used in the present invention evaluated by any appropriate method including the above immunological measurement method or molecular biological measurement method. Means that the amount increases or decreases. By measuring the expression level of a certain marker, various detection or diagnosis based on the marker can be performed.
本明細書において、活性、発現産物(例えば、タンパク質、転写物(RNAなど))の「減少」または「抑制」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における減少、または減少させる活性をいう。減少のうち「消失」した場合は、活性、発現産物等が検出限界未満になることをいい、特に「消失」ということがある。本明細書では、「消失」は「減少」または「抑制」に包含される。 As used herein, “reduction” or “suppression” or synonyms for activity, expression product (eg, protein, transcript (RNA, etc.)) or a synonym thereof is a decrease in the amount, quality or effect of a particular activity, transcript or protein. Or activity to decrease. When “disappears” of the decrease, it means that the activity, the expression product, etc. are below the detection limit, and in particular may be “disappear”. As used herein, “disappearance” is encompassed by “decrease” or “suppression”.
本明細書において、活性、発現産物(例えば、タンパク質、転写物(RNAなど))の「増加」または「活性化」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における増加または増加させる活性をいう。 As used herein, “increase” or “activation” of an activity, expression product (eg, protein, transcript (RNA, etc.)) or a synonym thereof refers to a quantity, quality or effect of a particular activity, transcript or protein. An activity that increases or increases.
本明細書において「(核酸)プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子(例えば、DNAまたはRNAなど)が用いられ得る。本明細書においてプライマーはマーカー検出手段として使用され得る。 In the present specification, the “(nucleic acid) primer” refers to a substance necessary for the initiation of a reaction of a polymer compound to be synthesized in a polymer synthesizing enzyme reaction. In the synthesis reaction of a nucleic acid molecule, a nucleic acid molecule (eg, DNA or RNA) complementary to a partial sequence of a polymer compound to be synthesized can be used. In the present specification, the primer can be used as a marker detection means.
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび/またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の手段となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチド、特異的抗体またはそのフラグメントなどが挙げられるがそれに限定されない。本明細書においてプローブは、マーカー検出、検査または診断の手段としてもちいられる。 As used herein, the term “probe” refers to a substance that serves as a search means used in biological experiments such as screening in vitro and / or in vivo. For example, a nucleic acid molecule containing a specific base sequence or a specific nucleic acid molecule Examples include, but are not limited to, peptides containing amino acid sequences, specific antibodies or fragments thereof. In the present specification, the probe is used as a means for marker detection, inspection or diagnosis.
本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在(例えば、物質、エネルギー、電磁波など)をいう。そのような標識方法としては、RI(ラジオアイソトープ)法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができる。本発明のマーカーまたはそれを捕捉する因子または手段を複数、蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、10nm以上であることが好ましい。リガンドを標識する場合、機能に影響を与えないものならば何れも用いることができるが、蛍光物質としては、AlexaTM Fluorが望ましい。AlexaTMFluorは、クマリン、ローダミン、フルオレセイン、シアニンなどを修飾して得られた水溶性の蛍光色素であり、広範囲の蛍光波長に対応したシリーズであり、他の該当波長の蛍光色素に比べ、非常に安定で、明るく、またpH感受性が低い。蛍光極大波長が10nm以上ある蛍光色素の組み合わせとしては、AlexaTM555とAlexaTM633の組み合わせ、AlexaTM488とAlexaTM555の組み合わせ等を挙げることができる。核酸を標識する場合は、その塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素(例えば、CyDyeTMシリーズのCy3、Cy5等)、ローダミン6G試薬、2−アセチルアミノフルオレン(AAF)、AAIF(AAFのヨウ素誘導体)等を使用することが好ましい。蛍光発光極大波長の差が10nm以上である蛍光物質としては、例えば、Cy5とローダミン6G試薬との組み合わせ、Cy3とフルオレセインとの組み合わせ、ローダミン6G試薬とフルオレセインとの組み合わせ等を挙げることができる。本発明では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。In this specification, the “label” refers to a presence (for example, a substance, energy, electromagnetic wave, etc.) for distinguishing a target molecule or substance from others. Examples of such a labeling method include RI (radioisotope) method, fluorescence method, biotin method, chemiluminescence method and the like. When the marker of the present invention or a plurality of factors or means for capturing the same are labeled by the fluorescence method, the labeling is performed with fluorescent substances having different fluorescence emission maximum wavelengths. The difference in the maximum fluorescence emission wavelength is preferably 10 nm or more. When labeling a ligand, any substance that does not affect the function can be used, but Alexa ™ Fluor is preferred as the fluorescent substance. Alexa ™ Fluor is a water-soluble fluorescent dye obtained by modifying coumarin, rhodamine, fluorescein, cyanine, etc., and is a series corresponding to a wide range of fluorescent wavelengths. Stable, bright and low pH sensitive. Examples of combinations of fluorescent dyes having a fluorescence maximum wavelength of 10 nm or more include a combination of Alexa ™ 555 and Alexa ™ 633, a combination of Alexa ™ 488 and Alexa ™ 555, and the like. Any nucleic acid can be used as long as it can bind to its base moiety. For example, a cyanine dye (for example, CyDye ™ series Cy3, Cy5 etc.), rhodamine 6G reagent, 2-acetylaminofluorene ( AAF), AAIF (iodine derivative of AAF) and the like are preferably used. Examples of the fluorescent substance having a fluorescence emission maximum wavelength difference of 10 nm or more include a combination of Cy5 and rhodamine 6G reagent, a combination of Cy3 and fluorescein, a combination of rhodamine 6G reagent and fluorescein, and the like. In the present invention, by using such a label, the target object can be modified so that it can be detected by the detection means used. Such modifications are known in the art, and those skilled in the art can appropriately carry out such methods depending on the label and the target object.
本明細書において使用される場合、「タグ」とは、受容体−リガンドのような特異的認識機構により分子を選別するための物質、より具体的には、特定の物質を結合するための結合パートナーの役割を果たす物質(例えば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジンのような関係を有する)をいい、「標識」の範疇に含まれうる。よって、例えば、タグが結合した特定の物質は、タグ配列の結合パートナーを結合させた基材を接触させることで、この特定の物質を選別することができる。このようなタグまたは標識は、当該分野で周知である。代表的なタグ配列としては、mycタグ、Hisタグ、HA、Aviタグなど
が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のマーカーまたはマーカーの検出剤、検査剤、診断剤(プライマーまたはプローブ等であり得る)にはこのようなタグを結合させてもよい。As used herein, a “tag” is a substance for sorting molecules by a specific recognition mechanism such as a receptor-ligand, more specifically, a binding for binding a specific substance. A substance that plays the role of a partner (for example, having a relationship such as biotin-avidin or biotin-streptavidin) and can be included in the category of “label”. Thus, for example, a specific substance to which a tag is bound can be selected by bringing the substrate to which the binding partner of the tag sequence is bound into contact. Such tags or labels are well known in the art. Representative tag sequences include, but are not limited to, myc tag, His tag, HA, Avi tag and the like. Such a tag may be bound to the marker of the present invention, a marker detection agent, a test agent, or a diagnostic agent (which may be a primer or a probe).
本明細書において「インビボ」(in vivo)とは、生体の内部をいう。特定の文脈において、「生体内」は、目的とする物質が配置されるべき位置をいう。 As used herein, “in vivo” refers to the inside of a living body. In a particular context, “in vivo” refers to the location where the target substance is to be placed.
本明細書において「インビトロ」(in vitro)とは、種々の研究目的のために生体の一部分が「生体外に」(例えば、試験管内に)摘出または遊離されている状態をいう。インビボと対照をなす用語である。 As used herein, “in vitro” refers to a state in which a part of a living body is removed or released “in vitro” (eg, in a test tube) for various research purposes. A term that contrasts with in vivo.
本明細書において「エキソビボ」とは、ある処置について、体外で行われるがその後体内に戻されることが意図される場合、一連の動作をエキソビボという。本発明においても、生体内にある細胞を本発明の薬剤で処置して再度患者に戻すような実施形態を想定することができる。 As used herein, “ex vivo” refers to a series of operations ex vivo when a treatment is performed outside the body but is then intended to be returned to the body. Also in the present invention, an embodiment in which cells in vivo are treated with the agent of the present invention and returned to the patient can be envisaged.
本明細書において「キット」とは、通常2つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分(例えば、検査薬、診断薬、治療薬、抗体、標識、説明書など)が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分(例えば、検査薬、診断薬、治療薬をどのように使用するか、あるいは、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、検査薬、診断薬、治療薬、抗体等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。 In this specification, the “kit” is a unit provided with a portion to be provided (eg, a test agent, a diagnostic agent, a therapeutic agent, an antibody, a label, instructions, etc.) usually divided into two or more compartments. Say. The form of this kit is preferred when it is intended to provide a composition that should not be provided in admixture because of stability, etc., but preferably used in admixture immediately prior to use. Such kits preferably include instructions or instructions describing how to use the provided parts (eg, how to use test agents, diagnostic agents, therapeutic agents, or how to process the reagents) In the present specification, when the kit is used as a reagent kit, the kit usually contains instructions including usage of test agents, diagnostic agents, therapeutic agents, antibodies, etc. Is included.
本明細書において「指示書」は、本発明を使用する方法を医師または他の使用者に対する説明を記載したものである。この指示書は、本発明の検出方法、診断薬の使い方、または医薬などを投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与部位として、経口、食道への投与(例えば、注射などによる)することを指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁(例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局(FDA)など)が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書(packageinsert)であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体(例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール)のような形態でも提供され得る。 In the present specification, the “instruction” describes a method for using the present invention to a doctor or other user. This instruction describes a word indicating that the detection method of the present invention, how to use a diagnostic agent, or administration of a medicine or the like is given. In addition, the instruction sheet may include a word indicating that the administration site is oral or esophageal administration (for example, by injection). This instruction is prepared in accordance with the format prescribed by the national supervisory authority (for example, the Ministry of Health, Labor and Welfare in Japan and the Food and Drug Administration (FDA) in the United States, etc.) in the country where the present invention is implemented, and is approved by the supervisory authority. It is clearly stated that it has received. The instruction sheet is a so-called package insert and is usually provided as a paper medium, but is not limited thereto. For example, the instruction sheet may be in a form such as an electronic medium (for example, a home page or e-mail provided on the Internet). Can be provided.
(好ましい実施形態)
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本発明の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。(Preferred embodiment)
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described. The embodiments provided below are provided for a better understanding of the present invention, and it is understood that the scope of the present invention should not be limited to the following description. Therefore, it is obvious that those skilled in the art can make appropriate modifications within the scope of the present invention with reference to the description in the present specification. It will also be appreciated that the following embodiments of the invention may be used alone or in combination.
(嗅球の状態に基づく脳マラリアの診断)
1つの局面において、本発明は、被験体の嗅球(OLF)の状態を脳マラリアの指標とする方法を提供する。あるいは、本発明は、被験体の嗅球(OLF)の状態を判定する工程を包含する、脳マラリアの診断方法を提供する。ここで、被験体の嗅球が異常であることは、該被験体が脳マラリアに罹患していることの指標であることが本発明において見出された。このような診断は、脳マラリアの他の症状が出る前に見出すことができることから、脳マラリアの早期診断を可能にするものとして注目されるべきである。すなわち、被験体の嗅球の異常は、脳マラリアの罹患早期の指標といえる。また、嗅球の状態の判定は、種々の手法で行うことが可能であり、脳マラリアの早期診断、および本発明が初めて提供するもののような脳マラリアの予防または治療薬を投与することで、脳マラリアの本格的な処置を可能にするという点でも注目される。(Diagnosis of brain malaria based on the state of the olfactory bulb)
In one aspect, the present invention provides a method using the state of a subject's olfactory bulb (OLF) as an indicator of brain malaria. Alternatively, the present invention provides a method for diagnosing cerebral malaria comprising the step of determining the state of a subject's olfactory bulb (OLF). Here, it was found in the present invention that an abnormality of the subject's olfactory bulb is an indicator that the subject suffers from cerebral malaria. Such a diagnosis should be noted as enabling early diagnosis of cerebral malaria because it can be found before other symptoms of cerebral malaria occur. That is, the abnormality of the subject's olfactory bulb can be said to be an early indicator of cerebral malaria. Further, the determination of the state of the olfactory bulb can be performed by various methods, and the early diagnosis of cerebral malaria and administration of a preventive or therapeutic agent for cerebral malaria such as those provided for the first time by the present invention, It is also noted that it enables full-scale treatment of malaria.
1つの実施形態において、本発明が判定する被験体の嗅球(OLF)の状態は、嗅覚異常、細胞検査および嗅球の診断画像等を挙げることができるが、これらに限定されない。したがって、本発明の診断方法は、嗅覚異常、細胞検査および嗅球の診断画像等から選択される少なくとも1つを行う工程を包含し、その結果によって、被験体の嗅球(OLF)の状態を判定することができ、それによって、脳マラリアの罹患早期の指標とすることができる。 In one embodiment, the subject's olfactory bulb (OLF) state determined by the present invention can include, but is not limited to, olfactory abnormalities, cytological examinations, diagnostic images of the olfactory bulb, and the like. Therefore, the diagnostic method of the present invention includes a step of performing at least one selected from olfactory abnormalities, cytological examination, diagnostic images of the olfactory bulb, and the like, and based on the result, the state of the olfactory bulb (OLF) of the subject is determined. It can be used as an indicator of early stage of cerebral malaria.
本明細書において、嗅覚は、食品に対する反応、芳香剤に対する反応、(他の可能な試験をご列挙ください)等があり、嗅覚測定法としては、例えば、各種におい物質に対する基準嗅覚検査、アリナミンなどを用いる静脈的嗅覚検査、ASTM注射器法,無臭室法,セントメータ法,食塩水平衡法,三点比較式臭袋法などによって試験することができる。 In this specification, olfaction includes reactions to foods, reactions to fragrances, (please list other possible tests), and examples of olfaction measurement methods include standard olfactory tests for various odorous substances, alinamine, etc. Can be tested by a venous olfactory test, an ASTM syringe method, an odorless chamber method, a centometer method, a saline balance method, a three-point comparison odor bag method, and the like.
本明細書において、嗅球の診断画像は核磁気共鳴映像法(MRI)によって得られたものであり得るが、これに限定されない。本発明が使用する「超高磁場」の核磁気共鳴画像法(MRI)としては、現在臨床用として使用されている3テスラ(T)の磁場またはそれを超える高い磁場、例えば、少なくとも3テスラ以上、少なくとも4テスラ以上、少なくとも5テスラ以上、少なくとも6テスラ以上、少なくとも7テスラ以上、少なくとも8テスラ以上、少なくとも9テスラ以上、少なくとも10テスラ以上、少なくとも11テスラ以上、少なくとも12テスラ以上でのMRIを挙げることができる。実施例では、11.7テスラのものが使用され、嗅球の状態を判定することができている。 In this specification, the diagnostic image of the olfactory bulb may be obtained by nuclear magnetic resonance imaging (MRI), but is not limited thereto. The “ultra high magnetic field” nuclear magnetic resonance imaging (MRI) used by the present invention includes a magnetic field of 3 Tesla (T) currently used for clinical use or a high magnetic field exceeding it, for example, at least 3 Tesla or more. MRI at least 4 Tesla, at least 5 Tesla, at least 6 Tesla, at least 7 Tesla, at least 8 Tesla, at least 9 Tesla, at least 10 Tesla, at least 11 Tesla, at least 12 Tesla be able to. In the embodiment, 11.7 Tesla is used, and the state of the olfactory bulb can be determined.
本発明の判定において、診断画像において、スポットが観察されることは脳マラリアの指標である。このようなスポットは、嗅球に異常があることが示されるものであり、脳マラリアの感染の指標であることが本発明において明らかになった。 In the determination of the present invention, the observation of spots in the diagnostic image is an indicator of cerebral malaria. Such a spot indicates that there is an abnormality in the olfactory bulb, and it was revealed in the present invention that it is an index of brain malaria infection.
本発明では、嗅球の状態は、細胞検査によって判定してもよく、そのような判定は、染色(例えば、ヘマトキシリン・エオシン(HE)染色)または免疫組織化学法で検査される。 In the present invention, the state of the olfactory bulb may be determined by cytological examination, and such determination is examined by staining (for example, hematoxylin and eosin (HE) staining) or immunohistochemistry.
1つの局面では、本発明は、嗅球の状態を測定する手段を含む、脳マラリアの検出または診断のための装置を提供する。このような装置は、上記方法を実現するものであれば、どのようなものでもよいことが理解される。 In one aspect, the present invention provides an apparatus for detection or diagnosis of cerebral malaria comprising means for measuring the state of the olfactory bulb. It will be understood that such an apparatus may be any apparatus that implements the above method.
1つの実施形態では、本発明の装置において用いられる手段は、磁気共鳴画像化(MRI)手段である。好ましくは、本発明において用いられるMRIは、超高磁場MRIである。通常のMRIでは、嗅球の異常をとらえることができなかったが、本発明では、超高磁場のMRIを用いることによって、はじめて、嗅球の異常を脳マラリアとの関係を解明することができた。したがって、本発明は、超高磁場によるMRIを用いるという点でも顕著性を示すといえる。 In one embodiment, the means used in the apparatus of the present invention is a magnetic resonance imaging (MRI) means. Preferably, the MRI used in the present invention is an ultra high magnetic field MRI. Ordinary MRI could not detect abnormalities of the olfactory bulb. However, in the present invention, the relationship between abnormalities of the olfactory bulb and brain malaria could be elucidated for the first time by using MRI of an ultrahigh magnetic field. Therefore, it can be said that the present invention is remarkable in that MRI using an ultrahigh magnetic field is used.
(CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系に基づく治療剤)
別の局面において、本発明は、CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の少なくとも1つの因子の阻害剤を含む、脳マラリアの予防または治療剤、予防薬または治療薬、予防または治療のための医薬もしくは医薬組成物(これらの用語は、本明細書において特に断らない限り相互に交換可能に使用され同じ対象を指す。)を提供する。あるいは、本発明は、脳マラリアの予防または治療のための、CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の少なくとも1つの因子の阻害剤を提供する。この治療または予防薬または特定の治療または予防用の阻害剤を用いれば、脳マラリアを治療または予防することができる。またこの予防または治療薬は、これまで治療・予防法がなかった脳マラリアに初めて予防および治療薬を提供するという点で優れており、好ましい実施形態で使用される場合は抗体を使用するため、安全性の観点から優れている。(Therapeutic agent based on CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system)
In another aspect, the present invention relates to a prophylactic or therapeutic agent for cerebral malaria, a prophylactic or therapeutic agent, a pharmaceutical agent for prevention or treatment, comprising an inhibitor of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system. Provided are pharmaceutical compositions (these terms are used interchangeably herein unless otherwise indicated) and refer to the same subject. Alternatively, the present invention provides an inhibitor of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system for the prevention or treatment of cerebral malaria. Brain malaria can be treated or prevented by using this therapeutic or prophylactic agent or a specific therapeutic or prophylactic inhibitor. In addition, this prophylactic or therapeutic agent is superior in that it provides a prophylactic and therapeutic agent for the first time for cerebral malaria for which there has been no treatment / prevention method so far, and since an antibody is used when used in a preferred embodiment, Excellent from the viewpoint of safety.
1つの実施形態では、本発明が使用するCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の少なくとも1つの因子の阻害剤は、CCL21、CXCR3およびCCR7、ならびにこれらをコードする核酸からなる群より選択される少なくとも1つ因子の阻害剤を含む。 In one embodiment, the inhibitor of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system used by the present invention is at least one selected from the group consisting of CCL21, CXCR3 and CCR7, and nucleic acids encoding them. Inhibitor of one factor.
より特定した実施形態では、本発明の阻害剤は、低分子化合物、抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、siRNA、shRNA、アンチセンス核酸、アプタマー、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも1種含む。これらは、2種以上使用してもよい。 In a more specific embodiment, the inhibitor of the present invention is a small molecule compound, antibody or fragment or functional equivalent thereof, siRNA, shRNA, antisense nucleic acid, aptamer, pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof. Or at least one solvate of a pharmaceutically acceptable salt thereof. Two or more of these may be used.
好ましい実施形態では、本発明で使用される阻害剤は、抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、および抗CCR7抗体からなる群より選択される少なくとも1種の抗体、またはそのフラグメントもしくは機能的等価物を含む。より好ましい実施形態では、本発明で使用される阻害剤は、抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体および抗CCR7抗体からなる群より選択される少なくとも2種の抗体、またはそのフラグメントもしくは機能的等価物を含む。理論に束縛されることを望まないが、CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系のうちの2か所以上で阻害効果を発揮させることによって脳マラリアのより顕著な効果がおいて示されており、より効果を望む場合には2種類以上の因子の阻害が好ましいと想定される。 In a preferred embodiment, the inhibitor used in the present invention comprises at least one antibody selected from the group consisting of an anti-CCL21 antibody, an anti-CXCR3 antibody, and an anti-CCR7 antibody, or a fragment or functional equivalent thereof. . In a more preferred embodiment, the inhibitor used in the present invention comprises at least two antibodies selected from the group consisting of an anti-CCL21 antibody, an anti-CXCR3 antibody and an anti-CCR7 antibody, or fragments or functional equivalents thereof. . Although not wishing to be bound by theory, it has been shown to have a more pronounced effect of brain malaria by exerting an inhibitory effect in two or more of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling systems, and more When an effect is desired, it is assumed that inhibition of two or more types of factors is preferable.
さらに別の実施形態では、本発明で使用される阻害剤は、抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体および抗CCR7抗体の3種の抗体、またはそのフラグメントもしくは機能的等価物を含む。 In yet another embodiment, the inhibitor used in the present invention comprises three antibodies, anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody and anti-CCR7 antibody, or fragments or functional equivalents thereof.
本発明の一実施形態に係る抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等は、重鎖CDR1、2、および3、ならびに軽鎖CDR1、2および3のアミノ酸配列のセットを含み、さらに、重鎖FR1、2、3、4、軽鎖FR1、2、3、および4のうち少なくとも1つ、好ましくは2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、あるいはすべてのフレームワークが特定されたもののいずれかのものと同一または実質的に同一あるいは保存的置換を除き同一であるものであり得る。1種以上の抗体であってもよい。また本発明の別の実施形態は、上に列挙した重鎖FR1、2、3、および4のアミノ酸配列のセットのうち、少なくとも1つのセットを含む抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等である。 The anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like according to one embodiment of the present invention include a set of amino acid sequences of heavy chain CDR1, 2, and 3 and light chain CDR1, 2, and 3, At least one, preferably two, three, four, five, six, seven, or all frameworks of chain FR1, 2, 3, 4, light chain FR1, 2, 3, and 4 Can be the same or substantially the same as any of those specified or the same except for conservative substitutions. One or more antibodies may be used. Another embodiment of the present invention provides an anti-CCL21 antibody, an anti-CXCR3 antibody, an anti-CCR7 antibody, etc., comprising at least one of the amino acid sequence sets of heavy chains FR1, 2, 3, and 4 listed above. It is.
本発明の一実施形態に係る抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等は、scFvの形態であってもよく、その場合、重鎖と軽鎖間のリンカーは、重鎖と軽鎖との間のアミノ酸配列を有していてもよい。上に列挙したアミノ酸配列は、抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等が所望の効果を有する限り、(i)上記のアミノ酸配列において、1または数個の塩基配列が欠失、置換、挿入、もしくは付加しているアミノ酸配列、(ii)上記のアミノ酸配列に対して、90%以上の相同性を有するアミノ酸配列、および(iii)上記のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列、からなる群から選ばれる1つ以上のアミノ酸配列であってもよい。 The anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody and the like according to an embodiment of the present invention may be in the form of scFv. It may have an amino acid sequence between As long as the anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody, etc. have a desired effect, (i) one or several nucleotide sequences are deleted or substituted in the above amino acid sequences. An inserted or added amino acid sequence, (ii) an amino acid sequence having 90% or more homology with the above amino acid sequence, and (iii) a base complementary to the base sequence encoding the above amino acid sequence It may be one or more amino acid sequences selected from the group consisting of an amino acid sequence encoded by a polynucleotide that specifically hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide comprising the sequence.
本発明の一実施形態に係る抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等をコードするポリヌクレオチドまたはベクターを細胞に導入することによって、形質転換体を作成できる。この形質転換体を用いれば、本発明の実施形態に係る抗CCL21抗体、抗CXCR3抗体、抗CCR7抗体等を作製できる。形質転換体は、ヒトまたはヒトを除く哺乳動物(例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ウシ、サル等)の細胞であってもよい。哺乳動物細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、サル細胞COS−7などが挙げられる。または、形質転換体はEscherichia属菌、酵母等であってもよい。 A transformant can be prepared by introducing a polynucleotide or vector encoding an anti-CCL21 antibody, anti-CXCR3 antibody, anti-CCR7 antibody, or the like according to an embodiment of the present invention into a cell. By using this transformant, an anti-CCL21 antibody, an anti-CXCR3 antibody, an anti-CCR7 antibody and the like according to an embodiment of the present invention can be produced. The transformant may be a cell of a human or a mammal other than a human (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, cow, monkey, etc.). Examples of mammalian cells include Chinese hamster ovary cells (CHO cells), monkey cells COS-7, and the like. Alternatively, the transformant may be Escherichia genus, yeast or the like.
上記のベクターとしては、例えば大腸菌由来のプラスミド(例えばpET−Blue)、枯草菌由来のプラスミド(例えばpUB110)、酵母由来プラスミド(例えばpSH19)、動物細胞発現プラスミド(例えばpA1−11、pcDNA3.1−V5/His−TOPO)、λファージなどのバクテリオファージ、ウイルス由来のベクターなどを用いることができる。これらのベクターは、プロモーター、複製開始点、または抗生物質耐性遺伝子など、タンパク質発現に必要な構成要素を含んでいてもよい。ベクターは発現ベクターであってもよい。 Examples of the vectors include plasmids derived from E. coli (eg, pET-Blue), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110), yeast-derived plasmids (eg, pSH19), and animal cell expression plasmids (eg, pA1-11, pcDNA3.1). V5 / His-TOPO), bacteriophages such as λ phage, virus-derived vectors, and the like can be used. These vectors may contain components necessary for protein expression, such as a promoter, origin of replication, or antibiotic resistance gene. The vector may be an expression vector.
上記のポリヌクレオチドまたはベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、アデノウイルスによる方法、レトロウイルスによる方法、またはマイクロインジェクションなどを使用できる(改訂第4版 新 遺伝子工学ハンドブック,羊土社(2003):152−179.)。抗体の細胞を用いた生産方法としては、例えば、″タンパク質実験ハンドブック,羊土社(2003):128−142.″に記載の方法を使用できる。抗体の精製においては、例えば、硫酸アンモニウム、エタノール沈殿、プロテインA、プロテインG、ゲルろ過クロマトグラフィー、陰イオン、陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、またはレクチンクロマトグラフィーなどを用いることができる(タンパク質実験ハンドブック,羊土社(2003):27−52.)。 As a method for introducing the above-described polynucleotide or vector into cells, for example, calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method, adenovirus method, retrovirus method, or microinjection can be used (Revised 4th edition) New Genetic Engineering Handbook, Yodosha (2003): 152-179.). As a production method using antibody cells, for example, the method described in “Protein Experiment Handbook, Yodosha (2003): 128-142.” Can be used. In the purification of antibodies, for example, ammonium sulfate, ethanol precipitation, protein A, protein G, gel filtration chromatography, anion, cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyl Apatite chromatography, lectin chromatography or the like can be used (Protein Experiment Handbook, Yodosha (2003): 27-52.).
別の実施形態では、前記CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の阻害剤は、抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物である。抗体は、全長配列のCDRを含む任意の配列を含む抗体またはその抗原結合フラグメント、あるいは、特定の配列の可変領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメントであって、そのフレームワーク領域において、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、12個、15個、17個、もしくは、20個、またはそれ以上の置換、不可、もしくは、欠失を含む抗体またはその抗原結合フラグメントであってもよい。抗体の製造等については、本明細書の他の箇所に記載された実施形態および/または当該分野で公知の手法を用いることができる。なお、本発明の治療または予防の目的では、このような抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物は、好ましくは、CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の下流の阻害活性を有することが好ましい。 In another embodiment, the inhibitor of CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system factor is an antibody or fragment or functional equivalent thereof. The antibody is an antibody or an antigen-binding fragment thereof containing an arbitrary sequence including a CDR of the full-length sequence, or an antibody or an antigen-binding fragment thereof containing a variable region of a specific sequence, one in its framework region, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, or 20 or more substitutions, impossible, or Or an antibody or antigen-binding fragment thereof containing the deletion. For the production of antibodies, etc., embodiments described elsewhere in this specification and / or techniques known in the art can be used. For the purpose of treatment or prevention of the present invention, such an antibody or a fragment or functional equivalent thereof preferably has an inhibitory activity downstream of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system.
本発明を実施するために、本発明の核酸形態の抑制剤としてはアンチセンス活性を指標に核酸を選択することができる。ここで、「アンチセンス活性」とは、標的となる遺伝子の発現を特異的に抑制または減少させることができる活性をいう。より具体的には細胞内に導入したあるヌクレオチド配列に依存して、その配列と相補的なヌクレオチド配列領域をもつ遺伝子のmRNA量を特異的に低下させることで、タンパク発現量を減少させ得る活性をいう。手法としては、標的となる遺伝子からつくられるmRNAに相補的なRNA分子を直接的に細胞に導入する方法と、細胞内に目的遺伝子と相補的なRNAを発現させ得る構築ベクターを導入する方法に大別される。 In order to carry out the present invention, nucleic acid can be selected as an inhibitor of the nucleic acid form of the present invention using antisense activity as an index. Here, “antisense activity” refers to an activity capable of specifically suppressing or reducing the expression of a target gene. More specifically, depending on a certain nucleotide sequence introduced into the cell, an activity that can reduce the protein expression level by specifically reducing the mRNA level of a gene having a nucleotide sequence region complementary to that sequence. Say. As a technique, there are a method for directly introducing an RNA molecule complementary to mRNA produced from a target gene into a cell, and a method for introducing a construction vector capable of expressing RNA complementary to a target gene into the cell. Broadly divided.
アンチセンス活性は、通常、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも8の連続するヌクレオチド長の核酸配列によって達成される。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも9の連続するヌクレオチド長の、より好ましく10の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは11の連続するヌクレオチド長の、12の連続するヌクレオチド長の、13の連続するヌクレオチド長の、14の連続するヌクレオチド長の、15の連続するヌクレオチド長の、16の連続するヌクレオチド長の、17の連続するヌクレオチド長の、18の連続するヌクレオチド長の、19の連続するヌクレオチド長の、20の連続するヌクレオチド長の、21の連続するヌクレオチド長の、22の連続するヌクレオチド長の、23の連続するヌクレオチド長の、24の連続するヌクレオチド長の、25の連続するヌクレオチド長の、30の連続するヌクレオチド長の、40の連続するヌクレオチド長の、50の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。そのような核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも70%相同な、より好ましくは、少なくとも80%相同な、さらに好ましくは、90%相同な、95%相同な核酸配列が含まれる。そのようなアンチセンス活性は、目的とする遺伝子の核酸配列の5’末端の配列に対して相補的であることが好ましい。そのようなアンチセンスの核酸配列には、上述の配列に対して、1つまたは数個あるいは1つ以上のヌクレオチドの置換、付加および/または欠失を有するものもまた含まれる。したがって、本明細書において、アンチセンス活性には、遺伝子の発現量の減少が含まれるがそれらに限定されない。 Antisense activity is usually achieved by a nucleic acid sequence of at least 8 contiguous nucleotides that is complementary to the nucleic acid sequence of the gene of interest. Such a nucleic acid sequence is preferably at least 9 contiguous nucleotides long, more preferably 10 contiguous nucleotides long, even more preferably 11 contiguous nucleotides long, 12 contiguous nucleotides long, 13 19 contiguous nucleotide lengths, 14 contiguous nucleotide lengths, 15 contiguous nucleotide lengths, 16 contiguous nucleotide lengths, 17 contiguous nucleotide lengths, 18 contiguous nucleotide lengths, 19 contiguous lengths Nucleotide length, 20 contiguous nucleotide lengths, 21 contiguous nucleotide lengths, 22 contiguous nucleotide lengths, 23 contiguous nucleotide lengths, 24 contiguous nucleotide lengths, 25 contiguous nucleotide lengths Of 40 consecutive nucleotides of 30 consecutive nucleotide lengths Plastid length of contiguous nucleotides in length 50, may be a nucleic acid sequence. Such nucleic acid sequences include nucleic acid sequences that are at least 70% homologous, more preferably at least 80% homologous, more preferably 90% homologous, 95% homologous to the sequences described above. Such antisense activity is preferably complementary to a sequence at the 5 'end of the nucleic acid sequence of the gene of interest. Such antisense nucleic acid sequences also include those having one, several or one or more nucleotide substitutions, additions and / or deletions relative to the sequences described above. Therefore, in the present specification, antisense activity includes, but is not limited to, a decrease in gene expression level.
一般的なアンチセンス技術については、教科書に記載されている(Murray,JAH eds.,Antisense RNA and DNA,Wiley−Liss Inc,1992)。さらに最新の研究でRNA干渉(RNAinterference;RNAi)と呼ばれる現象が明らかになり、アンチセンス技術の発展をもたらした。 General antisense techniques are described in textbooks (Murray, JAH eds., Antisense RNA and DNA, Wiley-Liss Inc, 1992). Furthermore, the latest research has revealed a phenomenon called RNA interference (RNAi), which has led to the development of antisense technology.
本明細書において「RNA干渉」または「RNAi」とは、RNA interferenceの略称で、当該分野で一般に知られており、RNAiを引き起こす因子によって媒介される、細胞における遺伝子発現を阻害または下方制御する生物学的プロセスである。例えば、二本鎖RNA(dsRNAともいう)のようなRNAiを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同なmRNAが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用いられる技術をいう。本明細書において「RNAi」はまた、場合によっては、「RNAiを引き起こす因子」、「RNAiを起こす因子」、「RNAi因子」などと同義に用いられ得る。RNAiについては、例えば、Zamore and Haley,2005,Science,309,1519−1524;Vaughn and Martienssen,2005,Science,309,1525−1526;Zamore et al.,2000,Cell,101,25−33;Bass,2001,Nature,411,428−429;Elbashiretal.,2001,Nature,411,494−498;およびKreutzer他、国際公開第00/44895号;Zernicka−Goetz他、国際公開第01/36646号;Fire、国際公開第99/32619号;Plaetinck他、国際公開第00/01846号;MelloおよびFire、国際公開第01/29058号;Deschamps−Depaillette、国際公開第99/07409号およびLi他、国際公開第00/44914号;Allshire,2002,Science,297,1818−1819;Volpe et al.,2002,Science,297,1833−1837;Jenuwein,2002,Science,297,2215−2218;およびHall et al.,2002,Science,297,2232−2237;Hutvagner andZamore,2002,Science,297,2056−60;McManus et al.,2002,RNA,8,842−850;Reinhart et al.,2002,gene & Dev.,16,1616−1626;およびReinhart & Bartel,2002,Science,297,1831を参照。)。また、本明細書では、RNAiという用語は、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、エピジェネティクスなどの配列特異的RNA干渉の記述に用いられる他の用語と同義のものを示すものとして理解される。本明細書では、「RNAiを起こす因子」は「RNAi」を起こす限りどのようなものであってもよい。 As used herein, “RNA interference” or “RNAi” is an abbreviation for RNA interference, an organism that is generally known in the art and that inhibits or down-regulates gene expression in cells mediated by factors that cause RNAi. Process. For example, a phenomenon in which homologous mRNA is specifically decomposed by introducing a factor causing RNAi such as double-stranded RNA (also referred to as dsRNA) into a cell, and the synthesis of a gene product is suppressed, and a technique used therefor Say. In this specification, “RNAi” can also be used synonymously with “factor causing RNAi”, “factor causing RNAi”, “RNAi factor” and the like in some cases. For RNAi, see, for example, Zamore and Haley, 2005, Science, 309, 1519-1524; Vaughn and Martinsensen, 2005, Science, 309, 1525-1526; Zamore et al. 2000, Cell, 101, 25-33; Bass, 2001, Nature, 411, 428-429; Elbashirital. , 2001, Nature, 411, 494-498; and Kreutzer et al., WO 00/44895; Zernica-Goetz et al., WO 01/36646; Fire, WO 99/32619; Plaetinck et al., International Publication No. 00/01846; Melo and Fire, International Publication No. 01/29058; Deschamps-Depairlette, International Publication No. 99/07409 and Li et al., International Publication No. 00/44914; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al. , 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; and Hall et al. , 2002, Science, 297, 2232-2237; Hutvagner and Zamore, 2002, Science, 297, 2056-60; McManus et al. , 2002, RNA, 8, 842-850; Reinhart et al. , 2002, gene & Dev. 16, 1616-1626; and Reinhart & Bartel, 2002, Science, 297, 1831. ). In this specification, the term RNAi is synonymous with other terms used to describe sequence-specific RNA interference such as post-transcriptional gene silencing, translational inhibition, transcriptional inhibition, and epigenetics. Understood. In the present specification, the “factor causing RNAi” may be any as long as it causes “RNAi”.
本明細書では「RNAiを起こす因子」としては、「低分子干渉核酸」、「siNA」、「低分子干渉RNA」、「siRNA」、「低分子干渉核酸分子」、「低分子干渉オリゴヌクレオチド分子」または「化学修飾低分子干渉核酸分子」等が挙げられ、これらの用語は、RNA干渉「RNAi」または遺伝子サイレンシングを配列特異的に媒介することによって、遺伝子発現またはウイルス複製を阻害または下方制御することができる任意の核酸分子を指す。これらの用語は、個々の核酸分子、複数のかかる核酸分子、またはかかる核酸分子のプールも表し得る。これらの分子は、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む二本鎖核酸分子であり得る。 In the present specification, the “factor causing RNAi” includes “small interfering nucleic acid”, “siNA”, “small interfering RNA”, “siRNA”, “small interfering nucleic acid molecule”, “small interfering oligonucleotide molecule”. ”Or“ chemically modified small interfering nucleic acid molecules ”and the like, these terms inhibit or down-regulate gene expression or viral replication by mediating RNA interference“ RNAi ”or gene silencing in a sequence-specific manner. Refers to any nucleic acid molecule that can. These terms may also represent individual nucleic acid molecules, a plurality of such nucleic acid molecules, or a pool of such nucleic acid molecules. These molecules can be double stranded nucleic acid molecules comprising self-complementary sense and antisense regions.
本発明で代表的に用いられる「siRNA」は、短い長さ、通常、約20塩基前後(例えば、代表的には約21〜23塩基長)またはそれ未満の長さの二本鎖RNAである。このようなsiRNAは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、そのsiRNAの標的となる病原遺伝子の発現を抑えることから、疾患の治療、予防、予後などに使用することができる。本発明において用いられるsiRNAは、RNAiを引き起こすことができる限り、どのような形態を採っていてもよい。 The “siRNA” typically used in the present invention is a double-stranded RNA having a short length, usually about 20 bases (eg, typically about 21 to 23 bases) or less. . Such siRNA can be used for treatment, prevention, prognosis, etc. of a disease because it suppresses gene expression by expressing in a cell and suppresses expression of a pathogenic gene targeted by the siRNA. The siRNA used in the present invention may take any form as long as it can cause RNAi.
本発明において、siRNA等のRNAiを起こす因子では、アンチセンス領域は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列、および標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列またはその一部を有するセンス領域を含む。これらの分子は、一方の鎖がセンス鎖であり、他方がアンチセンス鎖である、2個の別々のオリゴヌクレオチドから組み立てることができる。ここで、アンチセンス鎖とセンス鎖は自己相補的である(すなわち、アンチセンス鎖とセンス鎖が二本鎖または二本鎖構造を形成するなど、各鎖は、他方の鎖中のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。ここで、例えば、二本鎖領域は、約15から約30、例えば、約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30塩基対でありうるが、これらより長くてもよい。アンチセンス鎖は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス鎖は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む(例えば、その分子の約15から約25個またはそれを超えるヌクレオチドは、標的核酸またはその一部に相補的である)。あるいは、これらの分子は、単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、これらの分子の自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域は、核酸リンカーまたは非核酸リンカーによって連結されている。これらの分子は、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む、二本鎖、非対称二本鎖、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造を有するポリヌクレオチドであり得る。ここで、アンチセンス領域は、別個の標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列、および標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列またはその一部を有するセンス領域を含む。これらの分子は、2個以上のループ構造と、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む軸(stem)とを有する、環状一本鎖ポリヌクレオチドであり得る。ここで、アンチセンス領域は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列、および標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有するセンス領域を含み、環状ポリヌクレオチドは、インビボまたはインビトロでプロセシングを受けて、RNAiを媒介し得る活性な分子を生成し得る。これらの因子は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドも含み得る(例えば、これらの因子は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列がこれらの因子内に存在する必要がない。)。一本鎖ポリヌクレオチドは、5’リン酸(例えば、Martinez et al.,2002,Cell.,110,563−574およびSchwarz et al.,2002,Molecular Cell,10,537−568参照)、5’,3’−二リン酸などの末端リン酸基を更に含み得る。ある実施形態においては、本発明のCCL21、CXCR3、CCR7等の抑制剤は、別々のセンスおよびアンチセンス配列または領域を含む。ここで、センス領域とアンチセンス領域は、当該分野で公知のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー分子によって共有結合しており、またはイオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水的相互作用および/またはスタッキング相互作用によって交互に非共有結合している。ある実施形態においては、本発明のCCL21、CXCR3、CCR7等の抑制剤は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態においては、本発明のCCL21、CXCR3、CCR7等の抑制剤は、標的遺伝子の発現を阻害するように、標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。本明細書では、CCL21、CXCR3、CCR7等の抑制剤は、RNAのみを含む分子に必ずしも限定されず、化学修飾ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドも包含する。ある実施形態においては、本発明が低分子干渉核酸分子である場合は、2’ヒドロキシ(2’−OH)含有ヌクレオチドを欠いていてもよいく。ある実施形態において、本発明はRNAiを媒介するのに2’ヒドロキシル基を有するヌクレオチドの存在が不要である低分子干渉核酸でありうる。したがって、本発明が低分子干渉核酸分子である場合は、リボヌクレオチド(例えば、2’−OH基を有するヌクレオチド)を含まなくてもよい。しかし、RNAiを維持するのにCCL21、CXCR3、CCR7等の抑制剤内のリボヌクレオチドの存在が不要である場合は、2’−OH基を有する1個以上のヌクレオチドを含む、結合したリンカー、または他の結合若しくは会合した基、部分若しくは鎖を有し得る。場合によっては、本発明のCCL21、CXCR3、CCR7等を阻害する因子は、ヌクレオチド位置の約5、10、20、30、40または50%においてリボヌクレオチドを含み得る。本明細書ではCCL21、CXCR3、CCR7等の抑制剤は、配列特異的RNAiを媒介し得る核酸分子、例えば、低分子干渉RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、ミクロRNA(miRNA)、短鎖ヘアピンRNA(shRNA)、低分子干渉オリゴヌクレオチド、低分子干渉核酸、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾siRNA、転写後遺伝子サイレンシングRNA(ptgsRNA)であってもよい。 In the present invention, in an agent that causes RNAi such as siRNA, the antisense region includes a nucleotide sequence that is complementary to a nucleotide sequence in a target nucleic acid molecule or a part thereof, and a nucleotide sequence corresponding to the target nucleic acid sequence or a part thereof A sense region having These molecules can be assembled from two separate oligonucleotides, one strand is the sense strand and the other is the antisense strand. Here, the antisense strand and the sense strand are self-complementary (i.e., each strand has a nucleotide sequence in the other strand such that the antisense strand and the sense strand form a double-stranded or double-stranded structure). Complementary nucleotide sequences are included, where, for example, the double-stranded region is from about 15 to about 30, for example, about 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. , 26, 27, 28, 29 or 30 base pairs, but may be longer, the antisense strand comprises a nucleotide sequence that is complementary to a nucleotide sequence in the target nucleic acid molecule or a portion thereof, The sense strand includes a nucleotide sequence corresponding to the target nucleic acid sequence or portion thereof (eg, about 15 to about 25 or more nucleotides of the molecule are present in the target nucleic acid or portion thereof. Alternatively, these molecules are assembled from a single oligonucleotide, and the self-complementary sense and antisense regions of these molecules are linked by a nucleic acid linker or a non-nucleic acid linker. These molecules can be polynucleotides having a double-stranded, asymmetric duplex, hairpin or asymmetric hairpin secondary structure comprising self-complementary sense and antisense regions, where the antisense region is A nucleotide sequence that is complementary to a nucleotide sequence in a separate target nucleic acid molecule, or a portion thereof, and a sense region that has a nucleotide sequence corresponding to the target nucleic acid sequence, or a portion thereof, the molecule comprising two or more A ring having a loop structure and a stem comprising a self-complementary sense region and an antisense region The antisense region may comprise a nucleotide sequence that is complementary to a nucleotide sequence in a target nucleic acid molecule or a portion thereof, and a nucleotide sequence corresponding to the target nucleic acid sequence or a portion thereof. The circular polynucleotide can be processed in vivo or in vitro to produce an active molecule that can mediate RNAi, these factors being present in the nucleotide sequence or part thereof in the target nucleic acid molecule. Single-stranded polynucleotides having nucleotide sequences that are complementary can also be included (eg, these factors do not require a nucleotide sequence corresponding to the target nucleic acid sequence or a portion thereof to be present in these factors). Single-stranded polynucleotides are 5 ′ phosphates (eg, Martinez et al, 2002, Cell. 110, 563-574 and Schwartz et al. , 2002, Molecular Cell, 10, 537-568) and may further comprise a terminal phosphate group such as 5 ', 3'-diphosphate. In certain embodiments, inhibitors of the present invention such as CCL21, CXCR3, CCR7 comprise separate sense and antisense sequences or regions. Here, the sense and antisense regions are covalently linked by nucleotide or non-nucleotide linker molecules known in the art, or ionic interactions, hydrogen bonds, van der Waals interactions, hydrophobic interactions and / or Alternately non-covalently linked by stacking interactions. In certain embodiments, the inhibitor of the present invention, such as CCL21, CXCR3, CCR7, comprises a nucleotide sequence that is complementary to the nucleotide sequence of the target gene. In another embodiment, an inhibitor such as CCL21, CXCR3, CCR7 of the present invention interacts with the nucleotide sequence of the target gene so as to inhibit the expression of the target gene. In the present specification, inhibitors such as CCL21, CXCR3, and CCR7 are not necessarily limited to molecules containing only RNA, but also include chemically modified nucleotides and non-nucleotides. In certain embodiments, when the invention is a small interfering nucleic acid molecule, it may be devoid of 2'hydroxy (2'-OH) containing nucleotides. In certain embodiments, the invention can be a small interfering nucleic acid that does not require the presence of a nucleotide having a 2 'hydroxyl group to mediate RNAi. Therefore, when the present invention is a small interfering nucleic acid molecule, ribonucleotides (for example, nucleotides having a 2'-OH group) may not be contained. However, if the presence of a ribonucleotide in an inhibitor such as CCL21, CXCR3, CCR7 is not required to maintain RNAi, a linked linker comprising one or more nucleotides having a 2′-OH group, or It may have other bonds or associated groups, moieties or chains. In some cases, an agent that inhibits CCL21, CXCR3, CCR7, etc. of the present invention may comprise ribonucleotides at about 5, 10, 20, 30, 40 or 50% of the nucleotide positions. As used herein, inhibitors such as CCL21, CXCR3, CCR7 are nucleic acid molecules that can mediate sequence-specific RNAi, such as small interfering RNA (siRNA), double-stranded RNA (dsRNA), microRNA (miRNA), It may be a short hairpin RNA (shRNA), a small interfering oligonucleotide, a small interfering nucleic acid, a small interfering modified oligonucleotide, a chemically modified siRNA, or a post-transcriptional gene silencing RNA (ptgsRNA).
本明細書においてRNAiを引き起こす因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約70%の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、少なくとも10ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むRNAまたはその改変体が挙げられるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、3’突出末端を含み、より好ましくは、3’突出末端は、2ヌクレオチド長以上のDNA(例えば、2〜4ヌクレオチド長のDNAであり得る。 As used herein, factors that cause RNAi include, for example, a sequence having at least about 70% homology to a portion of the nucleic acid sequence of a target gene or a sequence that hybridizes under stringent conditions. Examples include, but are not limited to, RNA containing a double-stranded portion of nucleotide length or a variant thereof. Here, the factor preferably comprises a 3 'overhang, more preferably the 3' overhang can be 2 or more nucleotides long DNA (eg 2 to 4 nucleotides long DNA).
あるいは、本発明において用いられるRNAiとしては、例えば、短い逆向きの相補的配列(例えば、15bp以上であり、例えば、24bpなど)のペアが挙げられるがそれらに限定されない。 Alternatively, examples of RNAi used in the present invention include, but are not limited to, a pair of short reverse complementary sequences (for example, 15 bp or more, for example, 24 bp).
理論に束縛されないが、RNAiが働く機構として考えられるものの一つとして、dsRNAのようなRNAiを引き起こす分子が細胞に導入されると、比較的長い(例えば、40塩基対以上)RNAの場合、ヘリカーゼドメインを持つダイサー(Dicer)と呼ばれるRNaseIII様のヌクレアーゼがATP存在下で、その分子を3’末端から約20塩基対ずつ切り出し、短鎖dsRNA(siRNAとも呼ばれる)を生じる。本明細書において「siRNA」とは、short interfering RNAの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約40塩基以上の二本鎖RNAが体内で分解されてできた10塩基対以上の短鎖二本鎖RNAをいい、通常、5’−リン酸、3’−OHの構造を有しており、3’末端は約2塩基突出している。このsiRNAに特異的なタンパク質が結合して、RISC(RNA−induced−silencing−complex)が形成される。この複合体は、siRNAと同じ配列を有するmRNAを認識して結合し、RNaseIII様の酵素活性によってsiRNAの中央部でmRNAを切断する。siRNAの配列と標的として切断するmRNAの配列の関係については、100%一致することが好ましい。しかし、siRNAの中央から外れた位置についての塩基の変異については、完全にRNAiによる切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存する。他方、siRNAの中央部の塩基の変異は影響が大きく、RNAiによるmRNAの切断活性が極度に低下する。このような性質を利用して、変異をもつmRNAについては、その変異を中央に配したsiRNAを合成し、細胞内に導入することで特異的に変異を含むmRNAだけを分解することができる。従って、本発明では、siRNAそのものを、RNAiを引き起こす因子として用いることができるし、siRNAを生成するような因子(例えば、代表的に約40塩基以上のdsRNA)をそのような因子として用いることができる。 Without being bound by theory, one of the possible mechanisms for RNAi to work is that when a molecule that causes RNAi, such as dsRNA, is introduced into a cell, a relatively long (eg, 40 base pairs or more) RNA, helicase In the presence of ATP, an RNaseIII-like nuclease called Dicer having a domain excises the molecule from the 3 ′ end by about 20 base pairs to produce a short dsRNA (also called siRNA). As used herein, “siRNA” is an abbreviation for short interfering RNA, which is artificially chemically synthesized, biochemically synthesized, synthesized in an organism, or about 40 This refers to short double-stranded RNA of 10 base pairs or more formed by decomposing double-stranded RNA of bases or more in the body, and usually has a 5′-phosphate, 3′-OH structure. 'The end protrudes about 2 bases. A protein specific to the siRNA binds to form RISC (RNA-induced-silencing-complex). This complex recognizes and binds to mRNA having the same sequence as siRNA, and cleaves mRNA at the center of siRNA by RNaseIII-like enzyme activity. The relationship between the siRNA sequence and the mRNA sequence cleaved as a target is preferably 100% identical. However, with respect to the base mutation at a position off the center of siRNA, the cleavage activity by RNAi is not completely lost, but a partial activity remains. On the other hand, the mutation of the base at the center of siRNA has a large effect, and the cleavage activity of mRNA by RNAi is extremely reduced. Utilizing such properties, for mRNA having a mutation, only siRNA having the mutation can be specifically decomposed by synthesizing siRNA having the mutation in the center and introducing it into the cell. Therefore, in the present invention, siRNA itself can be used as a factor that causes RNAi, and a factor that generates siRNA (for example, a dsRNA typically having about 40 bases or more) can be used as such a factor. it can.
また、理論に束縛されることを希望しないが、siRNAは、上記経路とは別に、siRNAのアンチセンス鎖がmRNAに結合してRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRP)のプライマーとして作用し、dsRNAが合成され、このdsRNAが再びダイサーの基質となり、新たなsiRNAを生じて作用を増幅することも企図される。従って、本発明では、siRNA自体およびsiRNAが生じるような因子もまた、有用である。実際に、昆虫などでは、例えば35分子のdsRNA分子が、1,000コピー以上ある細胞内のmRNAをほぼ完全に分解することから、siRNA自体およびsiRNAが生じるような因子が有用であることが理解される。 Moreover, although not wishing to be bound by theory, siRNA is synthesized separately from the above pathway, and the antisense strand of siRNA binds to mRNA and acts as a primer for RNA-dependent RNA polymerase (RdRP). It is also contemplated that this dsRNA becomes Dicer's substrate again, generating new siRNA and amplifying the action. Thus, in the present invention, siRNA itself and factors that produce siRNA are also useful. In fact, in insects and the like, for example, 35 dsRNA molecules almost completely degrade the mRNA in a cell having 1,000 copies or more, so it is understood that siRNA itself and factors that generate siRNA are useful. Is done.
別の実施形態において、本発明のRNAiを引き起こす因子は、3’末端に突出部を有する短いヘアピン構造(shRNA;short hairpin RNA)であり得る。本明細書において「shRNA」とは、一本鎖RNAで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約20塩基対以上の分子をいう。そのようなshRNAは、人工的に化学合成される。あるいは、そのようなshRNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖のDNA配列を逆向きに連結したヘアピン構造のDNAをT7RNAポリメラーゼによりインビトロでRNAを合成することによって生成することができる。理論に束縛されることは希望しないが、そのようなshRNAは、細胞内に導入された後、細胞内で約20塩基(代表的には例えば、21塩基、22塩基、23塩基)の長さに分解され、siRNAと同様にRNAiを引き起こし、本発明の処置効果があることが理解されるべきである。このような効果は、昆虫、植物、動物(哺乳動物を含む)など広汎な生物において発揮されることが理解されるべきである。このように、shRNAは、siRNAと同様にRNAiを引き起こすことから、本発明の有効成分として用いることができる。shRNAはまた、好ましくは、3’突出末端を有し得る。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約10ヌクレオチド長以上、より好ましくは約20ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、3’突出末端は、好ましくはDNAであり得、より好ましくは少なくとも2ヌクレオチド長以上のDNAであり得、さらに好ましくは2〜4ヌクレオチド長のDNAであり得る。本発明において用いられるRNAiを引き起こす因子は、人工的に合成した(例えば、化学的または生化学的)ものでも、天然に存在するものでも用いることができ、この両者の間で本発明の効果に本質的な違いは生じない。化学的に合成したものでは、液体クロマトグラフィーなどにより精製をすることが好ましい。 In another embodiment, the factor causing RNAi of the present invention may be a short hairpin structure (shRNA; short hairpin RNA) having an overhang at the 3 'end. As used herein, “shRNA” is a single-stranded RNA that includes a partially palindromic base sequence, and thus has a double-stranded structure within the molecule, resulting in a hairpin-like structure. The above molecules. Such shRNA is artificially chemically synthesized. Alternatively, such shRNA can be generated by synthesizing RNA in vitro with T7 RNA polymerase, which has a hairpin structure DNA in which the DNA sequences of the sense strand and antisense strand are ligated in the reverse direction. Although not wishing to be bound by theory, such shRNAs are approximately 20 bases in length (typically 21 bases, 22 bases, 23 bases, etc.) in length after being introduced into the cell. It should be understood that it is degraded to cause RNAi as well as siRNA and has the therapeutic effect of the present invention. It should be understood that such effects are exerted in a wide range of organisms such as insects, plants, animals (including mammals). Thus, since shRNA causes RNAi similarly to siRNA, it can be used as an active ingredient of the present invention. The shRNA can also preferably have a 3 'overhang. The length of the double-stranded part is not particularly limited, but may preferably be about 10 nucleotides or more, more preferably about 20 nucleotides or more. Here, the 3 'protruding end may be preferably DNA, more preferably DNA having a length of at least 2 nucleotides, and further preferably DNA having a length of 2 to 4 nucleotides. The factor causing RNAi used in the present invention can be either artificially synthesized (for example, chemical or biochemical) or naturally occurring, and the effect of the present invention can be achieved between the two. There is no essential difference. Those chemically synthesized are preferably purified by liquid chromatography or the like.
本発明において用いられるRNAiを引き起こす因子は、インビトロで合成することもできる。この合成系において、T7RNAポリメラーゼおよびT7プロモーターを用いて、鋳型DNAからアンチセンスおよびセンスのRNAを合成する。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、上述のような機構を通じてRNAiが引き起こされ、本発明の効果が達成される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法等の任意の適切な方法でそのようなRNAを細胞内に導入することができる。本発明のRNAiを引き起こす因子としてはまた、mRNAとハイブリダイズし得る一本鎖、あるいはそれらのすべての類似の核酸アナログのような因子も挙げられる。そのような因子もまた、本発明において有用である。 The factor that causes RNAi used in the present invention can also be synthesized in vitro. In this synthesis system, antisense and sense RNAs are synthesized from template DNA using T7 RNA polymerase and T7 promoter. When these are annealed in vitro and then introduced into cells, RNAi is caused through the mechanism described above, and the effects of the present invention are achieved. Here, for example, such RNA can be introduced into cells by any appropriate method such as the calcium phosphate method. Factors causing RNAi of the present invention also include factors such as single strands that can hybridize to mRNA, or all similar nucleic acid analogs thereof. Such factors are also useful in the present invention.
本発明の一実施形態は、CCL21、CXCR3、CCR7等に対するRNAi分子、またはそのRNAi分子をコードするポリヌクレオチドを含む、CCL21、CXCR3、CCR7等陽性脳マラリアの治療薬である。このRNAi分子、またはそのRNAi分子をコードするポリヌクレオチドを用いれば、CCL21、CXCR3、CCR7等陽性脳マラリア細胞の増殖を抑制することができる。本発明の一実施形態において「ポリヌクレオチド」は、10以上のヌクレオチドを有する、ヌクレオチドが直鎖状に重合した高分子化合物であってもよい。 One embodiment of the present invention is a therapeutic agent for CCL21, CXCR3, CCR7 or other positive brain malaria comprising an RNAi molecule against CCL21, CXCR3, CCR7 or the like, or a polynucleotide encoding the RNAi molecule. If this RNAi molecule or a polynucleotide encoding the RNAi molecule is used, proliferation of positive brain malaria cells such as CCL21, CXCR3, and CCR7 can be suppressed. In one embodiment of the present invention, the “polynucleotide” may be a polymer compound having 10 or more nucleotides and in which nucleotides are linearly polymerized.
本発明の一実施形態において「RNAi分子」は、RNAi作用を有するRNA鎖であり、例えば、siRNA、shRNA、miRNA、またはRNAi作用を有するsmallRNA等を挙げることができる。 In one embodiment of the present invention, the “RNAi molecule” is an RNA strand having an RNAi action, and examples thereof include siRNA, shRNA, miRNA, and a small RNA having an RNAi action.
本発明の一実施形態において「RNAi」は、siRNA、shRNA、miRNA、短鎖もしくは長鎖の1もしくは2本鎖RNA、またはそれらの修飾物等の1つ以上によって、標的遺伝子もしくはmRNA等の機能が抑制、またはサイレンシングされる現象を含む。 In one embodiment of the present invention, “RNAi” is a function of a target gene or mRNA or the like by one or more of siRNA, shRNA, miRNA, short or long single or double stranded RNA, or a modification thereof. Including the phenomenon that is suppressed or silenced.
RNAi分子のデザインには、例えば、siDirect2.0(Naito et al.,BMCBioinformatics.2009 Nov 30;10:392.)等を使用できる。また、受託会社(例えば、タカラバイオ(株)等)に委託してもよい。RNAi作用の確認は、リアルタイムRT−PCRによるRNA鎖発現量の定量によって行なうことができる。または、ノザンブロットによるRNA鎖発現量の解析や、ウェスタンブロットによる蛋白量の解析・表現型の観察等の方法でも行うことができる。また、特定の遺伝子に対するsiRNAまたはshRNAを生成するプラスミドは、例えば、受託会社(例えば、タカラバイオ(株)等)から購入することができる。 For example, siDirect2.0 (Naito et al., BMC Bioinformatics. 2009 Nov 30; 10: 392.) Can be used for designing RNAi molecules. Further, it may be entrusted to a trust company (for example, Takara Bio Inc.). The RNAi action can be confirmed by quantifying the RNA strand expression level by real-time RT-PCR. Alternatively, it can also be performed by methods such as analysis of RNA strand expression level by Northern blot, analysis of protein amount by Western blot, and observation of phenotype. Moreover, the plasmid which produces siRNA or shRNA with respect to a specific gene can be purchased from a trust company (for example, Takara Bio Inc. etc.), for example.
本発明の一実施形態において「siRNA」は、RNAiを誘導可能なRNA鎖を含む。一般的にsiRNAの2本鎖はガイド鎖とパッセンジャー鎖に分けることができ、ガイド鎖がRISCに取り込まれる。RISCに取り込まれたガイド鎖は、標的RNAを認識するために使われる。RNAi研究では主に人工的に作成したものが使用されるが、生体内において内在的に存在するものも知られている。上記ガイド鎖は15塩基以上のRNAから構成されていてもよい。15塩基以上であれば、標的のポリヌクレオチドに対して精度よく結合できる可能性が高まる。また、そのガイド鎖は40塩基以下のRNAから構成されていてもよい。40塩基以下であれば、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクがより低くなる。 In one embodiment of the present invention, “siRNA” includes an RNA strand capable of inducing RNAi. In general, the duplex of siRNA can be divided into a guide strand and a passenger strand, and the guide strand is incorporated into RISC. The guide strand incorporated into the RISC is used to recognize the target RNA. In RNAi research, artificially prepared materials are mainly used, but those existing endogenously in the living body are also known. The guide strand may be composed of RNA having 15 or more bases. If it is 15 bases or more, the possibility of being able to bind to the target polynucleotide with high accuracy increases. The guide strand may be composed of RNA of 40 bases or less. If it is 40 bases or less, the risk that disadvantageous phenomena, such as an interferon response, will arise will become lower.
本発明の一実施形態において「shRNA」は、RNAiを誘導可能で、且つヘアピン状に折りたたまれた構造(ヘアピン様構造)を形成可能な1本鎖のRNA鎖を含む。典型的には、shRNAは細胞内でDicerによって切断され、siRNAが切り出される。このsiRNAによって標的RNAの切断が生じることが知られている。上記shRNAは35以上のヌクレオチドから構成されていてもよい。35以上であれば、shRNAに特有のヘアピン様構造を精度よく形成できる可能性が高まる。また、上記shRNAは100塩基以下のRNAから構成されていてもよい。100塩基以下であれば、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクが低くなる。但し、一般的にshRNAと構造および機能が類似しているpre−miRNAの多くが、100ヌクレオチド程度またはそれ以上の長さを有していることから、shRNAの長さは必ずしも100塩基以下でなくても、shRNAとして機能できると考えられる。 In one embodiment of the present invention, “shRNA” includes a single-stranded RNA strand capable of inducing RNAi and forming a hairpin-like folded structure (hairpin-like structure). Typically, shRNA is cleaved by Dicer in the cell, and siRNA is excised. It is known that target RNA is cleaved by this siRNA. The shRNA may be composed of 35 or more nucleotides. If it is 35 or more, the possibility that a hairpin-like structure peculiar to shRNA can be formed with high accuracy increases. The shRNA may be composed of RNA having 100 bases or less. If it is 100 bases or less, the risk that disadvantageous phenomena such as an interferon response occur will be reduced. However, since many pre-miRNAs that are generally similar in structure and function to shRNA have a length of about 100 nucleotides or more, the length of shRNA is not necessarily 100 bases or less. However, it is thought that it can function as shRNA.
本発明の一実施形態において「miRNA」は、siRNAと類似の機能を有しているRNA鎖を含み、標的RNA鎖の翻訳抑制や分解をすることが知られている。miRNAとsiRNAとの違いは、一般的に生成経路と、詳細なメカニズムにある。 In one embodiment of the present invention, “miRNA” includes an RNA strand having a function similar to that of siRNA, and is known to suppress or degrade the translation of a target RNA strand. The difference between miRNA and siRNA generally lies in the production pathway and detailed mechanism.
本発明の一実施形態において「small RNA」とは、比較的小さいRNA鎖をいい、例えば、siRNA、shRNA、miRNA、アンチセンスRNA、1または2本鎖の低分子RNAなどを挙げることができる。 In one embodiment of the present invention, “small RNA” refers to a relatively small RNA strand, and examples thereof include siRNA, shRNA, miRNA, antisense RNA, and 1 or double-stranded small RNA.
上記RNAi分子は、5’末端または3’末端に1〜5塩基からなるオーバーハングを含んでいてもよい。この場合、RNAiの効率が上昇すると考えられる。この数は、例えば、5、4、3、2、または1塩基であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。また上記RNAi分子が2本鎖のとき、各RNA鎖間にミスマッチRNAが存在していてもよい。その数は、例えば、1、2、3、4、5、または10個以下であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。また上記RNAi分子は、ヘアピンループを含んでいてもよい、ヘアピンループの塩基数は、例えば、10、8、6、5、4、または3塩基であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。塩基配列は、所望の効果を有する限り、1または複数個の塩基配列が欠失、置換、挿入、もしくは付加していてもよい。なお、各塩基配列の表記は、左側が5’末端、右側が3’末端である。 The RNAi molecule may contain an overhang consisting of 1 to 5 bases at the 5 'end or 3' end. In this case, it is considered that the efficiency of RNAi increases. This number may be, for example, 5, 4, 3, 2, or 1 base, and may be within the range of any two of them. When the RNAi molecule is double stranded, mismatch RNA may exist between the RNA strands. The number may be, for example, 1, 2, 3, 4, 5, or 10 or less, and may be in the range of any two of them. The RNAi molecule may contain a hairpin loop, and the number of bases of the hairpin loop may be, for example, 10, 8, 6, 5, 4, or 3 bases, and any two values thereof. It may be within the range. As long as the base sequence has a desired effect, one or a plurality of base sequences may be deleted, substituted, inserted, or added. In addition, the notation of each base sequence is the 5 'end on the left side and the 3' end on the right side.
上記RNAi分子の長さは、例えば、15、18、20、25、30、40、50、60、80、100、200、または400塩基であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。この数は、CCL21、CXCR3、CCR7等陽性悪性腫瘍に対する治療効果を高める観点からは、15以上、または100以下が好ましい。 The length of the RNAi molecule may be, for example, 15, 18, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200, or 400 bases, and is within the range of any two of them. It may be. This number is preferably 15 or more or 100 or less from the viewpoint of enhancing the therapeutic effect on positive malignant tumors such as CCL21, CXCR3 and CCR7.
本発明の一実施形態において「RNA鎖」は、RNAまたはその等価物が、複数結合した形態で構成されているものを含む。また本発明の一実施形態において「DNA鎖」は、DNAまたはその等価物が、複数結合した形態で構成されているものを含む。このRNA鎖またはDNA鎖は、1本鎖または複数本鎖(例えば、2本鎖)の形態のRNA鎖またはDNA鎖を含む。RNA鎖またはDNA鎖は、細胞取込促進物質(例えば、PEGまたはその誘導体)、標識タグ(例えば、蛍光標識タグ等)、またはリンカー(例えば、ヌクレオチドドリンカー等)等と結合していてもよい。RNA鎖またはDNA鎖は、核酸合成装置を用いて合成可能である。その他、受託会社(例えば、インビトロジェン社等)から購入することもできる。生体内のRNA鎖またはDNA鎖は、塩または溶媒和物を形成することがある。また、生体内のRNA鎖またはDNA鎖は、化学修飾を受けることがある。RNA鎖またはDNA鎖の用語は、例えば、塩もしくは溶媒和物を形成しているRNA鎖もしくはDNA鎖、または化学修飾を受けているRNA鎖もしくはDNA鎖等を含む。またRNA鎖またはDNA鎖は、RNA鎖のアナログ、またはDNA鎖のアナログであってもよい。 In one embodiment of the present invention, the “RNA strand” includes those in which RNA or an equivalent thereof is constituted in a combined form. Further, in one embodiment of the present invention, the “DNA strand” includes those in which a plurality of DNAs or their equivalents are combined. The RNA strand or DNA strand includes an RNA strand or a DNA strand in the form of a single strand or a plurality of strands (for example, a double strand). The RNA strand or DNA strand may be bound to a cell uptake promoting substance (for example, PEG or a derivative thereof), a label tag (for example, a fluorescent label tag), or a linker (for example, a nucleotide linker). RNA strands or DNA strands can be synthesized using a nucleic acid synthesizer. In addition, it can also be purchased from a trust company (for example, Invitrogen). In vivo RNA or DNA strands may form salts or solvates. In addition, the RNA strand or DNA strand in the living body may be chemically modified. The term RNA strand or DNA strand includes, for example, an RNA strand or DNA strand that forms a salt or solvate, or an RNA strand or DNA strand that has undergone chemical modification. The RNA strand or DNA strand may be an RNA strand analog or a DNA strand analog.
上記RNAi分子は、安定的にRNAi作用を発揮する観点からは、CCL21、CXCR3、CCR7等のmRNAの塩基配列の一部に対して、相補的な塩基配列を含むことが好ましい。上記「一部」は、例えば、5、10、15、18、20、22、24、26、28、30、35、40、または50塩基以上であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。 The RNAi molecule preferably contains a base sequence complementary to a part of the base sequence of mRNA such as CCL21, CXCR3, CCR7 and the like from the viewpoint of stably exhibiting RNAi action. The “part” may be, for example, 5, 10, 15, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, or 50 bases or more, and any two values thereof. It may be within the range.
本発明の一実施形態において「タンパク質の発現を阻害すること」は、例えば、遺伝子からmRNAへの転写機構を阻害、またはmRNAからタンパク質への翻訳機構を阻害することを含む。また、例えば、遺伝子、mRNA、またはタンパク質の分解を誘導することによって、結果的にタンパク質量を減少させることを含む。本発明の一実施形態において「タンパク質の機能を阻害すること」は、タンパク質に構造変化を生じさせ、タンパク質の活性を低下させることを含む。また、例えば、遺伝子の発現を阻害した結果、mRNAまたはタンパク質の生成量が低下することを含む。 In one embodiment of the present invention, “inhibiting protein expression” includes, for example, inhibiting a transcription mechanism from a gene to mRNA, or inhibiting a translation mechanism from mRNA to protein. It also includes reducing the amount of protein as a result, eg, by inducing degradation of a gene, mRNA, or protein. In one embodiment of the present invention, “inhibiting the function of a protein” includes causing a structural change in the protein and reducing the activity of the protein. In addition, for example, it includes a decrease in the amount of mRNA or protein produced as a result of inhibiting gene expression.
本発明の一実施形態において「発現が阻害されている状態」は、発現量が、正常時に比べて有意に減少している状態を含む。発現量はmRNA量、またはタンパク質量を指標としてもよい。本発明の一実施形態において「有意に」は、例えば統計学的有意差をスチューデントのt検定(片側または両側)を使用して評価し、p<0.05であるときを含んでいてもよい。または、実質的に差異が生じている状態を含む。本発明の一実施形態において「機能が阻害されている状態」は、活性が、正常時に比べて有意に減少している状態を含む。 In one embodiment of the present invention, “a state in which expression is inhibited” includes a state in which the expression level is significantly reduced as compared with that in a normal state. The expression level may be based on the amount of mRNA or the amount of protein. In one embodiment of the present invention, “significantly” may include, for example, when statistical significance is evaluated using Student's t-test (one-sided or two-sided) and p <0.05. . Or the state in which the difference has arisen substantially is included. In one embodiment of the present invention, “the state in which the function is inhibited” includes a state in which the activity is significantly decreased as compared with that in the normal state.
別の局面において、本発明は、有効量のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の少なくとも1つの因子の阻害剤またはこれを含む組成物または医薬(治療薬または予防薬)を、必要とする被験者に投与することを含む、該被験者の脳マラリアを予防または治療するための方法を提供する。これまでは、CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系が脳マラリアの予防または治療に適用され得ることは知られておらず、有効量についても、当然知られるところではなかった。他方、本発明では、本明細書において得られた知見に基づき、使用される阻害剤に応じて有効量を当業者が選択することができる。 In another aspect, the present invention provides a subject in need of an effective amount of an inhibitor of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system or a composition or medicament (therapeutic or prophylactic agent) containing the same. There is provided a method for preventing or treating cerebral malaria in said subject comprising administering. So far, it has not been known that the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system can be applied to the prevention or treatment of cerebral malaria, and the effective amount has not been known. On the other hand, in the present invention, an effective amount can be selected by those skilled in the art depending on the inhibitor to be used based on the knowledge obtained in the present specification.
治療薬の投与経路は、治療に際して効果的なものを使用するのが好ましく、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、または経口投与等であってもよい。投与形態としては、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤等であってもよい。抗体またはポリヌクレオチドを投与する場合には、注射剤として用いることが効果的である。注射用の水溶液は、例えば、バイアル、またはステンレス容器で保存してもよい。また注射用の水溶液は、例えば生理食塩水、糖(例えばトレハロース)、NaCl、またはNaOH等を配合してもよい。また治療薬は、例えば、緩衝剤(例えばリン酸塩緩衝液)、安定剤等を配合してもよい。 The administration route of the therapeutic agent is preferably one that is effective for treatment, and may be, for example, intravenous, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, or oral administration. The administration form may be, for example, an injection, capsule, tablet, granule or the like. When administering an antibody or a polynucleotide, it is effective to use it as an injection. Aqueous solutions for injection may be stored, for example, in vials or stainless steel containers. The aqueous solution for injection may contain, for example, physiological saline, sugar (for example, trehalose), NaCl, or NaOH. The therapeutic agent may contain, for example, a buffer (for example, phosphate buffer), a stabilizer and the like.
一般的に、本発明の組成物、医薬、治療剤、予防剤等は、治療有効量の治療剤または有効成分、および薬学的に許容しうるキャリアもしくは賦形剤を含む。本明細書において「薬学的に許容しうる」は、動物、そしてより詳細にはヒトにおける使用のため、政府の監督官庁に認可されたか、あるいは薬局方または他の一般的に認められる薬局方に列挙されていることを意味する。本明細書において使用される「キャリア」は、治療剤を一緒に投与する、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このようなキャリアは、無菌液体、例えば水および油であることも可能であり、石油、動物、植物または合成起源のものが含まれ、限定されるわけではないが、ピーナツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油等が含まれる。医薬を経口投与する場合は、水が好ましいキャリアである。医薬組成物を静脈内投与する場合は、生理食塩水および水性デキストロースが好ましいキャリアである。好ましくは、生理食塩水溶液、並びに水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、注射可能溶液の液体キャリアとして使用される。適切な賦形剤には、軽質無水ケイ酸、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が含まれる。組成物は、望ましい場合、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはpH緩衝剤もまた含有することも可能である。これらの組成物は、溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、持続放出配合物等の形を取ることも可能である。伝統的な結合剤およびキャリア、例えばトリグリセリドを用いて、組成物を座薬として配合することも可能である。経口配合物は、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的キャリアを含むことも可能である。適切なキャリアの例は、E.W.Martin,Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mark Publishing Company,Easton,U.S.A)に記載される。このような組成物は、患者に適切に投与する形を提供するように、適切な量のキャリアと一緒に、治療有効量の療法剤、好ましくは精製型のものを含有する。配合物は、投与様式に適していなければならない。これらのほか、例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含んでいてもよい。 In general, a composition, medicament, therapeutic agent, prophylactic agent, etc. of the present invention comprises a therapeutically effective amount of a therapeutic agent or active ingredient, and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. As used herein, “pharmaceutically acceptable” refers to a licensed or otherwise recognized pharmacopoeia of a government for use in animals, and more particularly in humans, by a government supervisory authority. It means that it is enumerated. As used herein, “carrier” refers to a diluent, adjuvant, excipient, or vehicle with which the therapeutic agent is administered. Such carriers can be sterile liquids, such as water and oils, including but not limited to those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, including but not limited to peanut oil, soybean oil, minerals Oil, sesame oil, etc. are included. Water is a preferred carrier when the drug is administered orally. Saline and aqueous dextrose are preferred carriers when the pharmaceutical composition is administered intravenously. Preferably, saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions are used as liquid carriers for injectable solutions. Suitable excipients include light anhydrous silicic acid, crystalline cellulose, mannitol, starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, chloride Sodium, nonfat dry milk, glycerol, propylene, glycol, water, ethanol, carmellose calcium, carmellose sodium, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylacetal diethylaminoacetate, polyvinylpyrrolidone, gelatin, medium chain fatty acid triglyceride, polyoxyethylene hardening Castor oil 60, sucrose, carboxymethylcellulose, corn starch, inorganic salts and the like are included. The composition can also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents, if desired. These compositions can take the form of solutions, suspensions, emulsion, tablets, pills, capsules, powders, sustained-release formulations and the like. It is also possible to formulate the composition as a suppository, with traditional binders and carriers such as triglycerides. Oral formulations may also include standard carriers such as pharmaceutical grade mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, cellulose, magnesium carbonate. Examples of suitable carriers are E.I. W. Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences (Mark Publishing Company, Easton, USA). Such compositions contain a therapeutically effective amount of the therapeutic agent, preferably in purified form, together with a suitable amount of carrier so as to provide the form for proper administration to the patient. The formulation must be suitable for the mode of administration. In addition to these, for example, surfactants, excipients, coloring agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffering agents, suspending agents, tonicity agents, binders, disintegrating agents, lubricants, fluidity Accelerators, flavoring agents and the like may be included.
本発明の一実施形態において「塩」は、例えば、任意の酸性(例えばカルボキシル)基で形成されるアニオン塩、または任意の塩基性(例えばアミノ)基で形成されるカチオン塩を含む。塩類には無機塩または有機塩を含み、例えば、Berge et al.,J.Pharm.Sci.,1977,66,1−19に記載されている塩が含まれる。また例えば、金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩等が挙げられる。本発明の一実施形態において「溶媒和物」は、溶質および溶媒によって形成される化合物である。溶媒和物については例えば、J.Honiget al.,The Van Nostrand Chemist’s Dictionary P650(1953)を参照できる。溶媒が水であれば形成される溶媒和物は水和物である。この溶媒は、溶質の生物活性を妨げないものが好ましい。そのような好ましい溶媒の例として、特に限定するものではないが、水、または各種バッファーが挙げられる。本発明の一実施形態において「化学修飾」は、例えば、PEGもしくはその誘導体による修飾、フルオレセイン修飾、またはビオチン修飾等が挙げられる。 In one embodiment of the invention, “salts” include, for example, anionic salts formed with any acidic (eg, carboxyl) group, or cationic salts formed with any basic (eg, amino) group. Salts include inorganic or organic salts, see, for example, Berge et al. , J .; Pharm. Sci. , 1977, 66, 1-19. Examples thereof include metal salts, ammonium salts, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, and the like. In one embodiment of the present invention, a “solvate” is a compound formed by a solute and a solvent. For solvates, see, for example, J. Org. Honige et al. , The Van Nostrand Chemist's Dictionary P650 (1953). If the solvent is water, the solvate formed is a hydrate. This solvent is preferably one that does not interfere with the biological activity of the solute. Examples of such preferred solvents include, but are not limited to, water or various buffers. In one embodiment of the present invention, “chemical modification” includes, for example, modification with PEG or a derivative thereof, fluorescein modification, biotin modification, or the like.
本発明を医薬として投与する場合、種々の送達(デリバリー)系が知られ、そしてこのような系を用いて、本発明の治療剤を適切な部位(例えば、食道)に投与することも可能であり、このような系には、例えばリポソーム、微小粒子、および微小カプセル中の被包:治療剤(例えば、ポリペプチド)を発現可能な組換え細胞の使用、受容体が仲介するエンドサイトーシスの使用;レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての療法核酸の構築などがある。導入法には、限定されるわけではないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、および経口経路が含まれる。好適な経路いずれによって、例えば注入によって、ボーラス(bolus)注射によって、上皮または皮膚粘膜裏打ち(例えば口腔、直腸および腸粘膜など)を通じた吸収によって、医薬を投与することも可能であるし、必要に応じてエアロゾル化剤を用いて吸入器または噴霧器を使用しうるし、そして他の生物学的活性剤と一緒に投与することも可能である。投与は全身性または局所であることも可能である。本発明が脳(例えば、嗅球)領域で使用される場合、さらに、脳(例えば、嗅球)に直接注入する等、適切な経路いずれかによって投与されうる。 When the present invention is administered as a pharmaceutical, various delivery systems are known, and such systems can be used to administer the therapeutic agent of the present invention to an appropriate site (eg, esophagus). Such systems include, for example, encapsulation in liposomes, microparticles, and microcapsules: the use of recombinant cells capable of expressing therapeutic agents (eg, polypeptides), receptor-mediated endocytosis Use; such as the construction of therapeutic nucleic acids as part of a retroviral vector or other vector. Introduction methods include, but are not limited to, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, epidural, and oral routes. It is possible and necessary to administer the medicament by any suitable route, for example by infusion, by bolus injection, by absorption through epithelial or dermal mucosal lining (eg oral, rectal and intestinal mucosa, etc.) Accordingly, an inhaler or nebulizer can be used with an aerosolizing agent and can be administered with other biologically active agents. Administration can be systemic or local. When the present invention is used in the brain (eg, olfactory bulb) region, it can be further administered by any suitable route, such as by direct injection into the brain (eg, olfactory bulb).
治療剤が核酸である特定の態様において、適切な核酸発現ベクターの一部として該核酸を構築し、そして細胞内に存在するように投与することによって、核酸をin vivo投与して、コードされるタンパク質の発現を促進することも可能であり、これは、例えばレトロウイルスベクターの使用によって、または直接注射によって、または微小粒子銃の使用によって、または核酸を脂質、細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤でコーティングすることによって、または核に進入することが知られるタグ配列に連結した核酸を投与することによって、実行可能である。あるいは、核酸治療剤を細胞内に導入し、そして発現のため、宿主細胞DNA内に相同組換えによって取り込ませることも可能である。 In certain embodiments where the therapeutic agent is a nucleic acid, it is encoded by in vivo administration of the nucleic acid by constructing the nucleic acid as part of a suitable nucleic acid expression vector and administering it to be present in a cell. It is also possible to facilitate the expression of the protein, for example by the use of retroviral vectors or by direct injection or by the use of microparticle guns or the nucleic acids with lipids, cell surface receptors or transfection agents. This can be done by coating or by administering a nucleic acid linked to a tag sequence known to enter the nucleus. Alternatively, nucleic acid therapeutics can be introduced into cells and incorporated by homologous recombination into host cell DNA for expression.
好ましい実施形態において、公知の方法に従って、ヒトへの投与に適応させた医薬組成物として、組成物を配合することができる。このような組成物は注射により投与することができる。代表的には、注射投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝剤中の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射部位での疼痛を和らげるリドカインなどの局所麻酔剤も含むことも可能である。一般的に、成分を別個に供給するか、または単位投薬型中で一緒に混合して供給し、例えば活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封容器中、凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として供給することができる。組成物を注入によって投与しようとする場合、無菌薬剤等級の水または生理食塩水を含有する注入ビンを用いて、分配することも可能である。組成物を注射によって投与しようとする場合、投与前に、成分を混合可能であるように、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルを提供することも可能である。 In a preferred embodiment, the composition can be formulated as a pharmaceutical composition adapted for human administration according to known methods. Such compositions can be administered by injection. Typically, compositions for injection administration are solutions in sterile isotonic aqueous buffer. Where necessary, the composition can also include a solubilizing agent and a local anesthetic such as lidocaine to ease pain at the site of the injection. In general, the ingredients are supplied separately or mixed together in a unit dosage form, for example in a sealed container such as an ampoule or sachet indicating the amount of active agent, lyophilized powder or water-free concentration Can be supplied as a product. Where the composition is to be administered by infusion, it can be dispensed with an infusion bottle containing sterile pharmaceutical grade water or saline. Where the composition is to be administered by injection, an ampoule of sterile water for injection or saline can be provided so that the ingredients may be mixed prior to administration.
本発明の組成物、医薬、治療剤、予防剤を中性型または塩型あるいは他のプロドラッグ(例えば、エステル等)で配合することも可能である。薬学的に許容しうる塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する遊離型のカルボキシル基とともに形成されるもの、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの遊離型のアミン基とともに形成されるもの、並びにナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、および水酸化第二鉄などに由来するものが含まれる。 It is also possible to mix the composition, medicament, therapeutic agent, or preventive agent of the present invention in a neutral or salt form or other prodrug (eg, ester). Pharmaceutically acceptable salts include those formed with free carboxyl groups derived from hydrochloric acid, phosphoric acid, acetic acid, oxalic acid, tartaric acid, isopropylamine, triethylamine, 2-ethylaminoethanol, histidine, procaine And those formed with free amine groups such as those derived from, and those derived from sodium, potassium, ammonium, calcium, ferric hydroxide, and the like.
特定の障害または状態の治療に有効な本発明の治療剤の量は、障害または状態の性質によって変動しうるが、当業者は本明細書の記載に基づき標準的臨床技術によって決定可能である。さらに、場合によって、in vitroアッセイを使用して、最適投薬量範囲を同定するのを補助することも可能である。配合物に使用しようとする正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重大性によっても変動しうるため、担当医の判断および各患者の状況に従って、決定すべきである。しかし、投与量は特に限定されないが、例えば、1回あたり0.001、1、5、10、15、100、または1000mg/kg体重であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。投与間隔は特に限定されないが、例えば、1、7、14、21、または28日あたりに1または2回投与してもよく、それらいずれか2つの値の範囲あたりに1または2回投与してもよい。投与量、投与間隔、投与方法は、患者の年齢や体重、症状、対象臓器等により、適宜選択してもよい。また治療薬は、治療有効量、または所望の作用を発揮する有効量の有効成分を含むことが好ましい。悪性腫瘍マーカーが、投与後に有意に減少した場合に、治療効果があったと判断してもよい。有効用量は、in vitroまたは動物モデル試験系から得られる用量−反応曲線から推定可能である。 The amount of the therapeutic agent of the invention that is effective in the treatment of a particular disorder or condition can vary depending on the nature of the disorder or condition, but can be determined by those skilled in the art by standard clinical techniques based on the description herein. Further, in some cases, in vitro assays can be used to help identify optimal dosage ranges. The exact dose to be used in the formulation can also vary depending on the route of administration and the severity of the disease or disorder and should be determined according to the judgment of the attending physician and the circumstances of each patient. However, the dose is not particularly limited, and may be, for example, 0.001, 1, 5, 10, 15, 100, or 1000 mg / kg body weight per dose, and within the range of any two of these values There may be. The dosing interval is not particularly limited. For example, it may be administered once or twice per 1, 7, 14, 21, or 28 days, or once or twice per any two of these ranges. Also good. The dose, administration interval, and administration method may be appropriately selected depending on the age, weight, symptoms, target organ, etc. of the patient. The therapeutic agent preferably contains a therapeutically effective amount or an effective amount of an active ingredient that exhibits a desired action. If the malignant tumor marker is significantly decreased after administration, it may be determined that there is a therapeutic effect. Effective doses can be extrapolated from dose-response curves derived from in vitro or animal model test systems.
本発明の一実施形態において「患者」または「被験体」は、ヒト、またはヒトを除く哺乳動物(例えば、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ネズミ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、マーモセット、サル、またはチンパンジー等の1種以上)を含む。また患者または被験体は、CCL21、CXCR3、CCR7等の発現が異常であると判断または診断された患者または被験体であってもよい。このとき、判断または診断は、CCL21、CXCR3、CCR7等のタンパク質レベルを検出することにより行われることが好ましい。 In one embodiment of the present invention, a “patient” or “subject” is a human or non-human mammal (eg, mouse, guinea pig, hamster, rat, mouse, rabbit, pig, sheep, goat, cow, horse, One or more of a cat, dog, marmoset, monkey, or chimpanzee). The patient or subject may be a patient or subject that has been determined or diagnosed as having abnormal expression of CCL21, CXCR3, CCR7, etc. At this time, the determination or diagnosis is preferably performed by detecting the protein level of CCL21, CXCR3, CCR7 or the like.
本発明の医薬組成物または治療剤もしくは予防剤はキットとして提供することができる。 The pharmaceutical composition or therapeutic agent or prophylactic agent of the present invention can be provided as a kit.
特定の実施形態では、本発明は、本発明の組成物または医薬の1以上の成分が充填された、1以上の容器を含む、薬剤パックまたはキットを提供する。場合によって、このような容器に付随して、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形で、政府機関による、ヒト投与のための製造、使用または販売の認可を示す情報を示すことも可能である。 In certain embodiments, the present invention provides a drug pack or kit comprising one or more containers filled with one or more components of a composition or medicament of the present invention. In some cases, associated with such containers, manufactured, used or sold for human administration by a government agency in a manner prescribed by the government agency that regulates the manufacture, use or sale of a pharmaceutical or biological product. It is also possible to indicate information indicating authorization.
本発明のキットはまた、本発明の組成物、治療剤、予防剤または医薬として使用するタンパク質をコードする発現ベクターも含有することも可能であり、このタンパク質は、発現された後、生物学的に活性な複合体を形成するため、再構成されることも可能である。このようなキットは、好ましくはまた、必要な緩衝剤および試薬も含有する。場合によって、このような容器に付随して、キット使用のための指示書(添付文書)、並びに/あるいは医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形で、政府機関による、ヒト投与のための製造、使用または販売の認可を示す情報を示すことも可能である。 The kit of the present invention can also contain an expression vector encoding a protein for use as a composition, therapeutic agent, prophylactic agent or medicament of the present invention, and the protein is biologically expressed after being expressed. Can also be reconstituted to form a complex that is active. Such a kit preferably also contains the necessary buffers and reagents. In some cases, such containers may be accompanied by instructions for use of the kit (package insert) and / or in a form prescribed by a government agency that regulates the manufacture, use or sale of a pharmaceutical or biological product. It is also possible to provide information indicating the approval of manufacture, use or sale for human administration by a government agency.
特定の実施形態において、本発明の核酸を含む医薬組成物を、リポソーム、微小粒子、または微小カプセルを介して投与することができる。本発明の多様な態様において、このような組成物を用いて、核酸の持続放出を達成することが有用である可能性もある。 In certain embodiments, pharmaceutical compositions comprising the nucleic acids of the invention can be administered via liposomes, microparticles, or microcapsules. In various embodiments of the present invention, it may be useful to achieve sustained release of nucleic acids using such compositions.
(CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系に基づく脳マラリアの診断)
別の局面において、本発明は、CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の少なくとも1つの因子を含む、脳マラリアのマーカーを提供する。あるいは、本発明は、CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の少なくとも1つの因子のいずれかまたはその発現産物に結合する物質を用いる、脳マラリアを識別または診断する方法を提供する。ここでは、対象検体のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の少なくとも1つの因子のいずれかの発現が正常検体のものに比べて上昇している場合、該対象検体は脳マラリアを有すると診断される。このような診断は、以下に説明するような結合剤ないし検出剤を用いて行うことができる。したがって、本発明の方法は、対象検体のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の少なくとも1つの因子のいずれかの発現を調べる工程を包含し、その結果によって、脳マラリアの罹患の指標とすることができる。(Diagnosis of brain malaria based on CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system)
In another aspect, the present invention provides a marker for cerebral malaria comprising at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system. Alternatively, the present invention provides a method for identifying or diagnosing cerebral malaria using a substance that binds to any of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system or an expression product thereof. Here, when the expression of any of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system of the target sample is increased compared to that of the normal sample, the target sample is diagnosed as having brain malaria. . Such a diagnosis can be performed using a binding agent or a detection agent as described below. Therefore, the method of the present invention includes a step of examining the expression of any of at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system in a subject specimen, and the result may be used as an index of cerebral malaria morbidity. it can.
このCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系は、本明細書の他の箇所で説明されるように、CCL21、CXCR3およびCCR7を経路とするシグナルの伝達経路をいい、脳マラリアの発症メカニズムのことをいい、その模式図は図7に示される。「CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系」の因子は、CCL21、CXCR3およびCCR7のほか、IP−10(CXCR3リガンド)、CXCL11(I−TAC)、およびCXCL9(MIG)からなる群より選択される少なくとも1つの炎症性サイトカイン;CCL21および/またはCCL19、CD8α樹状細胞(DC)および他の樹状細胞、CD11c+ CD8T細胞(ヒトの場合CD8T細胞)および他のT細胞などもこの因子として考慮することができる。This CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system, as described elsewhere in this specification, refers to the signal transduction pathway of CCL21, CXCR3 and CCR7, and refers to the onset mechanism of brain malaria. The schematic diagram is shown in FIG. The factor of “CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system” is at least selected from the group consisting of CCL21, CXCR3 and CCR7, IP-10 (CXCR3 ligand), CXCL11 (I-TAC), and CXCL9 (MIG). One inflammatory cytokine; CCL21 and / or CCL19, CD8α dendritic cells (DC) and other dendritic cells, CD11c + CD8 T cells (CD8 T cells in humans) and other T cells should also be considered as this factor Can do.
典型的な実施形態としては、本発明で使用されるCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の少なくとも1つの因子は、CCL21、CXCR3、CCR7、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも1つを含む。CCL21、CXCR3、CCR7の各因子については、脳マラリアとの関連が知られておらず、本発明は、このゆな経路および各々の因子を脳マラリアの診断または検出の指標として使用することができることを初めて提供する。 In a typical embodiment, at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system used in the present invention is derived from CCL21, CXCR3, CCR7, and nucleic acids encoding them, their expression products and their derivatives. At least one selected from the group consisting of: Regarding each factor of CCL21, CXCR3, and CCR7, the association with brain malaria is not known, and the present invention shows that this Yuna pathway and each factor can be used as an index for diagnosis or detection of brain malaria. Offer for the first time.
別の実施形態では、本発明において使用されるCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の少なくとも1つの因子は、CCL21、CXCR3、CCR7、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも1つに加えて、或いはそれと代替的に以下:
(1)IP−10(CXCR3リガンド)、CXCL11(I−TAC)、およびCXCL9(MIG)からなる群より選択される少なくとも1つの炎症性サイトカイン、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも1つ;
(2)CCL21および/またはCCL19
(3)CD8α樹状細胞および他の樹状細胞;ならびに
(4)CD11c+ CD8T細胞(ヒトの場合CD8T細胞)および他のT細胞
からなる群より選択される、少なくとも1つの因子を含む。In another embodiment, at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system used in the present invention is a group consisting of CCL21, CXCR3, CCR7, and nucleic acids encoding them, their expression products and their derivatives. In addition to or alternatively to at least one selected from:
(1) At least one inflammatory cytokine selected from the group consisting of IP-10 (CXCR3 ligand), CXCL11 (I-TAC), and CXCL9 (MIG), and a nucleic acid encoding them, its expression product and its origin At least one selected from the group consisting of:
(2) CCL21 and / or CCL19
(3) CD8α dendritic cells and other dendritic cells; and (4) at least one factor selected from the group consisting of CD11c + CD8 T cells (CD8 T cells in the case of humans) and other T cells.
より詳細な実施形態では、本発明の検出または診断は、以下:
(A)嗅球におけるCCL21および/またはCCL19の発現上昇;
(B)皮質におけるIFN−γの発現上昇;
(C)前記CD8α樹状細胞は、CCR7依存的にプライミングされるものが観察されること;および/または
(D)脳または脾臓においてCD11c+ CD8T細胞が観察されることを脳マラリアの発症の指標とすることができるがこれらに限定されない。In a more detailed embodiment, the detection or diagnosis of the present invention comprises the following:
(A) Increased expression of CCL21 and / or CCL19 in the olfactory bulb;
(B) Increased expression of IFN-γ in the cortex;
(C) that the CD8α dendritic cells are observed to be primed in a CCR7-dependent manner; and / or (D) that CD11c + CD8T cells are observed in the brain or spleen. However, it is not limited to these.
前記脳マラリアは、P.falciparumからなる群より選択されるマラリア原虫に対応するヒトマラリア原虫によって生じる。 The brain malaria is Produced by a human malaria parasite corresponding to a malaria parasite selected from the group consisting of falciparum.
1つの特定の実施形態では、本発明が対象とする脳マラリアはげっ歯類または霊長類のものを包含する。 In one particular embodiment, cerebral malaria targeted by the present invention includes rodents or primates.
特定の実施形態では、本発明は、本発明が使用するCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の少なくとも1つの因子は、配列番号1、3、5等に記載の核酸配列もしくはそのフラグメントもしくはその等価物または配列番号2、4、6等に記載のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントもしくはその等価物を含む。 In a specific embodiment, the present invention provides that at least one factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system used by the present invention is the nucleic acid sequence described in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, etc., or a fragment thereof or an equivalent thereof Alternatively, the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, etc. or a fragment thereof or an equivalent thereof is included.
特定の実施形態では、本発明のマーカーは
(1)CCL21タンパク質またはこれをコードする核酸;
(2)CXCR3またはこれをコードする核酸;および/または
(3)CCR7タンパク質またはこれをコードする核酸
を含む。In a particular embodiment, the marker of the present invention is (1) a CCL21 protein or a nucleic acid encoding it;
(2) CXCR3 or a nucleic acid encoding the same; and / or (3) a CCR7 protein or a nucleic acid encoding the same.
別の局面では、本発明は、CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の少なくとも1つの因子、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも1つに結合する物質を含む、脳マラリアの検出剤または診断剤を提供する。CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系が脳マラリアに関連していることは本発明において初めて見出されたものであり、これを利用した検出、検査、または診断も本発明によって初めて実現された。 In another aspect, the present invention binds to at least one factor of CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system, and at least one selected from the group consisting of nucleic acids encoding them, their expression products and their derivatives. Provided is a detection agent or diagnostic agent for cerebral malaria, which comprises a substance. It was first found in the present invention that the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system is related to cerebral malaria, and detection, examination, or diagnosis using this was also realized for the first time by the present invention.
本発明において、CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の異常(発現増加等)は、脳マラリアの指標となることが見出された。従って、本発明によれば、対象となる被験者またはそれに由来する試料(例えば、細胞試料、脳髄液、血清等)においてCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の発現を検出することにより、脳マラリアを検出または選択することができる。また、従って、本発明のマーカーの減少、抑制、増加または活性化等の調節能力を指標に、脳マラリア治療を行う薬剤を検出、スクリーニングすることができることが理解される。 In the present invention, it has been found that abnormalities (increased expression, etc.) of CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system factors are indicative of brain malaria. Therefore, according to the present invention, brain malaria is detected by detecting the expression of a CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system factor in a subject subject or a sample derived therefrom (eg, a cell sample, cerebral spinal fluid, serum, etc.). Can be detected or selected. Therefore, it is understood that an agent for treating cerebral malaria can be detected and screened using the ability of the marker of the present invention to reduce, suppress, increase or activate as an index.
別の局面において、本発明は、CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子に結合または相互作用する物質を含む、脳マラリアを識別するための検出剤、検査剤または診断剤を提供する。このような検出、検査または診断のためには、物質の結合は、特異的であることが好ましい。 In another aspect, the present invention provides a detection agent, a test agent, or a diagnostic agent for identifying cerebral malaria, including a substance that binds or interacts with a factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system. For such detection, examination or diagnosis, the substance binding is preferably specific.
このような検出剤、検査剤または診断剤は、CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子に結合または相互作用することができる限り、どのような物質を利用してもよいが、例えば、その代表的な例として、これらの因子の抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、あるいはこれらの因子をコードする核酸、特にCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子を増幅し得る核酸プライマーもしくはCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子に結合もしくは相互作用し得るプローブを挙げることができるが、それらに限定されない。 As such a detection agent, a test agent, or a diagnostic agent, any substance may be used as long as it can bind to or interact with a factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system. As a specific example, antibodies of these factors or fragments or functional equivalents thereof, or nucleic acids encoding these factors, in particular nucleic acid primers or CCL21-CXCR3- capable of amplifying factors of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system Examples include, but are not limited to, probes that can bind to or interact with factors of the CCR7 signaling system.
本発明の検出剤、検査剤または診断剤は、検出キット、検査キットまたは診断キットとして利用することができる。 The detection agent, test agent or diagnostic agent of the present invention can be used as a detection kit, test kit or diagnostic kit.
1つの実施形態では、本発明の検出剤、検査剤または診断剤は、検出、検査または診断可能とする部分(例えば、抗体等)に他の物質(例えば、標識等)を結合させた複合体または複合分子であってもよい。本明細書において使用される場合、「複合体」または「複合分子」とは、2以上の部分を含む任意の構成体を意味する。例えば、一方の部分がポリペプチドである場合は、他方の部分は、ポリペプチドであってもよく、それ以外の物質(例えば、糖、脂質、核酸、他の炭化水素等)であってもよい。本明細書において複合体を構成する2以上の部分は、共有結合で結合されていてもよくそれ以外の結合(例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等)で結合されていてもよい。2以上の部分がポリペプチドの場合は、キメラポリペプチドとも称しうる。従って、本明細書において「複合体」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子を含む。 In one embodiment, the detection agent, test agent or diagnostic agent of the present invention is a complex in which another substance (for example, a label or the like) is bound to a moiety (for example, an antibody or the like) capable of being detected, tested or diagnosed. Alternatively, it may be a complex molecule. As used herein, “complex” or “complex molecule” means any construct comprising two or more moieties. For example, when one part is a polypeptide, the other part may be a polypeptide or other substance (eg, sugar, lipid, nucleic acid, other hydrocarbon, etc.). . In the present specification, two or more parts constituting the complex may be bonded by a covalent bond, or bonded by other bonds (for example, hydrogen bond, ionic bond, hydrophobic interaction, van der Waals force, etc.). May be. When two or more parts are polypeptides, they can also be referred to as chimeric polypeptides. Therefore, in the present specification, the “complex” includes a molecule formed by linking a plurality of molecules such as a polypeptide, a polynucleotide, a lipid, a sugar, and a small molecule.
本発明の検出剤、検査剤または診断剤は、プローブおよびプライマーの形態を採ることができる。本発明のプローブおよびプライマーは、CCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子と特異的にハイブリダイズすることができる。本明細書に記載されるように、CCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の発現は脳マラリアの指標であり、指標として有用である。従って、本発明によるプローブおよびプライマーは、脳マラリアを識別するために用いることができる。本発明のプローブおよびプライマーは、1つの実施形態では、CCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の発現を検出することができればよく、複数のデオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)等の塩基または塩基対からなる重合体を指す。二本鎖cDNAも組織insituハイブリダイゼーションにおいて利用可能であることが知られており、本発明のプローブおよびプライマーにはそのような二本鎖cDNAも含まれる。組織中のRNAの検出において特に好ましいプローブおよびプライマーとしては、RNAプローブ(リボプローブ)を挙げることができる。 The detection agent, test agent or diagnostic agent of the present invention can take the form of probes and primers. The probes and primers of the present invention can specifically hybridize with CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system factors such as CCL21, CXCR3, CCR7. As described herein, expression of CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factors such as CCL21, CXCR3, CCR7 is an indicator of brain malaria and is useful as an indicator. Thus, the probes and primers according to the invention can be used to identify brain malaria. In one embodiment, the probe and primer of the present invention only need to be able to detect the expression of a CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factor such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc., and a plurality of deoxyribonucleic acids (DNA) or ribonucleic acids. It refers to a polymer composed of bases or base pairs such as nucleic acids (RNA). Double stranded cDNA is also known to be available for tissue in situ hybridization, and probes and primers of the invention include such double stranded cDNA. As a particularly preferred probe and primer for detecting RNA in tissue, an RNA probe (riboprobe) can be mentioned.
特定の実施形態において、本発明はプライマーの形態をとることができる。通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列(例えば、配列番号1)と相補的な、少なくとも8の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも9の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも10の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも11の連続するヌクレオチド長の、少なくとも12の連続するヌクレオチド長の、少なくとも13の連続するヌクレオチド長の、少なくとも14の連続するヌクレオチド長の、少なくとも15の連続するヌクレオチド長の、少なくとも16の連続するヌクレオチド長の、少なくとも17の連続するヌクレオチド長の、少なくとも18の連続するヌクレオチド長の、少なくとも19の連続するヌクレオチド長の、少なくとも20の連続するヌクレオチド長の、少なくとも25の連続するヌクレオチド長の、少なくとも30の連続するヌクレオチド長の、少なくとも40の連続するヌクレオチド長の、少なくとも50の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも70%相同な、より好ましくは、少なくとも80%相同な、さらに好ましくは、少なくとも90%相同な、少なくとも95%相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成(増幅)が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム(例えば、LASERGENE,PrimerSelect,DNAStar)を用いて行ってもよい。 In certain embodiments, the present invention can take the form of a primer. Examples of nucleic acid molecules that are usually used as primers include those having a nucleic acid sequence of at least 8 consecutive nucleotides that is complementary to the nucleic acid sequence of the target gene (eg, SEQ ID NO: 1). Such a nucleic acid sequence is preferably at least 12 contiguous nucleotides long, at least 9 contiguous nucleotides, more preferably at least 10 contiguous nucleotides, and even more preferably at least 11 contiguous nucleotides. At least 13 contiguous nucleotides, at least 14 contiguous nucleotides, at least 15 contiguous nucleotides, at least 16 contiguous nucleotides, at least 17 contiguous nucleotides, at least 18 At least 19 contiguous nucleotides, at least 19 contiguous nucleotides, at least 20 contiguous nucleotides, at least 25 contiguous nucleotides, at least 30 contiguous nucleotides, at least 40 Nucleotides long that connection, at least 50 contiguous nucleotides in length, may be a nucleic acid sequence. Nucleic acid sequences used as probes are nucleic acid sequences that are at least 70% homologous, more preferably at least 80% homologous, more preferably at least 90% homologous, at least 95% homologous to the sequences described above. Is included. A sequence suitable as a primer may vary depending on the nature of the sequence intended for synthesis (amplification), but those skilled in the art can appropriately design a primer according to the intended sequence. Such primer design is well known in the art, and may be performed manually or using a computer program (eg, LASERGENE, PrimerSelect, DNAStar).
特定の実施形態において、本発明によるプライマーは、二種以上の該プライマーからなる、プライマーセットとしても使用することができる。特定の実施形態において、本発明によるプライマーおよびプライマーセットは、PCR法、RT−PCR法、リアルタイムPCR法、in situ PCR法、LAMP法等の核酸増幅法を利用して目的遺伝子を検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーおよびプライマーセットとして利用することができる。 In a particular embodiment, the primer according to the invention can also be used as a primer set consisting of two or more of said primers. In a specific embodiment, the primer and primer set according to the present invention are known to detect a target gene using a nucleic acid amplification method such as a PCR method, an RT-PCR method, a real-time PCR method, an in situ PCR method, or a LAMP method. In the method, it can utilize as a primer and a primer set according to a conventional method.
本発明によるプライマーセットはCCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子等目的のタンパク質のヌクレオチド配列をPCR法等の核酸増幅法により増幅できるように選択することができる。核酸増幅法は周知であり、核酸増幅法におけるプライマーペアの選択は当業者に自明である。例えば、PCR法においては、二つのプライマー(プライマーペア)の一方がCCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子等目的のタンパク質の二本鎖DNAのプラス鎖に対合し、他方のプライマーが二本鎖DNAのマイナス鎖に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、LAMP法(WO00/28082号公報)においては、標的遺伝子に対して3’末端側からF3c、F2c、F1cという3つの領域を、5’末端側からB1、B2、B3という3つの領域を、それぞれ規定し、この6つの領域を用いて4種類のプライマーを設計することができる。本発明のプライマーは、本明細書に開示したヌクレオチド配列に基づき、化学合成できる。プライマーの調製は周知であり、例えば、”MolecularCloning,A Laboratory Manual 2nd ed.”(Cold Spring Harbor Press(1989))、”CurrentProtocols in Molecular Biology”(John Wiley & Sons(1987−1997))に従って実施することができる。The primer set according to the present invention can be selected so that the nucleotide sequence of a target protein such as a CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factor such as CCL21, CXCR3, CCR7 can be amplified by a nucleic acid amplification method such as PCR. Nucleic acid amplification methods are well known, and selection of primer pairs in nucleic acid amplification methods is obvious to those skilled in the art. For example, in the PCR method, one of two primers (primer pair) is paired with a plus strand of a double-stranded DNA of a target protein such as a CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factor such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc. The primer can be selected such that the other primer is paired with the minus strand of the double-stranded DNA, and the other primer is paired with the extended strand extended by one primer. In the LAMP method (WO 00/28082), three regions F3c, F2c and F1c from the 3 ′ end side and three regions B1, B2 and B3 from the 5 ′ end side to the target gene. Each of these six regions can be used to design four types of primers. The primers of the present invention can be chemically synthesized based on the nucleotide sequences disclosed herein. Preparation of the primer is well known, for example, carried out "MolecularCloning, A Laboratory Manual 2 nd ed." (Cold Spring Harbor Press (1989)), in accordance with "CurrentProtocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987-1997)) can do.
特定の実施形態において、本発明は「プローブ」の形態をとることができる。通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列(例えば、配列番号1)と相同なまたは相補的な、少なくとも8の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも9の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも10の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも11の連続するヌクレオチド長の、少なくとも12の連続するヌクレオチド長の、少なくとも13の連続するヌクレオチド長の、少なくとも14の連続するヌクレオチド長の、少なくとも15の連続するヌクレオチド長の、少なくとも16の連続するヌクレオチド長の、少なくとも17の連続するヌクレオチド長の、少なくとも18の連続するヌクレオチド長の、少なくとも19の連続するヌクレオチド長の、少なくとも20の連続するヌクレオチド長の、少なくとも25の連続するヌクレオチド長の、少なくとも30の連続するヌクレオチド長の、少なくとも40の連続するヌクレオチド長の、少なくとも50の連続するヌクレオチド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも70%相同な、より好ましくは、少なくとも80%相同な、さらに好ましくは、少なくとも90%相同な、少なくとも95%相同な核酸配列が含まれる。 In certain embodiments, the present invention can take the form of a “probe”. Examples of nucleic acid molecules that are usually used as probes include those having a nucleic acid sequence of at least 8 consecutive nucleotides that is homologous or complementary to the nucleic acid sequence of the target gene (eg, SEQ ID NO: 1). Such a nucleic acid sequence is preferably at least 12 contiguous nucleotides long, at least 9 contiguous nucleotides, more preferably at least 10 contiguous nucleotides, and even more preferably at least 11 contiguous nucleotides. At least 13 contiguous nucleotides, at least 14 contiguous nucleotides, at least 15 contiguous nucleotides, at least 16 contiguous nucleotides, at least 17 contiguous nucleotides, at least 18 At least 19 contiguous nucleotides, at least 19 contiguous nucleotides, at least 20 contiguous nucleotides, at least 25 contiguous nucleotides, at least 30 contiguous nucleotides, at least 40 Nucleotides long that connection, at least 50 contiguous nucleotides in length, at least the nucleic acid sequence. Nucleic acid sequences used as probes are nucleic acid sequences that are at least 70% homologous, more preferably at least 80% homologous, more preferably at least 90% homologous, at least 95% homologous to the sequences described above. Is included.
1つの実施形態において、本発明の検出剤は、標識されたものでありうる。あるいは、本発明の検出剤、検査剤または診断剤は、タグを結合させたものであってもよい。本発明で使用される標識またはタグは、本明細書において説明された任意の形態をとることができる。 In one embodiment, the detection agent of the present invention can be labeled. Alternatively, the detection agent, test agent or diagnostic agent of the present invention may have a tag attached thereto. The label or tag used in the present invention can take any of the forms described herein.
1つの局面において、本発明は、CCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子を、脳マラリアを識別する指標とするための方法、あるいは脳マラリアを検出、検査または診断する方法を提供する。 In one aspect, the present invention is a method for using a factor of CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system such as CCL21, CXCR3, CCR7 as an index for identifying cerebral malaria, or detecting, examining or diagnosing cerebral malaria. Provide a method.
1つの実施形態では、本発明の方法では、CCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子を、脳マラリアを識別する指標とするために、例えば、CCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の発現産物、例えば、タンパク質またはmRNAを生体内で検出する工程を行って実施することができる。例えば、その際に、CCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の発現産物、例えば、タンパク質またはmRNAに結合する物質を含む検出剤、検査剤または診断剤を用いることができる。そのような検出剤、検査剤または診断剤は、本明細書において記載されており、その記載を元に、必要に応じて当該分野で公知の技術を用いて当業者が本発明の方法を実施することができることが理解される。 In one embodiment, the method of the present invention uses CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factor such as CCL21, CXCR3, CCR7 as an index for identifying brain malaria, for example, CCL21, CXCR3, CCR7, etc. The CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction factor expression product, for example, protein or mRNA, can be detected in vivo. For example, a detection agent, a test agent or a diagnostic agent containing a substance that binds to an expression product of a factor of CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc. it can. Such a detection agent, test agent or diagnostic agent is described in the present specification, and a person skilled in the art performs the method of the present invention using a technique known in the art as necessary based on the description. It is understood that you can.
本発明の方法は、本発明の検出剤、検査剤または診断剤を目的とする試料に接触させ、その試料中に目的とする対象であるCCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の発現産物、例えば、タンパク質またはmRNAがあるかどうか、あるいはそのレベルまたは量を測定する。 In the method of the present invention, CCL21-CXCR3-CCR7 signaling such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc., which is a target of interest, is brought into contact with a target sample of the detection agent, test agent or diagnostic agent of the present invention The presence of, or the level or amount of, an expression product of a system factor, such as a protein or mRNA, is determined.
本発明において「接触」は、複数の物質の間の相互作用または結合が生じるようにその複数の物質を配置することであり、本発明では、検出剤、検査剤、診断剤として機能し得る物質(たとえば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド)を、直接的または間接的のいずれかで、本発明のマーカーまたはそれを含む試料に対して物理的に近接させることによって達成することができる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在させることができる。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリペプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ(例えば、遺伝子チップ)などに化合物を置くことが挙げられる。具体的なCCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の発現産物、例えば、タンパク質またはmRNAを検出する方法は、試料(例えば、血清等)におけるCCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の発現産物、例えば、タンパク質またはmRNAを検出できる方法であれば特に限定されず、例えば、ハイブリダイゼーション法、核酸増幅法、抗原抗体反応法が挙げられる。ここで、試料として使用されるものとしては、発現産物を含むと考えられる試料であればよく、例えば、血清を用いることができる。血清は慣用の方法により取得することができる。 In the present invention, “contact” means that a plurality of substances are arranged so as to cause interaction or binding between the plurality of substances. In the present invention, a substance that can function as a detection agent, a test agent, or a diagnostic agent. (E.g., a polypeptide or polynucleotide) can be achieved either in direct or indirect physical proximity to a marker of the invention or a sample containing it. The polypeptide or polynucleotide can be present in many buffers, salts, solutions, and the like. Contact includes placing the compound in, for example, a beaker, microtiter plate, cell culture flask or microarray (eg, gene chip) containing a polypeptide encoding a nucleic acid molecule or fragment thereof. A specific method for detecting an expression product of a factor of CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system such as CCL21, CXCR3, CCR7, such as protein or mRNA is the method of detecting CCL21, CXCR3, CCR7, etc. in a sample (eg, serum, etc.). The method is not particularly limited as long as it can detect an expression product of a factor of the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system, for example, protein or mRNA, and examples thereof include a hybridization method, a nucleic acid amplification method, and an antigen-antibody reaction method. Here, the sample used may be any sample that is considered to contain an expression product. For example, serum can be used. Serum can be obtained by a conventional method.
特定の実施形態では、本発明による検出、検査または診断は、本発明によるプローブを核酸試料(mRNA、またはそれから転写された相補的DNA(cDNA)等)とハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体、すなわちヌクレオチド二本鎖、を直接または間接的に検出することにより細胞試料におけるCCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の発現を検出することができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、”Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.”(Cold Spring Harbor Press(1989)、特にSection9.47−9.58)、”Current Protocols in Molecular Biology”(John Wiley &Sons(1987−1997)、特にSection 6.3−6.4)、”DNA Cloning 1:Core Techniques,A Practical Approach 2nd ed.”(Oxford University(1995)、条件については特にSection 2.10)を参照しうる。In a particular embodiment, the detection, test or diagnosis according to the invention comprises the hybridization of a probe according to the invention with a nucleic acid sample (such as mRNA or complementary DNA (cDNA) transcribed therefrom), ie a hybridization complex, By directly or indirectly detecting the nucleotide duplex, the expression of a CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system factor such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc. in a cell sample can be detected. For detailed procedures for hybridization techniques, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2 nd ed." (Cold Spring Harbor Press (1989), in particular Section9.47-9.58), "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987-1997), in particular Section 6.3-6.4), "DNA Cloning 1 :. Core Techniques, A Practical Approach 2 nd ed" (Oxford University (1995), particularly Section 2.10 for conditions ) May be referred to.
ハイブリダイゼーション法を利用したCCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の発現産物、例えば、mRNAの検出は、例えば、:(a)被験試料由来のポリヌクレオチドと、本発明によるプローブとを接触させる工程;および(b)ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程により実施することができる。工程(a)において、目的の被験試料から調製されたmRNAまたはそのmRNAから転写された相補的DNA(cDNA)を、被験細胞試料由来のポリヌクレオチドとして、プローブと接触させることができる。プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては例えば、放射能活性(例えば、32P、14C、および35S)、蛍光(例えば、FITC、ユーロピウム)、化学発色のような酵素反応(例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ)等を利用した標識が挙げられる。ハイブリダイゼーション産生物の検出は、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の周知の方法を用いて実施できる。ハイブリダイゼーション複合体が検出された試料は、被験者の組織がCCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子を発現していることを示すので、該試料が由来する被験者について、脳マラリアの可能性が高いと判定することができる。Detection of an expression product of a CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factor such as CCL21, CXCR3, CCR7 or the like using a hybridization method, for example, mRNA is performed by, for example: (a) a polynucleotide derived from a test sample, and the present invention And (b) detecting the hybridization complex. In step (a), mRNA prepared from the target test sample or complementary DNA (cDNA) transcribed from the mRNA can be contacted with the probe as a polynucleotide derived from the test cell sample. In the detection method using a probe, the probe can be labeled and used. For example, radioactive activity (for example, 32 P, 14 C, and 35 S), fluorescence (for example, FITC, europium), enzymatic reaction such as chemical coloration (for example, peroxidase, alkaline phosphatase), etc. were used as the label. A label can be mentioned. The detection of the hybridization product can be performed using a known method such as Northern hybridization, Southern hybridization, colony hybridization and the like. The sample in which the hybridization complex was detected indicates that the subject's tissue expresses CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factor such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc. It can be determined that the possibility of brain malaria is high.
本発明による検出、検査または診断の別の実施形態によれば、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法により核酸試料(mRNAまたはその転写産物)を増幅させ、増幅産物を検出することにより、試料におけるCCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の発現を検出、検査またはこれを用いて診断することができる。 According to another embodiment of the detection, test or diagnosis according to the present invention, a nucleic acid sample (mRNA or its transcription product) is amplified by a nucleic acid amplification method using the primer or primer set according to the present invention, and the amplified product is detected. Thus, the expression of CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factor such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc. in the sample can be detected, examined or diagnosed using this.
核酸増幅法を利用したCCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の発現の検出は、例えば、(i)被験試料由来のポリヌクレオチドを鋳型とし、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法を実施する工程;および(ii)形成された増幅産物を検出する工程により実施することができる。 Detection of the expression of CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system factors such as CCL21, CXCR3, CCR7 using nucleic acid amplification method, for example, (i) Primer or primer according to the present invention using a polynucleotide derived from a test sample as a template Performing a nucleic acid amplification method using the set; and (ii) detecting a formed amplification product.
工程(i)において、目的の被験試料から調製されたmRNAまたはそのmRNAから転写された相補的DNA(cDNA)を鋳型として用いることができる。増幅産物の検出は、PCR法、RT−PCR法、リアルタイムPCR法、LAMP法等の核酸増幅法を用いて実施できる。この試料中に増幅産物が検出されることは、被験者の組織がCCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子を発現していることを示すので、該試料が由来する被験者について、脳マラリアの可能性が高いと判定することができる。 In step (i), mRNA prepared from the target test sample or complementary DNA (cDNA) transcribed from the mRNA can be used as a template. Detection of the amplification product can be performed using a nucleic acid amplification method such as a PCR method, an RT-PCR method, a real-time PCR method, or a LAMP method. Detection of an amplification product in this sample indicates that the subject's tissue expresses a CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factor such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc. It can be determined that the possibility of brain malaria is high.
本発明による検出の別の実施形態によれば、本発明による抗体と試料とを接触させ、抗原抗体反応を検出することにより試料におけるCCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の発現を検出、検査またはこれを用いて診断することができる。 According to another embodiment of the detection according to the present invention, the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc. in the sample is detected by contacting the antibody according to the present invention with the sample and detecting an antigen-antibody reaction. The expression of the factor can be detected, examined or diagnosed using it.
抗原抗体反応を利用したCCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の発現の検出は、例えば、(I)被験細胞試料由来のタンパク質と、本発明による抗体とを接触させる工程;および(II)抗原抗体複合体を測定する工程により実施することができる。抗原抗体反応の検出方法は当業者に周知であり、例えば、免疫学的方法により、血清中のCCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子を検出することができる。免疫学的方法としては、細胞試料を必要に応じて適切な処理、例えば、細胞の分離、抽出操作などをした試料について、免疫組織染色法、酵素免疫測定法、ウェスタンブロット法、凝集法、競合法、サンドイッチ法など既知の方法を適用することができる。免疫組織染色法は、例えば標識化抗体を用いる直接法、該抗体に対する抗体の標識化されたものを用いる間接法などにより行うことができる。標識化剤としては蛍光物質、放射性物質、酵素、金属、色素など公知の標識物質を使用することができる。抗原抗体複合体が検出される試料は、CCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子を発現している細胞を含むので、該試料が由来する被験者について、脳マラリアの可能性が高いと判定することができる。 Detection of expression of factors of CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system such as CCL21, CXCR3, CCR7 using antigen-antibody reaction is performed by, for example, (I) contacting a protein derived from a test cell sample with the antibody according to the present invention. And (II) a step of measuring an antigen-antibody complex. Methods for detecting antigen-antibody reactions are well known to those skilled in the art. For example, CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factors such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc. in serum can be detected by immunological methods. Immunological methods include cell tissue samples that have been appropriately treated, such as cell separation and extraction procedures, immunohistochemical staining, enzyme immunoassay, western blotting, agglutination, competition, etc. A known method such as a method or a sandwich method can be applied. The immunohistochemical staining method can be performed by, for example, a direct method using a labeled antibody, an indirect method using a labeled antibody against the antibody, or the like. As the labeling agent, known labeling substances such as fluorescent substances, radioactive substances, enzymes, metals, and dyes can be used. The sample in which the antigen-antibody complex is detected contains cells expressing CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factors such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc. It can be determined that the property is high.
前記の各検出工程は1回のみならず、同工程を繰り返しあるいは組み合わせて行うことにより、脳マラリアの診断精度を高めていくことができる。従って、このような実施形態を採用した場合、本発明による検出、検査または診断方法によれば、前記の工程を2回以上行うことにより、脳マラリアの診断をより高精度に行うことができる。 Each of the detection steps described above can be performed not only once but also by repeating or combining the steps, thereby improving the diagnosis accuracy of cerebral malaria. Therefore, when such an embodiment is adopted, according to the detection, inspection, or diagnosis method of the present invention, cerebral malaria can be diagnosed with higher accuracy by performing the above-described steps twice or more.
また、他のマーカー遺伝子、好ましくはCCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子以外の増殖マーカー遺伝子(例えば、既知のマーカーであるSCCまたはCEA等)あるいはこれらの因子を併用することにより、脳マラリアの診断精度を高めていくことができる。 In addition, other marker genes, preferably proliferation marker genes other than CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factors such as CCL21, CXCR3, CCR7 (for example, SCC or CEA which are known markers) or these factors are used in combination By doing so, the diagnostic accuracy of cerebral malaria can be improved.
本発明の診断薬等の医薬等としての製剤化手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、使用すべき量等の実施形態を決定することができる。 Procedures for formulating a diagnostic agent or the like of the present invention as a pharmaceutical or the like are known in the art, and are described in, for example, the Japanese Pharmacopeia, the US Pharmacopeia, and the pharmacopoeia of other countries. Accordingly, those skilled in the art can determine the embodiment, such as the amount to be used, without undue experimentation as described herein.
1つの実施形態では、質量分析によってマーカーの濃度を測定することができる。この場合のイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化(matrix−assisted laser desorption/ionization、MALDI)、エレクトロスプレーイオン化(electrospray ionization、ESI)のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないMALDIが好ましい。特に、飛行時間質量分析計(time−of−flight mass spectromer、TOF)と組み合わせたMALDI−TOF−MSによれば、より正確にマーカーの濃度を測定することができる。さらに、2台の質量分析計を用いたMS/MSによれば、より正確にマーカーの濃度を測定することができる。 In one embodiment, the concentration of the marker can be measured by mass spectrometry. As ionization methods in this case, both matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI) and electrospray ionization (ESI) can be applied, but production of multivalent ions is small. MALDI is preferred. In particular, according to MALDI-TOF-MS combined with a time-of-flight mass spectrometer (TOF), the concentration of the marker can be measured more accurately. Furthermore, according to MS / MS using two mass spectrometers, the marker concentration can be measured more accurately.
電気泳動によりマーカーの濃度を測定する場合は、例えば、検査材料をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)に供して目的のマーカーを分離し、適宜の色素や蛍光物質でゲルを染色し、目的のマーカーに相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。SDS−PAGEだけではマーカーの分離が不十分な場合は、等電点電気泳動(IEF)と組み合わせた2次元電気泳動を用いることもできる。さらに、ゲルから直接検出するのではなく、ウェスタンブロッティングを行って膜上のマーカーの量を測定することもできる。 When measuring the marker concentration by electrophoresis, for example, the test material is subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) to separate the target marker, and the gel is stained with an appropriate dye or fluorescent substance. What is necessary is just to measure the darkness and fluorescence intensity of the band corresponding to the target marker. If the separation of the markers is insufficient by SDS-PAGE alone, two-dimensional electrophoresis combined with isoelectric focusing (IEF) can also be used. Furthermore, instead of detecting directly from the gel, Western blotting can be performed to measure the amount of marker on the membrane.
クロマトグラフィーによってマーカーの濃度を測定する場合は、例えば、液体高速クロマトグラフィー(HPLC)による方法を用いることができる。すなわち、試料をHPLCに供して目的のマーカーを分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中のマーカーの濃度を測定することができる。 When measuring the concentration of the marker by chromatography, for example, a method by liquid high performance chromatography (HPLC) can be used. That is, the concentration of the marker in the sample can be measured by subjecting the sample to HPLC to separate the target marker and measuring the peak area of the chromatogram.
1つの局面において、本発明によれば、本発明による検出、検査および/または診断のための方法を実施するための検出、検査および/または診断のためのキットが提供される。このキットは、本発明の検出剤、検査剤および/または診断剤を含む。その実施形態としては、本明細書において記載された任意の実施形態を単独または組み合わせ用いることができる。 In one aspect, the present invention provides a kit for detection, testing and / or diagnosis for performing the method for detection, testing and / or diagnosis according to the present invention. This kit contains the detection agent, test agent and / or diagnostic agent of the present invention. As the embodiment, any embodiment described in this specification can be used alone or in combination.
1つの実施形態では、本発明による検出キットとしては、本発明による実施形態の検出を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、CCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の発現を検出するためのキットであって、本発明によるプローブを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。このプローブは、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法によりCCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の発現を検出する。従って第一の態様の検出方法は、所望により、ハイブリッド形成法を実施するための種々の試薬、例えば標識の検出に用いられる基質化合物、ハイブリダイゼーション緩衝液、説明書、および/または器具などを更に含むことができる。 In one embodiment, the detection kit according to the present invention includes a detection kit for performing the detection of the embodiment according to the present invention, specifically, CCL21-CXCR3-CCR7 signal such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc. A kit for detecting expression of a factor of a transmission system, which includes at least a probe according to the present invention. This probe may be labeled. This detection kit detects the expression of a CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factor such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc. by a hybridization method. Accordingly, the detection method of the first aspect optionally further comprises various reagents for carrying out the hybridization method, such as substrate compounds, hybridization buffers, instructions, and / or instruments used for detection of the label. Can be included.
本発明によるこの実施形態の検出キットは、精度の高い検出を行うために、CCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子以外の脳マラリアのマーカー遺伝子(例えば、SCC、CEA等)の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでいてもよい。これらのプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、CCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子以外の脳マラリアのマーカー遺伝子の発現を更に検出する。 The detection kit of this embodiment according to the present invention provides a marker gene for brain malaria other than factors of CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system such as CCL21, CXCR3, CCR7 (for example, SCC, CEA) in order to perform highly accurate detection. Etc.) may further comprise a probe, a primer, a primer set, or an antibody capable of detecting the expression. These probes, primers, primer sets, or antibodies may be labeled. This detection kit expresses marker genes of brain malaria other than factors of CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc. by any of hybridization, nucleic acid amplification, and antigen-antibody reaction methods Is further detected.
別の実施形態において、本発明による検出用キットとしては、本発明による別の実施形態の検出を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、CCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の発現を検出するためのキットであって、本発明によるプライマーまたは本発明によるプライマーセットを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この検出用キットは核酸増幅法によりCCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の発現を検出する。従って第二の態様の検出方法は、所望により、核酸増幅法を実施するための種々の試薬、例えば緩衝液、PCRが正常に進行し得ることを示す内部標準、説明書、および/または器具などを更に含むことができる。 In another embodiment, the detection kit according to the present invention includes a detection kit for performing the detection according to another embodiment of the present invention, specifically, CCL21-CXCR3 such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc. -A kit for detecting the expression of a factor of the CCR7 signaling system, which includes at least a primer according to the present invention or a primer set according to the present invention. This detection kit detects the expression of CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factors such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc. by nucleic acid amplification. Therefore, the detection method of the second aspect includes various reagents for carrying out the nucleic acid amplification method, for example, a buffer, an internal standard indicating that PCR can proceed normally, instructions, and / or instruments, if desired. Can further be included.
本発明によるこの実施形態の検出キットは、精度の高い検出を行うために、CCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子以外の脳マラリアのマーカー遺伝子の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでいてもよい。これらのプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、CCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子以外の脳マラリアのマーカーの発現を更に検出する。 The detection kit of this embodiment according to the present invention can detect the expression of a marker gene of cerebral malaria other than factors of CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc. in order to perform highly accurate detection. A probe, primer, primer set, or antibody may further be included. These probes, primers, primer sets, or antibodies may be labeled. This detection kit can express markers of brain malaria other than factors of CCL21-CXCR3-CCR7 signal transduction system such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc. by any of hybridization, nucleic acid amplification, and antigen-antibody reaction methods. Further detect.
さらなる実施形態において、本発明による検出キットとしては、本発明によるさらなる実施形態の検出を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、CCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子のタンパク質を検出するためのキットであって、本発明による抗体を少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットは抗原抗体反応を検出することによりCCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子の発現を検出する。この実施形態の検出方法は、所望により、抗原抗体反応を実施するための種々の試薬、例えばELISA法等に用いる2次抗体、発色試薬、緩衝液、説明書、および/または器具などを更に含むことができる。 In further embodiments, detection kits according to the present invention include detection kits for carrying out the detection of further embodiments according to the present invention, specifically CCL21-CXCR3-CCR7 signals such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc. A kit for detecting a protein of a factor of a transmission system, which includes at least the antibody according to the present invention. This antibody may be labeled. This detection kit detects the expression of factors of CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc. by detecting antigen-antibody reaction. The detection method of this embodiment further includes various reagents for carrying out the antigen-antibody reaction, for example, secondary antibodies used in the ELISA method, coloring reagents, buffers, instructions, and / or instruments, if desired. be able to.
これらのキット、組成物またはシステムは、本発明のマーカー(例えば、CCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子を同定することができる限り、任意の被験体由来の試料中のマーカー、該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段を用いることができることが理解され得る。従って、本明細書において具体的に記載された因子または手段のみならず、当該分野において公知の任意の等価の因子または手段を用いることができることが理解される。 These kits, compositions or systems can be used in samples from any subject as long as they can identify the markers of the present invention (eg, CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system factors such as CCL21, CXCR3, CCR7, etc.). Can be used, or a factor that specifically interacts with the marker, or a means for selectively recognizing the marker, and thus only the factors or means specifically described herein. Rather, it is understood that any equivalent factor or means known in the art can be used.
1つの実施形態では、本発明において使用される因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択され、好ましくは、因子は、タンパク質または複合分子(例えば、糖タンパク質、脂質タンパク質など)である。好ましくは、因子は、抗体(例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体)である。このような因子は、標識されるか、または標識可能であることが好ましい。なぜなら、診断することが容易となるからである。 In one embodiment, the factor used in the present invention is selected from the group consisting of nucleic acid molecules, polypeptides, lipids, sugar chains, small organic molecules and complex molecules thereof, preferably the factor is a protein or complex. A molecule (eg, glycoprotein, lipid protein, etc.). Preferably, the factor is an antibody (eg, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody). Such factors are preferably labeled or labelable. This is because it is easy to diagnose.
本発明の好ましい実施形態において、使用される手段は、質量分析装置、核磁気共鳴測定装置、X線解析装置、SPR、クロマトグラフィー(例えば、HPLC、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー)、免疫学的手段(例えば、ウェスタンブロッティング、EIA(エンザイムイムノアッセイ)、RIA(ラジオイムノアッセイ)、ELISA(酵素連結イムノソルベントアッセイ))、生化学的手段(例えば、pI電気泳動、サザンブロッティング、二次元電気泳動)、電気泳動機器、化学的分析機器、蛍光二次元ディファレンシャル電気泳動法(2DE−DIGE)、同位体標識法(ICAT)、タンデムアフィニティ精製法(TAP法)、物理学的手段、レーザーマイクロダイセクションおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される。 In a preferred embodiment of the present invention, the means used are mass spectrometer, nuclear magnetic resonance analyzer, X-ray analyzer, SPR, chromatography (eg, HPLC, thin layer chromatography, gas chromatography), immunology (E.g. Western blotting, EIA (enzyme immunoassay), RIA (radioimmunoassay), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)), biochemical means (e.g. pI electrophoresis, Southern blotting, two-dimensional electrophoresis), Electrophoresis equipment, chemical analysis equipment, fluorescence two-dimensional differential electrophoresis (2DE-DIGE), isotope labeling (ICAT), tandem affinity purification (TAP), physical means, laser microdissection and these From a combination of It is selected from the group that.
本発明の好ましい実施形態では、本発明のシステムまたはキットは、さらに、マーカーの標準を含む。このような標準は、マーカーの検出手段(該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段など)が正常に機能しているかどうかを確認するために用いることが好ましい。 In a preferred embodiment of the invention, the system or kit of the invention further comprises a marker standard. Such a standard may be used to confirm whether a marker detection means (such as a factor that specifically interacts with the marker or a means for selectively recognizing the marker) is functioning normally. preferable.
好ましい実施形態では、本発明では、対象となる試料を精製する手段をさらに備え得る。このような精製手段としては、例えば、クロマトグラフィーなどを挙げることができる。精製することによって、診断の精度を上げることができることから、好ましい実施形態において使用され得るが、これは必須ではない。 In a preferred embodiment, the present invention may further comprise means for purifying the sample of interest. Examples of such purification means include chromatography. Since purification can increase the accuracy of the diagnosis, it can be used in preferred embodiments, but this is not essential.
1つの実施形態では、本発明において使用される因子または手段は、本発明のマーカーの定量をする能力を有する。このような定量は、標準曲線を描いたときに、検量線がきちんと描ける手段または因子であるものがよい。好ましくは、例えば、抗体、質量分析、クロマトグラフィー分析などを挙げることができる。従って、ある実施形態では、本発明のシステムは、マーカーの定量を行うための定量手段をさらに備える。 In one embodiment, the factor or means used in the present invention has the ability to quantify the marker of the present invention. Such quantification may be a means or factor that can draw a calibration curve properly when a standard curve is drawn. Preferable examples include antibodies, mass spectrometry, and chromatographic analysis. Therefore, in one embodiment, the system of the present invention further comprises a quantification means for quantifying the marker.
1つの実施形態では、定量手段は、標準曲線と測定結果とを比較して前記マーカーが正常値の範囲内かどうかを判定する判定手段を含む。このような判定手段は、コンピュータを用いて実現することができる。 In one embodiment, the quantification unit includes a determination unit that compares the standard curve with a measurement result to determine whether the marker is within a normal value range. Such determination means can be realized using a computer.
1つの実施形態では、本発明のキットまたはシステムは、マーカーまたはマーカーに特異的に相互作用する因子を含む組成物を含む。 In one embodiment, a kit or system of the invention comprises a composition comprising a marker or an agent that specifically interacts with the marker.
1つの局面において、本発明は、被験体由来の試料中のマーカー、該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段の、増殖能のレベルまたは分化状態、またはそれに関する疾患、障害または状態の予測診断、事前診断、予測、検出または診断するための医薬の製造における、使用を提供する。ここで、試料の取得は、どのような手段で行ってもよい。通常、医師以外の担当者が測定に従事する場合は、何らかの形で医師が取得したものであり得る。測定結果から、増殖能のレベルまたは分化状態、またはそれに関する疾患、障害または状態またはその可能性があるかどうかの決定は、正常値と比べて、各々のマーカーに比較して異常であるかどうかを判定することによって実施することができる。本発明の方法において、使用されるマーカーなどは、本明細書の他の場所において記載される任意の1または複数の特徴を矛盾することがない限り有していても良いことが理解される。本発明の検出または診断において、マーカーの濃度を測定する方法は、そのマーカーの濃度を特異的に測定できる方法であれば、タンパク質の定量に一般に用いられている方法をそのまま用いることができる。例えば、各種のイムノアッセイ、質量分析(MS)、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いることができる。 In one aspect, the present invention provides a level of proliferative ability or differentiation state of a marker in a sample from a subject, a factor that specifically interacts with the marker, or a means for selectively recognizing the marker, or Provided is the use in the manufacture of a medicament for predictive diagnosis, pre-diagnosis, prediction, detection or diagnosis of a disease, disorder or condition related thereto. Here, the sample may be acquired by any means. Usually, when a person in charge other than the doctor is engaged in the measurement, it may have been acquired by the doctor in some form. Whether the determination of the level of proliferative potential or the state of differentiation, or the associated disease, disorder or condition, or whether it is possible, is abnormal compared to the normal value, relative to each marker It can be implemented by determining. It will be appreciated that in the methods of the invention, the markers used, etc. may have any one or more of the features described elsewhere in this specification as long as they do not conflict. In the detection or diagnosis of the present invention, as a method for measuring the marker concentration, a method generally used for protein quantification can be used as it is as long as the marker concentration can be specifically measured. For example, various immunoassays, mass spectrometry (MS), chromatography, electrophoresis and the like can be used.
本発明の検出または診断における好ましい実施形態の一つは、マーカーを担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカーの濃度を測定することである。すなわち、マーカーに対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカーを担体上に捕捉する。本実施形態によれば、試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカーの濃度を測定することができる。 One preferred embodiment in the detection or diagnosis of the present invention is to capture a marker on a carrier and measure the concentration of the captured marker. That is, a substance having affinity for the marker is immobilized on the carrier, and the marker is captured on the carrier via the substance having the affinity. According to this embodiment, the influence of the contaminant contained in the sample can be reduced, and the marker concentration can be measured with higher sensitivity and higher accuracy.
1つの実施形態においてマーカーの測定方法にイムノアッセイを用いる場合は、抗体を固定化した担体を用いることが好ましい。このようにすれば、担体に固定化された抗体を1次抗体としたイムノアッセイの系を簡単に構築することができる。例えば、マーカーに特異的でエピトープの異なる2種類の抗体を用意し、一方を1次抗体として担体に固定化し、他方を2次抗体として酵素標識し、サンドイッチEIAの系を構築することができる。その他、結合阻止法や競合法によるイムノアッセイの系も構築可能である。さらに、担体として基板を用いる場合は、抗体チップによるイムノアッセイが可能である。抗体チップによれば、複数のマーカーの濃度を同時に測定でき、迅速な測定が可能である。 In one embodiment, when an immunoassay is used as a marker measurement method, it is preferable to use a carrier on which an antibody is immobilized. In this way, an immunoassay system using the antibody immobilized on the carrier as the primary antibody can be easily constructed. For example, two types of antibodies specific to a marker and having different epitopes are prepared, one is immobilized on a carrier as a primary antibody, and the other is enzyme-labeled as a secondary antibody to construct a sandwich EIA system. In addition, immunoassay systems based on binding inhibition methods and competitive methods can be constructed. Further, when a substrate is used as a carrier, immunoassay using an antibody chip is possible. According to the antibody chip, the concentration of a plurality of markers can be measured simultaneously, and rapid measurement is possible.
一方、1つの実施形態において、マーカーの測定方法に質量分析を用いる場合は、抗体の他、イオン結合や疎水性相互作用によってマーカーを担体に捕捉することもできる。イオン結合や疎水性相互作用は抗原と抗体等のバイオアフィニティほどの特異性がなく、マーカー以外の物質も捕捉されるが、質量分析によれば分子量を反映した質量分析計スペクトルによって定量するので、問題はない。特に、担体として基板を使用したプロテインチップを用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化(surface−enhanced laser desorption/ionization)−飛行時間質量分析(time−of−flight mass spectrometry)(本明細書中「SELDI−TOF−MS」と称する)を行えば、マーカーの濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、特に弱陽イオン交換基板と、金属イオン基板が好ましく用いられる。 On the other hand, in one embodiment, when mass spectrometry is used as a method for measuring a marker, the marker can be captured on a carrier by ion binding or hydrophobic interaction in addition to the antibody. Ion binding and hydrophobic interactions are not as specific as bioaffinity such as antigens and antibodies, and substances other than markers are captured, but according to mass spectrometry, they are quantified by a mass spectrometer spectrum that reflects molecular weight. No problem. In particular, using a protein chip using a substrate as a carrier, surface-enhanced laser desorption / ionization-time-of-flight mass spectrometry (herein referred to as "SELDI") (Referred to as “-TOF-MS”), the concentration of the marker can be measured more accurately. As the types of substrates that can be used, cation exchange substrates, anion exchange substrates, normal phase substrates, reverse phase substrates, metal ion substrates, antibody substrates, etc. can be used, but cation exchange substrates, particularly weak cation exchanges. A substrate and a metal ion substrate are preferably used.
イオン結合によってマーカーを担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定化する。この場合、イオン交換体には陰イオン交換体、陽イオン交換体のいずれも用いることができ、さらに、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体のいずれも用いることができる。例えば、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル(DE)、ジエチルアミノエチル(DEAE)等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陰イオン交換体の例としては、4級アンモニウム(トリメチルアミノメチル)(QA)、4級アミノエチル(ジエチル,モノ・2−ヒドロキシブチルアミノエチル)(QAE)、4級アンモニウム(トリメチルアンモニウム)(QMA)等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル(CM)等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル(SP)等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。一方、疎水性相互作用によってマーカーを担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、C4〜C20のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。さらに、Cu2+、Zn2+、Ni2+、Ca2+、Co2+、Mg2+等の金属イオンを固定化した担体にマーカーを捕捉することもできる。When the marker is captured on the carrier by ionic bonding, the ion exchanger is immobilized on the carrier. In this case, both an anion exchanger and a cation exchanger can be used as the ion exchanger, and further, a strong anion exchanger, a weak anion exchanger, a strong cation exchanger, and a weak cation exchanger. Any of these can be used. For example, examples of weak anion exchangers include those having weak anion exchange groups such as dimethylaminoethyl (DE) and diethylaminoethyl (DEAE). Examples of strong anion exchangers include quaternary ammonium (trimethylaminomethyl) (QA), quaternary aminoethyl (diethyl, mono-2-hydroxybutylaminoethyl) (QAE), quaternary ammonium (trimethylammonium). And those having a strong anion exchange group such as (QMA). Examples of weak cation exchangers include those having weak cation exchange groups such as carboxymethyl (CM). Further, examples of the strong cation exchanger include those having a strong cation exchange group such as sulfopropyl (SP). On the other hand, when a marker is captured on a carrier by hydrophobic interaction, a substance having a hydrophobic group is immobilized on the carrier. Examples of hydrophobic groups include C4-C20 alkyl groups, phenyl groups, and the like. Furthermore, the marker can be captured on a carrier on which metal ions such as Cu 2+ , Zn 2+ , Ni 2+ , Ca 2+ , Co 2+ , and Mg 2+ are immobilized.
1つの実施形態において、用いる担体の例としては、ビーズ、マイクロタイタープレート、樹脂等の公知のものを使用することができる。特に、ビーズとマイクロタイタープレートは、イムノアッセイにおいて従来から用いられており、測定系の構築が容易である。一方、基板のような、平面部分を有する担体を用いることもできる。この場合は、平面部分の一部にマーカーに対する親和性を有する物質を固定化することが好ましい。例としては、基盤としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカーに特異的な抗体を固定化した担体が挙げられる。 In one embodiment, well-known materials such as beads, microtiter plates, and resins can be used as examples of carriers to be used. In particular, beads and microtiter plates are conventionally used in immunoassays, and the measurement system can be easily constructed. On the other hand, a carrier having a planar portion such as a substrate can also be used. In this case, it is preferable to immobilize a substance having affinity for the marker in a part of the flat surface portion. An example is a carrier in which a chip is used as a substrate and an antibody specific for a marker is immobilized in spots on a plurality of spots on the surface.
本発明による検出、検査または診断方法は、脳マラリアの予防または治療に有効な物質のスクリーニングに適用することができる。すなわち、被験物質をCCL21、CXCR3、CCR7等のCCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系の因子またはそれをコードする核酸分子に対する結合または相互作用を指標に、有効な物質をスクリーニングすることができる。使用されうる被験物質としては、合成低分子化合物、タンパク質、合成ペプチド、精製または部分精製ポリペプチド、抗体、細菌放出物質(細菌代謝産物を含む)、核酸(アンチセンス、リボザイム、RNAi等)等が挙げられ、好ましくは、化合物もしくはその塩またはそれらの溶媒和物(例えば、水和物)であるが、これらに限定されるものではない。被験物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。本発明によるスクリーニング法により特定された物質は、脳マラリアの治療または予防に有効な物質として用いることができる。 The detection, test or diagnostic method according to the present invention can be applied to screening of substances effective for the prevention or treatment of cerebral malaria. That is, an effective substance can be screened using the test substance as an index of binding or interaction with a CCL21-CXCR3-CCR7 signaling factor such as CCL21, CXCR3, CCR7, or a nucleic acid molecule encoding the same. Test substances that can be used include synthetic low molecular weight compounds, proteins, synthetic peptides, purified or partially purified polypeptides, antibodies, bacterial release substances (including bacterial metabolites), nucleic acids (antisense, ribozyme, RNAi, etc.), etc. Preferably, it is a compound or a salt thereof, or a solvate (for example, hydrate) thereof, but is not limited thereto. The test substance may be a novel substance or a known substance. The substance identified by the screening method according to the present invention can be used as a substance effective for the treatment or prevention of cerebral malaria.
(一般技術)
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J.et al.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001);Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley−Interscience;Ausubel,F.M.(1989).Short Protocols inMolecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley−Interscience;Innis,M.A.(1990).PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press;Ausubel,F.M.(1992).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates;Ausubel,F.M.(1995).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates;Innis,M.A.et al.(1995).PCR Strategies,Academic Press;Ausubel,F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,and annual updates;Sninsky,J.J.et al.(1999).PCR Applications:Protocols for Functional Genomics,Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。(General technology)
Molecular biological techniques, biochemical techniques, and microbiological techniques used in this specification are well known and commonly used in the art, and are described in, for example, Sambrook J. et al. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor and its 3rd Ed. (2001); Ausubel, F .; M.M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F .; M.M. (1989). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M .; A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F .; M.M. (1992). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F .; M.M. (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M .; A. et al. (1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F .; M.M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; J. et al. et al. (1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press, “Experimental Methods for Gene Introduction & Expression Analysis”, Yodosha, 1997, etc. Is incorporated by reference.
人工的に合成した遺伝子を作製するためのDNA合成技術および核酸化学については、例えば、Gait,M.J.(1985).Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press;Gait,M.J.(1990).Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press;Eckstein,F.(1991).Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,IRL Press;Adams,R.L.et al.(1992).The Biochemistry of the Nucleic Acids,Chapman & Hall;Shabarova,Z.et al.(1994).Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids,Weinheim;Blackburn,G.M.et al.(1996).Nucleic Acids in Chemistry and Biology,Oxford University Press;Hermanson,G.T.(1996).Bioconjugate Techniques,Academic Pressなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。 For DNA synthesis technology and nucleic acid chemistry for producing artificially synthesized genes, see, for example, Gait, M. et al. J. et al. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M .; J. et al. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F .; (1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R .; L. et al. (1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman &Hall; Shabarova, Z .; et al. (1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G .; M.M. et al. (1996). Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G .; T.A. (1996). Bioconjugate Technologies, Academic Press, etc., which are incorporated herein by reference in the relevant part.
例えば、本明細書において、当該分野に知られる標準法によって、例えば自動化DNA合成装置(Biosearch、Applied Biosystems等から市販されるものなど)の使用によって、本発明のオリゴヌクレオチドを合成することも可能である。例えば、Steinら(Stein et al.,1988,Nucl.Acids Res.16:3209)の方法によって、ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを合成することも可能であるし、調節孔ガラスポリマー支持体(Sarin et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:7448−7451)等の使用によって、メチルホスホネート・オリゴヌクレオチドを調製することも可能である。 For example, the oligonucleotides of the present invention can be synthesized herein by standard methods known in the art, for example, by using automated DNA synthesizers (such as those commercially available from Biosearch, Applied Biosystems, etc.). is there. For example, phosphorothioate oligonucleotides can be synthesized by the method of Stein et al. (Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209) and controlled pore glass polymer supports (Sarin et al. , 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7448-7451), etc., can also be used to prepare methylphosphonate oligonucleotides.
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には2つの値自体も含む。 In this specification, “or” is used when “at least one or more” of the items listed in the text can be adopted. The same applies to “or”. In this specification, when “within the range of two values” is specified, the range includes the two values themselves.
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。 References such as scientific literature, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety to the same extent as if each was specifically described.
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。 The present invention has been described with reference to the preferred embodiments for easy understanding. In the following, the present invention will be described based on examples, but the above description and the following examples are provided only for the purpose of illustration, not for the purpose of limiting the present invention. Accordingly, the scope of the present invention is not limited to the embodiments or examples specifically described in the present specification, but is limited only by the scope of the claims.
以下に実施例を記載する。必要な場合、以下の実施例で用いる動物の取り扱いは、必要な場合、医薬基盤研究所において規定される基準を遵守し、ヘルシンキ宣言に基づいて行った。試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー(Sigma−Aldrich、和光純薬、ナカライ、R&D Systems、USCN Life Science INC等)の同等品でも代用可能である。
(材料および方法)
P.berghei ANKA(PbA)
2種類の異なるPbA系統を使用した。これらのPbA系統の詳細(GFP有、無)については、以前に記載されている(Coban,C.ら(2007).Int Immunol 19,67−79.;Ishino,T.ら(2006).Mol Microbiol 59,1175−1184.;Zhao,H.ら(2012).Cell Host Microbe 12,705−716.)。Examples are described below. When necessary, the animals used in the following examples were handled according to the Declaration of Helsinki, if necessary, in compliance with the standards stipulated by the National Institute of Pharmaceutical Sciences. Specifically, the products described in the examples were used as reagents, but equivalent products from other manufacturers (Sigma-Aldrich, Wako Pure Chemicals, Nakarai, R & D Systems, USCN Life Science INC, etc.) can be substituted.
(Materials and methods)
P. berghei ANKA (PbA)
Two different PbA lines were used. Details of these PbA strains (with and without GFP) have been previously described (Coban, C. et al. (2007). Int Immunol 19, 67-79 .; Ishino, T. et al. (2006). Mol. Microbiol 59, 1175-1184 .; Zhao, H. et al. (2012). Cell Host Microbe 12, 705-716.).
動物および抗体によるインビボケモカインブロッキング
マウス
年齢と性別をマッチさせたC57BL/6(CLEA,Osaka,Japan)または同腹仔マウス(Ccr7+/−)を野生型(WT)群として使用した。C57BL/6バックグラウンドのCcr7−/−マウスは、M.MiyasakaおよびM.H.Jang(大阪大学)によって提供され、以前に記載されたとおりに作製された(Forster,R.ら(1999).Cell 99,23−33.)。Batf3−/−マウスは、Jackson Laboratoriesから購入し、C57BL/6マウスと交配させて、+/−表現型を作製した。In vivo chemokine blocking mice with animals and antibodies Age- and sex-matched C57BL / 6 (CLEA, Osaka, Japan) or littermate mice (Ccr7 +/- ) were used as wild type (WT) groups. Ccr7 − / − mice with C57BL / 6 background Miyasaka and M.S. H. Produced by Jang (Osaka University) and described previously (Forster, R. et al. (1999). Cell 99, 23-33.). Batf3 − / − mice were purchased from Jackson Laboratories and crossed with C57BL / 6 mice to create a +/− phenotype.
野生型マウスに、PbA感染の開始から3日間、エンドトキシンフリーの抗CCL21抗体またはアイソタイプコントロール(毎日マウス1匹あたり50μg,Peprotech)を毎日静脈内(i.v.)注射した。あるいは、感染後4日目および5日目に2回、抗CXCR3抗体(LEAF精製抗マウスCD183(CXCR3),マウス1匹あたり100μg,Biolegend)を注射した。組み合わせ治療は、感染後4日目に抗CXCR3および抗CCL21抗体混合物を用いて行い、感染後5日目に抗CCL21抗体の注射を繰り返した。 Wild type mice were injected intravenously (iv) daily with endotoxin-free anti-CCL21 antibody or isotype control (50 μg per mouse, Peprotech daily) for 3 days from the start of PbA infection. Alternatively, an anti-CXCR3 antibody (LEAF purified anti-mouse CD183 (CXCR3), 100 μg per mouse, Biolegend) was injected twice on days 4 and 5 after infection. The combination treatment was performed using anti-CXCR3 and anti-CCL21 antibody mixture on the 4th day after infection, and repeated injections of anti-CCL21 antibody on the 5th day after infection.
サル
体重5kgの雌性ニホンザル(Macacafuscata)に、以前に記載されたように、1×109の凍結P.coatneyi感染赤血球(CDC系統)をi.v.接種し、毎日追跡した(Kawai,S.およびSugiyama,M.(2010).Acta Trop 114,152−156.)。サルが重篤なマラリアの症状を示し、意識不明となった感染後14日目の終わりに、ケタミン−HCl(15mg/kg)の筋肉内注射により麻酔をかけた後に検死解剖を行った。コントロールとして、P.knowlesiiを感染させたニホンザル1頭と、非感染コントロールとしてのカニクイザル1頭を用いた。Monkeys A female Japanese macaque (Macacafuscata) weighing 5 kg, as described previously, 1 × 10 9 frozen P. a. Coatneyi infected erythrocytes (CDC line) i. v. Inoculated and followed daily (Kawai, S. and Sugiyama, M. (2010). Acta Trop 114, 152-156.). At the end of the 14th day after infection, when the monkey showed severe malaria symptoms and became unconscious, autopsy was performed after anesthesia by intramuscular injection of ketamine-HCl (15 mg / kg). As a control, P.I. One Japanese macaque infected with knowlesii and one cynomolgus monkey as a non-infected control were used.
全てのマウスおよびサルの実験は、独立行政法人 医薬基盤研究所および大阪大学のガイドライン、ならびに、日本実験動物学会公認の実験動物の使用に関する指針に従って行った。 All mouse and monkey experiments were conducted according to the guidelines of the National Institute of Biomedical Innovation and Osaka University, and the guidelines for the use of laboratory animals approved by the Japanese Society for Experimental Zoology.
MRI脳イメージング
マウス頭部のMRIイメージングは、超高磁場11.7T MRIスキャナ(AVANCE−II 500 WB;Bruker BioSpin)を用いて行った。ナイーブなマウスを、MRI処理手順の間に1.0〜1.5%イソフルランで麻酔することにより、生体からの最初の像と、4%パラホルムアルデヒド(PFA)固定した死亡マウスからの像とを比較した。この比較から、両者に有意な差がないことが示唆された(図1E)。それゆえ、この後の実験においては、深麻酔をかけた感染マウスを、PFA中で固定し、MRIによって可視化した。以下のパラメーターでT2*強調画像(FLASHシーケンス)および拡散強調画像(DWI;スピンエコーシーケンス)を用いて出血を検出した:1)T2*強調細密画像:視野,15mm×15mm;マトリックスサイズ,512×512;スライス厚,0.3mm;繰り返し時間,450ms;エコー時間,6.0ms;平均,64;スキャン時間,4時間5分。2)T2*強調通常画像:視野,20mm×20mm;マトリックスサイズ,256×256;スライス厚,0.5mm;繰り返し時間,400ms;エコー時間,6.0ms;平均,16;スキャン時間,27分。3)DWI:視野,15mm×15mm;マトリックスサイズ,512×512;スライス厚,0.3mm;繰り返し時間,6000ms;エコー時間,21.0ms;b値,1000s/mm2;平均,9;スキャン時間,7時間41分。MRI brain imaging MRI imaging of the mouse head was performed using an ultra-high magnetic field 11.7T MRI scanner (AVANCE-II 500 WB; Bruker BioSpin). Naive mice were anesthetized with 1.0-1.5% isoflurane during the MRI treatment procedure to obtain an initial image from the living body and an image from a dead mouse with 4% paraformaldehyde (PFA) fixation. Compared. This comparison suggested that there was no significant difference between the two (FIG. 1E). Therefore, in subsequent experiments, infected mice with deep anesthesia were fixed in PFA and visualized by MRI. Bleeding was detected using T2 * weighted image (FLASH sequence) and diffusion weighted image (DWI; spin echo sequence) with the following parameters: 1) T2 * weighted fine image: field of view, 15 mm × 15 mm; matrix size, 512 × 512; slice thickness, 0.3 mm; repetition time, 450 ms; echo time, 6.0 ms; average, 64; scan time, 4 hours and 5 minutes. 2) T2 * weighted normal image: field of view, 20 mm × 20 mm; matrix size, 256 × 256; slice thickness, 0.5 mm; repetition time, 400 ms; echo time, 6.0 ms; average, 16; scan time, 27 minutes. 3) DWI: field of view, 15 mm × 15 mm; matrix size, 512 × 512; slice thickness, 0.3 mm; repetition time, 6000 ms; echo time, 21.0 ms; b value, 1000 s / mm 2 ; average, 9; scan time 7 hours 41 minutes.
薄型頭蓋外科手術および多光子イメージング
生体マウス内のOLFを可視化するために、マウスを、ケタミン(0.13mg/g)およびキシラジン(0.01mg/g)の筋肉内注射により絶えず麻酔しながら、以前に記載された外科的「薄型頭蓋(thinned−skull)」技術をOLF領域用に改良した(Sawada,M.ら、(2011).J Neurosci 31,11587−11596.;Wake,H.ら(2009).J Neurosci 29,3974−3980.)。簡単に述べると、定位固定ステージ上にイヤーバーを用いてマウスの頭部を固定した。双眼実体顕微鏡下で、高速ドリル(Minimo,ミニター株式会社)および手術用メスを用いて、OLF上の頭蓋を注意深く薄く(約20〜30μm)した。その領域上の頭蓋に金属リングを取り付け、実験の間、薄くした領域を湿った状態に維持した。イメージングは、1〜2.5倍のデジタルズームにて、水浸対物レンズ(XLPLN25XWMP,Olympus)を備えた顕微鏡(FV1000MPE,Olympus)を用いて行った。OLFの血管構造をテトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)−デキストラン(5mg/マウス)(T1287,Sigma)を静脈内注射することにより可視化し、T細胞を、ブリリアントバイオレット421を結合させたTCR−β(H57−597,Biolegend)10μg、またはCD8α(53−6.7,Biolegend)5μgにより標識した。チタンサファイアレーザー(MaiTai Hp,Spectral Physics)をT細胞および血管用に800nmの励起波長にチューニングし、そして、Chameleonレーザー(Coherent)をGFP−PbA用に950nmの励起波長にチューニングした。30〜80のz平面を含む蛍光画像スタックを連続的に繰り返し取得することによって、小さなOLF領域のコマ撮りイメージング[1.1095秒あたり507.934μm(x),507.934μm(y),5μm(z)]を行った(1つのスタック画像の取得には、取得するz平面の数に応じて約40〜90秒を要する)。典型的なイメージングの深さは、軟膜表面から80〜150μmであり、これは、糸球層に対応していた(図2A〜B)(Chaigneau,E.ら、(2003).Proc Natl Acad Sci U SA 100,13081−13086.)。ケタミンおよびキシラジンの混合物の断続的な筋肉内注射は、動物を1〜2時間にわたりモニタリングすることを可能にした。各マウスについて1回だけイメージングを行った。全てのイメージングデータは、Velocityソフトウェアを用いて処理および分析した。Thin Cranial Surgery and Multiphoton Imaging To visualize OLF in living mice, mice were previously anesthetized by intramuscular injection of ketamine (0.13 mg / g) and xylazine (0.01 mg / g) The surgical “thinned-skull” technique described in S., et al. (Sawada, M. et al., (2011). J Neurosci 31, 11587-11596 .; Wake, H. et al. (2009). J Neurosci 29, 3974-3980.). Briefly, the head of the mouse was fixed on the stereotaxic stage using an ear bar. Under a binocular stereomicroscope, the skull on the OLF was carefully thinned (about 20-30 μm) using a high-speed drill (Minimo, Miniter) and a scalpel. A metal ring was attached to the skull over that area and the thinned area was kept moist during the experiment. Imaging was performed using a microscope (FV1000MPE, Olympus) equipped with a water immersion objective lens (XLPLN25XWMP, Olympus) at a digital zoom of 1 to 2.5 times. The vasculature of OLF was visualized by intravenous injection of tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) -dextran (5 mg / mouse) (T1287, Sigma), and T cells were expressed in TCR-β conjugated with brilliant violet 421 ( Labeled with 10 μg of H57-597, Biolegend), or 5 μg of CD8α (53-6.7, Biolegend). A titanium sapphire laser (MaiTai Hp, Spectral Physics) was tuned to an excitation wavelength of 800 nm for T cells and blood vessels, and a Chameleon laser (Coherent) was tuned to an excitation wavelength of 950 nm for GFP-PbA. Time-lapse imaging of small OLF regions [507.934 μm (x), 507.934 μm (y), 5 μm (1.1095 seconds) by continuously and repeatedly acquiring a fluorescence image stack containing 30-80 z-planes. z)] (acquisition of one stack image takes about 40 to 90 seconds depending on the number of z planes to be acquired). Typical imaging depths were 80-150 μm from the buffy coat surface, which corresponded to the glomerular layer (FIGS. 2A-B) (Chaignau, E. et al. (2003). Proc Natl Acad Sci. U SA 100, 13081-13086.). Intermittent intramuscular injection of a mixture of ketamine and xylazine allowed the animals to be monitored for 1-2 hours. Imaging was performed only once for each mouse. All imaging data was processed and analyzed using Velocity software.
血管直径の測定
糸球に近い深部層における血管の直径を、Z像スタックの取得し、これを二次元画像へと投影することによって測定した。次いで、血管の内径を、以前に記載されたとおりに測定した(Chaigneau,E.ら、(2003).Proc Natl Acad Sci U SA 100,13081−13086.)。
BBB透過性の評価
示す時点において、マウスに、1%エバンスブルー染料(Sigma)200μlをi.v.注射した。2時間後にマウスを屠殺し、脳を摘出し、PBSで洗浄し、そして、解剖顕微鏡下で脳の像を撮影した。Measurement of blood vessel diameter The blood vessel diameter in the deep layer near the glomerulus was measured by acquiring a Z image stack and projecting it onto a two-dimensional image. Vessel inner diameter was then measured as previously described (Chaigneau, E. et al. (2003). Proc Natl Acad Sci USA 100, 13081-13086.).
Evaluation of BBB permeability At time points indicated, mice were given i.e. 200 μl of 1% Evans blue dye (Sigma) i. v. Injected. Two hours later, the mice were sacrificed, the brains were removed, washed with PBS, and brain images were taken under a dissecting microscope.
定量的リアルタイム逆転写PCR分析
脳サンプルをホモジナイズし、総RNAを単離し、そして、q−PCRを以前に記載されたとおりに実施した(Zhao,H.ら(2012).Cell HostMicrobe 12,705−716.)。マラリア感染を、PbA 18S rRNAに特異的なプライマーを用いて定量した。全てのプライマーは、Assays on Demand(Applied Biosystems)から購入した。Quantitative real-time reverse transcription PCR analysis Brain samples were homogenized, total RNA was isolated, and q-PCR was performed as previously described (Zhao, H. et al. (2012). Cell Host Microbe 12, 705- 716.). Malaria infection was quantified using primers specific for PbA 18S rRNA. All primers were purchased from Assays on Demand (Applied Biosystems).
食料埋設試験
食料埋設試験を、以前に記載されたとおりに実施した(Yang,M.およびCrawley,J.N.(2009).Curr Protoc Neurosci Chapter 8,Unit 8 24.)。簡単に述べると、マウスを、18時間にわたって食料の無い状態にし、続いて、床敷きを含み、ケージのランダムなコーナーに、表面からおよそ1cm下に食料が埋設された新しいケージに移した。マウスが埋設された食料を見つけるまでの時間を記録した。15分が経過してもマウスが埋設された食料を見つけられなかった場合、試験を中止し、その時間を900秒(潜伏スコア,>>>)として記録した。Food Embedding Test The food burying test was performed as previously described (Yang, M. and Crawley, JN (2009). Curr Protoc Neurosci Chapter 8, Unit 8 24.). Briefly, mice were left free of food for 18 hours, and then transferred to a new cage with bedding embedded in the random corners of the cage approximately 1 cm below the surface. The time taken for the mouse to find the buried food was recorded. If the mouse did not find any embedded food after 15 minutes, the test was stopped and the time was recorded as 900 seconds (latency score, >>).
組織学
脳を摘出し、以前に報告されたとおりに免疫組織化学(IHC)のために調製した(Zhao,H.ら(2012).Cell HostMicrobe 12,705−716.)。以下の抗体を使用した:抗マウスTER119抗体(Biolegend)、ZO−1抗体(Invitrogen)、CCL21抗体(Peprotech)、PECAM抗体(BD Pharmingen)およびGFAP抗体(Dakocytomation)。切片は、蛍光またはLSM 780共焦点レーザースキャン顕微鏡(Zeiss,Germany)を用いて観察した。Histology Brains were removed and prepared for immunohistochemistry (IHC) as previously reported (Zhao, H. et al. (2012). Cell Host Microbe 12, 705-716.). The following antibodies were used: anti-mouse TER119 antibody (Biolegend), ZO-1 antibody (Invitrogen), CCL21 antibody (Peprotech), PECAM antibody (BD Pharmingen) and GFAP antibody (Dakocytomation). Sections were observed using a fluorescence or LSM 780 confocal laser scanning microscope (Zeiss, Germany).
温度のモニタリング
継続的な発熱を記録するために、内製のサーマルモニタリングシステムを備えたマウスのケージを開発した(Aoshiら、論文投稿準備中、特開2012−231725参照)。ケージは、12時間−12時間の明暗サイクルを持ち、そして、食料および水への自由なアクセスが可能な、環境温度が30℃に制御されたインキュベーターのように調製した。マウスの背の毛を電気バリカンで取り除き、背の皮膚温度を、インキュベーターの内側に備え付けたFLIR b60サーマルカメラによって1分間隔で連続的に記録し、そして、データを、QuickPlotソフトウェア(FLIR Systems,Inc.)により分析した。Temperature monitoring A mouse cage equipped with an in-house thermal monitoring system was developed to record continuous heat generation (Aoshi et al., In preparation for paper submission, see JP2012-231725). The cages were prepared as incubators with a 12-12 hour light / dark cycle and controlled free ambient temperature of 30 ° C. with free access to food and water. The back hair of the mouse was removed with an electric clipper, the skin temperature on the back was continuously recorded at 1 minute intervals by a FLIR b60 thermal camera mounted inside the incubator, and the data was collected using QuickPlot software (FLIR Systems, Inc. .).
フローサイトメトリー分析
脾臓および脳の細胞を、以前に記載されたとおりに精製した(Coban,C.ら(2007).Int Immunol 19,67−79.;Zhao,H.ら(2012).Cell Host Microbe 12,705−716.)。細胞表面を、APC−CD11c(HL3)、PE−CD4(RM4−5)、PerCp Cy5.5−CD8α(53−6.7)、PE Cy7−CD3(145−2C11)、APC Cy7−TCRβ(H57−597)、APC−CCR7(4B12)、APC−CD44(IM7)、PE CY7−CD11c(HL3)およびAPC Cy7−CD11b(M1/70)で染色した。これらの抗体は、BD Biosciences(San Jose,CA)およびBioLegend(San Diego,CA)から購入した。サンプルを、BD LSRFortessaフローサイトメーター上に取り込み、FlowJoソフトウェアを用いて分析した。細胞内IFNγ染色には、脾細胞をブレフェルジンA(10μg/ml,Sigma)の存在下で2時間インキュベートし、細胞を回収して、細胞内染色プロトコール(eBioscience)に従ってIFNγで染色した。Flow cytometric analysis Spleen and brain cells were purified as previously described (Coban, C. et al. (2007). Int Immunol 19, 67-79 .; Zhao, H. et al. (2012). Cell Host. Microbe 12, 705-716.). The cell surface was treated with APC-CD11c (HL3), PE-CD4 (RM4-5), PerCp Cy5.5-CD8α (53-6.7), PE Cy7-CD3 (145-2C11), APC Cy7-TCRβ (H57). -597), APC-CCR7 (4B12), APC-CD44 (IM7), PE CY7-CD11c (HL3) and APC Cy7-CD11b (M1 / 70). These antibodies were purchased from BD Biosciences (San Jose, CA) and BioLegend (San Diego, CA). Samples were taken on a BD LSRFortessa flow cytometer and analyzed using FlowJo software. For intracellular IFNγ staining, splenocytes were incubated for 2 hours in the presence of brefeldin A (10 μg / ml, Sigma), the cells were collected and stained with IFNγ according to the intracellular staining protocol (eBioscience).
トランスウェル移動アッセイ
48ウェルのトランスウェルプレート(5μm孔径,Costar,Corning Inc.)を、以前に記載されたとおりに、化学走性アッセイに使用した(Rappert,A.ら、(2002).J Immunol 168,3221−3226.)。簡単に述べると、無血清DMEM中に指定した濃度で希釈した組換えタンパク質CCL21および/または抗CCL21抗体(R&D Systems)を、下側の区画に充填した。感染後6日目の感染動物由来の、B細胞およびCD11b+細胞およびCD4+細胞を枯渇させた後に濃縮された脾臓CD8 T細胞を、上側のウェルに三連で加え(5×106/ウェル)、37℃にて2時間無血清DMEM培地中でインキュベートした。リンパ球に対する強力な化学走性リガンドであるヒトSDF−1α(Peprotech,Inc.)をポジティブコントロールとして使用した。CD11c+CXCR3+CD8 T細胞の移動率を、フローサイトメーターにより全細胞をカウントすることによって計算した。ケモカイン誘導性の移動を、非刺激のコントロール群の移動に対して標準化し、コントロールに対する割合(%)として表した。Transwell Migration Assay 48 well transwell plates (5 μm pore size, Costar, Corning Inc.) were used for chemotaxis assays as previously described (Rappert, A. et al. (2002). J Immunol. 168, 3221-3226.). Briefly, the lower compartment was filled with recombinant protein CCL21 and / or anti-CCL21 antibody (R & D Systems) diluted in serum-free DMEM at the indicated concentrations. Spleen CD8 T cells enriched after depletion of B cells and CD11b + cells and CD4 + cells from infected animals on day 6 after infection were added to the upper wells in triplicate (5 × 10 6 / well). ), And incubated in serum-free DMEM medium at 37 ° C. for 2 hours. Human SDF-1α (Peprotech, Inc.), a potent chemotactic ligand for lymphocytes, was used as a positive control. The migration rate of CD11c + CXCR3 + CD8 T cells was calculated by counting total cells with a flow cytometer. Chemokine-induced migration was normalized to that of the unstimulated control group and expressed as a percentage of the control.
血清サイトカイン
感染後5日目に採血を行い、マウスBio−Plex(Bio−rad)によってサイトカインおよびケモカインの検出を行った。Serum cytokines Blood was collected on day 5 after infection, and cytokines and chemokines were detected by mouse Bio-Plex (Bio-rad).
養子免疫実験
PbANKA感染後5日目のRag2−/−マウスから総脾細胞を調製し、脾臓CD8α+DCを濃縮した。簡単に述べると、抗マウスCD11bマイクロビーズ(MACS,Miltenyi Biotec.,Germany)を用いてCD11b−集団をネガティブ選択し、その後、CD4+集団を除去した(L3T4,MACS)。残った濃縮CD8α+DC(20×106細胞)を、0日目にPbA感染の2時間前にレシピエントマウスにi.v.注入した。ポジティブ選択したCD8α+DC細胞集団の純度および表現型は、養子免疫の前にフローサイトメトリーにより評価し、典型的には、95%超の純度であることが分かった(図6I)。
統計解析
2群間の差は、両側対応無しのStudentのt検定またはノンパラメトリックMann−Whitney検定(Prismソフトウェア)のいずれかを用いて統計的有意差について解析した。生存曲線については、Log−rank(Mantel−Cox)検定を行った。p<0.05を統計的に有意とみなした。Adoptive immunization experiment Total splenocytes were prepared from Rag2 − / − mice on the fifth day after PbANKA infection, and spleen CD8α + DC were concentrated. Briefly, the CD11b - population was negatively selected using anti-mouse CD11b microbeads (MACS, Miltenyi Biotec., Germany), after which the CD4 + population was removed (L3T4, MACS). The remaining enriched CD8α + DC (20 × 10 6 cells) was administered i.p. to recipient mice on day 0 2 hours prior to PbA infection. v. Injected. The purity and phenotype of the positively selected CD8α + DC cell population was assessed by flow cytometry prior to adoptive immunization and was typically found to be more than 95% pure (FIG. 6I).
Statistical analysis Differences between the two groups were analyzed for statistical significance using either the Student's t test without two-sided correspondence or the nonparametric Mann-Whitney test (Prism software). For the survival curve, Log-rank (Mantel-Cox) test was performed. p <0.05 was considered statistically significant.
(実施例1:脳マラリアと嗅球の関係性の解明)
実施例1では、マウスモデルを用いて、脳マラリアと嗅球の関係性に関する実験を行った。(Example 1: Elucidation of relationship between brain malaria and olfactory bulb)
In Example 1, an experiment on the relationship between brain malaria and the olfactory bulb was performed using a mouse model.
(超高磁場MRIイメージング)
本実施例ではまず、超高磁場MRIイメージングは嗅球をP.berghei ANKA寄生虫より引き起こされる脳マラリア中の脳における微小出血の場所として同定した。(Ultra-high magnetic field MRI imaging)
In the present embodiment, first, ultrahigh magnetic field MRI imaging is performed on the olfactory bulb. identified as the location of microhemorrhages in the brain during cerebral malaria caused by berghei ANKA parasites.
マウスの脳内の変化を研究し、ECMに関連する病理を可視化するために、本発明者らは、超高磁場11.7T MRI(Mori,Y.ら(2011).Magn Reson MedSci 10,219−227.)を行った。方向感覚の喪失や麻痺といった特定のECM症状が始まったPbA感染から6日後に、11.7T MRIは、両側のOLFにおいて暗いはっきりとしたスポットを示し(図1Aの冠状断面および図1E)、大脳または小脳を含む脳の他の部分はこのようなスポットを示さなかった(図1Aの矢状断面)。拡散強調画像(DWI)を取得すると、OLF領域の細部がより明らかとなり、これは、組織学的な詳細と顕著に類似しており、低密度の領域がヘマトキシリン・エオジン(HE)染色による出血部位と対応していた(図1Bおよび1C)。本発明者らはまた、免疫組織化学(IHC)により、出血(TER119+赤血球)とGFP−PbA寄生虫がOLFの同じ領域に存在し、その領域が顆粒細胞層(GGL)と同じくらい深部であったことを確認した(図1D)。本発明者らは、より早い時点のOLF内のMRIを追加で行ったが、感染後6日目よりも前には変化は検出されなかった(図1F)。さらに、症状発症後のいくつかのMRI画像は、おそらく進行性の疾患状態を引き起こしているOLFにおいて、異なる程度の微小出血の重症度を示した(図3H、I)。これに対し、OLFにおいて重度の出血が生じていても、MRIでは脳の他の部分における微小出血の明らかな証拠は見られなかった(図3H、I)。加えて、致死性の寄生虫P.yoeliiL(PyL)に感染したマウスは、MRIではそのOLFにおける微小出血が検出されなかった(図3H、I)。それゆえ、より低磁場のMRIではなく、本発明者らの超高磁場MRIセッティングが、嗅球を、PbA感染の間に攻撃されやすく、脳の他の部分と比較して出血が起こりやすい領域として同定することを可能にしたと考えるのが合理的である。In order to study changes in the mouse brain and visualize the pathology associated with ECM, we have developed a very high magnetic field 11.7T MRI (Mori, Y. et al. (2011). Magn Reson MedSci 10,219. -227.). Six days after PbA infection in which specific ECM symptoms such as loss of direction and paralysis began, 11.7T MRI showed dark and distinct spots in the bilateral OLF (coronal section in FIG. 1A and FIG. 1E), Or other parts of the brain including the cerebellum did not show such spots (sagittal section in FIG. 1A). Acquiring a diffusion-weighted image (DWI) reveals more detail in the OLF area, which is remarkably similar to the histological detail, where the low density area is the site of bleeding due to hematoxylin and eosin (HE) staining (FIGS. 1B and 1C). The inventors have also demonstrated that by immunohistochemistry (IHC), bleeding (TER119 + red blood cells) and GFP-PbA parasites are present in the same region of OLF, which is as deep as the granular cell layer (GGL). It was confirmed that there was (FIG. 1D). The inventors additionally performed MRI in the OLF at an earlier time point, but no change was detected before 6 days after infection (FIG. 1F). In addition, several MRI images after the onset of symptoms showed different degrees of microbleeding severity in OLF, possibly causing a progressive disease state (FIGS. 3H, I). In contrast, even if severe bleeding occurred in OLF, MRI showed no clear evidence of microbleeding in other parts of the brain (FIGS. 3H, I). In addition, the lethal parasite P. Mice infected with yoeliiL (PyL) did not detect microbleeds in their OLF by MRI (FIGS. 3H, I). Therefore, instead of the lower magnetic field MRI, our ultra-high magnetic field MRI setting makes the olfactory bulb more susceptible to attack during PbA infection and is more likely to bleed compared to other parts of the brain It is reasonable to think that it was possible to identify.
(OLFの柵状微小血管内の寄生虫の生体内多光子イメージング)
本発明者らは次に、BBB崩壊の潜在的な関与を含めて、ECMの間にOLF領域からの出血が何故、そして、どのようにして生じるかを調べた。OLFは、高密度でかつ様々な方向(放射状および接線方向)を向いた柵状の微小血管構造から構成される。このような複雑な血管構造は、神経細胞およびグリア細胞と一緒に糸球内でシナプス性の相互作用を行い、組織内での神経細胞移動のための適切な足場環境として機能し得る(Bovetti,S.ら(2007).J Neurosci 27,5976−5980.;Danielyan,L.ら(2009).Eur J Cell Biol 88,315−324.)。このOLFの独特な血管構造が、PbA感染赤血球ならびに感染に関連する事象のための「脆弱な」スポットとなり得るかどうかを調べるために、OLFを生体内MP顕微鏡により可視化した。GL程度に深い(約150μm)OLF毛細管が可視化され得るOLFのMPイメージングは、これまでに、げっ歯類を用いて実施されている(Chaigneau,E.ら、(2003).Proc Natl Acad Sci USA100,13081−13086.;Petzold,G.C.ら、(2008).Neuron 58,897−910.;Sawada,M.ら、(2011).J Neurosci 31,11587−11596.)(図2A)。本発明者らは、以前に記載されたとおり(Sawada,M.ら、上掲)にマウスの背部OLFの上で薄型頭蓋外科手術を行い、組織をインタクトなまま維持した。OLF血管の生体画像は、この領域が解剖学的に複雑な毛細管構造(直径<5μm)を有しており(Petzold,ら、上掲)、感染から5日後に、PbA寄生虫内で発現されるGFPシグナルとして示される、循環iRBCの付着/閉塞に適していることを示した(図2B、また動画S1(本明細書では示さない)でも確認している)。動画S1では、生体内多光子顕微鏡によって可視化したマウスの嗅球を確認した。マウスにGFP−PbA寄生虫を感染させた。感染後5日目、マウスは目に見えるECMの症状を示さなかったが、血管を赤色TRITC−デキストランで標識し、図2Aに示されるように、30分間にわたって像を取得した。一部の寄生虫が減速し、血管に付着しているのが観察された。撮影した動画は5つあったが、感染後5日目の5匹のマウスにおいて同様であった。この動画S1に見られるように、一部のGFP標識された寄生虫の速度は低減および/または停止され、最終的には閉塞を引き起こした。これは、脳の他の部分と比較して、感染後6日目のOLFにおいて18S rRNAレベルならびにT細胞の蓄積によって測定される寄生虫負荷量が有意により高かったことと一致していた(図2C)。まとめると、これらの結果は、OLFが、おそらくはその柵状の毛細管構造に起因して、ECM発病に特有の領域となり、それによって、循環iRBCが減速し、付着し、そして/または、隔離され得、最終的には出血へと至ることを示唆している。(In vivo multiphoton imaging of parasites in OLF's fenced microvessels)
We next investigated why and how bleeding from the OLF region occurred during ECM, including the potential involvement of BBB disruption. The OLF is composed of a fence-like microvascular structure with high density and oriented in various directions (radial and tangential directions). Such complex vasculature can act as a suitable scaffolding environment for neuronal migration within tissues, with synaptic interactions within the glomerulus together with neurons and glial cells (Bovetti, S. et al. (2007) J Neurosci 27, 5976-5980 .; Danielyan, L. et al. (2009). Eur J Cell Biol 88, 315-324.). To investigate whether this unique vascular structure of OLF could be a “fragile” spot for PbA-infected erythrocytes as well as infection-related events, OLF was visualized by in vivo MP microscopy. MP imaging of OLF, in which OLF capillaries as deep as GL (about 150 μm) can be visualized, has been performed with rodents (Chaineau, E. et al. (2003). Proc Natl Acad Sci USA100. Petzold, GC et al., (2008) Neuron 58, 897-910 .; Sawada, M. et al. (2011). J Neurosci 31, 11587-11596.) (FIG. 2A). We performed thin cranial surgery on the dorsal OLF of mice as previously described (Sawada, M. et al., Supra) to keep the tissue intact. Biological images of OLF blood vessels have an anatomically complex capillary structure (diameter <5 μm) (Petzold, et al., Supra) and are expressed in PbA parasites 5 days after infection. It was shown to be suitable for attachment / occlusion of circulating iRBC, which is shown as a GFP signal (also confirmed in FIG. 2B and animation S1 (not shown here)). In the moving image S1, the olfactory bulb of the mouse visualized by an in vivo multiphoton microscope was confirmed. Mice were infected with GFP-PbA parasites. Five days after infection, mice showed no visible ECM symptoms, but blood vessels were labeled with red TRITC-dextran and images were acquired for 30 minutes as shown in FIG. 2A. It was observed that some parasites slowed down and attached to the blood vessels. Although there were five moving images, the same was true for five mice on the fifth day after infection. As can be seen in this animation S1, the rate of some GFP-labeled parasites was reduced and / or stopped, eventually causing occlusion. This was consistent with significantly higher parasite burden as measured by 18S rRNA levels as well as T cell accumulation in OLF at 6 days post infection compared to other parts of the brain (Fig. 2C). Taken together, these results indicate that OLF is a region that is unique to ECM pathogenesis, possibly due to its fenced capillary structure, whereby circulating iRBCs can slow down, adhere and / or be sequestered. Suggests that eventually it leads to bleeding.
(OLF内の血管を介したCD8 T細胞の往来)
脳内のCD8 T細胞の血管内蓄積は、ECMの発病において重要な役割を有することが示された(Belnoue,E.ら(2002).J Immunol 169,6369−6375.;Miyakoda,M.ら、(2008).J Immunol 181,1420−1428.)。それゆえ、本発明者らは、CD8 T細胞の補充が、OLFの生体内MPイメージングによって、観察され得るかどうか、そして/または、PbA感染後の微小出血と関連し得るかどうか、を検討した。感染マウスのOLFにおける標識CD8 T細胞およびGFP発現PbA寄生虫の生体内イメージングは、微小出血が分岐毛細管において生じていることをはっきりと示した(図2D、動画S2でも確認している(本明細書では示さない))。動画S2では、嗅球毛細管における新たな微小出血部位を示す、GFP−PbA寄生虫を感染させたマウスの代表的な3D像を撮影した。感染マウスを、感染後6日目に約1時間、生体内多光子顕微鏡によって可視化した。赤色、赤色TRITC−デキストランで標識した血管;緑色、GFPを発現するPbA寄生虫;青色、抗CD8α抗体で標識したCD8 T細胞。一部の赤色領域は、血管の完全性が失われた既に出血した領域を示している;T細胞は組織中をクロールしている。中心部の血管の完全性の突然の喪失は新たな出血が示された。動画S2に見られるように、微小出血の発生中に、赤色のデキストラン標識された毛細管が変更された(赤色色素がほとんど組織内に放出された)。重要なことには、CD8 T細胞は、ECMの発症中、血管内を前後に「クロール」し、数が増加することが分かり(図2D、動画S2、S3およびS4(本明細書では示さない)でも確認している)、一部は、出血領域周囲に付着することが分かった(動画S2(本明細書では示さない))。これらのOLF内でのCD8 T細胞の挙動は、ECMの末期における不安定な血流に受動的に従い得るが、比較的大きな血管(10μm前後)における感染後5日目に本願発明者らが構築した3D動画は、CD8 T細胞が、血管に付着し、血管壁に沿って活発にクロールしている様子をはっきりと示した(動画S3(本明細書では示さない))。動画3Sでは、T細胞が嗅球内の微小血管に沿ってクロールする様子が示され、感染後5日目のGFP−PbA寄生虫を感染させたマウスの嗅球の3D構築した多光子動画が示される。赤色、赤色TRITC−デキストランで標識した血管;緑色、GFPを発現するPbA寄生虫;青色、抗TCRβ抗体で標識したT細胞が示される。T細胞は、微小血管(直径約10μm)の壁に付着し、壁に沿って移動していることが分かった。これらのT細胞によるクロール挙動は、インビボでの抗TCRβまたは抗CD8抗体(これらの抗体は、ナイーブな動物のT細胞に対して影響を有さなかった)標識に因るものではなかった(動画S4(本明細書では示さない)、データ示さず)。それどころか、完全に活性化されたT細胞は、感染後5日目にOLF毛細管内に蓄積し始め、クロールの動きによってその数を大いに増加させた(動画S4(本明細書では示さない))。動画S4では、T細胞が活性化され、嗅球毛細管内をクロールする様子を示す、感染後4〜6日目のナイーブマウスおよびGFP−PbA寄生虫感染マウスの嗅球生体内多光子イメージングが示される。赤色、赤色TRITC−デキストランで標識した血管;緑色、GFPを発現するPbA寄生虫;青色、抗TCRβ抗体で標識したT細胞であるが、これらの動画では、青色チャンネルのみが示される。各動画は約1時間撮影した。青色の円は、血管内で速く流れるT細胞を示し、赤色の円は、減速し、血管内をクロールするT細胞を示す。ナイーブなマウスにおいてT細胞の動きを捉えるのは困難であったが、T細胞数は感染後の日数と共に増加した。その動きはクロール挙動を示す。まとめると、これらのOLFの生体画像は、クロールするCD8 T細胞の数の増加とともに、蓄積したiRBCが、最終的には小さなOLF毛細血管の微小出血によって血管から出ていくにちがいないことを示す。(CD8 T cell traffic through blood vessels in OLF)
Intravascular accumulation of CD8 T cells in the brain has been shown to have an important role in the pathogenesis of ECM (Belnoue, E. et al. (2002). J Immunol 169, 6369-6375 .; Miyakoda, M. et al. (2008). J Immunol 181, 1420-1428.). Therefore, we investigated whether CD8 T cell recruitment could be observed by in vivo MP imaging of OLF and / or could be associated with microhemorrhage after PbA infection. . In vivo imaging of labeled CD8 T cells and GFP-expressing PbA parasites in infected mouse OLF clearly showed that microbleeding occurred in the branching capillaries (FIG. 2D, also confirmed by animation S2 (this specification) Not shown in the book)). In animation S2, a representative 3D image of a mouse infected with a GFP-PbA parasite showing a new microbleeding site in the olfactory bulb capillary was taken. Infected mice were visualized by in vivo multiphoton microscopy for approximately 1 hour on day 6 after infection. Blood vessels labeled with red, red TRITC-dextran; green, PbA parasite expressing GFP; blue, CD8 T cells labeled with anti-CD8α antibody. Some red areas indicate areas that have already bleed that have lost vascular integrity; T cells are crawling through the tissue. Sudden loss of central vascular integrity indicated new bleeding. As seen in movie S2, red dextran labeled capillaries were altered during the development of microbleeds (almost red pigment was released into the tissue). Importantly, CD8 T cells are found to “crawl” back and forth within the blood vessels during ECM development, increasing in number (FIG. 2D, animated S2, S3 and S4 (not shown here) ) Also confirmed), it was found that some of them attached around the bleeding area (moving image S2 (not shown here)). The behavior of CD8 T cells within these OLFs can passively follow the unstable blood flow at the end of ECM, but was constructed by the inventors on the fifth day after infection in relatively large blood vessels (around 10 μm). The 3D video showed clearly that CD8 T cells were attached to the blood vessel and actively crawling along the blood vessel wall (video S3 (not shown here)). Movie 3S shows how T cells crawl along microvessels in the olfactory bulb, and shows a 3D constructed multiphoton movie of the olfactory bulb of a mouse infected with a GFP-PbA parasite 5 days after infection. . Blood vessels labeled with red, red TRITC-dextran; green, PbA parasite expressing GFP; blue, T cells labeled with anti-TCRβ antibody are shown. It was found that T cells attached to the wall of microvessels (diameter about 10 μm) and migrated along the wall. The crawl behavior by these T cells was not due to in vivo anti-TCRβ or anti-CD8 antibody labeling (these antibodies had no effect on naive animal T cells) (video) S4 (not shown here), data not shown). On the contrary, fully activated T cells began to accumulate in the OLF capillaries 5 days after infection and greatly increased their number due to crawl movement (movie S4 (not shown here)). Movie S4 shows in vivo olfactory bulb multiphoton imaging of naive mice and mice infected with GFP-PbA parasites 4-6 days after infection, showing T cells activated and crawling inside the olfactory bulb capillaries. Red, red TRITC-dextran-labeled blood vessels; green, GFP-expressing PbA parasites; blue, anti-TCRβ antibody-labeled T cells, but these videos show only the blue channel. Each video was taken for about 1 hour. Blue circles indicate T cells that flow faster in the blood vessel, and red circles indicate T cells that slow down and crawl within the blood vessel. Although it was difficult to capture T cell movement in naive mice, the number of T cells increased with the number of days after infection. The movement shows crawl behavior. In summary, these OLF bio-images show that with increasing numbers of crawling CD8 T cells, the accumulated iRBC must eventually exit the blood vessel due to micro-bleeding of small OLF capillaries. .
脳内のCD8 T細胞の血管内蓄積は、脳マラリアの発病において重要な役割を有することが示された(Belnoue,E.ら(2002).J Immunol 169,6369−6375.)。それゆえ、本発明者らは、CD8 T細胞の補充が、OLFの生体内MPイメージングによって、観察され得るかどうか、そして/または、PbA感染後の微小出血と関連し得るかどうか、を検討した。感染マウスのOLFにおける標識CD8 T細胞およびGFP発現PbA寄生虫の生体内イメージングは、微小出血が分岐血管において生じていることをはっきりと示した(図2Cおよび動画S2(本明細書では示さない))。重要なことには、CD8 T細胞は、OLF血管内の寄生虫を「追跡する」かのように、血管内を前後に行き来することが分かった(図2Dおよ動画S3(本明細書では示さない))。さらに、構築した3D動画は、CD8 T細胞が、血管に付着し、血管壁に沿ってクロールし得ることを示唆した(動画S4(本明細書では示さない))。まとめると、これらのOLFの生体画像は、OLF内に蓄積した寄生虫が、CD8 T細胞によって追跡され、小さなOLF血管の微小出血によって血管から出ていくことを示す。 Intravascular accumulation of CD8 T cells in the brain has been shown to have an important role in the pathogenesis of cerebral malaria (Belnoue, E. et al. (2002). J Immunol 169, 6369-6375.). Therefore, we investigated whether CD8 T cell recruitment could be observed by in vivo MP imaging of OLF and / or could be associated with microhemorrhage after PbA infection. . In vivo imaging of labeled CD8 T cells and GFP-expressing PbA parasites in the OLF of infected mice clearly showed that microhemorrhages occurred in branch vessels (FIG. 2C and animation S2 (not shown here)) ). Importantly, CD8 T cells were found to traverse back and forth within the blood vessel as if they “followed” parasites within the OLF blood vessels (FIG. 2D and animation S3 (herein Not shown)). In addition, the constructed 3D animation suggested that CD8 T cells can attach to blood vessels and crawl along the vessel wall (animation S4 (not shown here)). In summary, these OLF bioimages show that parasites that have accumulated in the OLF are tracked by CD8 T cells and exit the blood vessel by micro-bleeding of small OLF vessels.
(嗅覚機能は脳マラリア中に破壊されることの確認)
iRBCならびにCD8 T細胞の蓄積が、ECMの間に段階的に生じ、OLF内の微小出血をもたらすという上記の知見を考慮して、本発明者らは、OLFが化学感受性のための複雑な生理学的シナプスを形成する嗅覚神経を含んでいるために、OLFの機能(嗅覚)が影響を受けると仮説を立てた。OLFの機能を評価するために、本発明者らは、単純な「食料埋設試験」を実施した(Yang,M.およびCrawley,J.N.(2009).Curr Protoc Neurosci Chapter 8,Unit 8 24.)。簡単に述べると、マウスを、18時間にわたって食料の無い状態にし、続いて、床敷きを含み、ケージのランダムなコーナーに、表面からおよそ1cm下に食料が埋設された新しいケージに移した。マウスが埋設された食料を見つけるまでの時間を記録した。OLF機能は、食料を見つけるまでの時間の遅延によって決定した場合、BALB/cまたはRag2−/−マウスまたは致死性のPyL寄生虫に感染したマウスのようなECMに対して抵抗性の正常なマウス(図3B)と比較して、早くも感染後4日目には有意に損なわれていた(図3A)。このように、OLF機能の喪失は、OLF内の出血およびBBBの完全性の潜在的な喪失といったECMの顕在化の予測を可能にし得る。(Confirmation that olfactory function is destroyed during brain malaria)
In view of the above findings that iRBC as well as CD8 T cell accumulation occurs in stages during ECM, leading to microbleeds within the OLF, we have found that OLF is a complex physiology for chemosensitivity. It was hypothesized that the function of OLF (olfaction) is affected by the inclusion of olfactory nerves that form a dynamic synapse. To evaluate the function of OLF, we performed a simple “food burying test” (Yang, M. and Crawley, JN (2009). Curr Protoc Neurosci Chapter 8, Unit 824. .). Briefly, mice were left free of food for 18 hours, and then transferred to a new cage with bedding embedded in the random corners of the cage approximately 1 cm below the surface. The time taken for the mouse to find the buried food was recorded. OLF function is normal mice that are resistant to ECM, such as BALB / c or Rag2 − / − mice or mice infected with lethal PyL parasites, as determined by a delay in the time to find food. Compared with (FIG. 3B), it was significantly impaired as early as 4 days after infection (FIG. 3A). Thus, loss of OLF function may allow predictions of ECM manifestation such as bleeding within OLF and potential loss of BBB integrity.
OLF機能の喪失がBBBの完全性の喪失(BBB漏出)と直接相関するかどうかを評価するために、感染後の早い時点(3〜6日目)にマウスにエバンスブルー染料を注射し、脳組織への青色染料の滲出をモニターした。iRBCが血管内で減速し停止したMPイメージングの観察によれば、脳組織への青色染料の滲出は、早くも感染後5日目にOLFから出現し、一方で、脳全体は感染後6〜7日目に青くなった(図3C)。BBBは、密着結合および密着帯−1(ZO−1)のようなタンパク質に起因して拘束性であるので、本発明者らは次に、OLFにおけるZO−1染色がBBB漏出と関係するかどうかを調べた。ZO−1は、嗅上皮、嗅覚ニューロン、ならびに、嗅球僧帽細胞層に局在することが示されている(Miragall,F.ら、(1994).J Comp Neurol 341,433−448.)。感染後6日目に、本発明者らは、GFP発現寄生虫の蓄積(iRBC)と一致した、OLFMCLにおけるZO−1免疫染色の有意な中断を観察し(図3D)、これは、OLFの密着結合におけるZO−1発現の中断が、ECM中のBBBの完全性の喪失と関連し得ることを示唆している。 To assess whether loss of OLF function correlates directly with loss of BBB integrity (BBB leakage), mice were injected with Evans Blue dye at early time points (days 3-6) after infection, The oozing of blue dye into the tissue was monitored. According to the observation of MP imaging in which iRBC slowed down and stopped in blood vessels, blue dye exudation to brain tissue appeared from OLF as early as 5 days after infection, while the whole brain was 6 to 6 after infection. It turned blue on day 7 (FIG. 3C). Since BBB is restrictive due to proteins such as tight junctions and tight band-1 (ZO-1), we next examine whether ZO-1 staining in OLF is associated with BBB leakage I checked. ZO-1 has been shown to localize in the olfactory epithelium, olfactory neurons, and the olfactory bulb mitral cell layer (Miragal, F. et al. (1994). J Comp Neurol 341, 433-448.). On day 6 post-infection, we observed a significant interruption of ZO-1 immunostaining in OLFMCL, consistent with the accumulation of GFP-expressing parasites (iRBC) (FIG. 3D), indicating that OLF It suggests that disruption of ZO-1 expression in tight junctions may be associated with a loss of BBB integrity in the ECM.
(実施例2:脳マラリアとケモカインとの関係)
次に、本実施例では脳マラリアとケモカインとの関係を確認し、CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系と脳マラリアとの関係性を解明した。(Example 2: Relationship between brain malaria and chemokines)
Next, in this example, the relationship between brain malaria and chemokines was confirmed, and the relationship between the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system and brain malaria was elucidated.
(脳マラリア中の高熱およびケモカインストームはOLFの機能不全および物理的ダメージと関連する)
本発明者らは次に、ECMの間のOLF機能不全に寄与する潜在的な因子を探索した。高熱は、BBB機能喪失の促進因子の一つであることが示された(Kiyatkin,E.A.およびSharma,H.S.(2009).Neuroscience 161,926−939.)。高熱がマラリア性昏睡状態の重要な症状であることを考慮し、本発明者らは、サーマルカメラを用いてPbA感染マウスの体温の連続的な測定を可能にする実験システムを開発した。感染マウスの体温の連続的かつ非侵襲性の測定は、高熱の攻撃が、ECM症状の発症の24時間前(PbA感染後5日目付近)に始まり、24時間持続し、その後、熱損により終結し、最終的には次の12〜24時間以内に死に至ることを明らかにした(図3、動画S5(本明細書では示さない))。動画S5では、サーマルモニターカメラによる、感染/非感染マウスの継続的な発熱の記録がなされた。10日間にわたってケージを継続的にモニターした。動は32秒間撮影され、感染後5〜7日目に対応する。非感染のナイーブコントロールマウス(#1、右上、黄色)、感染マウス(#2、左上;#3、右下;#4、左下)。感染マウス#4は、最終的には熱を失って早期に死亡し、カメラから消えている。感染マウス#3は、感染マウス#4が死亡した翌日に死亡した。動画は、少なくとも10匹のマウスで撮影したところほぼ同様の様子を示した。
脳マラリアを発症しない免疫不全マウスであるRag2−/−マウスに感染させると、これらのマウスは、感染の全体を通じて高熱の徴候を示さず、OLFがインタクトであることがMRIによって確認された(図3Fおよび図3I)。さらに、致死性のPyLまたは非致死性のP.yoelii−NLを感染させたマウスは、感染の間に発熱せず(図3Gおよび図5F〜G)、感染後5日目の熱の上昇はPbA特異的であり得ることが示唆された。高熱がBBBの崩壊とその後のOLF機能不全および出血をトリガーし、そして/または、促進する正確な機構は明らかでないが、データは、高熱がECM関連死の24時間前に生じ、OLFが機能不全となり、出血が促進された後のBBB漏出と相関し得ることを示唆する。特筆すべきことは、PbA感染後5日目に、全身血清サイトカインレベル(大部分は炎症促進性サイトカイン)が上昇しており、サイトカインストームが高熱を伴うという考えを裏付けている(図5F〜G)。(High fever and chemokine storms in brain malaria are associated with OLF dysfunction and physical damage)
We next searched for potential factors that contribute to OLF dysfunction during ECM. High fever has been shown to be one of the promoters of BBB loss of function (Kiyatkin, EA and Sharma, HS (2009). Neuroscience 161, 926-939.). Considering that high fever is an important symptom of malarial coma, we developed an experimental system that allows continuous measurement of body temperature in PbA-infected mice using a thermal camera. Continuous and non-invasive measurement of body temperature of infected mice shows that a high fever attack begins 24 hours before the onset of ECM symptoms (near day 5 after PbA infection) and lasts 24 hours, after which heat loss It was revealed that it ended and eventually died within the next 12-24 hours (FIG. 3, animation S5 (not shown here)). In the moving image S5, continuous fever of the infected / non-infected mouse was recorded by the thermal monitor camera. The cage was continuously monitored for 10 days. The motion is filmed for 32 seconds and corresponds to days 5-7 after infection. Uninfected naive control mice (# 1, upper right, yellow), infected mice (# 2, upper left; # 3, lower right; # 4, lower left). Infected mouse # 4 eventually lost heat and died early and disappeared from the camera. Infected mouse # 3 died the day after infected mouse # 4 died. The video showed almost the same when taken with at least 10 mice.
When infected with Rag2 − / − mice, which are immunodeficient mice that do not develop cerebral malaria, these mice show no signs of hyperthermia throughout the infection and OLF is confirmed by MRI (FIG. 3F and FIG. 3I). In addition, lethal PyL or non-lethal P. Mice infected with yoelii-NL did not develop fever during infection (FIGS. 3G and 5F-G), suggesting that the increase in heat 5 days after infection may be PbA specific. Although the exact mechanism by which high fever triggers and / or promotes BBB collapse and subsequent OLF dysfunction and bleeding is not clear, data show that high fever occurs 24 hours before ECM-related death and OLF is And suggests that it may correlate with BBB leakage after bleeding is promoted. Notably, 5 days after PbA infection, systemic serum cytokine levels (mostly pro-inflammatory cytokines) are elevated, supporting the notion that cytokine storms are associated with high fever (FIGS. 5F-G ).
(CCL21は感染の初期段階でOLFにおいて高度に発現される)
本発明者らはさらに、PbA感染の初期段階における嗅覚の喪失と関連し得る要因を調べた。ケモカインは、感染または炎症の初期メディエーターであり、次第に、発熱の発生に貢献するものと認識されている(Machado,R.R.ら(2007).Brain Res 1161,21−31.)。一部のケモカインおよびサイトカインは、ECMの発症において重要な役割を有するので、本発明者らは、OLFにおいて、インターフェロン(IFN)−γ、IP−10(CXCR3リガンド)、MCP−1(CCR2リガンド)、CCL19およびCCL21(CCR7リガンド)を含むいくつかのサイトカイン/ケモカインmRNAの発現レベルを測定した。CCL21およびCCL19のmRNAおよびタンパク質は、OLFにおいて、早くも感染後3日目に高度に発現されており(図4A〜B)、ケモカインリガンド、特にCCL21の早期発現が、脳への免疫細胞の補充に重要であり得ることが示唆された。(CCL21 is highly expressed in OLF at an early stage of infection)
We further investigated factors that may be associated with olfactory loss in the early stages of PbA infection. Chemokines are early mediators of infection or inflammation and are increasingly recognized as contributing to the development of fever (Machado, RR et al. (2007). Brain Res 1161, 21-31.). Because some chemokines and cytokines have an important role in the development of ECM, we have interferon (IFN) -γ, IP-10 (CXCR3 ligand), MCP-1 (CCR2 ligand) in OLF The expression levels of several cytokine / chemokine mRNAs, including CCL19 and CCL21 (CCR7 ligand), were measured. CCL21 and CCL19 mRNA and protein are highly expressed in OLF as early as 3 days after infection (FIGS. 4A-B), and early expression of chemokine ligands, particularly CCL21, recruits immune cells to the brain It was suggested that it may be important.
上記の結果から、本発明者らは、CCR7が、OLFを介して脳内にCCR7発現細胞を補充することによって、ECMの病理に関与するかどうかを調べることにした。本発明者らは、WT(C57BL/6)および同腹仔のCcr7+/−およびCcr7−/−マウスにPbAを感染させ、その生存を追跡した。Ccr7−/−マウスの生存率の有意な増加が生じ、死は最終的には高寄生虫血症によって引き起こされたが、両群間で寄生虫レベルに違いはなかった(図4C、データ示さず)。Ccr7−/−マウスにおけるOLF機能がインタクトであったかどうかを評価するために、食料埋設試験を実施したところ、WTマウスと比較してインタクトなOLF機能が観察された(図4D)。興味深いことに、Ccr7−/−マウスでは、WTマウス(24時間)と比較して、高熱発生の遅延(約48時間)が生じており(図4E)、MRIおよびエバンスブルー染色によって決定した場合、感染後6日目に、OLFにおける出血の徴候はなかった(図5HおよびI)。エバンスブルー染色は、8日目以降のCcr7−/−マウスの脳の約80%において徐々に生じた(図5HおよびI)。これらのデータは、CCR7がECMの発病において役割を有しており、OLF機能不全、微小出血および高熱にも寄与していることを示唆した。From the above results, the present inventors decided to examine whether CCR7 is involved in ECM pathology by recruiting CCR7-expressing cells into the brain via OLF. We infected WT (C57BL / 6) and littermate Ccr7 +/− and Ccr7 − / − mice with PbA and followed their survival. There was a significant increase in survival of Ccr7 − / − mice and death was ultimately caused by hyperparasemia, but there was no difference in parasite levels between the two groups (FIG. 4C, data shown). ) In order to evaluate whether OLF function in Ccr7 − / − mice was intact, a food embedding test was performed, and intact OLF function was observed compared to WT mice (FIG. 4D). Interestingly, Ccr7 − / − mice have a delayed hyperthermia (about 48 hours) compared to WT mice (24 hours) (FIG. 4E), as determined by MRI and Evans blue staining, There were no signs of bleeding in OLF on day 6 after infection (FIGS. 5H and I). Evans blue staining occurred gradually in about 80% of the brains of Ccr7 − / − mice after day 8 (FIGS. 5H and I). These data suggested that CCR7 has a role in the pathogenesis of ECM and also contributes to OLF dysfunction, microhemorrhage and high fever.
(CCR7の発現はCD11c+CD8 T細胞のCD8α DC活性化にとって重要であるが、その脳内への移動にとっては重要ではない)
本発明者らは次に、ECMからのCcr7−/−マウスの生存率の増加を担う基礎的な機構を調べた。CCR7は、DCおよびT細胞のような免疫細胞の二次リンパ系器官への移動において重要なケモカイン受容体であるので、本発明者らは、脳内でのT細胞の補充を調べた。PbA感染後6日目の脳から得た免疫細胞のフローサイトメトリー分析は、脳内のCD8 T細胞蓄積が、WTマウスと比較して、Ccr7−/−マウスにおいて50%減少することを示した(*p<0.05;図5A)。特筆すべきことに、近年の報告は、脳内に補充されたCD8 T細胞の中でも、CD11c+CD8 T細胞が、高度に活性化されており、おそらくはIFN−γおよびグランザイム−Bを産生することによって発病に関与していると示唆した(Tamura,T.ら(2011).Infect Immun 79,3947−3956.)。この報告と一致して、本発明者らは、PbA感染したWTマウスの脳におけるCD8 T細胞の大部分がCD11c+であり、この集団は、Ccr7−/−マウスの感染脳(図5A;**p<0.01および***p<0.001)ならびに脾臓(図5B;**p<0.01)においてパーセンテージおよび数が著しく減少していたが、WTマウスとCcr7−/−マウスの間で、脾臓内のCD8 T細胞のパーセンテージおよび数は同等であったことを見い出した。脾臓におけるCD11c+CD8T細胞の活性化もまた、同じ細胞集団からのIFN−γ分泌の減少を伴って、CCR7の非存在(CD44の発現によって決定)下で損なわれた(図5C〜D)。まとめると、これらのデータは、CCR7が、CD8T細胞のごく特定の部分集団である活性型CD11c+CD8 T細胞のPbA感染脳内への誘導および/または移動に関与し、そして、ECMの発病において重要な役割を有し得ることを示唆し得る。このことを確認するために、本発明者らはさらに、PbA感染中のCcr7−/−マウスの脾臓におけるCD11c+CD8 T細胞のパーセンテージの低下が、脾臓における以前のプライミングにおける欠陥によって引き起こされたかどうかを決定した。CD8α+DCは、CD8 T細胞応答をクロスプライミングし得るので、マウス脳マラリアの発病においてCD8 T細胞を病気に罹りやすくすることが示唆されている(Lundie,R.J.ら(2008).Proc NatlAcad Sci U S A 105,14509−14514.;Piva,L.ら(2012).J Immunol 189,1128−1132.)。このことと一致して、本発明者らは、脾臓内にCD8α DCを持たない塩基性ロイシンジッパー転写因子ATF様−3(Batf3)欠失マウス(Hildner,K.ら(2008).Science 322,1097−1100.)を用いて、PbAに感染させたときに、脾臓における活性型CD11c+CD8 T細胞の数および脳におけるその蓄積は、Batf3+/−コントロールと比較してBatf3−/−マウスにおいて有意に損なわれていた(図6EおよびF)。また、Batf3−/−マウスが生存率の改善を示したことを確認した(図6G)。他方、Ccr7−/−マウスが、WTマウスの脾臓内のものとほぼ同等数のCD8α DCを有したことを考慮し(図6E)、本発明者らは、CD8α DC上の機能的なCCR7発現がCD8 T細胞活性化に必要とされるかどうかを理解するための実験を設計した。(CCR7 expression is important for CD8α DC activation of CD11c + CD8 T cells, but not for its movement into the brain)
We next examined the underlying mechanism responsible for increasing the survival of Ccr7 − / − mice from ECM. Since CCR7 is an important chemokine receptor in the migration of immune cells such as DCs and T cells to secondary lymphoid organs, we examined recruitment of T cells in the brain. Flow cytometric analysis of immune cells obtained from the brain 6 days after PbA infection showed that CD8 T cell accumulation in the brain was reduced by 50% in Ccr7 − / − mice compared to WT mice. ( * P <0.05; FIG. 5A). Notably, recent reports indicate that among CD8 T cells recruited into the brain, CD11c + CD8 T cells are highly activated, presumably producing IFN-γ and granzyme-B. (Tamura, T. et al. (2011). Infect Immun 79, 3947-3956.). Consistent with this report, we found that the majority of CD8 T cells in the brains of WT mice infected with PbA were CD11c + , and this population was infected with Ccr7 − / − mice (FIG. 5A; * WT and Ccr7 − / − mice, although percentages and numbers were significantly reduced in * p <0.01 and *** p <0.001) and spleen (FIG. 5B; ** p <0.01) In between, the percentage and number of CD8 T cells in the spleen were found to be comparable. Activation of CD11c + CD8 T cells in the spleen was also impaired in the absence of CCR7 (determined by CD44 expression), with decreased IFN-γ secretion from the same cell population (FIGS. 5C-D). Taken together, these data indicate that CCR7 is involved in the induction and / or migration of activated CD11c + CD8 T cells, a very specific subpopulation of CD8 T cells, into the PbA-infected brain and in the pathogenesis of ECM It may suggest that it can have an important role. To confirm this, we further determined whether the decrease in the percentage of CD11c + CD8 T cells in the spleen of Ccr7 − / − mice during PbA infection was caused by a defect in previous priming in the spleen. It was determined. Since CD8α + DC can cross-prime the CD8 T cell response, it has been suggested that CD8 T cells are susceptible to disease in the development of mouse brain malaria (Lundie, RJ et al. (2008). Proc. NatlAcad Sci USA 105, 14509-14514 .; Piva, L. et al. (2012). J Immunol 189, 1128-1132.). Consistent with this, we found that mice lacking the basic leucine zipper transcription factor ATF-like-3 (Batf3) without CD8α DC in the spleen (Hildner, K. et al. (2008). Science 322. 1097-1100.), The number of activated CD11c + CD8 T cells in the spleen and their accumulation in the brain when infected with PbA is higher in Batf3 − / − mice compared to Batf3 +/− controls. Significantly impaired (Figures 6E and F). It was also confirmed that Batf3 − / − mice showed improved survival (FIG. 6G). On the other hand, considering that Ccr7 − / − mice had approximately the same number of CD8α DC as in the spleen of WT mice (FIG. 6E), we expressed functional CCR7 expression on CD8α DC. An experiment was designed to understand whether is required for CD8 T cell activation.
(機能的なCCR7は、脾臓におけるCD11c+CD8 T細胞のプライミングに必要とされる)
本発明者らは、インタクトなDCを有するがT/B細胞を有さない感染Rag2−/−マウスからCDR8α DCを精製した(McLellan,A.D.ら(2002).Blood 99,2084−2093.)。Rag2−/−マウスからの脾臓CD8α+DCは、感染後5日目に高レベルのCCR7を発現したが、CD8α−DCはこれを発現しなかった(図6HおよびI)。これらのDCを精製するために、CD8α+DCをまず、CD11b+ビーズを用いてネガティブ選択によって濃縮し、次いで、NK細胞、マクロファージおよび顆粒球を除去し、そして、さらなるCD4+細胞枯渇の後に純粋なCD8α+DC集団を得た(95%超の純度、図6B)。その後、高度に濃縮したCCR7+CD8α+DCを、Ccr7−/−マウスに養子免疫した。濃縮CD8α+DCの養子免疫は、Ccr7−/−マウスにおいて、脳内の活性型CD11c+CD8 T細胞(Ccr7−/−マウス起源のもの)の補充を効率的に復活させ、ECMを加速させた(図5E)。まとめると、これらの知見は、PbA感染中の活性型CD8α+DC上の高レベルでの機能的CCR7発現が、おそらくは、CD11c+CD8T細胞とその膨張を活性化することによって、ECMの発病において重要な役割を有することを示唆する。しかしながら、CD11c+CD8 T細胞上のCCR7発現は、脳内へのこれらの病原性細胞の移動には不必要である。(Functional CCR7 is required for priming CD11c + CD8 T cells in the spleen)
We purified CDR8α DC from infected Rag2 − / − mice with intact DC but no T / B cells (McLellan, AD et al. (2002). Blood 99, 2084-2093). .). Rag2 - / - spleen CD8a + DC from mice, but expressed high levels of CCR7 5 days after infection, CD8a - DC did not express it (Figure 6H and I). To purify these DCs, CD8α + DCs are first enriched by negative selection with CD11b + beads, then NK cells, macrophages and granulocytes are removed and purified after further CD4 + cell depletion Obtained a CD8α + DC population ( > 95% purity, FIG. 6B). Subsequently, Ccr7 − / − mice were adoptively immunized with highly concentrated CCR7 + CD8α + DC. Adoptive concentration CD8a + DC is, CCR7 - / - in mouse, activated CD11c + CD8 T cells in the brain (CCR7 - / - of mouse origin) supplemented efficiently revive the accelerated the ECM (FIG. 5E). Taken together, these findings are important in the pathogenesis of ECM, where high-level functional CCR7 expression on activated CD8α + DC during PbA infection presumably activates CD11c + CD8 T cells and their expansion. It suggests having a role. However, CCR7 expression on CD11c + CD8 T cells is unnecessary for the migration of these pathogenic cells into the brain.
(OLF内で発現されるCCL21は、星状細胞の活性化と一致しており、CD11c+CD8 T細胞のOLF内への移動にとって重要であり得る)
CCR7がCD11c+CD8 T細胞のOLF内への移動に不必要であるとの知見は、CD8 T細胞のプライミング中のCCL21の重要性を意味している。しかしながら、CCL21の発現もまた、3日目から最終段階までPbA感染したOLFにおいて観察されたので、本発明者らはさらに、CCL21が、CCR7以外の代替的なケモカイン受容体相互作用を介してOLF内へのCD8T細胞の補充に関してさらなる役割を有し得るという仮説を立てた。CXCR3が、特に小膠細胞および星状細胞においてCCL21の代替的ケモカイン受容体となり得ること(Rappert,A.ら、(2002).J Immunol 168,3221−3226.;vanWeering,H.R.ら(2010).Brain Behav Immun 24,768−775.)、そして、CD8 T細胞の脳内への移動を担う重要なケモカイン受容体であること(Campanella,G.S.ら(2008).ProcNatl Acad Sci U S A 105,4814−4819.;Hansen,D.S.ら(2007).J Immunol 178,5779−5788.;Van denSteen,P.E.ら(2008).Eur J Immunol 38,1082−1095.)を考慮し、本発明者らはさらに、感染したOLFにおけるCCL21の局在性および/または供給源を分析した。OLF内でCCL21を発現する細胞型を扱うことは困難であったが、CCL21染色は、星状細胞がしばしば同時局在化する炎症を起こした血管の内皮に限定されていた(図6A)。星状細胞は、そのエンドフィートを介して血管の変化を監視し、感知する特殊化された細胞であり、ECMの間には、網膜におけるその再分配が関係付けられている(Medana,I.M.ら、(1996).Glia 16,51−64.)。感染後6日目には、OLFにおける星状細胞の形態変化(例えば、不十分な分布、厚くより長い突起)が明らかとなり、星状細胞とPECAM染色との相互関係は、大きく乱されていた(図6B)。興味深いことに、特にその線維様構造によるCCL21染色は、OLF内のCD8 T細胞と密接に相互関係していた(図は示さず、この省略した図ではCD8 T細胞がOLF内のCCL21と関連する様子が示される。感染後6日目の、PbA感染したWTマウスからのOLF切片を、抗CCL21(緑色)および抗CD8(赤色)抗体で染色した。核をDAPI(青色)により可視化した。スケールバーは10μmである。)矢印はCD8T細胞と相互作用するCCL21の線維様構造を示す。CCL21とCXCR3発現CD11c+CD8 T細胞との間に化学走性相互作用が存在するかどうかを検討するために、本発明者らは次に、インビトロトランスウェル移動アッセイを行った。その結果に見られるように、CXCR3+CD11c+CD8 T細胞はCCL21に向かって用量依存性に移動したが、この移動は、抗CCL21抗体によって特異的にブロックされ(図は省略する)、CCL21が、ECMの間にCXCR3にとっての代替的ケモカインリガンドとして機能し得ることを示唆する。省略した図では、増加する濃度(0、0.1、1および2μg/ml)のCCL21に応じた、感染したWTマウスからの精製脾臓CD11c+CXCR3+CD8 T細胞の移動を示される。ポジティブコントロールとしてヒトSDF1−α(80ng/ml)を使用し、(E)CCL21(1μg/ml)および/または抗CCL21抗体(1および5μg/ml)に対する応答を検討した。移動した細胞を三連のウェルから回収し、フローサイトメーターでカウントし、そして、ケモカイン誘導性の移動を、非刺激のコントロール(灰色の点線)に対して標準化し、非刺激コントロールの移動に対する割合(%)として示し、抗CCL21抗体によって特異的にブロックされることが示された。(CCL21 expressed in OLF is consistent with astrocyte activation and may be important for migration of CD11c + CD8 T cells into OLF)
The finding that CCR7 is not required for migration of CD11c + CD8 T cells into the OLF implies the importance of CCL21 during priming of CD8 T cells. However, since CCL21 expression was also observed in PbA-infected OLF from day 3 to the final stage, we further observed that CCL21 is OLF via alternative chemokine receptor interactions other than CCR7. It was hypothesized that it could have an additional role in recruiting CD8 T cells into it. CXCR3 can be an alternative chemokine receptor for CCL21, particularly in microglia and astrocytes (Rappert, A. et al. (2002). J Immunol 168, 3221-3226 .; vanWeering, HR et al. ( 2010) .Brain Behav Immun 24,768-775.) And an important chemokine receptor responsible for migration of CD8 T cells into the brain (Campanella, GS et al. (2008). ProcNatl Acad Sci. U S A 105,4814-4819 .; Hansen, DS et al. (2007) .J Immunol 178, 5779-5788.; Van denSteen, PE et al. (2008) .Eur J Immunol 38, 1082-1095. .) Taking into, the present inventors have further analyzed the localization and / or source of CCL21 in infected OLF. Although it was difficult to handle cell types that express CCL21 within OLF, CCL21 staining was limited to inflamed endothelium where astrocytes often co-localize (FIG. 6A). Astrocytes are specialized cells that monitor and sense vascular changes through their end feet, and their redistribution in the retina is associated with ECM (Medana, I. et al. M. et al., (1996). Glia 16, 51-64.). Six days after infection, morphological changes of astrocytes in OLF (eg, poor distribution, thicker and longer protrusions) became apparent, and the correlation between astrocytes and PECAM staining was greatly disturbed (FIG. 6B). Interestingly, CCL21 staining, particularly by its fibrous-like structure, was closely correlated with CD8 T cells in OLF (not shown, in this omitted figure, CD8 T cells are associated with CCL21 in OLF) OLF sections from PbA infected WT mice, 6 days post infection, were stained with anti-CCL21 (green) and anti-CD8 (red) antibodies, nuclei were visualized with DAPI (blue). Bars are 10 μm.) Arrows indicate CCL21 fibrillar structures that interact with CD8 T cells. To investigate whether there is a chemotactic interaction between CCL21 and CXCR3-expressing CD11c + CD8 T cells, we next performed an in vitro transwell migration assay. As can be seen in the results, CXCR3 + CD11c + CD8 T cells migrated in a dose-dependent manner toward CCL21, but this migration was specifically blocked by anti-CCL21 antibody (the figure is omitted). , Suggesting that it may function as an alternative chemokine ligand for CXCR3 during ECM. In the omitted figure, migration of purified splenic CD11c + CXCR3 + CD8 T cells from infected WT mice in response to increasing concentrations (0, 0.1, 1 and 2 μg / ml) of CCL21 is shown. Human SDF1-α (80 ng / ml) was used as a positive control, and the response to (E) CCL21 (1 μg / ml) and / or anti-CCL21 antibody (1 and 5 μg / ml) was examined. Migrated cells are collected from triplicate wells, counted in a flow cytometer, and chemokine-induced migration is normalized to unstimulated control (gray dotted line), as a percentage of unstimulated control migration (%) And was shown to be specifically blocked by anti-CCL21 antibody.
(実施例3:脳マラリアの予防及び治療)
次に、CCL21−CXCR3−CCR7シグナル伝達系をブロックすることで、脳マラリアが予防および治療することができるのではないかと考え、その例として抗体を用いた実験を行った。(Example 3: Prevention and treatment of cerebral malaria)
Next, it was thought that cerebral malaria could be prevented and treated by blocking the CCL21-CXCR3-CCR7 signaling system, and an experiment using an antibody was conducted as an example.
(CCL21−CCR7−CXCR3軸のブロックはECM治療のための新規ストラテジーである)
CCL21−CCR7−CXCR3軸がCD8α DC−CD8 T細胞媒介性のECM免疫病理において重要な役割を有することを考慮し、本発明者らは、CCL21がECMの治療のための治療標的として利用されうるかどうかを評価した。感染の最初の3日間の、抗CCL21抗体でのOPbA感染マウスのインビボ処置は、アイソタイプコントロールで処置したマウスと比較して、マウスにおける有意に良好な生存につながった(図6F、**p<0.01)。しかしながら、感染後4日目の抗CCL21抗体処置は、ECMの進行に対して顕著な効果を有さず(データ示さず)、ECMの後期段階の間のCCL21の関与が、他のエフェクター機構の活性化によって損なわれ得ることが示唆された。それゆえ、本発明者らは、CCR21とCXCR3の標的化の組み合わせを行った。概念実証として、感染後4日目および5日目における準最適用量の抗体(100μg)によるCXCR3のブロッキングは、WTの対応マウスと比較して、Ccr7−/−マウスにおいてECMからの有意な生存をもたらした(図6D)。同様に、嗅覚を喪失した日(感染後4日目)の抗CXCR3+CCL21抗体混合物による組み合わせ抗体治療は、抗CXCR3抗体単独治療よりも良好なECMからの生存をもたらした(図は示さず)。これらのデータは、ケモカインの組み合わせブロッキングがECMからの脱出を導き得る新規治療ストラテジーとして活用され得ることを示唆した。省略した図では、組み合わせ抗ケモカイン抗体治療の生存曲線を示が示される。抗CXCR3および抗CCL21抗体の混合物を、嗅覚の喪失が始まった感染後4日目に注射した。抗CCL21抗体注射は5日目にも繰り返した。Log−rank(Mantel−Cox)検定により、コントロール 対 抗CXCR3抗体群、そして、コントロール 対 組合せ治療群で*p<0.05(各群n=5)。その結果、抗CXCR3抗体単独治療よりも良好なECMからの生存をもたらしたことが示された。(CCL21-CCR7-CXCR3 axis block is a new strategy for ECM treatment)
Given that the CCL21-CCR7-CXCR3 axis has an important role in CD8α DC-CD8 T cell-mediated ECM immunopathology, we could use CCL21 as a therapeutic target for the treatment of ECM I evaluated it. In vivo treatment of OPbA infected mice with anti-CCL21 antibody during the first 3 days of infection led to significantly better survival in mice compared to mice treated with isotype control (FIG. 6F, ** p < 0.01). However, anti-CCL21 antibody treatment on day 4 after infection had no significant effect on the progression of ECM (data not shown), and involvement of CCL21 during the late phase of ECM is related to other effector mechanisms. It was suggested that it can be impaired by activation. Therefore, we performed a targeted combination of CCR21 and CXCR3. As a proof of concept, blocking CXCR3 with suboptimal doses of antibody (100 μg) on days 4 and 5 post infection resulted in significant survival from ECM in Ccr7 − / − mice compared to WT matched mice. (Fig. 6D). Similarly, combination antibody treatment with anti-CXCR3 + CCL21 antibody mixture on the day of loss of olfaction (day 4 after infection) resulted in better survival from ECM than anti-CXCR3 antibody alone treatment (not shown). These data suggested that combined blocking of chemokines could be exploited as a novel therapeutic strategy that could lead to escape from ECM. In the abbreviated figure, the survival curve of combined anti-chemokine antibody treatment is shown. A mixture of anti-CXCR3 and anti-CCL21 antibodies was injected 4 days after infection when olfactory loss began. Anti-CCL21 antibody injection was repeated on day 5. * P <0.05 in control vs. anti-CXCR3 antibody group and control vs. combination treatment group by Log-rank (Mantel-Cox) test (each group n = 5). The results showed that it resulted in better survival from ECM than anti-CXCR3 antibody monotherapy.
(実施例4:霊長類での確認:脳マラリアと嗅球の関係性)
次に、本実施例では、脳マラリアと嗅球の関係性に関する実験を霊長類で行う。(Example 4: Confirmation with primates: relationship between brain malaria and olfactory bulb)
Next, in this example, an experiment on the relationship between cerebral malaria and the olfactory bulb is performed with primates.
(嗅球は脳マラリアのサルモデルにおいて標的化される)
本発明者らは最後に、我々の知見が非ヒト霊長類のOLFのMRIを行うことによって、ヒトにも応用可能であるかどうかを検討する。ニホンザル(Macaca fuscata)のP.coatneyi感染は、脳マラリアの霊長類モデルである(Kawai,S.およびSugiyama,M.(2010).Acta Trop 114,152−156.)。P.coatneyi感染した赤血球のi.v.接種後、サルを毎日追跡し、血液スメアから寄生虫血症レベルをカウントする。寄生虫血症レベルが低く、おそらくは毛細血管内に隔離されており、サルが典型的な症状を示し、昏睡状態となった終わりに、検死解剖を行う。頭蓋を摘出した後、頭部を4% パラホルムアルデヒド中で固定し、7T MRIを用いて全頭部のイメージングを行う。7TMRIは、OLF内でいくつかの疑わしい出血スポットを検出すること、および脳の他の部分には出血の徴候を確認することができる。出血スポットの存在を確認するために、OLFを取り出し、11.7T MRIによるイメージングを行う。超高磁場イメージングは、マウスと同様に、P.coatneyi感染後のサルのOLF内で出血が生じることを確認することができる。これに対して、ナイーブなサル、ならびに、重篤なマラリアモデルであるが脳マラリアではないP.knowlesii感染サルからのOLFでは低密度な領域は存在しないことを確認することが出来る(White,N.J.(2008).Clin Infect Dis 46,172−173.)。(The olfactory bulb is targeted in a monkey model of brain malaria)
We finally examine whether our findings can be applied to humans by performing MRI of non-human primate OLF. P. of Japanese macaque (Macaca fuscata) Coatneyi infection is a primate model of brain malaria (Kawai, S. and Sugiyama, M. (2010). Acta Trop 114, 152-156.). P. Coatneyi infected red blood cells i. v. Following inoculation, monkeys are tracked daily and parasitemia levels are counted from blood smears. At low levels of parasitemia, possibly isolated in capillaries, the autopsy is performed at the end of the monkey showing typical symptoms and coma. After removing the skull, the head is fixed in 4% paraformaldehyde and the whole head is imaged using 7T MRI. 7TMRI can detect some suspicious bleeding spots in the OLF and check for signs of bleeding in other parts of the brain. In order to confirm the presence of a bleeding spot, the OLF is taken out and imaged by 11.7T MRI. Ultra-high magnetic field imaging is similar to that used for mice. It can be confirmed that bleeding occurs in the monkey OLF after infection with coatneyi. In contrast, naïve monkeys and P. aerial malaria model but not brain malaria. It can be confirmed that there is no low density region in OLF from knowlesii-infected monkeys (White, NJ (2008). Clin Infect Dis 46, 172-173.).
予備的な実験結果では、サルでもマウスと同様の結果が出ていることが確認されている。 Preliminary experimental results confirm that monkeys have similar results to mice.
(考察)
脳は、BBBの破壊、血管漏出、免疫細胞の蓄積(特に、CD8 T細胞の浸潤)といった多数の病理学的事象に起因してECM中に重度に機能不全となるが、脳が破壊される正確な位置はあまり理解されていない。本研究において、本発明者らは、マウスおよび非ヒト霊長類の両方において、OLF領域がECM中の血管漏出の攻撃を受けやすい場所であることを同定したが、この発見は、超高磁場MRIを、MP生体イメージング顕微鏡と組み合わせて用いることによってのみ可能となり得た。本発明者らはさらに、ECMにおいて昏睡状態の開始前に、初期の症状である嗅覚の喪失が存在することを同定した。1日でも早いマラリア性昏睡の検出が治療の成功率を劇的に増大させ得ることを考慮すると、マラリア感染中のこの以前には気付かれていなかった真に見過ごされていた位置と、嗅覚の喪失の検出は、ECMの早期の安価でかつ容易な診断を提供し得、昏睡状態とその後の状態が確立する前の早期治療を可能にし得る。OLFを介したECMの病理の基礎的機構の探求において、本発明者らは、OLFの星状細胞から分泌されたCCL21が、CXCR3ケモカイン軸を利用することにより、病理学的なCD11c+CD8 T細胞の脳内への補充において役割を有し得ることを見い出した(図7)。本発明者らはさらに、この新たな理解を、ECMの初期症状である嗅覚の喪失が顕らかとなった時点で、抗体の組み合わせによりケモカイン−受容体相互作用をブロックすることによる新規治療ストラテジーへと発展させた。(Discussion)
The brain is severely dysfunctional during ECM due to numerous pathological events such as BBB destruction, vascular leakage, immune cell accumulation (especially CD8 T cell infiltration), but the brain is destroyed The exact location is not well understood. In this study, we have identified that the OLF region is susceptible to attack of vascular leakage in the ECM in both mice and non-human primates, but this discovery Could only be possible by using in combination with an MP bioimaging microscope. We further identified the presence of an early olfactory loss in the ECM prior to the onset of coma. Given that detection of malarial coma as early as a day can dramatically increase the success rate of treatment, the previously undetected location of malaria infection that was not previously noticed and the olfactory status Loss detection may provide an early, inexpensive and easy diagnosis of ECM and may allow early treatment before coma and subsequent conditions are established. In exploring the basic mechanism of pathology of ECM via OLF, the present inventors found that CCL21 secreted from OLF astrocytes utilizes pathological CD11c + CD8 T by utilizing the CXCR3 chemokine axis. It has been found that it may have a role in the recruitment of cells into the brain (FIG. 7). We further move this new understanding to a novel therapeutic strategy by blocking chemokine-receptor interactions with antibody combinations when the loss of olfactory, an early symptom of ECM, becomes apparent. And developed.
興味深い疑問は、何故OLFがPlasmodium寄生虫によって影響を受ける最初の場所なのか、ということである。OLFは、様々な方向(放射状および接線方向)を向いた高密度の毛細血管から構成され(図2A〜BおよびムービーS1)、このような構造は、血管を取り囲む星状細胞の細いエンドフィートとの密着結合のネットワークを呈し、BBBの「ガーディアン」を形作っている。これが血液と神経組織との間の物質の流れを制限するが、これはおそらく、密着結合が星状細胞間で情報を伝達する能力を介するものであり得る(Bailey,M.S.およびShipley,M.T.(1993).J Comp Neurol 328,501−526.;Chen,Y.ら、(2013).J Biomed Opt 18,126012.;Whitman,M.C.ら(2009).J Comp Neurol 516,94−104.)。本研究において、OLFの神経層(ONL)、糸球層(GL)周囲の血管足場、ならびに、僧帽細胞層(MCL)程度の深さが、PbA感染赤血球または寄生虫に関連した免疫学的事象による標的とされた。現在、本発明者らは、どの寄生虫または関連する因子がこのことに貢献し得るかを理解していないが、ECMの間に、OLF内の密着結合ネットワーク(ZO−1)が標的とされ、おそらくは破壊されていた可能性がある。末梢の寄生虫負荷量が非常に少ない場合でも、感染後3日目には、GLおよびMCLにおいて豊富な血管周囲の星状細胞エンドフィートが血管の変化を感知する可能性がある(Bailey,M.S.およびShipley,M.T.(1993).J Comp Neurol 328,501−526.;De Saint Jan,D.およびWestbrook,G.L.(2005).J Neurosci 25,2917−2924.;Petzold,G.C.ら、(2008).Neuron 58,897−910.)。ECM発病の際にも、毛細管細静脈および/または細動脈後の脳において同様の事象が報告された(Cabrales,P.ら、(2010).Am J Pathol 176,1306−1315.;Nacer,A.ら、(2012).PLoS Pathog 8,e1002982.)が、ECM発病の際に異なる解剖学的構造に異なる役割が存在するかどうかについては、さらなる検討が必要である。 An interesting question is why OLF is the first place to be affected by Plasmodium parasites. The OLF is composed of dense capillaries that are oriented in various directions (radial and tangential directions) (FIGS. 2A-B and movie S1), such a structure comprising a thin end foot of stellate cells surrounding the blood vessel. Presents a network of tight junctions and forms the “guardian” of the BBB. This restricts the flow of substances between blood and nervous tissue, which may probably be through the ability of tight junctions to transmit information between astrocytes (Bailey, MS and Shipley, M. T. (1993) J Comp Neurol 328, 501-526.; Chen, Y. et al. (2013) .J Biomed Opt 18,126012.; Whitman, MC et al. (2009) .J Comp Neurol. 516, 94-104.). In this study, the depth of the OLF nerve layer (ONL), vascular scaffolding around the glomerular layer (GL), and mitral cell layer (MCL) is immunologically related to PbA-infected erythrocytes or parasites. Targeted by the event. Currently, we do not understand which parasites or related factors can contribute to this, but during ECM, the tight junction network (ZO-1) within the OLF is targeted. , Maybe it was destroyed. Even at very low peripheral parasite loads, 3 days post-infection, abundant perivascular astrocyte endofetes in GL and MCL may sense vascular changes (Bailey, M S. and Shipley, MT (1993) J Comp Neurol 328, 501-526. De Saint Jan, D. and Westbrook, GL (2005) J Neurosci 25, 2917-2924. Petzold, GC et al. (2008) Neuron 58, 897-910.). Similar events were reported in the brain after capillary venules and / or arterioles during ECM pathogenesis (Cabrales, P. et al. (2010). Am J Pathol 176, 1306-1315 .; Nacer, A. (2012). PLoS Pathog 8, e1002982.) Needs to be further investigated as to whether different roles exist in different anatomical structures during ECM pathogenesis.
OLFは、OLFの神経投射、特に、化学感受性の動的な位置として知られる。OLF神経は、鼻粘膜から始まり、篩板を経由して嗅球で終わる。リンパ管や血管がこれらの神経を取り囲み、これらの管を通じて、分子、細胞、そして病原体さえもが、脳の実質へのアクセスを獲得し得る(Danielyan,L.ら(2009).Eur J CellBiol 88,315−324.)。近年の研究は、神経細胞が、中枢神経系(CNS)から神経を介して、脳血管に沿ってOLFに向かって移動することを明らかにしており(Bovetti,S.ら(2007).J Neurosci 27,5976−5980.)、OLFが外的環境とCNSとの間の動的な細胞移動の出入口となり得ることを示唆している。それゆえ、神経変性疾患であるアルツハイマー病やパーキンソン病、そして、全身性エリテマトーデス(SLE)のような自己免疫疾患を罹患する患者が、初期症状としてOLFの機能不全を経験するのは合理的である(Mesholam,R.I.ら(1998).ArchNeurol 55,84−90.;Perricone,C.ら(2012).Smell and Autoimmunity:A Comprehensive Review.Clin Rev Allergy Immunol.(2012年12月13日オンライン版公開,doi:10.1007/s12016−012−8343−x);Talamo,B.R.ら(1989).Nature 337,736−739.)。同様に、本発明者らの知見は、iRBCが血管の内部を移動したとしても、これらの密集した様々な方向に構造化された毛細血管が、Plasmodium寄生虫の付着/閉塞に適した環境ともなり、これらの連続した事象が、嗅覚の喪失の理由となり得ることを意味している。 OLF is known as the OLF neuronal projection, particularly the dynamic location of chemosensitivity. The OLF nerve begins with the nasal mucosa and ends with the olfactory bulb via the sieve plate. Lymphatic vessels and blood vessels surround these nerves, through which molecules, cells, and even pathogens can gain access to the brain parenchyma (Danielyan, L. et al. (2009). Eur J CellBiol 88 , 315-324.). Recent studies have revealed that neurons migrate from the central nervous system (CNS), via nerves, and along the cerebral blood vessels toward OLF (Bovetti, S. et al. (2007). J Neurosci. 27, 5976-5980.), Suggesting that OLF may be the gateway for dynamic cell migration between the external environment and the CNS. Therefore, it is reasonable for patients suffering from neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease, and autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus (SLE) to experience OLF dysfunction as an initial symptom. (Mesholam, RI et al. (1998). ArchNeurol 55, 84-90 .; Perricone, C. et al. (2012). Smell and Autoimmunity: A Comprehensive Review. Clin Rev Alliance Immunol. Edition published, doi: 10.1007 / s12016-012-8343-x); Talamo, BR et al. (1989). Nature 337, 736-739.). Similarly, the present inventors have found that even if iRBC moves inside the blood vessel, these densely structured capillaries are not suitable for the attachment / occlusion of Plasmodium parasites. It means that these consecutive events can be the reason for the loss of olfaction.
本研究は、OLFからのBBB開口に先行して関与し得る因子を同定した。BBB漏出に関与する因子の一つは、高熱であり得る。マウス敗血症モデルと同様に、マウスマラリアモデルにおいて体温調節が存在するはずであると推測されるが、現在、マウスマラリアにおいてる熱から起こる反応は報告されていない(Lamb,T.J.ら(2006).Expert RevMol Med 8,1−22.)。さらに、マウスの脳マラリアは、ヒトの感染とは対照的に、低体温症を引き起こすと考えられる(Grau,G.E.ら(1991).Eur J Immunol21,2265−2267.)。サーマルカメラを用いることによって、最近開発された新しいが比較的単純な技術(AoshiおよびIshii、論文投稿準備中、特開2012−231725参照)が、熱損や死といった、疾患の最終的な顕在化の24時間前に、別の発熱期間が生じることを検出した。重要なことに、この発熱期間は、重篤な嗅覚の喪失と相関していた。マウスのサーカディアンリズムが、単一時点における正確な発熱の測定を妨げることを考慮すると、以前の研究が、疾患の最終段階における最終的な熱損しか測定できなかったことは驚くべきことではない。本発明者らは、全身性および局所性のサイトカインおよびケモカインストームが、ヒトの脳マラリアの場合と同様に、マウスにおいて高熱の攻撃を引き起こし得、そしておそらくは、BBBの完全性の喪失において主要な役割を有したと結論付けた。重要なことに、Rag2−/−マウスならびに非致死性および致死性のPy感染において高熱が存在しないことは、発熱がECMに関連しており、脳マラリアの間のBBB漏出に関連し得るという本発明者らの知見を確認し得る。しかしながら、ECMの間に発熱を引き起こすメディエーターとそのBBB破壊に対する直接的な役割は、現在未知のままである。発熱の機構とそのサイトカイン血症との関連性の科学的な理解は、LPSのような大部分は細菌性の生成物と、発熱がサイトカインIL−1βおよびTNFαとよく相関することが知られるLPSチャレンジモデルとを用いてしか行われていない(Netea,M.G.ら、(2000).Clin Infect Dis 31 Supp15,S178−184.)。これに対し、これらとまったく同じサイトカインが上昇し、マラリア性の発熱を引き起こすマウスマラリアにおいて入手可能な明確な情報および直接的な相関性は存在しない。明らかに、この領域にはさらなる検討が必要である。This study identified factors that may be involved prior to BBB opening from OLF. One of the factors involved in BBB leakage can be high fever. As with the mouse sepsis model, it is speculated that thermoregulation should be present in the mouse malaria model, but currently no reaction resulting from fever in mouse malaria has been reported (Lamb, TJ et al. (2006). ) Expert RevMol Med 8, 1-22.). Furthermore, mouse brain malaria is thought to cause hypothermia, as opposed to human infection (Grau, GE et al. (1991). Eur J Immunol 21, 2265-2267.). By using a thermal camera, a recently developed but relatively simple technology (Aoshi and Ishii, in preparation for paper submission, see JP2012-231725) is the final manifestation of diseases such as heat loss and death. It was detected that another exothermic period occurred 24 hours before. Importantly, this fever period correlated with severe olfactory loss. Given that the circadian rhythm of mice precludes accurate measurement of fever at a single time point, it is not surprising that previous studies were only able to measure the final heat loss at the final stage of the disease. The inventors have shown that systemic and local cytokines and chemokine storms can cause high fever attacks in mice as well as in human brain malaria, and perhaps play a major role in the loss of BBB integrity It was concluded that Importantly, the absence of hyperthermia in Rag2 − / − mice and non-lethal and lethal Py infections suggests that fever is associated with ECM and may be associated with BBB leakage during brain malaria. The inventors' knowledge can be confirmed. However, the mediators that cause fever during ECM and its direct role in BBB disruption remain currently unknown. Scientific understanding of the mechanism of fever and its relevance to cytokineemia suggests that LPS is known to correlate well with mostly bacterial products such as LPS and fever with cytokines IL-1β and TNFα. (Netea, MG et al., (2000). Clin Infect Dis 31 Supp15, S178-184.). In contrast, there is no clear information and direct correlation available in mouse malaria that raises exactly the same cytokines and causes malarial fever. Clearly this area needs further consideration.
星状細胞は、血流の調節とBBBの維持に必須の一般的なCNS駐在細胞である。星状細胞はまた、生理学的状態および病理学的状態の間に広範な種々のケモカインを発現することによって、CNSの免疫防御においても重要な働きを有する(de Haas,A.H.ら(2007).MolNeurobiol 36,137−151.;Medana,I.M.ら、(1996).Glia 16,51−64.)。さらに、星状細胞は、CNS損傷および感染に応答してCCL21発現を増加させる(Lalor,S.J.およびSegal,B.M.(2010).J Neuroimmunol 224,56−61.;Noor,S.ら(2010).Infect Immun 78,2257−2263.)。OLF、特に、非常に多数の星状細胞が存在するGLにおけるCCL21発現の勾配が増加していることから、本発明者らは、Ccr7欠失マウスを検討することにした。なぜならば、CCR7は、そのリガンドであるCCL19およびCCL21との相互作用を介して、CNSの免疫監視のためのリンパ球の往来を調節しているからである(Noor,S.およびWilson,E.H.(2012).J Neuroinflammation 9,77.)。加えて、これまでの研究が、CCR1、CCR2、CCR5、CCR7、CCR8、CXCR3およびCXCR1のようなケモカイン受容体が、脳内への細胞の移動にとって重要であり得ること(Miu,J.ら(2008).J Immunol 180,1217−1230.)、そして、ケモカイン/ケモカイン受容体を欠失するマウスにおいて、CCR1およびCCR2がECMの発病に不必要であったのに対し、CCR5とCXCR3は、脳マラリアの最中に脳内へのCD8T細胞の移動を増強したこと(Belnoue,E.ら(2003).Infect Immun71,3648−3651.;Belnoue,E.ら(2003).Blood 101,4253−4259.;Hansen,D.S.(2012).PLoS Pathog 8,e1003045.;Miu,J.ら(2008).J Immunol 180,1217−1230.)を報告している。抗ウイルス性のエフェクターおよびメモリーCTL応答の誘導および維持におけるCCR7の役割は、Ccr7−/−マウスにおいて徹底的に検討されているが(Junt,T.ら(2004).J Immunol 173,6684−6693.)、ECMなどの重篤なマラリアモデルにおけるCCR7の役割はこれまでに検討されていなかった。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス感染モデルにおいて、CCR7は、抗ウイルス性のエフェクターおよびメモリーCTLの移動および増殖の協調にとって重要であった(Junt,T.ら(2004).J Immunol 173,6684−6693.)。同様に、本発明者らは、CD11cを発現するエフェクターCD8 T細胞の増殖および移動が、CCR7の非存在下において、脾臓ならびに脳でひどく損なわれていることを見い出した。しかしながら、Rag2−/−マウスからのCD8α DCを用いた本発明者らの詳細な分析からは、CD11c+CD8 T細胞の増殖が、脾臓におけるCD8α DCからの抗原性刺激を必要とし、CCR7の存在お必要としたと結論付けるに至った。CD8α DCは、抗原、特に、死細胞からの抗原をT細胞に対してクロスプレゼンテーションし得ることが示唆された(Shortman,K.およびHeath,W.R.(2010).Immunol Rev 234,18−31.)。他方で、Batf3−/−マウスが部分的(約50%)にしかECMから逃れることができないことを考慮すると、ECMの間に、BATF3、BATFおよびBATF2の組み合わさった作用の結果としてDC発症におけるBATFファミリーのメンバー間で代償が生じるのか、あるいは、他のDCタイプの間で代償が生じるのかについては、さらなる検討が必要である(Edelson,B.T.ら、(2011).Immunity 35,236−248.;Murphy,T.L.ら、(2013).Nat Rev Immunol 13,499−509.)。それにもかかわらず、これらの結果は、PbA感染中のCD8 T細胞のCD8α DCクロスプライミングが、エフェクターCD11c+CD8 T細胞の増殖を誘導するCCR7を必要とし、これらのCD11c+CD8 T細胞がOLFを介して脳内に移動し、最終的にはECMを引き起こすことを示した。しかしながら、活性化されたCD11c+CD8 T細胞は、エフェクター期に、IP−10およびCXCR3のようないくつかのケモカインおよびケモカイン受容体を含む複数の分子を介して脳に移動する。CCL21がCD11c+CD8 T細胞のプライミングに関与していることは明らかであるが、感染後3日目という感染早期のOLFにおけるCCL21の存在は、T細胞の移動についての化学走性の裏付けとのその関連性を意味した。本発明者らの仮説の裏付けとして、CXCR3は、特に星状細胞および小膠細胞において、CCL21の代替的ケモカイン受容体として認識されている(van Weering,H.R.ら(2010).BrainBehav Immun 24,768−775.)。さらに、CCL21が、トキソプラズマ感染後に脳において急速に増加し、T細胞の移動を裏付けることが示されている(Wilson,E.H.ら(2009).Immunity 30,300−311.)。それゆえ、CXCR3+CD8 T細胞もまた、CCL21が関与する同様の機構によってOLFに移動し得る可能性がある。本発明者らによるインビトロのトランスウェル移動アッセイは、これらの仮説を裏付けるが、OLF機能不全の発症時(4日目)における抗CCL21抗体治療の効果が限られていることから、インビボでECMのエフェクター期に病理を引き起こす他の機構による代償が示唆され得る。とはいえ、本発明者らは、本明細書において、CCL21のブロッキング、抗CCL21治療、ならびに、CCR7−CCL21軸およびCXCR3−CCL21軸の妨害の組み合わせという新たな治療アプローチは、ECM処置のための新規ストラテジーとして開発され得るという「概念実証」を示す。嗅覚の喪失が、ECM症状の新たな早期診断マーカーとなり得、PbA感染後早くも4日目には、マウスの治療を可能にし得ることは特筆すべきである。Astrocytes are common CNS resident cells essential for blood flow regulation and BBB maintenance. Astrocytes also have an important role in the immune defense of the CNS by expressing a wide variety of chemokines during physiological and pathological states (de Haas, AH et al. (2007). Mol Neurobiol 36, 137-151 .; Medana, IM et al. (1996). Glia 16, 51-64.). Furthermore, astrocytes increase CCL21 expression in response to CNS injury and infection (Lalor, SJ and Segal, B.M. (2010). J Neuroimmunol 224, 56-61 .; Noor, S. (2010) .Infect Immun 78, 2257-2263.). Because of the increasing gradient of CCL21 expression in OLF, particularly GL where there are a large number of astrocytes, we decided to study Ccr7-deficient mice. This is because CCR7 regulates lymphocyte traffic for immune surveillance of CNS through its interaction with its ligands CCL19 and CCL21 (Noor, S. and Wilson, E. et al. H. (2012) J Neuroinflamation 9, 77.). In addition, previous studies have shown that chemokine receptors such as CCR1, CCR2, CCR5, CCR7, CCR8, CXCR3 and CXCR1 may be important for cell migration into the brain (Miu, J. et al. ( 2008) .J Immunol 180,1217-1230.), And in mice lacking chemokine / chemokine receptors, CCR1 and CCR2 were unnecessary for ECM pathogenesis, whereas CCR5 and CXCR3 Enhanced migration of CD8 T cells into the brain during malaria (Belnoue, E. et al. (2003). Infect Immun 71, 3648-3651 .; Belnoue, E. et al. (2003). Blood 101, 4253-4259 Hansen, DS (2012) PLo S Pathog 8, e1003045 .; Miu, J. et al. (2008). J Immunol 180, 1217-1230.). The role of CCR7 in the induction and maintenance of antiviral effector and memory CTL responses has been thoroughly investigated in Ccr7 − / − mice (Junt, T. et al. (2004). J Immunol 173, 6684-6669. )), The role of CCR7 in serious malaria models such as ECM has not been studied so far. In a lymphocytic choriomeningitis virus infection model, CCR7 was important for coordination of antiviral effector and memory CTL migration and proliferation (Junt, T. et al. (2004). J Immunol 173, 6684- 6663.). Similarly, the inventors have found that the proliferation and migration of effector CD8 T cells expressing CD11c are severely impaired in the spleen and brain in the absence of CCR7. However, from our detailed analysis with CD8α DC from Rag2 − / − mice, the proliferation of CD11c + CD8 T cells requires antigenic stimulation from CD8α DC in the spleen and the presence of CCR7 I came to the conclusion that I needed it. It has been suggested that CD8α DC can cross-present antigens, particularly antigens from dead cells, to T cells (Shortman, K. and Heath, WR (2010). Immunol Rev 234, 18- 31.). On the other hand, considering that Batf3 − / − mice can only partially (about 50%) escape ECM, during ECM, as a result of the combined action of BATF3, BATF and BATF2, in DC development Further consideration is necessary as to whether compensation occurs between members of the BATF family or between other DC types (Edelson, BT et al. (2011). Immunity 35,236. Murphy, TL et al. (2013). Nat Rev Immunol 13, 499-509.). Nevertheless, these results indicate that CD8α DC cross-priming of CD8 T cells during PbA infection requires CCR7 to induce the proliferation of effector CD11c + CD8 T cells, which these CD11c + CD8 T cells It has been shown to migrate into the brain and eventually cause ECM. However, activated CD11c + CD8 T cells migrate to the brain during the effector phase via multiple molecules including several chemokines and chemokine receptors such as IP-10 and CXCR3. Although it is clear that CCL21 is involved in priming of CD11c + CD8 T cells, the presence of CCL21 in OLF early in the infection 3 days after infection suggests chemotactic support for T cell migration. It meant that relevance. In support of our hypothesis, CXCR3 has been recognized as an alternative chemokine receptor for CCL21, particularly in astrocytes and microglia (van Weering, HR et al. (2010). BrainBehave Immuno). 24, 768-775.). Furthermore, CCL21 has been shown to increase rapidly in the brain after Toxoplasma infection and support T cell migration (Wilson, EH et al. (2009). Immunity 30, 300-311.). Therefore, CXCR3 + CD8 T cells may also be able to migrate to OLF by a similar mechanism involving CCL21. In vitro transwell migration assays by the inventors support these hypotheses, but due to the limited effectiveness of anti-CCL21 antibody treatment at the onset of OLF dysfunction (day 4), in vivo ECM Compensation by other mechanisms that cause pathology during the effector phase may be suggested. Nonetheless, the inventors herein have described a novel therapeutic approach, CCL21 blocking, anti-CCL21 therapy, and a combination of CCR7-CCL21 axis and CXCR3-CCL21 axis blockade for ECM treatment. Demonstrate a “proof of concept” that can be developed as a new strategy. It should be noted that loss of olfaction can be a new early diagnostic marker for ECM symptoms and allow treatment of mice as early as 4 days after PbA infection.
まとめると、本研究は、OLFが、マウスおよびサルの両方において、多くの病原菌が脳に侵入するための「弱点」であり、それゆえ、その複雑な毛細管構造がECMを引き起こすPlasmodium寄生虫の標的となり得ることを実証する。マウスの研究はまた、病原性CD11c+CD8 T細胞のような免疫細胞がOLFにおける微小出血を介して脳に侵入すると結論付けた。感染初期のOLFのGLにおけるCCL21は、病原性CD11c+CD8 T細胞の蓄積の基礎的な機構の一つとなり得、CCL21の発現は、ECMの発症にとってのリスクファクターとなり得る(図7)。これらの結果は、OLFの機能不全がECMの発症および早期診断の有用なマーカーであるという証拠を提供する。現在、マウスにおけるこれらの知見がヒトにも適用可能であるかどうかは不明である。特筆すべきことに、「幻嗅」(Perry,T.L.ら、(2009).Open Med 3,e10−16.)のように、ヒトにおけるOLFが関与する症状は、マウスのものとは異なり得る。嗅覚の喪失の新たな試験や、改良されたヒトOLF MRIイメージング(Wang,J.ら、(2011).AJNR Am J Neuroradiol 32,677−681.)のような技術が将来必要とされるのは明らかである。さらに、OLF、早期のBBB漏出および出血の位置は、脳マラリアにとって、ならびに、ヒトにおける自己免疫疾患および炎症性疾患を含む様々な神経免疫学的疾患にとって、有用な治療標的であることが証明され得る(Barresi,M.ら、(2012).J Neurol Sci 323,16−24.)。In summary, this study shows that OLF is a “weakness” for many pathogens to enter the brain in both mice and monkeys, and therefore its complex capillary structure targets the Plasmodium parasite that causes ECM. Demonstrate that it can be. Mouse studies also concluded that immune cells such as pathogenic CD11c + CD8 T cells enter the brain via microbleeding in OLF. CCL21 in OLF GL early in infection can be one of the fundamental mechanisms of pathogenic CD11c + CD8 T cell accumulation, and CCL21 expression can be a risk factor for the development of ECM (FIG. 7). These results provide evidence that OLF dysfunction is a useful marker for the onset and early diagnosis of ECM. Currently, it is unclear whether these findings in mice are applicable to humans. Of particular note, the symptoms associated with OLF in humans, such as “Phantom Olfactory” (Perry, TL et al., (2009). Open Med 3, e10-16.) Can be different. What is needed in the future is a new test of olfactory loss and techniques such as improved human OLF MRI imaging (Wang, J. et al. (2011). AJNR Am J Neuroradiol 32, 677-681.) it is obvious. Furthermore, the location of OLF, early BBB leakage and bleeding has proven to be a useful therapeutic target for cerebral malaria and for various neuroimmunological diseases including autoimmune and inflammatory diseases in humans. (Barresi, M. et al. (2012). J Neurol Sci 323, 16-24.).
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。 As mentioned above, although this invention has been illustrated using preferable embodiment of this invention, it is understood that the scope of this invention should be construed only by the claims. Patents, patent applications, and references cited herein should be incorporated by reference in their entirety as if the contents themselves were specifically described herein. Understood.
脳マラリアの診断・検出マーカーおよび脳マラリアの制御技術が提供され、脳マラリアの診断、治療および予防に関連する技術に関与する産業(試薬、製薬等)において利用可能な技術が提供される。 A diagnosis / detection marker for cerebral malaria and a control technique for cerebral malaria are provided, and a technique that can be used in industries (reagents, pharmaceuticals, etc.) related to the diagnosis, treatment, and prevention of cerebral malaria is provided.
配列番号1:CCL21の代表的核酸配列
配列番号2:CCL21の代表的アミノ酸配列
配列番号3:CXCR3の代表的核酸配列
配列番号4:CXCR3の代表的アミノ酸配列
配列番号5:CCR7の代表的核酸配列
配列番号6:CCR7の代表的アミノ酸配列
[配列表]
SEQ ID NO: 1: Representative nucleic acid sequence of CCL21 SEQ ID NO: 2: Representative amino acid sequence of CCL21 SEQ ID NO: 3: Representative nucleic acid sequence of CXCR3 SEQ ID NO: 4: Representative amino acid sequence of CXCR3 SEQ ID NO: 5: Representative nucleic acid sequence of CCR7 SEQ ID NO: 6: Representative amino acid sequence of CCR7 [Sequence Listing]
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