JP6615474B2 - Reagent and method for measuring thrombin / antithrombin complex - Google Patents
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Description
本発明は、生体試料中のトロンビン（Ｔ）・アンチトロンビン（ＡＴ）複合体(ＴＡＴ)を測定する試薬および方法に関する。 The present invention relates to a reagent and method for measuring thrombin (T) / antithrombin (AT) complex (TAT) in a biological sample.
トロンビン・アンチトロンビン複合体(ＴＡＴ)は血液凝固が進行するときに血液中に産生されるタンパク質複合体で、血液中のＴＡＴの定量は播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）等の血栓症などの診断にとって有用である。現在主流のＴＡＴ定量法は、シーメンス社のエンザイグノスト（登録商標）ＴＡＴ ｍｉｃｒｏ等の酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)を用いる試薬キット、およびＬＳＩメディエンス社のステイシア（登録商標） ＣＬＥＩＡ
ＴＡＴ等の化学発光酵素免疫測定法(ＣＬＥＩＡ)を用いる試薬キットがあるが、いずれも固相・液相分離(Ｂ／Ｆ分離)が必要な測定法で、煩雑な洗浄作業が要り、手作業あるいは専用機器が必要であり、測定感度などの点でも改善の余地がある。
Thrombin / antithrombin complex (TAT) is a protein complex produced in blood when blood coagulation progresses. TAT in blood is quantified by thrombosis such as disseminated intravascular coagulation syndrome (DIC). Useful for diagnosis. Currently, the mainstream TAT quantification methods include reagent kits using enzyme immunoassay (ELISA) such as Siemens' Enzygnost (registered trademark) TAT micro, and Stacia (registered trademark) CLEIA from LSI Medience.
There are reagent kits that use chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA) such as TAT, but both are solid-phase and liquid-phase separation (B / F separation) and require complicated washing and manual labor. Alternatively, dedicated equipment is required, and there is room for improvement in terms of measurement sensitivity.
特許文献１〜５には、ＥＬＩＳＡやラテックス免疫凝集法によってＴＡＴを測定する方法が報告されているが、いずれも実検体中のＴＡＴを定量するには不十分であり、実検体中のＴＡＴを定量するために測定反応時のｐＨの測定結果に対する影響について検討した例はなく、これまでに、ラテックス免疫凝集法によりＴＡＴを測定する際に、反応を酸性側のｐＨで行った例はない。 Patent Documents 1 to 5 report methods for measuring TAT by ELISA or latex immunoaggregation, but none of them is sufficient for quantifying TAT in a real sample. There is no example which examined the influence with respect to the measurement result of pH at the time of measurement reaction for quantification, and when TAT was measured by latex immunoagglutination method, there was no example which carried out reaction by acidic pH.
本発明は、Ｂ／Ｆ分離や洗浄作業を必須としないラテックス凝集法を用いた、生体試料中のＴＡＴの測定試薬および測定方法を提供することを課題とする。
ＴＡＴの測定については、ＤＩＣ診断基準の感度・特異度の向上の観点から、また、ＴＡＴ測定値が正常であればＤＩＣは否定的とする除外診断用としての使用可能性の観点から、その臨床的有用性が認められている。しかし、現在は煩雑な手技を必要とするＥＬＩＳＡ法や専用機器を必要とするＣＬＥＩＡ法が主流であることが、測定の普及が遅れている原因ともされている。
従って、測定が簡便なラテックス凝集法において、高感度・高精度に生体試料中のＴＡＴを測定する試薬及び方法が求められていた。
また、その臨床的意義を考慮した場合、ＣＬＥＩＡ法と同等の数ナノグラム単位で測定できる検出感度が必要であるが、ＣＬＥＩＡ法と同等の感度をラテックス凝集法で達成することは、使用する粒子の特性などその測定原理から考えて、非常に困難な課題である。
また、ラテックス凝集法ではＥＬＩＳＡ法やＣＬＥＩＡ法等のように、洗浄等によるＢ／Ｆ分離の工程を含まないため、遊離アンチトロンビン等、本来目的とする測定対象物質以外との交差反応性を克服することが、試薬や測定法の構築をする際の課題である。
It is an object of the present invention to provide a measuring reagent and a measuring method for TAT in a biological sample using a latex agglutination method that does not require B / F separation and washing operations.
Regarding the measurement of TAT, from the viewpoint of improving the sensitivity and specificity of the DIC diagnostic criteria, and from the viewpoint of the possibility of use as an exclusion diagnosis in which DIC is negative if the TAT measurement value is normal, its clinical Usefulness is recognized. However, at present, the mainstream is the ELISA method that requires complicated procedures and the CLEIA method that requires dedicated equipment, which is also the cause of the delay in the spread of measurement.
Accordingly, there has been a demand for a reagent and method for measuring TAT in a biological sample with high sensitivity and high accuracy in a latex agglutination method that is easy to measure.
In addition, when considering its clinical significance, detection sensitivity that can be measured in the unit of several nanograms equivalent to the CLEIA method is necessary, but achieving the sensitivity equivalent to the CLEIA method by the latex agglutination method is This is a very difficult task considering the characteristics and other measurement principles.
In addition, the latex agglutination method does not include a B / F separation step such as washing, unlike the ELISA method or CLEIA method, so it overcomes cross-reactivity with substances other than the target analyte, such as free antithrombin. This is a problem when constructing reagents and measurement methods.
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、ラテックス免疫凝集法を用いた生体試料中のＴＡＴの測定法において、凝集反応を弱酸性の条件で行うことで、生体試料中のＴＡＴを高感度かつ特異的に測定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。 The present inventor has intensively studied to solve the above problems. As a result, in the method for measuring TAT in biological samples using latex immunoaggregation, we found that TAT in biological samples can be measured with high sensitivity and specificity by performing the aggregation reaction under weakly acidic conditions. The invention has been completed.
すなわち、本発明は以下を提供する。
[１] トロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）測定試薬であって、
ラテックス粒子に結合した、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する第１の抗体、および
ラテックス粒子に結合した、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識する第２の抗体を含み、
測定時のｐＨが５．８〜６．６となるように構成されていることを特徴とする、ＴＡＴ測定試薬。
[２] 前記第１の抗体が結合したラテックス粒子および前記第２の抗体が結合したラテックス粒子を含む第１試薬、ならびに、
ｐＨが５．８〜６．６の緩衝液を含む第２試薬を含む、[１]に記載のＴＡＴ測定試薬。
[３] 生体から分離された試料中に存在する試料中のＴＡＴを測定する方法であって、[
１]または[２]に記載のＴＡＴ測定試薬を用いてラテックス免疫凝集反応をｐＨが５．８
〜６．６の条件で行うことによりＴＡＴを測定することを特徴とする方法。
That is, the present invention provides the following.
[1] A reagent for measuring thrombin-antithrombin complex (TAT),
A first antibody that binds to the latex particle and binds to the antithrombin side and recognizes TAT; and a second antibody that binds to the latex particle and binds to the thrombin side and recognizes TAT;
A TAT measurement reagent characterized in that the pH at the time of measurement is 5.8 to 6.6.
[2] a first reagent comprising latex particles bound to the first antibody and latex particles bound to the second antibody; and
The TAT measurement reagent according to [1], comprising a second reagent containing a buffer solution having a pH of 5.8 to 6.6.
[3] A method for measuring TAT in a sample present in a sample separated from a living body,
Using the TAT measurement reagent according to 1] or [2], the latex immunoaggregation reaction was performed at a pH of 5.8.
A method characterized in that TAT is measured under the conditions of ˜6.6.
本発明によれば、反応時のｐＨを弱酸性に保つことで、感度、特異性ともに高性能の試薬の調製が可能である。ｐＨが高くなると、生食ブランク・血漿ブランク・ＴＡＴ反応性がｐＨ依存的に下がる傾向が見出された。ｐＨが中性よりも高いと反応性が落ちるというのは、本発明者らが見出した意外な効果であった。従って、反応時のｐＨを弱酸性域にすることで、高い反応性を持ち、特異性の高い試薬の提供が可能となった。
According to the present invention, it is possible to prepare a high-performance reagent in both sensitivity and specificity by keeping the pH during the reaction weakly acidic. It was found that when the pH was increased, the raw food blank, plasma blank, and TAT reactivity tended to decrease in a pH-dependent manner. Reducing the reactivity when the pH is higher than neutral was an unexpected effect found by the present inventors. Therefore, by setting the pH during the reaction to a weakly acidic range, it has become possible to provide a reagent having high reactivity and high specificity.
以下に、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体を第１抗体、トロンビン
側に結合してＴＡＴを認識する抗体を第２抗体として構成する、ＴＡＴ測定試薬の一例を、実施の一態様として記載するが、本願発明の範囲はこれに限定されるものではない。
An embodiment of an embodiment of the present invention is an example of a TAT measurement reagent comprising an antibody that binds to the antithrombin side and recognizes TAT as the first antibody, and an antibody that binds to the thrombin side and recognizes TAT as the second antibody. However, the scope of the present invention is not limited to this.
例えば、本発明のＴＡＴ測定試薬は、トロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）測定試薬であって、ラテックス粒子に結合した、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する第１抗体、および、ラテックス粒子に結合した、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識する第２抗体を含み、測定時のｐＨが５．８〜６．６となるように構成されていることを特徴とする。ラテックス粒子に結合させる抗体は、２種類の粒子にそれぞれ２種類の抗体を結合させてもよいし、１種類の粒子に複数種類の抗体を結合させてもよいし、１種類の抗体を複数種類の粒子に結合させたものを混合して使用することもできる。 For example, the TAT measurement reagent of the present invention is a thrombin / antithrombin complex (TAT) measurement reagent, which binds to latex particles, binds to the antithrombin side and recognizes TAT, and latex particles A second antibody that binds to the thrombin side and recognizes TAT, and is configured to have a pH of 5.8 to 6.6 at the time of measurement. The antibody to be bound to latex particles may be two types of antibodies bound to two types of particles, each of which may be bound to a plurality of types of antibodies, or a plurality of types of one type of antibody. It is also possible to use a mixture of those bonded to the particles.
第１抗体としては、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識することができる抗体を使用する。
該抗体を調製するにあたっては、ヒト以外の動物に対して、遊離アンチトロンビンを免疫したものであっても、ＴＡＴを免疫したものであってもよく、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識することができる抗体であれば、本発明に使用することができる。
ここで、本願発明においてアンチトロンビン側に結合するとは、試料中に最も多く存在している遊離した状態のアンチトロンビンが、遊離トロンビンと結合して複合体（ＴＡＴ）を形成している状態のアンチトロンビンに結合することを意味する。従って、複合体を形成した時の構造を有するアンチトロンビンを複合体型構造アンチトロンビン、複合体を形成していない時の構造を有するアンチトロンビンを遊離型構造アンチトロンビン（遊離アンチトロンビン）と称した場合、アンチトロンビン側に結合するとは、複合体型構造アンチトロンビンに結合することを意味する。
遊離型構造アンチトロンビンは、複合体型構造アンチトロンビンと異なる構造を有する。それは、遊離型構造アンチトロンビンは、遊離トロンビンと結合して複合体を形成することによってその構造が変化した状態で存在するためである。
As the first antibody, an antibody capable of recognizing TAT by binding to the antithrombin side is used.
In preparing the antibody, non-human animals may be immunized with free antithrombin or immunized with TAT, and bind to the antithrombin side to recognize TAT. Any antibody that can be used can be used in the present invention.
Here, in the present invention, binding to the antithrombin side means that the antithrombin in the free state that is present most in the sample is bound to the free thrombin to form a complex (TAT). Means binding to thrombin. Therefore, when the antithrombin having the structure when the complex is formed is called the complex type antithrombin, and the antithrombin having the structure when the complex is not formed is called the free type antithrombin (free antithrombin). And binding to the antithrombin side means binding to the complex type antithrombin.
Free structure antithrombin has a structure different from complex structure antithrombin. This is because free structure antithrombin exists in a state in which its structure is changed by binding to free thrombin to form a complex.
第２抗体としては、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識することができる抗体であればよく、トロンビンに対して特異的に反応する抗体を使用することができる。試料中において、遊離トロンビンはほとんど存在しないため、遊離トロンビンに対して交差反応性を有する抗体であっても利用できることが多い。当業者であれば、適宜選択して使用することができる。
該抗体を調製するにあたっては、ヒト以外の動物に対して、遊離トロンビンを免疫したものであっても、ＴＡＴを免疫したものであってもよく、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識することができる抗体であれば、本発明に使用することができる。
ここで、本願発明においてトロンビン側に結合するとは、試料中に存在している遊離した状態のトロンビンが、アンチトロンビンに結合して複合体（ＴＡＴ）を形成している状態のトロンビンに結合することを意味する。従って、複合体を形成した時の構造を有するトロンビンを複合体型構造トロンビン、複合体を形成していない時の構造を有するトロンビンを遊離型構造トロンビンと称した場合、トロンビン側に結合するとは、複合体型構造トロンビンに結合することを意味する。
遊離型構造トロンビンは、複合体型構造トロンビンと異なる構造を有する可能性が考えられる。それは、遊離型構造トロンビンは、アンチトロンビンと結合して複合体を形成することによってその構造が変化した状態で存在することによる。
The second antibody may be any antibody that can bind to the thrombin side and recognize TAT, and an antibody that specifically reacts with thrombin can be used. Since there is almost no free thrombin in the sample, even an antibody having cross-reactivity with free thrombin can often be used. A person skilled in the art can select and use as appropriate.
In preparing the antibody, a non-human animal may be immunized with free thrombin or TAT, and may bind to the thrombin side and recognize TAT. Any antibody that can be used can be used in the present invention.
Here, in the present invention, binding to the thrombin side means binding of thrombin in a free state existing in a sample to thrombin in a state of binding to antithrombin to form a complex (TAT). Means. Therefore, when thrombin having the structure when the complex is formed is referred to as complex structure thrombin, and thrombin having the structure when not forming the complex is referred to as free structure thrombin, binding to the thrombin side means that complex It means to bind to the body structure thrombin.
The free structure thrombin may have a structure different from the complex structure thrombin. This is because free structure thrombin exists in a state in which its structure is changed by binding to antithrombin to form a complex.
上記の第１抗体及び第２抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれも使用することができる。これらの抗体は、当業者であれば、公知の手法に従って取得することができる。
抗体作製用に免疫原を免疫する動物としては、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等が使用可能であり、特にポリクローナル抗体作製にはウサギ、ヤギなどが好まし
い。また、ハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法によりモノクローナル抗体を得ることも可能であり、この場合はマウス、ラット或いはウサギ等が好ましい。
免疫原としては、上述したように、ＴＡＴを使用してもよいし、ビトロネクチンが結合したＶＴＡＴを免疫原として作製した抗体を本願発明の使用することもできる。また、第１抗体の場合はアンチトロンビンを、第２抗体の場合にはトロンビンを使用してもよい。
これらの免疫原は、生体から採取された試料を原料として精製されたＴＡＴを使用してもよいし、遊離トロンビンと遊離アンチトロンビンを混合してｉｎｖｉｔｒｏで合成したＴＡＴを使用してもよい。合成ＴＡＴとしては、例えば、生物製剤として入手可能なトロンビンとアンチトロンビンを試験管内でインキュベートして得られるＴＡＴでもよいし、大腸菌や哺乳動物細胞、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞等、既知の翻訳発現系を使用して発現させたものを回収して精製したものを免疫原として使用してもよい。
また、立体構造の違いを部分的なペプチドのみで免疫させることが可能である場合、具体的に抗体の結合部位を特定して抗体を作製したい場合には第１抗体の場合はアンチトロンビン、第２抗体の場合はトロンビンの部分ペプチドを用いて作製することもできる。その場合の抗原としてのペプチド配列の選択やペプチド断片の合成方法、免疫方法は既知の方法を使用することができる。
As the first antibody and the second antibody, either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be used. Those skilled in the art can obtain these antibodies according to known methods.
Sheep, horses, goats, rabbits, mice, rats, etc. can be used as animals to immunize the immunogen for antibody production, and rabbits, goats, etc. are particularly preferred for polyclonal antibody production. Monoclonal antibodies can also be obtained by a known method for producing hybridoma cells. In this case, mouse, rat, rabbit or the like is preferable.
As described above, TAT may be used as the immunogen, and an antibody prepared using VTAT bound with vitronectin as an immunogen can also be used in the present invention. In the case of the first antibody, antithrombin may be used, and in the case of the second antibody, thrombin may be used.
As these immunogens, TAT purified using a sample collected from a living body as a raw material may be used, or TAT synthesized in vitro by mixing free thrombin and free antithrombin may be used. Synthetic TAT may be TAT obtained by incubating thrombin and antithrombin, which are available as biologics, in a test tube, known translations such as E. coli, mammalian cells, and insect cells infected with baculovirus. What collected and refine | purified what was expressed using the expression system may be used as an immunogen.
In addition, when it is possible to immunize the difference in the three-dimensional structure with only a partial peptide, in the case of specifically preparing the antibody by specifying the antibody binding site, antithrombin in the case of the first antibody, In the case of two antibodies, it can also be prepared using a partial peptide of thrombin. In this case, known methods can be used for selection of peptide sequences as antigens, peptide fragment synthesis methods, and immunization methods.
図１を参照して、ラテックス凝集法による測定方法を説明する。図１に示すように、ＴＡＴのアンチトロンビン側に第１抗体が結合し、ＴＡＴのトロンビン側に第２抗体が結合した場合に、ラテックス凝集が起こり、その時の吸光度の値に基づいてＴＡＴ濃度の測定ができる。 With reference to FIG. 1, the measuring method by a latex agglutination method is demonstrated. As shown in FIG. 1, when the first antibody binds to the antithrombin side of TAT and the second antibody binds to the thrombin side of TAT, latex aggregation occurs, and the TAT concentration is determined based on the absorbance value at that time. Can measure.
第１抗体は、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗ＴＡＴ抗体であればよいが、血中でのＴＡＴの存在量が遊離アンチトロンビンの存在量と比べてごく微量なので、遊離アンチトロンビンとの交差反応性が小さい抗ＴＡＴ抗体を用いることが好ましい。 The first antibody may be an anti-TAT antibody that binds to the antithrombin side and recognizes TAT. However, since the amount of TAT in blood is very small compared to the amount of free antithrombin, free antithrombin It is preferable to use an anti-TAT antibody that has low cross-reactivity with the antibody.
第１抗体として使用し得る、遊離アンチトロンビンとの交差反応性が小さい抗ＴＡＴ抗体としては、ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上である抗ＴＡＴ抗体が挙げられる。第１抗体のＴＡＴに対する反応性は遊離アンチトロンビンに対する反応性より少なくとも１００倍以上であればよく、１，０００倍以上であることが好ましく、１０，０００倍以上であることがより好ましい。交差反応性は少ないほどよいので上限は特にないが、例えば、１００，０００倍未満、または５０，０００倍未満であってもよい。 Examples of the anti-TAT antibody having a small cross-reactivity with free antithrombin that can be used as the first antibody include an anti-TAT antibody that has a reactivity to TAT of 100 times or more of a reactivity to free antithrombin. The reactivity of the first antibody with respect to TAT may be at least 100 times or more than the reactivity with free antithrombin, preferably 1,000 times or more, and more preferably 10,000 times or more. The lower the cross-reactivity, the better, so there is no particular upper limit.
生体内におけるＴＡＴとＴＡＴを形成していない遊離アンチトロンビンの存在割合は健常人の測定値幅を参考として１：６０，０００〜１：１１０，０００の間と考えられるが、一般的には約１：１００，０００で存在していると考えられる。また、敗血症や肝疾患患者においてその存在割合が変化する場合が知られているが、遊離アンチトロンビン量が少なくなる場合でも１：５０，０００程度であるとされている。従って、第１抗体が遊離アンチトロンビンにも反応性を示すとＴＡＴの定量が困難になる。そこで、ＴＡＴを定量するには、遊離アンチトロンビンへの反応性が低い抗体を使用する必要があり、ＴＡＴに対する反応性は、計算上、遊離アンチトロンビンへの反応性の５０，０００〜１００，０００倍以上であることが必要と考えられるところ、以下の実施例において示すように、本発明では、ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上であれば、その抗体を第１抗体として用いることで、ＴＡＴの定量が十分可能であることを見出した。 The proportion of free antithrombin that does not form TAT and TAT in the living body is considered to be between 1: 60,000 and 1: 110,000 with reference to the measured value range of a healthy person. : It is thought that it exists at 100,000. In addition, it is known that the presence ratio changes in patients with sepsis or liver disease, but even when the amount of free antithrombin decreases, it is said to be about 1: 50,000. Therefore, if the first antibody is also reactive with free antithrombin, it becomes difficult to quantify TAT. Therefore, in order to quantify TAT, it is necessary to use an antibody having low reactivity to free antithrombin, and the reactivity to TAT is calculated to be 50,000 to 100,000 of reactivity to free antithrombin. In the present invention, as shown in the following examples, if the reactivity to TAT is 100 times or more the reactivity to free antithrombin, the antibody is designated as the first antibody. As a result, it was found that the TAT can be quantified sufficiently.
本発明において、「ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上」とは、各抗原に対する親和性の比が１００倍以上である場合や、後述の、間接阻害ＥＬＩＳＡで評価したときの、一定割合の阻害率を示すのに必要な抗原量の比が１
００倍以上である場合などが挙げられる。
In the present invention, “the reactivity to TAT is 100 times or more of the reactivity to free antithrombin” means that the affinity ratio to each antigen is 100 times or more, or when evaluated by an indirect inhibition ELISA described later. The ratio of the amount of antigen required to show a certain percentage of inhibition is 1
The case where it is 00 times or more is mentioned.
ＴＡＴに対する反応性が、遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上である抗ＴＡＴ抗体を間接阻害ＥＬＩＳＡで評価またはスクリーニングする場合について説明する。
まず、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗ＴＡＴ抗体（第１抗体の候補抗体）を用意する。このような抗体は、後述のハイブリドーマによるモノクローナル抗体産生法等により抗ＴＡＴ抗体を得たのち、結合部位がアンチトロンビン側である、ＴＡＴを認識する抗体を選択すればよい。もちろん、あらかじめ、結合部位がアンチトロンビン側である抗ＴＡＴ抗体が存在する場合はそれを以下の評価系に供すればよい。
The case where an anti-TAT antibody whose reactivity to TAT is 100 times or more that of free antithrombin is evaluated or screened by indirect inhibition ELISA will be described.
First, an anti-TAT antibody (candidate antibody for the first antibody) that binds to the antithrombin side and recognizes TAT is prepared. Such an antibody may be obtained by obtaining an anti-TAT antibody by a monoclonal antibody production method using a hybridoma, which will be described later, and then selecting an antibody that recognizes TAT whose binding site is on the antithrombin side. Of course, when an anti-TAT antibody whose binding site is on the antithrombin side is present in advance, it may be used for the following evaluation system.
すなわち、候補抗体と一定量（例えば、０．１、０．５、１、５、１０、５０μｇ／ｍＬ）のＴＡＴ、又はＴＡＴの反応を阻害し得る抗原を含む溶液とを十分な時間（例えば、１２時間）反応させる。次いで、前記反応液をＴＡＴを固定化した基材と一定時間反応させる。その後、洗浄操作を行った後、標識２次抗体を用いて基材上のＴＡＴに結合した抗体の量（抗体残存率）を測定する。 That is, a candidate antibody and a solution containing an antigen that can inhibit the TAT reaction in a certain amount (for example, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 μg / mL) or a sufficient amount of time (for example, , 12 hours). Next, the reaction solution is reacted with a substrate on which TAT is immobilized for a predetermined time. Thereafter, after washing operation, the amount of antibody bound to TAT on the substrate (antibody residual ratio) is measured using a labeled secondary antibody.
例えば、まず、該抗体の反応を阻害する抗原が存在しない条件で、一定量のＴＡＴをプレート等の基材に固相する。基材に固相する抗原（ＴＡＴ）の量は、当業者であれば、使用する抗原の分注量と評価対象の抗体の種類との関係を考慮して、適宜設定することができる。
該抗体の反応を阻害する抗原が存在しない条件で、各濃度（例えば０．０４〜１μｇ／ｍＬ）の上記第１抗体の候補抗体を、上記ＴＡＴを固定化した基材と一定時間反応させる。その後、洗浄操作を行った後、標識２次抗体（抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ）を用いて、基材上のＴＡＴに結合した抗体の量を測定する。吸光度が１．０付近（表１の記載方法だと１０００）となる抗体濃度を決定する。この抗体濃度を、抗原による阻害時の抗体濃度とすることができる（表３；反応時濃度（μｇ／ｍＬ））。
次に上記方法で決定した濃度の候補抗体と一定量（例えば、０．１、０．５、１、５、１０、５０μｇ／ｍＬ）のＴＡＴまたは遊離アンチトロンビンを含む溶液とを十分な時間（例えば、１２時間）反応させる。次いで、前記反応液をＴＡＴを固定化した基材と一定時間反応させる。その後、洗浄操作を行った後、標識２次抗体（抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ）を用いて基材上のＴＡＴに結合した抗体の量（抗体残存率）を測定する。
なお、抗体残存率は、抗原による吸収が未実施の時に得られる検出値を１００％として算出できる。
For example, first, a certain amount of TAT is solid-phased on a substrate such as a plate under the condition that there is no antigen that inhibits the antibody reaction. A person skilled in the art can appropriately set the amount of the antigen (TAT) to be immobilized on the substrate in consideration of the relationship between the dispensed amount of the antigen to be used and the kind of the antibody to be evaluated.
Under the condition that no antigen that inhibits the reaction of the antibody is present, the candidate antibody of the first antibody at each concentration (for example, 0.04 to 1 μg / mL) is reacted with the substrate on which the TAT is immobilized for a certain period of time. Thereafter, after washing operation, the amount of antibody bound to TAT on the substrate is measured using a labeled secondary antibody (anti-mouse IgG-HRP). The antibody concentration at which the absorbance is around 1.0 (1000 in the method described in Table 1) is determined. This antibody concentration can be used as the antibody concentration at the time of inhibition by the antigen (Table 3; concentration at the time of reaction (μg / mL)).
Next, the candidate antibody at the concentration determined by the above method and a solution containing a certain amount (for example, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 μg / mL) of TAT or free antithrombin for a sufficient time ( For example, 12 hours). Next, the reaction solution is reacted with a substrate on which TAT is immobilized for a predetermined time. Thereafter, after washing operation, the amount of antibody bound to TAT on the substrate (antibody residual ratio) is measured using a labeled secondary antibody (anti-mouse IgG-HRP).
The antibody residual ratio can be calculated with the detection value obtained when absorption by the antigen is not performed as 100%.
抗体の遊離アンチトロンビンに対する反応性が高い場合はＴＡＴに結合できる抗体の量が減るため、標識２次抗体によって検出される抗体の量が少なくなり（抗体残存率が低くなり）、一方、抗体が遊離アンチトロンビンに対する反応性が低い場合はＴＡＴに結合できる抗体が多く残るため、標識２次抗体によって検出される抗体の量が多くなる（抗体残存率が高くなる）。
この抗体残存率を、最初にＴＡＴと抗体とを反応させた（阻害反応をＴＡＴで行った）後に、反応液を固体化ＴＡＴと反応させたときの抗体残存率と比較する。
When the reactivity of the antibody to free antithrombin is high, the amount of antibody that can bind to TAT is reduced, so that the amount of antibody detected by the labeled secondary antibody is reduced (the residual ratio of the antibody is low), whereas the antibody is When the reactivity to free antithrombin is low, a large amount of antibody that can bind to TAT remains, so that the amount of antibody detected by the labeled secondary antibody increases (the antibody residual ratio increases).
This antibody residual rate is compared with the antibody residual rate when the TAT and the antibody are first reacted (inhibition reaction is performed with TAT) and then the reaction solution is reacted with the solidified TAT.
そして、例えば、遊離アンチトロンビンを50μg/mL加えて阻害反応させたときの抗体残存率が５０％であった場合、同じ抗体残存率を示すのに必要なＴＡＴの量を上記のＴＡＴで阻害したときの結果から算出する。ＴＡＴで阻害したときに、抗体残存率５０％を達成するのに必要なＴＡＴ阻害抗原の量が0.50μg/mL未満であれば、ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上とすることができる。
このようにして選択された抗ＴＡＴ抗体を第1抗体として選択することができる。なお
、第1抗体は、モノクローナル抗体の場合、ＴＡＴに対する親和性（Ｋｄ）が１０−８以
下であることが好ましいが、当業者であればＴＡＴに対する親和性の値を参考としてラテックス試薬に適した抗体の選択を適宜することが可能である。
And, for example, when the antibody remaining rate when 50 μg / mL of free antithrombin was added to cause an inhibition reaction was 50%, the amount of TAT necessary to show the same antibody remaining rate was inhibited by the above TAT. Calculate from the time results. When the amount of TAT-inhibiting antigen required to achieve 50% of the remaining antibody rate when TAT is inhibited is less than 0.50 μg / mL, the reactivity to TAT is 100 times or more the reactivity to free antithrombin. can do.
The anti-TAT antibody thus selected can be selected as the first antibody. In the case of the monoclonal antibody, the first antibody preferably has an affinity (Td) for TAT of 10 −8 or less, but those skilled in the art are suitable for latex reagents with reference to the affinity value for TAT. It is possible to select the antibody appropriately.
本発明で使用される抗体はモノクローナル抗体であるが、モノクローナル抗体には、抗体フラグメントが含まれる。前記抗体フラグメントは、所望のモノクローナル抗体のフラグメントであって、しかも、もとのモノクローナル抗体と同じ反応性を有する抗体フラグメントである。本発明で用いることのできる抗体フラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、又はＦｖ等が含まれる。これらのフラグメントは、例えば、モ
ノクローナル抗体を常法によりタンパク質分解酵素によって消化し、続いて、タンパク質の分離・精製の常法に従って得ることができる。これらは、そのままラテックス粒子に固相して使用することができるが、Ｆａｂ’フラグメントやＦ（ａｂ’）2フラグメントに
調製したものをラテックス粒子に固相することができる。抗体のＦｃフラグメントに対する非特異反応を回避する観点から、Ｆａｂ’やＦ（ａｂ’）2がより好ましい。
The antibody used in the present invention is a monoclonal antibody, and the monoclonal antibody includes an antibody fragment. The antibody fragment is a fragment of a desired monoclonal antibody and has the same reactivity as the original monoclonal antibody. Antibody fragments that can be used in the present invention include, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , or Fv. These fragments can be obtained, for example, by digesting a monoclonal antibody with a proteolytic enzyme according to a conventional method, and subsequently following a conventional method for protein separation and purification. These can be used as they are solid-phased on latex particles, but those prepared as Fab ′ fragments or F (ab ′) 2 fragments can be solid-phased on latex particles. Fab ′ and F (ab ′) 2 are more preferable from the viewpoint of avoiding a non-specific reaction of the antibody against the Fc fragment.
本発明で使用する抗体は、まず、ハイブリドーマによるモノクローナル抗体産生法な
どによりＴＡＴ抗体（候補抗体）を得て、その後、ＴＡＴ抗体（候補抗体）の中から、上記のような手法及び基準で、遊離アンチトロンビンとの交差反応性が低い抗体、具体的には、ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上である抗体を選択することにより得ることができる。
The antibody to be used in the present invention is obtained by first obtaining a TAT antibody (candidate antibody) by a monoclonal antibody production method using a hybridoma, and then released from the TAT antibody (candidate antibody) by the above-described method and standard. It can be obtained by selecting an antibody having a low cross-reactivity with antithrombin, specifically, an antibody having a reactivity to TAT of 100 times or more of the reactivity to free antithrombin.
候補となる抗体は、例えば、公知の細胞融合法で作製されたハイブリドーマによるモノクローナル抗体産生法により得ることができる。抗体産生細胞としては、ヒトを除く動物、例えば、マウス・ラット・モルモット等から選択することができる。ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の調製は、定法、例えば、続生化学実験講座（日本生化学会編）又は免疫生化学研究法（日本生化学会編）に記載の方法に従って行うことができる。 Candidate antibodies can be obtained, for example, by a monoclonal antibody production method using a hybridoma prepared by a known cell fusion method. The antibody-producing cells can be selected from animals other than humans, such as mice, rats, guinea pigs and the like. The hybridoma and the monoclonal antibody can be prepared according to a conventional method, for example, a method described in a follow-up biochemistry experiment course (edited by the Japanese Biochemical Society) or an immunobiochemical research method (edited by the Japanese Biochemical Society).
第２抗体としては、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗ＴＡＴ抗体であれば特に制限されない。モノクローナル抗体の場合、ＴＡＴに対する親和性（Ｋｄ）が１０−８以下であることが好ましいが、当業者であればＴＡＴに対する親和性の値を参考としてラテックス試薬に適した抗体の選択を適宜することが可能である。抗体を選択する方法については、第１抗体と同様にして作製した抗体を使用することができる。 The second antibody is not particularly limited as long as it is an anti-TAT antibody that recognizes TAT by binding to the thrombin side. In the case of a monoclonal antibody, the affinity (Kd) for TAT is preferably 10 −8 or less. However, those skilled in the art should appropriately select an antibody suitable for a latex reagent with reference to the affinity value for TAT. Is possible. As a method for selecting an antibody, an antibody prepared in the same manner as the first antibody can be used.
第１抗体と第２抗体の組み合わせはラテックス凝集法においてＴＡＴの測定が可能であれば特に制限されないが、血漿などの生体試料中に含まれるマトリクス（バックグラウンド）の影響が最少の抗体組み合わせを選出することが好ましい。
ＴＡＴ測定試薬に求められる感度は、健常人と患者とを明確に区別できる基準値、或いはその２倍の濃度を測定できることが必要であるため、本発明の試薬は生体試料中の１０〜１５ｎｇ／ｍＬの微量のＴＡＴを定量できる試薬であることが好ましく、３〜４ｎｇ／ｍＬの微量のＴＡＴを定量できる試薬であることがより好ましく、１ｎｇ／ｍＬ程度の濃度でも定量できる試薬であることがさらに好ましい。
The combination of the first antibody and the second antibody is not particularly limited as long as TAT can be measured in the latex agglutination method, but an antibody combination having the least influence of the matrix (background) contained in a biological sample such as plasma is selected. It is preferable to do.
Since the sensitivity required for the TAT measurement reagent needs to be able to measure a reference value that can clearly distinguish a healthy person from a patient, or twice its concentration, the reagent of the present invention is 10 to 15 ng / in a biological sample. It is preferable that the reagent can quantitate a trace amount of TAT in mL, more preferably a reagent that can quantitate a trace amount of TAT of 3 to 4 ng / mL, and more preferably a reagent that can be quantified even at a concentration of about 1 ng / mL. preferable.
上記の第１抗体および第２抗体を結合させるラテックス粒子はラテックス凝集反応に使用し得るものであれば特に制限されないが、平均粒子径が０．０５μｍ〜０．５μｍであることが好ましく、０．２〜０．４μｍであることがより好ましい。
使用するラテックス粒子の種類は、１種類のラテックス粒子のみを使用してもよいし、複数種のラテックス粒子を使用してもよい。例えば、粒子径の異なるラテックス粒子を組み合わせて使用することができる。ラテックス粒子は単一粒径で製造することは実質的に困難であることから、粒子全体の平均粒子径として規定される。従って、平均粒子径０．０５μｍ〜０．５μｍという場合、当該範囲に含まれないラテックス粒子を含む場合であっても、本発明に該当する場合がある。当業者にとって、粒径が異なるラテックス粒子が
含まれることは常識の範囲内であり、当業者であれば、その粒径の分布に大きく偏りの無い粒子群を含む溶液を使用してラテックス試薬の構築することが可能である。
なお、この平均粒子径は、公知の方法で測定することが可能であり、例えば、透過型電子顕微鏡装置を用いた画像解析により算出される。
The latex particles to which the first antibody and the second antibody are bound are not particularly limited as long as they can be used in the latex agglutination reaction, but the average particle diameter is preferably 0.05 μm to 0.5 μm. More preferably, it is 2 to 0.4 μm.
As the kind of latex particles to be used, only one kind of latex particles may be used, or plural kinds of latex particles may be used. For example, latex particles having different particle diameters can be used in combination. Since latex particles are substantially difficult to produce with a single particle size, they are defined as the average particle size of the entire particle. Therefore, when the average particle diameter is 0.05 μm to 0.5 μm, even if it contains latex particles not included in the range, it may fall under the present invention. For those skilled in the art, it is within the scope of common knowledge that latex particles having different particle sizes are included, and those skilled in the art can use latex solutions containing particles having a large and non-biased particle size distribution. It is possible to build.
The average particle diameter can be measured by a known method, and is calculated by, for example, image analysis using a transmission electron microscope apparatus.
本発明に係るラテックス粒子としては、通常この分野で用いられているものであれば特に限定はされないが、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーを重合させてなる単一重合体（例えば、ポリスチレン、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体等）からなる粒子、ブタジエン系共重合体（例えば、スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン共重合体等）からなる粒子、それ以外の共重合体（例えば、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸エステル共重合体、アクリル酸エステル共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体等）からなる粒子を挙げられる。官能基としてカルボキシル基、１級アミノ基、カルバモイル基（−ＣＯＮＨ2）、水酸基、アルデヒド基等を有し、かつ、基体が上記有機系
微粒子からなる粒子を挙げられる。
The latex particles according to the present invention are not particularly limited as long as they are usually used in this field. For example, vinyl particles such as styrene, vinyl chloride, acrylonitrile, vinyl acetate, acrylic acid ester, and methacrylic acid ester are used. Particles consisting of a single polymer obtained by polymerizing monomers (eg, polystyrene, methacrylic acid polymer, acrylic acid polymer, etc.), butadiene copolymers (eg, styrene-butadiene copolymer, methyl methacrylate-butadiene copolymer) Particles made of polymer, acrylonitrile-butadiene copolymer, etc., and other copolymers (for example, styrene-styrene sulfonate copolymer, methacrylate ester copolymer, acrylate ester copolymer, vinyl chloride- Acrylic ester copolymer etc.) That. Examples thereof include particles having a carboxyl group, a primary amino group, a carbamoyl group (—CONH 2 ), a hydroxyl group, an aldehyde group, etc. as a functional group, and a substrate composed of the organic fine particles.
ラテックス粒子に抗体を固相する方法としては、公知の方法に準じて行えばよく、例えば、抗体とラテックス粒子とを緩衝液中で懸濁させ、２５℃で１時間反応させた後、遠心分離、ブロッキング処理等、通常この分野で行われる処理により得ることができる。また、抗体とラテックス粒子とを化学結合により固相する方法や、ビオチン−アビジン反応により抗体を固相する方法も選択できる。
ラテックス粒子に抗体を結合させる際には、抗体が、上記のＴＡＴに対する反応性および特異性を維持できる条件で行う。
好適な試薬の調製が行いやすいことから、第１抗体を固相した第１のラテックス粒子、第２抗体を固相した第２のラテックス粒子として、抗体の種類ごとに固相ラテックス液を調製することもできるし、１種類のラテックス粒子に第１の抗体と第２の抗体を固相させて試薬の調製を行うこともできる。抗体とラテックス粒子をどのように固相させて試薬の調製を行うかは、当業者であれば適宜設計することができる。
The antibody may be solid-phased on the latex particles in accordance with a known method. For example, the antibody and latex particles are suspended in a buffer, reacted at 25 ° C. for 1 hour, and then centrifuged. It can be obtained by a process usually performed in this field, such as a blocking process. In addition, a method in which the antibody and latex particles are solid-phased by a chemical bond and a method in which the antibody is solid-phased by a biotin-avidin reaction can be selected.
When the antibody is bound to the latex particles, the antibody is subjected to the conditions that can maintain the reactivity and specificity for the TAT.
Since it is easy to prepare a suitable reagent, a solid phase latex solution is prepared for each type of antibody as a first latex particle having a first antibody as a solid phase and a second latex particle having a second antibody as a solid phase. Alternatively, the reagent can be prepared by immobilizing the first antibody and the second antibody on one type of latex particle. A person skilled in the art can appropriately design how the antibody and latex particles are solid-phased to prepare the reagent.
本発明の試薬は、１試薬系であってもよいし、２試薬系であってもよい。本発明の試薬が１試薬系である場合は、生体試料に前記抗体を固相したラテックス粒子懸濁液を添加し、ｐＨ５．８〜６．６の条件で抗原抗体反応を生じさせることにより、生体試料中のＴＡＴを測定することができる。本発明の試薬が２試薬系である場合には、緩衝液成分を主体とした第１試薬を生体試料に添加した後、更に前記抗体を固相したラテックス粒子を含む第２試薬を添加することで、ｐＨ５．８〜６．６の条件で抗原抗体反応を生じさせ、生体試料中のＴＡＴを測定することができる。 The reagent of the present invention may be a one-reagent system or a two-reagent system. When the reagent of the present invention is a one-reagent system, a latex particle suspension in which the antibody is solid-phased is added to a biological sample, and an antigen-antibody reaction is caused under conditions of pH 5.8 to 6.6, TAT in a biological sample can be measured. When the reagent of the present invention is a two-reagent system, a first reagent mainly composed of a buffer component is added to a biological sample, and then a second reagent containing latex particles having the antibody as a solid phase is added. Thus, an antigen-antibody reaction is caused under the conditions of pH 5.8 to 6.6, and TAT in the biological sample can be measured.
本発明の試薬は、測定（ラテックス凝集反応）時のｐＨが５．８〜６．６となるように構成されている。１試薬系であれば、試薬のｐＨが５．８〜６．６に調整されていればよいし、２試薬系であれば、混合したときにｐＨが５．８〜６．６になるように構成されていればよい。例えば、緩衝液成分を主体とした第１試薬と、抗体を固相したラテックス粒子を含む第２試薬から構成される場合に、第１試薬のｐＨが５．８〜６．６に調整されており、両試薬を混合したときに、混合液のｐＨが５．８〜６．６になるような態様が挙げられる。
なお、ｐＨは６．０〜６．４であることが好ましく、６．１〜６．３であることがより好ましく、６．１５〜６．２５であることがさらに好ましく約６．２であることが特に好ましい。
The reagent of this invention is comprised so that pH at the time of a measurement (latex aggregation reaction) may be set to 5.8-6.6. In the case of one reagent system, it is sufficient that the pH of the reagent is adjusted to 5.8 to 6.6, and in the case of two reagent systems, the pH is adjusted to 5.8 to 6.6 when mixed. It suffices to be configured. For example, in the case of a first reagent mainly composed of a buffer component and a second reagent containing latex particles in which an antibody is solid-phased, the pH of the first reagent is adjusted to 5.8 to 6.6. In addition, there is an embodiment in which the pH of the mixed solution becomes 5.8 to 6.6 when both reagents are mixed.
The pH is preferably 6.0 to 6.4, more preferably 6.1 to 6.3, still more preferably 6.15 to 6.25, and about 6.2. It is particularly preferred.
ｐＨはｐＨ調節剤によって調節されてもよいが、緩衝液により調整されることが好まし
い。緩衝剤としては、ｐＨ５．８〜６．６に緩衝能を有する緩衝液であればよいが、トリス緩衝液、ビス−トリス緩衝液、リン酸緩衝液、又はグッド緩衝液などが好適に使用される。また、反応時の緩衝液濃度は１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、２０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
なお、血液試料を試薬と混合したときのｐＨが５．８〜６．６から外れる場合は、別途、ｐＨ調整剤などで調整されてもよい。
The pH may be adjusted with a pH adjusting agent, but is preferably adjusted with a buffer. The buffer may be any buffer having a buffer capacity at pH 5.8 to 6.6, but Tris buffer, bis-Tris buffer, phosphate buffer, Good buffer, or the like is preferably used. The Moreover, it is preferable that the buffer solution density | concentration at the time of reaction is 10-500 mmol / L, and it is more preferable that it is 20-200 mmol / L.
In addition, when the pH when the blood sample is mixed with the reagent deviates from 5.8 to 6.6, it may be adjusted separately with a pH adjusting agent or the like.
ラテックス粒子の凝集の度合いは、例えば吸光度を用いて測定し、予め求めておいた標準品の検量線からその濃度を求めることにより、検体中のＴＡＴ濃度を定量することができる。なお、吸光度の測定波長は、通常は３４０ｎｍ〜１０００ｎｍ、好ましくは５００ｎｍ〜９００ｎｍで測定すればよい。ラテックス凝集反応を測光する時間は、ラテックス凝集反応が生じている時間を時間当たりの変化速度、あるいは一定時間の変化量によって測光することができる。例えば、吸光度を測定する場合、ラテックス凝集反応が始まってから３０秒後から５分後の時間当たりの吸光度変化速度、あるいは一定時間の吸光度変化量によって測光することができる。反応温度は１０〜５０℃であることが好ましく、２０〜４０℃であることがより好ましい。反応時間は適宜決定することができ、例えば汎用自動分析機では１０〜１５分間の反応時間で測定することができる。なお、当業者であれば、光学機器あるいは汎用自動分析機を用いた分析において、公知の方法に従って、反応温度、反応時間、測定波長、測定時間、試薬構成、ラテックス濃度、ラテックス固定化するモノクローナル抗体濃度、各種添加剤濃度を適宜決定することができる。 The degree of latex particle aggregation can be quantified by measuring the concentration of latex particles using, for example, absorbance and determining the concentration from a standard calibration curve determined in advance. The absorbance measurement wavelength is usually 340 nm to 1000 nm, preferably 500 nm to 900 nm. The time during which the latex agglutination reaction is measured can be measured by the rate at which the latex agglutination reaction is occurring, or the amount of change over a certain period of time. For example, when measuring the absorbance, it can be measured by the absorbance change rate per hour from 30 seconds to 5 minutes after the start of the latex agglutination reaction, or the absorbance change amount for a fixed time. The reaction temperature is preferably 10 to 50 ° C, more preferably 20 to 40 ° C. The reaction time can be appropriately determined. For example, in a general-purpose automatic analyzer, the reaction time can be measured with a reaction time of 10 to 15 minutes. A person skilled in the art can analyze a reaction temperature, a reaction time, a measurement wavelength, a measurement time, a reagent configuration, a latex concentration, and a latex-immobilized monoclonal antibody according to a known method in an analysis using an optical instrument or a general-purpose automatic analyzer. The concentration and various additive concentrations can be determined as appropriate.
本発明に用いられるラテックス粒子の濃度は、ラテックス凝集法による免疫学的測定試薬に適用できる濃度であれば特に限定されるものではないが、ＴＡＴを測定するために必要な反応時のラテックス粒子の濃度は０．００５ｗ／ｖ％〜０．２ｗ／ｖ％が好ましく、０．０１ｗ／ｖ％〜０．１ｗ／ｖ％であることがより好ましい。 The concentration of latex particles used in the present invention is not particularly limited as long as it is a concentration applicable to an immunoassay reagent by latex agglutination method, but the latex particles at the time of reaction necessary for measuring TAT are not limited. The concentration is preferably 0.005 w / v% to 0.2 w / v%, and more preferably 0.01 w / v% to 0.1 w / v%.
本発明の試薬に適用することのできる被検試料は、ＴＡＴを含有する可能性のある被検試料である限り、特に限定されるものではないが、生体試料であることが好ましく、培養細胞でもよいが、血清、血漿の測定に特に好適に使用できる。哺乳動物由来の試料であることが好ましく、ヒト由来の試料であることがより好ましい。 The test sample that can be applied to the reagent of the present invention is not particularly limited as long as it is a test sample that may contain TAT, but is preferably a biological sample, even a cultured cell. Although it is good, it can be particularly preferably used for measurement of serum and plasma. A sample derived from a mammal is preferable, and a sample derived from a human is more preferable.
本発明の試薬は、抗体を固定化したラテックス粒子や上記の緩衝液以外にも、ラテックス凝集法による免疫学的測定試薬に添加可能な添加剤、例えば、凝集促進剤、非特異反応抑制剤、増感剤などを更に含有することができる。本発明の試薬に添加可能な増感剤としては、アルギン酸ナトリウムやアルギン酸プロピレングリコールなどが挙げられる。また、本発明の試薬に添加可能な凝集促進剤としては、水溶性高分子やタンパク質が好適に用いられる。例えば、デキストランやデキストラン硫酸、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンなどの水溶性高分子や、ウシ血清アルブミンなどのアルブミン類、γ−グロブリンなどのグロブリン類が挙げられる。 The reagent of the present invention is an additive that can be added to an immunological measurement reagent by latex agglutination, in addition to latex particles immobilized with an antibody and the above-mentioned buffer solution, for example, an aggregation accelerator, a nonspecific reaction inhibitor, A sensitizer and the like can be further contained. Examples of the sensitizer that can be added to the reagent of the present invention include sodium alginate and propylene glycol alginate. As the aggregation promoter that can be added to the reagent of the present invention, water-soluble polymers and proteins are preferably used. Examples include water-soluble polymers such as dextran, dextran sulfate, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, and polyvinylpyrrolidone, albumins such as bovine serum albumin, and globulins such as γ-globulin.
また、第３の抗体を添加して使用することもできる。第３の抗体の使用は、例えば、ＴＡＴ測定試薬の測定可能範囲を低濃度から高濃度まで広く測定可能としたい場合において、反応速度の異なる抗体を第３の抗体として使用することが好ましく用いられる。 Further, a third antibody can be added and used. The use of the third antibody is preferably performed by using an antibody having a different reaction rate as the third antibody, for example, when it is desired that the TAT measurement reagent can be widely measured from a low concentration to a high concentration. .
本発明の試薬に添加可能な非特異反応抑制剤としては、非特異反応の原因物質に対する抗体やレセプター、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液又はグッド緩衝液などの緩衝液類、ＥＤＴＡ、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＧＴＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰなどのキレート剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムなどの塩類、脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキ
シエチレンアルキルフェニルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、アルキルモノグリセリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、アルキルグリコシドなどの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
Nonspecific reaction inhibitors that can be added to the reagent of the present invention include antibodies and receptors for substances causing nonspecific reactions, Tris buffer, phosphate buffer, glycine buffer, borate buffer, citrate buffer, Buffers such as acetate buffer or Good buffer, chelating agents such as EDTA, CyDTA, DTPA, EGTA, NTA, NTP, sodium chloride, potassium chloride, sodium sulfate, calcium sulfate, magnesium sulfate, calcium carbonate, sodium carbonate, etc. Salts, fatty acid diethanolamide, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, fatty acid sorbitan ester, alkyl polyglucoside, alkyl monoglyceryl ether, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, fatty acid alkanolamide, Nonionic surfactants such as Rukirugurikoshido the like.
本発明の試薬は、標準物質として使用し得るＴＡＴを含んでもよい。ＴＡＴは生体から精製されたＴＡＴでもよいし、遺伝子組み換えなどで合成されたＴＡＴでもよい。合成ＴＡＴとしては、例えば、生物製剤として入手可能なトロンビンとアンチトロンビンを試験管内でインキュベートして得ることができる。また、大腸菌や哺乳動物細胞、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞等において、既知の翻訳発現系を使用して発現させたものを回収して精製したものを混合してＴＡＴを合成することもできる。 The reagent of the present invention may contain TAT that can be used as a standard substance. TAT may be TAT purified from a living body, or TAT synthesized by gene recombination. Synthetic TAT can be obtained, for example, by incubating thrombin and antithrombin available as biologics in a test tube. In addition, TAT can be synthesized by mixing and purifying what was expressed using a known translational expression system in E. coli, mammalian cells, insect cells infected with baculovirus, and the like. .
実施例１ 合成ＴＡＴの調製
市販のヒトトロンビン製剤（日本血液製剤機構製）とアンチトロンビン製剤（日本血液製剤機構製）をＰＢＳ（ダルベッコＰＢＳ（−）粉末「ニッスイ（日水製薬株式会社製）」、を９．６ｇ／Ｌで溶解）で希釈し、１：３のモル比で混合後、３７℃で３０分間反応させた。３０分後、ＤＦＰ（フルオロリン酸ジイソプロピル、和光純薬社製）を０．７５ｍＭになるように添加し反応を停止した。
得られた反応物には未反応のトロンビン、アンチトロンビンが含まれるため、予め５００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した
Ｈｉｌｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ（ＧＥヘルスケア社製）によって精製した。
ＴＡＴ画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、回収した。得られたＴＡＴは０．５％のＢＳＡを含む生理食塩水で希釈し、ＣＬＥＩＡ試薬（ステイシア(登録商標) ＣＬＥＩＡ
ＴＡＴ、ＬＳＩメディエンス社製）を用いて値付けした。これを合成ＴＡＴとして使用した。
Example 1 Preparation of Synthetic TAT Commercial human thrombin preparation (manufactured by Japan Blood Products Organization) and antithrombin preparation (manufactured by Japan Blood Products Organization) were PBS (Dulbecco PBS (−) powder “Nissui (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.)” , Dissolved at 9.6 g / L), mixed at a molar ratio of 1: 3, and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. After 30 minutes, DFP (diisopropyl fluorophosphate, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to 0.75 mM to stop the reaction.
Since the obtained reaction product contains unreacted thrombin and antithrombin, Hiload 26/60 Superdex 200 HR (GE Health) previously equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 500 mM NaCl. Purified by Care).
The TAT fraction was collected after confirmation by SDS-PAGE. The obtained TAT was diluted with physiological saline containing 0.5% BSA, and CLEIA reagent (Stacea (registered trademark) CLEIA) was used.
The price was determined using TAT (manufactured by LSI Medience). This was used as a synthetic TAT.
実施例２ 抗ＴＡＴ抗体の調製
細胞融合法は、安藤民衛・岩崎辰夫/著「単クローン抗体/ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ」（講談社）に従って実施した。
実施例１で調製した合成ＴＡＴ ５０μｇをフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ
社製）と混合し、投与抗原とした。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、４週令）に２週間間隔で３回投与し、４回目の投与は半量の２５μｇを静注した。
１週間後、脾臓よりリンパ球を分離し、ミエローマ細胞Ｐ３ｘ６３−Ａｇ．８と混合した後、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００、メルク社製）を用いて細胞融合を実施した。
ＨＡＴ選択培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後目的の抗体を産生しているハイブリドーマを合成ＴＡＴに対する結合活性を指標にスクリーニングした。すなわち、０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で合成ＴＡＴをそれぞれ０．２μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ＮＵＮＣ社製）に５０μＬ／ウェル添加した。４℃、Ｏｖｅｒ Ｎｉｇｈｔで反応後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗
浄し、１．０％ＢＳＡを含むＰＢＳを各ウェルに１００μＬ添加しブロッキングを行った。
次に、培養上清各ウェルに５０μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた後、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノ
グロブリン抗体（Ｄａｋｏ社製）を、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで１０
００倍に希釈し、各ウェルに５０μＬ添加した。
３７℃、１時間反応後、同様に５回洗浄しｏ−フェニレンジアミン溶液（和光純薬社製
）を各ウェル５０μＬ添加した。室温で５〜１０分間反応後、２Ｎ硫酸溶液で反応を停止した。
プレート分光光度計（ＥＬ３１２ｅ、ＢＩＯ−ＴＥＫ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製）
で４９２ｎｍの吸光度を測定した。合成ＴＡＴとの反応が良好な抗体を産生している細胞を選択し、限界希釈法によりクローニングを行った。１０日後、スクリーニングを行い、合成ＴＡＴと反応する抗体を産生するハイブリドーマを取得した。
Example 2 Preparation of Anti-TAT Antibody The cell fusion method was performed according to Tamie Ando and Ikuzaki Ikuzaki / Author “Monoclonal Antibody / Hybridoma and ELISA” (Kodansha).
50 μg of the synthetic TAT prepared in Example 1 was mixed with Freund's complete adjuvant (DIFCO).
To be administered antigen.
BALB / c mice (female, 4 weeks old) were administered 3 times at 2-week intervals, and the fourth dose was intravenously injected with a half amount of 25 μg.
One week later, lymphocytes were isolated from the spleen and myeloma cells P3x63-Ag. After mixing with No. 8, cell fusion was performed using polyethylene glycol (PEG 4000, manufactured by Merck).
Hybridomas were selected using a HAT selection medium, and one week later, hybridomas producing the desired antibody were screened using the binding activity to synthetic TAT as an indicator. Specifically, synthetic TAT was diluted to 0.2 μg / mL with 0.05 M carbonate buffer (pH 9.5), and 50 μL / well was added to an immunoplate (Maxisorp, manufactured by NUNC). After reacting at 4 ° C. and Over Night, the plate was washed 3 times with PBS containing 0.05% Tween-20, and 100 μL of PBS containing 1.0% BSA was added to each well for blocking.
Next, 50 μL was added to each well of the culture supernatant and reacted at 37 ° C. for 1 hour, and then 0.05%
Washed 3 times with PBS containing Tween-20. Peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (manufactured by Dako) was added 10% with PBS containing 0.05% Tween-20.
Dilute 00 times and add 50 μL to each well.
After reacting at 37 ° C. for 1 hour, the well was washed 5 times in the same manner, and 50 μL of an o-phenylenediamine solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to each well. After reacting for 5 to 10 minutes at room temperature, the reaction was stopped with a 2N sulfuric acid solution.
Plate spectrophotometer (EL312e, manufactured by BIO-TEK INSTRUMENTS)
The absorbance at 492 nm was measured. Cells producing antibodies with good reaction with synthetic TAT were selected and cloned by limiting dilution. Ten days later, screening was performed to obtain a hybridoma that produces an antibody that reacts with synthetic TAT.
実施例３ 抗トロンビン抗体の調製
実施例２と同様の方法で免疫抗原をトロンビンとして、抗トロンビン抗体を得た。トロンビンに対して特異的に反応する抗体を選択し、このうちの１クローンを抗トロンビン抗体（Ｔ−１）として使用した。
Example 3 Preparation of anti-thrombin antibody An anti -thrombin antibody was obtained in the same manner as in Example 2 using immunizing antigen as thrombin. An antibody that specifically reacts with thrombin was selected, and one of these clones was used as an antithrombin antibody (T-1).
実施例４ 間接阻害ＥＬＩＳＡによる抗体特異性の評価
間接阻害ＥＬＩＳＡ法によって、各抗体の反応性の評価を行った。間接阻害ＥＬＩＳＡ法による反応系の模式図を図２に示す。
評価しようとする０．０４〜０．４μｇ／ｍＬの濃度のＴＡＴを認識する抗体（抗ＴＡＴ抗体）候補を阻害抗原（プロトロンビン（エンザイムリサーチ社製）、トロンビン、アンチトロンビン、合成ＴＡＴ）と混合し、インキュベートした。一部阻害された該抗体候補を一次抗体として、９６ウェルプレートに固相化した合成ＴＡＴと結合させた。さらにペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（Ｄａｋｏ社製）を二次抗体として結合させ、発色基質を添加し吸光度を測定した。また、発色の変化率から、抗体の残存率を計算した。
特定の抗体（ＴＡＴ−５）について、各阻害抗原を用いた時の吸光度を表１に、吸光度から計算された抗体の残存率を表２に示した。
例えば、ＴＡＴの阻害抗原濃度が１０μｇ／ｍＬの時の残存率は、２８５／１０６６×１００＝２６．７（％）となる。各抗体の各抗原濃度について残存率を算出した。なお、表中において、Ｐｒｏ−Ｔはプロトロンビンを、Ｔはトロンビンを、ＡＴはアンチトロンビンを示す。
Example 4 Evaluation of Antibody Specificity by Indirect Inhibition ELISA Reactivity of each antibody was evaluated by an indirect inhibition ELISA method. A schematic diagram of the reaction system by the indirect inhibition ELISA is shown in FIG.
An antibody (anti-TAT antibody) candidate that recognizes TAT at a concentration of 0.04 to 0.4 μg / mL to be evaluated is mixed with an inhibitory antigen (prothrombin (enzyme research), thrombin, antithrombin, synthetic TAT). Incubated. The partially inhibited antibody candidate was bound as a primary antibody to synthetic TAT immobilized on a 96-well plate. Further, a peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (manufactured by Dako) was bound as a secondary antibody, a chromogenic substrate was added, and the absorbance was measured. In addition, the residual ratio of the antibody was calculated from the color change rate.
For a specific antibody (TAT-5), the absorbance when each inhibitory antigen was used is shown in Table 1, and the residual ratio of the antibody calculated from the absorbance is shown in Table 2.
For example, the residual rate when the TAT inhibitory antigen concentration is 10 μg / mL is 285/1066 × 100 = 26.7 (%). The residual rate was calculated for each antigen concentration of each antibody. In the table, Pro-T represents prothrombin, T represents thrombin, and AT represents antithrombin.
また、アンチトロンビン ５０ μｇ／ｍＬで阻害をかけた時の残存率と同等の阻害率となるＴＡＴ抗原量を算出し比較することで、アンチトロンビンに対するＴＡＴの反応性差（倍率）を求めた。この違いが大きければ、アンチトロンビンと比較しＴＡＴに対する特異性が強いこと意味する。計算はＴＡＴの阻害曲線（阻害抗原添加濃度対数-残存率％）
を描き、スプライン関数を用いておこなった。
例えば、ＴＡＴ−５の場合、アンチトロンビン ５０ μｇ／ｍＬの残存率は、７４．０％でありその残存率と同様となるＴＡＴ抗原量は１．１４４ μｇ／ｍＬである。すなわ
ち、反応性の差は５０／１．１４４＝４４倍となる。（図３）。
Moreover, the TAT antigen amount which becomes the inhibition rate equivalent to the residual rate when inhibiting with antithrombin 50 microgram / mL was calculated, and the TAT reactivity difference (magnification) with respect to antithrombin was calculated | required. If this difference is large, it means that the specificity for TAT is stronger than that of antithrombin. Calculation is TAT inhibition curve (logarithm of concentration of inhibitory antigen-remaining rate%)
Was drawn using a spline function.
For example, in the case of TAT-5, the residual rate of 50 μg / mL of antithrombin is 74.0%, and the amount of TAT antigen that is similar to the residual rate is 1.144 μg / mL. That is, the difference in reactivity is 50 / 1.144 = 44 times. (Figure 3).
その他、抗体クローン２７種類について上記倍率の計算を行った。添加ＴＡＴとアンチトロンビンの量の違い（倍率）が１００倍以上となる抗体は１３種類、１０００倍以上となる抗体は7種類、１００００倍以上となる抗体は２種類存在した。５種類の抗体につい
て、表３に示す。
In addition, the above magnification was calculated for 27 types of antibody clones. There were 13 types of antibodies in which the difference (magnification) between the amount of added TAT and antithrombin was 100 times or more, 7 types of antibodies having 1000 times or more, and 2 types of antibodies having 10,000 times or more. Table 5 shows the five types of antibodies.
実施例５ ラテックス凝集法試薬によるＴＡＴ反応性の評価
実施例４の間接阻害ＥＬＩＳＡで評価したアンチトロンビン側抗体（ＴＡＴ−１、ＴＡＴ−２、ＴＡＴ−３、ＴＡＴ−４、ＴＡＴ−５）および実施例３で得たトロンビン側抗体（Ｔ−１）をラテックス粒子に感作してその反応性を評価した。
抗体のラテックス粒子への感作はそれぞれの抗体を０．３２μｍのポリスチレンラテックス粒子に吸着させ、０．３％ ＢＳＡ溶液でブロッキング処理をしたのち遠心処理により０．０５％ アジ化ナトリウム（キシダ化学社製）溶液で洗浄後、再度０．０５％ アジ
化ナトリウム溶液に分散させて行った。
上記で作製した抗体を感作したラテックス粒子を含む試薬を調製し、ＴＡＴに対する反応性を評価した。使用した試薬の組成は、以下の通りである。第１試薬には、１００ｍＭ
Ｂｉｓ−tｒｉｓ（同仁化学社製） ｐＨ６．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１５％ ＢＳＡを使用した。第２試薬には、各抗体感作粒子が波長７００ｎｍにおける吸光度が１．０になるように０．０５％アジ化ナトリウム溶液で希釈し混合したものを使用した。
血清中には多量のＴＡＴが含まれるため、これを０．５％のＢＳＡを含む生理食塩水で希釈しＣＬＥＩＡ試薬で値付けをしたものを血清ＴＡＴとして使用した。測定用試料としては、値付けされた血清ＴＡＴをプール血漿（ＶＩＴＲＯ ＬＯＧＩＣ社製）でＴＡＴ濃度が１０００ｎｇ／ｍＬになるように希釈したものを使用した。
測定機器としては７１７０Ｓ（日立ハイテクノロジーズ社製）を使用した。測定用パラメータは、サンプル量１２μＬ、第１試薬９０μＬ、第２試薬９０μＬ、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍに設定し、測光ポイント３４ポイント目の吸光度から２０ポイント目の吸光度を差し引き１００００倍したものをΔＡｂｓとして測定を実施した。
結果を図４に示す。表３で示した５種類の抗体はいずれも、ＴＡＴ無添加に対してＴＡＴ １０００ｎｇ／ｍＬの反応性がΔＡｂｓで１００以上であった。
表３におけるＴＡＴ−１、ＴＡＴ−２、ＴＡＴ−３は、ラテックス凝集法で高い反応性が確認できた。また、ＴＡＴ−４、ＴＡＴ−５の抗体についても、前記ＴＡＴ−１、ＴＡＴ−２、ＴＡＴ−３より小さいものの反応性が確認された。
Example 5 Evaluation of TAT reactivity with latex agglutination method reagents Antithrombin side antibodies (TAT-1, TAT-2, TAT-3, TAT-4, TAT-5) evaluated by the indirect inhibition ELISA of Example 4 and execution The thrombin antibody (T-1) obtained in Example 3 was sensitized to latex particles, and the reactivity was evaluated.
Sensitization of antibody with latex particles is performed by adsorbing each antibody to 0.32 μm polystyrene latex particles, blocking with 0.3% BSA solution, and then centrifugation to 0.05% sodium azide (Kishida Chemical Co., Ltd.). The product was washed with a solution and then dispersed again in a 0.05% sodium azide solution.
Reagents containing latex particles sensitized with the antibody prepared above were prepared and evaluated for reactivity to TAT. The composition of the used reagent is as follows. For the first reagent, 100 mM
Bis-tris (manufactured by Dojindo) pH 6.0, 500 mM NaCl, 0.15% BSA was used. As the second reagent, each antibody-sensitized particle was diluted and mixed with a 0.05% sodium azide solution so that the absorbance at a wavelength of 700 nm was 1.0.
Since serum contains a large amount of TAT, the serum TAT diluted with physiological saline containing 0.5% BSA and priced with CLEIA reagent was used. As a sample for measurement, diluted serum TAT was used pooled plasma (manufactured by VITRO LOGIC) so that the TAT concentration was 1000 ng / mL.
7170S (manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation) was used as a measuring instrument. The measurement parameters are set to a sample amount of 12 μL, a first reagent of 90 μL, a second reagent of 90 μL, a main wavelength of 570 nm, and a sub wavelength of 800 nm, and the absorbance at the 34th point of the photometry point minus the absorbance at the 20th point multiplied by 10000 Measurements were performed as ΔAbs.
The results are shown in FIG. All of the five types of antibodies shown in Table 3 had a TAT 1000 ng / mL reactivity of 100 or more in ΔAbs with respect to the absence of TAT.
TAT-1, TAT-2 and TAT-3 in Table 3 were confirmed to be highly reactive by the latex agglutination method. In addition, the reactivity of TAT-4 and TAT-5 antibodies, which were smaller than those of TAT-1, TAT-2, and TAT-3, was confirmed.
実施例６ ラテックス凝集法試薬によるアンチトロンビンとの交差反応性評価
調製した試薬のアンチトロンビンとの交差反応性を実施例５に記載のヒト血清を０．５％ＢＳＡを含む生理食塩水で１０００ｎｇ／ｍＬに希釈したサンプル中に更にアンチトロンビンを２５０、５００μｇ/ｍＬになるように添加したサンプルを用いて評価した。
アンチトロンビン無添加のときの反応性と各濃度のアンチトロンビンを添加した時の反応性を比較した。
測定用試薬、測定機器、測定パラメータはいずれも実施例４と同様にして実施した。評価に使用した抗ＴＡＴ抗体の種類は、ＴＡＴ−１、ＴＡＴ−２、ＴＡＴ−３、ＴＡＴ−４、ＴＡＴ−５である。
ラテックス試薬によるアンチトロンビンへの交差反応性の評価結果を図５に示す。実施例４の間接阻害ＥＬＩＳＡで１００倍以上の特異性が得られた抗体（ＴＡＴ−１、ＴＡＴ−２、ＴＡＴ−３）はアンチトロンビン濃度５００μｇ/ｍＬ添加でも７０％以上の反応
性を保持していた。一方、１００倍以下の抗体（ＴＡＴ−４、ＴＡＴ−５）についてはアンチトロンビン濃度の増加に伴い、いずれも極端な反応性低下が認められた（図５）。
実施例５のラテックス凝集反応系において反応性が確認された各抗体について、ＥＬＩＳＡ法によって交差反応性を確認した結果、ＴＡＴ−１、ＴＡＴ−２、ＴＡＴ−３の各抗体ではラテックス凝集の両反応系において高い特異性が認められたのに対し、ＴＡＴ−４、ＴＡＴ−５の各抗体はラテックス凝集法で反応性は見られるものの、特異性が十分ではないことが明らかとなった。
従って、実施例４の間接阻害ＥＬＩＳＡによって確認した抗体の反応性の差が１００倍以上の時に、それらの抗体は試薬としての使用に非常に有用であることが認められた。
Example 6 Evaluation of Cross-reactivity with Antithrombin Using Latex Aggregation Reagent The cross-reactivity of the prepared reagent with antithrombin was determined by subjecting the human serum described in Example 5 to 1000 ng / in physiological saline containing 0.5% BSA. Evaluation was performed using a sample further diluted with antithrombin at 250 to 500 μg / mL in the sample diluted to mL.
The reactivity when no antithrombin was added and the reactivity when each concentration of antithrombin was added were compared.
The measurement reagents, measurement equipment, and measurement parameters were all the same as in Example 4. The types of anti-TAT antibodies used for evaluation are TAT-1, TAT-2, TAT-3, TAT-4, and TAT-5.
The evaluation result of the cross-reactivity to antithrombin by the latex reagent is shown in FIG. The antibodies (TAT-1, TAT-2, TAT-3) that obtained a specificity of 100 times or more in the indirect inhibition ELISA of Example 4 retained a reactivity of 70% or more even when an antithrombin concentration of 500 μg / mL was added. It was. On the other hand, as for the antibodies (TAT-4, TAT-5) of 100 times or less, as the antithrombin concentration increased, an extremely low reactivity was observed in all cases (FIG. 5).
About each antibody by which the reactivity was confirmed in the latex agglutination reaction system of Example 5, as a result of confirming cross-reactivity by ELISA method, both reactions of latex agglutination were obtained for each antibody of TAT-1, TAT-2 and TAT-3. While high specificity was observed in the system, it was revealed that the antibodies of TAT-4 and TAT-5 were not sufficiently specific although reactivity was observed in the latex agglutination method.
Therefore, when the difference in the reactivity of the antibodies confirmed by the indirect inhibition ELISA of Example 4 was 100 times or more, those antibodies were found to be very useful for use as a reagent.
実施例７ 第１試薬ｐＨの影響
ラテックス試薬のｐＨによる反応性への影響を、ｐＨ５．７〜７．２の間で変えて評価した。
試薬組成としては、第１試薬として１００ｍＭ Ｂｉｓ−ｔｒｉｓまたはＭＥＳ（同仁化学社製）、７００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１５％ ＢＳＡ、０．２０％ アルギン酸ナトリウム（和光純薬社製）、０．０５％ エマルゲン１５０（花王社製）、第２試薬としてアンチトロンビン側抗体にはＴＡＴ−１、トロンビン側抗体にはＴ−１を使用し、各抗体感作粒子が７００ｎｍにおける吸光度が１．０になるように０．０５％アジ化ナトリウム
溶液で希釈し混合した。ラテックス粒子への抗体感作は、粒径０．２０μｍの粒子を用いたこと以外は実施例５と同様に実施した。
測定対象サンプルの調製は、０．５％ ＢＳＡを含む生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅと表記
）、ヒトプール血漿（Ｐｌａｓｍａと表記）を使用した。また、ＣＬＥＩＡ試薬によって値付けされたヒト血清を、上記プール血漿で各濃度（１０、５０、１００ｎｇ／ｍＬ）に希釈したものを、ＴＡＴサンプルとした。測定機器、パラメータは実施例４と同様にしておこなった。
第１試薬の緩衝液としてＢｉｓ−ｔｒｉｓを使用し、ｐＨを６．０〜７．２の間で変化させた場合の反応性への影響は、以下のような傾向がみられた。まず、ｐＨ６．７でＳａｌｉｎｅ Ｂａｓｅが０以下となった（図６）。血漿ベースを差し引いたＴＡＴ反応性へ
の影響はｐＨが高くなると徐々に反応性が下がる傾向が見られた（図７）。
高感度にＴＡＴを測定できる試薬性能を目指して、ＴＡＴ濃度が５０ｎｇ／ｍＬの時のシグナル（ΔＡｂｓ）１００以上を１つの指標とすることとし、その場合、反応液中におけるｐＨは６．６以下が好ましいことが分かった（図７）。
更に、ブランクの抑制と反応性の両立を目指し、ｐＨ５．７〜６．２におけるブランク値への影響を調べた。その結果、ブランクの吸光度はＢｉｓ−ｔｒｉｓ、ＭＥＳいずれの緩衝液を用いた場合もｐＨが上昇すると低くなる傾向が見られた。特に、ｐＨ５．７から５．８の間での低下が大きく、ｐＨ６．０からｐＨ６．２の間で吸光度が１００以下となることが判明した（図８、９）。
ｐＨが高くなると、Ｓａｌｉｎｅブランク・Ｐｌａｓｍａブランク・ＴＡＴ反応性がｐＨ依存的に下がる傾向が見出された。ｐＨが中性よりも高いと反応性が落ちるというのは、本発明者らが見出した、意外な効果であった。
以上より、ブランク抑制の観点からはｐＨの下限が５．８で、ｐＨ６．２が特に好ましく、反応性維持の観点から、ｐＨの上限が６．６で、６．２が特に好ましいことが分かった。
Example 7 Effect of First Reagent pH The influence of the latex reagent pH on the reactivity was evaluated by changing the pH between 5.7 and 7.2.
As the reagent composition, 100 mM Bis-tris or MES (manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.), 700 mM NaCl, 0.15% BSA, 0.20% sodium alginate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.05% 150 (manufactured by Kao), TAT-1 for the antithrombin antibody as the second reagent, and T-1 for the thrombin antibody, so that each antibody-sensitized particle has an absorbance at 700 nm of 1.0. Diluted and mixed with 0.05% sodium azide solution. Antibody sensitization to latex particles was performed in the same manner as in Example 5 except that particles having a particle size of 0.20 μm were used.
For the preparation of the sample to be measured, physiological saline containing 0.5% BSA (denoted as Saline) and human pooled plasma (denoted as Plasma) were used. Moreover, what diluted the human serum quoted with the CLEIA reagent to each density | concentration (10, 50, 100 ng / mL) with the said pool plasma was made into the TAT sample. Measurement equipment and parameters were the same as in Example 4.
The influence on the reactivity when Bis-tris was used as the buffer solution of the first reagent and the pH was changed between 6.0 and 7.2 had the following tendency. First, Saline Base became 0 or less at pH 6.7 (FIG. 6). The effect on the TAT reactivity minus the plasma base tended to decrease gradually as the pH increased (FIG. 7).
Aiming at reagent performance capable of measuring TAT with high sensitivity, a signal (ΔAbs) of 100 or more when the TAT concentration is 50 ng / mL is set as one index. In that case, the pH in the reaction solution is 6.6 or less. Was found to be preferable (FIG. 7).
Furthermore, the influence on the blank value in pH 5.7-6.2 was investigated aiming at coexistence of suppression of a blank and reactivity. As a result, the absorbance of the blank tended to decrease as the pH increased in both the Bis-tris and MES buffer solutions. In particular, it was found that the decrease between pH 5.7 and 5.8 was large, and the absorbance was 100 or less between pH 6.0 and pH 6.2 (FIGS. 8 and 9).
It was found that the salin blank / plasma blank / TAT reactivity decreased in a pH-dependent manner as the pH increased. Reducing the reactivity when the pH is higher than neutral was an unexpected effect found by the present inventors.
From the above, it can be seen that the lower limit of pH is 5.8 and pH 6.2 is particularly preferable from the viewpoint of blank suppression, and the upper limit of pH is 6.6 and 6.2 is particularly preferable from the viewpoint of maintaining reactivity. It was.
実施例８ 臨床検体を用いた相関試験
臨床検体を使用して、本発明のＴＡＴ測定ラテックス試薬が、血中のＴＡＴ濃度測定に使用することができるか検証した。
試薬組成は以下の通り調製したものを使用した。１００ｍＭ Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ ｐＨ６．２、７００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ エマルゲン１５０、０．２０％ アルギン酸ナトリウム、０．１５％ ＢＳＡを第１試薬とした。第２試薬には実施例７と同様のものを使用した。
対照試薬には、ＣＬＥＩＡ試薬を用いて測定した。標準品には、ＴＡＴキャリブレーター（ＬＳＩメディエンス社製）をラテックス試薬、ＣＬＥＩＡ試薬ともに使用した。
使用検体は、クエン酸血漿２０検体を使用した。測定機器、パラメータはいずれも実施例４と同様にして測定した。ＣＬＥＩＡ試薬の測定機器はＳＴＡＣＩＡ（ＬＳＩメディエンス社製）を使用し、添付文書記載のパラメータに準じて測定を実施した。
両試薬によって測定された結果について図１０に示した。
本発明によるラテックス試薬は、３ｎｇ／ｍＬ〜１２０ｎｇ／ｍＬの範囲で、臨床検体でも従来のＣＬＥＩＡ試薬による測定試薬と良好な相関性を示した。本発明を用いればＢ／Ｆ分離などの処理を行うことなく、高感度に臨床検体での測定が可能である。
Example 8 Correlation Test Using Clinical Specimens Using clinical specimens, it was verified whether the TAT measurement latex reagent of the present invention can be used for measuring TAT concentration in blood.
The reagent composition prepared as follows was used. 100 mM Bis-tris pH 6.2, 700 mM NaCl, 0.05% Emulgen 150, 0.20% sodium alginate, 0.15% BSA were used as the first reagent. The same second reagent as in Example 7 was used.
As a control reagent, measurement was performed using CLEIA reagent. As a standard product, a TAT calibrator (manufactured by LSI Medience) was used with both a latex reagent and a CLEIA reagent.
The sample used was 20 citrate plasma samples. The measurement equipment and parameters were measured in the same manner as in Example 4. As a measuring instrument of CLEIA reagent, STACIA (manufactured by LSI Medience) was used, and measurement was carried out according to the parameters described in the package insert.
The results measured with both reagents are shown in FIG.
The latex reagent according to the present invention was in the range of 3 ng / mL to 120 ng / mL, and clinical samples showed a good correlation with the measurement reagent using the conventional CLEIA reagent. By using the present invention, it is possible to measure a clinical sample with high sensitivity without performing processing such as B / F separation.
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