JP6609444B2 - 血管病変の評価方法および血管病変評価用キット - Google Patents
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Description
イヌ正常血管内皮細胞(CnAOEC細胞)およびイヌ血管肉腫由来培養細胞(Re12細胞、およびUd6細胞)を用いて、培養中に培地に分泌されたバイオマーカー(miR−214、miR−126)および内在性コントロール(RNU6B)の発現レベルを測定した。
イヌ正常血管内皮細胞(CnAOEC細胞)は、CELL APPLICATIONS社より購入した。
1×106cell/mlの濃度で6ウェルプレートに播種した細胞を、上記条件で48時間培養した。次いで、培養後の培地をすべて回収し、NucleoSpin miRNA(タカラバイオ株式会社)を用いて低分子RNAを回収した。PrimeScript(登録商標)RT reagent kit(タカラバイオ株式会社)を用いて、回収したRNAの逆転写反応を行い、得られたcDNAをバイオマーカー(miR−214、miR−126)および内在性コントロール(RNU6B;RNA, U6B small nuclear)の発現レベル測定用試料とした。
イヌの健康群(n=10)、非腫瘍性脾疾患群(n=9)、および血管肉腫罹患群(n=10)から、それぞれ3〜4mlの血液を採血管(エチレンジアミン四酢酸−2ナトリウム処理)に回収した。血液から速やかに血漿を回収し、使用時まで−80℃にて保管した。血漿サンプルからNucleoSpin miRNA(タカラバイオ株式会社)を用いて低分子RNAを回収した。内在性コントロールとしてmiR−16を用いた以外は実施例1と同様の手法により、バイオマーカー(miR−214、miR−126)および内在性コントロール(miR−16)の発現レベルを測定した。
実施例2で用いた血管肉腫罹患群のうち3個体について、腫瘍摘出手術を行った。腫瘍摘出手術前後における血漿中のバイオマーカーの発現レベルを測定した。具体的には、血管肉腫罹患個体であるHSA3、HSA6およびHSA8から、手術当日を0日目として、初診時から術前日までに採血した。それぞれの個体から腫瘍摘出手術を行い、20日目(HSA3)、21日目(HSA6)または15日目(HSA8)に再度採血した。回収した血液から血漿を調製し、上記と同様の手法によりバイオマーカー(miR−214、miR−126)および内在性コントロール(miR−16)の発現レベルを測定した。
ヒト血管内皮細胞(HMEC1細胞)およびヒト血管肉腫由来培養細胞(ISO−HAS細胞、およびHAMON細胞)を用いて、培養中に培地に分泌されたバイオマーカー(miR−214、miR−126)および内在性コントロール(miR−16)の発現レベルを測定した。
HMEC1細胞(ヒト血管内皮細胞)は、MCDB131培地(10ng/ml EGF、1μg/mlハイドロコルチゾン、10mMグルタミン、10%(v/v)ウシ胎児血清を含む)にて培養した。ISO−HAS細胞(ヒト血管肉腫由来培養細胞、International Journal of Cancer (1999),81(2)305〜308参照)は、DME培地(15%(v/v)ウシ胎児血清、50%(v/v)ISOS−1細胞培養上清(15%(v/v)ウシ胎児血清を含むDME培地でISOS−1細胞を3〜4日培養し、0.22μmフィルタでろ過して回収)を含む)にて培養した。HAMON細胞(ヒト血管肉腫由来培養細胞、Journal of Dermatological Science (2013),70(2),116〜122参照)は、DME培地(牛胎児血清10%を含む)にて培養した。
1〜2×105cell/mlの濃度で6ウェルプレートに播種した細胞を、37℃のインキュベーター(95%空気/5%CO2)内で48時間培養した。培養後の培地を回収し、以下のプライマーおよびプローブを用いて実施例1、2に準じてバイオマーカー(miR−214、miR−126)および内在性コントロール(miR−16)の発現レベルを測定した。
Claims (8)
- 被験者における血管病変の評価方法であって、
前記被験者から分離した生体試料中のバイオマーカー発現レベルを測定すること、および
前記バイオマーカー発現レベルを基準値と比較することを含み、
前記バイオマーカー発現レベルが、前記基準値以下の場合は血管病変を有しない指標であるとし、前記基準値を超える場合は血管病変を有する指標であるとし、前記基準値は健常な個体から分離した生体試料中のバイオマーカー発現レベルであり、
前記血管病変が、血管肉腫であり、
前記バイオマーカーが、miR−214およびmiR−126からなる群から選択される、血管病変の評価方法。 - 被験者における血管病変の評価方法であって、
前記被験者から分離した生体試料中のバイオマーカー発現レベルを測定すること、および
前記バイオマーカー発現レベルを基準値と比較することを含み、
治療的処置後の前記被験者から分離した生体試料中の前記バイオマーカー発現レベルが、前記基準値未満のときは血管病変を有しない指標であるとし、前記基準値以上のときは血管病変を有する指標であるとし、前記基準値は当該治療的処置前における同一被験者から分離した生体試料中のバイオマーカー発現レベルであり、
前記血管病変が、血管肉腫であり、
前記バイオマーカーが、miR−214およびmiR−126からなる群から選択される、血管病変の評価方法。 - 前記バイオマーカーとして、miR−214およびmiR−126の発現レベルを測定する、請求項1または2に記載の血管病変の評価方法。
- 前記発現レベルの測定が、核酸増幅法、マイクロアレイ法、またはノーザンブロット法により行われる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の血管病変の評価方法。
- 前記生体試料中の内在性コントロール発現レベルを測定すること、および
当該内在性コントロール発現レベルにより補正した前記バイオマーカー発現レベルを前記基準値と比較する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の血管病変の評価方法。 - 前記生体試料が、血液、血漿、および血清からなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の血管病変の評価方法。
- miR−214およびmiR−126であるバイオマーカーの検出物質を含む、血管肉腫評価用キット。
- 前記検出物質が、核酸増幅用プライマー、またはプローブである、請求項7に記載の血管肉腫評価用キット。
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