JP6597988B2 - Aqueous solution containing ozone nanobubbles, method for producing the same, and use of the aqueous solution containing ozone nanobubbles - Google Patents
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Description
本発明は、細胞培養液、生理食塩水、輸液及び点眼薬のいずれかの液体に含まれる水溶液として使用することを主な用途としており、前記細胞培養液中での細胞培養又は前記生理食塩水、輸液若しくは点眼薬の生体への投与において、生体内組織の細胞等の細菌感染やウイルス感染を治療することができるだけでなく、細菌やウイルスの発生を防止又は抑制することができる殺菌性又は抗菌性を有する、オゾンナノバブルを含む水溶液とその製造方法及び前記オゾンナノバブルを含む水溶液の使用に関する。 The main use of the present invention is as an aqueous solution contained in any one of a cell culture solution, physiological saline, infusion, and eye drops, and the cell culture in the cell culture solution or the physiological saline In addition, in the administration of infusions or eye drops to the living body, bactericidal or antibacterial can not only treat bacterial infections and viral infections of cells in tissues in the body, but also prevent or suppress the generation of bacteria and viruses The present invention relates to an aqueous solution containing ozone nanobubbles, a method for producing the same, and the use of the aqueous solution containing ozone nanobubbles.
マイクロ・ナノバブルは、非特許文献１に記載されているように、（ａ）気泡径が小さいこと、（ｂ）上昇速度が遅いこと、（ｃ）摩擦抵抗を低減すること、（ｄ））気泡内圧力が高いこと、（ｅ）気液界面が大きいこと、（ｆ）ガスの溶解量が大きいこと、（ｇ）溶解、収縮を伴うことと、及び（ｈ）気泡表面が負に帯電していること、等の様々な特徴を有する。特に、ナノバブルは粒径が１μｍ未満と非常に小さく、ナノバブルを含む液体では目視確認ができず無色透明になること、粒子径が小さくなるほど浮力が粘性力に比べて非常に小さくなるため、上面に浮上しないで液体中に超微細バブルのままで長期間存在できること、等が知られている。ナノバブルは、これらの特徴を利用して医療分野への応用が期待されており、その中でもオゾンナノバブルを含む水溶液は強力な力価や殺菌又は抗菌の効果を有することから様々な用途への適用が検討されている。 As described in Non-Patent Document 1, the micro / nano bubbles are (a) a small bubble diameter, (b) a low ascending speed, (c) reducing frictional resistance, (d)) a bubble. The internal pressure is high, (e) the gas-liquid interface is large, (f) the amount of dissolved gas is large, (g) is accompanied by dissolution and contraction, and (h) the bubble surface is negatively charged. And so on. In particular, nanobubbles have a very small particle size of less than 1 μm, and liquids containing nanobubbles cannot be visually confirmed and become colorless and transparent, and as the particle size decreases, the buoyancy becomes very small compared to the viscous force. It is known that it can exist for a long period of time in a liquid as it is without being floated. Nanobubbles are expected to be applied to the medical field by utilizing these characteristics. Among them, aqueous solutions containing ozone nanobubbles have strong potency, sterilization, or antibacterial effects, so that they can be applied to various applications. It is being considered.
例えば、特許文献１には、気泡径が５０〜５００ｎｍの大きさを有し、生物に対する活性効果や殺菌効果等を有するオゾンナノバブルを含む水溶液が開示されており、具体的に、気泡径の中心粒径が約１４０ｎｍ（標準偏差約３０ｎｍ）のオゾンナノバブルを含む水溶液を温泉源水の殺菌のために適用し、温泉源水中の菌数の変化を調べた結果、十分な殺菌効果を有することが記載されている。 For example, Patent Document 1 discloses an aqueous solution containing ozone nanobubbles having a bubble diameter of 50 to 500 nm and having an activity effect and a bactericidal effect on a living organism. Specifically, the center of the bubble diameter is disclosed. As a result of applying an aqueous solution containing ozone nanobubbles having a particle size of about 140 nm (standard deviation about 30 nm) for sterilization of hot spring source water and examining the change in the number of bacteria in the hot spring source water, it has a sufficient sterilization effect. Are listed.
非特許文献２には、オゾンナノバブル水の強力な殺菌効果を利用して、オゾンナノバブル水を歯周治療へ応用することが提案されている。非特許文献２に記載の治療法は、オゾンナノバブル水として工業用や水産加工用として入手可能なものがそのまま使用されている。 Non-Patent Document 2 proposes that ozone nanobubble water is applied to periodontal treatment using the strong bactericidal effect of ozone nanobubble water. As the treatment method described in Non-Patent Document 2, an ozone nanobubble water that is available for industrial use or fishery processing is used as it is.
また、特許文献２には、消化管感染性疾患の治療や、低侵襲の外科手術前処置としての消化管殺菌等のために、塩分濃度が０．９％又はその近傍の値の水中に、安定したオゾンナノバブルを含有する医療用オゾンナノバブル水が提案されている。前記特許文献１に記載の医療用オゾンナノバブル水は、結腸の洗浄に使用した場合に、特異的な粘膜除去効果によりウイルス感染した粘膜上皮のみを除去して、健常な粘膜再生に寄与する効果を有するものである。 In Patent Document 2, for treatment of gastrointestinal infectious diseases, gastrointestinal sterilization as a minimally invasive surgical pretreatment, etc., in a water having a salt concentration of 0.9% or in the vicinity thereof, Medical ozone nanobubble water containing stable ozone nanobubbles has been proposed. When used for washing the colon, the medical ozone nanobubble water described in Patent Document 1 has an effect of removing only the mucosal epithelium infected with a virus by a specific mucosal removal effect and contributing to healthy mucosal regeneration. It is what you have.
一方、オゾンナノバブルを含む水溶液は、上記のような生体内の殺菌又は抗菌だけでなく、癌の治療又は予防のための薬剤としても提案されている。例えば、特許文献３には実施例１において、オゾンナノバブル水及び酸素ナノバブル水とオゾンナノバブル水とを混合した塩分濃度が０．３質量％であるナノバブル水を癌の治療又は予防に適用することが提案されている。このときに使用するナノバブル水は、特許文献１及び４に記載の方法によって製造することが記載されている。
On the other hand, an aqueous solution containing ozone nanobubbles has been proposed not only for in vivo sterilization or antibacterial as described above, but also as a drug for treating or preventing cancer. For example, in Example 1, it is possible to apply nanobubble water having a salt concentration of 0.3% by mass obtained by mixing ozone nanobubble water, oxygen nanobubble water, and ozone nanobubble water to treatment or prevention of cancer in Patent Document 3. Proposed. It is described that the nanobubble water used at this time is manufactured by the methods described in
上記に示すように、オゾンナノバブルを含む水溶液を殺菌又は抗菌のために洗浄や医療の用途に適用することは従来から検討されており、周知の技術である。オゾンは強い酸化力を有するため優れた殺菌性を有するが、他方でオゾンに触れた生体内組織は細胞への侵襲が大きく、場合によっては細胞組織の損傷又は損害が大きくなることが避けられない。また、オゾンは空気中に揮発しやすい性状を有するため、ナノバブルの気泡径が大きい場合には、使用中にオゾンの揮発による殺菌力の低下が短期間にみられる場合がある。そのため、オゾンナノバブルに含む水溶液は、一定の殺菌又は抗菌の効果を常時得るために十分な注意を払う必要があり、使用時及び保管時の取扱い性及びメンテナンス性が劣るという課題がある。加えて、オゾンの使用は侵襲性が高くなる傾向にあり、生体組織の適用箇所によっては高侵襲性の問題を十分に考慮する必要がある。したがって、オゾンナノバブルに含む水溶液は従来からよく知られているものの、その適用範囲が限定されるため実際の適用が進んでいない。例えば、生体内組織の細胞等の殺菌又は抗菌を行う用途にはほとんど適用されていないのが実情である。 As described above, applying an aqueous solution containing ozone nanobubbles for cleaning or medical purposes for sterilization or antibacterial has been studied and is a well-known technique. Ozone has excellent bactericidal properties due to its strong oxidizing power, but on the other hand, in vivo tissue exposed to ozone is highly invasive to cells, and in some cases, damage or damage to cellular tissues is unavoidable. . In addition, since ozone has a property of easily volatilizing in the air, when the bubble size of the nanobubbles is large, the sterilizing power may be lowered during use in a short period of time due to volatilization of ozone. Therefore, it is necessary to pay sufficient attention to the aqueous solution contained in the ozone nanobubbles in order to always obtain a certain sterilization or antibacterial effect, and there is a problem that handling and maintenance during use and storage are inferior. In addition, the use of ozone tends to be highly invasive, and it is necessary to fully consider the highly invasive problem depending on the application site of living tissue. Therefore, although the aqueous solution contained in ozone nanobubble is well known conventionally, since the application range is limited, actual application is not progressing. For example, the actual situation is that it is hardly applied to sterilization or antibacterial treatment of cells in living tissues.
前記特許文献１に記載されているオゾンナノバブルを含む水溶液は、気泡径が５０〜５００ｎｍであるため１ヶ月程度は殺菌又は抗菌の効果を維持できるものの、それ以上の期間ではその効果を維持することが困難になる。加えて、オゾンナノバブルを含む水溶液を保管した容器を一度開封した後や長期間の保管後は、オゾンの揮発により効果の低下が顕著になるため、容器に残ったオゾンナノバブルを含む水溶液を再利用することができない場合がある。また、前記特許文献１に記載されているオゾンナノバブルを含む水溶液は、殺菌効果が温泉源水を使用して調べられているに過ぎず、生体内組織に適用したときに損傷又は損害を与えずに殺菌ができるのか否かが不明である。この本発明者らの検討によると、オゾンの気泡径が５０ｎｍ以上である場合はオゾンを高濃度で含むため優れた殺菌力を期待できるが、逆に、侵襲性が高く細胞の損傷や損害が大きいため、生体内組織の細胞等の殺菌又は抗菌には適用できないことが分かった。 Although the aqueous solution containing ozone nanobubbles described in Patent Document 1 has a bubble diameter of 50 to 500 nm, the effect of sterilization or antibacterial can be maintained for about one month, but the effect is maintained for a longer period. Becomes difficult. In addition, after opening a container that contains an aqueous solution containing ozone nanobubbles or after a long-term storage, the effect of ozone volatilization will be significantly reduced, so the aqueous solution containing ozone nanobubbles remaining in the container will be reused. You may not be able to. In addition, the aqueous solution containing ozone nanobubbles described in Patent Document 1 is only examined for the bactericidal effect using hot spring source water, and does not cause damage or damage when applied to in vivo tissues. It is unclear whether or not it can be sterilized. According to the study by the present inventors, when the bubble diameter of ozone is 50 nm or more, it can be expected to have excellent bactericidal power because it contains ozone at a high concentration, but conversely, it is highly invasive and causes cell damage and damage. Since it is large, it has been found that it cannot be applied to sterilization or antibacterial treatment of cells in living tissues.
前記非特許文献２に記載されている歯周治療法は、工業用や水産加工用として入手可能なオゾンナノバブルが使用されており、含まれるオゾンの気泡径が１００ｎｍ以上であると考えられる。そのため、前記特許文献１に記載のオゾンナノバブルを含む水溶液と同様に、殺菌又は抗菌の効果が持続しづらく、また、生体組織への高侵襲性という問題の発生が避けられない。前記非特許文献２に記載の発明は、オゾンナノバブルを含む水溶液を用いて嗽（うがい）を所定の期間続けることにより歯周ポケットの改善を行うものであり、そもそも生体内組織の細胞等への適用を視野に入れたものではないと考えられる。 The periodontal treatment described in Non-Patent Document 2 uses ozone nanobubbles that are available for industrial use or fishery processing, and it is considered that the bubble diameter of the contained ozone is 100 nm or more. Therefore, like the aqueous solution containing ozone nanobubbles described in Patent Document 1, it is difficult to maintain the effect of sterilization or antibacterial effect, and the problem of high invasiveness to living tissue is unavoidable. The invention described in Non-Patent Document 2 is to improve the periodontal pocket by continuing gargle for a predetermined period using an aqueous solution containing ozone nanobubbles. The application is not considered.
前記特許文献２に記載の医療用オゾンナノバブル水は、塩分濃度を最適化することにより消化管感染性疾患の治療や消化管殺菌等に適用されるものであるが、高い殺菌力は特異的な粘膜除去効果によって得られることが記載されており、生体組織への侵襲性が高いことが考えられる。加えて、塩分濃度を０．９％又はその近傍の値に調整するための工程を追加する必要がある。そもそも前記特許文献２には、オゾンナノバブルの気泡径が具体的に記載されておらず、サイズ５０μｍ以下のオゾンマイクロバブルを物理的刺激により圧壊されて縮小したオゾンナノバブルが作製されることを鑑みると、前記特許文献１に記載のオゾンナノバブルを含む水溶液と同程度の気泡径が形成されていると考えられる。そうすると、生体組織への高侵襲性という問題だけでなく、殺菌又は抗菌の効果が持続しづらいという課題を有することが推察される。 The medical nanobubble water described in Patent Document 2 is applied to the treatment of gastrointestinal infectious diseases and gastrointestinal sterilization by optimizing the salinity, but the high bactericidal power is specific. It is described that it can be obtained by a mucous membrane removing effect, and is considered to be highly invasive to living tissue. In addition, it is necessary to add a process for adjusting the salinity concentration to 0.9% or a value in the vicinity thereof. In the first place, the above patent document 2 does not specifically describe the bubble diameter of ozone nanobubbles, and considering that ozone nanobubbles having a size of 50 μm or less are crushed by physical stimulation to reduce ozone nanobubbles. It is considered that the bubble diameter of the same level as the aqueous solution containing ozone nanobubbles described in Patent Document 1 is formed. In this case, it is presumed that not only the problem of high invasiveness to living tissue but also the problem that the effect of sterilization or antibacterial is difficult to be sustained.
さらに、前記特許文献３に開示されているように、オゾンナノバブル水は癌の治療又は予防にも効果があると期待されているものの、安定的に持続して顕著な効能が得られていないためオゾンナノバブル水の効能に対しては疑問視されており、具体的な治療への適用が進んでいないのが現状である。これは、従来から使用されているオゾンナノバブル水は気泡径が最小でも５０ｎｍであるため、温度や保管状態等の使用環境によってはナノバブルが急速に消失しやすく、且つ、生体内の細胞や血管への吸収性又は浸透性の点でも十分に機能していないためであると本発明等は考えた。前記特許文献３の発明においても、使用するナノバブル水は前記特許文献１及び４に記載の方法で作製されており、その気泡径は５０ｎｍ以上である。
Furthermore, as disclosed in Patent Document 3, although ozone nanobubble water is expected to be effective in the treatment or prevention of cancer, it does not have a stable and stable effect. The efficacy of ozone nanobubble water has been questioned, and the current situation is that it has not been applied to specific treatments. This is because ozone nanobubble water used in the past has a bubble diameter of at least 50 nm, so that the nanobubbles are likely to disappear rapidly depending on the usage environment such as temperature and storage conditions, and to cells and blood vessels in the living body. The present invention and the like considered that this is because it is not functioning sufficiently in terms of absorbability or permeability. Also in the invention of Patent Document 3, the nanobubble water to be used is prepared by the method described in
以上のように、オゾンナノバブルを含む水溶液は、オゾンの殺菌又は抗菌の効果を長期間に亘って安定的に発揮することができ、且つ、生体内組織内の細胞等の殺菌又は抗菌を行うために安全かつ安心して適用できることが求められる。また、オゾンは、塩素や過酸化水素等に比べて、人体に対する有害性が低く、環境面での負荷も小さい。そのため、そのような効果を奏するオゾンナノバブルを含む水溶液は、本発明の主な用途である医療分野はもちろんのこと、殺菌及び抗菌を行う一般的な分野においてもそのニーズが極めて高い。さらに、オゾンナノバブルを癌の治療や予防のために使用することができれば副作用が少なく、利便性が高く、かつ、医療コストの低減にも寄与できることから有用と考えられるが、そのためには安定的に継続して十分な癌治療の効果を奏することができる水溶液を創生することが強く望まれている。 As described above, the aqueous solution containing ozone nanobubbles can stably exhibit the effects of ozone sterilization or antibacterial over a long period of time, and perform sterilization or antibacterial of cells in living tissue. It is required to be able to be applied safely and safely. In addition, ozone is less harmful to the human body than chlorine, hydrogen peroxide, and the like, and has less environmental impact. Therefore, an aqueous solution containing ozone nanobubbles having such an effect has an extremely high need not only in the medical field which is the main application of the present invention but also in a general field where sterilization and antibacterial are performed. Furthermore, if ozone nanobubbles can be used for the treatment and prevention of cancer, it is considered useful because it has few side effects, is highly convenient, and can contribute to the reduction of medical costs. It is strongly desired to create an aqueous solution that can continuously exert a sufficient cancer treatment effect.
本発明は、上記した従来の問題点に鑑みてなされたものであって、オゾンナノバブルを含む水溶液においてオゾン気泡径の平均粒径が従来技術で形成されるものより小さく、且つ、その密度が高い場合に、オゾンによる高い殺菌力又は抗菌力が安定的に持続し、生体組織内の細胞等への侵襲性を低くできるという検証に基づき、オゾンナノバブルを含む水溶液に含まれるオゾンナノバブルの平均粒径をより小さくするだけでなく、オゾンナノバブルの密度についても高くする方向で最適化することによって、従来技術よりも高い殺菌又は抗菌の効果を長期間に亘って持続的に有するだけでなく、オゾンを使用しても生体組織内の細胞等の損傷又は障害を大幅に低減できるオゾンナノバブルを含む水溶液とその製造方法及び前記オゾンナノバブルを含む水溶液の使用を提供することにある。また、このような性状と特性を有するオゾンナノバブル水を使用することにより、癌の治療や予防に対して薬剤の一種として適用が期待される水溶液を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above-described conventional problems, and in an aqueous solution containing ozone nanobubbles, the average particle diameter of ozone bubbles is smaller than that formed by the prior art, and the density thereof is high. In this case, the average particle size of ozone nanobubbles contained in an aqueous solution containing ozone nanobubbles based on the verification that high bactericidal or antibacterial activity due to ozone can be stably maintained and the invasiveness to cells in living tissues can be reduced. By optimizing the density of ozone nanobubbles not only to be smaller, but also to have higher bactericidal or antibacterial effects over the long term than the prior art, An aqueous solution containing ozone nanobubbles that can greatly reduce damage or damage to cells or the like in a living tissue even when used, a method for producing the same, and the ozone nanobubble It is to provide the use of an aqueous solution containing. Another object of the present invention is to provide an aqueous solution expected to be applied as a kind of drug for cancer treatment and prevention by using ozone nanobubble water having such properties and characteristics.
本発明は、オゾンナノバブルを含む水溶液においてオゾンナノバブルの平均粒径を５０ｎｍ未満に小さくし、且つ、オゾンナノバブルの密度を高くする方向で規定するとともに、そのような性状と特性を有するオゾンナノバブルの形成方法を、オゾンナノバブルを含む水溶液の製造方法として適用すること、さらに、そのようにして得られるオゾンナノバブルを含む水溶液を、医療用として広く使用されている細胞培養液、生理食塩水、輸液又は点眼薬に含有させて使用することによって上記の課題を解決できることを見出して本発明に到った。 The present invention defines an ozone nanobubble in an aqueous solution containing ozone nanobubbles so that the average particle size of ozone nanobubbles is reduced to less than 50 nm and the density of ozone nanobubbles is increased, and formation of ozone nanobubbles having such properties and characteristics The method is applied as a method for producing an aqueous solution containing ozone nanobubbles, and the aqueous solution containing ozone nanobubbles thus obtained is used in cell culture solution, physiological saline, infusion or eye drops widely used for medical purposes. It has been found that the above-mentioned problems can be solved by using it in a medicine, and the present invention has been achieved.
すなわち、本発明の構成は以下の通りである。
[１] 本発明は、生体内組織の細菌感染やウイルス感染の治療、及び細菌やウイルスの発生防止又はその抑制を行うための生体投与可能な水溶液であって、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定したときのオゾンナノバブルの平均粒径及び密度がそれぞれ３０ｎｍ以下及び１ｍｌあたり１０１６個以上であることを特徴とするオゾンナノバブルを含む水溶液を提供する。
[２]本発明は、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定したときの前記オゾンナノバブルの平均粒径及び密度がそれぞれ１〜１０ｎｍ及び１ｍｌあたり１０１７個以上であることを特徴とする前記[１]に記載のオゾンナノバブルを含む水溶液を提供する。
[３］本発明は、さらに、癌の治療若しくは予防を行うための生体投与可能な水溶液であって、前記［１］又は［２］に記載のオゾンナノバブルを含む水溶液と、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定したときに平均粒径及び密度がそれぞれ３０ｎｍ以下及び１ｍｌあたり１０１６個以上である酸素ナノバブルを含む水溶液とを有するオゾンナノバブルを含む水溶液を提供する。
[４]本発明は、生体内組織の細菌感染やウイルス感染の治療、及び細菌やウイルスの発生防止又はその抑制を行うための生体投与可能な水溶液の製造方法であって、溶存オゾンを含む水溶液を、２以上の貫通***を周方向に有する筒の外部から該貫通***を通して大気圧以上の圧力で噴射させるときに、前記筒の径方向断面と平行な同一平面上で対向するように配置された前記２以上の貫通***のそれぞれの開口部から噴射した溶存液を前記筒の中心に水撃が集中するように衝突させることによって発生させたオゾンナノバブルを含有し、該オゾンナノバブルは、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定したときの平均粒径及び密度がそれぞれ３０ｎｍ以下及び１ｍｌあたり１０１６個以上であることを特徴とするオゾンナノバブルを含む水溶液の製造方法を提供する。
[５]本発明は、前記オゾンナノバブルにおいて、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定したときの平均粒径及び密度がそれぞれ１〜１０ｎｍ及び１ｍｌあたり１０１７個以上であることを特徴とする前記[４]に記載のオゾンナノバブルを含む水溶液の製造方法を提供する。
[６]本発明は、気体及び液体をそれぞれ吸引する手段と、前記気体及び前記液体を同時に加圧して搬送する手段と、該搬送された気体を含む前記液体を新たなオゾンと混合させることによって溶存酸素を富化させるための気液混合槽と、該気液混合槽において気液混合の状態にある溶存液を用いてナノバブルを発生させるために、空洞の筒、該筒の周方向に２以上の貫通***のそれぞれの開口部が前記筒の径方向断面と平行な同一平面上で対向するように配置された前記２以上の貫通***、及び前記筒の少なくとも片端部にナノバブル吐出口を有し、前記貫通***は該貫通***の断面中心部を通る延長線のすべてが前記筒の中心で交差するように配置される噴射ノズルと、を備えるナノバブル発生手段によって前記オゾンナノバブルを発生させることを特徴とする前記[４]又は[５]に記載のオゾンナノバブルを含む水溶液の製造方法を提供する。
[７]本発明は、前記貫通***が、前記筒の径方向断面と平行な同一平面上で対向するように、前記筒の周方向等間隔に４個以上８個以内で設けられ、前記筒の空洞に通じる部分の孔径が０．１〜０．５ｍｍであることを特徴とする前記[４]〜[６]のいずれかに記載のオゾンナノバブルを含む水溶液の製造方法を提供する。
［８］本発明は、さらに、癌の治療若しくは予防を行うための生体投与可能な水溶液の製造方法であって、前記［４］〜［７］のいずれかに記載の製造方法によって得られるオゾンナノバブルを含む水溶液と、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定したときに平均粒径及び密度がそれぞれ３０ｎｍ以下及び１ｍｌあたり１０１６個以上である酸素ナノバブルを含む水溶液とを混合して得られるオゾンナノバブルを含む水溶液の製造方法を提供する。
[９]本発明は、前記[１]又は[２]に記載のオゾンナノバブルを含む水溶液が、細胞培養液、生理食塩水、輸液及び点眼薬からなる群のいずれかの液体に含まれる態様で使用される、オゾンナノバブルを含む水溶液を提供する。
［１０］本発明は、前記［３］に記載のオゾンナノバブルを含む水溶液が、生理食塩水又は輸液に含まれる水溶液として、又は経口摂取することにより、生体内に投与される、オゾンナノバブルを含む水溶液を提供する。
[１１]本発明は、前記オゾンナノバブルを含む水溶液を有する細胞培養液、生理食塩水、輸液及び点眼薬からなる群のいずれかの液体を１００ｍｌとするとき、前記オゾンナノバブルを含む水溶液の配合量が１体積％以上であることを特徴とする前記[９]又は［１０］に記載のオゾンナノバブルを含む水溶液を提供する。
[１２]本発明は、前記[４]〜[７]のいずれかに記載の製造方法によって製造されるオゾンナノバブルを含む水溶液が、細胞培養液、生理食塩水、輸液及び点眼薬からなる群のいずれかの液体にに含まれる態様で使用される、オゾンナノバブルを含む水溶液の製造方法を提供する。
［１３］本発明は、前記［８］に記載の製造方法によって製造されるオゾンナノバブルを含む水溶液が、生理食塩水又は輸液に含まれる水溶液として、又は経口摂取することにより、生体内に投与される、オゾンナノバブルを含む水溶液の製造方法を提供する。
[１４]本発明は、前記オゾンナノバブルを含む水溶液を有する細胞培養液、生理食塩水、輸液及び点眼薬からなる群のいずれかの液体を１００ｍｌとするとき、前記オゾンナノバブルを含む水溶液を１体積％以上の含有量で、前記細胞培養液、生理食塩水、輸液及び点眼薬からなる群のいずれかの液体に混合することを特徴とする前記［１２］又は［１３］に記載のオゾンナノバブルを含む水溶液の製造方法を提供する。
［発明の効果］
That is, the configuration of the present invention is as follows.
[1] The present invention is a biologically administrable aqueous solution for treating bacterial infection and viral infection of tissues in a living body and preventing or suppressing the generation of bacteria and viruses. Provided is an aqueous solution containing ozone nanobubbles, wherein the average particle diameter and density of ozone nanobubbles as measured with an electron microscope are 30 nm or less and 10 16 or more per ml, respectively.
[2] The present invention is characterized in that the average particle size and density of the ozone nanobubbles are 1 to 10 nm and 10 17 or more per ml, respectively, as measured with a cryo-transmission electron microscope by an ice embedding method. An aqueous solution containing the ozone nanobubbles according to [1] is provided.
[3] The present invention further provides a biologically administrable aqueous solution for treating or preventing cancer , comprising the aqueous solution containing ozone nanobubbles according to [1] or [2] above, and an ice embedding method. Provided is an aqueous solution containing ozone nanobubbles having an average particle size and density of 30 nm or less and an aqueous solution containing oxygen nanobubbles of 10 16 or more per ml when measured with a cryo-transmission electron microscope.
[4] The present invention relates to a method for producing a biologically administrable aqueous solution for treating bacterial infection or viral infection of in vivo tissues, and preventing or suppressing the generation of bacteria or viruses, and an aqueous solution containing dissolved ozone Are disposed so as to face each other on the same plane parallel to the radial cross section of the cylinder when the jet is injected from the outside of the cylinder having two or more through-holes in the circumferential direction through the through-holes at a pressure higher than atmospheric pressure. In addition, ozone nanobubbles generated by colliding the dissolved liquid sprayed from the openings of each of the two or more through-holes so that water hammer concentrates on the center of the cylinder are contained. Ozon'nanobabu, wherein the average particle size and density as measured by cryo transmission electron microscope is respectively 30nm or less and 10 16 or more per 1ml by embedding method To provide a method of manufacturing an aqueous solution containing.
[5] The present invention, in the ozone nanobubbles, and wherein the average particle size and density as measured by cryo transmission electron microscope is respectively 1~10nm and 10 17 or more per 1ml by Koritsutsumiuma method The manufacturing method of the aqueous solution containing the ozone nanobubble as described in said [4] is provided.
[6] The present invention includes means for sucking gas and liquid, means for simultaneously pressurizing and transporting the gas and liquid, and mixing the liquid containing the transported gas with new ozone. In order to generate nanobubbles using a gas-liquid mixing tank for enriching dissolved oxygen and dissolved liquid in a gas-liquid mixing state in the gas-liquid mixing tank, a hollow cylinder, 2 in the circumferential direction of the cylinder The two or more through small holes arranged so that the respective openings of the through small holes face each other on the same plane parallel to the radial cross section of the cylinder, and a nanobubble discharge port at least at one end of the cylinder The ozone nanobubbles are generated by the nanobubble generating means, wherein the through-holes are arranged such that all of the extension lines passing through the center of the cross-section of the through-holes intersect at the center of the cylinder. To provide a manufacturing method of an aqueous solution containing ozone nanobubbles according to above, wherein the Rukoto [4] or [5].
[7] In the present invention, the through small holes are provided at equal intervals in the circumferential direction of the cylinder at 4 or more and 8 or less so as to face each other on the same plane parallel to the radial cross section of the cylinder. The method for producing an aqueous solution containing ozone nanobubbles according to any one of the above [4] to [6], wherein the pore diameter of the portion leading to the cavity is 0.1 to 0.5 mm.
[8] The present invention further relates to a method for producing a biologically administrable aqueous solution for treating or preventing cancer, which is obtained by the production method according to any one of [4] to [7]. an aqueous solution containing nanobubbles, obtained by mixing an aqueous solution containing oxygen nanobubbles average particle size and density of each 30nm or less and 10 16 or more per 1ml when measured by cryo transmission electron microscopy by Koritsutsumiuma method A method for producing an aqueous solution containing ozone nanobubbles is provided.
[9] The present invention is an aqueous solution containing ozone nanobubbles according to [1] or [2], cell culture, saline, in a manner that is included in any of the liquid of the group consisting of infusion, and eye drops An aqueous solution containing ozone nanobubbles is provided.
[10] The present invention is an aqueous solution containing ozone nanobubbles according to [3], as an aqueous solution contained in the saline or infusion, or by oral ingestion, are administered in vivo, including ozone nanobubbles An aqueous solution is provided.
[11] The present invention provides a blending amount of the aqueous solution containing ozone nanobubbles when 100 ml of the liquid in the group consisting of the cell culture solution, physiological saline, infusion solution, and eye drops having the aqueous solution containing ozone nanobubbles is used. Is an aqueous solution containing ozone nanobubbles according to [9] or [10], wherein the aqueous solution contains ozone nanobubbles .
[12] In the present invention, the aqueous solution containing ozone nanobubbles produced by the production method according to any one of [4] to [7] is a group consisting of a cell culture solution, physiological saline, infusion solution, and eye drops. Provided is a method for producing an aqueous solution containing ozone nanobubbles, which is used in a mode included in any liquid.
[13] The present invention is an aqueous solution containing ozone nanobubbles produced by the production method according to [8], as an aqueous solution contained in the saline or infusion, or by oral ingestion, it is administered in vivo A method for producing an aqueous solution containing ozone nanobubbles is provided.
[14] The present invention provides an aqueous solution containing ozone nanobubbles in a volume of 100 ml when any one of the group consisting of a cell culture solution, physiological saline, infusion solution, and eye drops having an aqueous solution containing ozone nanobubbles is used. The ozone nanobubbles according to [12] or [13], wherein the ozone nanobubbles are mixed in a liquid of any one of the group consisting of the cell culture solution, physiological saline, infusion solution, and eye drops at a content of at least%. A method for producing an aqueous solution containing the same is provided.
[The invention's effect]
本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液は、従来よりも小さな平均粒径を有するオゾンナノバブルが大量に含まれることにより、オゾンによる高い殺菌力又は抗菌力が安定的に持続できるだけでなく、オゾンを含んでも生体内組織の細胞等への侵襲性を著しく低くし、細胞等の損傷又は障害を大幅に低減できる。 The aqueous solution containing the ozone nanobubbles of the present invention contains a large amount of ozone nanobubbles having an average particle size smaller than that of the conventional one, so that high sterilization power or antibacterial power due to ozone can be stably maintained, and even ozone can be contained. The invasiveness of the tissue in the living body to the cells or the like can be remarkably reduced, and damage or damage to the cells or the like can be greatly reduced.
また、本発明によるオゾンナノバブルを含む水溶液の製造方法は、従来のナノバブル発生装置と比べて、３０ｎｍ以下の平均粒径を有するオゾンナノバブルを大量に、且つ、安定的に発生することができるため、高い殺菌力又は抗菌力が安定して持続的に得られ、且つ、生体内組織の細胞等への低侵襲性を図ることができる、オゾンナノバブルを含む水溶液を容易に製造することができる。そのような効果を有するオゾンナノバブルを含む水溶液は、従来技術では製造することが困難であり、本発明の製造方法によって初めて得ることができる。 In addition, the method for producing an aqueous solution containing ozone nanobubbles according to the present invention can stably generate a large amount of ozone nanobubbles having an average particle size of 30 nm or less as compared with a conventional nanobubble generator, It is possible to easily produce an aqueous solution containing ozone nanobubbles in which a high bactericidal power or antibacterial power is stably and continuously obtained and can be minimally invasive to cells of living tissue. An aqueous solution containing ozone nanobubbles having such an effect is difficult to produce by the prior art, and can be obtained for the first time by the production method of the present invention.
さらに、本発明によるオゾンナノバブルを含む水溶液を有する細胞培養液、生理食塩水、輸液及び点眼薬は、生体内組織の細胞等のウイルスや細菌による感染の治療やその予防に適用することができる。さらに、本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液は、癌の治療及び予防において薬剤の一つとして適用される可能性が高い。それにより、オゾンナノバブルを含む水溶液の医療分野への適用範囲を大きく広げることが可能になる。 Furthermore, the cell culture solution, physiological saline solution, infusion solution, and eye drops having an aqueous solution containing ozone nanobubbles according to the present invention can be applied to the treatment and prevention of infections caused by viruses and bacteria such as cells in in vivo tissues. Furthermore, the aqueous solution containing ozone nanobubbles of the present invention is likely to be applied as one of drugs in the treatment and prevention of cancer. Thereby, it becomes possible to greatly expand the application range of the aqueous solution containing ozone nanobubbles to the medical field.
気体のマイクロナノバブル発生させる技術としては、前記非特許文献１に記載されているように、旋回液流式、スタティックミキサー式、ベンチュリー式、加圧溶解式、細孔式等の様々な方法が従来から提案されている。また、前記特許文献１及び４に記載されているように、水溶液中に含まれる酸素を含有する微小気泡に物理的刺激を加えることにより、より微細な酸素ナノバブル（気泡径５０〜５００ｎｍ）を発生させる方法も提案されている。しかしながら、これら従来のナノバブル発生方法で得られる気泡径は、最も小さいものでも５０ｎｍ位が限度である。加えて、１００ｎｍ以下の気体ナノバブルは可視光及び紫外光の波長よりも小さい直径を有する非常に微細な粒子であるため、粒径を精密に測定できる測定技術が確立されておらず、気体のナノバブルを含む水溶液として一般的に呼ばれるものは、数十ｎｍ以下の粒子径を有するナノバブルの存在を明確に証明することが困難であった。
As a technique for generating gas micro-nano bubbles, as described in Non-Patent Document 1, various methods such as a swirling liquid flow method, a static mixer method, a venturi method, a pressure dissolution method, and a pore method have been conventionally used. Proposed by In addition, as described in
本発明者等は、従来のマイクロナノバブル発生方法で得られる最も小さな気泡径として５０ｎｍを有するオゾンナノバブルを含む水溶液及びオゾンナノバブルを含まない水溶液をそれぞれ有する細胞培養液を用いて、細菌やウイルスによる細胞の殺菌又は抗菌の効果を検証した。検証は、細胞を培養した細胞培養液に、オゾンナノバブルを含む水溶液を使用して培養したウイルス浮遊液を混合した後、所定の時間インキュベーション培養することにより、培養中の細胞にウイルス感染が発生するか否かを調べることによって行った。その結果、オゾンナノバブルを含まない水溶液を使用する場合ではウイルスの発生が観測されるのに対して、本発明によるオゾンナノバブルを含む水溶液を使用する場合は、細胞に損傷又は損害を与えずにウイルスの発生を防止することができることが分かった。さらに、５０ｎｍ以上の気泡径を有するオゾンナノバブルを含む水溶液において、ウイルスの発生を防止できる水溶液を使用する場合は細胞が損傷又は損害を受けるが、その一方で、細胞の損傷又は損害がまったく見られない水溶液を選んで使用するときはウイルスによる感染が発生しやすいことが分かった。したがって、細菌やウイルスによる細胞等の感染治療又は感染予防においては、水溶液に含まれるオゾンナノバブルの粒径として一般的に１０００ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、３００ｎｍ未満又は１００ｎｍ未満と規定するだけでは十分でないことが明らかとなった。 The present inventors have used bacteria and virus cells using cell culture solutions each having an aqueous solution containing ozone nanobubbles having the smallest bubble diameter of 50 nm obtained by conventional micronanobubble generation methods and an aqueous solution not containing ozone nanobubbles. The sterilization or antibacterial effect of the was verified. In the verification, the cell culture medium in which the cells are cultured is mixed with a suspension of virus cultured using an aqueous solution containing ozone nanobubbles, and then incubated for a predetermined period of time, which causes viral infection in the cells being cultured. Done by examining whether or not. As a result, when an aqueous solution containing no ozone nanobubbles is used, the generation of virus is observed, whereas when using an aqueous solution containing ozone nanobubbles according to the present invention, the virus is not damaged or damaged. It has been found that the occurrence of can be prevented. Furthermore, in an aqueous solution containing ozone nanobubbles having a bubble diameter of 50 nm or more, cells are damaged or damaged when using an aqueous solution that can prevent the generation of viruses, but on the other hand, there is no damage or damage to cells. It was found that virus infection is likely to occur when an aqueous solution not selected is used. Therefore, in the treatment of infection or prevention of infection of cells or the like by bacteria or viruses, it is not sufficient to merely define the particle size of ozone nanobubbles contained in an aqueous solution as generally less than 1000 nm, less than 500 nm, less than 300 nm, or less than 100 nm. It became clear.
本発明は、上記の結果から、生体組織内の細胞等に対する殺菌又は抗菌の効果が、水溶液に含まれるオゾンナノバブルの平均粒径を従来方法よりもさらに小さく、且つ、その密度を高くすることによって十分に得られるではないかとの思想に基づいて、そのような性状及び特性を有するオゾンナノバブルを含む水溶液を製造できる方法について試行錯誤で検討を行い、実現可能な方法を見出すことによってなされたものである。そして、実際にその方法によって製造される水溶液を有する細胞培養液、生理食塩水、輸液又は点眼薬を使用することにより、生体内組織の細胞等にほとんど損傷又は損害与えずに、抗ウイルス、殺菌又は抗菌の効果が得られることが確認された。なお、検証結果については、後述の実施例において詳細に説明する。 From the above results, the present invention has the effect of sterilization or antibacterial effect on cells in living tissue by making the average particle size of ozone nanobubbles contained in an aqueous solution smaller than that of the conventional method and increasing its density. Based on the idea that it can be obtained sufficiently, it was made by examining trial and error about a method that can produce an aqueous solution containing ozone nanobubbles having such properties and characteristics, and finding a feasible method. is there. Then, by using a cell culture solution, physiological saline, infusion solution or eye drops having an aqueous solution actually produced by the method, anti-virus, sterilization can be carried out with little damage or damage to cells in the body tissue. It was also confirmed that an antibacterial effect was obtained. The verification result will be described in detail in an example described later.
本発明において使用する水溶液に含まれるオゾンナノバブルの大きさは、平均粒径で規定することができる。平均粒径が小さいものほど、ナノレベルで含まれるバブルの量が多く、それよりも大きな粒径を有するバブルの量が少なくなる傾向にある。ナノバブルの大きさは、粒度分布（粒径の標準偏差）によっても影響を受けるが、その影響は小さく、水溶液に含まれるオゾンナノバブルは、平均粒径が５０ｎｍ未満のオーダーであり、できるだけ小さい平均粒径を有することが必要である。 The size of the ozone nanobubbles contained in the aqueous solution used in the present invention can be defined by the average particle diameter. The smaller the average particle size, the larger the amount of bubbles contained at the nano level, and the smaller the amount of bubbles having a larger particle size. The size of the nanobubbles is also affected by the particle size distribution (standard deviation of particle size), but the effect is small, and the ozone nanobubbles contained in the aqueous solution have an average particle size of less than 50 nm, and the average particle size is as small as possible. It is necessary to have a diameter.
本発明において、オゾンナノバブルは、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定したときの平均粒径が３０ｎｍ以下であり、好ましくは１ｎｍ以上で１０ｎｍ以下である。オゾンナノバブルの平均粒径が３０ｎｍ以下であるときに、オゾンナノバブルの開裂又は開放が長期間に亘って抑えられるため、生体内組織の殺菌又は抗菌を行うときに細胞等の損傷又は障害が少なく、細胞を保護する効果を安定的に持続して得られる。さらに、１０ｎｍ以下であれば、著しく大きな効果を得ることができる。他方、細胞を保護する効果は、オゾンナノバブルの平均粒径が１ｎｍ未満であっても飽和する傾向にあり、逆に、殺菌力又は抗菌力が著しく低下するようになる。さらに、オゾンナノバブル発生装置を製造するときの技術的なハードルの高さを考慮すると経済性及びメンテナンス容易性の観点からも、平均粒径は１ｎｍ以上で規定するのが好ましい。 In the present invention, the ozone nanobubbles have an average particle size of 30 nm or less, preferably 1 nm or more and 10 nm or less when measured with a cryo-transmission electron microscope by the ice embedding method. When the average particle size of ozone nanobubbles is 30 nm or less, the cleavage or release of ozone nanobubbles is suppressed over a long period of time, so there is less damage or damage to cells or the like when sterilizing or antibacterial in vivo tissues, The effect of protecting cells can be obtained stably and continuously. Furthermore, if it is 10 nm or less, a remarkably big effect can be acquired. On the other hand, the effect of protecting cells tends to saturate even if the average particle size of ozone nanobubbles is less than 1 nm, and conversely, the bactericidal or antibacterial power is significantly reduced. Furthermore, considering the height of technical hurdles when manufacturing an ozone nanobubble generator, the average particle size is preferably specified to be 1 nm or more from the viewpoints of economy and ease of maintenance.
本発明においては、オゾンナノバブルの平均粒径だけでなく、さらに、水溶液１ｍｌ中に含まれるナノバブルの個数、すなわち、オゾンナノバブルの密度を高い値に規定することが必要である。すなわち、オゾンナノバブルの平均粒径を３０ｎｍ以下と非常に小さくすることによりバブルの保存安定性及び粒径維持性の向上を図り、オゾンが生体組織の細胞等に対して大きなダメージを与えないでオゾンの殺菌力又は抗菌力を長期間に亘って安定的に維持することができる。その一方で、平均粒径が３０ｎｍ以下の微細ナノバブルの１個に充填している微量のオゾン量では細菌やウイルスの殺菌又は抗菌を有効かつ効率的に行うことが困難である。そのため、水溶液１ｍｌ中に含まれるオゾンバブル数を従来以上に増やし、ナノバブルを多点及び多方向で存在させることにより、細胞に接触又は近接する細菌やウイルスなどの異物に対して局所的な攻撃ができるように、水溶液１ｍｌ中に含まれるオゾンバブル数を従来以上に増やす必要がある。 In the present invention, it is necessary to define not only the average particle diameter of ozone nanobubbles but also the number of nanobubbles contained in 1 ml of aqueous solution, that is, the density of ozone nanobubbles, to a high value. That is, by making the average particle size of ozone nanobubbles as very small as 30 nm or less, the storage stability of the bubbles and the maintenance of the particle size are improved, and the ozone does not cause significant damage to the cells of the living tissue. Can be stably maintained over a long period of time. On the other hand, it is difficult to effectively and efficiently sterilize or antibacterial bacteria and viruses with a small amount of ozone filled in one fine nanobubble having an average particle size of 30 nm or less. Therefore, by increasing the number of ozone bubbles contained in 1 ml of aqueous solution more than before, and making nanobubbles exist in multiple points and directions, local attacks against foreign substances such as bacteria and viruses that are in contact with or close to the cells can be made. In order to do so, it is necessary to increase the number of ozone bubbles contained in 1 ml of the aqueous solution more than before.
また、マイクロ・ナノバブルの微細バブルの特徴としては、粒子表面にゼータ電位を有し、周囲がＯＨ−の負電荷によって囲まれていることが知られている。そのため、本発明のオゾンナノバブルの場合も、バブル中に含まれるオゾンによる局所的な酸化作用とともに、バブルの表面のＯＨ−の電荷によって細胞の表面に付着又は感染している細菌やウイルスの殺菌又は抗菌が促進することが考えられる。この効果は、水溶液１ｍｌ中に含まれるオゾンナノバブルの密度が高くなれば、バブル表面に存在するＯＨ−の濃度が高くなるため大きくなる傾向にある。加えて、オゾンナノバブルは開裂のときにバブル衝撃力を発生するが、オゾンナノバブルの平均粒径が小さく、さらに、その密度が高くなればバブル衝撃力が大きくなることが考えられる。このように、本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液は、バブル内に含まれるオゾン量による影響の他にも、バブル表面に存在するＯＨ−数の増加、及びバブル衝撃力の増大等の効果により、細菌やウイルスなどの異物に対して殺菌力又は抗菌力を高くできるのはないかと考えられるが、殺菌又は抗菌の詳細なメカニズム解明については今後の検討事項である。Further, it is known that microbubbles of micro / nanobubbles have a zeta potential on the particle surface and are surrounded by a negative charge of OH − . Therefore, also in the case of the ozone nanobubble of the present invention, together with the local oxidation action by ozone contained in the bubble, sterilization of bacteria or viruses attached or infected to the cell surface by the OH − charge on the bubble surface or It is thought that antibacterial promotes. This effect tends to increase as the density of ozone nanobubbles contained in 1 ml of the aqueous solution increases because the concentration of OH − present on the bubble surface increases. In addition, although ozone nanobubbles generate a bubble impact force when cleaved, it is considered that the bubble impact force increases as the average particle size of ozone nanobubbles decreases and the density increases. Thus, the aqueous solution containing ozone nanobubbles of the present invention has an effect such as an increase in the number of OH − present on the bubble surface and an increase in bubble impact force in addition to the influence of the amount of ozone contained in the bubbles. Although it may be possible to increase the bactericidal or antibacterial power against foreign substances such as bacteria and viruses, the detailed mechanism elucidation of the bactericidal or antibacterial is for further study.
したがって、本発明で使用する水溶液に含まれるオゾンナノバブルの密度は、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定したときの密度が水溶液１ｍｌあたり１０１６個以上であることが必要であり、好ましくは１０１７個／ｍｌ以上である。本発明で利用するオゾンナノバブルは、そもそも平均粒径が非常に小さいため、その密度が１０１６個未満であると、単位体積当たりの水溶液に含まれるオゾン濃度が薄くなるため、殺菌力又は抗菌力を十分に得ることができない。殺菌力又は抗菌力は、水溶系中のオゾン濃度が高いほど大きくなる。さらに、オゾンナノバブルの平均粒径が１〜１０ｎｍの場合は、水溶液に含まれるオゾンの濃度を十分に確保するため、オゾンナノバブルの密度が１０１７個／ｍｌ以上であるのが好ましい。Therefore, the density of ozone nanobubbles contained in the aqueous solution used in the present invention needs to be 10 16 or more per 1 ml of aqueous solution, as measured by a cryo-transmission electron microscope by the ice embedding method. Is 10 17 pieces / ml or more. Since the ozone nanobubbles used in the present invention have an extremely small average particle size in the first place, if the density is less than 10 16 , the concentration of ozone contained in the aqueous solution per unit volume becomes thin. Can't get enough. The sterilizing power or antibacterial power increases as the ozone concentration in the aqueous system increases. Furthermore, when the average particle diameter of ozone nanobubbles is 1 to 10 nm, the density of ozone nanobubbles is preferably 10 17 particles / ml or more in order to sufficiently secure the concentration of ozone contained in the aqueous solution.
マイクロ・ナノバブルの粒径の測定方法としては、従来から様々な方法が知られている。それらの中で、ナノバブルの計測法は、光学的な観察が困難であるため、例えば、ミー散乱光を利用する光散乱法、レーザ回折・散乱法、液中のバブル粒子のブラウン運動を観測するナノ粒子トラッキング解析法、細孔電気抵抗法（コール・カウンター法）、動的光散乱法、ＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の梁を利用する共振式質量測定法等が提案されている。これらの方法以外にも、ゼータ電位測定によるナノバブルの粒子径を求める方法やスピントラップ剤を用いて電子スポン共鳴法（ＥＳＲ）によるナノバブルの存在を確認する方法が提案されている。 Various methods are conventionally known as methods for measuring the particle size of micro / nano bubbles. Among them, nanobubble measurement methods are difficult to observe optically. For example, light scattering method using Mie scattered light, laser diffraction / scattering method, Brownian motion of bubble particles in liquid is observed. Nanoparticle tracking analysis method, pore electrical resistance method (Cole counter method), dynamic light scattering method, resonance mass measurement method using MEMS (Micro Electro-Mechanical Systems) beam, and the like have been proposed. In addition to these methods, methods for obtaining the particle size of nanobubbles by zeta potential measurement and methods for confirming the presence of nanobubbles by electron spon resonance (ESR) using a spin trap agent have been proposed.
本発明等は、上記以外のマイクロ・ナノバブル計測法として、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定する方法を提案している（特願２０１４−２３０４０７号を参照）。この方法は、液体を非晶質の固相状態にし、前記非晶質の固相状態にある液体に含まれる超微細バブルを、透過型電子顕微鏡を用いて観察することによって、液中に含まれる超微細バブル及びその分布状態を直接的に画像として観測し解析できる。そのため、１０ｎｍ未満の粒径を有する超微細バブルを高精度に測定することができる。また、この方法は、オゾンナノバブルの平均粒径の他にも、粒径分布及び密度を求めることができるため、本発明において規定するオゾンナノバブルの平均粒径及び密度は、この方法で測定して求めたものである。 The present invention proposes a method of measuring with a cryo-transmission electron microscope by an ice embedding method as a micro / nano bubble measurement method other than the above (see Japanese Patent Application No. 2014-230407). In this method, a liquid is made into an amorphous solid state, and ultrafine bubbles contained in the liquid in the amorphous solid state are observed in a liquid by using a transmission electron microscope. The observed ultrafine bubbles and their distribution can be directly observed and analyzed as images. Therefore, ultrafine bubbles having a particle diameter of less than 10 nm can be measured with high accuracy. Moreover, since this method can determine the particle size distribution and density in addition to the average particle size of ozone nanobubbles, the average particle size and density of ozone nanobubbles defined in the present invention are measured by this method. It is what I have sought.
氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定する方法は、マイクログリッド又はマイクロメッシュに保持した液体を試料として用い、エネルギーが１０〜３００キロエレクトロンボルト（ｋｅＶ）の透過型電子顕微鏡によって、観察のときに用いる電子線の数を１〜１０５電子／Å２に設定して測定が行われる。In the method of measuring with a cryo-transmission electron microscope by the ice embedding method, a liquid held in a microgrid or micromesh is used as a sample, and an observation is performed by a transmission electron microscope having an energy of 10 to 300 kiloelectron volts (keV). The measurement is performed with the number of electron beams used sometimes being set to 1 to 10 5 electrons / Å 2 .
なお、本発明で使用する酸素ナノバブル水のバブル粒径は、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定する方法以外にも、例えば、動的光散乱法（光子相関法）によっても測定することが可能である。例えば、大塚電子製の粒径・分子量測定システム（型番：ＥＬＳＺ−２０００Ｓ）又はゼータ電位・粒径・分子量測定システム（型番：ＥＬＳＺ−２０００ＺＳ）等の測定装置を用いて、特殊なデータ処理を行うことによって１０ｎｍ以下のバブル径の測定が可能になる。ここで、特殊なデータ処理とは、例えば、測定の積算回数を増やし、測定時に不確定乱反射するデータだけを削除することによって安定的に存在する粒子だけを抽出し、その粒径を測定する方法である。 In addition, the bubble particle size of oxygen nanobubble water used in the present invention is measured by, for example, a dynamic light scattering method (photon correlation method) in addition to the method of measuring with a cryo-transmission electron microscope by the ice embedding method. It is possible. For example, special data processing is performed using a measuring device such as a particle size / molecular weight measurement system (model number: ELSZ-2000S) or a zeta potential / particle size / molecular weight measurement system (model number: ELSZ-2000ZS) manufactured by Otsuka Electronics. This makes it possible to measure a bubble diameter of 10 nm or less. Here, special data processing means, for example, a method in which only the particles that exist stably are extracted by increasing the number of measurement integrations, and only the data that is indeterminately reflected at the time of measurement is extracted, and the particle size is measured. It is.
本発明者等が検討を行った結果、動的光散乱法による測定方法でも、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定する方法と同じような粒径測定結果が得られることが確認できた。しかしながら、動的光散乱法においては測定粒子が内実であるのか、又は中空であるのかを明確に区別することが極めて難しい。さらに、オゾンナノバブルの密度についても高精度測定を行うことは技術的な制約を受け、困難である。それに対して、本発明のように氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定する方法は、電子顕微鏡によって測定粒子が内実か中空であるかを明確に区別して観測することができるだけでなく、オゾンナノバブルの密度も高精度で測定することが可能である。したがって、本発明においては、オゾンナノバブル径の測定方法として、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定する方法を採用する。 As a result of investigations by the present inventors, it can be confirmed that even the measurement method using the dynamic light scattering method can obtain the same particle size measurement result as the method using a cryo-transmission electron microscope by the ice embedding method. It was. However, in the dynamic light scattering method, it is very difficult to clearly distinguish whether the measurement particle is solid or hollow. Furthermore, it is difficult to measure the density of ozone nanobubbles with high accuracy due to technical limitations. On the other hand, the method of measuring with a cryo-transmission electron microscope by the ice embedding method as in the present invention can not only clearly observe whether the measurement particles are solid or hollow by an electron microscope, The density of ozone nanobubbles can also be measured with high accuracy. Therefore, in this invention, the method of measuring with a cryo-transmission electron microscope by the ice embedding method is employ | adopted as a measuring method of an ozone nano bubble diameter.
本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液を生体内組織の殺菌又は抗菌を行うときは、少なくとも前記オゾンナノバブルを含む水溶液を有する細胞培養液、生理食塩水、輸液及び点眼薬からなる群のいずれかの液体を使用することが好ましい。細胞を培養するために使用する細胞培養液は、細胞培養中に起きやすい細菌やウイルスによる感染を防止するために使用する。また、前記生理食塩水、輸液又は点眼薬は、生体に投与することにより、細菌やウイルスのよる生体内組織の感染を治療したり、予防するために使用する。これらの液体は、すでに細菌やウイルスに感染した状態を有する細胞の治療にも適用が可能である。 When the aqueous solution containing the ozone nanobubbles of the present invention is used to sterilize or antibacterial tissues in the living body, at least one liquid selected from the group consisting of a cell culture solution, a physiological saline solution, an infusion solution, and eye drops containing the aqueous solution containing the ozone nanobubbles Is preferably used. The cell culture medium used for culturing cells is used to prevent infection by bacteria and viruses that are likely to occur during cell culture. The physiological saline, infusion or eye drop is used to treat or prevent infection of in vivo tissues caused by bacteria or viruses by administration to a living body. These liquids can also be applied to the treatment of cells that are already infected with bacteria or viruses.
本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液を有する細胞培養液は、通常、培地及び血清の所定量を含み、必要に応じて抗生物質とサプリメントが微量で加えられる。細胞培養用培地は、一般的に無機塩類、炭水化物、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸・脂質、タンパク質・ペプチド及び微量元素等で構成され、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）が使用されるが、これ以外の培地を使用することもできる。また、血清としては、例えばウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が広く知られているが、それ以外にも仔ウシ血清（ＮＣＳ）やウマ血清等を使用してもよい。培地と血清とを含む細胞培養液は、一般的に減菌的な環境を形成することが求められており、ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質等が配合される場合がある。本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液を有する細胞培養液は、減菌的な環境を形成するだけでなく、殺菌又は抗菌の効果を持たせることができ、従来の細胞培養液に比べて優れた殺菌性又は抗菌性を得ることができる。ここで、細胞培養液の構成成分としては、本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液だけでなく、用途に応じて本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液が混合された生理食塩水又は輸液を使用することができる。 The cell culture solution having an aqueous solution containing ozone nanobubbles of the present invention usually contains a predetermined amount of medium and serum, and antibiotics and supplements are added in trace amounts as necessary. Cell culture media are generally composed of inorganic salts, carbohydrates, amino acids, vitamins, fatty acids / lipids, proteins / peptides, trace elements, etc. For example, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) is used. The medium can also be used. As serum, for example, fetal bovine serum (FBS) is widely known, but calf serum (NCS), horse serum, and the like may also be used. A cell culture medium containing a medium and serum is generally required to form a sterilizing environment, and antibiotics such as penicillin and streptomycin may be blended. The cell culture solution having an aqueous solution containing ozone nanobubbles of the present invention not only forms a sterilizing environment, but also has a sterilization or antibacterial effect, which is superior to conventional cell culture solutions. Or antibacterial properties can be obtained. Here, as a constituent of the cell culture solution, not only the aqueous solution containing the ozone nanobubbles of the present invention but also physiological saline or infusion mixed with the aqueous solution containing the ozone nanobubbles of the present invention may be used depending on the application. it can.
生理食塩水は、浸透圧が血液又は体液に合致するように基本的に０．９質量％の塩化ナトリウムを含み、通常は、塩化ナトリウムが生理食塩水の１００質量部に対して０．８５〜０．９５質量％の範囲で配合される。本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液は、一般的に塩化ナトリウムを含まない状態で使用されるが、前記オゾンナノバブルを含む水溶液に塩化ナトリウムを０．８５〜０．９５質量％の含有量で配合してもよい。 The physiological saline basically contains 0.9% by mass of sodium chloride so that the osmotic pressure matches that of blood or body fluid. Usually, the sodium chloride is 0.85 to 100 parts by mass of the physiological saline. It mix | blends in 0.95 mass%. The aqueous solution containing ozone nanobubbles of the present invention is generally used in a state not containing sodium chloride, but sodium chloride is added to the aqueous solution containing ozone nanobubbles at a content of 0.85 to 0.95 mass%. May be.
本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液は、次のような各種の添加剤を含む輸液として使用することができる。例えば、本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液を有する生理食塩水に、５％ブドウ糖液を所定の量で添加した低張複合電解質液、カリウムやカルシウムを加えたリンゲル液、ブドウ糖やアミノ酸を添加した高カロリー液、ヘパリンを添加した生食液である。本発明の輸液を製造する場合は、通常、生理食塩水を溶媒として使用される場合もあるが、必ずしも塩化ナトリウムを０．８５〜０．９５質量％の範囲で含む生理食塩水を使用することに限定されない。 The aqueous solution containing the ozone nanobubbles of the present invention can be used as an infusion containing the following various additives. For example, a hypotonic composite electrolyte solution in which 5% glucose solution is added in a predetermined amount to physiological saline having an aqueous solution containing ozone nanobubbles of the present invention, Ringer solution in which potassium and calcium are added, and high calorie in which glucose and amino acids are added This is a saline solution to which heparin is added. When the infusion solution of the present invention is manufactured, physiological saline is usually used as a solvent, but a physiological saline containing sodium chloride in a range of 0.85 to 0.95 mass% is necessarily used. It is not limited to.
点眼薬は、一般的に抗生物質、抗アレルギー薬、抗炎症薬、ビタミン類等を含有し、結膜嚢に適用する無菌の外用剤である。そのため、本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液を点眼薬に含有させることにより、従来よりも優れた殺菌性又は抗菌性を有する点眼薬を得ることができる。また、従来のものと同じ程度の殺菌性又は抗菌性を有する点眼薬の場合は、抗生物質、抗アレルギー薬、抗炎症薬の含有量を少なくすることができるため、眼の生理に対して非常に優しい薬を調製することが可能になる。 Eye drops generally contain antibiotics, antiallergic drugs, anti-inflammatory drugs, vitamins and the like, and are sterile external preparations applied to the conjunctival sac. Therefore, an ophthalmic solution having better bactericidal or antibacterial properties than before can be obtained by incorporating an aqueous solution containing the ozone nanobubbles of the present invention into the ophthalmic solution. In addition, in the case of eye drops having the same degree of bactericidal or antibacterial properties as conventional ones, the content of antibiotics, antiallergic drugs, and anti-inflammatory drugs can be reduced, which is very important for eye physiology. It becomes possible to prepare a gentle medicine.
本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液を有する細胞培養液、生理食塩水、輸液及び点眼薬からなる群のいずれかの液体を調整するとき、前記オゾンナノバブルを含む水溶液の配合量は、前記細胞培養液、生理食塩水、輸液及び点眼薬からなる群のいずれかの液体の１００ｍｌに対して１体積％以上であることが好ましい。本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液の配合量が１体積％未満であると、細胞培養液、生理食塩水、輸液及び点眼薬１ｍｌ中に含まれるオゾンナノバブルの個数が単純計算でも１×１０１４未満となり、それらの液体に殺菌又は抗菌の効果を十分に付与することができない。参考までに、特開２０１１−８８９７９号公報の段落[０１２１]及び[０１３６]には、直径の分布ピークが１００ｎｍである気体バブルを含む水１Ｌ当たりの気泡の個数が１．７×１０１６個と算出されることが記載されており、この個数は、単純計算で水１ｍｌ当たり約２×１０１３個に相当する。したがって、本発明のように、前記細胞培養液、生理食塩水、輸液又は点眼薬に含まれるナノバブルは密度が１×１０１４以上あれば、１００ｎｍであるオゾンナノバブルを含む水溶液の単独と比べても高密度のバブルが含まれていることが容易に理解できる。さらに、本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液の配合量は、殺菌又は抗菌の効果を十分に得るため５体積％以上がより好ましく、１０体積％以上が特に好ましい。When adjusting any liquid in the group consisting of a cell culture solution, a physiological saline solution, an infusion solution, and eye drops having an aqueous solution containing ozone nanobubbles of the present invention, the blending amount of the aqueous solution containing ozone nanobubbles is the cell culture solution. It is preferably 1% by volume or more with respect to 100 ml of any liquid in the group consisting of physiological saline, infusion and eye drops. When the blending amount of the aqueous solution containing ozone nanobubbles of the present invention is less than 1% by volume, the number of ozone nanobubbles contained in 1 ml of cell culture solution, physiological saline, infusion solution and eye drops is less than 1 × 10 14 even by simple calculation. Therefore, it is not possible to sufficiently impart sterilization or antibacterial effects to these liquids. For reference, in paragraphs [0121] and [0136] of Japanese Patent Application Laid-Open No. 2011-89799, the number of bubbles per liter of water including gas bubbles having a diameter distribution peak of 100 nm is 1.7 × 10 16. This number is equivalent to about 2 × 10 13 per ml of water by simple calculation. Therefore, as in the present invention, the nanobubbles contained in the cell culture solution, physiological saline, infusion solution or eye drops have a density of 1 × 10 14 or more, compared with an aqueous solution containing ozone nanobubbles of 100 nm alone. It can be easily understood that high-density bubbles are included. Furthermore, the blending amount of the aqueous solution containing ozone nanobubbles of the present invention is more preferably 5% by volume or more, and particularly preferably 10% by volume or more in order to sufficiently obtain a bactericidal or antibacterial effect.
一方、本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液は単独で使用しても生体組織の細胞等に損傷及び損害を与えることがないため、配合量の上限値は特に規定する必要は無い。例えば、本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液を有する細胞培養液の場合は、細胞培養培地として必要な固形成分（無機塩類、炭水化物、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸・脂質、タンパク質・ペプチド、血清及び微量元素等）を均一に添加したものを、そのまま細胞培養液として使用してもよい。 On the other hand, the aqueous solution containing ozone nanobubbles of the present invention does not cause damage or damage to cells or the like of living tissue even when used alone, and therefore the upper limit value of the blending amount does not need to be specified. For example, in the case of a cell culture solution having an aqueous solution containing ozone nanobubbles of the present invention, solid components (inorganic salts, carbohydrates, amino acids, vitamins, fatty acids / lipids, proteins / peptides, serum, trace elements, etc.) required as a cell culture medium ) May be used as a cell culture solution as it is.
また、本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液は、純水と混合して使用してもよいし、他の気体を含むナノバブル、例えば、酸素ナノバブルを含む水溶液と混合して使用してもよい。酸素ナノバブルを含む水溶液としては、本発明と同じように、平均粒径が３０ｎｍ以下、好ましくは１〜１０ｎｍで、水溶液１ｍｌ当たりの密度が１０１６以上、好ましくは１０１７以上である酸素ナノバブルを含む水溶液を使用するのが好ましい。水溶液に含まれる酸素ナノバブル及びオゾンナノバブルにおいて両者の平均粒径をほぼ同じにすることにより、殺菌又は抗菌の効果及びバブルの安定性に対してバブル径の違いに起因する悪影響を極力小さくできるためである。平均粒径が３０ｎｍ以下で、水溶液１ｍｌ当たりの密度が１０１６以上である酸素ナノバブルを含む水溶液は、後述の図１に示すナノバブル発生装置によって、酸素を溶存気体として使用することにより製造することができる。Moreover, the aqueous solution containing ozone nanobubbles of the present invention may be used by mixing with pure water, or may be used by mixing with nanobubbles containing other gases, for example, aqueous solutions containing oxygen nanobubbles. As in the present invention, the aqueous solution containing oxygen nanobubbles contains oxygen nanobubbles having an average particle size of 30 nm or less, preferably 1 to 10 nm, and a density per ml of aqueous solution of 10 16 or more, preferably 10 17 or more. It is preferred to use an aqueous solution. By making the average particle size of both oxygen nanobubbles and ozone nanobubbles contained in the aqueous solution substantially the same, the adverse effects caused by the difference in bubble diameter can be minimized as much as possible against the bactericidal or antibacterial effects and bubble stability. is there. An aqueous solution containing oxygen nanobubbles having an average particle size of 30 nm or less and a density per ml of aqueous solution of 10 16 or more can be produced by using oxygen as a dissolved gas by a nanobubble generator shown in FIG. it can.
本発明は、細胞培養液、生理食塩水、輸液及び点眼薬のいずれかの液体と混合して使用することを主な用途とする水溶液であるが、このような使用に限定されない。従来から行われているように、本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液をうがい薬などとして使用したり、前記オゾンナノバブルを含む水溶液を経口摂取することができる。また、食品、飲料水、汚泥処理水、温泉、又は居室等の殺菌や抗菌を行うために使用することも可能である。そのような一般の用途においては、生体内組織の細胞などへの侵襲性の問題を気にする必要がなく、本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液をそのままで、又は水に適当な濃度で希釈した状態で、それぞれ使用することができる。 The present invention is an aqueous solution whose main application is to be used by mixing with any one of cell culture solution, physiological saline, infusion solution and eye drops, but is not limited to such use. As conventionally performed, the aqueous solution containing the ozone nanobubbles of the present invention can be used as a mouthwash or the like, or the aqueous solution containing the ozone nanobubbles can be taken orally. It can also be used to sterilize and antibacterial foods, drinking water, sludge treated water, hot springs, and living rooms. In such a general application, there is no need to worry about the invasive problem of cells in living tissues, and the aqueous solution containing the ozone nanobubbles of the present invention is diluted as it is or in an appropriate concentration in water. Can be used in each state.
本発明において、前記オゾンナノバブルを含む水溶液と、包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定したときに平均粒径及び密度がそれぞれ３０ｎｍ以下及び１ｍｌあたり１０１６個以上である酸素ナノバブルを含む水溶液とを混合して得られる水溶液は、輸液又は生理食塩水として生体内に投与するか、又は経口摂取することにより癌の治療及び予防のために使用することができる。その場合に使用する生理食塩水としては、塩化ナトリウムの含有量が０．８５〜０．９５質量％である必要は必ずしもなく、０．８５質量％未満の含有量であってもよい。場合によっては、塩化ナトリウムを含まないオゾン及び酸素のナノバブル純水を作製し、それを経口摂取することができる。 In the present invention, an aqueous solution containing the ozone nanobubbles and an aqueous solution containing oxygen nanobubbles having an average particle diameter of 30 nm or less and a density of 1016 or more per ml when measured with a cryo-transmission electron microscope by an embedding method, The aqueous solution obtained by mixing can be used for the treatment and prevention of cancer by in vivo administration as an infusion solution or physiological saline, or by ingestion. As the physiological saline used in that case, the content of sodium chloride is not necessarily 0.85 to 0.95% by mass, and may be less than 0.85% by mass. In some cases, nanobubble pure water of ozone and oxygen that does not contain sodium chloride can be prepared and taken orally.
本発明によるオゾン及び酸素のナノバブルを含む水溶液を癌の治療及び予防に適用できると考えられる理由は次の通りである。 The reason why the aqueous solution containing ozone and oxygen nanobubbles according to the present invention can be applied to the treatment and prevention of cancer is as follows.
従来から癌細胞は嫌気性雰囲気下で増殖しやすいことが知られており、癌細胞の周辺を酸素ナノバブル水によって酸素濃度の高い好気性にすることにより、その増殖及び肥大化が抑えられるではないかと考えられる。他方、オゾンナノバブル水は、オゾンが活性酸素として機能するため癌細胞に対して侵襲性を発現し、癌細胞を小さくする効果を有するものと考えられる。このことは、放射線によって癌の治療を行う場合、放射線が活性酸素の形成に大きく寄与しており、仮に、癌細胞周辺に酸素がない酸欠状態では放射線による癌治療の効果がほとんど得られないという報告からも推察できる（例えば、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ Ｍ，Ｉｔａｓａｋａ Ｓ，Ｈａｒａｄａ Ｈ，Ｈｉｒａｏｋａ Ｍ． Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ． ＢｉｏＭｅｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１３；２０１３：６８５３０８等を参照）。 Conventionally, cancer cells are known to proliferate easily under anaerobic atmosphere, and their growth and hypertrophy are not suppressed by making the periphery of cancer cells aerobic with high oxygen concentration by oxygen nanobubble water. It is thought. On the other hand, ozone nanobubble water is considered to have an effect of expressing invasiveness to cancer cells and reducing the size of cancer cells because ozone functions as active oxygen. This means that when cancer is treated with radiation, radiation greatly contributes to the formation of active oxygen, and in the absence of oxygen in the vicinity of cancer cells, the effect of cancer treatment with radiation is hardly obtained. (See, for example, Yoshimura M, Itasaka S, Harada H, Hiraoka M. Microenvironment and radiation therapy. BioMed research international, 2013; 2013: 685308, etc.).
従来のオゾンナノバブル水を使用した癌の治療及び予防においては、例えば、前記特許文献３に開示されているように、気泡径が５０ｎｍ〜５００ｎｍのナノバブル水を使用していた。しかしながら、生体内の正常な細胞や血管の表面に存在する孔径は３０ｎｍ以下、具体的には数ｎｍ〜十数ｎｍの範囲であるため、酸素及びオゾンのナノバブル水内に存在する気泡径が５０ｎｍ以上では、生体内の細胞又は血管の内部への吸収性又は浸透性が必ずしも十分であるとは言えなかった。さらに、生体は通常３５〜３７℃とやや高温に維持されているため、ナノバブルの気泡径が大きくなるほど、バブルの大径化が加速されバブル消失が促進されることから、癌細胞の増殖及び肥大化を抑制又は防止する効果が十分に得られなかった。仮に、その効果があったとしても安定的に持続するものではなかった。 In the treatment and prevention of cancer using conventional ozone nanobubble water, for example, as disclosed in Patent Document 3, nanobubble water having a bubble diameter of 50 nm to 500 nm has been used. However, since the pore size present on the surface of normal cells and blood vessels in the living body is 30 nm or less, specifically in the range of several nanometers to tens of nanometers, the bubble diameter present in the nanobubble water of oxygen and ozone is 50 nm. From the above, it cannot be said that the absorbability or permeability into cells or blood vessels in a living body is necessarily sufficient. Furthermore, since the living body is usually maintained at a slightly high temperature of 35 to 37 ° C., the larger the bubble diameter of the nanobubble, the more the bubble diameter is accelerated and the disappearance of the bubble is promoted. The effect of suppressing or preventing crystallization was not sufficiently obtained. Even if there was an effect, it did not continue stably.
それに対して、本発明の生体投与可能な水溶液に含まれるオゾンナノバブル及び酸素ナノバブルは、気泡の平均粒径が３０ｎｍ以下、好ましくは１〜１０ｎｍであり、加えてバブルの密度が非常に高いため、生体内細胞や血管内への吸収性又は浸透性が優れるとともに、その気泡径で存在するナノバブルの寿命が相対的に長くなる。酸素ナノバブルは癌細胞の周辺環境を酸素濃度の高い好気性雰囲気に長期間維持することが可能になり、癌の増殖及び肥大化を抑制又は防止する効果が高くなる。他方、オゾンナノバブルは正常細胞に対して低侵襲性であるが、菌やビールス及び癌等の異常細胞に対しては活性酸素として機能し、高い侵襲性を有することが期待される。そして、これらの効果は、従来の平均粒径がやや大きなナノバブルに比べて、相対的に長期間にわたって持続することが可能になる。以上の点から、本発明によるオゾンナノバブル及び酸素ナノバブルの両者を有する水溶液は、癌の治療及び予防のための薬剤としての機能を有しており、癌治療等の医療分野において好適な水溶液であると考えられる。 On the other hand, the ozone nanobubbles and oxygen nanobubbles contained in the bioadministrable aqueous solution of the present invention have an average bubble diameter of 30 nm or less, preferably 1 to 10 nm, and in addition, the density of the bubbles is very high. It has excellent absorbability or penetrability into living cells and blood vessels, and the lifetime of nanobubbles existing with the bubble diameter is relatively long. Oxygen nanobubbles can maintain the surrounding environment of cancer cells in an aerobic atmosphere with a high oxygen concentration for a long period of time, and the effect of suppressing or preventing cancer growth and hypertrophy is enhanced. On the other hand, ozone nanobubbles are less invasive to normal cells, but are expected to function as active oxygen and have high invasiveness to abnormal cells such as bacteria, viruses, and cancer. These effects can be sustained over a relatively long period of time compared to nanobubbles having a slightly larger average particle size. From the above points, the aqueous solution having both ozone nanobubbles and oxygen nanobubbles according to the present invention has a function as a drug for the treatment and prevention of cancer and is a suitable aqueous solution in the medical field such as cancer treatment. it is conceivable that.
本発明において、前記オゾンナノバブルを含む水溶液と前記酸素ナノバブルを含む水溶液との混合割合は特に限定されないが、前記オゾンナノバブルによる癌細胞への侵襲性の効果を十分に得るために、前記オゾンナノバブルを含む水溶液を１体積％以上で混合することが好ましい。本発明のオゾンナノバブル水は、配合比率が１００体積％であっても正常細胞に悪影響がほとんどみられない点に大きな特徴を有するが、前記酸素ナノバブルを含む水溶液による癌細胞の増殖及び肥大化を抑える効果を活かすため、前記オゾンナノバブルを含む水溶液と前記酸素ナノバブルを含む水溶液との混合割合は体積比で１：９９〜８０：２０の範囲にするのがより好ましい。 In the present invention, the mixing ratio of the aqueous solution containing ozone nanobubbles and the aqueous solution containing oxygen nanobubbles is not particularly limited, but in order to sufficiently obtain the invasive effect on cancer cells by the ozone nanobubbles, the ozone nanobubbles are used. It is preferable to mix the aqueous solution containing 1 vol% or more. The ozone nanobubble water of the present invention has a great feature in that even if the blending ratio is 100% by volume, normal cells are hardly adversely affected. However, the growth and enlargement of cancer cells by the aqueous solution containing the oxygen nanobubbles can be achieved. In order to make use of the suppressing effect, the mixing ratio of the aqueous solution containing ozone nanobubbles and the aqueous solution containing oxygen nanobubbles is more preferably in the range of 1:99 to 80:20 by volume ratio.
次に、本発明の生理食塩水を製造するためのオゾンナノバブル発生装置について図面を用いて説明する。 Next, an ozone nanobubble generator for producing the physiological saline of the present invention will be described with reference to the drawings.
図１は本発明で使用するオゾンナノバブル発生装置の一例を示す図であり、基本的な構成は特許第５５５５８９２号公報に記載されている装置と同じである。図１において（ａ）及び（ｂ）は、それぞれオゾンナノバブル発生装置の正面図と斜視図である。図１に示すオゾンナノバブル発生装置１において、２がベローズシリンダポンプ、３が気液混合槽、４がポンプコントローラ、５が圧力センサ、６がマイクロ・ナノバルブ発生用ノズル取付部、７が液吸引管、８が気体吸引口、９が気体吸引調整バルブである。 FIG. 1 is a view showing an example of an ozone nanobubble generator used in the present invention, and the basic configuration is the same as that described in Japanese Patent No. 5555892. 1A and 1B are a front view and a perspective view, respectively, of an ozone nanobubble generator. In the ozone nanobubble generator 1 shown in FIG. 1, 2 is a bellows cylinder pump, 3 is a gas-liquid mixing tank, 4 is a pump controller, 5 is a pressure sensor, 6 is a nozzle mounting portion for generating micro / nanovalves, and 7 is a liquid suction tube. , 8 is a gas suction port, and 9 is a gas suction adjustment valve.
これらは、図１の（ｂ）に示す斜視図のように配置する。接液部をフッ素樹脂で作成したベローズシリンダポンプ２で７の液吸引管、９の気体吸引調整バルブを使用して気体量を調整してポンプ内部に液と気体を混ぜた状態で吸い込んでベローズ内部で撹拌、溶存させて、圧縮液の中に酸素を溶存させる。本発明においては、ベローズシリンダポンプ２はメタルフリーであれば良く、フッ素樹脂以外のプラスチック、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリエチレンテレフタレート等の汎用プラスチック、ポリアセタール、ポリアミド、ポリカーボネート及び変性ポリフェニレンエーテル等のエンジニアリングプラスチック、ポリエーテルサルフォン、ポリフェニレンスルフィド、ポリエーテルエーテルケトン及び液晶ポリマー等のスーパーエンジニアリング等の少なくとも１種を使用しても良い。その場合、ポンプだけでなく、液設部にもフッ素樹脂を始め、前記の各種プラスチックを用いることによって、信頼性の高い清浄なオゾンナノバブル発生装置とすることができる。また、本発明において、厳密なメタルフリー化による洗浄や殺菌が要求されない場合には、上記のプラスチックだけでなく、金属やセラミックスを使用しても良い。 These are arranged as shown in the perspective view of FIG. The bellows cylinder pump 2 with the liquid contact part made of fluororesin 2 adjusts the amount of gas using the 7 liquid suction pipe and 9 gas suction adjustment valve, and sucks the liquid and gas mixed in the pump and bellows Stir and dissolve inside to dissolve oxygen in the compressed liquid. In the present invention, the bellows cylinder pump 2 may be metal-free, plastic other than fluororesin, for example, general-purpose plastics such as polyethylene, polypropylene and polyethylene terephthalate, engineering plastics such as polyacetal, polyamide, polycarbonate and modified polyphenylene ether, You may use at least 1 sort (s), such as super engineering, such as polyether sulfone, polyphenylene sulfide, polyether ether ketone, and a liquid crystal polymer. In that case, a highly reliable clean ozone nanobubble generator can be obtained by using not only the pump but also the above-mentioned various plastics including the fluororesin in the liquid installation part. In the present invention, in the case where strict metal-free cleaning and sterilization are not required, not only the plastics but also metals and ceramics may be used.
次に、気液混合槽３に気体（オゾン）と液をポンプ２で撹拌して圧送する。ポンプ２は、主に圧縮空気起動式ベローズシリンダポンプを使用するが、電動式のものであっても良い。気液混合槽３の気体（オゾン）と液とは、ポンプ２からの圧力を受けており、気体（オゾン）が溶存しやすくなる。つまり気体（オゾン）と液体とをポンプ２から圧送する圧力を５の圧力センサでチェックしている。この方法によって溶存気体の量を多くしてナノバブルの発生量を増やす準備を行う。本発明のオゾンナノバルブ発生システムはポンプ２としてベローズシリンダポンプを用いるのが実用的であるが、用途に応じて、従来から送液ポンプとして公知のピストンポンプ、プランジャーポンプ又はダイヤフラム等の往復動ポンプや、ギヤーポンプ、偏心ポンプ又はネジポンプ、カスケードポンプ、ベーンポンプ等の回転ポンプ等を適用することができる。
Next, gas (ozone) and liquid are stirred and pumped into the gas-liquid mixing tank 3 by the pump 2. The pump 2 mainly uses a compressed air activated bellows cylinder pump, but may be an electric type. The gas (ozone) and liquid in the gas-liquid mixing tank 3 are subjected to pressure from the pump 2, and the gas (ozone) is easily dissolved. That is, the pressure at which gas (ozone) and liquid are pumped from the pump 2 is checked by the
圧送されて気液混合槽３に入った液はオゾンと混合して、オゾンを液の内部に溶存させてからナノバルブ発生用ノズル取り付け部６に送る。ナノバルブ発生用ノズル取り付け部６は、溶存したオゾンを直径が３０ｎｍ以下、好ましくは１ｎｍ〜１０ｎｍの大きさのオゾンナノバルブを大量に作成するノズルと接続する部分である。
The liquid that has been pumped and entered the gas-liquid mixing tank 3 is mixed with ozone, dissolved in the liquid, and then sent to the nanovalve generating
このとき、５の圧力センサでノズル６と気液混合槽３との間の液圧力の変動をみて気液の溶存状態を監視する。こうすることで安定したナノバルブ用発生ノズルに必要な一定した圧力状態を実現する。
At this time, the dissolved state of the gas-liquid is monitored by looking at the fluctuation of the liquid pressure between the
図１の（ａ）及び（ｂ）に示す本発明で使用するオゾンナノバルブ発生装置を用いて実施する工程は次の通りである。液吸引管７、気体（酸素）吸引口８及び気体吸引調整バブル９を用いて行うのが気体・液体吸引工程である。圧力は、圧力センサ５で調整する。次に、ベローズシリンダポンプ２を用いてオゾンを含有する気体を含む液体を加圧する工程が気体・液体加圧工程である。引き続き、加圧された前記の気体を含む液体を新たなオゾンと混合させるために、ポンプコントローラ４及び気液混合槽３を用いて行う工程が溶存気体富化工程である。その後、後述する本発明の発生ノズルをオゾンナノバルブ発生用ノズル取付部６に接続してからオゾンナノバブルを発生させる。この工程を溶存気体微細化工程と呼ぶが、オゾンナノバブルは、２以上の貫通***を有する筒の外部から該貫通***を通して大気圧以上の圧力で噴射し、前記筒の内部の一点で衝突させることによって発生させることができる。
The steps performed using the ozone nanovalve generator used in the present invention shown in FIGS. 1A and 1B are as follows. The gas / liquid suction step is performed using the
本発明で使用するオゾンナノバルブ発生装置においては、空気が含まれる通常の液体を真空下で脱気処理することにより液体中に含まれる空気をできるだけ除いた状態にした液体を使用してもよい。脱気処理後の液体は、気体吸入口８から吸引したオゾン及び／又は溶存気体富化工程において新たなオゾンとそれぞれ混合された後、本発明で使用するバブル発生ノズルを用いてオゾンナノバブルの発生を行うことにより、オゾンナノバブルを含む液体として使用される。この方法は、オゾンを混合する前に液体を脱気することにより、後で行うオゾンの混合及び溶存の工程で液体中のオゾン濃度を高める効果が得られることから本発明の製造方法において好適に採用される。 In the ozone nano-valve generator used in the present invention, a liquid in which air contained in the liquid is removed as much as possible by degassing a normal liquid containing air under vacuum may be used. . The degassed liquid is mixed with ozone sucked from the gas suction port 8 and / or new ozone in the dissolved gas enrichment step, and then the generation of ozone nanobubbles using the bubble generating nozzle used in the present invention. Is used as a liquid containing ozone nanobubbles. This method is suitable for the production method of the present invention because the effect of increasing the ozone concentration in the liquid can be obtained in the step of mixing and dissolving the ozone by degassing the liquid before mixing the ozone. Adopted.
図２に 図１の洗浄装置において、オゾンナノバブルを発生させるノズル形状及び処理液を噴射するノズルヘッダーの例をそれぞれ示す。図２において、（ａ）及び（ｂ）は、それぞれノズルヘッダー１０の断面図及び上面図である。図２の（ａ）は、（ｂ）のＤ−Ｄ断面を示している。
FIG. 2 shows an example of a nozzle shape for generating ozone nanobubbles and a nozzle header for injecting treatment liquid in the cleaning apparatus of FIG. 2, (a) and (b) are a sectional view and a top view of the
図２の（ａ）及び（ｂ）に示すように、ノズルヘッダー１０は、処理液を噴射するための噴射ノズル１１及びオゾンナノバブルを吐出させるための液衝突ノズル１２と台１３とから構成されており、液衝突ノズル１２の１個又は２個以上を１３の台上に取り付け配置する。ここで、液衝突ノズル１２が、オゾンナノバブルを発生させるノズル形状の例である。
As shown in FIGS. 2A and 2B, the
図３は、図２の（ａ）に示すノズルヘッダー１０の液衝突ノズル１２を配置した部分の拡大図である。図３に示すように、１２の液衝突ノズルの１個の形状において、１２ａの小さな穴は１２の中心に向かって空いている。この小さな穴１２ａを通り、高圧で入った液を液衝突ノズル１２の中心部分で衝突させてナノバブルを発生させ、矢印Ｑで示す方向に噴射する。実験の結果、液の速度Ｖをコントロールすれば、発生したナノバブルの量が多く、かつバブルの寿命が長くなることがわかった。速度Ｖの目安として、２５m／秒を超える速度になると安定したナノバブル発生ノズルになる。
FIG. 3 is an enlarged view of a portion where the
図２及び図３において液衝突ノズル１２から噴射した水溶液（Ｑ）は、例えば、塩化ナトリウム等の所望の添加物を有するオゾンナノバブルを含む水溶液を製造するときに、次の２つの方法に従って調整する。第１の方法は、図１に示す液吸引管７によって吸引する液として、塩化ナトリウム等の所望の添加物を所定の配合量で含有する水溶液を使用し、該水溶液にオゾンを溶存させた後に噴射ノズル１１から噴射して得られる気液混合液をそのままオゾンナノバブルを含む水溶液とする方法である。また、第２の方法においては、図１に示す液吸引管７によって吸引する液として塩化ナトリウム等の添加物を含まない水溶液（純水を含む）を使用し、オゾンナノバブルを含む水溶液を製造した後、前記オゾンナノバブルを含む水溶液に、塩化ナトリウム等の添加物を前記水溶液の１００質量部に対して所定の含有量で配合することによりオゾンナノバブルを含む水溶液として用いる。
The aqueous solution (Q) ejected from the
液噴射ノズル１１からの水流を用いてオゾンナノバルブを作成する方法について説明する。高速ジェット液噴射ノズル１１から出たベローズシリンダポンプ２からなる高圧ポンプの吐出圧力（大気圧以上）状態から圧力を急激に解放するので、オゾンが溶存する液が互いに激突し、その水撃力で炸裂する力で気体を溶存した液を砕いてオゾンナノバルブを大量に含む状態にする。ただし解放する方法によっては、オゾンナノバブルの発生量が少なくなってしまう場合があるが、本発明による方法と装置によってオゾンナノバブルを大量に発生させることができる。 A method of creating an ozone nanovalve using the water flow from the liquid injection nozzle 11 will be described. Since the pressure is suddenly released from the discharge pressure (above atmospheric pressure) state of the high-pressure pump composed of the bellows cylinder pump 2 that is discharged from the high-speed jet liquid injection nozzle 11, the liquids in which the ozone is dissolved collide with each other, and the water hammer force The liquid in which the gas is dissolved is crushed by the bursting force, and a large amount of ozone nanobulbs are contained. However, although the amount of ozone nanobubbles generated may be reduced depending on the method of releasing, a large amount of ozone nanobubbles can be generated by the method and apparatus according to the present invention.
本発明の水溶液に含まれるオゾンナノバブルは、例えば、図２及び図３に示すような構造を有する液衝突ノズル１２を使用することによって、気液混合の状態にある溶存液を噴射するときの圧力が大気圧（約０．１ＭＰａ）以上であれば、オゾンナノバブルの発生量を従来と同等以上にすることができる。さらに、この圧力を０．２ＭＰａ以上に設定することによって、十分な量で発生させたオゾンナノバブルを含む水溶液を製造することができる。このように、本発明においては溶存液の噴射圧力の下限値を０．２ＭＰａと従来よりも低くできるため、金属コンタミの影響を無くすために好適なポンプ、例えば、フッ素樹脂で作製した圧縮空気駆動式又は電動式のベローズシリンダポンプ２を使用することが可能となる。酸素溶存液の噴射圧力の上限値は特に規定されないが、噴射圧力の増大に伴うオゾンナノバブル発生装置１の負荷を低減したい場合には１．０ＭＰａ以下に設定することが好ましい。
The ozone nanobubbles contained in the aqueous solution of the present invention are, for example, a pressure when jetting a dissolved liquid in a gas-liquid mixed state by using a
本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液水を製造するときに使用するオゾンナノバブル発生装置のノズルは、大気圧以上、好ましくは０．２ＭＰａ以上という従来よりも低い圧力でも溶存液のジェット流を噴射できるように設計する。気体溶存液のジェット流の噴射及び衝突によって得られる水撃力をＦとする。水撃力Ｆは、液の密度をρ、小さい穴の大きさをＳ、液の速度をＶとするとき、Ｆ＝ρSV2の関係が成り立つ。Ｆを最適値にするためには、穴の大きさSと速度Ｖの関係を考慮した最適設計が必要になる。 The nozzle of the ozone nanobubble generator used when producing the aqueous solution containing ozone nanobubbles of the present invention can inject a jet of dissolved liquid even at a pressure lower than the conventional pressure of atmospheric pressure or higher, preferably 0.2 MPa or higher. To design. Let F be a water hammer obtained by jetting and colliding a jet of gas dissolved liquid. The water hammer F has a relationship of F = ρSV2, where ρ is the density of the liquid, S is the size of the small hole, and V is the speed of the liquid. In order to set F to an optimum value, an optimum design is required in consideration of the relationship between the hole size S and the speed V.
本発明で使用するオゾンナノバブル発生装置においては、図２及び図３の１２で示す液衝突ノズルが有する貫通孔の径Ｓ、すなわち小さな穴１２ａの径が０．１〜０．５ｍｍであることが好ましく、さらに０．２〜０．４ｍｍであることがより好ましい。ここで、液衝突ノズル１２の穴１２ａの径が０．１ｍｍ未満であると、粒径が小さな微細オゾンバブルの生成量は増える傾向にあるものの、１ｎｍ以上の粒径を有するバブルの生成量が急激に少なくなるため、オゾンナノバブルの発生量が低下して、オゾンナノバブルの密度低下が顕著になる。また、液衝突ノズル１２の穴１２ａの径が０．５ｍｍを超えると、１ｎｍ以上の粒径を有するバブルの総生成量は増えるものの、逆に、１０ｎｍ以下の小粒径バブルの生成量が急激に減少するため、平均粒径の増大に伴ってオゾンナノバブルの安定性が急激に低下し、本発明の効果を十分に奏することができない。したがって、本発明においては、オゾンナノバブルの平均粒径を３０ｎｍ以下と小さくし、オゾンナノバブルの密度を水溶液１ｍｌあたり１０１６個以上と大量にするために、液衝突ノズル１６の貫通小孔径は０．１〜０．５ｍｍの範囲で設けることがより好ましい。さらに、液衝突ノズル１６の貫通小孔径を０．２〜０．４ｍｍの範囲で設けることにより、オゾンナノバブルの平均粒径及び密度をそれぞれ１〜１０ｎｍ及び水溶液１ｍｌあたり１０１７個以上にすることができる。In the ozone nanobubble generator used in the present invention, the diameter S of the through hole of the liquid collision nozzle shown by 12 in FIGS. 2 and 3, that is, the diameter of the
同じ効果は、四方から中心に向けて発射してセンターに水撃を集中させることで速度をより高めることができ、平均粒径がより小さなオゾンナノバブルを大量に発生させることができる。そのため、四方からの水撃を行う場合には、水噴射の速さが同じある場合、貫通孔の穴の個数に応じてより大きな効果を得ることができる。例えば、F=ρSV２なので貫通小孔が４穴があり、それらが中心に集中する場合は、中心に集まる力F=４ρSV２になり、貫通孔の穴の個数が２の場合と比べて２倍の水撃力が得られる。このように液が衝突して中心に水撃を集中させるのにノズルの小さい穴の個数を多くすると、流量が多くなるため液の衝突するエネルギーが高くなる。オゾンナノバブルの発生量は液の衝突するエネルギーが大きくなれば、より小さな平均粒径を有するオゾンナノバブルを大量に発生させることができる。The same effect can be achieved by increasing the speed by launching from four directions to the center and concentrating the water hammer at the center, and can generate a large amount of ozone nanobubbles having a smaller average particle diameter. Therefore, when performing water hammer from four directions, if the speed of water injection is the same, a greater effect can be obtained according to the number of holes in the through hole. For example, if F = ρSV 2 and there are 4 through-holes and they are concentrated at the center, the force gathered at the center is F = 4ρSV 2, which is 2 compared to the case of 2 through-holes. Double water hammer power is obtained. In this way, if the number of small holes in the nozzle is increased in order for the liquid to collide and concentrate the water hammer in the center, the flow rate increases and the energy of the liquid colliding increases. If the energy with which the liquid collides increases as the amount of ozone nanobubbles generated, a large amount of ozone nanobubbles having a smaller average particle size can be generated.
本発明においては、液衝突ノズル１２の貫通小孔径を０．１〜０．５ｍｍと規定することにより、オゾン溶存液の速度Ｖが上昇し、発生するオゾンナノバブルの平均粒径を小さくできる効果が得られる。加えてオゾンナノバブルの密度も同時に高くする必要があるため、液衝突ノズル１２の貫通小孔の個数は、液衝突ノズル１２の筒の周方向等間隔に４個以上８個以内で設けることが好ましい。液衝突ノズル１２の貫通小孔の個数が３個以下であると、オゾンナノバブルの密度の低下が顕著になる。また、貫通小孔の個数が９個以上である場合は、オゾンナノバブルの密度向上の効果が飽和するだけでなく、液衝突ノズル１２の貫通小孔の位置合せを行うときに高精度が要求されるため、液衝突ノズル１２の製造が非常に困難になる。
In the present invention, by defining the through hole diameter of the
また、本発明で使用するオゾンナノバブル発生装置において、液衝突ノズル１２の形状は、１２ａの***を４〜８個で周方向に等間隔に設けるだけでなく、例えば、液衝突ノズル１２の長手方向に２段以上で並行して貫通小孔の穴をあけ、液の水撃の発生する場所を２ヵ所以上にしてもよい。それによりナノバブルを大量に発生させることが可能になるので、ノズルの小型化と効率化には有効な方法である。さらに、４個以上の***から液を同時に吐出させることで水撃の強度を増加させることができるため、液の速度Ｖを上げなくとも３０ｎｍ以下の平均粒径を有するオゾンナノバブルを大量に発生できる。そのため、高圧で液を吐出させるポンプが必要でなくなり、負担が少なくて済むため、工業的には、非常に有益な技術で、エネルギー効率の良いノズルの開発ができる。
Further, in the ozone nanobubble generator used in the present invention, the shape of the
以下において、本発明に基づく実施例を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Examples according to the present invention will be specifically described below, but the present invention is not limited to these examples.
＜参考例１＞
特許第５５５５８９２号公報に開示された方法に従ってナノバブル水作製装置ΣPM-5 (ベローズポンプ式) (シグマテクノロジー有限会社製)により空気ナノバブル水を作製し、純水によって１００倍に希釈して測定用試料として用いた。液噴射ノズルとして、図２に示す液衝突ノズル１２を有するものを使用した。液衝突ノズル１２に設ける貫通小孔の穴は、液衝突ノズル１２を構成する筒の径方向断面と平行な同一平面上で対向するように、前記筒の周方向等間隔に６個で設けられており、前記筒の空洞に通じる部分の孔径が０．３ｍｍである。また、参考用試料としてナノバブル作製前の純水を用いた。ナノバブル作製前の純水は、ナノバブルを含まない水に相当する。<Reference Example 1>
According to the method disclosed in Japanese Patent No. 5555892, nanobubble water preparation device ΣPM-5 (bellows pump type) (manufactured by Sigma Technology Co., Ltd.) produces air nanobubble water and dilutes it 100 times with pure water for measurement sample Used as. A liquid jet nozzle having the
試料急速凍結装置Vitrobot Mark IV (FEI社製)により作製直後の前記空気ナノバブル水を急速凍結してナノバブルをアモルファス氷中に包埋した試料を作製し、観察用試料とした。試料厚さは２００ｎｍである。一方、ナノバブルを含まない水（純水）についても同じ試料急速凍結装置により急速凍結して参考用試料とした。試料厚さは２００ｎｍである。３００ｋｅＶの電子エネルギーを有するクライオ透過型電子顕微鏡Titan Krios (FEI社製)を用いて、試料温度約８０Ｋにおいてアモルファス氷中に包埋されたナノバブルを直接観察した。観察に用いる電子線は、Ｌｏｗ ｄｏｓｅ技術によって２０ 電子/Å２程度であり、撮影中の試料温度の上昇はほとんどなかった。 A sample in which nanobubbles were embedded in amorphous ice by rapidly freezing the air nanobubble water immediately after preparation by a sample quick freezing apparatus Vitrobot Mark IV (manufactured by FEI) was used as an observation sample. The sample thickness is 200 nm. On the other hand, water (pure water) that does not contain nanobubbles was quickly frozen by the same sample quick freezing device to obtain a reference sample. The sample thickness is 200 nm. Using a cryo-transmission electron microscope Titan Krios (manufactured by FEI) having an electron energy of 300 keV, nanobubbles embedded in amorphous ice were directly observed at a sample temperature of about 80K. The electron beam used for observation was about 20 electrons / Å2 by the low dose technique, and there was almost no increase in the sample temperature during imaging.
図４に、空気ナノバブルを含む純水を凍結したアモルファス氷及び純水（ナノバブルを含まない水）を凍結したアモルファス氷について電子顕微鏡像の写真を示す。また、空気ナノバブル水については、電子顕微鏡写真の下にバブルの粒度分布（サイズ分散を示すヒストグラム）を示す。 FIG. 4 shows photographs of electron microscopic images of amorphous ice frozen pure water containing air nanobubbles and amorphous ice frozen pure water (water not containing nanobubbles). Moreover, about air nano bubble water, the particle size distribution (histogram which shows size dispersion | distribution) of a bubble is shown under an electron micrograph.
図４の左側に示す電子顕微鏡像の写真は、ΣＰＭ−５によって作製後、ただちに観察された空気ナノバブルであり、写真中に観察される円形のコントラストがナノバブルである。画像処理の結果、平均粒径は７ｎｍである。ヒストグラムの測定に用いたアモルファス氷の体積は3.2×10-14 cc（400 nm×400 nm×200 nm厚さ）であり、その中にバブルは約260個含まれている。100倍に希釈したナノバブル水を観察していることから、このナノバブル水の空気ナノバブルの濃度は、8.1×1017個/cc (mｌ)（81京個/cc (mｌ)）であると評価される。それに対して、図４の右側に示す電子顕微鏡像の写真はアモルファス氷でありコントラストの変化はなく、バブルが含まれない水であることが確認できる。このように、本発明による測定方法及び測定装置によって、水に含まれるナノバブルの存在を直接的に画像として確認することができるだけでなく、ナノバブルの粒子径、個数、粒度分布及び形態に関する情報を取得することができる。The photograph of the electron microscopic image shown on the left side of FIG. 4 shows air nanobubbles observed immediately after being produced by ΣPM-5, and the circular contrast observed in the photograph is nanobubbles. As a result of the image processing, the average particle diameter is 7 nm. The volume of amorphous ice used for the measurement of the histogram is 3.2 × 10 −14 cc (400 nm × 400 nm × 200 nm thickness), and about 260 bubbles are included in it. Since nanobubble water diluted 100 times is observed, the concentration of air nanobubbles in this nanobubble water is estimated to be 8.1 × 10 17 / cc (ml) (81 Kyo / cc (ml)). The On the other hand, the photograph of the electron microscopic image shown on the right side of FIG. 4 is amorphous ice, there is no change in contrast, and it can be confirmed that the water does not contain bubbles. As described above, the measurement method and the measurement apparatus according to the present invention can not only directly confirm the presence of nanobubbles contained in water as an image, but also acquire information on the particle size, number, particle size distribution, and morphology of nanobubbles. can do.
＜実施例１＞
空気に代えてオゾンを用いたことを除いては、参考例１を同様の装置を用いて、同じ方法によってオゾンナノバブルを含む水溶液を製造した。本実施例によるオゾンナノバブルを含む生理食塩水は、クライオ透過型電子顕微鏡Titan Krios (FEI社製)を用いて、上記と同じ条件と方法によって酸素ナノバブルの平均粒径及び密度を測定した結果、酸素ナノバブルの平均粒径及び密度は、それぞれ１〜１０ｎｍ以下及び１×１０１７個／ｃｃ（ｍｌ）以上であることが確認された。この水溶液を実施例１とする。<Example 1>
An aqueous solution containing ozone nanobubbles was produced by the same method as in Reference Example 1 using the same apparatus except that ozone was used instead of air. The physiological saline containing ozone nanobubbles according to this example was measured by measuring the average particle size and density of oxygen nanobubbles using the cryo-transmission electron microscope Titan Krios (manufactured by FEI) under the same conditions and method as described above. It was confirmed that the average particle diameter and density of the nanobubbles were 1 to 10 nm or less and 1 × 10 17 pieces / cc (ml) or more, respectively. This aqueous solution is referred to as Example 1.
＜比較例１＞
オゾンナノバブルを発生させる前の純水を比較例１として用いた。比較例１の水溶液は、図４の右側に示すように、ナノバブルが含まれない水である。<Comparative Example 1>
Pure water before generating ozone nanobubbles was used as Comparative Example 1. The aqueous solution of Comparative Example 1 is water that does not contain nanobubbles, as shown on the right side of FIG.
以上のようにして製造されたオゾンナノバブルを含む水溶液（実施例１）及び酸素ナノバブルを含まない水溶液（比較例１）を用いて細胞培養液を作製し、該細胞培養液中で血管平滑筋細胞の培養をおこなうときに細胞のアデノウイルス感染に対する防御効果を検証した。検証は、以下の方法で行った。 A cell culture solution is prepared using the aqueous solution containing ozone nanobubbles produced as described above (Example 1) and the aqueous solution not containing oxygen nanobubbles (Comparative Example 1), and vascular smooth muscle cells are produced in the cell culture solution. When the cells were cultured, the protective effect against adenovirus infection of the cells was verified. The verification was performed by the following method.
ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の１０質量％を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）[ＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ]を注入したガラス製の細胞培養用ウエルプレートに、血管平滑筋細胞を１０００００個を入れて播種を行った後、１晩インキュベーション（低温培養）を行ったものを２群準備し、それぞれ実施例１及び比較例１の検証のために使用した。他方で、ウイルス感染を起こさせるために使用するウイルスは、アデノウイルス浮遊液を作製し、二酸化炭素を含む孵卵器（インキュベータ）の中で一晩留置したものを使用した。ここで、アデノウイルス浮遊液を含むガラス製ウエルプレートを２群準備し、２つのウエルプレートにはあらかじめ実施例１のオゾンナノバブルを含む水溶液に２％ＦＢＳを含有する媒体、及び比較例１の水溶液からなるＤＭＥＭ２％ＦＢＳ媒体、をそれぞれ注入しておいた。 100000 vascular smooth muscle cells were seeded in a glass cell culture well plate into which Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) [DMEM 10% FBS] containing 10% by mass of fetal bovine serum (FBS) was injected. After that, two groups of overnight incubation (cold culture) were prepared and used for verification of Example 1 and Comparative Example 1, respectively. On the other hand, the virus used for causing the virus infection was an adenovirus suspension prepared and left overnight in an incubator containing carbon dioxide. Here, two groups of glass well plates containing adenovirus suspension were prepared, and the medium containing 2% FBS in the aqueous solution containing the ozone nanobubbles of Example 1 in advance and the aqueous solution of Comparative Example 1 were prepared in the two well plates. A DMEM 2% FBS medium consisting of
次いで、１晩インキュベーションして細胞の培養を行った後の細胞培養用ウエルプレート中に存在する血管平滑筋細胞の培養上清の一部（細培養液の３０体積％）を前記アデノウイルス浮遊液の同量で置換した後、さらに４８時間培養（インキュベーション）した。細胞のウイルス感染状態は、インキュベーションの２４時間後及び４８時間後に前記ウエルプレートを蛍光顕微鏡によって観察し、写真撮影することにより確認した。仮に細胞がウイルスに感染される場合は、撮影した写真図において、感染した細胞の箇所に強く輝いた緑色の光を観測することができる。 Next, after culturing the cells by overnight incubation, a part of the culture supernatant of vascular smooth muscle cells (30% by volume of the fine culture solution) present in the well plate for cell culture is transferred to the adenovirus suspension. After replacing with the same amount of, the mixture was further incubated for 48 hours (incubation). The virus infection state of the cells was confirmed by observing the well plate with a fluorescence microscope after 24 and 48 hours of incubation and taking a photograph. If a cell is infected with a virus, it is possible to observe a bright green light at the location of the infected cell in the photograph taken.
図５は、実施例１及び比較例１の水溶液を用いて作製した細胞培養液中のウイルス感染状態を示す写真図であり、（ａ）及び（ｂ）にそれぞれ２４時間後及び４８時間後の結果を示す。図５に示す写真撮影図において、点線で囲んだ部分がウイルス感染箇所である。図５の（ａ）に示すように、２４時間培養後は実施例１及び比較例１による両者の細胞培養液ともにウイルス感染が観測されなかった。その後の４８時間の培養では、図５の（ｂ）に示すように、実施例１による細胞培養液はウイルス感染が観測されなかったのに対して、比較例１による細胞培養液においてウイルス感染箇所が３箇所観測された。このように、実施例１と比較例１との間にはウイルス感染率の違いが有意差でみられており、実施例１のオゾンナノバブルを含む水溶液を有する細胞培養液を使用することにより細胞のウイルス感染を抑制又は防止する効果が得られることが分かった。また、実施例１の水溶液を有する細胞培養液中には、比較例１の場合と同様に、４８時間培養後でも細胞の損傷又は損害がみられず、細胞形態が保持されていることが確認できた。 FIG. 5 is a photograph showing the virus infection state in the cell culture solution prepared using the aqueous solutions of Example 1 and Comparative Example 1, and (a) and (b) show the results after 24 hours and 48 hours, respectively. Results are shown. In the photographed photograph shown in FIG. 5, the part surrounded by a dotted line is a virus infected part. As shown in FIG. 5 (a), no virus infection was observed in the cell culture solutions of both Example 1 and Comparative Example 1 after 24 hours of culture. In the subsequent 48-hour culture, as shown in FIG. 5 (b), no virus infection was observed in the cell culture solution of Example 1, whereas in the cell culture solution of Comparative Example 1, the virus infection site Were observed in three places. Thus, there is a significant difference in virus infection rate between Example 1 and Comparative Example 1, and cells can be obtained by using the cell culture solution having the aqueous solution containing ozone nanobubbles of Example 1. It has been found that the effect of suppressing or preventing the virus infection can be obtained. Further, in the cell culture solution having the aqueous solution of Example 1, as in Comparative Example 1, it was confirmed that no cell damage or damage was observed after 48 hours of culture and the cell morphology was maintained. did it.
＜比較例２＞
前記特許文献１に開示された方法を参考にして、気泡径５０〜５００ｎｍを有するオゾンナノバブルを含む水溶液（比較例２）を製造した。この水溶液にＦＢＳを２％含有させた媒体を用いて、実施例１の場合と同じように、アデノウイルス浮遊液を、二酸化炭素を含む孵卵器（インキュベータ）の中で一晩留置した。次いで、実施例１と同様の方法に従って、１晩インキュベーションして細胞の培養を行った後の細胞培養用ウエルプレート中に存在する血管平滑筋細胞の培養上清の一部（細培養液の３０体積％）を前記アデノウイルス浮遊液の同量で置換した後、さらに４８時間培養（インキュベーション）した。細胞のウイルス感染状態は、インキュベーションの２４時間後及び４８時間後に細胞培養ウエルプレートを蛍光顕微鏡によって観察し、写真撮影することにより確認した。<Comparative example 2>
With reference to the method disclosed in Patent Document 1, an aqueous solution (Comparative Example 2) containing ozone nanobubbles having a bubble diameter of 50 to 500 nm was produced. Using a medium containing 2% FBS in this aqueous solution, the adenovirus suspension was left overnight in an incubator containing carbon dioxide, as in Example 1. Next, according to the same method as in Example 1, a portion of the culture supernatant of vascular smooth muscle cells present in the cell culture well plate after overnight incubation and cell culture (30% of the fine culture solution). (Volume%) was replaced with the same amount of the adenovirus suspension, followed by further incubation (incubation) for 48 hours. The viral infection state of the cells was confirmed by observing the cell culture well plate with a fluorescence microscope after 24 hours and 48 hours of incubation and taking a photograph.
以上の方法によって検証を行った結果、比較例２の水溶液を含む細胞培養液は、４８時間後でもウイルス感染に起因する強く輝いた緑色光が観測されず、実施例１と同じように殺菌又は抗菌の効果を奏することが分かった。しかしながら、比較例２の水溶液を含む細胞培養液中には、２４時間後からすでに細胞が小さくなる傾向がみられ、４８時間後では多くの細胞が死にかけているのを確認した。このように、比較例２（気泡径５０〜５００ｎｍを有するオゾンナノバブルを含む水溶液）による細胞培養液は、殺菌性又は抗菌性を有するものの、細胞の損傷又は損害という問題の発生を避けることができないため、生体内組織の殺菌又は抗菌を行う用途には不適である。 As a result of the verification by the above method, the cell culture solution containing the aqueous solution of Comparative Example 2 was not sterilized or sterilized in the same manner as in Example 1 because no intense bright green light due to virus infection was observed even after 48 hours. It was found that there was an antibacterial effect. However, in the cell culture solution containing the aqueous solution of Comparative Example 2, it was confirmed that the cells were already small after 24 hours, and many cells were dying after 48 hours. Thus, although the cell culture solution by the comparative example 2 (the aqueous solution containing the ozone nanobubble which has a bubble diameter of 50-500 nm) has bactericidal property or antibacterial property, generation | occurrence | production of the problem of damage or damage of a cell cannot be avoided. Therefore, it is unsuitable for the use which performs disinfection or antibacterial of in-vivo tissue.
＜比較例３＞
前記比較例２で得られた水溶液を容器に入れ、栓をした状態で１ヶ月ほど室温で放置した後の水溶液（比較例３）を用いて、比較例２に示すものと同じ方法によって細胞培養液中で播種、培養した血管平滑筋細胞のウイルス感染状態を検証した。ウイルス感染状態の検証方法は、比較例２に示す方法と同じである。検証の結果、１ヶ月ほど室温で放置した後の前記水溶液を有する細胞培養液は、４８時間培養後においてウイルス感染に起因する強く輝いた緑色光が観測され、前記比較例１と同じような結果が得られた。一方、細胞培養液中の細胞の損傷又は損害は観測されなかった。本比較例の水溶液を使用した場合にこのような結果が得られた理由は以下のように考えられる。<Comparative Example 3>
Cell culture by the same method as shown in Comparative Example 2 using the aqueous solution (Comparative Example 3) after putting the aqueous solution obtained in Comparative Example 2 into a container and leaving it in a stoppered state for about one month at room temperature. The virus infection state of the vascular smooth muscle cells seeded and cultured in the liquid was verified. The method for verifying the virus infection state is the same as the method shown in Comparative Example 2. As a result of the verification, in the cell culture solution having the aqueous solution after being left at room temperature for about one month, a strong brilliant green light due to virus infection was observed after culturing for 48 hours, and the same results as in Comparative Example 1 were obtained. was gotten. On the other hand, no cell damage or damage in the cell culture was observed. The reason why such a result was obtained when the aqueous solution of this comparative example was used is considered as follows.
前記比較例２で得られた水溶液を１ヶ月ほど室温に放置した本比較例の水溶液は、オゾンナノバブルの気泡径が保管中に徐々に大きくなる傾向にあるため、ナノバブルの密度（単位体積当たりの個数）の減少及びオゾンの揮発が促進される。保管期間中に揮発が促進されたオゾンは水溶液に溶解したり、容器中の空間に滞留しており、容器の栓を開けた時点で滞留していたオゾンがすぐに揮発することが考えられる。その結果、容器の栓を開けた後に取出される水溶液には、オゾン量が非常に少なくなった状態になる。それだけでなく、水溶液に含まれるナノバブルの密度の減少が顕著になるため、細胞培養液中において細胞のウイルス感染を防止する効果が失われたではないかと推定される。 In the aqueous solution of this comparative example in which the aqueous solution obtained in Comparative Example 2 was allowed to stand at room temperature for about one month, the bubble size of ozone nanobubbles tends to gradually increase during storage, so the density of nanobubbles (per unit volume) Number) and ozone volatilization are promoted. It is conceivable that ozone whose volatilization has been promoted during the storage period is dissolved in the aqueous solution or stays in the space in the container, and the ozone that has stayed when the container is opened is immediately volatilized. As a result, the amount of ozone in the aqueous solution taken out after opening the container is very small. In addition, since the density of nanobubbles contained in the aqueous solution is significantly reduced, it is presumed that the effect of preventing viral infection of cells in the cell culture solution has been lost.
＜実施例２＞
特許第５５５５８９２号公報に開示された方法に従ってナノバブル水作製装置ΣＰＭ-５ (べローズポンプ式) (シグマテクノロジー有限会社製)によりオゾンナノバブル水を作製した後、半月程度時間を経たオゾンナノバブルを純水によって１００倍に希釈したものを測定試料として用いた。試料厚さは２００ｎｍである。この試料を実施例１と同じ試料急速凍結装置で急速凍結させた後、実施例１と同じクライオ透過型電子顕微によって試料温度約８０Ｋにおいてアモルファス氷中に包埋されたナノバブルを直接観察した。観察に用いる電子線は、Ｌｏｗ ｄｏｓｅ技術によって２０電子/Å2程度であり、撮影中の試料温度の上昇はほとんどなかった。<Example 2>
In accordance with the method disclosed in Japanese Patent No. 5555892, the nanobubble water production device ΣPM-5 (bellows pump type) (manufactured by Sigma Technology Co., Ltd.) was used to produce ozone nanobubble water, and after about half a month, ozone nanobubbles were purified with pure water. A sample diluted 100 times by the above was used as a measurement sample. The sample thickness is 200 nm. This sample was quickly frozen with the same sample quick freezing apparatus as in Example 1, and then the nanobubbles embedded in amorphous ice were directly observed at the sample temperature of about 80 K by the same cryo-transmission electron microscope as in Example 1. The electron beam used for observation was about 20 electrons / cm 2 by the low dose technique, and there was almost no increase in the sample temperature during imaging.
この試料を用いて観察した電子顕微鏡像の写真及びその写真の下にバブルの粒度分布（サイズ分散を示すヒストグラム）を図６に示す。図６に示す画像は、ΣＰＭ−５によって作製後、半月程度経たオゾンナノバブルを観察したものである。平均粒径は１８ｎｍであり、前記実施例１のオゾンナノバブルと比べてやや大きく、合体したことによりサイズの粗大化も起こっていると考えられる。ヒストグラムの測定に用いたアモルファス氷の体積は3.2×10-14 cc（400 nm×400 nm×200 nm厚さ）であり、その中にバブルは約２１個含まれている。１００倍に希釈したナノバブル水を観察していることから、このナノバブル水のオゾンナノバブルの濃度は、8.6×1016個/cc (mｌ)（約9京個/cc (mｌ)）であると評価される。FIG. 6 shows a photograph of an electron microscope image observed using this sample and a bubble particle size distribution (histogram showing size dispersion) under the photograph. The image shown in FIG. 6 is an observation of ozone nanobubbles that have passed about half a month after being produced by ΣPM-5. The average particle size is 18 nm, which is slightly larger than the ozone nanobubbles of Example 1, and it is considered that the coarsening of the size is caused by the combination. The volume of amorphous ice used for the measurement of the histogram is 3.2 × 10 −14 cc (400 nm × 400 nm × 200 nm thickness), and about 21 bubbles are included therein. Since nanobubble water diluted 100 times is observed, the concentration of ozone nanobubbles in this nanobubble water is estimated to be 8.6 × 10 16 / cc (ml) (approximately 9 Kyo / cc (ml)). Is done.
このようにして得られた実施例２の水溶液にＦＢＳを２％で含有させた媒体を用いて、実施例１の場合と同じように、アデノウイルス浮遊液を二酸化炭素を含む孵卵器（インキュベータ）の中で一晩留置した。次いで、実施例１と同様の方法に従って、１晩インキュベーションして細胞の培養を行った後の細胞培養用ウエルプレート中に存在する血管平滑筋細胞の培養上清の一部（細培養液の３０体積％）を前記アデノウイルス浮遊液の同量で置換した後、さらに４８時間培養（インキュベーション）した。細胞のウイルス感染状態は、インキュベーションの２４時間後及び４８時間後に細胞培養用ウエルプレートを蛍光顕微鏡によって観察し、写真撮影することにより確認した。 Using the medium containing 2% of FBS in the aqueous solution of Example 2 thus obtained, the adenovirus suspension was incubated with carbon dioxide in the same manner as in Example 1. Left in the night. Next, according to the same method as in Example 1, a portion of the culture supernatant of vascular smooth muscle cells present in the cell culture well plate after overnight incubation and cell culture (30% of the fine culture solution). (Volume%) was replaced with the same amount of the adenovirus suspension, followed by further incubation (incubation) for 48 hours. The virus infection state of the cells was confirmed by observing the cell culture well plate with a fluorescence microscope after 24 hours and 48 hours of incubation and taking a photograph.
以上の方法によって検証を行った結果、実施例２の水溶液は、実施例１の場合と同じように、４８時間において細胞培養液中にウイルス感染がみられず、さらに、細胞培養液中の細胞の損傷又は損害も観測されなかった。このように、オゾンナノバブルの平均粒径が３０ｎｍ以下で、水溶液１ｍｌ当たりの密度が１０１６以上であれば、オゾンナノバブルを含む水溶液を、安全で効果的な殺菌剤又は抗菌剤として体内組織の殺菌又は抗菌のために適用できることが確認できた。As a result of the verification by the above method, the aqueous solution of Example 2 showed no virus infection in the cell culture solution in 48 hours, and the cells in the cell culture solution were the same as in Example 1. No damage or damage was observed. Thus, if the average particle size of ozone nanobubbles is 30 nm or less and the density per ml of aqueous solution is 10 16 or more, the aqueous solution containing ozone nanobubbles can be used as a safe and effective disinfectant or antibacterial agent to sterilize body tissues. It was also confirmed that it could be applied for antibacterial purposes.
上記の実際例及び比較例は、本発明の酸素ナノバブルを含む水溶液を有する細胞培養液について説明したものであるが、本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液は、細胞培養液以外にも、生理食塩水、輸液及び点眼薬のいずれかの液体の構成成分として使用することができる。その場合は、生理食塩水、輸液及び点眼薬のいずれかの液体を生体内組織（内臓器官、血管、眼等）に投与することにより、細胞培養液の場合と同様に、生体内組織の細胞等を損傷又は損害を与えないで、殺菌又は抗菌を行うことができる。 Although the above-mentioned practical examples and comparative examples are described for the cell culture solution having the aqueous solution containing oxygen nanobubbles of the present invention, the aqueous solution containing the ozone nanobubbles of the present invention is not limited to the cell culture solution but is physiological saline. It can be used as a liquid component of any of infusions and eye drops. In that case, by administering any one of physiological saline, infusion, and eye drops to the tissue in the living body (internal organs, blood vessels, eyes, etc.), the cells in the tissue in the living body are the same as in the case of the cell culture solution. Sterilization or antibacterial can be carried out without damaging or damaging etc.
＜実施例３＞
実施例１で製造されたオゾンナノバブルを含む水溶液と、実施例１で使用したナノバブル水作製装置ΣＰＭ−５（ベローズポンンプ式）（シグマテクノロジー有限会社製）によって製造した酸素ナノバブルを含む水溶液とを有する水溶液を用いて、実施例１と同様の方法によって細胞培養液を作製し、該細胞培養液中で血管平滑筋細胞の培養を行うときに細胞のアデノウイルス感染に対する防御効果を検証した。<Example 3>
An aqueous solution containing ozone nanobubbles produced in Example 1 and an aqueous solution containing oxygen nanobubbles produced by the nanobubble water preparation device ΣPM-5 (bellows pump type) (manufactured by Sigma Technology Co., Ltd.) used in Example 1 Using the aqueous solution, a cell culture solution was prepared in the same manner as in Example 1, and the protective effect of the cells against adenovirus infection was verified when vascular smooth muscle cells were cultured in the cell culture solution.
本実施例で使用した酸素ナノバブル水は、クライオ透過型電子顕微鏡Titan Krios (FEI社製)を用いて、参考例１と同じ条件と方法によって平均粒径及び密度を測定した。図７に、酸素ナノバブルを含む純水を凍結したアモルファス氷について電子顕微鏡像の写真を示す。 The oxygen nanobubble water used in this example was measured for average particle diameter and density by the same conditions and method as in Reference Example 1 using a cryo-transmission electron microscope Titan Krios (manufactured by FEI). FIG. 7 shows a photograph of an electron microscope image of amorphous ice frozen from pure water containing oxygen nanobubbles.
図７において、写真の中央部付近に実線の円で囲った領域には平均粒径は３ｎｍ の暗いコントラストが認められる。また、写真の下部付近に点線の円で囲った領域には暗いコントラストが連続的につながって配列し、線のように観察される部分が存在しているが、これも酸素ナノバブルである。この結果から、３ｎｍの平均粒径を有する酸素ナノバブルは、孤立して存在するのではなく、一部凝集した配列をとることが明らかになった。このアモルファス氷の体積１．８×１０−１４ ｃｃ（３００ｎｍ×３００ｎｍ×２００ｎｍ厚さ）中には酸素ナノバブルが３６０個含まれていることが分かり、酸素ナノバブル水を１００ 倍に希釈した水を用いて観察していることから、このナノバブル水の酸素ナノバブルの密度は、２×１０１８個／ｃｃ（ｍｌ）（２００ 京個／ｃｃ（ｍｌ））であると評価される。In FIG. 7, a dark contrast having an average particle diameter of 3 nm is recognized in a region surrounded by a solid circle near the center of the photograph. In addition, in the region surrounded by a dotted circle near the lower part of the photograph, dark contrast is continuously connected and arranged, and there is a portion observed like a line, which is also an oxygen nanobubble. From this result, it was revealed that oxygen nanobubbles having an average particle diameter of 3 nm do not exist in isolation but have a partially aggregated arrangement. The amorphous ice volume 1.8 × 10 −14 cc (300 nm × 300 nm × 200 nm thickness) is found to contain 360 oxygen nanobubbles, and water that is diluted 100 times with oxygen nanobubble water is used. Therefore, the density of oxygen nanobubbles in this nanobubble water is evaluated to be 2 × 10 18 / cc (ml) (200 Kyo / cc (ml)).
本実施例において、実施例１で製造したオゾンナノバブルを含む水溶液と、前記の方法で製造した酸素ナノバブルを含む水溶液とを配合比率を体積比で１０：９０の割合で混合した。このようにして得られた水溶液にＦＢＳを２％で含有させた媒体を用いて、実施例１の場合と同じように、アデノウイルス浮遊液を、二酸化炭素を含む孵卵器（インキュベータ）の中で一晩留置した。次いで、実施例１と同様の方法に従って、１晩インキュベーションして細胞の培養を行った後の細胞培養用ウエルプレート中に存在する血管平滑筋細胞の培養上清の一部（細培養液の３０体積％）を前記アデノウイルス浮遊液の同量で置換した後、さらに４８時間培養（インキュベーション）した。細胞のウイルス感染状態は、インキュベーションの２４時間後及び４８時間後に細胞培養用ウエルプレートを蛍光顕微鏡によって観察し、写真撮影することにより確認した。 In this example, the aqueous solution containing ozone nanobubbles produced in Example 1 and the aqueous solution containing oxygen nanobubbles produced by the above method were mixed at a mixing ratio of 10:90 by volume ratio. Using the medium containing 2% FBS in the aqueous solution thus obtained, the adenovirus suspension was placed in an incubator containing carbon dioxide in the same manner as in Example 1. Left overnight. Next, according to the same method as in Example 1, a portion of the culture supernatant of vascular smooth muscle cells present in the cell culture well plate after overnight incubation and cell culture (30% of the fine culture solution). (Volume%) was replaced with the same amount of the adenovirus suspension, followed by further incubation (incubation) for 48 hours. The virus infection state of the cells was confirmed by observing the cell culture well plate with a fluorescence microscope after 24 hours and 48 hours of incubation and taking a photograph.
以上の方法によって検証を行った結果、本実施例の水溶液は、実施例１の場合と同じように、４８時間において細胞培養液中にウイルス感染がみられず、さらに、細胞培養液中の細胞の損傷又は損害も観測されなかった。このように、平均粒径が３０ｎｍ以下で、水溶液１ｍｌ当たりの密度が１０１６以上であれば、オゾンナノバブル及び酸素ナノバブルの両者を含む水溶液を、安全で効果的な殺菌剤又は抗菌剤として体内組織の殺菌又は抗菌のために適用できることが確認できた。As a result of the verification by the above method, the aqueous solution of this example was not infected with virus in the cell culture solution in 48 hours as in the case of Example 1, and further, the cells in the cell culture solution No damage or damage was observed. Thus, if the average particle diameter is 30 nm or less and the density per ml of the aqueous solution is 10 16 or more, the aqueous solution containing both ozone nanobubbles and oxygen nanobubbles can be used as a safe and effective disinfectant or antibacterial body tissue. It was confirmed that it can be applied for sterilization or antibacterial treatment.
＜実施例４＞
オゾンナノバブルを含む水溶液と酸素ナノバブルを含む水溶液と混合して得られた前記実施例３の水溶液は、上記で検証したような殺菌又は抗菌の効果の他にも、癌の治療及び予防に適用が期待される。その根拠について、酸素ナノバブル使用液を用いて癌細胞の増殖及び肥大化を抑制又は防止する効果を検討した次の検証例に基づいて説明する。<Example 4>
The aqueous solution of Example 3 obtained by mixing an aqueous solution containing ozone nanobubbles and an aqueous solution containing oxygen nanobubbles can be applied to the treatment and prevention of cancer in addition to the bactericidal or antibacterial effects as verified above. Be expected. The reason will be described based on the following verification example in which the effect of suppressing or preventing the growth and enlargement of cancer cells using an oxygen nanobubble use solution is examined.
前記実施例３と同じ方法で製造された平均粒径が３ｎｍの酸素ナノバブルを含む水溶液を用いて血清と培地とを有する細胞培養液を作製し、この細胞培養液を注入したガラス製の細胞培養用ウエルプレート中に、癌細胞として肺扁平上皮版細胞株ＥＢＣ１の肺がん細胞を入れた後、低酸素状態で所定時間留置するときに前記肺がん細胞によって誘導されるタンパク（ＨＩＦ１ａ）の発現の程度を調べた。 A cell culture medium having a serum and a medium was prepared using an aqueous solution containing oxygen nanobubbles having an average particle diameter of 3 nm manufactured by the same method as in Example 3, and the cell culture made of glass into which the cell culture liquid was injected Into a well plate, after putting lung cancer cells of the lung squamous epithelial cell line EBC1 as cancer cells, the degree of expression of the protein (HIF1a) induced by the lung cancer cells when placed in a low oxygen state for a predetermined time Examined.
図８に、癌細胞の培養を行ったときに使用した市販の低酸素培養キットを示す。図８に示すように、この低酸素培養キットはラインＡ及びラインＢの各線に沿ってクリップ１４、１５が設けられており、ガスバリア性パウチ袋１６の内部を２つの空間に区分けすることにより、それぞれの空間をクリップ１４、１５によって密閉状態に保つことができる。ラインＡの奥の方にはＯ２センサ１７が配置され、該Ｏ２センサ１７のすぐ横には培養液を満たした細胞培養用ウエルプレート１８を載置し、ラインＡとラインＢとの間には、ガス濃度調整剤１９を入れる。ガス濃度調整剤１９は使用時にアルミ袋から開封して取り出し、ラインＡより入口近くに置き、ラインＢに設けたクリップ１４を用いて密封する。それにより、ガスバリア性パウチ袋１６の内部のＯ２が短時間で吸収され、低酸素環境が創り出される。ガスバリア性パウチ袋１６の内部のＯ２濃度は、Ｏ２センサ１７の目盛を監視し、希望するＯ２濃度に近づいた時点で細胞培養用ウエルプレート１８の内部の空気をガスバリア性パウチ袋１６の内部の空気と入れ替える。そして、Ｏ２濃度が希望する値よりやや低くなった時点で、ラインＡに設けるクリップ１５によって封鎖してＯ２の吸収を停止させる。ラインＡとラインＢとの間の空間内のＯ２濃度は、ラインＡに設けるクリップ１５を用いて調整することができる。本実施例においては、ラインＡとラインＢとの間の空間内のＯ２濃度が約１％となるように調整した。FIG. 8 shows a commercially available hypoxic culture kit used when culturing cancer cells. As shown in FIG. 8, this hypoxic culture kit is provided with
低酸素雰囲気で留置するときに前記肺がん細胞によって誘導されるタンパク（ＨＩＦ１ａ）の発現の程度はウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）法により測定した。ウエスタンブロッティング法とは、電気泳動の優れた分離能と抗原抗体反応の高い特異性を組み合わせて、タンパク質混合物から特定のタンパク質を検出する手法であり、たんぱく質の検出や解析に利用される公知の測定方法である。本実施例では、前記肺がん細胞によって誘導されるタンパク（ＨＩＦ１ａ）に加えて、細胞培養用ウエルプレート中の試料に確実にタンパク質が含まれていること、及びウエスタンブロッティング法で使用される総たんぱく量が一定であることを確認する目的で、タンパク発現のコントロール（基準）として前記肺扁平上皮版細胞株ＥＢＣ１に含まれるｂ−ａｃｔｉｎのタンパク質についても測定を行った。 The degree of expression of the protein (HIF1a) induced by the lung cancer cells when placed in a low oxygen atmosphere was measured by Western blotting. Western blotting is a technique for detecting specific proteins from protein mixtures by combining the superior resolution of electrophoresis and the high specificity of antigen-antibody reactions. It is a well-known measurement used for protein detection and analysis. Is the method. In this example, in addition to the protein (HIF1a) induced by the lung cancer cells, the sample in the cell culture well plate surely contains the protein, and the total amount of protein used in the Western blotting method. In order to confirm that the protein is constant, the protein of b-actin contained in the lung squamous cell line EBC1 was also measured as a protein expression control (standard).
本実施例で使用する酸素ナノバブルを含む水溶液に代えて、酸素ナノバブルを全く含まない水溶液を比較用試料として作製した。この比較例の試料を用いて、本実施例の酸素ナノバブル水溶液で行った方法に従って前記肺がん細胞によって誘導されるタンパク（ＨＩＦ１ａ）の発現を検証した。前記肺がん細胞によって誘導されるタンパク（ＨＩＦ１ａ）の発現の測定は、上記で述べたウエスタンブロッティング法で行った。 Instead of the aqueous solution containing oxygen nanobubbles used in this example, an aqueous solution containing no oxygen nanobubbles was prepared as a comparative sample. Using the sample of this comparative example, the expression of the protein (HIF1a) induced by the lung cancer cells was verified according to the method performed with the oxygen nanobubble aqueous solution of this example. The expression of the protein (HIF1a) induced by the lung cancer cells was measured by the Western blotting method described above.
図９に、Ｏ２濃度が約１％である低酸素雰囲気で２４時間及び４８時間留置した後の酸素ナノバブル水溶液及び酸素ナノバブルを含まない水溶液について、ＨＩＦ１ａ及びｂ−ａｃｔｉｎの各タンパク質の誘導結果を示す。図９に示す「通常ｍｅｄｉｕｍ」及び「ＮＢ ｍｅｄｉｕｍ」は、それぞれ酸素ナノバブルを含まない水溶液（比較例）及び酸素ナノバブルを含む水溶液を意味する。FIG. 9 shows the induction results of the HIF1a and b-actin proteins for the aqueous solution containing oxygen nanobubbles and the aqueous solution not containing oxygen nanobubbles after being left in a low oxygen atmosphere with an O 2 concentration of about 1% for 24 hours and 48 hours. Show. “Normal medium” and “NB medium” shown in FIG. 9 mean an aqueous solution not containing oxygen nanobubbles (comparative example) and an aqueous solution containing oxygen nanobubbles, respectively.
図９はウエスタンブロッティング法による測定結果であり、図中に黒く写っている部分がＨＩＦ１ａ及びｂ−ａｃｔｉｎの各タンパク質の発現を示す部分である。図中の黒い部分が濃いほど、タンパク質の発現が強いことを示している。図９に示すように、通常ｍｅｄｉｕｍ（比較例）は、低酸素雰囲気で２４時間及び４８時間留置すると黒い部分が濃く表れており、ＨＩＦ１ａの発現が顕著であった。それに対して、ＮＢ ｍｅｄｉｕｍ（酸素ナノバブルを含む水溶液）は黒い部分が薄いままであり、酸素ナノバブルが存在することにより低酸素雰囲気で誘導されるＨＩＦ１ａ誘導は大きく抑制されることが分かった。ここで、コントロール用のタンパク質として測定したｂ−ａｃｔｉｎは、測定誤差の範囲内で黒い部分がほぼ同じ濃さを示しており、酸素ナノバブルの有無に関係なく、両者のｍｅｄｉｕｍの間でほとんど差異がなかった。 FIG. 9 shows the results of measurement by Western blotting, and the portions shown in black in the figure are the portions showing the expression of HIF1a and b-actin proteins. The darker the black portion in the figure, the stronger the protein expression. As shown in FIG. 9, when the medium (comparative example) was left in a low-oxygen atmosphere for 24 hours and 48 hours, a black part appeared darkly and the expression of HIF1a was remarkable. On the other hand, NB medium (aqueous solution containing oxygen nanobubbles) has a thin black portion, and it was found that the presence of oxygen nanobubbles greatly suppresses HIF1a induction induced in a low oxygen atmosphere. Here, b-actin measured as a control protein has almost the same darkness within the measurement error range, and there is almost no difference between the two media regardless of the presence or absence of oxygen nanobubbles. There wasn't.
このように、平均粒径が３０ｎｍ以下の酸素ナノバブルを含む水溶液は、単独で使用しても癌細胞の増殖を抑える効果を十分に有することが確認できた。この水溶液に、さらに酸素ナノバブルと同じような平均粒径と密度を有するオゾンナノバブルを含む水溶液を併用することにより、オゾンナノバブル中のオゾンが活性酸素として機能するため、生体組織内に存在する癌細胞をアタックし、癌細胞を小さくする効果が生まれることが考えられる。オゾンのアタックにより小さくなった癌細胞は、酸素ナノバブルに含まれる酸素によって酸素濃度の高い好気性雰囲気が形成されるため、図９に示した結果から推察されるように、癌細胞の増殖及び肥大化が抑えられる。これが、オゾンナノバブルを含む水溶液と酸素ナノバブルを含む水溶液とを混合して得られる本発明の水溶液が癌の治療及び予防に適用できるではないかと考える根拠である。この効果は、さらに実際の癌患者を用いて行う治療臨床例によって確認されることが期待される。 Thus, it was confirmed that the aqueous solution containing oxygen nanobubbles having an average particle size of 30 nm or less has a sufficient effect of suppressing the growth of cancer cells even when used alone. By combining this aqueous solution with an aqueous solution containing ozone nanobubbles having an average particle size and density similar to that of oxygen nanobubbles, the ozone in the ozone nanobubbles functions as active oxygen. It is conceivable that an effect of reducing the size of the cancer cell is born. Cancer cells that have become smaller due to the attack of ozone form an aerobic atmosphere with a high oxygen concentration due to the oxygen contained in the oxygen nanobubbles. Therefore, as inferred from the results shown in FIG. Can be suppressed. This is the basis for thinking that the aqueous solution of the present invention obtained by mixing an aqueous solution containing ozone nanobubbles and an aqueous solution containing oxygen nanobubbles can be applied to the treatment and prevention of cancer. This effect is expected to be further confirmed by clinical treatment cases performed using actual cancer patients.
以上のように、本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液は、オゾンによる高い殺菌力又は抗菌力が安定的に持続できるだけでなく、オゾンを含んでも生体内組織の細胞等への侵襲性を低くし、細胞等の損傷又は障害を大幅に低減できる。また、本発明による製造方法により、３０ｎｍ以下の平均粒径を有するオゾンナノバブルを大量に、且つ、安定的に製発生させることができるため、高い殺菌力又は抗菌力が安定して持続的に得られ、且つ、生体組織の細胞等への低侵襲性を図ることができる、オゾンナノバブルを含む水溶液を容易に製造することができる。そのような効果を有するオゾンナノバブルを含む水溶液は、従来技術では製造することが困難であり、本発明の製造方法によって初めて得られたものである。 As described above, the aqueous solution containing ozone nanobubbles of the present invention not only can stably maintain high bactericidal or antibacterial activity due to ozone, but also reduces the invasiveness to cells of living tissue even if ozone is contained, Damage or damage to cells or the like can be greatly reduced. In addition, since the production method according to the present invention can stably produce and generate a large amount of ozone nanobubbles having an average particle size of 30 nm or less, a high bactericidal or antibacterial activity can be obtained stably and continuously. In addition, an aqueous solution containing ozone nanobubbles that can be less invasive to cells of living tissue can be easily produced. An aqueous solution containing ozone nanobubbles having such an effect is difficult to produce by the prior art, and is obtained for the first time by the production method of the present invention.
さらに、本発明によるオゾンナノバブルを含む水溶液を有する細胞培養液、生理食塩水、輸液又は点眼薬は、ウイルスや細菌による生体内組織の感染の治療やその予防に適用することができるだけでなく、癌の治療及び予防においても薬剤の一つとして適用できる可能性を有する。それにより、オゾンナノバブルを含む水溶液の医療分野への適用を大幅に広げることができる。 Furthermore, the cell culture solution, physiological saline solution, infusion solution or eye drops having an aqueous solution containing ozone nanobubbles according to the present invention can be applied not only to the treatment and prevention of in vivo tissue infection by viruses and bacteria, but also to cancer. It can be applied as one of the drugs in the treatment and prevention. Thereby, the application to the medical field of the aqueous solution containing an ozone nanobubble can be expanded significantly.
本発明のオゾンナノバブルを含む水溶液は、細胞培養液、生理食塩水、輸液又は点眼薬として、ウイルスや細菌による生体内組織の感染の治療やその予防に適用することができるだけでなく、癌の治療及び予防においても薬剤の一つとして適用できる可能性を有するため、様々な医療分野においてその有用性は極めて高い。 The aqueous solution containing ozone nanobubbles of the present invention can be applied as a cell culture solution, physiological saline solution, infusion solution or eye drop for treatment or prevention of in vivo tissue infection by viruses or bacteria, as well as cancer treatment. In addition, since it has a possibility of being applied as one of drugs in prevention, its usefulness is extremely high in various medical fields.
１・・・酸素ナノバブル発生装置、２・・・べローズシリンダポンプ、３・・・気液混合槽、４・・・ポンプコントローラ、５・・・圧力センサ、６・・・マイクロ・ナノバブル用ノズル取付部、７・・・液吸引缶、８・・・気体吸引口、９・・・気体吸引調整バルブ、１０・・・ノズルヘッダー、１１・・・噴射ノズル、１２・・・液衝突ノズル、１３・・・台、１４・・・クリップ、１５・・・クリップ、１６・・・ガスバリア性パウチ袋、１７・・・Ｏ２センサ、１８・・・細胞培養用ウエルプレート、 １９・・・ガス濃度調整剤。 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Oxygen nano bubble generator, 2 ... Bellows cylinder pump, 3 ... Gas-liquid mixing tank, 4 ... Pump controller, 5 ... Pressure sensor, 6 ... Nozzle for micro / nano bubbles Attachment part, 7 ... Liquid suction can, 8 ... Gas suction port, 9 ... Gas suction adjustment valve, 10 ... Nozzle header, 11 ... Injection nozzle, 12 ... Liquid collision nozzle, 13 ... stand, 14 ... clip, 15 ... clip, 16 ... gas barrier pouch bag, 17 ... O2 sensor, 18 ... well plate for cell culture, 19 ... gas concentration Regulator.
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