JP6593174B2 - 微粒子分析装置、観察装置、微粒子分析プログラムおよび微粒子分析方法 - Google Patents

Description

本発明は、微粒子分析装置、観察装置、微粒子分析プログラムおよび微粒子分析方法に関する。
本願は、２０１４年１月１７日に出願された日本国特許出願２０１４−７１５８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

媒質中を移動する微粒子を暗視野照明のもとでの顕微鏡観察により撮像し、撮像した画像を処理することによって、その微粒子の数や移動速度を計測する装置が知られている（例えば、特許文献１参照）。このような装置においては、異なるタイミングで撮像された複数枚の画像に基づいて、微粒子の移動の軌跡を追跡することにより、微粒子の数や移動速度を計測している。

特開２００９−２２９１０３号公報

しかしながら、例えば、特許文献１記載の技術では、微粒子が顕微鏡の視野外に移動した場合に、微粒子の移動の軌跡を追跡できなくなることがあり、この場合には、微粒子の数や移動速度などの計測誤差を低減することができなかった。
本発明の態様は、微粒子の計測誤差を低減することができる微粒子分析装置、観察装置、微粒子分析プログラムおよび微粒子分析方法を提供する。

本発明の一態様は、媒質中を所定方向に移動する微粒子が異なる時刻においてそれぞれ撮像された複数の画像を取得する取得部と、前記取得部が取得した前記複数の画像のうち、第１の時刻において撮像された画像に含まれる第１の微粒子の画像と、前記第１の時刻とは異なる第２の時刻において撮像された画像に含まれる第２の微粒子の画像とが、同一の微粒子を示す画像であるか否かを、前記媒質中のブラウン運動による微粒子の移動量に基づいて判定する判定部と、前記第１の微粒子の画像が示す微粒子の前記第１の時刻における座標と、前記第１の微粒子が前記所定方向に移動する移動速度とに基づいて、前記第２の時刻における前記第１の微粒子の座標を推定する推定部と、を備え、前記判定部は、さらに、前記第２の微粒子の画像が示す微粒子の前記第２の時刻における座標と、前記推定部が推定した前記第１の微粒子の座標とに基づいて、前記第１の微粒子の画像と前記第２の微粒子の画像とが、同一の微粒子を示す画像であるか否かを判定する微粒子分析装置である。

また、本発明の一態様は、上述の微粒子分析装置と、照射される光によって前記媒質中の微粒子から生ずる散乱光の画像を、異なる複数の時刻においてそれぞれ撮像する撮像部と、を備える観察装置である。

また、本発明の一態様は、コンピュータに、（ａ）媒質中を所定方向に移動する微粒子が異なる時刻においてそれぞれ撮像された複数の画像を取得することと、（ｂ）前記（ａ）において取得された前記複数の画像のうち、第１の時刻において撮像された第１の微粒子の画像と、前記第１の時刻とは異なる第２の時刻において撮像された第２の微粒子の画像とが、同一の微粒子を示す画像であるか否かを、前記媒質中のブラウン運動による微粒子の移動量に基づいて判定することと、（ｃ）前記第１の微粒子の画像が示す微粒子の前記第１の時刻における座標と、前記第１の微粒子が前記所定方向に移動する移動速度とに基づいて、前記第２の時刻における前記第１の微粒子の座標を推定することと、（ｄ）前記第２の微粒子の画像が示す微粒子の前記第２の時刻における座標と、前記（ｃ）において推定された前記第１の微粒子の座標とに基づいて、前記第１の微粒子の画像と前記第２の微粒子の画像とが、同一の微粒子を示す画像であるか否かを判定することと、を実行させるための微粒子分析プログラムである。

また、本発明の一態様は、（ａ）媒質中を所定方向に移動する微粒子が異なる時刻においてそれぞれ撮像された複数の画像を取得することと、（ｂ）前記（ａ）において取得された前記複数の画像のうち、第１の時刻において撮像された第１の微粒子の画像と、前記第１の時刻とは異なる第２の時刻において撮像された第２の微粒子の画像とが、同一の微粒子を示す画像であるか否かを、前記媒質中のブラウン運動による微粒子の移動量に基づいて判定することと、（ｃ）前記第１の微粒子の画像が示す微粒子の前記第１の時刻における座標と、前記第１の微粒子が前記所定方向に移動する移動速度とに基づいて、前記第２の時刻における前記第１の微粒子の座標を推定することと、（ｄ）前記第２の微粒子の画像が示す微粒子の前記第２の時刻における座標と、前記（ｃ）において推定された前記第１の微粒子の座標とに基づいて、前記第１の微粒子の画像と前記第２の微粒子の画像とが、同一の微粒子を示す画像であるか否かを判定することと、を含む微粒子分析方法である。

本発明の態様によれば、微粒子の計測誤差を低減することができる。

本発明の第１の実施形態に係る観察装置の外観構成の一例を示す模式図である。 エキソソーム、及び抗体−エキソソーム複合体それぞれの電気泳動の一例を示す模式図である。 ゼータ電位対エキソソーム粒子数のヒストグラムの一例を示すグラフである。 ゼータ電位対エキソソーム粒子数のヒストグラムの一例を示すグラフである。 本実施形態の微粒子分析装置の機能構成の一例を示す構成図である。 本実施形態の観察装置による観察領域の一例を示す模式図である。 時系列に並べたエキソソームの画像の一例を示す模式図である。 本実施形態の記憶部が記憶する粒子リストの一例を示す図である。 本実施形態の微粒子分析装置の動作の一例を示すフローチャートである。 本発明の第２の実施形態の観察装置の構成の一例を示す模式図である。 本実施形態の輪帯の構成の一例を示す模式図である。 本実施形態の観察装置による微粒子の観察結果の一例を示す模式図である。 観察装置の暗視野光学系の変形例を示す模式図である。

[第１の実施形態]
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。
図１は、本発明の第１の実施形態に係る観察装置１の外観構成の一例を示す模式図である。観察装置１は、電気泳動装置４０を備えている。

以下、本実施形態において、ＸＹＺ直交座標系を用いて観察装置１の構成を説明する。
このＸＹＺ直交座標系において、鉛直方向をＺ方向とし、電気泳動装置４０による泳動方向をＸ方向とし、Ｘ方向およびＺ方向に直交する方向をＹ方向とする。

電気泳動装置４０は、電源４１と、負電極４２と、正電極４３と、電気泳動漕４４とを備えている。電気泳動漕４４は、Ｘ方向の第１端部にリザーバ４４ａを備えている。電気泳動漕４４は、Ｘ方向の第２端部にリザーバ４４ｂを備えている。また、電気泳動漕４４は、リザーバ４４ａと、リザーバ４４ｂとを接続する流路４４ｃを備えている。流路４４ｃのサイズは、一例として、Ｘ方向の長さ１０００［μｍ］、Ｙ方向の幅２００［μｍ］、Ｚ方向の高さ５０［μｍ］である。これらの数値は一例であり、流路４４ｃのサイズはこれに限定されない。負電極４２は、例えば白金等の金属により構成されており、電気泳動漕４４の−Ｘ方向の端（第１端部）にあるリザーバ４４ａに配置される。正電極４３は、負電極４２と同様に例えば白金等の金属により構成されており、電気泳動漕４４の＋Ｘ方向の端（第２端部）にあるリザーバ４４ｂに配置される。電源４１は、負電極４２と、正電極４３との間に電位差を生じさせる。一例として、電源４１は、流路４４ｃにおける電界強度が５０［Ｖ／ｃｍ］となるようにして、負電極４２と、正電極４３との間に電位差を生じさせる。媒質中の粒子には、この媒質中を所定方向（この一例の場合においてはＸ方向）に移動させる力が加えられている。電気泳動装置４０は、種々の粒子を媒質中に浮遊させて泳動させることができる。本実施形態の電気泳動装置４０は、微粒子の電気泳動に用いることができる。微粒子としては、例えばエキソソーム（エクソソーム）、アポトーシス小体やマイクロベシクル等を含む脂質小胞、細胞外小胞体、ラテックス粒子（抗体で修飾され、さらに細胞で修飾されたラテックス粒子を含む）、高分子ミセルなど、が挙げられる。本実施形態では、一例として、がん患者の血液、唾液、尿等の体液から抽出されたエキソソームに対し、免疫電気泳動を行う場合について説明する。

図２は、エキソソーム、及び抗体−エキソソーム複合体それぞれの電気泳動の一例を示す模式図である。図２に示すように、エキソソームは負に帯電する一方、抗体は正に帯電する。このため、抗体−エキソソーム複合体のゼータ電位は、エキソソーム単独のゼータ電位と比較して正の電荷を有している。したがって、抗体−エキソソーム複合体の泳動度は、エキソソームの泳動度より小さいものとなる。この免疫電気泳動においては、電気泳動中のエキソソームの数を計測することにより、ゼータ電位対エキソソーム粒子数のヒストグラムを生成する。

図３Ａ、３Ｂは、ゼータ電位対エキソソーム粒子数のヒストグラムの一例を示すグラフである。
図３Ａおよび３Ｂにおいて、横軸は、ゼータ電位を示し、縦軸は、エキソソームの粒子数（以下の説明において、エキソソーム数とも記載する。）を示す。図３Ａは、エキソソーム懸濁液におけるゼータ電位の分布を示す。図３Ｂは、抗体−エキソソーム懸濁液におけるゼータ電位の分布を示す。このゼータ電位対エキソソーム数のヒストグラムから、あるエキソソーム数におけるゼータ電位の平均値を求めることができる。この一例においては、エキソソーム数が１００個の場合におけるゼータ電位の平均値を求める。一例には、図３Ａに示すように、エキソソーム懸濁液におけるゼータ電位の平均値は、−４．７±２．２［ｍＶ］である。また、図３Ｂに示すように、抗体−エキソソーム懸濁液におけるゼータ電位の平均値は、−９．０±２．２［ｍＶ］である。

また、このゼータ電位対エキソソーム数のヒストグラムによれば、抗体−エキソソーム複合体のゼータ電位の平均値だけでなく、抗体−エキソソーム複合体のゼータ電位を１粒子レベルで計測することができる。そのため、ゼータ電位の平均値からは、抗体が認識する抗原を有するエキソソームが試料中に存在しないように思われる場合であっても、電気泳動チップによって、マイナーポピュレーションとして存在する、その抗原を有するエキソソームを検出することができる。このようにしてゼータ電位対エキソソーム粒子数のヒストグラムを解析することにより、例えば、生体内に微量に存在する悪性度の高いがん細胞を高感度に検出し、がんの浸潤・転移を早期に発見することができる。

また、複数の種類の抗体−エキソソーム複合体のゼータ電位を比較することもできる。一例には、第１の抗体としてがん細胞特異的に発現するタンパク質を抗原とする抗体を用いて、第１の抗体−エキソソーム複合体のゼータ電位を計測し、次いで、第２の抗体として臓器特異的に発現するタンパク質を抗原とする抗体を用いて、第２の抗体−エキソソーム複合体のゼータ電位を計測することにより、検出対象の細胞がどの臓器由来のがん細胞であるかを特定できる。また、がん細胞に限らず、用いる抗体の組合せを変えることにより、生体内における細胞の異常を詳細に特定することができる。

このゼータ電位対エキソソーム数のヒストグラムは、媒質中を電気泳動する各エキソソームについて、その移動の軌跡を検出することによって生成する。このヒストグラムの精度を向上させるためには、媒質中のエキソソームの軌跡を正確に検出することが求められる。以下、媒質中のエキソソームの軌跡を正確に検出するための仕組みについて説明する。

図１に戻り、観察装置１は、微粒子分析装置２と、撮像部１０と、照射部２０と、暗視野光学系３０とを備えている。
照射部２０は、電気泳動装置４０の流路４４ｃ内の媒質に向けて照明光を照射する。流路４４ｃ内の媒質中に浮遊する微粒子に、この照明光が照射されると、散乱光が生じる。
ここで、微粒子の一例には、上述したエキソソーム（エクソソーム）がある。以下の説明において、観察装置１は、エキソソームを観察する場合について記載するが、観察装置１は、エキソソーム以外の微粒子についても観察可能である。

暗視野光学系３０は、対物レンズ３１と、ダイクロイックミラー３２とを備えている。
対物レンズ３１は、照射部２０が照射する照明光が直接入射しない位置に配置される。また、対物レンズ３１には、照明光がエキソソームに照射された際に生じる散乱光が入射する。ダイクロイックミラー３２は、光波長に応じて反射・透過特性が異なる反射透過部材である。ダイクロイックミラー３２は、対物レンズ３１と、撮像部１０との間の光路に配置されており、対物レンズ３１から入射する光の少なくとも一部を撮像部１０の方向へ反射する。
暗視野光学系３０は、対物レンズ３１と、ダイクロイックミラー３２とを備えることにより、流路４４ｃ内の観察領域ＤＯＦを、撮像部１０によって暗視野観察することを可能にする。

撮像部１０は、ＥＭＣＣＤ（Electron Multiplying Charge Coupled Device）カメラを備えており、入射する光の画像を撮像する。撮像部１０は、動画撮影が可能である。
一例として、撮像部１０は、１００［フレーム／秒］で画像を撮像する。撮像部１０は、撮像した画像を微粒子分析装置２に出力する。なお、撮像部１０はＥＭＣＣＤカメラ以外にも、ＣＭＯＳやＮＭＯＳなどの撮像素子を備えていてもよい。

微粒子分析装置２は、撮像部１０が撮像した画像に基づいて、エキソソームの移動の軌跡を検出する。微粒子分析装置２の機能構成について、図４を参照して説明する。
図４は、本実施形態の微粒子分析装置２の機能構成の一例を示す構成図である。

微粒子分析装置２は、演算部２００と、記憶部２０６とを備えている。記憶部２０６は、フラッシュメモリ、ＨＤＤ（Hard Disk Drive）、ＲＡＭ（Random Access Memory）、ＲＯＭ（Read Only Memory）、レジスタなどの記憶装置を備えている。記憶部２０６には、演算部２００が実行するプログラム（ファームウェア）が予め格納される。
また、記憶部２０６には、演算部２００が演算処理を行った演算結果が格納される。

演算部２００は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）を備えており、各種の演算を行う。演算部２００は、その機能部として、取得部２０１と、抽出部２０２と、速度算出部２０３と、推定部２０４と、判定部２０５とを備えている。

取得部２０１は、撮像部１０が撮像した画像を取得する。上述したように撮像部１０は、媒質中を移動するエキソソームの動画を撮像する。すなわち、取得部２０１は、媒質中を所定方向に移動する微粒子が異なる時刻においてそれぞれ撮像された複数の画像を、取得する。取得部２０１は、取得した画像を抽出部２０２に出力する。

抽出部２０２は、撮像部１０が撮像した画像のなかから、エキソソームの画像を抽出する。例えば、抽出部２０２は、取得部２０１から供給される画像のうち、１フレーム分の画像を選択し、選択した画像に対して既知のフィルタ処理やパターンマッチング処理を施すことにより、エキソソームの画像を抽出する。このとき、抽出部２０２は、抽出したエキソソームの画像に対して、エキソソームの粒子ごとに粒子番号を付与する。つまり、抽出部２０２は、エキソソームの粒子に対してラベリングを行う。ここで、流路４４ｃの媒質中にエキソソームが存在するにもかかわらず、撮像部１０がこのエキソソームの画像を撮像できない場合がある。

図５は、本実施形態の観察装置１による観察領域ＤＯＦの一例を示す模式図である。図５（ａ）は、エキソソームが、流路４４ｃ内の観察領域ＤＯＦの位置Ｐにある場合について示している。図５（ａ）に示すように、撮像部１０は、流路４４ｃ内の観察領域ＤＯＦを通過する微粒子の画像を撮像する。このエキソソームは、流路４４ｃ内を電気泳動によってＸ方向に進行する。照射部２０は、観察領域ＤＯＦを含む範囲に光を照射する。照射部２０が照射した光がエキソソームにあたると、散乱光が生じる。撮像部１０は、観察領域ＤＯＦ内の位置Ｐにあるエキソソームから生じる散乱光の画像を撮像する。

ここで、エキソソームは媒質中に浮遊しており、ブラウン運動により移動する。このため、エキソソームが観察領域ＤＯＦの外に移動することがある。図５（ｂ）は、エキソソームが、ブラウン運動によって−Ｚ方向の位置Ｐ’に移動した場合について示している。
図５（ｂ）に示すように、エキソソームが観察領域ＤＯＦの外に移動すると、エキソソームが存在するにもかかわらず、撮像部１０は、このエキソソームの画像を撮像できない。
また、いったん観察領域ＤＯＦの外に移動したエキソソームが、ブラウン運動によって再び観察領域ＤＯＦ内に移動することがある。この場合には、撮像部１０は、このエキソソームの画像を撮像できる。このエキソソームの画像を時系列に並べた一例について、図６を参照して説明する。

図６は、時系列に並べたエキソソームの画像の一例を示す模式図である。図６を参照して、エキソソームＰ１およびエキソソームＰ２の２つのエキソソームの移動の軌跡について説明する。上述したように、撮像部１０は、所定の時間間隔で画像を撮像する。この一例では、撮像部１０は、１００［フレーム／秒］の頻度で、時刻ｔ０から時刻ｔ５０の各時刻において１フレームの画像を撮像する。すなわち、撮像部１０は、５１フレームの画像を、０．５秒間で撮像する。

図６において、例えば、時刻ｔ０におけるエキソソームＰ１の位置を、位置Ｐ１（ｔ０）と表す。また、例えば、時刻ｔ４８におけるエキソソームＰ２の位置を、位置Ｐ２（ｔ４８）と表す。図６に示すように、各エキソソームは、電気泳動によって、時間の経過とともに、Ｘ方向に移動する。一例として、エキソソームＰ１は、時間の経過とともに、位置Ｐ１（ｔ０）、位置Ｐ１（ｔ１）…とＸ方向に移動する。また、エキソソームＰ２は、時間の経過とともに、位置Ｐ２（ｔ０）、位置Ｐ２（ｔ１）…とＸ方向に移動する。
この一例では、エキソソームＰ１は、時刻ｔ０から時刻ｔ１までの間、観察領域ＤＯＦ内にある。また、エキソソームＰ１は、時刻ｔ２から時刻ｔ４７までの間、観察領域ＤＯＦの外にあり、時刻ｔ４８において、再び観察領域ＤＯＦ内に戻る。また、エキソソームＰ２は、時刻ｔ０から時刻ｔ４８までの間、観察領域ＤＯＦ内にある。
この一例の場合、撮像部１０が時刻ｔ０および時刻ｔ１において撮像した画像には、エキソソームＰ１と、エキソソームＰ２とが写る。また、撮像部１０が時刻ｔ２から時刻ｔ４７までの間に撮像した画像には、エキソソームＰ２が写るが、エキソソームＰ１は写らない。また、撮像部１０が時刻ｔ４８において撮像した画像には、エキソソームＰ１と、エキソソームＰ２とが写る。

抽出部２０２は、撮像部１０が各時刻において撮像した画像から、エキソソームの画像を抽出し、抽出したエキソソームの画像に基づいて、エキソソームの座標と、エキソソームの画像の明るさおよび面積を算出する。また、抽出部２０２は、算出したエキソソームの座標と、エキソソームの画像の明るさおよび面積を記憶部２０６に書き込む。
ここで、時刻ｔ０において撮像された画像に対する、抽出部２０２の処理について説明する。図６に示す例においては、抽出部２０２は、時刻ｔ０において撮像された画像から、２つのエキソソームの画像を抽出する。抽出部２０２は、抽出した、２つのエキソソームの画像のうち、１つの画像について、エキソソームＰ１とラベリングし、もう１つの画像について、エキソソームＰ２とラベリングする。また、抽出部２０２は、ラベリングしたエキソソームＰ１について、その位置Ｐ１（ｔ０）の座標（ｘ１、ｙ１）、明るさｌ１、面積ｓ１をそれぞれ算出する。抽出部２０２は、エキソソームＰ１について、算出した座標（ｘ１、ｙ１）、明るさｌ１、面積ｓ１を、記憶部２０６が記憶する粒子リストに書き込む。記憶部２０６が記憶する粒子リストの一例について、図７を参照して説明する。

図７は、本実施形態の記憶部２０６が記憶する粒子リストの一例を示す図である。この粒子リストは、行方向をラベリングされた微粒子番号とし、列方向を撮像時刻として、各時刻における各微粒子の画像の、座標（Ｘ、Ｙ）、明るさＬ、面積Ｓが記憶される。一例として、抽出部２０２は、算出した座標（ｘ１、ｙ１）、明るさｌ１、面積ｓ１を、粒子リストのエキソソームＰ１の行の、時刻ｔ０の列に書き込む。抽出部２０２は、エキソソームＰ２についても、エキソソームＰ１と同様にして、各時刻における座標（Ｘ、Ｙ）、明るさＬ、面積Ｓを算出して、粒子リストに書き込む。

図６に戻り、時刻ｔ１において撮像された画像に対する、抽出部２０２の処理について説明する。抽出部２０２は、時刻ｔ１において撮像された画像から、２つのエキソソームの画像を抽出する。抽出部２０２は、抽出した、２つのエキソソームの画像のうち、１つの画像について、時刻ｔ０において撮像された各エキソソームの画像と連続性を有しているか否かを判定する。例えば、抽出部２０２は、異なる２つの時刻において撮像された画像が連続性を有しているか否かを、次のようにして判定する。

抽出部２０２は、時刻ｔ１において撮像されたエキソソームの座標と、時刻ｔ０において撮像された各エキソソームの座標とを比較する。ここで、エキソソームは、電気泳動によってＸ方向に移動するため、Ｘ方向に比較的大きな変位が発生する。また、エキソソームは、Ｘ方向の変位に比べて、Ｙ方向の変位は少ない。そこで、抽出部２０２は、時刻ｔ０において撮像された各エキソソームのＹ座標のうち、時刻ｔ２において撮像されたエキソソームのＹ座標（ｙ１）に近いＹ座標を有するエキソソームについて、連続性を有していると判定する。例えば、抽出部２０２は、時刻ｔ１において撮像されたエキソソームのＹ座標（ｙ１）と、時刻ｔ０において撮像されたエキソソームＰ１のＹ座標（ｙ１）とを比較する。また、抽出部２０２は、時刻ｔ１において撮像されたエキソソームのＹ座標（ｙ１）と、時刻ｔ０において撮像されたエキソソームＰ２のＹ座標（ｙ２）とを比較する。この例においては、時刻ｔ１において撮像されたエキソソームのＹ座標（ｙ１）は、エキソソームＰ２のＹ座標（ｙ２）よりもエキソソームＰ１のＹ座標（ｙ１）に近い。そこで、抽出部２０２は、時刻ｔ２において撮像された、このエキソソームの画像は、時刻ｔ０において撮像されたエキソソームＰ１の画像と連続性を有すると判定する。
この場合、抽出部２０２は、時刻ｔ１において撮像された、このエキソソームの画像を、エキソソームＰ１とラベリングする。また、抽出部２０２は、時刻ｔ１におけるエキソソームＰ１の座標（ｘ１’、ｙ１）、明るさｌ１、面積ｓ１を、粒子リストのエキソソームＰ１の行の、時刻ｔ１の列に書き込む。
また、抽出部２０２は、時刻ｔ１において撮像された、もう１つのエキソソームについても、同様にして直前フレームとの連続性を判定して、ラベリングする。

ここで、時刻ｔ４８において撮像された画像に対する、抽出部２０２の処理について説明する。抽出部２０２は、時刻ｔ４８において撮像された画像から、２つのエキソソームの画像を抽出する。抽出部２０２は、抽出した、２つのエキソソームの画像うち、１つの画像について、直前の時刻ｔ４７において撮像されたエキソソームの画像と連続性を有しているか否かを判定する。上述したように、時刻ｔ４７においては、撮像部１０が撮像した画像に、エキソソームＰ１が写っていない。つまり、時刻ｔ４７においては、撮像部１０が撮像した画像に、時刻ｔ４８においてエキソソームＰ１とラベリングできるエキソソームが写っていない。抽出部２０２は、時刻ｔ４８において撮像されたいずれのエキソソームについても、エキソソームＰ１とラベリングしない。抽出部２０２は、エキソソームＰ１とラベリングしなかったエキソソームを、新たなエキソソームとしてラベリングする。この一例においては、抽出部２０２は、エキソソームＰ１００とラベリングする。

なお、この一例では、抽出部２０２は、エキソソームのＹ座標を比較することよって画像の連続性を判定しているが、エキソソームの画像の明るさ、または面積を比較することによってエキソソームの画像を抽出して、画像の連続性を判定してもよい。また、抽出部２０２は、これらのＹ座標、明るさ、および面積のうち少なくとも２つを組み合わせて比較することによってエキソソームの画像を抽出して、画像の連続性を判定してもよい。すなわち、抽出部２０２は、エキソソームの粒径に基づいて、エキソソームの画像を抽出して、画像の連続性を判定してもよい。

ここまで、２フレームの画像間において、エキソソームの画像をラベリングする処理について説明した。次に、異なる微粒子番号を付与したエキソソームの画像が、同一のエキソソームを示す画像であるか否かを判定する処理について説明する。このとき、同一のエキソソームを示す画像であることを判定するとは、ある時刻において微粒子番号１を付与されたエキソソームが、別の時刻において微粒子番号２を付与された場合に、微粒子番号２を付与されたエキソソームの微粒子番号を微粒子番号１に付け替えることである。例えば、異なる微粒子番号を付与されたエキソソームを再びラベリングして、同じ微粒子番号を付与する。一例として、上述したエキソソームＰ１００が、エキソソームＰ１と同一のエキソソームであるか否かを判定する場合について説明する。

速度算出部２０３は、抽出部２０２が算出したエキソソームの座標と、撮像時間差とに基づいて、エキソソームの移動速度を算出する。上述したように、抽出部２０２は、エキソソームＰ１について、時刻ｔ０における座標（ｘ１、ｙ１）と、時刻ｔ１における座標（ｘ１’、ｙ１）を算出する。また、上述したように、撮像部１０は、１００［フレーム／秒］の頻度で、時刻ｔ０から時刻ｔ５０の各時刻において１フレームの画像を撮像する。したがって、この一例においては、時刻ｔ０から時刻ｔ１までの時間、つまり、隣接するフレーム間の時間は、０．０１秒である。速度算出部２０３は、エキソソームＰ１について、抽出部２０２が算出した、時刻ｔ０におけるＸ座標（ｘ１）と、時刻ｔ１におけるＸ座標（ｘ１’）とを取得する。また、速度算出部２０３は、エキソソームＰ１について、取得したＸ座標の差Ｐ１ΔＸを算出し、算出したＸ座標の差Ｐ１ΔＸを、フレーム間の時間で除することにより、エキソソームＰ１の移動速度ｖ１を算出する。このようにして速度算出部２０３は、複数の画像からエキソソームＰ１が所定方向に移動する移動速度を算出する。

推定部２０４は、速度算出部２０３が算出したエキソソームの移動速度に基づいて、ある時間が経過した後のエキソソームの座標を推定する。ここで、時刻ｔ０におけるエキソソームＰ１のＸ座標（ｘ１）と、エキソソームＰ１の移動速度ｖ１とが既知である場合、時刻ｔ０からある時間Ｔ１が経過した場合のエキソソームＰ１のＸ座標（ｘＴ１）は、次の式（１）によって求めることができる。

ｘＴ１＝ｘ１＋ｖ１×Ｔ１ …（１）

推定部２０４は、抽出部２０２が算出した時刻ｔ０におけるエキソソームＰ１のＸ座標（ｘ１）と、時刻ｔ４８におけるエキソソームＰ１００のＸ座標（ｘ１００）とを取得する。また、推定部２０４は、速度算出部２０３が算出した、エキソソームＰ１の移動速度ｖ１を取得する。ここで、時間Ｔ１は、時刻ｔ０から、時刻ｔ４８までの時間である。この一例においては、時間Ｔ１は、０．４８秒である。推定部２０４は、取得したこれらのパラメータを上述の式（１）に代入して、時刻ｔ４８におけるエキソソームＰ１のＸ座標（ｘＴ１）を算出する。このようにして、推定部２０４は、エキソソームＰ１の時刻ｔ０における座標と、エキソソームＰ１がＸ方向に移動する移動速度ｖ１とに基づいて、時刻ｔ４８におけるエキソソームＰ１の座標を推定する。

判定部２０５は、推定部２０４が推定したエキソソームの座標に基づいて、２つの時刻において撮像されたエキソソームが同一のエキソソームであるか否かを判定する。例えば、判定部２０５は、抽出部２０２が算出した時刻ｔ４８におけるエキソソームＰ１００のＸ座標（ｘ１００）と、推定部２０４が推定した時刻ｔ４８におけるエキソソームＰ１のＸ座標（ｘＴ１）とを取得する。また、判定部２０５は、取得したエキソソームＰ１００のＸ座標（ｘ１００）と、エキソソームＰ１のＸ座標（ｘＴ１）とを比較する。ここで、判定部２０５は、エキソソームＰ１００のＸ座標（ｘ１００）と、エキソソームＰ１のＸ座標（ｘＴ１）との差が所定のしきい値以下であれば、エキソソームＰ１００と、エキソソームＰ１とが同一のエキソソームであると仮判定する。

さらに、判定部２０５は、エキソソームＰ１００と、エキソソームＰ１とが同一のエキソソームであると仮判定した場合には、これらのエキソソームのＹ座標の差に基づいて、確定判定の処理を行う。例えば、判定部２０５は、抽出部２０２がそれぞれ算出した時刻ｔ０におけるエキソソームＰ１のＹ座標（ｙ１）と、時刻ｔ４８におけるエキソソームＰ１００のＹ座標（ｙ１００）とを取得する。

上述したように、エキソソームは媒質中に浮遊しており、ブラウン運動により様々な方向に移動する。このため、エキソソームは、電気泳動によってＸ方向に移動するだけでなく、ブラウン運動によりＹ方向に移動することがある。判定部２０５は、エキソソームがブラウン運動によりＹ方向に移動する移動量の許容値ＢＭに基づいて、時刻ｔ０におけるエキソソームＰ１と、時刻ｔ４８におけるエキソソームＰ１００とが同一のエキソソームであるか否かを確定判定する。例えば、判定部２０５は、取得した時刻ｔ０におけるエキソソームＰ１のＹ座標（ｙ１）と、時刻ｔ４８におけるエキソソームＰ１００のＹ座標（ｙ１００）との差Δｙを算出する。また、判定部２０５は、算出したＹ座標の差Δｙと、許容値ＢＭとを比較し、Ｙ座標の差Δｙが許容値ＢＭ以下であれば、時刻ｔ０におけるエキソソームＰ１と、時刻ｔ４８におけるエキソソームＰ１００とが同一のエキソソームであると確定判定する。すなわち、判定部２０５は、ブラウン運動によるエキソソームの移動量の成分のうち、少なくとも電気泳動による移動方向であるＸ方向と直交するＹ方向の成分に基づいて、同一のエキソソームであるか否かを確定判定する。

判定部２０５は、取得部２０１が取得した複数の画像のうち、時刻ｔ０において撮像されたエキソソームＰ１と、時刻ｔ４８において撮像されたエキソソームＰ１００とが、同一のエキソソームであるか否かを、媒質中のブラウン運動によるエキソソームの移動量に基づいて判定する。

なお、判定部２０５は、ブラウン運動によるエキソソームのＹ方向の移動量に基づいて、２つの時刻のエキソソームの画像が、同一のエキソソームを示すものであるか否かを判定するとして説明したが、これに限られない。判定部２０５は、電気泳動方向であるＸ方向について、ブラウン運動による移動量に基づいて、２つの時刻のエキソソームの画像が、同一のエキソソームを示すものであるか否かを判定してもよい。すなわち、判定部２０５は、エキソソームがＸ方向にブラウン運動を行う場合に、このＸ方向のブラウン運動によるエキソソームの変位の許容値に基づいて、２つの時刻のエキソソームの画像が、同一のエキソソームを示すものであるか否かを判定してもよい。また、判定部２０５は、Ｘ方向およびＹ方向についてのブラウン運動による移動量を組み合わせて、２つの時刻のエキソソームの画像が、同一のエキソソームを示すものであるか否かを判定してもよい。

次に、図８を参照して、微粒子分析装置２の動作について説明する。
図８は、本実施形態の微粒子分析装置２の動作の一例を示すフローチャートである。

抽出部２０２は、粒子リストを作成する（ステップＳ１０）。例えば、抽出部２０２は、撮像部１０が各時刻において撮像した画像から、エキソソームの画像を抽出し、抽出したエキソソームの画像に基づいて、エキソソームの座標と、エキソソームの画像の明るさおよび面積を算出する。また、抽出部２０２は、算出したエキソソームの座標と、エキソソームの画像の明るさおよび面積を記憶部２０６の粒子リストに書き込む。

次に、速度算出部２０３は、抽出部２０２が算出したエキソソームの座標と、撮像時間差とに基づいて、エキソソームの移動速度を算出する（ステップＳ２０）。

次に、抽出部２０２は、記憶部２０６の粒子リストに記憶されている各座標値について、電気泳動方向（この一例においてはＸ方向）に揃えるための座標変換を行って、座標を再作成する（ステップＳ３０）。これにより、電気泳動方向と、撮像部１０の撮像方向とが一致しておらず、エキソソームがＸ方向以外の方向に移動しているように撮像された場合においても、微粒子分析装置２は、エキソソームを正確にトラッキングすることができる。

次に、抽出部２０２が抽出したすべてのエキソソームについて、ステップＳ４０からステップＳ７０までの処理を繰り返し適用する。
まず、判定部２０５は、撮像間隔を取得する。また、判定部２０５は、着目しているエキソソームについて、第１の時刻における座標、第２の時刻における座標、移動速度を取得する（ステップＳ４０）。

次に、判定部２０５は、着目しているエキソソームについて、第１の時刻におけるＸ座標と、第２の時刻におけるＸ座標との差が所定のしきい値以下であれば、これら２つの時刻におけるエキソソームが同一のエキソソームであると仮判定する。次に、判定部２０５は、同一のエキソソームであると仮判定した２つのエキソソームについて、Ｙ座標の差が所定のしきい値以下であれば、これら２つのエキソソームが同一のエキソソームであると確定判定する。ここで、判定部２０５は、算出したＹ座標の差が、ブラウン運動による許容値ＢＭ以下である場合（ステップＳ５０；ＹＥＳ）には、処理をステップＳ６０に進める。一方、判定部２０５は、算出したＹ座標の差が、ブラウン運動による許容値ＢＭを超える場合（ステップＳ５０；ＮＯ）には、処理をステップＳ７０に進める。

次に、ステップＳ６０において、判定部２０５は、２つのエキソソームを同一のエキソソームとしてラベリングする。一方、判定部２０５は、ステップＳ７０において、２つのエキソソームを異なるエキソソームとしてラベリングする。

判定部２０５は、抽出部２０２が抽出したすべてのエキソソームについて、ステップＳ４０からステップＳ７０までの処理を繰り返し適用した後、処理を終了する。

以上説明したように、微粒子分析装置２は、判定部２０５を備えることにより、エキソソームが撮像できない期間がある場合に、別々の時刻において撮像されたエキソソームが同一のエキソソームであるか否かを判定することができる。したがって、微粒子分析装置２は、１つのエキソソームが、画像処理において別々のエキソソームとして判定されてしまうことにより、エキソソーム数を誤って計測してしまうことを抑止することができる。すなわち、微粒子分析装置２によれば、微粒子の計測誤差を低減することができる。

また、微粒子分析装置２は、微粒子に対して、所定方向に微粒子を移動させる力を加えている。例えば、微粒子分析装置２は、微粒子に対して、上述したＸ方向に微粒子を移動させる電界を加えている。これにより、微粒子は、電界による移動量と、ブラウン運動による移動量とによって定まる軌跡を移動する。微粒子分析装置２は、ブラウン運動による移動量を考慮して微粒子の位置を推定することにより、微粒子の移動の軌跡を推定することができる。このとき、ブラウン運動による移動量が、電界による移動量に比べて小さい場合には、微粒子分析装置２は、微粒子の位置をより正確に推定することができる。
すなわち、ブラウン運動による移動量が、電界による移動量に比べて小さい場合、微粒子分析装置２は、微粒子の計測誤差をさらに低減することができる。

［第２の実施形態］
以下、図面を参照して、本発明の第２の実施形態を説明する。なお、上述した第１の実施形態と同様である構成及び動作については、同一の符号を付して、説明を簡略化あるいは省略する。本実施形態の観察装置１ａは、照射部２０が輪帯５０を介して流路４４ｃに光を照射する点において、第１の実施形態と異なる。

図９は、本発明の第２の実施形態の観察装置１ａの構成の一例を示す模式図である。観察装置１ａは、輪帯５０を備えている。照射部２０は、輪帯５０を介して流路４４ｃに光を照射する。輪帯５０の構成について図１０を参照して説明する。

図１０は、本実施形態の輪帯５０の構成の一例を示す模式図である。輪帯５０は、直径Ｒ１の内側遮蔽部と、直径Ｒ３の外側遮蔽部とを有し、内側遮蔽部と外側遮蔽部との間に透過部を有している。この透過部は、直径Ｒ１から直径Ｒ２の範囲に設けられている。輪帯５０は、この透過部の内輪の直径Ｒ１と、外輪の直径Ｒ２との比（輪帯比）が変化することによって、透過光による照明特性が変化する。輪帯比は、直径Ｒ１／直径Ｒ２によって求められる。本実施形態において、輪帯５０は、輪帯比０．８〜０．８５にできる。この数値は一例であり、輪帯比はこれに限定されない。

図１１は、本実施形態の観察装置１ａによる微粒子の観察結果の一例を示す模式図である。観察装置１ａは、輪帯５０を介して流路４４ｃを照明する。このため、観察装置１ａによれば、例えば、レーザ光を直接流路４４ｃに照射する場合に比べて、流路４４ｃに光が当たった場合の散乱光を低減することができる。また、輪帯５０の輪帯比を上述した範囲に設定することにより、流路４４ｃによる散乱光を低減しつつ、撮像部１０が撮像する画像のコントラストを向上させることができる。したがって、観察装置１ａによれば、図１１に示すように粒子ＰＡ１〜ＰＡ８を高コントラストに撮像することができるため、微粒子の計測誤差を低減することができる。

なお、観察装置１ａは、図１２に示すように構成してもよい。
図１２は、観察装置１ａの暗視野光学系の変形例を示す模式図である。図１２に示すように、この変形例による暗視野光学系３０は、レンズ３３を備えている。レンズ３３は、照射部２０から輪帯５０を介して入射する光を、流路４４ｃ内の観察領域ＤＯＦの位置に集光する。流路４４ｃに微粒子Ｐａが存在する場合に、レンズ３３によって集光された光が、微粒子Ｐａにあたると、散乱光が発生する。対物レンズ３１は、レンズ３３によって集光された光が直接入射しない位置であり、かつ、この散乱光が入射する位置に配置されている。このように構成しても、観察装置１ａは、流路４４ｃ内の微粒子を暗視野観察することができる。

なお、上述した各実施形態における観察装置１（または、観察装置１ａ。以下の説明において同じ。）において、電気泳動によって微粒子を所定方向に移動させる場合について説明したが、これに限られない。例えば、観察装置１は、媒質に流速を与えることによって、微粒子を所定方向に移動させてもよい。また、観察装置１は、微粒子を所定方向に移動させる力を与えない構成であってもよい。

なお、上述した各実施形態における観察装置１の一部をコンピュータで実現するようにしてもよい。その場合、この制御機能を実現するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、この記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することによって実現してもよい。なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、観察装置１に内蔵されたコンピュータシステムであって、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものとする。また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムを送信する場合の通信線のように、短時間、動的にプログラムを保持するもの、その場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリのように、一定時間プログラムを保持しているものも含んでもよい。また上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであってもよく、さらに前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるものであってもよい。また、上述した実施形態における観察装置１の各機能ブロックの一部、または全部を、ＬＳＩ（Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）等の集積回路として実現してもよい。観察装置１の各機能ブロックは個別にプロセッサ化してもよいし、一部、または全部を集積してプロセッサ化してもよい。また、集積回路化の手法はＬＳＩに限らず専用回路、または汎用プロセッサで実現してもよい。
また、半導体技術の進歩によりＬＳＩに代替する集積回路化の技術が出現した場合、その技術による集積回路を用いてもよい。

以上、図面を参照してこの発明の一実施形態について詳しく説明してきたが、具体的な構成は上述のものに限られることはなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲内において様々な設計変更等をすることが可能である。また、上述した各実施形態および変形例に示す構成を適宜組み合わせてもよい。

１、１ａ…観察装置、２…微粒子分析装置、１０…撮像部、２０…照射部、２０１…取得部、２０３…速度算出部、２０４…推定部、２０５…判定部。

Claims (17)

1. 媒質中を所定方向に移動する微粒子が異なる時刻においてそれぞれ撮像された複数の画像を取得する取得部と、
   前記取得部が取得した前記複数の画像のうち、第１の時刻において撮像された画像に含まれる第１の微粒子の画像と、前記第１の時刻とは異なる第２の時刻において撮像された画像に含まれる第２の微粒子の画像とが、同一の微粒子を示す画像であるか否かを、前記媒質中のブラウン運動による微粒子の移動量に基づいて判定する判定部と、
   前記第１の微粒子の画像が示す微粒子の前記第１の時刻における座標と、前記第１の微粒子が前記所定方向に移動する移動速度とに基づいて、前記第２の時刻における前記第１の微粒子の座標を推定する推定部と、
   を備え、
   前記判定部は、さらに、前記第２の微粒子の画像が示す微粒子の前記第２の時刻における座標と、前記推定部が推定した前記第１の微粒子の座標とに基づいて、前記第１の微粒子の画像と前記第２の微粒子の画像とが、同一の微粒子を示す画像であるか否かを判定する
   微粒子分析装置。
2. 前記判定部は、
   前記第２の微粒子の画像が示す微粒子の前記第２の時刻における座標と、前記推定部が推定した前記第２の時刻における前記第１の微粒子の座標との差が、ブラウン運動による前記第１の微粒子の移動量以下である場合には、前記第１の微粒子の画像と前記第２の微粒子の画像とを、同一の微粒子を示す画像であると判定する
   請求項１に記載の微粒子分析装置。
3. 前記微粒子には、前記媒質中を前記所定方向に前記微粒子を移動させる力が加えられている
   請求項１または請求項２に記載の微粒子分析装置。
4. 前記微粒子を移動させる力とは、前記媒質中に印加される電界による力である
   請求項３に記載の微粒子分析装置。
5. 前記判定部は、
   前記ブラウン運動による微粒子の移動量の成分のうち、少なくとも前記所定方向と直交する方向の成分に基づいて、前記第１の微粒子の画像と前記第２の微粒子の画像とが、同一の微粒子を示す画像であるか否かを判定する
   請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の微粒子分析装置。
6. 前記判定部は、
   前記ブラウン運動による微粒子の移動量の成分のうち、少なくとも前記所定方向の成分に基づいて、前記第１の微粒子の画像と前記第２の微粒子の画像とが、同一の微粒子を示す画像であるか否かを判定する
   請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の微粒子分析装置。
7. 前記複数の画像から前記第１の微粒子が前記所定方向に移動する移動速度を算出する速度算出部
   をさらに備える
   請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の微粒子分析装置。
8. 前記微粒子はエキソソームであること
   請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の微粒子分析装置。
9. 前記取得部が取得した画像に含まれる粒子の画像の明るさおよび面積に基づいて、前記第１の時刻において撮像された画像から前記第１の微粒子の画像を、前記第２の時刻において撮像された画像から前記第２の微粒子の画像を、それぞれ抽出する抽出部
   をさらに備える請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の微粒子分析装置。
10. 媒質中を所定方向に移動する微粒子が異なる時刻においてそれぞれ撮像された複数の画像を取得する取得部と、
    前記取得部が取得した前記複数の画像のうち、第１の時刻において撮像された画像に含まれる第１の微粒子の座標と、前記第１の時刻とは異なる第２の時刻において撮像された画像に含まれる第２の微粒子の座標と、前記媒質中のブラウン運動による微粒子の移動量とに基づいて、前記第１の微粒子と前記第２の微粒子とを同一の微粒子として扱うか否かを判定する判定部と、
    前記第１の微粒子の座標と、前記第１の微粒子が前記所定方向に移動する移動速度とに基づいて、前記第２の時刻における前記第１の微粒子の座標を推定する推定部と
    を備え
    前記判定部は、さらに、前記第２の微粒子の座標と、前記推定部が推定した前記第１の微粒子の座標とに基づいて、前記第１の微粒子と前記第２の微粒子とが同一の微粒子を示す画像であるか否かを判定する
    微粒子分析装置。
11. 請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の前記微粒子分析装置と、
    照射される光によって前記媒質中の微粒子から生ずる散乱光の画像を、異なる複数の時刻においてそれぞれ撮像する撮像部と、
    を備える観察装置。
12. 光源からの光を、輪帯を介して前記媒質中に照射する照射部を備えることを特徴とする請求項１１に記載の観察装置。
13. コンピュータに、
    （ａ）媒質中を所定方向に移動する微粒子が異なる時刻においてそれぞれ撮像された複数の画像を取得することと、
    （ｂ）前記（ａ）において取得された前記複数の画像のうち、第１の時刻において撮像された第１の微粒子の画像と、前記第１の時刻とは異なる第２の時刻において撮像された第２の微粒子の画像とが、同一の微粒子を示す画像であるか否かを、前記媒質中のブラウン運動による微粒子の移動量に基づいて判定することと、
    （ｃ）前記第１の微粒子の画像が示す微粒子の前記第１の時刻における座標と、前記第１の微粒子が前記所定方向に移動する移動速度とに基づいて、前記第２の時刻における前記第１の微粒子の座標を推定することと、
    （ｄ）前記第２の微粒子の画像が示す微粒子の前記第２の時刻における座標と、前記（ｃ）において推定された前記第１の微粒子の座標とに基づいて、前記第１の微粒子の画像と前記第２の微粒子の画像とが、同一の微粒子を示す画像であるか否かを判定することと、
    を実行させるための微粒子分析プログラム。
14. コンピュータに、
    （ａ）媒質中を所定方向に移動する微粒子が異なる時刻においてそれぞれ撮像された複数の画像を取得することと、
    （ｂ）前記（ａ）において取得された前記複数の画像のうち、第１の時刻において撮像された第１の微粒子の座標と、前記第１の時刻とは異なる第２の時刻において撮像された第２の微粒子の座標と、前記媒質中のブラウン運動による微粒子の移動量とに基づいて、前記第１の微粒子と前記第２の微粒子とを同一の微粒子として扱うか否かを判定することと、
    （ｃ）前記第１の微粒子の座標と、前記第１の微粒子が前記所定方向に移動する移動速度とに基づいて、前記第２の時刻における前記第１の微粒子の座標を推定することと、
    （ｄ）前記第２の微粒子の座標と、前記（ｃ）において推定された前記第１の微粒子の座標とに基づいて、前記第１の微粒子と前記第２の微粒子とが同一の微粒子を示す画像であるか否かを判定することと、
    を実行させるための微粒子分析プログラム。
15. （ａ）媒質中を所定方向に移動する微粒子が異なる時刻においてそれぞれ撮像された複数の画像を取得することと、
    （ｂ）前記（ａ）において取得された前記複数の画像のうち、第１の時刻において撮像された第１の微粒子の画像と、前記第１の時刻とは異なる第２の時刻において撮像された第２の微粒子の画像とが、同一の微粒子を示す画像であるか否かを、前記媒質中のブラウン運動による微粒子の移動量に基づいて判定することと、
    （ｃ）前記第１の微粒子の画像が示す微粒子の前記第１の時刻における座標と、前記第１の微粒子が前記所定方向に移動する移動速度とに基づいて、前記第２の時刻における前記第１の微粒子の座標を推定することと、
    （ｄ）前記第２の微粒子の画像が示す微粒子の前記第２の時刻における座標と、前記（ｃ）において推定された前記第１の微粒子の座標とに基づいて、前記第１の微粒子の画像と前記第２の微粒子の画像とが、同一の微粒子を示す画像であるか否かを判定することと、
    を含む微粒子分析方法。
16. （ｃ）光源からの光を、輪帯を介して前記媒質中に照射することと、
    （ｄ）前記（ｃ）において照射される光によって前記媒質中の微粒子から生ずる散乱光の画像を、異なる複数の時刻においてそれぞれ撮像することと、
    をさらに含み、
    前記（ａ）において、
    前記（ｄ）において撮像された複数の画像を取得する
    請求項１５に記載の微粒子分析方法。
17. （ａ）媒質中を所定方向に移動する微粒子が異なる時刻においてそれぞれ撮像された複数の画像を取得することと、
    （ｂ）前記（ａ）において取得された前記複数の画像のうち、第１の時刻において撮像された第１の微粒子の座標と、前記第１の時刻とは異なる第２の時刻において撮像された第２の微粒子の座標と、前記媒質中のブラウン運動による微粒子の移動量とに基づいて前記第１の微粒子と前記第２の微粒子とを同一の微粒子として扱うか否かを判定することと、
    （ｃ）前記第１の微粒子の座標と、前記第１の微粒子が前記所定方向に移動する移動速度とに基づいて、前記第２の時刻における前記第１の微粒子の座標を推定することと、
    （ｄ）前記第２の微粒子の座標と、前記（ｃ）において推定された前記第１の微粒子の座標とに基づいて、前記第１の微粒子と前記第２の微粒子とが同一の微粒子を示す画像であるか否かを判定することと、
    を含む微粒子分析方法。