JP6591772B2

JP6591772B2 - 抗ｃ−Ｍｅｔ抗体効能予測のためのバイオマーカー

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Publication number: JP6591772B2
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Inventors: 鍾石鄭; 兌臻安; 大淳孫; 恩眞李
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Description

抗ｃ−Ｍｅｔ抗体薬効予測および／もしくは抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象の選別のためのバイオマーカー、遺伝子発現水準比較のための基準マーカー、生物試料内の前記バイオマーカー水準を測定する段階を含むｃ−Ｍｅｔ抗体薬効予測方法および／もしくは抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象の選別方法、ならびに前記選別された対象に抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を投与する段階を含む癌の予防および／もしくは治療方法が提供される。

１９９８年ジェネンテック社のハーセプチン標的治療剤のＦＤＡ（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ＆ＤｒｕｇＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）承認以後に個別化医療の多様な方法が導入されており、適用症患者選別マーカーを開発する試みも増えている。ハーセプチンの場合、癌細胞の細胞膜に発現したＨＥＲ２成長因子受容体の発現量を介して患者を選別する。ＩＨＣ（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）検査方法の開発以後、ＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、ＣＩＳＨ（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）などのＩＣＨ技法を含む多様な技術が患者選別に導入された。その後、エルロチニブ（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）（タルセバ（登録商標）（Ｔａｒｃｅｖａ）、ジェネンテック社）の患者（肺および膵臓癌）選別マーカーとしてのＥＧＦＲ変異、ベクティビックス（登録商標）（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）およびエルビタックス（登録商標）（Ｅｒｂｉｔｕｘ）の患者（大腸癌）の選別マーカーとしてのＫＲＡＳ変異などが承認を受けた。

ｃ−Ｍｅｔタンパク質を標的とする抗癌剤に対しては、効能がよく発揮される患者を選別するためのマーカーに関する研究が現在行なわれている。近年、新規ｃ−Ｍｅｔ標的薬物のうち、ジェネンテック社のＭｅｔＭａｂ（登録商標）について第ＩＩＩ相臨床試験が行なわれており、この際、コンパニオン診断方法としてベンタナＩＨＣアッセイ（ｖｅｎｔａｎａＩＨＣａｓｓａｙ）（ｓｐ４４：ｃ−ｍｅｔ一次抗体、ラビットモノクロナール）を用いてｃ−Ｍｅｔタンパク質過発現を適用して行っている。しかし、このような方法で他のサンプルをテストしてみれば、正確な結果が得られない場合が発生し、一般的な診断手段として使用されるには限界がある。

また、ＩＨＣの方法は実験者個人差、病変部位、病理学者の性向などによってその結果値が一定でないという短所を有している。

ｃ−Ｍｅｔ標的抗癌剤を用いた治療の効能をより増進させるために、前記標的抗癌剤の効能予測および／または前記薬物の適用が適した患者の選別のためのバイオマーカーの開発および薬効予測技術の開発が要求される。

本発明の一実施形態は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能予測および／または抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の適用対象選別のためのバイオマーカーを提供する。

また、本発明の他の実施形態は、前記バイオマーカーの検出手段（例えば、検出用分子または製剤）を含む抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能予測および／または抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象選別用組成物およびキットを提供する。

本発明の他の実施形態は、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能予測および／または抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象選別のためのバイオマーカーの水準を比較するための基準マーカーを提供する。

本発明の他の実施形態は、生物試料内の前記バイオマーカーの存在有無および／または水準を測定する段階を含む抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能予測および／または抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象の選別方法を提供する。

本発明の他の実施形態は、前記選別された抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象に抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を投与する段階を含む癌の予防および／または治療方法を提供する。

本発明の他の実施形態は、前記選別された抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象に抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を投与する段階を含むｃ−Ｍｅｔ抑制方法を提供する。

本発明は、以下の内容をその骨子とする。
（１）ＴＨＳＤ７Ａ、ＭＥＴ、ＲＡＢ３１、ＦＡＭ１２６Ａ、ＰＨＣ１、ＣＨＭＬ、ＳＴ８ＳＩＡ４およびＣＡＶ１からなる群より選択された１種以上であるバイオマーカーの検出用分子または製剤を含む、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物。
（２）前記バイオマーカーは、ＴＨＳＤ７Ａ；またはＴＨＳＤ７Ａと、ＭＥＴ、ＲＡＢ３１、ＦＡＭ１２６Ａ、ＰＨＣ１、ＣＨＭＬ、ＳＴ８ＳＩＡ４およびＣＡＶ１からなる群より選択された１種以上との組み合わせである、（１）に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物。
（３）前記バイオマーカーは、ＭＥＴ；またはＭＥＴと、ＴＨＳＤ７Ａ、ＲＡＢ３１、ＦＡＭ１２６Ａ、ＰＨＣ１、ＣＨＭＬ、ＳＴ８ＳＩＡ４およびＣＡＶ１からなる群より選択された１種以上との組み合わせである、（１）に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物。
（４）前記バイオマーカーは、ＲＡＢ３１；またはＲＡＢ３１と、ＴＨＳＤ７Ａ、ＭＥＴ、ＦＡＭ１２６Ａ、ＰＨＣ１、ＣＨＭＬ、ＳＴ８ＳＩＡ４およびＣＡＶ１からなる群より選択された１種以上との組み合わせである、（１）に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物。
（５）前記バイオマーカーは、ＦＡＭ１２６Ａ；またはＦＡＭ１２６Ａと、ＴＨＳＤ７Ａ、ＭＥＴ、ＲＡＢ３１、ＰＨＣ１、ＣＨＭＬ、ＳＴ８ＳＩＡ４、およびＣＡＶ１からなる群より選択された１種以上との組み合わせである、（１）に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物。
（６）前記バイオマーカーは、ＴＨＳＤ７Ａ、ＭＥＴ、ＲＡＢ３１およびＦＡＭ１２６Ａからなる群より選択された２種以上である、（１）に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物。
（７）ＥＥＦ１Ａ１、ＲＰＬ２３Ａ、ＴＰＴ１、ＨＵＷＥ１、ＭＡＴＲ３、ＳＲＳＦ３、ＨＮＲＮＰＣ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＷＤＲ９０およびＴＵＴ１からなる群より選択された１種以上の基準マーカーの検出用分子または製剤を追加的に含む、（１）〜（６）のうちのいずれか１つに記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物。
（８）前記検出用分子または製剤は、前記バイオマーカーもしくは基準マーカーとハイブリダイズ可能なプライマー、プローブもしくはアプタマー、もしくは前記バイオマーカーもしくは基準マーカーにコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体もしくはアプタマー、またはこれらの組み合わせである、（７）に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物。
（９）前記検出用分子または製剤は、配列番号１０９〜２６９の中から選択された１種以上のプローブ、配列番号２７０〜３０５の中から選択された１種以上のプライマー、またはこれらの組み合わせである、（１）〜（８）のうちのいずれか１つに記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物。
（１０）前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７１のアミノ酸配列のうちの配列番号７３（ＥＥＰＳＱ）を含む連続する５〜１９個のアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合する、（１）〜（９）のうちのいずれか１つに記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物。
（１１）前記ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合フラグメントは、下記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つを含む、（１０）に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物；
（ｉ）下記ＣＤＲ−Ｈ１〜ＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択された一つ以上の重鎖相補性決定領域、または前記一つ以上の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変部位；配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列内の３番目から１０番目までのアミノ酸を含む連続する８〜１９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号６のアミノ酸配列、配列番号８５のアミノ酸配列、または配列番号８５のアミノ酸配列内の１番目から６番目までのアミノ酸を含む連続する６〜１３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３
（ｉｉ）下記ＣＤＲ−Ｌ１〜ＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択された一つ以上の軽鎖相補性決定領域、または前記一つ以上の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変部位；配列番号７のアミノ酸配列のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号９のアミノ酸配列、配列番号１５のアミノ酸配列、配列番号８６のアミノ酸配列、または配列番号８９のアミノ酸配列内の１番目から９番目までのアミノ酸を含む９〜１７個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３
（ｉｉｉ）前記重鎖相補性決定領域および前記軽鎖相補性決定領域の組み合わせ
（ｉｖ）前記重鎖可変部位および前記軽鎖可変部位の組み合わせ。
（１２）生物試料中の標的遺伝子の発現水準を測定する段階；および前記標的遺伝子の発現水準を前記生物試料中の基準マーカーの発現水準と比較する段階を含み、前記基準マーカーは、ＥＥＦ１Ａ１、ＲＰＬ２３Ａ、ＴＰＴ１、ＨＵＷＥ１、ＭＡＴＲ３、ＳＲＳＦ３、ＨＮＲＮＰＣ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＷＤＲ９０、およびＴＵＴ１からなる群より選択された１種以上である、遺伝子発現水準測定方法。
（１３）ＥＥＦ１Ａ１、ＲＰＬ２３Ａ、ＴＰＴ１、ＨＵＷＥ１、ＭＡＴＲ３、ＳＲＳＦ３、ＨＮＲＮＰＣ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＷＤＲ９０、およびＴＵＴ１からなる群より選択された１種以上である基準マーカーの検出用分子または製剤を含む、遺伝子発現水準測定用組成物。
（１４）前記検出用分子または製剤は、前記基準マーカーとハイブリダイズ可能なプライマー、プローブもしくはアプタマー、または前記基準マーカーがコードするタンパク質に特異的に結合する抗体もしくはアプタマー、またはこれらの組み合わせである、（１３）に記載の遺伝子発現水準測定用組成物。

マウス異種移植モデルに対してＶｅｎｔａｎａＭＥＴＩＨＣ方法を用いて得られた効能群および非効能群判断結果を示す図である。ＲＴ−ＰＣＲを通じて得られた効能群および非効能群判断結果を示すグラフである（Ｘ軸：ＩＨＣｓｃｏｒｅ、◆：非効能群、●：効能群）。基準マーカー（コントロール遺伝子）の発現水準を示すグラフである。基準マーカー（コントロール遺伝子）の発現水準を示すグラフである。コントロール遺伝子の発現水準を特定プライマーを用いて測定した結果を示すグラフである。選別された基準マーカーの発現水準を特定プライマーを用いて測定した結果を示すグラフである。

抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対して効果を示す群（効能群）と効果を示さない群（非効能群）の遺伝子発現水準を比較して、差の大きい遺伝子を選別し、前記選別された遺伝子またはこれによって暗号化されるタンパク質を抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能予測のためのバイオマーカーとして提案する。また、細胞種類によってまたは同一な種類の細胞でも個別細胞で発現水準の差が無いか少ない遺伝子を選別し、前記選別された遺伝子またはこれによって暗号化されるタンパク質を前記目的遺伝子および／または目的タンパク質の発現水準比較時のコントロールとして使用可能な基準マーカーとして提案する。

本発明で提案されるバイオマーカーおよび／または基準マーカーを用いて抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の適用が適した患者を高い正確度で選別することができ、これによって個々の患者において前記抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能が最大限発揮されるように患者別に合わせた治療が可能であり、前記抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体の臨床試験にも有用に用いることができる。

具体的に、一実施形態は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する効能群と非効能群で発現差を示す遺伝子の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体効能予測および／または抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の適用対象選別のためのバイオマーカーとしての用途を提供する。

一実施形態において、前記バイオマーカーは、ＴＨＳＤ７Ａ、ＭＥＴ、ＲＡＢ３１、ＦＡＭ１２６Ａ、ＰＨＣ１、ＣＨＭＬ、ＳＴ８ＳＩＡ４、およびＣＡＶ１からなる群より選択された１種以上であり得る。前記バイオマーカーは、前述の遺伝子の全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびこれらによってコードされるタンパク質からなる群より選択された１種以上であり得る。前記バイオマーカーとして使用可能な遺伝子を下記の表１に整理した：

前記バイオマーカーを効能群と非効能群での発現差が大きいものから降順で羅列すれば、ＴＨＳＤ７Ａ、ＭＥＴ、ＲＡＢ３１、ＦＡＭ１２６Ａ、ＰＨＣ１、ＣＨＭＬ、ＳＴ８ＳＩＡ４、およびＣＡＶ１である。より正確な効能予測または適用対象選別のために、効能群と非効能群での発現差が大きいものを優先的に選択して前記バイオマーカーとして使用することができる。したがって、一実施形態において、前記バイオマーカーは、前記優先的に選択された遺伝子に追加して残りの遺伝子からなる群より選択された１種以上を追加的に含むものであり得る。

一実施形態において、前記バイオマーカーは、
（１）ＴＨＳＤ７Ａ；
（２）ＴＨＳＤ７Ａと、ＭＥＴ、ＲＡＢ３１、ＦＡＭ１２６Ａ、ＰＨＣ１、ＣＨＭＬ、ＳＴ８ＳＩＡ４、およびＣＡＶ１からなる群より選択された１種以上との組み合わせ；
（３）ＭＥＴ；
（４）ＭＥＴと、ＴＨＳＤ７Ａ、ＲＡＢ３１、ＦＡＭ１２６Ａ、ＰＨＣ１、ＣＨＭＬ、ＳＴ８ＳＩＡ４、およびＣＡＶ１からなる群より選択された１種以上との組み合わせ；
（５）ＴＨＳＤ７ＡおよびＭＥＴの組み合わせ；
（６）ＴＨＳＤ７ＡおよびＭＥＴの組み合わせと、ＲＡＢ３１、ＦＡＭ１２６Ａ、ＰＨＣ１、ＣＨＭＬ、ＳＴ８ＳＩＡ４、およびＣＡＶ１からなる群より選択された１種以上との組み合わせ；
（７）ＲＡＢ３１；
（８）ＲＡＢ３１と、ＴＨＳＤ７Ａ、ＭＥＴ、ＦＡＭ１２６Ａ、ＰＨＣ１、ＣＨＭＬ、ＳＴ８ＳＩＡ４、およびＣＡＶ１からなる群より選択された１種以上との組み合わせ；
（９）ＴＨＳＤ７Ａ、ＭＥＴ、およびＲＡＢ３１からなる群より選択された２種以上（このとき、ＴＨＳＤ７ＡおよびＭＥＴの組み合わせは除外されてもよい）；
（１０）ＴＨＳＤ７Ａ、ＭＥＴ、およびＲＡＢ３１からなる群より選択された２種以上と、ＦＡＭ１２６Ａ、ＰＨＣ１、ＣＨＭＬ、ＳＴ８ＳＩＡ４、およびＣＡＶ１からなる群より選択された１種以上との組み合わせ；
（１１）ＦＡＭ１２６Ａ；
（１２）ＦＡＭ１２６Ａと、ＴＨＳＤ７Ａ、ＭＥＴ、ＲＡＢ３１、ＰＨＣ１、ＣＨＭＬ、ＳＴ８ＳＩＡ４、およびＣＡＶ１からなる群より選択された１種以上との組み合わせ；
（１３）ＴＨＳＤ７Ａ、ＭＥＴ、ＲＡＢ３１およびＦＡＭ１２６Ａからなる群より選択された２種以上（このとき、ＴＨＳＤ７Ａ、ＭＥＴ、およびＲＡＢ３１からなる群より選択された２種以上は除外されてもよい）；または
（１４）ＴＨＳＤ７Ａ、ＭＥＴ、ＲＡＢ３１およびＦＡＭ１２６Ａからなる群より選択された２種以上と、ＰＨＣ１、ＣＨＭＬ、ＳＴ８ＳＩＡ４、およびＣＡＶ１からなる群より選択された１種以上との組み合わせ、を含むものであり得る。

他の実施形態は、細胞種類が異なっても発現水準の差が少ない遺伝子および／または同一な種類の細胞でも個別細胞での発現水準の差が少ない遺伝子を探索して、これらの目的遺伝子の発現水準比較時の比較基準（リファレンス、コントロール）として使用するための基準マーカー（コントロール遺伝子）としての用途を提供する。前記目的遺伝子は、発現水準を測定しようとする全ての遺伝子であり得る。例えば、前記目的遺伝子は、先に選別された抗ｃ−Ｍｅｔ抗体効能予測および／または抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の適用対象選別のためのバイオマーカーであり得、この場合、前記基準マーカーは、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体効能予測および／または抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の適用対象選別時の目的遺伝子の発現水準測定のための比較基準として使用することができる。

目的遺伝子の遺伝子発現水準測定において、その比較基準（リファレンス、コントロール）になる遺伝子が細胞の種類によって異なる場合、または同一な種類の細胞でも個々の細胞での発現水準が異なる場合、正確な目的遺伝子の発現水準の測定が困難になる。このため、目的遺伝子の発現水準を正確に測定するために適切な基準マーカーを選定することが重要である。

一実施形態において、前記基準マーカーは、細胞生存に必須な内在的遺伝子（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｇｅｎｓ）から選択される。例えば、前記基準マーカーは、ＥＥＦ１Ａ１、ＲＰＬ２３Ａ、ＴＰＴ１、ＨＵＷＥ１、ＭＡＴＲ３、ＳＲＳＦ３、ＨＮＲＮＰＣ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＷＤＲ９０、およびＴＵＴ１からなる群より選択された１種以上であり得る。ＲＰＬ２３Ａ、ＴＰＴ１、ＭＡＴＲ３、ＳＲＳＦ３、およびＨＮＲＮＰＣの発現量が非常に一定の水準に維持されるので（実施例１参照）、一実施形態において、前記基準マーカーはＲＰＬ２３Ａ、ＴＰＴ１、ＭＡＴＲ３、ＳＲＳＦ３、およびＨＮＲＮＰＣからなる群より選択された１種以上を含み、任意に、ＥＥＦ１Ａ１、ＨＵＷＥ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＷＤＲ９０、およびＴＵＴ１からなる群より選択された１種以上を追加的に含むことができるが、これらに限定されない。一実施形態において、前記基準マーカーは、ＲＰＬ２３Ａ、ＴＰＴ１、ＭＡＴＲ３、ＳＲＳＦ３、およびＨＮＲＮＰＣを含むものであり得る。あるいは、基準マーカーは、ＴＰＴ１、ＥＥＦ１Ｍ、ＴＵＴ１、ＭＡＴＲ３、およびＳＭＡＲＣＡ４を含むものであり得る。

前記基準マーカーは、前述の遺伝子の全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびこれによってコードされるタンパク質からなる群より選択された１種以上であり得る。この時、試験対象細胞は肺癌細胞、例えば、肺腺癌（Ｌｕｎｇｃａｎｃｅｒａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、非小細胞肺癌（Ｎｏｎ−ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ）などであり得るが、これに制限されるものではない。前記基準マーカーとして使用可能な遺伝子を下記の表２に整理した：

他の実施形態では、基準マーカーを比較基準として使用する標的遺伝子の発現水準を判断（または評価）する方法であって、前記基準マーカーが、ＥＥＦ１Ａ１、ＲＰＬ２３Ａ、ＴＰＴ１、ＨＵＷＥ１、ＭＡＴＲ３、ＳＲＳＦ３、ＨＮＲＮＰＣ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＷＤＲ９０、およびＴＵＴ１からなる群から選択される少なくとも一つである方法を提供する。遺伝子の発現水準を判断（または評価）する方法は、生物試料内の標的遺伝子の発現水準を測定し、当該標的遺伝子の発現水準を基準マーカーの発現水準と比較することを含み得る。遺伝子の発現水準を判断（または評価）する方法は、基準マーカーの発現水準を測定することをさらに含み得る。遺伝子の発現水準は、生体から分離された細胞、組織、またはこれらから抽出された遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）若しくはタンパク質であり得る。発現水準の測定は、生体から分離された生物試料中における遺伝子自体（例えば、全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなど）の量または前記遺伝子からコードされるタンパク質の量を測定することによって行うことができる。他の実施形態では、生体から分離された生物試料中における標的遺伝子の発現水準を判断（または評価）するための、ＥＥＦ１Ａ１、ＲＰＬ２３Ａ、ＴＰＴ１、ＨＵＷＥ１、ＭＡＴＲ３、ＳＲＳＦ３、ＨＮＲＮＰＣ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＷＤＲ９０、およびＴＵＴ１からなる群から選択される一つ以上の使用が提供される。

例えば、前記遺伝子の発現水準を判断（または評価）する方法は、生物試料内の標的遺伝子の発現水準を測定する段階；および前記標的遺伝子の発現水準を前記生物試料内の基準マーカーの発現水準と比較する段階を含むことができる。この時、前記方法は、生物試料内の基準マーカーの発現水準を測定する段階を追加的に含むことができる。

前記標的遺伝子は、発現水準を測定しようとする対象遺伝子である。

他の実施形態は、前記バイオマーカーまたは前記バイオマーカーによってコードされるタンパク質の検出手段を含む対象者に対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体効能（または抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する対象者の応答性もしくは感度）予測および／または抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の適用対象選別のための組成物を提供する。前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体効能予測および／または抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の適用対象選別のための組成物は、前記基準マーカー遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくはｍＲＮＡ）または基準マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の検出用分子または製剤を追加的に含むものであり得る。

他の実施形態は、前記バイオマーカーまたは前記バイオマーカーによってコードされるタンパク質の検出手段を含む対象者に対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体効能（または抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する対象者の応答性もしくは感度）予測および／または抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象選別のためのキットを提供する。前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体効能予測および／または抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象選別のためのキットは、前記基準マーカー遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくはｍＲＮＡ）または基準マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の検出用分子または組成物を追加的に含むものであり得る。

他の実施形態では、基準マーカー遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくはｍＲＮＡ）または基準マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の検出用分子または組成物を含む、基準マーカー組成物または標的遺伝子の発現水準を測定（判断または評価）するためのキットを提供する。一実施形態において、前記標的遺伝子が前述のバイオマーカーである場合、前記組成物またはキットは、対象者に対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体効能予測および／または抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の適用対象選別のために使用され得る。

前記バイオマーカーの検出手段または基準マーカーの検出手段は、前述の遺伝子定量またはタンパク質定量方法に使用される手段（例えば、検出用分子または製剤）であり得る。例えば、前記バイオマーカーの検出手段または基準マーカーの検出手段（検出用分子または製剤）は、前記バイオマーカーまたは基準マーカーの遺伝子に特異的に結合する（ハイブリダイズ可能な）プライマー、プローブもしくはアプタマー、もしくは前記バイオマーカーまたは基準マーカーの遺伝子にコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体もしくはアプタマー、またはこれらの組み合わせであり得る。前記プライマーは、前記バイオマーカー遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）もしくは基準マーカー遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）の全長、またはこれらの遺伝子の塩基配列中の連続する５〜１０００ｂｐ、例えば１０〜５００ｂｐ、２０〜２００ｂｐ、または５０〜２００ｂｐの遺伝子断片を検出することができるものであり得、前記遺伝子全長または遺伝子断片の３’−末端および５’−末端それぞれの連続する５〜１００ｂｐ、例えば、５〜５０ｂｐ、５〜３０ｂｐ、または１０〜２５ｂｐ部位とハイブリダイズ可能な（例えば、相補的な）塩基配列を有するまたはから成るものであり得る。前記プローブまたはアプタマーは、例えば、５〜１００ｂｐ、５〜５０ｂｐ、５〜３０ｂｐ、または１０〜２５ｂｐのサイズのヌクレオチド配列を有するまたはから成るものであり得、前記バイオマーカー遺伝子または基準マーカー遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）の塩基配列の中の連続する５〜１００ｂｐ、例えば、５〜５０ｂｐ、５〜３０ｂｐ、または１０〜２５ｂｐ部位とハイブリダイズ可能な（例えば、相補的な）塩基配列を有するまたはから成るものであり得る。前記「ハイブリダイズ可能」とは、プライマー、プローブまたはアプタマーの塩基配列と前記遺伝子の特定領域の塩基配列との間で、８０％以上、例えば９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列相補性を有することによって、前記遺伝子特定領域に相補的に結合し得ることを意味する。

一実施形態における、前記バイオマーカーまたは基準マーカーの検出に使用可能なプローブまたはプライマーを下記の表３〜表５に示した。

一実施形態において、前記バイオマーカーＴＨＳＤ７Ａの検出に使用可能なプローブは、配列番号１０９〜配列番号１４２からなる群より選択された１種以上であり得、例えば、配列番号１０９のプローブ、配列番号１１０〜配列番号１２０を含むプローブセット、配列番号１２１〜配列番号１３１を含むプローブセット、および配列番号１３２〜配列番号１４２を含むプローブセットからなる群より選択された１種以上であり得る。前記バイオマーカーＴＨＳＤ７Ａの検出に使用可能なプライマーは、配列番号２７０のプライマー、配列番号２７１のプライマー、またはこれらを含むプライマー対であり得るが、これに制限されるものではない。

前記バイオマーカーＭＥＴの検出に使用可能なプローブは、配列番号１４３〜配列番号１５４からなる群より選択された１種以上であり得、例えば、配列番号１４３のプローブ、配列番号１４４〜配列番号１５４を含むプローブセット、またはこれらの組み合わせであり得る。前記バイオマーカーＭＥＴの検出に使用可能なプライマーは、配列番号２７２のプライマー、配列番号２７３のプライマー、またはこれらを含むプライマー対であり得るが、これに制限されるものではない。

前記バイオマーカーＲＡＢ３１の検出に使用可能なプローブは、配列番号１５５〜配列番号１７７からなる群より選択された１種以上であり得、例えば、配列番号１５５のプローブ、配列番号１５６〜配列番号１６６を含むプローブセット、および配列番号１６７〜配列番号１７７を含むプローブセットからなる群より選択された１種以上であり得る。前記バイオマーカーＲＡＢ３１の検出に使用可能なプライマーは、配列番号２７８のプライマー、配列番号２７９のプライマー、またはこれらを含むプライマー対であり得るが、これに制限されるものではない。

前記バイオマーカーＦＡＭ１２６Ａの検出に使用可能なプローブは、配列番号１７８〜配列番号２００および配列番号２２５〜配列番号２３５からなる群より選択された１種以上であり得、例えば、配列番号１７８のプローブ、配列番号１７９〜配列番号１８９を含むプローブセット、配列番号１９０〜配列番号２００を含むプローブセット、および配列番号２２５〜配列番号２３５を含むプローブセットからなる群より選択された１種以上であり得る。前記バイオマーカーＦＡＭ１２６Ａの検出に使用可能なプライマーは、配列番号２７４のプライマー、配列番号２７５のプライマー、またはこれらを含むプライマー対であり得るが、これに制限されるものではない。

前記バイオマーカーＰＨＣ１の検出に使用可能なプローブは、配列番号２０１〜配列番号２１２からなる群より選択された１種以上であり得、例えば、配列番号２０１のプローブ、配列番号２０２〜配列番号２１２を含むプローブセット、またはこれらの組み合わせであり得る。前記バイオマーカーＰＨＣ１の検出に使用可能なプライマーは、配列番号２７６のプライマー、配列番号２７７のプライマー、またはこれらを含むプライマー対であり得るが、これに制限されるものではない。

前記バイオマーカーＣＨＭＬの検出に使用可能なプローブは、配列番号２１３〜配列番号２２４からなる群より選択された１種以上であり得、例えば、配列番号２１３のプローブ、配列番号２１４〜配列番号２２４を含むプローブセット、またはこれらの組み合わせであり得る。前記バイオマーカーＣＨＭＬの検出に使用可能なプライマーは、配列番号２８２のプライマー、配列番号２８３のプライマー、またはこれらを含むプライマー対であり得るが、これに制限されるものではない。

前記バイオマーカーＳＴ８ＳＩＡ４の検出に使用可能なプローブは、配列番号２３６〜配列番号２４７からなる群より選択された１種以上であり得、例えば、配列番号２３６のプローブ、配列番号２３７〜配列番号２４７を含むプローブセット、またはこれらの組み合わせであり得る。前記バイオマーカーＳＴ８ＳＩＡ４の検出に使用可能なプライマーは、配列番号２８０のプライマー、配列番号２８１のプライマー、またはこれらを含むプライマー対であり得るが、これに制限されるものではない。

前記バイオマーカーＣＡＶ１の検出に使用可能なプローブは、配列番号２４８〜配列番号２５９からなる群より選択された１種以上であり得、例えば、配列番号２４８のプローブ、配列番号２４９〜配列番号２５９を含むプローブセット、またはこれらの組み合わせであり得る。前記バイオマーカーＣＡＶ１の検出に使用可能なプライマーは、配列番号２８４のプライマー、配列番号２８５のプライマー、またはこれらを含むプライマー対であり得るが、これに制限されるものではない。

前記基準マーカーＥＥＦ１Ａ１の検出に使用可能なプローブは、配列番号２６２のプローブであり得るが、これに制限されるものではない。前記基準マーカーＥＥＦ１Ａ１の検出に使用可能なプライマーは、配列番号２９０のプライマー、配列番号２９１のプライマー、またはこれらを含むプライマー対であり得るが、これに制限されるものではない。

前記基準マーカーＲＰＬ２３Ａの検出に使用可能なプローブは、配列番号２６０のプローブであり得るが、これに制限されるものではない。前記基準マーカーＲＰＬ２３Ａの検出に使用可能なプライマーは、配列番号２８６のプライマー、配列番号２８７のプライマー、またはこれらを含むプライマー対であり得るが、これに制限されるものではない。

前記基準マーカーＴＰＴ１の検出に使用可能なプローブは、配列番号２６１のプローブであり得るが、これに制限されるものではない。前記基準マーカーＴＰＴ１の検出に使用可能なプライマーは、配列番号２８８のプライマー、配列番号２８９のプライマー、またはこれらを含むプライマー対であり得るが、これに制限されるものではない。

前記基準マーカーＨＵＷＥ１の検出に使用可能なプローブは、配列番号２６６のプローブであり得るが、これに制限されるものではない。前記基準マーカーＨＵＷＥ１の検出に使用可能なプライマーは、配列番号２９８のプライマー、配列番号２９９のプライマー、またはこれらを含むプライマー対であり得るが、これに制限されるものではない。

前記基準マーカーＭＡＴＲ３の検出に使用可能なプローブは、配列番号２６８のプローブであり得るが、これに制限されるものではない。前記基準マーカーＭＡＴＲ３の検出に使用可能なプライマーは、配列番号３０２のプライマー、配列番号３０３のプライマー、またはこれらを含むプライマー対であり得るが、これに制限されるものではない。

前記基準マーカーＳＲＳＦ３の検出に使用可能なプローブは、配列番号２６３のプローブであり得るが、これに制限されるものではない。前記基準マーカーＳＲＳＦ３の検出に使用可能なプライマーは、配列番号２９２のプライマー、配列番号２９３のプライマー、またはこれらを含むプライマー対であり得るが、これに制限されるものではない。

前記基準マーカーＨＮＲＮＰＣの検出に使用可能なプローブは、配列番号２６５のプローブであり得るが、これに制限されるものではない。前記基準マーカーＨＮＲＮＰＣの検出に使用可能なプライマーは、配列番号２９６のプライマー、配列番号２９７のプライマー、またはこれらを含むプライマー対であり得るが、これに制限されるものではない。

前記基準マーカーＳＭＡＲＣＡ４の検出に使用可能なプローブは、配列番号２６９のプローブであり得るが、これに制限されるものではない。前記基準マーカーＳＭＡＲＣＡ４の検出に使用可能なプライマーは、配列番号３０４のプライマー、配列番号３０５のプライマー、またはこれらを含むプライマー対であり得るが、これに制限されるものではない。

前記基準マーカーＷＤＲ９０の検出に使用可能なプローブは、配列番号２６７のプローブであり得るが、これに制限されるものではない。前記基準マーカーＷＤＲ９０の検出に使用可能なプライマーは、配列番号３００のプライマー、配列番号３０１のプライマー、またはこれらを含むプライマー対であり得るが、これに制限されるものではない。

前記基準マーカーＴＵＴ１の検出に使用可能なプローブは、配列番号２６４のプローブであり得るが、これに制限されるものではない。前記基準マーカーＴＵＴ１の検出に使用可能なプライマーは、配列番号２９４のプライマー、配列番号２９５のプライマー、またはこれらを含むプライマー対であり得るが、これに制限されるものではない。

他の実施形態は、生物試料内の前記バイオマーカーの存在有無および発現水準を測定する段階を含む、対象者に対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能（または抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する対象者の応答性もしくは感度）予測方法、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象の選別（または同定）方法または抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象の選別に情報を提供する方法を提供する。前記方法では、前記バイオマーカーの存在有無および発現水準を測定する段階は、前記基準マーカーを比較のための参照（コントロール）として用いることにより行われ得る。

例えば、ＣＡＶ１、ＦＡＭ１２６Ａ、ＭＥＴ、ＲＡＢ３１、ＳＴ８ＳＩＡ４、および／またはＴＨＳＤ７Ａの場合、これらの遺伝子の発現水準が高いときは、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を用いた治療が効果的であるか、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を適用するに適した対象であると判断することができる。また、ＣＭＨＬおよび／またはＰＨＣ１の場合、発現水準が低いときは、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を用いた治療が効果的であるか、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を適用するに適した対象と判断することができる。

本発明の一実施形態では、生物試料内のバイオマーカーの発現水準を測定する段階；および前記バイオマーカーの発現水準を前記生物試料内の基準マーカーの発現水準と比較する段階を含み、前記バイオマーカーが、ＴＨＳＤ７Ａ、ＭＥＴ、ＲＡＢ３１、ＦＡＭ１２６Ａ、ＰＨＣ１、ＣＨＭＬ、ＳＴ８ＳＩＡ４、およびＣＡＶ１からなる群より選択された１種以上の遺伝子、または前記遺伝子によってコードされるタンパク質である、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能または適用対象選別のためのデータを収集する方法が提供される。

前記バイオマーカーの発現水準の評価は、基準マーカーの発現水準と比較して行なうことができる。例えば、前記バイオマーカーの発現水準の評価と抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能および／または抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の適用に適するかどうかの判断は、ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ；例えば、競合的ＰＣＲ（ＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、など）を用いて下記表６に記載された通り行うことができる。

（ΔＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｃｙｃｌｅ）：基準マーカーのＣｔ値（２種以上の基準マーカーを測定する場合は、その平均値）−バイオマーカーのＣｔ値）。

上記表６で、基準マーカーは前述のＥＥＦ１Ａ１、ＲＰＬ２３Ａ、ＴＰＴ１、ＨＵＷＥ１、ＭＡＴＲ３、ＳＲＳＦ３、ＨＮＲＮＰＣ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＷＤＲ９０、およびＴＵＴ１からなる群より選択された１種以上を意味する。

抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能予測方法、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象の選別方法、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能予測または抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象の選別に情報を提供する方法は、各バイオマーカーについて標準基準値（表６参照）を測定する段階を追加的に含むことができる。例えば、前記標準基準値の測定は、（ｉ）抗ｃ−Ｍｅｔ抗体感受性であることが分かっている集団（効能群）および抗ｃ−Ｍｅｔ抗体非感受性であることが分かっている集団（非効能群）でそれぞれバイオマーカーのΔＣｔを測定する段階；、ならびに（ｉｉ）効能群および非効能群それぞれにおけるバイオマーカーのΔＣｔを平均して標準基準値を提供する段階によって行うことができる。前記のように、ΔＣｔは１種以上の基準マーカー（ＥＥＦ１Ａ１、ＲＰＬ２３Ａ、ＴＰＴ１、ＨＵＷＥ１、ＭＡＴＲ３、ＳＲＳＦ３、ＨＮＲＮＰＣ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＷＤＲ９０、およびＴＵＴ１）のＣｔ値の平均から、標準発現値が産出される所定のバイオマーカーのＣｔ値を引いた数値である。

前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を使用する治療法が適用されるのに適した患者を意味し、全ての哺乳類、例えばヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどのげっ歯類であり得、例えば癌患者であり得る。本明細書に使用された生物試料は、患者（例えば、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどのげっ歯類などを含む哺乳類）、または前記患者から分離されるか人工的に培養された細胞、組織、体液などであり得、例えば癌細胞または癌組織、またはこれらから抽出されたＤＮＡまたはＲＮＡ、または分離されたタンパク質であり得る。前記生物試料は、加工されない試料または加工された試料（例えば、ＲＲＰＥ（ｆｏｒｍａｌｉｎｆｉｘｅｄｐａｒａｆｆｉｎｅｍｂｅｄｄｅｄ）試料など）であり得る。

あるいは、「高発現水準」または「低発現水準」は、患者からの生物試料中のバイオマーカーの発現水準と、基準試料中のバイオマーカーの発現水準とを比較することによって判断され得る。基準試料は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体が効果を示さないまたは抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する抵抗性を有するいずれの細胞または組織（例えば、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体非感受性群または抗ｃ−Ｍｅｔ抗体抵抗性群のような、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体非効能群）でもよい。例えば、基準試料は、細胞株Ｈ１３７３（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−５８６６）、ＨＣＣ１８０６（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−２３３５）、Ｃａｋｉ−１（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ−４６）、ＳＫＢＲ３（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ−３０）、ＢＴ４７４（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ−２０）、ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ−３８）、ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−２２９）、ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−２４７）、ＳＷ６２０（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−２２７）、Ｌｓ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ，ＣＬ−１８８）、ならびに抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の繰り返し投与および／または継続投与によって抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対して抵抗性を獲得した細胞からなる群から選択される少なくとも一つであり得る。従って、患者に対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能を予測する方法または抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の適用について患者を選別する（もしくは特定する）方法は、生物試料中のバイオマーカーの発現水準と、基準試料中のバイオマーカーの発現水準とを上記のように比較する工程を更に含み得る。この場合、前記方法は、基準試料中のバイオマーカーの発現水準を測定する工程をさらに含み得る。前記方法は、バイオマーカー（ＣＡＶ１、ＦＡＭ１２６Ａ、ＭＥＴ、ＲＡＢ３１、ＳＴ８ＳＩＡ４、およびＴＨＳＤ７Ａからなる群から選択される少なくとも一つ）の発現水準が基準試料のものよりも高い場合またはバイオマーカー（ＣＭＨＬ、ＰＨＣ１、もしくはこれらの組み合わせ）の発現水準が基準試料のものよりも低い場合、生物試料もしくは当該生物試料が得られた（分離された）患者に抗ｃ−Ｍｅｔ抗体が有効であるまたは生物試料もしくは当該生物試料が得られた（分離された）患者は抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の適用に適すると判断する（予想する、または選別する）工程を更に含み得る。

抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の適用対象は癌患者であり得、前記癌は固形癌または血液癌であり得、ｃ−Ｍｅｔの過剰発現または非正常的な活性化に関連する癌であり得る。前記癌は、原発性癌だけでなく転移性癌も含むことができる。一実施形態において、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の適用対象は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚および眼球内黒色腫、直膓癌、肛門付近癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、慢性および急性白血病、リンパ球リンパ腫、肝細胞癌、胃癌、すい臓癌、膠芽腫、頸部癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜および子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、頭頸部癌、脳癌、ならびに骨肉腫などからなる群より選択された１種以上の癌患者の中から選択される。一実施形態において、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の適用対象は、肺癌（例えば、肺腺癌（Ｌｕｎｇｃａｎｃｅｒａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、非小細胞肺癌（Ｎｏｎ−ｓｍａｌｌｃｅｌｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）など）などからなる群より選択された１種以上の癌患者の中から選択される。

前記バイオマーカーの存在有無および／または前記バイオマーカーおよび／または基準マーカーの発現水準は、通常の遺伝子定量方法、例えば前記遺伝子とハイブリダイズ可能なプローブまたはプライマーを使用する通常のマイクロアレイ法、ＰＣＲ（例えば、ｑＰＣＲ（定量ＰＣＴ）またはＲＴ−ＰＣＲ）、ＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）などを用いて測定することができるが、これに制限されるものではない。一実施形態において、前記バイオマーカーの存在有無および／または前記バイオマーカーおよび／または基準マーカーの発現水準は、通常の遺伝子定量方法、たとえば、重合酵素連鎖反応法（ＰＣＲ）によって測定することができる。また、通常のシークエンシングによって前記バイオマーカーの存在有無を確認することができる。一実施形態において、前記プライマーは、前記バイオマーカー遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）または前記基準マーカー遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）の塩基配列の中の連続する５〜１０００ｂｐ、例えば１０〜５００ｂｐ、２０〜２００ｂｐ、または５０〜２００ｂｐの遺伝子断片を検出することができるものであって、前記バイオマーカー遺伝子もしくは基準マーカー遺伝子またはこれらの遺伝子断片の３’−末端および５’−末端それぞれの連続する５〜１００ｂｐ、例えば、５〜５０ｂｐ、５〜３０ｂｐ、または１０〜２５ｂｐ部位とハイブリダイズ可能な（例えば、相補的な）塩基配列を有するものであり得る。前記プローブは、前記バイオマーカー遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）または前記基準マーカー遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）の塩基配列の中の連続する５〜１００ｂｐ、例えば、５〜５０ｂｐ、５〜３０ｂｐ、または１０〜２５ｂｐ部位とハイブリダイズ可能な（例えば、相補的な）塩基配列を有するものであり得る。前記「ハイブリダイズ可能」とは、前記バイオマーカー遺伝子もしくは基準マーカー遺伝子の塩基配列と８０％以上、例えば９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列相補性を有することによって相補的結合が可能であることを意味する。

前記バイオマーカーおよび基準マーカーの存在有無および／または水準（ｌｅｖｅｌ）は、これらがコードするタンパク質の定量を通じても測定可能である。例えば、前記バイオマーカー遺伝子および基準マーカー遺伝子がコードするタンパク質の定量は、当該タンパク質に特異的に結合する抗体、アプタマーなどを用いる通常の酵素反応、蛍光、発光および／または放射線検出を通じて行うことができる。具体的には、免疫クロマトグラフィー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着分析（ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、蛍光免疫分析（Ｆｌｏｒｅｓｅｎｃｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＦＩＡ）、発光免疫分析（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＬＩＡ）、ウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）、マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、免疫組織化学法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ＩＨＣ）、表面プラズモン共鳴法（ｓｕｒｆａｃｅｐｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＳＰＲ）などからなる群より選択された方法によって行われるが、これらに制限されるものではない。

他の実施形態は、前記選別された抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象に抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を投与する段階を含むｃ−Ｍｅｔ抑制方法、または癌の予防および／または治療方法を提供する。

前記ｃ−Ｍｅｔ抑制方法または癌の予防および／または治療方法は、前記投与段階以前に前記選別された抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象を確認する段階を追加的に含むことができる。前記確認する段階は、前述の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象選別方法によって選別された生物試料または患者を確認する段階であって、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象を選別する方法において説明された段階を行うことによって行われるか、与えられた情報によって前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象を選別する方法によって選別された抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象であるのを確認することによって行われるものであり得る。

一実施形態において、前記ｃ−Ｍｅｔ抑制方法または癌の予防および／または治療方法は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象を確認する段階；および前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象に抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の有効量を投与する段階を含むことができる。他の実施形態において、前記ｃ−Ｍｅｔ抑制方法または癌の予防および／または治療方法は、生物試料内の前記バイオマーカーの存在有無および／または水準を測定して抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象を選別する段階；前記選別された抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象に抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の有効量を投与する段階を含むことができる。

一実施形態において、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ｃ−Ｍｅｔを抗原として認識する全ての抗体またはその抗原結合フラグメント（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔ）であり得る。例えば、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合して内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）および分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を誘導する全ての抗体またはそれらの抗原結合フラグメントであり得る。前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ｃ−Ｍｅｔの特定部位、例えばＳＥＭＡドメイン内の特定部位をエピトープとして認識するものであり得る。

本明細書では、別途の言及がない限り、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体としては完全な形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体だけでなく前記抗体の抗原結合部位も使用される。

前記「ｃ−Ｍｅｔタンパク質」は、肝細胞成長因子と結合する受容体チロシンキナーゼを意味する。前記ｃ−Ｍｅｔタンパク質は、全ての種に由来するものであり得、例えば、ヒトｃ−Ｍｅｔ（例えば、ＮＰ＿０００２３６）、サルｃ−Ｍｅｔ（例えば、Ｍａｃａｃａｍｕｌａｔｔａ、ＮＰ＿００１１６２１００）などのような霊長類由来のもの、またはマウスｃ−Ｍｅｔ（例えば、ＮＰ＿０３２６１７．２）、ラットｃ−Ｍｅｔ（例えば、ＮＰ＿１１３７０５．１）などのようなげっ歯類由来のものなどであり得る。前記タンパク質は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｅｅｓｓｉｏｎＮｕｍｂｅｒＮＭ＿０００２４５に提供されたヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチド配列、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｅｅｓｓｉｏｎＮｕｍｂｅｒＮＭ＿０００２３６にコードされたポリペプチド配列、またはこれらの細胞外ドメインを含み得る。受容体チロシンキナーゼｃ−Ｍｅｔは、例えば、癌発生、癌転移、癌細胞移動、癌細胞浸潤、新生血管生成過程などの様々な機序に関与する。

ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）の受容体であるｃ−Ｍｅｔは、細胞外部位、膜透過部位、細胞内部位の三つの部分に区分され、細胞外部位は、α−サブユニットとβ−サブユニットとがジスルフィド結合によって連結された形態であり、ＨＧＦ結合ドメインであるＳＥＭＡドメイン、ＰＳＩドメイン（ｐｌｅｘｉｎ−ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｓ−ｉｎｔｅｇｒｉｎｈｏｍｏｌｏｇｙｄｏｍａｉｎ）およびＩＰＴドメイン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｆｏｌｄｓｈａｒｅｄｂｙｐｌｅｘｉｎｓａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｆａｃｔｏｒｓｄｏｍａｉｎ）を含む。ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメインは、配列番号７９のアミノ酸配列を有するものであり得、ｃ−Ｍｅｔの細胞外部位に存在するドメインであって、ＨＧＦが結合する部位に該当する。ＳＥＭＡドメイン中の特定部位、例えば、ＳＥＭＡドメインの１０６番目から１２４番目までに該当する配列番号７１で示されるアミノ酸配列を有する領域は、ＳＥＭＡドメイン内のエピトープ中の第２番目と第３番目のプロペラ領域間のループ（ｌｏｏｐ）領域に該当する。この領域は、本発明で提案される抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のエピトープとして作用することができる。

用語、「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、抗原決定部位（ａｎｔｉｇｅｎｉｃｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）であって、抗体によって認識される抗原の一部分を意味すると解釈される。一実施形態によれば、前記エピトープはｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン（配列番号７９）内の連続する５個以上のアミノ酸を含む部位、例えば、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン（配列番号７９）内の１０６番目から１２４番目までに該当する配列番号７１内に位置する連続する５個〜１９個のアミノ酸を含むものであり得る。前記「連続するアミノ酸」はタンパク質の１次構造（ｌｉｎｅａｒｓｅｑｕｅｎｃｅ）上で連続するアミノ酸またはタンパク質の立体構造（例えば、２次または３次構造）上で連続するアミノ酸（この場合、必ずしも１次構造上では連続することが要求されない）であり得る。例えば、前記エピトープは、配列番号７１のアミノ酸配列において配列番号７３（ＥＥＰＳＱ）を含んで連続する５〜１９個のアミノ酸からなるものであり得、例えば、配列番号７１、配列番号７２または配列番号７３のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり得る。

前記配列番号７２のアミノ酸配列を有するエピトープは、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内の第２番目と第３番目のプロペラ領域間のループ領域の中の最も外側に位置した部位に該当し、前記配列番号７３のアミノ酸配列を有するエピトープは、一実施形態による抗体または抗原結合フラグメントが最も特異的に結合する部位である。

したがって、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号７１のアミノ酸配列において、配列番号７３（ＥＥＰＳＱ）を含む連続する５〜１９個のアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合するものであり得、例えば、配列番号７１、配列番号７２、または配列番号７３のアミノ酸配列を有するエピトープに、特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントであり得る。

一実施形態によれば、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、下記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つを含むものであってもよい；
（ｉ）下記ＣＤＲ−Ｈ１〜ＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択された一つ以上の重鎖相補性決定領域、または前記一つ以上の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変部位；配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列内の３番目から１０番目までのアミノ酸を含む連続する８〜１９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列、配列番号８５のアミノ酸配列、または配列番号８５のアミノ酸配列内の１番目から６番目までのアミノ酸を含む連続する６〜１３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３
（ｉｉ）下記ＣＤＲ−Ｌ１〜ＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択された一つ以上の軽鎖相補性決定領域、または前記一つ以上の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変部位；配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号９のアミノ酸配列、配列番号１５のアミノ酸配列、配列番号８６のアミノ酸配列、または配列番号８９のアミノ酸配列内の１番目から９番目までのアミノ酸を含む９〜１７個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３
（ｉｉｉ）前記重鎖相補性決定領域および軽鎖相補性決定領域の組み合わせ
（ｉｖ）前記重鎖可変部位および軽鎖可変部位の組み合わせ。

前記配列番号４〜配列番号９はそれぞれ下記一般式Ｉ〜一般式ＶＩで表示されるアミノ酸配列である：

前記一般式Ｉにおいて、Ｘａａ_１は存在しないかＰｒｏまたはＳｅｒであり、Ｘａａ_２はＧｌｕまたはＡｓｐである。前記一般式ＩＩにおいて、Ｘａａ_３はＡｓｎまたはＬｙｓであり、Ｘａａ_４はＡｌａまたはＶａｌであり、Ｘａａ_５はＡｓｎまたはＴｈｒであり、
前記一般式ＩＩＩにおいて、Ｘａａ_６はＳｅｒまたはＴｈｒである。前記一般式ＩＶにおいて、Ｘａａ_７はＨｉｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、Ｘａａ_８はＳｅｒまたはＴｒｐであり、Ｘａａ_９はＨｉｓまたはＧｌｎであり、Ｘａａ_１０はＬｙｓまたはＡｓｎである。前記一般式Ｖにおいて、Ｘａａ_１１はＡｌａまたはＧｌｙであり、Ｘａａ_１２はＴｈｒまたはＬｙｓであり、Ｘａａ_１３はＳｅｒまたはＰｒｏである。前記一般式ＶＩにおいて、Ｘａａ_１４はＧｌｙ、ＡｌａまたはＧｌｎであり、Ｘａａ_１５はＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＬｙｓであり、Ｘａａ_１６はＬｅｕ、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＭｅｔである。

一実施形態において、前記ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであり得る。前記ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号２、配列番号２５、および配列番号２６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであり得る。前記ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号３、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号８５からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであり得る。

前記ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号１０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号１０６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであり得る。前記ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号１１、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであり得る。前記ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３７、配列番号８６、および配列番号８９からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであり得る。

一実施形態において、前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号２、配列番号２５、および配列番号２６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｈ２）、および配列番号３、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号８５からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｈ３）を含む重鎖可変部位；および配列番号１０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号１０６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１１、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｌ２）、および配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３７、配列番号８６、および配列番号８９からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｌ３）を含む軽鎖可変部位を含むものであり得る。

一実施形態によれば、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体または抗原結合フラグメントにおいて、前記重鎖可変部位は配列番号１７、配列番号７４、配列番号８７、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３または配列番号９４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変部位は配列番号３０６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号７５、配列番号８８、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９または配列番号１０７のアミノ酸配列を含むものであり得る。

所望の抗原を被免疫動物に免疫させて生産する動物由来抗体は、一般に、治療目的でヒトに投与時、免疫拒絶反応が起こることがある。このような免疫拒絶反応を抑制するためにキメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｂｏｄｙ）が開発された。キメラ抗体は、遺伝子工学的方法を用いて、抗−アイソタイプ（ａｎｔｉ−ｉｓｏｔｙｐｅ）反応の原因になるとされる動物由来抗体の不変部位をヒト抗体の不変部位に置換したものである。キメラ抗体は、動物由来抗体に比べて抗−アイソタイプ反応において相当部分改善されたが、可変部位は依然として動物由来アミノ酸を有しているため、潜在的な抗−イディオタイプ（ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ）反応に対する副作用を内包している。このような副作用を改善するために開発されたものがヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄａｎｔｉｂｏｄｙ）である。これは、キメラ抗体の可変部位の中の抗原の結合に重要な役割を果たすＣＤＲ部位をヒト抗体フレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に移植して製作される。

ヒト化抗体を製作するためのＣＤＲグラフト（ｇｒａｆｔｉｎｇ）技術において最も重要なことは、動物由来抗体のＣＤＲ部位を最もよく受け入れる最適化されたヒト抗体を選定することであり、このために、抗体データベースの活用、結晶構造の分析、分子モデリング技術などが活用される。しかし、最適化されたヒト抗体の骨格（フレームワーク）に動物由来抗体のＣＤＲ部位を移植しても、動物由来抗体の骨格（フレームワーク）に位置しながら、抗原結合に影響を与えるアミノ酸が存在する場合があるため、抗原結合力が保存されない場合が相当数存在するため、抗原結合力を復元するための追加的な抗体工学技術の適用は必須といえる。

一実施形態によれば、前記抗体は、マウス由来抗体、マウス−ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト由来抗体であり得る。前記抗体は、生体から分離されたものまたは自然に発生しないものであり得る。前記抗体は、組換えまたは合成的に製造されたものであり得る。

完全な抗体は、２個の全長軽鎖および２個の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。抗体の不変部位（Ｆｃ）は、重鎖不変部位（Ｃ_Ｈ）と軽鎖不変部位（Ｃ_Ｌ）とに分けられる。重鎖不変部位は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）およびエプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとして、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変部位は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する。

用語「重鎖（ｈｅａｖｙｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するために十分な可変部位配列を有するアミノ酸配列を含む可変部位ドメインＶ_Ｈ、３個の不変部位ドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３、ならびにヒンジ（ｈｉｎｇｅ）を含む全長重鎖、ならびにそのフラグメントを全て含む意味として解釈される。また、用語「軽鎖（ｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変部位配列を有するアミノ酸配列を含む可変部位ドメインＶ_Ｌ、および不変部位ドメインＣ_Ｌを含む全長軽鎖、ならびにそのフラグメントを全て含む意味として解釈される。

用語「ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）」は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の高可変部位（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列（相補性決定領域）を意味する。重鎖および軽鎖はそれぞれ、３個のＣＤＲを含むことができる（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３）。前記ＣＤＲは、抗体が抗原またはエピトープに結合するにおいて主な接触残基を提供することができる。一方、本明細書において、用語「特異的に結合」または「特異的に認識」は、当業者に通常知られている意味と同一のものであって、抗原および抗体が特異的に相互作用して免疫学的反応を行なうことを意味する。

用語「抗原結合フラグメント」は、免疫グロブリン全体構造に対するそれのフラグメントで、抗原が結合可能な部分を含むポリペプチドの一部を意味する。一実施形態では、前記抗原結合フラグメントは、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）_２であり得るが、これに限定されない。前記抗原結合フラグメントの中のＦａｂは、軽鎖および重鎖の可変部位と、軽鎖の不変部位および重鎖の１番目の不変部位（Ｃ_Ｈ１）とを有する構造で、１つの抗原結合部位を有する。

Ｆａｂ’は、重鎖Ｃ_Ｈ１ドメインのＣ−末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅｒｅｇｉｏｎ）を有するという点からＦａｂと差がある。

Ｆ（ａｂ’）_２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を成しながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変部位および軽鎖可変部位のみを有している最小の抗体片で、Ｆｖフラグメントを生成する組換え技術は当業界に広く公知されている。

二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎＦｖ）は、非共有結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位とが連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎＦｖ）は、一般に、ペプチドリンカーを通じて重鎖の可変部位と単鎖の可変部位とが共有結合で連結されるか、またはＣ−末端で直接連結されていて、二重鎖Ｆｖと同様に、ダイマーのような構造を成すことができる。前記ペプチドリンカーは、１〜１００個または２〜５０個の任意のアミノ酸からなるポリペプチドであり得、その含まれているアミノ酸の種類は制限がない。

前記抗原結合フラグメントは、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すればＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）_２フラグメントを得ることができる）、遺伝子組換え技術によって製作することができる。

用語「ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅｒｅｇｉｏｎ）」は、抗体の重鎖に含まれている領域であって、ＣＨ１およびＣＨ２領域の間に存在し、抗体内の抗原結合部位の柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）を提供する機能を果たす領域を意味する。

非ヒト動物由来抗体がキメラ化（ｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）過程を経ると、非ヒト動物由来のＩｇＧ１ヒンジはヒトＩｇＧ１ヒンジに置換されるが、非ヒト動物由来ＩｇＧ１ヒンジはヒトＩｇＧ１ヒンジに比べてその長さが短く、２個の重鎖の間のジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄ）が３個から２個に減少し、ヒンジの硬直性（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）が互いに異なる効果を示す。したがって、ヒンジ領域の変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）はヒト化抗体の抗原結合効率性を増加させることができる。前記ヒンジ領域のアミノ酸配列を変形させるためのアミノ酸の欠失、付加または置換方法は当業者によく知られている。

ここで、本発明の一実施形態において、抗原結合効率性を増進させるために、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体または抗原結合フラグメントは、一つ以上のアミノ酸が欠失、付加または置換されてアミノ酸配列が改変されたヒンジ領域を含むものであり得る。例えば、前記抗体は、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３または配列番号１０４のアミノ酸配列を有するヒンジ領域、または配列番号１０５のアミノ酸配列を有するヒンジ領域（非変形ヒトヒンジ領域）を含むものであり得る。より具体的には、前記ヒンジ領域は、配列番号１００または配列番号１０１のアミノ酸配列を有するものであり得る。

一実施形態において、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２２０のハイブリドーマ細胞から生産される、ｃ−Ｍｅｔタンパク質の細胞外部位（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｇｉｏｎ）に特異的に結合するモノクローナル抗体であり得る（大韓民国公開特許第２０１１−００４７６９８号公報参照；前記文献は、本明細書に参照として含まれる）。前記の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、大韓民国公開特許第２０１１−００４７６９８公報号に定義された抗体を全て含むことができる。

前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の前記定義されたＣＤＲ部位または軽鎖可変部位と重鎖可変部位を除いた部位、例えば、軽鎖不変部位と重鎖不変部位は全てのサブタイプの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４など）、またはＩｇＭなど）に由来するもの、例えば、軽鎖不変部位と重鎖不変部位であり得る。

一実施形態によれば、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、
配列番号６２のアミノ酸配列（このうち、１番目から１７番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）、配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列、配列番号６４のアミノ酸配列（このうち、１番目から１７番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）または配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列、配列番号６６のアミノ酸配列（このうち、１番目から１７番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）、および配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む重鎖；ならびに
配列番号６８のアミノ酸配列（このうち、１番目から２０番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）、配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列、配列番号７０のアミノ酸配列（このうち、１番目から２０番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）、配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列、および配列番号１０８のアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖
を含むものであり得る。

例えば、前記抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体は、
配列番号６２のアミノ酸配列または配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体；
配列番号６４のアミノ酸配列または配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体；
配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体；
配列番号６２のアミノ酸配列または配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号７０のアミノ酸配列または配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体；
配列番号６４のアミノ酸配列または配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号７０のアミノ酸配列または配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体；または
配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号７０または配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体
配列番号６２のアミノ酸配列または配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体；
配列番号６４のアミノ酸配列または配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体；ならびに
配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体
からなる群より選択されたものであり得る。

一方、前記配列番号７０のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ヒトのカッパ不変部位からなる軽鎖であり、配列番号６８のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、前記配列番号７０のアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて３６番（カバットナンバリングに従う；配列番号６８内の６２番目のアミノ酸の位置）ヒスチジン（Ｈｉｓ）がチロシン（Ｔｙｒ）に置換された形態のポリペプチドである。前記置換によって、一実施形態による抗体の生産量が増加できる。また、前記配列番号１０８のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、前記配列番号６８のアミノ酸配列の中の１番目から２０番目までのシグナルペプチドを除いた２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいてカバットナンバリングによる２７ｅ位置（カバットナンバリングに従う；配列番号１０８内の３２番目の位置；ＣＤＲ−Ｌ１の内部）のセリン（Ｓｅｒ）がトリプトファン（Ｔｒｐ）に置換されたものであり、前記置換によって、一実施形態による抗体の活性（例えば、ｃ−Ｍｅｔに対する結合親和性、ｃ−Ｍｅｔ分解活性およびＡｋｔリン酸化抑制活性など）がより増進できる。

前記抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体は、薬学的に許容可能な担体と共に製剤化することができ、前記担体は、薬物の製剤化に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどからなる群より選択された１種以上であり得るが、これに限定されるものではない。

前記抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体は、経口または非経口で投与することができる。非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与または直腸内投与などで投与することができる。経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化されなければならない。また、前記抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体は、標的細胞に移動できる任意の装置によって投与することができる。

前記抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体は、癌の予防および／または治療に用いることができる。前記癌は固形癌または血液癌であり得、ｃ−Ｍｅｔの過発現または活性化に関連するものであり得る。例えば、前記癌は、これに制限されないが、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼球内黒色腫、直膓癌、肛門付近癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、肝細胞癌、胃腸癌、胃癌、すい臓癌、膠芽腫、頸部癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、頭頸部癌、脳癌、骨肉腫などからなる群より選択された１種以上であり得る。

前記癌の予防および／または治療効果は、癌細胞の成長を抑制する効果だけでなく、移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、浸湿（ｉｎｖａｓｉｏｎ）、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）などを抑制して、これによる癌の悪化を抑制する効果を含む。また、原発性癌だけでなく転移性癌に対する効果を含む。

以下、本発明を実施例および試験例を通じてより詳細に説明する。しかし、これら実施例および試験例は本発明を例示するためのもので、本発明を制限すると解釈されてはならない。

＜参考例１：抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の作製＞
１．１．ｃ−Ｍｅｔに対するマウス抗体‘ＡｂＦ４６’の産生
１．１．１．マウスの免疫化
ハイブリドーマ細胞株の開発に必要な免疫化されたマウスを得るために、５匹のマウスに、１匹当り１００μｇのヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社）と、同量の完全フロイントアジュバントを混合して、４〜６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本エスエルシー株式会社）の腹腔内に注射した。２週後に、前記と同様の方法で、前記抗原として使用されたヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質を、前記注射した量の半分である５０μｇを同量の不完全フロイントアジュバントと混合して、マウスの腹腔内に注射した。１週間後、最後のブースティング（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）が行われ、３日後に、前記マウスの尾から採血して血清を得た。その後、血液を１／１０００倍にＰＢＳで希釈して、ＥＬＩＳＡ法でｃ−Ｍｅｔを認識する抗体の力価が増加することを確認した。前記結果で抗体の量が十分に得られるマウスを選別し、下記の細胞融合過程を行った。

１．１．２．細胞融合およびハイブリドーマの製造
細胞融合実験３日前に、５０μｇのＰＢＳ内のヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質と等量のＰＢＳとの混合物を、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本エスエルシー株式会社）の腹腔内に注射して免疫した。免疫化されたマウスを麻酔した後、体の左側に位置した脾臓を摘出した。摘出した脾臓をメッシュで粉砕して細胞を分離し、培養培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ、インビトロジェン社）と混合して、脾臓細胞懸濁液を調製した。前記懸濁液を遠心分離して細胞層を回収した。前記得られた脾臓細胞１×１０^８個と、骨髄腫細胞（Ｓｐ２／０）１×１０^８個とを混合した後、遠心分離して細胞を沈殿させた。前記遠心分離された沈殿物を徐々に分散させ、培養培地（ＤＭＥＭ）に入っている４５（ｗ／ｖ）％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（１ｍｌ）によって３７℃で１分間処理した後、培養培地（ＤＭＥＭ）１ｍｌを添加した。以後、培養培地（ＤＭＥＭ）１０ｍｌを１０分間かけて添加し、３７℃のウォーターバスで５分間放置した。その後、培養培地（ＤＭＥＭ）にて５０ｍｌに合わせて、再び遠心分離した。細胞沈殿物を選択培地（ＨＡＴ培地）で１〜２×１０^５／ｍｌ程度に再懸濁させ、９６ウェル（ｗｅｌｌ）プレートに０．１ｍｌずつ分注した後、３７℃の二酸化炭素培養器で培養して、ハイブリドーマ細胞群を作製した。

１．１．３．ｃ−Ｍｅｔタンパク質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選別
前記参考例１．１．２で製造されたハイブリドーマ細胞群のうち、ｃ−Ｍｅｔタンパク質にのみ特異的に反応するハイブリドーマ細胞を選別するために、ヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質とヒトのＦｃタンパク質を抗原として用いたＥＬＩＳＡ分析方法によってスクリーニングした。

マイクロタイタープレートに、ヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質を、１ウェル当りそれぞれ５０μｌ（２μｇ／ｍｌ）ずつ加えてプレート表面に付着させ、反応しない抗原は洗浄して除去した。ｃ−ＭｅｔでないＦｃに結合される抗体を選別して除外させるために、ヒトのＦｃタンパク質を、前記と同様の方法でプレート表面に付着させた。

前記参考例１．１．２で得られたハイブリドーマ細胞の培養液を、前記用意されたそれぞれのウェルに５０μｌずつ加えて１時間反応させた後、リン酸緩衝溶液−ツイン２０（ＴＢＳＴ）溶液で十分に洗浄し、反応しない培養液を除去した。これに、ヤギ抗−マウスＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｇｏａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ−ＨＲＰ）を加えて、１時間、室温で反応させた後、ＴＢＳＴ溶液で十分に洗浄した。その次に、ペルオキシダーゼの基質溶液（ＯＰＤ）を加えて反応させ、その反応の程度は、ＥＬＩＳＡリーダー（ＥＬＩＳＡＲｅａｄｅｒ）で４５０ｎｍにおける吸光度を測定して確認した。

前記のような反応程度の確認によって、ヒトのＦｃには結合せず、ヒトのｃ−Ｍｅｔタンパク質にのみ特異的に高い結合力を有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を繰り返し選別した。繰り返し選別によって得られたハイブリドーマ細胞株を制限稀釈して、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株１個のクローンを最終的に得た。最終選別されたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、２００９年１０月６日付でブダペスト条約下の国際寄託機関である、大韓民国、ソウル、鍾路区、蓮建洞所在の韓国細胞株研究財団に寄託し、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２２０が付与された（韓国公開特許第２０１１−００４７６９８号公報参照）。

１．１．４．モノクローナル抗体の産生および精製
前記参考例１．１．３で得られたハイブリドーマ細胞を無血清培地で培養し、培養液からモノクローナル抗体を産生精製した。

まず、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが含まれている培養培地（ＤＭＥＭ）５０ｍｌで培養された前記ハイブリドーマ細胞を遠心分離し、細胞沈殿物を２０ｍｌのＰＢＳで２回以上洗浄し、ＦＢＳが除去された状態で、前記細胞沈殿物を培養培地（ＤＭＥＭ）５０ｍｌに再懸濁させた後、３日間、３７℃の二酸化炭素培養器で培養した。

その後、遠心分離して、抗体を産生する細胞を除去し、抗体が分泌された培養液を分離して、４℃に保管するか、直ちに集めて、抗体の分離精製に使用した。親和性カラム（ＰｒｏｔｅｉｎＧａｇａｒｏｓｅｃｏｌｕｍｎ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ＵＳＡ）を装着したＡＫＴＡ精製機器（ＧＥヘルスケア社）を用いて、前記用意された培養液５０ｍｌ〜３００ｍｌから抗体を純粋精製した。その後、タンパク質凝集用フィルタ（アミコン）を用いてＰＢＳで上層液を置換し、精製された抗体を保管し、以後の実施例に使用した。

１．２．ｃ−Ｍｅｔに対するキメラ抗体ｃｈＡｂＦ４６の作製
一般に、マウス抗体は、治療目的でヒトに注入された時、免疫拒絶反応（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を示す可能性が高い。これを解決するために、前記参考例１．１．で作製されたマウス抗体ＡｂＦ４６から、抗原の結合に関連する可変部位（ｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ）を除いた不変部位（ｃｏｎｓｔａｎｔｒｅｇｉｏｎ）を、ヒトＩｇＧ１抗体の配列に置換するキメラ抗体ｃｈＡｂＦ４６を作製した。

重鎖に該当するヌクレオチド配列は‘ＥｃｏＲＩ−ｓｉｇｎａｌｓｅｑｕｅｎｃｅ−ＶＨ−ＮｈｅＩ−ＣＨ−ＴＧＡ−ＸｈｏＩ’（配列番号３８）から構成され、軽鎖に該当するヌクレオチド配列は‘ＥｃｏＲＩ−ｓｉｇｎａｌｓｅｑｕｅｎｃｅ−ＶＬ−ＢｓｉＷＩ−ＣＬ−ＴＧＡ−ＸｈｏＩ’（配列番号３９）から構成されるようにそれぞれデザインして遺伝子を合成した。その後、インビトロジェン社のＯｐｔｉＣＨＯ^ＴＭＡｎｔｉｂｏｄｙＥｘｐｒｅｓｓＫｉｔ（Ｃａｔｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣ^ＴＭ−ＴＯＰＯＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔに前記重鎖に該当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ切片（配列番号３８）を、ｐｃＤＮＡ^ＴＭ３．３−ＴＯＰＯＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｃａｔｎｏ．８３００−０１）に前記軽鎖に該当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ切片（配列番号３９）を、それぞれＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ社、Ｒ０１０１Ｓ）とＸｈｏＩ（ＮＥＢ社、Ｒ０１４６Ｓ）制限酵素を用いてクローニングすることにより、キメラ抗体の発現のため重鎖を含むベクターおよび軽鎖を含むベクターをそれぞれ構築した。

前記構築されたベクターはそれぞれ、ＱｉａｇｅｎＭａｘｉｐｒｅｐｋｉｔ（Ｃａｔｎｏ．１２６６２）を用いて増幅され、一過性発現はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭＭＡＸ２９３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いて行なわれた。使用された細胞株は２９３Ｆ細胞であり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ２９３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍを培地として用いて浮遊培養方式で培養された。一過性発現の１日前に細胞を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で用意した。２４時間経過後、細胞数が１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなった時、一過性発現を行なった。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭＭＡＸｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）を用いたｌｉｐｏｓｏｍａｌｒｅａｇｅｎｔ法で形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を行い、１５ｍｌのチューブに重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の割合でＤＮＡを用意してＯｐｔｉＰｒｏ^ＴＭＳＦＭ（インビトロジェン社）２ｍｌと混合し（Ａ）、他の１５ｍｌのチューブにＦｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭＭＡＸｒｅａｇｅｎｔ１００μｌとＯｐｔｉＰｒｏ^ＴＭＳＦＭ２ｍｌを混合（Ｂ）した。その後、（Ａ）と（Ｂ）とを混合して１５分間インキュベートした後、１日前に用意した細胞に混合液を徐々に入れ混ぜた。形質導入完了後、３７℃、湿度８０％、８％ＣＯ_２、１３０ｒｐｍの培養器で５日間培養した。

その後、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で５時間培養した後、ＦＢＳが添加されていないＤＭＥＭ培地で、４８時間、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養した。

前記培養された細胞を遠心分離して上清をそれぞれ１００ｍｌ取って、ＡＫＴＡＰｒｉｍｅ（ＧＥヘルスケア社）を用いて精製した。ＡＫＴＡＰｒｉｍｅにＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（ＧＥヘルスケア社、１７−０４０５−０３）を設け、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ溶出バッファー（サーモサイエンティフィック社、２１００４）で溶出させた。得られた溶出物をＰＢＳにバッファー交換し、最終的にキメラ抗体ＡｂＦ４６（以下、ｃｈＡｂＦ４６と名づける）を精製した。

１．３．キメラ抗体ｃｈＡｂＦ４６からヒト化抗体ｈｕＡｂＦ４６の作製
１．３．１．重鎖のヒト化（Ｈｅａｖｙｃｈａｉｎｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）
Ｈ１−ｈｅａｖｙおよびＨ３−ｈｅａｖｙの２つのドメインのデザインのために、まず、ＩｇＢｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を通じて、前記参考例１．２で精製されたマウス抗体ＡｂＦ４６のＶＨ遺伝子と最も相同性が高いヒトの生殖腺系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）遺伝子を分析した。その結果、ＶＨ３−７１がアミノ酸レベルで８３％の相同性を有することを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３をカバットナンバリングで定義し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ部分がＶＨ３−７１のフレームワークに導入されるようにデザインした。この時、３０番（Ｓ→Ｔ）、４８番（Ｖ→Ｌ）、７３番（Ｄ→Ｎ）、７８番（Ｔ→Ｌ）のアミノ酸は、元々、マウスＡｂＦ４６抗体のアミノ酸配列に逆変異させた。その後、Ｈ１は、追加的に８３番（Ｒ→Ｋ）と８４番（Ａ→Ｔ）のアミノ酸に突然変異を与え、最終的にＨ１−ｈｅａｖｙ（配列番号４０）とＨ３−ｈｅａｖｙ（配列番号４１）を構築した。

Ｈ４−ｈｅａｖｙのデザインのために、ヒト抗体のフレームワーク配列を調べた結果、ＡｂＦ４６抗体のマウスのフレームワーク配列と配列が非常に類似すると同時に、従来の最も安定的と知られているＶＨ３サブタイプを用いて、カバットナンバリングで定義されたマウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３を導入した。これにより、Ｈ４−ｈｅａｖｙ（配列番号４２）を構築した。

１．３．２．軽鎖のヒト化（Ｌｉｇｈｔｃｈａｉｎｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）
Ｈ１−ｌｉｇｈｔ（配列番号４３）およびＨ２−ｌｉｇｈｔ（配列番号４４）の２種のデザインのために、ＩｇＢｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を通じて、マウス抗体ＡｂＦ４６のＶＬ遺伝子と最も相同性が高いヒト生殖腺遺伝子を分析した。その結果、ＶＫ４−１がアミノ酸レベルで７５％の相同性を有することを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３をカバットナンバリングで定義し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ部分がＶＫ４−１のフレームワークに導入されるようにデザインした。この時、Ｈ１−ｌｉｇｈｔは、３６番（Ｙ→Ｈ）、４６番（Ｌ→Ｍ）、４９番（Ｙ→Ｉ）の３個のアミノ酸を逆変異させ、Ｈ２−ｌｉｇｈｔは、４９番のアミノ酸（Ｙ→Ｉ）１個のみを逆変異させて構築した。

Ｈ３−ｌｉｇｈｔ（配列番号４５）のデザインのために、Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を通じて、マウス抗体ＡｂＦ４６のＶＬ遺伝子と最も相同性が高いヒト生殖腺遺伝子を分析した結果のうち、前記ＶＫ４−１のほか、ＶＫ２−４０を選定した。マウス抗体ＡｂＦ４６ＶＬとＶＫ２−４０は、アミノ酸レベルで６１％の相同性を有することを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３をカバットナンバリングで定義し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ部分がＶＫ４−１のフレームワークに導入されるようにデザインした。この時、Ｈ３−ｌｉｇｈｔは、３６番（Ｙ→Ｈ）、４６番（Ｌ→Ｍ）、４９番（Ｙ→Ｉ）の３個のアミノ酸を逆変異させて構築した。

Ｈ４−ｌｉｇｈｔ（配列番号４６）のデザインのために、ヒト抗体のフレームワーク配列を調べた結果、従来の最も安定的と知られているＶｋ１サブタイプを用いて、カバットナンバリングで定義されたマウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３を導入した。この時、Ｈ４−ｌｉｇｈｔは、３６番（Ｙ→Ｈ）、４６番（Ｌ→Ｍ）、４９番（Ｙ→Ｉ）の３個のアミノ酸を追加的に逆変異させて構築した。

その後、インビトロジェン社のＯｐｔｉＣＨＯ^ＴＭＡｎｔｉｂｏｄｙＥｘｐｒｅｓｓＫｉｔ（Ｃａｔｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣ^ＴＭ−ＴＯＰＯＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔに前記重鎖に該当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ切片（Ｈ１−ｈｅａｖｙ；配列番号４７、Ｈ３−ｈｅａｖｙ；配列番号４８、Ｈ４−ｈｅａｖｙ；配列番号４９）を、ｐｃＤＮＡ^ＴＭ３．３−ＴＯＰＯＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔに前記軽鎖に該当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ切片（Ｈ１−ｌｉｇｈｔ；配列番号５０、Ｈ２−ｌｉｇｈｔ；配列番号５１、Ｈ３−ｌｉｇｈｔ；配列番号５２、Ｈ４−ｌｉｇｈｔ；配列番号５３）を、それぞれＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ社、Ｒ０１０１Ｓ）とＸｈｏＩ（ＮＥＢ社、Ｒ０１４６Ｓ）制限酵素を用いて、クローニングすることにより、ヒト化抗体の発現のためのベクターを構築した。

前記構築されたベクターはそれぞれ、ＱｉａｇｅｎＭａｘｉｐｒｅｐｋｉｔ（Ｃａｔｎｏ．１２６６２）を用いて増幅され、一過性発現はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭＭＡＸ２９３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いて行なわれた。使用された細胞株は２９３Ｆ細胞であり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ２９３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍを培地として用いて浮遊培養方式で培養された。一過性発現の１日前に細胞を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で用意した。２４時間経過後、細胞数が１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなった時、一過性発現を行なった。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭＭＡＸｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）を用いたｌｉｐｏｓｏｍａｌｒｅａｇｅｎｔ法で形質導入を行った。すなわち、１５ｍｌのチューブに重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の割合でＤＮＡを用意してＯｐｔｉＰｒｏ^ＴＭＳＦＭ（インビトロジェン社）２ｍｌと混合し（Ａ）、他の１５ｍｌのチューブにＦｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭＭＡＸｒｅａｇｅｎｔ１００μｌとＯｐｔｉＰｒｏ^ＴＭＳＦＭ２ｍｌを混合（Ｂ）した後、（Ａ）と（Ｂ）とを混合して１５分間インキュベートした後、１日前に用意した細胞に混合液を徐々に入れ混ぜた。形質導入完了後、３７℃、湿度８０％、８％ＣＯ_２、１３０ｒｐｍの培養器で５日間培養した。

前記培養された細胞を遠心分離して上清各１００ｍｌを取って、ＡＫＴＡＰｒｉｍｅ（ＧＥヘルスケア社）を用いて精製した。ＡＫＴＡＰｒｉｍｅにＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（ＧＥヘルスケア社、１７−０４０５−０３）を設け、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ溶出バッファー（サーモサイエンティフィック社、２１００４）で溶出した。これをＰＢＳにバッファー交換し、最終的にヒト化抗体ＡｂＦ４６（以下、ｈｕＡｂＦ４６と名づける）を精製した。一方、以後の実施例で使用したヒト化抗体ｈｕＡｂＦ４６の重鎖、軽鎖の組み合わせは、Ｈ４−ｈｅａｖｙ（配列番号４２）およびＨ４−ｌｉｇｈｔ（配列番号４６）である。

１．４．ｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖライブラリーの作製
ｈｕＡｂＦ４６抗体の重鎖可変部位および軽鎖可変部位を用いてｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖを作製するための遺伝子をデザインした。それぞれの重鎖可変部位および軽鎖可変領域を‘ＶＨ−リンカー−ＶＬ’の形態となるようにし、前記リンカーは‘ＧＬＧＧＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＳＧＶＧＳ’（配列番号５４）のアミノ酸配列を有するようにデザインした。このようにデザインされたｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド（配列番号５５）をバイオニア社に依頼して合成し、これを発現させるためのベクターを配列番号５６に示した。

以後、前記ベクターから発現した結果物を分析し、ｃ−Ｍｅｔに特異的な結合力を示すことを確認した。

１．５．親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）のためのライブラリー遺伝子の作製
１．５．１．標的ＣＤＲの選定およびプライマーの作製
ｈｕＡｂＦ４６抗体の親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）のために６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を、前記作製されたマウス抗体ＡｂＦ４６から‘カバットナンバリング’によって定義した。それぞれのＣＤＲは下記の表１の通りである。

抗体ＣＤＲのランダム配列導入のために、次のようにプライマーを作製した。従来のランダム配列導入方式は、突然変異を与えようとする部位に同一の割合の塩基（２５％Ａ、２５％Ｇ、２５％Ｃ、２５％Ｔ）が導入されるようにＮコドンが用いられる。本実施例では、ｈｕＡｂＦ４６抗体のＣＤＲにランダム塩基を導入するために、各ＣＤＲのアミノ酸をコードする３個の野生型ヌクレオチド中の１番目および２番目のヌクレオチドの８５％はそのまま保存し、残りの３個の塩基をそれぞれ５％ずつ導入する方式を採った。また、３番目のヌクレオチドは、同一に（３３％Ｇ、３３％Ｃ、３３％Ｔ）が導入されるようにプライマーをデザインした。

１．５．２．ｈｕＡｂＦ４６抗体のライブラリーの作製およびｃ−Ｍｅｔに対する結合力の確認
ＣＤＲのランダム配列の導入による抗体ライブラリー遺伝子の構築は、前記参考例１．５．１のような方法で作製されたプライマーを用いて行った。鋳型としてｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖを含むポリヌクレオチドを用いて、２個のＰＣＲ切片を作製し、これを重複拡張重合酵素連鎖反応（ｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎＰＣＲ）方法により、所望のＣＤＲのみそれぞれ突然変異したｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖライブラリー遺伝子を確保して作製された６つのＣＤＲをそれぞれ標的とするライブラリーを構築した。

このように作製されたライブラリーは、野生型と各ライブラリーのｃ−Ｍｅｔに対する結合力を確認し、それぞれのライブラリーは、野生型に比べてｃ−Ｍｅｔに対する結合力が大部分低下する傾向を示したが、一部でｃ−Ｍｅｔに対する結合力が維持される突然変異を確認した。

１．６．作製されたライブラリーから親和性の改善された抗体の選別
前記構築されたライブラリーからｃ−Ｍｅｔに対するライブラリーの結合力を向上させた後、それぞれの個別クローンからｓｃＦｖの遺伝子配列を分析した。確保された遺伝子配列はそれぞれ下記の表８の通りであり、これをＩｇＧ形態に変換した。下記のクローンのうち、Ｌ３−１、Ｌ３−２、Ｌ３−３、Ｌ３−５から産生された４種の抗体を選別して後続の実験を行った。

１．７．選別された抗体のＩｇＧへの変換
選別された４種の抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドは‘ＥｃｏＲＩ−ｓｉｇｎａｌｓｅｑｕｅｎｃｅ−ＶＨ−ＮｈｅＩ−ＣＨ−ＸｈｏＩ’（配列番号３８）の構造を有するように設計された。ｈｕＡｂＦ４６抗体の重鎖の場合、親和性成熟の際に抗体のアミノ酸が変更されなかったので、ｈｕＡｂＦ４６抗体の重鎖をそのまま使用した。但し、ヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１のヒンジでないＵ６−ＨＣ７ヒンジ（配列番号５７）に置換した。軽鎖は‘ＥｃｏＲＩ−ｓｉｇｎａｌｓｅｑｕｅｎｃｅ−ＶＬ−ＢｓｉＷＩ−ＣＬ−ＸｈｏＩ’の構造を有するようにそれぞれ遺伝子を設計して合成した。親和性の成熟後に選別された、前記４種の抗体の軽鎖可変部位を含んでコードするポリヌクレオチド（配列番号５８〜配列番号６１）をバイオニア社に依頼して合成した。その後、インビトロジェン社のＯｐｔｉＣＨＯ^ＴＭＡｎｔｉｂｏｄｙＥｘｐｒｅｓｓＫｉｔ（Ｃａｔｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣ^ＴＭ−ＴＯＰＯＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔに前記重鎖に該当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ切片（配列番号３８）を、ｐｃＤＮＡ^ＴＭ３．３−ＴＯＰＯＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｃａｔｎｏ．８３００−０１）に前記軽鎖に該当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ切片（Ｌ３−１由来のＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ切片：配列番号５８、Ｌ３−２由来のＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ切片：配列番号５９、Ｌ３−３由来のＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ切片：配列番号６０、Ｌ３−５由来のＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ切片：配列番号６１）を、それぞれＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ社、Ｒ０１０１Ｓ）とＸｈｏＩ（ＮＥＢ社、Ｒ０１４６Ｓ）制限酵素を用いてクローニングすることにより、親和性の成熟した抗体の発現のためのベクターを構築した。

前記構築されたベクターはそれぞれ、ＱｉａｇｅｎＭａｘｉｐｒｅｐｋｉｔ（Ｃａｔｎｏ．１２６６２）を用いて増幅され、一過性発現はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭＭＡＸ２９３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いて行なわれた。使用された細胞株は２９３Ｆ細胞であり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ２９３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍを培地として用いて浮遊培養方式で培養された。一過性発現の１日前に細胞を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で用意した。２４時間経過後、細胞数が１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなった時、一過性発現を行なった。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭＭＡＸｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）を用いたｌｉｐｏｓｏｍａｌｒｅａｇｅｎｔ法で形質導入を行った。すなわち、１５ｍｌのチューブに重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の割合でＤＮＡを用意し、ＯｐｔｉＰｒｏ^ＴＭＳＦＭ（インビトロジェン社）２ｍｌと混合し（Ａ）、他の１５ｍｌのチューブにＦｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭＭＡＸｒｅａｇｅｎｔ１００μｌとＯｐｔｉＰｒｏ^ＴＭＳＦＭ２ｍｌを混合（Ｂ）した後、（Ａ）と（Ｂ）とを混合して１５分間インキュベートした後、１日前に用意した細胞に混合液を徐々に入れ混ぜた。形質導入完了後、３７℃、湿度８０％、８％ＣＯ_２、１３０ｒｐｍの培養器で５日間培養した。

前記培養された細胞を遠心分離して上清各１００ｍｌを取って、ＡＫＴＡＰｒｉｍｅ（ＧＥヘルスケア社）を用いて精製した。ＡＫＴＡＰｒｉｍｅにＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（ＧＥヘルスケア社、１７−０４０５−０３）を設け、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ溶出バッファー（サーモサイエンティフィック社、２１００４）で溶出した。これをＰＢＳにバッファー交換し、最終的に親和性の成熟した４種の抗体（以下、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｌ３−１由来）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ２（Ｌ３−２由来）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ３（Ｌ３−３由来）、およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ５（Ｌ３−５由来）と名づける）を精製した。

１．８．不変部位および／またはヒンジ領域の置換されたｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の製造
前記参考例１．７で選別された４種の抗体のうち、ｃ−Ｍｅｔとの結合親和性が最も高く、Ａｋｔのリン酸化およびｃ−Ｍｅｔの分解の程度が最も低いと測定されたｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１を対象に、ヒンジ領域または不変部位およびヒンジ領域の置換された抗体を作製した。

ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変部位、Ｕ６−ＨＣ７ヒンジおよびヒトのＩｇＧ１不変部位からなる重鎖、ならびにｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変部位およびヒトのカッパ（ｋａｐｐａ）不変部位からなる軽鎖からなる抗体を、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−ＨＣ７）と名づけた。ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変部位、ヒトのＩｇＧ２ヒンジおよびヒトのＩｇＧ１不変部位からなる重鎖、ならびにｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変部位およびヒトのカッパ不変部位からなる軽鎖、からなる抗体を、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２ヒンジ）と名づけた。ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変部位、ヒトのＩｇＧ２ヒンジおよびヒトのＩｇＧ２不変部位からなる重鎖、およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変部位およびヒトのカッパ不変部位からなる軽鎖、からなる抗体を、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ）と名づけた。また、一方、前記３種の抗体は、産生量増大のために、ヒトのカッパ不変部位からなる軽鎖の３６番のヒスチジン（Ｈｉｓ）を全てチロシン（Ｔｙｒ）に置換した。

前記３種の抗体を作製するために、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変部位、Ｕ６−ＨＣ７ヒンジ領域およびヒトＩｇＧ１不変部位からなるポリペプチド（配列番号６２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６３）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変部位、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域およびヒトＩｇＧ１不変部位からなるポリペプチド（配列番号６４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６５）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変部位、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域およびヒトＩｇＧ２不変部位からなるポリペプチド（配列番号６６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６７）、３６番のヒスチジンがチロシンに置換されたｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変部位およびヒトカッパ不変部位からなるポリペプチド（配列番号６８）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６９）をバイオニア社に依頼して合成した。以後、インビトロジェン社のＯｐｔｉＣＨＯ^ＴＭＡｎｔｉｂｏｄｙＥｘｐｒｅｓｓＫｉｔ（Ｃａｔｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣ^ＴＭ−ＴＯＰＯＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔに前記重鎖に該当する塩基配列を有するＤＮＡ切片を、ｐｃＤＮＡ^ＴＭ３．３−ＴＯＰＯＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｃａｔｎｏ．８３００−０１）に前記軽鎖に該当する塩基配列を有するＤＮＡ切片を挿入して、前記抗体の発現のためのベクターを構築した。

前記構築されたベクターはそれぞれ、ＱｉａｇｅｎＭａｘｉｐｒｅｐｋｉｔ（Ｃａｔｎｏ．１２６６２）を用いて増幅され、一過性発現はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭＭＡＸ２９３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いて行なわれた。使用された細胞株は２９３Ｆ細胞であり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ２９３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍを培地として用いて浮遊培養方式で培養された。一過性発現の１日前に細胞を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で用意した。２４時間経過後、細胞数が１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなった時、臨時発現を行なった。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭＭＡＸｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）を用いたｌｉｐｏｓｏｍａｌｒｅａｇｅｎｔ法で形質導入を行い、１５ｍｌのチューブに重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の割合でＤＮＡを用意してＯｐｔｉＰｒｏ^ＴＭＳＦＭ（インビトロジェン社）２ｍｌと混合し（Ａ）、他の１５ｍｌのチューブにＦｒｅｅｓｔｙｌｅ^ＴＭＭＡＸｒｅａｇｅｎｔ１００μｌとＯｐｔｉＰｒｏ^ＴＭＳＦＭ２ｍｌを混合（Ｂ）した後、（Ａ）と（Ｂ）とを混合して１５分間インキュベートした後、１日前に用意した細胞に混合液を徐々に入れ混ぜた。形質導入完了後、３７℃、湿度８０％、８％ＣＯ_２、１３０ｒｐｍの培養器で５日間培養した。

前記培養された細胞を遠心分離して上清各１００ｍｌを取って、ＡＫＴＡＰｒｉｍｅ（ＧＥヘルスケア社）を用いて精製した。ＡＫＴＡＰｒｉｍｅにＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（ＧＥヘルスケア社、１７−０４０５−０３）を設け、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ溶出バッファー（サーモサイエンティフィック社、２１００４）で溶出した。これをＰＢＳにバッファー交換し、最終的に３種の抗体（ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−ＨＣ７）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２ヒンジ）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ））を精製した。このうち、本発明による抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を代表してｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ）を選択して下記の実施例に使用し、便宜上、前記抗体を抗ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２と名づけた。

＜参考例２．異種移植モデルおよび試験試料の用意＞
患者由来腫瘍組織（Ｎｏｎ−ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ：ＮＳＣＬＣ、非小細胞肺癌）が腹腔内移植されたマウス異種移植モデル（ｍｏｕｓｅｘｅｎｏｇｒａｆｔｍｏｄｅｌ）１４種をＯｎｃｏｔｅｓｔ社（ドイツ）から入手した。

前記１４種のマウス異種移植モデルに候補医薬最終形態（Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２）（各モデル毎にｎ＝１０）とビヒクル（各モデル毎にｎ＝１０）を投与し、腫瘍組織の大きさを測定して、前記抗体に対する反応性の有無を測定した。

前記マウス異種移植モデル内の腫瘍の大きさが５００ｍｍ^３以上に成長した時点から、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２（コントロールの場合はＰＢＳバッファーを投与した）を５ｍｇ／ｋｇの量で１週に１回投与し、計６週間実験を行い、腫瘍の大きさが２０００ｍｍ^３以上になった時点で実験を中断した。

腫瘍の大きさ（ｍｍ^３）は長径×短径×短径×１／２の式を用いて体積で計算し、効能群の判別はＡＮＯＶＡ分析を通じてｐ値が０．０５以下の仮説のみを棄却して行った。即ち、薬を投与した群で、投与しない群に比べて腫瘍の大きさ分布が変わらなかったという仮説をＡＮＯＶＡテストし、ｐ値が０．０５以下の群は非効能群、超過する群を効能群と判別した。

Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理に対する各マウス異種移植モデルの反応性（効能）有無について、評価結果を、下記表９に示した：

実験済みのマウスの腫瘍組織を摘出して、一部の腫瘍組織はＦＦＰＥ（ＦｏｒｍａｌｉｎＦｉｘｅｄＰａｒａｆｆｉｎＥｍｂｅｄｄｅｄ、ホルマリン固定パラフィン包埋）ブロックを製作し、残りの腫瘍組織からＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．７４１０４）を用いて製造会社のプロトコルによってｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。

製作されたＦＦＰＥブロックは、ＶｅｎｔａｎａＭＥＴＩＨＣ（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（Ｒｏｃｈｅ；ＵＳ２０１３０８９５４１Ａ１参照）を用いて製作会社で提供する標準プロトコルによって表面発現ｃ−ＭＥＴを測定するのに使用した。抽出されたｔｏｔａｌＲＮＡは、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によるｃ−ＭＥＴｍＲＮＡ発現実験に使用した（ＭＥＴｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ：ＣＣＴＴＧＡＡＣＡＧＡＡＴＣＡＣＴＧ（配列番号２７２）；ＭＥＴａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ：ＣＣＡＴＧＴＴＴＣＡＴＧＴＡＴＧＧＴＡ（配列番号２７３））。

ＶｅｎｔａｎａＭＥＴＩＨＣ方法を用いて得られた結果を図１に示した。この方法によれば、ＩＨＣスコア（ｓｃｏｒｅ）が２〜３であれば効能群と判断できる。しかし、図１で確認されるように、非効能群に分類されたＬＸＦＡ２９７、ＬＸＦＡ９８３、およびＬＸＦＡ１０４１もＩＨＣスコアが２〜３であって、ＩＨＣ方法では効能群と非効能群の選別正確度が高くないことが分かる（正確度：約５０％）。なお、「正確度」は、後述の「Ａｃｃｕｒａｃｙ」と同様に算出し、１００倍して１００％に換算した値である。

一方、図１において効能群と判断された６つのモデル（ＬＸＦＡ２９７、ＬＸＦＡ９８３、ＬＸＦＡ１０４１、ＬＸＦＡ６２３、ＬＸＦＡ５２６、およびＬＸＦＡ１６４７）のＲＴ−ＰＣＲの結果を図２に示した。図２において、Ｙ軸はＲＴ−ＰＣＲで測定されたＣｔ値であり、Ｘ軸はＩＨＣスコアであり、◆は非効能群、●は効能群を示す。図２で確認されるように、ＲＴ−ＰＣＲの結果によれば、非効能群は全てＣｔ値が０以上である反面、効能群は全てＣｔ値が０より低かった。したがって、ＲＴ−ＰＣＲの結果によると、従来のＩＨＣ方法による場合と比較して、効能群と非効能群とをより正確に区別できる（正確度：約７１％〜約９３％）。ＲＴ−ＰＣＲの結果を主として用い、さらにＩＨＣスコアを補充的に適用すれば、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体が有効であるか否かについて、より正確な区別が可能である（例えば、ＲＴ−ＰＣＲのＣｔ値が０より低くＩＨＣスコアが２〜３である場合、効能群として選別）。

＜実施例１：バイオマーカーの選別＞
参考例１で製作された抗ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２の効能性試験のための異種移植片試料（ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓａｍｐｌｅ；前臨床試料１４種；参考例２）を用いて、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する効能群と非効能群それぞれにおいて、遺伝子発現水準を測定した。得られた遺伝子発現水準の結果を用いて各グループ間の遺伝子発現差（△ｌｏｇ２（ｅｘｐ））を測定し、その差が大きい遺伝子を選別した。

前記遺伝子発現差は、Ａｆｆｙｍａｔｒｉｘｈｕｍａｎｕ１３３ｐｌｕｓ２．０（アフィメトリクス社）を用いてマイクロアレイ実験を行い、製造会社が提供するｍｉｃｒｏａｒｒａｙａｎａｌｙｓｉｓｃｏｎｓｏｌｅを用いて、各プローブ毎にｌｏｇ２値（ｐｒｏｂｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、プローブ強度）を測定して、これを基準にした。この時に使用されたプローブは表１０に示した通りである：

効能群と非効能群との発現水準の差を基準に、その差が大きいものから順に羅列して選別した。

前記得られた結果を下記表１１に示した（下記表において、ΔｅｘｐＦｏｌｄが大きいほど、効能群と非効能群の発現差が大きいことを意味する）：

上記表１１から確認されるように、効能群と非効能群の発現差は、ＴＨＳＤ７Ａ、ＭＥＴ、ＲＡＢ３１、ＦＡＭ１２６Ａ、ＰＨＣ１、ＣＨＭＬ、ＳＴ８ＳＩＡ４、およびＣＡＶ１の順に大きいことが示された。

前記８個の遺伝子を抗ｃ−Ｍｅｔ抗体効能検出のためのバイオマーカーとして選択した。

＜実施例２：基準マーカーの選別＞
総計１２０個の肺腺がん（Ｌｕｎｇｃａｎｃｅｒａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）のマイクロアレイデータ（ＧＥＯ：ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｍｎｉｂｕｓ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）を用いて、細胞間で遺伝子発現水準の変動が少ない遺伝子を選定した。

ＧＥＯから得られたＮＳＣＬＣ腫瘍由来ｔｏｔａｌＲＮＡについて、ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘＵ１３３ｐｌｕｓ２．０（アフィメトリクス社）を用いてプローブ毎のｌｏｇ２（ｉｎｔ）値を求め、上記の１２０個の試料間でＣＶ（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎ、変動係数）が最も少ない遺伝子をリスト化した。ｌｏｇ２（ｉｎｔ）値が標的（ｔａｒｇｅｔ）遺伝子（実施例１で選択された８種のバイオマーカー）と類似した分布である遺伝子を選定した。この時使用されたプライマーを下記表１２に整理した：

前記得られた結果を図３および４に示した。図３に示されているように遺伝子発現変動が少ない１０個の遺伝子、即ち、ＥＥＦ１Ａ１、ＲＰＬ２３Ａ、ＴＰＴ１、ＨＵＷＥ１、ＭＡＴＲ３、ＳＲＳＦ３、ＨＮＲＮＰＣ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＷＤＲ９０、およびＴＵＴ１を基準マーカーとして選別した。

前記１０種の選別された基準マーカーの変動および分類性能の差を測定し、従来の内部コントロール遺伝子（ＯｎｃｙｔｐｅＤＸ^ＴＭ；図４参照）と比較した。

前記１０種の選別された基準マーカーについて使用されたプローブとプライマーを下記表１３および表１４にそれぞれ整理した：

参考例２の異種移植モデル１４個から抽出された、１４個のＮＳＣＬＣｍＲＮＡサンプルを用いて、前記方法で、前記１０種の選別された基準マーカーおよび従来の内部コントロール遺伝子に対してＣｔ値の変動を測定した。

得られた結果を図５（従来のコントロール遺伝子）および図６（選別された基準マーカー）に示した。図５および図６に示されているように、本発明で選別された１０種の基準マーカーの平均ＣＶ値は１１．７７０程度で、従来のコントロール遺伝子（ＯｎｃｙｔｐｅＤＸ^ＴＭ）（平均ＣＶ＝１５．４０３３５）に比べて顕著に低いことを確認することができた。前記１０種の基準マーカー中でもＲＰＬ２３Ａ、ＴＰＴ１、ＭＡＴＲ３、ＳＲＳＦ３、およびＨＮＲＮＰＣの５種の遺伝子は発現量変動幅が特に小さかった（５種の遺伝子平均ＣＶ＝８．３９）。

＜実施例３：選別されたバイオマーカーおよび基準マーカーを用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能群選別＞
前記選別されたバイオマーカーおよび基準マーカーを参考例２で用意されたマウス異種移植モデルに適用してこれらの効能群／非効能群の選別正確度を試験した。

すなわち、マウス異種移植モデルの腫瘍組織から抽出されたｔｏｔａｌＲＮＡに対して下記表１５のプローブおよび表１６のプライマーを用いて表１７の条件下でＰＣＲを行い、前記８種のバイオマーカーおよび５種の基準マーカー（ＴＰＴ１、ＥＥＦ１Ｍ、ＴＵＴ１、ＭＡＴＲ３およびＳＭＡＲＣＡ４）のＣｔ値を得た。

この時、効能群と非効能群の判断は下記表１８に従った：

表１８において、
ＣＡＶ１、ＦＡＭ１２６Ａ、ＭＥＴ、ＲＡＢ３１、ＲＡＢ３１、ＳＴ８ＳＩＡ４、およびＴＨＳＤ７Ａについての標準基準値：［Ｍｉｎ（ｅｆｆｉｃａｃｙｖａｌｕｅ（ΔＣｔ））＋Ｍａｘ（ｎｏｎ−ｅｆｆｉｃａｃｙｖａｌｕｅ（ΔＣｔ））］／２；
ＣＭＨＬおよびＰＨＣ１についての標準基準値：［Ｍｉｎ（ｎｏｎ−ｅｆｆｉｃａｃｙｖａｌｕｅ（ΔＣｔ））＋Ｍａｘ（ｅｆｆｉｃａｃｙｖａｌｕｅ（ΔＣｔ））］／２；
ΔＣｔ：｛５種の基準マーカー（ＴＰＴ１、ＥＥＦ１Ｍ、ＴＵＴ１、ＭＡＴＲ３およびＳＭＡＲＣＡ４）の平均Ｃｔ｝−｛該当バイオマーカーのＣｔ｝；
Ｍｉｎ（ｅｆｆｉｃａｃｙｖａｌｕｅ（ΔＣｔ））：効能群のΔＣｔ最小値；
Ｍａｘ（ｎｏｎ−ｅｆｆｉｃａｃｙｖａｌｕｅ（ΔＣｔ））：非効能群のΔＣｔ最大値；
Ｍｉｎ（ｎｏｎ−ｅｆｆｉｃａｃｙｖａｌｕｅ（ΔＣｔ））：非効能群のΔＣｔ最小値；
Ｍａｘ（ｅｆｆｉｃａｃｙｖａｌｕｅ（ΔＣｔ））：効能群のΔＣｔ最大値）。

各バイオマーカーについて計算されたΔＣｔを前記表１８の値と比較し、ＣＡＶ１、ＦＡＭ１２６Ａ、ＭＥＴ、ＲＡＢ３１、ＲＡＢ３１、ＳＴ８ＳＩＡ４、およびＴＨＳＤ７Ａの場合、各バイオマーカーについてのΔＣｔ値が表１８の値より高いときに効能群と判定した。ＣＭＨＬおよびＰＨＣ１の場合、各バイオマーカーについてのΔＣｔ値が表１８の値より低い場合に効能群と判定した。

前記のような方法で、参考例２で用意された１４種のマウス異種移植モデルに対して効能群と非効能群を判定した正確度と“ΔＦｏｌｄ”値を下記表１９に示した。

表１９において、「Ａｃｃｕｒａｃｙ」および「ΔＦｏｌｄ」はそれぞれ以下の意味である。

Ａｃｃｕｒａｃｙ：各バイオマーカーを使用して得られる抗体効能予測の正確度、１（１００％に該当）に近いほど正確度が高い。下式によって得られる値である。

ΔＦｏｌｄ：効能群と非効能群と間のΔＣｔ（コントロール遺伝子（基準マーカー）Ｃｔ（基準マーカーの数が２以上の場合は、「基準マーカーの平均Ｃｔ値」を意味する）−標的遺伝子（バイオマーカー）Ｃｔ）の差である。非効能群と非反応群とを区別することができるｍＲＮＡ発現値範囲を示す。

表１９に示すように、本発明で選別されたバイオマーカーと基準マーカーを用いることで、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能群と非効能群を約６０％以上、例えば約８０％以上の正確度で判断可能である。

Claims

ＴＨＳＤ７Ａであるバイオマーカーの検出用分子または製剤を含む、非小細胞肺癌に対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物。
ＭＥＴ、ＲＡＢ３１、ＦＡＭ１２６Ａ、ＰＨＣ１、ＣＨＭＬ、ＳＴ８ＳＩＡ４およびＣＡＶ１からなる群より選択された１種以上であるバイオマーカーの検出用分子または製剤をさらに含む、請求項１に記載の非小細胞肺癌に対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物。
ＭＥＴであるバイオマーカーの検出用分子または製剤をさらに含む、請求項１に記載の非小細胞肺癌に対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物。
ＲＡＢ３１であるバイオマーカーの検出用分子または製剤をさらに含む、請求項１に記載の非小細胞肺癌に対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物。
ＦＡＭ１２６Ａであるバイオマーカーの検出用分子または製剤をさらに含む、請求項１に記載の非小細胞肺癌に対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物。
ＭＥＴであるバイオマーカーおよびＲＡＢ３１であるバイオマーカーの検出用分子または製剤をさらに含む、請求項１に記載の非小細胞肺癌に対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物。
ＭＥＴであるバイオマーカー、ＲＡＢ３１であるバイオマーカーおよびＦＡＭ１２６Ａであるバイオマーカーの検出用分子または製剤をさらに含む、請求項１に記載の非小細胞肺癌に対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物。
ＭＥＴであるバイオマーカー、ＲＡＢ３１であるバイオマーカー、ＦＡＭ１２６Ａであるバイオマーカー、ＰＨＣ１であるバイオマーカー、ＣＨＭＬであるバイオマーカー、ＳＴ８ＳＩＡ４であるバイオマーカーおよびＣＡＶ１であるバイオマーカーの検出用分子または製剤をさらに含む、請求項１に記載の非小細胞肺癌に対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物。
ＥＥＦ１Ａ１、ＲＰＬ２３Ａ、ＴＰＴ１、ＨＵＷＥ１、ＭＡＴＲ３、ＳＲＳＦ３、ＨＮＲＮＰＣ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＷＤＲ９０およびＴＵＴ１からなる群より選択された１種以上の基準マーカーの検出用分子または製剤を追加的に含む、請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の非小細胞肺癌に対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物。
前記検出用分子または製剤は、前記バイオマーカーもしくは基準マーカーとハイブリダイズ可能なプライマー、プローブもしくはアプタマー、もしくは前記バイオマーカーもしくは基準マーカーにコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体もしくはアプタマー、またはこれらの組み合わせである、請求項９に記載の非小細胞肺癌に対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物。
前記検出用分子または製剤は、配列番号１０９〜２６９の中から選択された１種以上のプローブ、配列番号２７０〜３０５の中から選択された１種以上のプライマー、またはこれらの組み合わせである、請求項１〜１０のうちのいずれか１項に記載の非小細胞肺癌に対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物。
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７１のアミノ酸配列のうちの配列番号７３（ＥＥＰＳＱ）を含む連続する５〜１９個のアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合する、請求項１〜１１のうちのいずれか１項に記載の非小細胞肺癌に対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物。
前記ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合フラグメントは、下記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つを含む、請求項１２に記載の非小細胞肺癌に対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体もしくはその抗原結合フラグメントの効能予測または適用対象選別のための組成物；
（ｉ）下記ＣＤＲ−Ｈ１〜ＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択された一つ以上の重鎖相補性決定領域、または前記一つ以上の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変部位；
配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１
配列番号５のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列内の３番目から１０番目までのアミノ酸を含む連続する８〜１９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２
配列番号６のアミノ酸配列、配列番号８５のアミノ酸配列、または配列番号８５のアミノ酸配列内の１番目から６番目までのアミノ酸を含む連続する６〜１３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３
（ｉｉ）下記ＣＤＲ−Ｌ１〜ＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択された一つ以上の軽鎖相補性決定領域、または前記一つ以上の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変部位；
配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１
配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２
配列番号９のアミノ酸配列、配列番号１５のアミノ酸配列、配列番号８６のアミノ酸配列、または配列番号８９のアミノ酸配列内の１番目から９番目までのアミノ酸を含む９〜１７個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３
（ｉｉｉ）前記重鎖相補性決定領域および前記軽鎖相補性決定領域の組み合わせ
（ｉｖ）前記重鎖可変部位および前記軽鎖可変部位の組み合わせ。