JP6584322B2 - アルツハイマー病及び前頭側頭葉変性症の診断方法、診断薬、治療薬、及びこれら薬剤のスクリーニング方法 - Google Patents

アルツハイマー病及び前頭側頭葉変性症の診断方法、診断薬、治療薬、及びこれら薬剤のスクリーニング方法 Download PDF

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Description

本発明は、アルツハイマー病の診断方法、診断薬及び治療薬に関する。さらに、これら薬剤の候補化合物をスクリーニングする方法に関する。また、本発明は、前頭側頭葉変性症の診断薬及び治療薬に関する。
アルツハイマー病（アルツハイマー型認知症、ＡＤ）は、初老期〜老年期に生じる進行性の神経変性疾患である。その主な症状は、記憶障害、高次脳機能障害（失語、失行、失認、構成失行）、人格の変化等である。そして、このような症状故、患者本人の生活の質の低下のみならず、家族等の周囲の生活にも多大な影響を与えている。さらに、その患者数は人口の高齢化に伴い増加の一途を辿っており、アルツハイマー病は世界的に現代社会の抱える深刻な問題となっている。そのため、アルツハイマー病については精力的に研究が進められているが、発症機構の全貌は未だ明らかになっておらず、その根治薬は未だ開発されていないのが現状である。
一方、アルツハイマー病の症状の進行を遅らせることは可能となりつつある。特にコリンエステラーゼ阻害剤が実際に臨床の場で使用されそれなりの成果をあげ、症状の進行をある程度抑えることも可能になっている。そのため、アルツハイマー病の治療においては、より早期に該疾患を検出することが求められており、脳波診断、血液・髄液を対象とした生化学的検査や、ＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ等の画像診断等の開発が進められている。特にＰＥＴにより、アルツハイマー病の特徴であり、その病因として有力視されている脳における老人班（アミロイド班）の沈着を検出することが可能になりつつある。しかしながら、現状の診断技術により、アルツハイマー病が発症する前段階を捉えることは依然として難しく、有効な早期診断方法も未だ確立されていないのが現状である。
アルツハイマー病は、老人班の沈着の他、神経原線維変化（神経原線維のもつれ、対らせん状繊維（ＰＨＦ））の沈着によっても神経病理学的に特徴づけられる。そして、これら構造体の沈着が、前述の諸症状に関与する神経機能障害や神経細胞死（神経細胞の脱落）を引き起こすと考えられている。また、老人班は、アミロイドβ（Ａβ）と称される４０アミノ酸程度のポリペプチドが凝集し、神経細胞の外部に高密度に沈着して生じる構造体であることが明らかになっている。さらに、神経原線維変化についても、微小管結合タンパク質であるタウ（ｔａｕ）がリン酸化されることにより、細胞骨格を形成する微小管から解離し、ｔａｕ同士が重合することによって生じる構造体であることが明らかになっている。また、未だ結論は出されていないものの、アルツハイマーの病因及び発症機構については、アミロイドβの凝集（アミロイド病変）が生じ、該凝集によってｔａｕのリン酸化及び重合（ｔａｕ病変）が促進され、ひいては神経細胞死等に至るという機構（アミロイドカスケード仮説）が有力視されている。
さらに、アルツハイマー病の病変においては、様々なリン酸化シグナル伝達が関与していることが示唆されている。例えば、前述の通り、神経原線維変化の沈着はｔａｕのリン酸化に起因するものである。そして、このｔａｕのリン酸化は、ＧＳＫ３β、ＪＮＫ、ＰＫＡ、Ｃｄｋ５及びカゼインキナーゼIIといった様々なセリン／スレオニンキナーゼによって調節されていることが明らかになっている（非特許文献１〜７）。また、かかるリン酸化によりｔａｕが解離した微小管は不安定となり、ひいてはＡＤ患者の脳において観察される神経突起の減少が生じていることが想定されている（非特許文献８及び９）。
また、リン酸化酵素であるＰＫＣは記憶の形成に関与していることが示唆されている（非特許文献１０及び１１）。さらに、ＰＫＣ及びＣａＭＫIIの活性化は、記憶の制御に関与するＢＤＮＦ及びＡｒｃの転写を促進し、アルツハイマー病に対する保護作用を奏しているとも考えられている（非特許文献１２及び１３）。また、かかる知見に基づき、ＰＫＣ活性化剤であるブリスタチン等に関し、アルツハイマー病治療への適用が試みられている。しかしながら、その一方で、ＰＫＣの過剰な活性化は作業記憶に害を及ぼすことも報告されている（非特許文献１４）。
さらに、ＰＫＣによるＭＡＲＣＫＳのリン酸化は、該タンパク質の細胞膜（ＰＩＰ２及びアクチン）からの解離を生じさせ、その結果として、アミロイドβの産生が誘導されることも示唆されている（非特許文献１５）。また、リン酸化されたＭＡＲＣＫＳが、老人班内のジストロフィー神経突起及びミクログリアにおいて確認されている。しかしながら、その一方で、アルツハイマー病患者の脳におけるＭＡＲＣＫＳのリン酸化レベルは健常人のそれに比べ低いことも明らかになっている（非特許文献１６）。
このように、アルツハイマー病の病変においては、リン酸化シグナル伝達が関与していることが示唆されており、この関与を詳細に解明することができれば、この疾患の早期診断方法及び治療方法の確立に大きく貢献することが期待される。
しかしながら、アルツハイマー病におけるリン酸化シグナル伝達、特に、多種多様なリン酸化シグナル伝達において、どのようなタンパク質のリン酸化が、アルツハイマー病の発症の前段階において中心的な役割を担っているのか、何ら解明されていなかった。
また、アルツハイマー病同様に、進行性の神経変性障害を示す疾患として、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）が知られている。前頭側頭葉変性症は、アルツハイマー病に次いで２番目若しくは３番目に頻度の高い早期発症型神経変性認知症であり、顕著な挙動及び人格変化の症状を示し、しばしば言語機能障害が付随して起こり、これが徐々に認知障害及び認知症へと発展していくこととなる。また、アルツハイマー病同様に研究が進められているが、発症機構の全貌は未だ明らかになっていない。
例えば、遺伝性前頭側頭葉変性症の原因の一つとして、ＰＧＲＮ遺伝子における変異が知られている。そして、ＰＧＲＮタンパク質は、ＴＮＦ受容体の結合においてＴＮＦに対して拮抗的作用を示すことが報告されており、当該拮抗が前頭側頭葉変性症の発症に関与することが示唆されている（非特許文献１７）。しかしながら、その一方で、相反する結果も報告されており、前頭側頭葉変性症の発症において、ＴＮＦシグナル伝達経路が関与しているか否かも含め（非特許文献１８〜２１）、その分子機構について解明されていないのが現状である。
また、前頭側頭葉変性症に関しては、その分子機構解明のため、ＰＧＲＮ遺伝子のノックアウトマウスがモデル動物として作製されている。そして実際に、前頭側頭葉変性症にて示される諸所見（過度の炎症反応、細胞の老化、シナプスの機能障害、ユビキチン化の促進、カスパーゼの活性化の増強、ＴＤＰ−４３の可溶性の減少等）が、これらノックアウトマウスにて確認されている（非特許文献２２〜２８）。しかしながら、アルツハイマー病等の他の神経変性疾患においてもしばし指摘されているように（非特許文献２９）、前記モデル動物においては、ＰＧＲＮタンパク質の量を人為的に減少させることにより、実際にはＰＧＲＮの変異ｍＲＮＡ等の発現によって引き起こされる諸症状を模倣しているに過ぎないとして、モデル動物としての有効性が疑問視されている。
以上の通り、前頭側頭葉変性症においては、有効なモデル動物が開発されていないこともあり、前記アルツハイマー病同様に、その発症機構は解明されていない。そのため、当該疾患の診断方法及び治療方法の開発において、有用な標的分子が見出されていないのが現状である。
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本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、アルツハイマー病の発症の前段階において中心的な役割を担っているリン酸化タンパク質、キナーゼタンパク質、及びそれらタンパク質から構成されるネットワークを同定し、ひいてはアルツハイマー病の診断及び治療に有用な標的分子を提供することを目的とする。
また、本発明は、前頭側頭葉変性症の発症の前段階において中心的な役割を担っているシグナル伝達経路を同定し、ひいては前頭側頭葉変性症の診断及び治療に有用な標的分子を提供することも目的とする。
本発明者は、アルツハイマー病の診断及び治療に有用な標的分子を提供すべく、先ず、質量分析法による解析（２Ｄ ＬＣ ＭＳ／ＭＳ解析）を用いて、４タイプのアルツハイマー病（ＡＤ）モデルマウス及びｔａｕモデルマウスの発症前段階にある脳、並びにＡＤ患者の死後の脳を対象とし、１１００以上のリン酸化タンパク質及び３００００以上のリン酸化ポリペプチドから、野生型マウス及び健常人等と各々比較して発現量が変化しているタンパク質を探索した。
その結果、複数のＡＤモデルマウスの脳においてアミロイドβの凝集が生じ始める直前又は直後に、発現が変化しているリン酸化タンパク質を同定することができた。さらに、それらリン酸化タンパク質の殆どは、ＡＤ患者においても又はｔａｕモデルマウスにおいても共通してリン酸化が変化していることが明らかとなった。総じて、アルツハイマー病を罹患している脳においてリン酸化レベルが変化しており、その病変において中心的な役割を担っていることが想定されるタンパク質（ＡＤコアタンパク質）として、ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、ＳＲＲＭ２、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ、ＨＳ９０Ａ、ＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＧＰＲＩＮ１、ＡＣＯＮ、ＡＴＰＡ及びＡＴＰＢを選抜することができた。
さらに、これらＡＤコアタンパク質を、実験的に実証されているタンパク質間相互作用（ＰＰＩ）データベースに組み込んで解析し、アルツハイマー病の病変において中核となるＡＤシグナルネットワーク（ＡＤコアネットワーク）を同定した。
その結果、驚くべきことに、ＡＤコアタンパク質の殆どは互いに直接相互作用しており、さらに、それらの機能は、スパイン形成、小胞再利用及びエネルギー代謝といったシナプスにおいて重要な機能に集中していることを見出した。特に、神経細胞骨格に関与するＡＤコアタンパク質のリン酸化の亢進は、まだアミロイドβの凝集が生じる前の、無症候段階から始っていることを明らかにした。さらに、ＡＤコアタンパク質のリン酸化の変化は、アルツハイマー病の発症前段階において、初期にピークがあるもの、中期にピークがあるもの、後期にピークがあるもの、これら３パターンにカテゴリー化することができ、このように各ＡＤコアタンパク質において時期特異的なリン酸化の変化が生じていることも明らかになった。
さらに、タンパク質間相互作用データベースを利用した解析から、このような時期特異的なリン酸化の変化を制御するキナーゼとして、ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＣＳＫ及びＬｙｎを同定することもできた。
また、アルツハイマー病の病変において、アミロイドβの凝集（アミロイド病変）から、該凝集によって生じるｔａｕのリン酸化及び重合（ｔａｕ病変）への移行が、重要な位置づけにあると想定されている。この点に関し、前記モデルマウスを対象とした質量分析の結果を通し、アミロイド病変からｔａｕ病変への移行を促進するキナーゼとして、ｂ−ＲＡＦを同定することもできた。
さらに、ＭＡＲＣＫＳの発現を抑制することによって、若しくはＰＫＣ又はＣａＭＫのキナーゼ活性を抑制することによって、アルツハイマー病における病変（スパインの形成異常）を回復できることも実証し、本発明を完成するに至った。
また、本発明者は、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）の診断及び治療に有用な標的分子を提供すべく、上述の通り、既存のＦＴＬＤモデル動物においては、該疾患の原因となる、変異ｍＲＮＡ等の発現までは再現されていないという現状を鑑み、先ず、真にＦＴＬＤのモデルといえる動物の作製を試みた。すなわち、ＦＴＬＤ患者において確認されているストップ変異を、マウスにおいて、そのＰＧＲＮ（プログラニュリン）遺伝子に導入することにより、ＦＴＬＤモデルマウスの作製を試みた。その結果、得られたＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいて、ＰＧＲＮの変異ｍＲＮＡ及びそれがコードする変異タンパク質の発現が認められたのみならず、当該マウスにおいては、当該変異の導入によって、病理学上所見においても、また臨床症状においても、ＦＴＬＤ患者のそれらを再現できていることも見出され、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスはＦＴＬＤのモデル動物として極めて有用であることが明らかになった。
次に、このＰＧＲＮ−ＫＩマウスを用いて、上記アルツハイマー病についての解析同様に、ＦＴＬＤについても該疾患におけるリン酸化シグナル伝達を網羅的に解析（フォスフォプロテオーム解析）し、その病変において中心的な役割を担うリン酸化シグナル伝達の同定を試みた。
その結果、驚くべきことに、従前ＦＴＬＤの発症機構に関与していることが示唆されていたＴＮＦシグナル伝達経路自体においては、リン酸化が変化しているタンパク質を見出すことはできなかった。一方、ＭＡＰＫシグナル伝達経路等のＴＮＦ関連シグナル伝達経路においては、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいて、かかるシグナル伝達経路に属するタンパク質のリン酸化が、顕著に変化していることが明らかになった。特に、ＭＡＰＫシグナル伝達経路は、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいて、その発症前段階から明らかに活性化しており、病状が進行している期間においても、該当シグナル伝達経路に属する複数のタンパク質は常に高リン酸化状態にあった。
そこで次に、ＭＡＰＫシグナル伝達経路に属し、前記解析にてＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいて高リン酸化状態にあることが明らかになった、ｂ−ＲＡＦ及びそのリン酸化基質であるｔａｕ等を標的として、その治療効果について解析を行った。すなわち先ず、ＭＡＰＫシグナル伝達経路における異常な活性化を、ｂ−ｒａｆ特異的な阻害剤等を用いて抑制することにより、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスの表現型が回復されるかどうかを解析した。
その結果、ｂ−ｒａｆ阻害剤の投与により、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいて認められていた行動異常が改善されることが明らかになった。さらには、ｂ−ｒａｆ阻害剤の投与、又は、ｔａｕをノックダウンすることによって、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいて減少していたスパイン数が、回復することも明らかとなり、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、前述のＡＤコアタンパク質及びそれらをリン酸化するキナーゼを対象とする、アルツハイマー病の診断方法、診断薬、診断薬候補化合物のスクリーニング方法、治療薬及び治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関するものであり、より詳しくは、以下を提供するものである。
＜１＞ アルツハイマー病を診断する方法であって、
（ｉ）被検体において、ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、ＳＲＲＭ２、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ、ＨＳ９０Ａ、ＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＧＰＲＩＮ１、ＡＣＯＮ、ＡＴＰＡ及びＡＴＰＢからなる群から選択される少なくとも１の基質タンパク質のリン酸化を検出する工程、
（ii）該リン酸化と、正常検体における基質タンパク質のリン酸化とを比較する工程、及び、
（iii）該比較の結果、前記被検体における基質タンパク質のリン酸化が、前記正常検体における基質タンパク質のリン酸化よりも高い場合、前記被検体はアルツハイマー病を罹患している、またはアルツハイマー病を発症する危険性を有していると判定する工程
を含む、方法。
＜２＞ アルツハイマー病を診断する方法であって、
（ｉ）被検体において、キナーゼタンパク質の活性又は発現を検出する工程、
（ii）該活性又は発現と、正常検体におけるキナーゼタンパク質の活性又は発現とを比較する工程、及び、
（iii）該比較の結果、前記被検体におけるキナーゼタンパク質の活性又は発現が、前記正常検体におけるキナーゼタンパク質の活性又は発現よりも高い場合、前記被検体はアルツハイマー病を罹患している、またはアルツハイマー病を発症する危険性を有していると判定する工程
を含み、かつ前記キナーゼタンパク質が、ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＣＳＫ、Ｌｙｎ及びｂ−ＲＡＦからなる群から選択される少なくとも１のキナーゼタンパク質である、方法。
＜３＞ ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、ＳＲＲＭ２、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ、ＨＳ９０Ａ、ＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＧＰＲＩＮ１、ＡＣＯＮ、ＡＴＰＡ及びＡＴＰＢからなる群から選択される少なくとも１の基質タンパク質のリン酸化部位に対して結合活性を有する化合物を含有する、アルツハイマー病を診断するための薬剤。
＜４＞ ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＣＳＫ、Ｌｙｎ及びｂ−ＲＡＦからなる群から選択される少なくとも１のキナーゼタンパク質に対して結合活性を有する化合物を含有する、アルツハイマー病を診断するための薬剤。
＜５＞ アルツハイマー病を診断するための候補化合物のスクリーニング方法であって、
ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、ＳＲＲＭ２、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ、ＨＳ９０Ａ、ＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＧＰＲＩＮ１、ＡＣＯＮ、ＡＴＰＡ及びＡＴＰＢからなる群から選択される少なくとも１の基質タンパク質のリン酸化部位と、被験化合物とを接触させ、前記リン酸化部位と結合する化合物を選択する工程を含む方法。
＜６＞ アルツハイマー病を診断するための候補化合物のスクリーニング方法であって、
ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＣＳＫ、Ｌｙｎ及びｂ−ＲＡＦからなる群から選択される少なくとも１のキナーゼタンパク質と、被験化合物とを接触させ、前記キナーゼタンパク質と結合する化合物を選択する工程を含む方法。
＜７＞ ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、ＳＲＲＭ２、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ、ＨＳ９０Ａ、ＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＧＰＲＩＮ１、ＡＣＯＮ、ＡＴＰＡ及びＡＴＰＢからなる群から選択される少なくとも１の基質タンパク質のリン酸化を抑制する化合物を含有する、アルツハイマー病を治療するための薬剤。
＜８＞ ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＣＳＫ、Ｌｙｎ及びｂ−ＲＡＦからなる群から選択される少なくとも１のキナーゼタンパク質の活性又は発現を抑制する化合物を含有する、アルツハイマー病を治療するための薬剤。
＜９＞ 前記化合物が、ＰＬＸ−４７２０、ソラフェニブ、ＧＤＣ−０８７９、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ソラフェニブトシレート及びＬＧＸ８１８からなる群から選択される少なくとも１の、ｂ−ＲＡＦの活性又は発現を抑制する化合物である、＜８＞に記載の薬剤。
＜１０＞ 前記化合物がベムラフェニブである、＜９＞に記載の薬剤。
＜１１＞ ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、ＳＲＲＭ２、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ、ＨＳ９０Ａ、ＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＧＰＲＩＮ１、ＡＣＯＮ、ＡＴＰＡ及びＡＴＰＢからなる群から選択される少なくとも１の基質タンパク質と、ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＣＳＫ、Ｌｙｎ及びｂ−ＲＡＦからなる群から選択される少なくとも１のキナーゼタンパク質との結合を抑制する化合物を含有する、アルツハイマー病を治療するための薬剤。
＜１２＞ アルツハイマー病を治療するための候補化合物のスクリーニング方法であって、
（ｉ）ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、ＳＲＲＭ２、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ、ＨＳ９０Ａ、ＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＧＰＲＩＮ１、ＡＣＯＮ、ＡＴＰＡ及びＡＴＰＢからなる群から選択される少なくとも１の基質タンパク質のリン酸化を検出しうる系に、被験化合物を適用させる工程、並びに、
（ii）該基質タンパク質のリン酸化を抑制する化合物を選択する工程
を含む、方法。
＜１３＞ アルツハイマー病を治療するための候補化合物のスクリーニング方法であって、
（ｉ）ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＣＳＫ、Ｌｙｎ及びｂ−ＲＡＦからなる群から選択される少なくとも１のキナーゼタンパク質の活性又は発現を検出しうる系に、被験化合物を適用させる工程、並びに、
（ii）該タンパク質の活性又は発現を抑制する化合物を選択する工程
を含む、方法。
＜１４＞ 下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、アルツハイマー病を治療するための候補化合物のスクリーニング方法
（ａ）被験化合物の存在下で、ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＣＳＫ、Ｌｙｎ及びｂ−ＲＡＦからなる群から選択される少なくとも１のキナーゼタンパク質と、ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、ＳＲＲＭ２、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ、ＨＳ９０Ａ、ＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＧＰＲＩＮ１、ＡＣＯＮ、ＡＴＰＡ及びＡＴＰＢからなる群から選択される少なくとも１の基質タンパク質とを接触させる工程、
（ｂ）前記キナーゼタンパク質と前記基質タンパク質との結合を検出する工程、
（ｃ）前記結合を抑制する化合物を選択する工程。
また、本発明は、上述のｂ−ＲＡＦを標的とする、前頭側頭葉変性症の治療薬及び診断薬に関するものであり、より詳しくは、以下を提供するものである。
＜１５＞ ｂ−ＲＡＦの活性又は発現を抑制する化合物を含有する、前頭側頭葉変性症を治療するための薬剤。
＜１６＞ 前記化合物が、ＰＬＸ−４７２０、ソラフェニブ、ＧＤＣ−０８７９、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ソラフェニブトシレート及びＬＧＸ８１８からなる群から選択される少なくとも１の化合物である、＜１５＞に記載の薬剤。
＜１７＞ 前記化合物がベムラフェニブである、＜１６＞に記載の薬剤。
＜１８＞ ｂ−ＲＡＦに対して結合活性を有する化合物を含有する、前頭側頭葉変性症を診断するための薬剤。
なお、本発明において、「アルツハイマー病」とは、アルツハイマー型認知症、ＡＤとも称される神経変性疾患であり、遺伝子の変異に起因する「家族性アルツハイマー病」及び「遺伝性アルツハイマー病」や、生活習慣やストレスといった環境因子による「孤発性アルツハイマー病」も含まれる。「アルツハイマー病の発症」とは、臨床診断において判断される、記憶障害、高次脳機能障害（失語、失行、失認、構成失行）、人格の変化といった症状の発現、及び、画像診断によって判断される脳の萎縮の出現を意味するものである。「アルツハイマー病の罹患」とは、前記症状は発現していないものの、アルツハイマー病特有の病理変化（例えば、アミロイドβの凝集）が生じている状態も含む意味である。
また、本発明において、「前頭側頭葉変性症」とは、ＦＴＬＤとも称される、前頭葉・側頭葉に早期には萎縮を呈し、晩期には脳全体の萎縮に至る、非アルツハイマー病型の神経変性疾患のことである。すなわち、前頭側頭葉変性症には、臨床的特徴上分類される３種の疾患、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性非流暢性失語（ＰＮＦＡ）及び意味性認知症（ＳＤ）が含まれ、また病理学上においては、細胞内に異常タンパク質として蓄積されるタンパク質の種類に応じ、ＦＴＬＤ−Ｔａｕ、ＦＴＬＤ−ＴＤＰ、ＦＴＬＤ−ＵＰＳ及びＦＴＬＤ−ＦＵＳに分類される４種の疾患が含まれる。
さらに、「ＦＴＬＤ−Ｔａｕ」は、細胞内に優位に蓄積されるｔａｕタンパク質中の微小管結合領域のリピート数に応じ、「３Ｒ Ｔａｕ」型、「４Ｒ Ｔａｕ」型及び「３／４Ｒ Ｔａｕ」型に分類される。また、「３Ｒ Ｔａｕ」型には、Ｐｉｃｋ球を伴うＦＴＬＤ（ピック病）、ＭＡＰＴ（微小管関連蛋白ｔａｕ）遺伝子変異を伴うＦＴＬＤ（ＦＴＬＤ−１７）等が含まれ、「４Ｒ Ｔａｕ」型には、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、認知症を伴う多系統タウオパチー、嗜銀顆粒性認知症（嗜銀顆粒病）、ＭＡＰＴ遺伝子変異を伴うＦＴＬＤ（ＦＴＬＤ−１７）等が含まれ、「３／４Ｒ Ｔａｕ」型には、神経原線維変化型認知症、ＭＡＰＴ遺伝子変異を伴うＦＴＬＤ（ＦＴＬＤ−１７）等が含まれる。 一方、ｔａｕが陰性であり、ユビキチン陽性封入体を有するＦＴＬＤ群は、「ＦＴＬＤ−Ｕ」と称され、上記ＦＴＬＤ−ＴＤＰ、ＦＴＬＤ−ＵＰＳ及びＦＴＬＤ−ＦＵＳが含まれる。
「ＦＴＬＤ−ＴＤＰ」は、ＦＴＬＤ−Ｕのうち、ＴＤＰ−４３が陽性の疾患を意味し、該疾患には、ＰＧＲＮ（ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎ（プログラニュリン）遺伝子）変異を伴うＦＴＬＤ、孤発性のＦＴＬＤ−ＴＤＰ／ＦＴＬＤ−Ｕ、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＤＰ−４３遺伝子）変異を伴うＦＴＬＤ、ＶＣＰ（ｖａｌｏｓｉｎ含有蛋白遺伝子）変異を伴うＦＴＬＤ、９番染色体に連鎖するＦＴＬＤ等が含まれる。 また、「ＦＴＬＤ−ＦＵＳ」は、ＦＴＬＤ−Ｕのうち、ＴＤＰ−４３が陰性であり、ＦＵＳ（ｆｕｓｅｄ ｉｎ ｓａｒｃｏｍａ）が陽性の疾患を意味し、該疾患には、神経細胞性中間径フィラメント封入体病、非典型的ＦＴＬＤ−Ｕ、好塩基性封入体病、ＦＵＳ変異を伴うＦＴＬＤ等が含まれる。
また、「ＦＴＬＤ−ＵＰＳ」は、ＴＤＰ−４３が陰性であるＦＴＬＤ−Ｕの１種であり、該疾患には、ＣＨＭＰ２Ｂ（荷電多発空胞体蛋白２Ｂ遺伝子）変異を伴うＦＴＬＤ等が含まれる。
「前頭側頭葉変性症の発症」とは、臨床診断において判断される、記憶障害、高次脳機能障害（失語、失行、失認、構成失行）、人格の変化といった症状の発現、及び、画像診断によって判断される脳の萎縮の出現を意味するものである。「前頭側頭葉変性症の罹患」とは、前記症状は発現していないものの、前頭側頭葉変性症特有の病理変化（例えば、前記異常タンパク質の細胞内の蓄積）が生じている状態も含む意味である。
本発明の診断方法の対象となる「被検体」には、ヒトを含む動物の身体のみならず、その身体から単離された体液、組織、細胞等（例えば、脳脊髄液、脳神経組織（特に神経学的生検組織）、血液、血漿、漿液、リンパ液、尿、唾液）も含まれる。
正常検体における「正常」とは、少なくとも本発明の診断方法の対象とする疾患（アルツハイマー病又は前頭側頭葉変性症）を罹患していない状態のことを意味する。また、本発明の診断方法において、被検体の比較の対象として用いられる正常検体は、該被検体と性別が一致しており、年齢が同等であることが好ましい。
また、本発明において、「ＭＡＲＣＫＳ」とは、ミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿００２３４７で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＭＡＲＣＫＳをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿００２３５８に記載のコーディング領域（ＣＤＳ）を含む核酸が挙げられる。
「Ｍａｒｃｋｓｌ１」とは、ＭＡＲＣＫＳ様タンパク質１とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿０７５３８５で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＭＡＲＣＫＳをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿０２３００９に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ＳＲＲＭ２」とは、ＳＲｍ３００／セリン−アルギニン反復マトリックスタンパク質２とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿０５７４１７で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＳＲＲＭ２をコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿０１６３３３に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ＳＰＴＡ２」とは、α−IIスペクトリンとも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１１２３９１０で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１１８２４６１で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００３１１８で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＳＰＴＡ２をコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１１３０４３８に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１１９５５３２に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００３１２７に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ＡＤＤＢ」とは、βアデューシンとも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１１７１９８３で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１１７１９８４で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１６０８で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０５９５１６で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０５９５２２で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＡＤＤＢをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１１８５０５４に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１１８５０５５に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１６１７に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿０１７４８２に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿０１７４８８に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ＮＥＵＭ」とは、ニューロモジュリン、ＧＡＰ４３とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１１２３５３で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００２０３６で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＮＥＵＭをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１１３００６４に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００２０４５に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ＢＡＳＰ１」とは、ＮＡＰ−２２、ＣＡＰ２３とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１２５８５３５で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００６３０８で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＢＡＳＰ１をコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１２７１６０６に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００６３１７に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ＳＹＴ１」とは、シナプトタグミン１とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１１２９２７で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１１２９２７８で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００５６３０で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＳＹＴ１をコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１１３５８０５に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１１３５８０６に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００５６３９に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「Ｇ３Ｐ」とは、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒロゲナーゼとも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１２４３７２８で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００２０３７で特定されるタンパク質が挙げられる。また、Ｇ３Ｐをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１２５６７９９に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００２０４６に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ＨＳ９０Ａ」とは、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ９０α、ＨＳＰ８６とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１０１７９６３で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００５３３９で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＨＳ９０Ａをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１０１７９６３に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００５３４８に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ＣＬＨ」とは、ＣＬＨ１、クラスリン重鎖１とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＮＰ＿００４８５０で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＣＬＨをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＮＭ＿００４８５９に記載のＣＤＳを含む核酸挙げられる。
「ＮＦＨ」とは、ニューロフィラメント重鎖ポリぺプチドとも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０６６５５４で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＮＦＨをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿０２１０７６に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ＮＦＬ」とは、ニューロフィラメント軽鎖ポリぺプチドとも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００６１４９で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＮＦＬをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００６１５８に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ＧＰＲＩＮ１」とは、Ｇタンパク質制御性誘導因子１とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿４４３１３１．２で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＸＰ＿００５２６５８６３で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＧＰＲＩＮ１をコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿０５２８９９に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＸＭ＿００５２６５８０６に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ＡＣＯＮ」とは、アコニテートヒドラターゼとも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１０８９で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＡＣＯＮをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１０９８に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ＡＴＰＡ」とは、ＡＴＰ合成酵素サブユニットα、ＡＴＰ５Ａ１、ＡＴＰ５Ａ、ＡＴＰ５ＡＬ２、ＡＴＰＭとも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１００１９３５で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１００１９３７で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１２４４２６３で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１２４４２６４で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００４０３７で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＡＴＰＡをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１００１９３５に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１００１９３７に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１２５７３３４に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１２５７３３５に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００４０４６に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ＡＴＰＢ」とは、ＡＴＰ合成酵素サブユニットβ、ＡＴＰＭＢ、ＡＴＰＳＢとも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１６７７で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＡＴＰＢをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１６８６に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
また、本発明において、「ＰＫＣ」とは、プロテインキナーゼＣとも称されるタンパク質であり、例えば、ＰＫＣβ、ＰＫＣα、ＰＫＣλ/ι（ラムダ/イオタ）、ＰＫＣσ（デルタ）、ＰＫＣζ（ゼータ）が挙げられる。
「ＰＫＣβ」の典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００２７２９で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿９９７７００で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＰＫＣβをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００２７３８に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿２１２５３５に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ＰＫＣα」の典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００２７２８で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＰＫＣαをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００２７３７に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ＰＫＣλ／ι」の典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００２７３１で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＰＫＣλ／ιをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００２７４０に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ＰＫＣσ」の典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００６２４５で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿９９７７０４で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＰＫＣσをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００６２５４に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿２１２５３９に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ＰＫＣζ」の典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１０２８７５３で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１０２８７５４で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１２２９８０３で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００２７３５で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＰＫＣζをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１０３３５８１に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１０３３５８２に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１２４２８７４に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００２７４４に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ＣａＭＫ」とは、カルモジュリンキナーゼ、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼとも称されるタンパク質であり、例えば、ＣａＭＫＩ、ＣａＭＫIIβ、ＣａＭＫIV、ＣａＭＫIIσ（デルタ）、ＣａＭＫIIαが挙げられる。
「ＣａＭＫＩ」の典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００３６４７で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＣａＭＫＩをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００３６５６に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ＣａＭＫIIβ」の典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１２１１で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿７４２０７５で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿７４２０７６で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿７４２０７７で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿７４２０７８で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿７４２０７９で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿７４２０８０で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿７４２０８１で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＸＰ＿００５２４９９１８で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＣａＭＫIIβをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１２２０に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿１７２０７８に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿１７２０７９に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿１７２０８０に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿１７２０８１に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿１７２０８２に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿１７２０８３に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿１７２０８４に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＸＭ＿００５２４９８６１に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ＣａＭＫIV」の典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１７３５で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＣａＭＫIVをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１７４４に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ＣａＭＫIIσ」の典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１２１２で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿７４２１１２で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿７４２１１３で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿７４２１２５で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿７４２１２６で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿７４２１２７で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＸＰ＿００５２６３３１２で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＣａＭＫIIσをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１２２１に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿１７２１１４に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿１７２１１５に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿１７２１２７に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿１７２１２８に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿１７２１２９に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＸＭ＿００５２６３２５５に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ＣａＭＫIIα」の典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿７４１９６０で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＣａＭＫIIαをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿１７１８２５に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。 「ＣＳＫ」とは、カゼインキナーゼとも称されるタンパク質であり、例えば、ＣＳＫIIα、ＣＳＫIIサブユニットαが挙げられる。
「ＣＳＫIIα」の典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１８８６で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿８０８２２７で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿８０８２２８で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＣＳＫIIαをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１８９５に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿１７７５５９に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿１７７５６０に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ＣＳＫIIサブユニットα」の典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１８８７で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＣＳＫIIサブユニットαをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１８９６に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「Ｌｙｎ」とは、Ｌｙｎチロシンキナーゼとも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１１０４５６７で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００２３４１で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＸＰ＿００５２５１２８９で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＸＰ＿００５２５１２９０で特定されるタンパク質が挙げられる。また、Ｌｙｎをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１１１１０９７に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００２３５０に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＸＭ＿００５２５１２３２に記載のＣＤＳを含む核酸、ＲｅｆＳｅｑ ＸＭ＿００５２５１２３３に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
「ｂ−ＲＡＦ」とは、ｂ−ＲＡＦセリン／スレオニンキナーゼとも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００４３２４で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ｂ−ＲＡＦをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００４３３３．４に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。
本発明によれば、アルツハイマー病をその発症前に診断することができ、さらに該疾患の治療に有効な薬剤及び方法を提供することが可能となる。また、本発明によれば、前頭側頭葉変性症をその発症前に診断することができ、さらに該疾患の治療に有効な薬剤及び方法を提供することが可能となる。
異なる２つのアプローチ（仮説を設定しないアプローチ及びＡβ凝集と関連付けるアプローチ）によって同定された、複数のアルツハイマー病（ＡＤ）モデルマウスにおいて共通して発現量が亢進していたリン酸化タンパク質を示す図である。図中、「ＭＡＲＣＳ」及び「ＭＡＲＣＫＳＬ１」は、各々ＭＡＲＣＫＳ及びＭａｒｃｋｓｌ１を示す。 図１に示す１７のタンパク質によって構築されたネットワークを示す概略図である。なお、１７のタンパク質は、本発明において同定されたアルツハイマー病を罹患している脳においてリン酸化レベルが亢進しており、その病変において中心的な役割を担っていることが明らかとなったタンパク質（ＡＤコアタンパク質）である。また、図中、各タンパク質（ノード）間を結ぶ線（エッジ）は相互作用していることを示す。 アルツハイマー病の発症前段階における、キナーゼ及びその基質タンパク質のリン酸化の経時変化を示す、概略図である。すなわち、１〜３カ月齢において、ＡＤモデルマウス（５ｘＦＡＤマウス）のＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１及びＳＲＲＭ２のリン酸化は、野生型のそれに比べて顕著に高くなっていることを示し、３〜６カ月齢において、ＡＤモデルマウスのＧ３Ｐ、ＳＹＴ１、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１及びＨＳＰ９０Ａのリン酸化は、野生型のそれに比べて顕著に高くなっていることを示し、６カ月齢以降において、ＡＤモデルマウスのＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ及びＧＰＲＩＮ１のリン酸化は、野生型のそれに比べて顕著に高くなっていることを示す。なお、１２カ月齢のＡＤモデルマウスにおいて発症（行動異常等）は認められていない。また、図中、各タンパク質（ノード）間を結ぶ線（エッジ）は相互作用していることを示す。図中、「ＰＫＣ」については、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、１９９４年、２６９巻、３０号、１９４６２〜１９４６５ページ及びＪ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、１９９９年、７３巻、３号、９２１〜９３２ページ参照のこと。また、「ＣＳＫＩＩ」については、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、１９９３年、２６８巻、９号、６８１６〜６８２２ページ 参照のこと。 キナーゼ阻害剤（Ｇｏ６９７若しくはＫＮ−９３）、又はＬｙｎキナーゼ活性化剤（ＭＬＲ１０２３）を５ｘＦＡＤマウス（１２週齢）に投与し、その３６時間後及び６０時間後の脳梁膨大後部皮質レイヤー１における樹状突起スパイン／樹状突起を観察した結果を示す写真である。なお、コントロールとして、５ｘＦＡＤマウス及びそのバックグランドマウス（Ｂ６／ＳＪＬ（ＷＴ））にＤＭＳＯ（溶媒のみ）を投与して観察した結果も併せて示す。 Ｇｏ６９７、ＫＮ−９３又はＭＬＲ１０２３を投与してから３６時間後及び６０時間後の５ｘＦＡＤマウスにおける、樹状突起スパイン密度を定量的に解析した結果を示すグラフである。すなわち、５ｘＦＡＤマウスにおいては、明確に突起の数が少なくなっており、一方、Ｇｏ６９７、ＫＮ−９３又はＭＬＲ１０２３にて処理することによって、５ｘＦＡＤマウスにおけるスパインの減少は回復したことを示すグラフである。図中、Ａはバックグランド（ＷＴ）マウスにＤＭＳＯ（溶媒のみ）を投与した結果を示し、Ｂは５ｘＦＡＤマウスにＤＭＳＯを投与した結果を示し、Ｃは５ｘＦＡＤマウスにＧｏ６９７を投与した結果を示し、Ｄは、５ｘＦＡＤマウスにＭＬＲ１０２３を投与した結果を示し、Ｅは５ｘＦＡＤマウスにＫＮ−９３を投与した結果を示す。また、各棒グラフは平均値＋／−標準誤差を示し、付記した数値は各投与群におけるサンプル数を示す。アスタリスク１つ及び２つは、スチューデント独立ｔ検定においてｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１であることを各々示す（図中の表記については、図６、８、９及び１１において同じ）。 Ｇｏ６９７、ＫＮ−９３又はＭＬＲ１０２３を投与してから３６時間後及び６０時間後のスパインのタイプを定量的に解析した結果を示すグラフである。すなわち、形態学的タイプを問わず、５ｘＦＡＤマウスにおけるスパイン密度は減少しており、その減少は、Ｇｏ６９７、ＫＮ−９３又はＭＬＲ１０２３にて処理することによって回復したことを示すグラフである。 Ｇｏ６９７、ＫＮ−９３又はＭＬＲ１０２３を投与してから３６時間後及び６０時間後の５ｘＦＡＤマウスにおける、スパイン形成及び除去を示す写真である。３６時間後の図中（３６ｈ）の矢印はその後除去されたスパインを示し、６０時間後の図中（６０ｈ）の矢印は形成されたスパインを示す。なお、コントロールとして、５ｘＦＡＤマウス及びそのバックグランドマウス（Ｂ６／ＳＪＬ（ＷＴ））にＤＭＳＯ（溶媒のみ）を投与して観察した結果も併せて示す。 Ｇｏ６９７、ＫＮ−９３又はＭＬＲ１０２３を投与してから３６時間後及び６０時間後の５ｘＦＡＤマウスにおける、樹状突起スパインの動態を定量的に解析した結果を示すグラフである。図中縦軸は、樹状突起軸１００μｍにおいて、形成されたスパイン、除去されたスパイン又は安定して残っていたスパインの数を示す。 Ｇｏ６９７、ＫＮ−９３又はＭＬＲ１０２３を投与してから３６時間後及び６０時間後の５ｘＦＡＤマウスにおける、樹状突起スパインの動態を定量的に解析した結果を示すグラフである。図中縦軸は、形成されたスパイン、除去されたスパイン又は安定して残っていたスパインの相対的な比率を示す。 ＷＴ／ＤＭＳＯ（ＤＭＳＯのみにて処理したバックグランドマウス）、５×ＦＡＤ／ＤＭＳＯ（ＤＭＳＯのみにて処理した５ｘＦＡＤマウス）、５×ＦＡＤ／Ｇｏ（Ｇｏ６９７にて処理した５ｘＦＡＤマウス）、５×ＦＡＤ／ＭＬＲ（ＭＬＲ１０２３にて処理した５ｘＦＡＤマウス）及び５×ＦＡＤ／ＫＮ−９３（ＫＮ−９３にて処理した５ｘＦＡＤマウス）の大脳皮質について、活性化ＰＫＣβ（ＰＫＣβ ｐＴ６４２）、活性化ＰＫＣδ（ＰＫＣδ ｐＳ６４３／６７６）及び活性化ＣａｍＫII（ＣａｍＫII ｐＴ２８６）に対する各抗体を用いた免疫組織染色により解析した結果を示す、顕微鏡写真である。 図１０に示した５タイプのマウスについて、神経細胞体又はニューロピルにおける、各活性化キナーゼのシグナルを定量的に解析した結果を示すグラフである。 ＭＡＲＣＫＳに対するｓｈＲＮＡをコードするレンチウィルスベクターを脳梁膨大後部皮質レイヤー１に注入し、その４日後及び５日後の該部位における樹状突起スパイン／樹状突起を観察した結果を示す写真である。なお、コントロールとして、５ｘＦＡＤマウス及びそのバックグランドマウス（Ｂ６／ＳＪＬ（ＷＴ））にスクランブルｓｈＲＮＡを注入して観察した結果も併せて示す。 ＭＡＲＣＫＳに対するｓｈＲＮＡを注入してから４日後及び５日後の５ｘＦＡＤマウスにおける、樹状突起スパイン密度を定量的に解析した結果を示すグラフである。図中、Ａはバックグランド（ＷＴ）マウスにスクランブルｓｈＲＮＡを注入した結果を示し、Ｂは５ｘＦＡＤマウスにスクランブルｓｈＲＮＡを注入した結果を示し、Ｃは５ｘＦＡＤマウスにＭＡＲＣＫＳに対するｓｈＲＮＡを注入した結果を示す。また、各棒グラフは平均値＋／−標準誤差を示し、付記した数値（ｎ＝４）は各注入群におけるサンプル数を示す。アスタリスク１つ及び２つは、スチューデント独立ｔ検定においてｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１であることを各々示す（図中の表記については、図１４、１５、１７及び１８において同じ）。 ＭＡＲＣＫＳに対するｓｈＲＮＡを注入してから４日後のスパインのタイプを定量的に解析した結果を示すグラフである。 ＭＡＲＣＫＳに対するｓｈＲＮＡを注入してから５日後のスパインのタイプを定量的に解析した結果を示すグラフである。 ＭＡＲＣＫＳに対するｓｈＲＮＡを注入してから４日後及び５日後の５ｘＦＡＤマウスにおける、スパイン形成及び除去を示す写真である。図中の４日後の観察結果（４ｄ）に付された矢印はその後除去されたスパインを示し、その他の矢印は形成されたスパインを示す。なお、コントロールとして、５ｘＦＡＤマウス及びそのバックグランドマウス（Ｂ６／ＳＪＬ（ＷＴ））にスクランブルｓｈＲＮＡを注入して観察した結果も併せて示す。 ＭＡＲＣＫＳに対するｓｈＲＮＡを注入した５ｘＦＡＤマウスにおける、樹状突起スパインの動態を定量的に解析した結果を示すグラフである。図中縦軸は、樹状突起軸１００μｍにおいて、形成されたスパイン、除去されたスパイン又は安定して残っていたスパインの数を示す。 ＭＡＲＣＫＳに対するｓｈＲＮＡを注入した５ｘＦＡＤマウスにおける、樹状突起スパインの動態を定量的に解析した結果を示すグラフである。図中縦軸は、形成されたスパイン、除去されたスパイン又は安定して残っていたスパインの相対的な比率を示す。 ｂ−ｒａｆキナーゼ阻害剤存在下又は非存在下にて、マウス初代皮質神経細胞（Ｅ１８）を培地中、１０μＭ アミロイドβタンパク質（Ａβ１−４２）にて６時間処理した。そして、抗リン酸化ｔａｕ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す写真である。なお、ｂ−ｒａｆキナーゼ阻害剤として、ＰＬＸ−４７２０（ＰＬＸ）、ソラフェニブ（Ｓｏｒ）及びＧＤＣ−０８７９（ＧＤＣ）を用い、濃度が１μＭ又は１０μＭになるよう培地に添加した。 図１９に示したウェスタンブロットのバンドを定量的に解析した結果を示すグラフである。スチューデント独立ｔ検定において、アスタリスク１つはｐ＜０．０５であることを示す（ｎ＝３）。 ｂ−ｒａｆ阻害剤による、ＦＴＬＤモデルマウスの行動的表現型に対する治療効果を解析するためのプロトコールを示す、概略図である。 ｂ−ｒａｆ阻害剤（べムラフェニブ）をＦＴＬＤモデルマウス（ＰＧＲＮ−ＫＩマウス）に与え、モリス水迷路試験にて、これらマウスの行動を評価した結果を示すグラフである。図中、グラフの棒中に記載された数字は、各試験において解析されたマウスの数を示す。また、「−」はべムラフェニブの代わりにＰＢＳが投与されたマウスの結果（陰性対照）を示す。 べムラフェニブをＰＧＲＮ−ＫＩマウスに与え、恐怖条件付け試験にて、これらマウスの行動を評価した結果を示すグラフである（図中の表記については、図２２におけるそれらと同様である）。 ＴＮＦシグナル伝達阻害剤による、ＦＴＬＤモデルマウスの行動的表現型に対する治療効果を解析するためのプロトコールを示す、概略図である。 ＴＮＦシグナル伝達阻害剤（サリドマイド）をＦＴＬＤモデルマウス（ＰＧＲＮ−ＫＩマウス）に与え、モリス水迷路試験にて、これらマウスの行動を評価した結果を示すグラフである。図中、グラフの棒中に記載された数字は、各試験において解析されたマウスの数を示す。また、「−」はサリドマイドの代わりにＰＢＳが投与されたマウスの結果（陰性対照）を示す。 サリドマイドをＰＧＲＮ−ＫＩマウスに与え、恐怖条件付け試験にて、これらマウスの行動を評価した結果を示すグラフである（図中の表記については、図２５におけるそれらと同様である）。 べムラフェニブを投与した、ＰＧＲＮ−ＫＩマウス及び野生型マウス（ＷＴ）の大脳皮質を、ウェスタンブロットにより解析した結果を示す図である。図中、上部パネルは、前記ウェスタンブロット解析結果を示す写真であり、「Ａｎｔｉ−ｐ−Ｂｒａｆ」及び「Ａｎｔｉ−ｐ−ＰＫＣ」は、リン酸化ｂ−ｒａｆタンパク質について解析した結果及びリン酸化ＰＫＣタンパク質について解析した結果を各々示す。「Ａｎｔｉ−ＧＡＰＤＨ」は、内部標準として、ＧＡＰＤＨタンパク質について検出した結果を示す。また、図中、下部２パネルは、前記ウェスタンブロット解析結果を示すグラフであり、左側はＧＡＰＤＨ量を基準としたリン酸化ｂ−ｒａｆタンパク質量の相対値を示し、右側はＧＡＰＤＨ量を基準としたリン酸化ＰＫＣタンパク質量の相対値を示す。有意差については、スチューデント独立ｔ検定により算出したＰ値に基づき評価した。 サリドマイドを投与したＰＧＲＮ−ＫＩマウスの大脳皮質を、ウェスタンブロットにより解析した結果を示す図である。図中、左側のパネルは、前記ウェスタンブロット解析結果を示す写真であり、「Ａｎｔｉ−ｐ−Ｂｒａｆ」、「Ａｎｔｉ−Ｂｒａｆ」及び「Ａｎｔｉ−ｐ−ＰＫＣ」は、リン酸化ｂ−ｒａｆタンパク質について解析した結果、ｂ−ｒａｆタンパク質について解析した結果及びリン酸化ＰＫＣタンパク質について解析した結果を各々示す。「Ａｎｔｉ−ＧＡＰＤＨ」は、内部標準として、ＧＡＰＤＨタンパク質について検出した結果を示す。また、図中、右側のパネルは、前記ウェスタンブロット解析結果を示すグラフであり、「ｐ−Ｂ−ｒａｆ／Ｂｒａｆ」はｂ−ｒａｆタンパク質の総量を基準としたリン酸化ｂ−ｒａｆタンパク質量の相対値を示し、「ｐ−Ｂ−ｒａｆ／ＧＡＰＤＨ」は、ＧＡＰＤＨ量を基準としたリン酸化ｂ−ｒａｆタンパク質量の相対値を示し、「ｐ−ＰＫＣ／ＧＡＰＤＨ」は、ＧＡＰＤＨ量を基準としたリン酸化ＰＫＣタンパク質量の相対値を示す。また、図中、アスタリスク１つは、スチューデント独立ｔ検定において、ｐ＜０．０５であることを示し、アスタリスク２つは、スチューデント独立ｔ検定において、ｐ＜０．０１であることを示す。 ＦＴＬＤモデルマウス（ＰＧＲＮ−ＫＩマウス）及び野生型マウス（ＷＴ）の脳梁膨大後部異顆粒皮質（ＲＳＤ）において、スパインの静態を解析した結果を示す図である。図中、左側のパネルは、２光子顕微鏡により観察したスパインの写真を示す。図中、右側のパネルは、２光子顕微鏡観察により測定したスパイン数（樹状突起１μｍあたりのスパインの数）、スパインの長さ、スパインヘッドの直径及びスパンの体積を示すグラフである。また、各グラフにおいて、左側の棒は野生型マウスの観察結果を示し、右側の棒はＰＧＲＮ−ＫＩマウスの観察結果を示す。図中、アアスタリスク２つは、スチューデント独立ｔ検定において、ｐ＜０．０１であることを示す。 ＦＴＬＤモデルマウス（ＰＧＲＮ−ＫＩマウス）及び野生型マウス（ＷＴ）の脳梁膨大後部異顆粒皮質（ＲＳＤ）において、スパインの動態を解析した結果を示す図である。図中、左側のパネルは、２光子顕微鏡により観察したスパインの写真を示す。写真中、上向きの矢印は、除去されたスパインを示し、下向きの矢印は、産生されたスパインを示す。右側のパネルは、２光子顕微鏡観察により検出された、スパインの産生数、除去されたスパインの数及び安定して残ったスパインの数を示す。また、各グラフにおいて、左側の棒は野生型マウスの観察結果を示し、右側の棒はＰＧＲＮ−ＫＩマウスの観察結果を示す。 ｂ−ｒａｆ阻害剤（べムラフェニブ）又はＰＢＳを投与した、ＰＧＲＮ−ＫＩマウス（ＫＩ）の脳梁膨大後部異顆粒皮質（ＲＳＤ）において、スパインの静態を解析した結果を示す図である。図中、左側のパネルは、２光子顕微鏡により観察したスパインの写真を示す。図中、右側のパネルは、２光子顕微鏡観察により測定したスパイン数（樹状突起１μｍあたりのスパインの数）、スパインの長さ、スパインヘッドの直径及びスパンの体積を示すグラフである。また、各グラフにおいて、左側の棒はＰＢＳを投与したＰＧＲＮ−ＫＩマウスの観察結果（ＫＩ＋ＰＢＳ）を示し、右側の棒はべムラフェニブを投与したＰＧＲＮ−ＫＩマウスの観察結果（ＫＩ＋べムラフェニブ）を示す。図中、アアスタリスク１つは、スチューデント独立ｔ検定において、ｐ＜０．０５であることを示す。 ｔａｕに対するｓｈＲＮＡ（Ｓｈ−Ｔａｕ）又はスクランブルｓｈＲＮＡ（Ｓｈ−スクランブル）を注入した、ＰＧＲＮ−ＫＩマウス（ＫＩ）の脳梁膨大後部異顆粒皮質（ＲＳＤ）において、スパインの静態を解析した結果を示す図である。図中、左側のパネルは、２光子顕微鏡により観察したスパインの写真を示す。図中、右側のパネルは、２光子顕微鏡観察により測定したスパイン数（樹状突起１μｍあたりのスパインの数）、スパインの長さ、スパインヘッドの直径及びスパンの体積を示すグラフである。また、各グラフにおいて、左側の棒はスクランブルｓｈＲＮＡを注入したＰＧＲＮ−ＫＩマウスの観察結果（ＫＩ＋Ｓｈ−スクランブル）を示し、右側の棒はｔａｕに対するｓｈＲＮＡを注入したＰＧＲＮ−ＫＩマウスの観察結果（ＫＩ＋Ｓｈ−Ｔａｕ）を示す。図中、アアスタリスク１つは、スチューデント独立ｔ検定において、ｐ＜０．０５であることを示す。 ＦＴＬＤモデルマウス（ＰＧＲＮ−ＫＩマウス）の脳梁膨大後部異顆粒皮質において、スパインの動態を解析した結果を示すグラフである。図中、左側のグラフは、べムラフェニブをＰＧＲＮ−ＫＩマウスに投与した結果（解析数：３匹、グラフ中左側の棒）又はＰＢＳをＰＧＲＮ−ＫＩマウスに投与した結果（解析数：４匹、グラフ中右側の棒）を示す。図中、右側のグラフは、スクランブルｓｈＲＮＡをＰＧＲＮ−ＫＩマウスに注入した結果（解析数：４匹、グラフ中左側の棒）又はｔａｕに対するｓｈＲＮＡをＰＧＲＮ−ＫＩマウスに注入した結果（解析数：４匹、グラフ中右側の棒）を示す。
＜アルツハイマー病を診断する方法１＞
後述の実施例において示す通り、複数のアルツハイマー病モデルマウスにおいて、それらの発症前に、ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、ＳＲＲＭ２、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ、ＨＳ９０Ａ、ＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＧＰＲＩＮ１、ＡＣＯＮ、ＡＴＰＡ及びＡＴＰＢのリン酸化が共通して亢進していることが明らかになった。したがって、本発明においては、これらタンパク質のリン酸化を指標とする、下記工程（ｉ）〜（iii）を含むアルツハイマー病を診断する方法が提供される。
（ｉ）被検体において、ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、ＳＲＲＭ２、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ、ＨＳ９０Ａ、ＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＧＰＲＩＮ１、ＡＣＯＮ、ＡＴＰＡ及びＡＴＰＢからなる群から選択される少なくとも１の基質タンパク質のリン酸化を検出する工程、
（ii）該リン酸化と、正常検体における基質タンパク質のリン酸化とを比較する工程、及び、
（iii）該比較の結果、前記被検体における基質タンパク質のリン酸化が、前記正常検体における基質タンパク質のリン酸化よりも高い場合、前記被検体はアルツハイマー病を罹患している、またはアルツハイマー病を発症する危険性を有していると判定する工程
を含む、方法。
当該診断方法において、ＭＡＲＣＫＳ等の基質タンパク質は、上記典型例として挙げているアミノ酸配列からなるタンパク質に各々限定されず、自然界において生じ得る変異体も対象となる。また、１の基質タンパク質中リン酸化される部位（アミノ酸残基）が複数ある場合には、該タンパク質の少なくとも１の部位のリン酸化を検出すればよいが、診断精度をより高めるという観点から、該タンパク質における全ての部位のリン酸化を検出することが好ましい。
ヒトに関し、本発明の検出対象となるリン酸化部位としては、ＭＡＲＣＫＳにおいては、例えば、２６位のセリン、２７位のセリン、２９位のセリン、１１８位のセリン、１２８位のセリン、１３１位のセリン、１３２位のセリン、１３４位のセリン、１３５位のセリン、１４５位のセリン、１４７位のセリン、１５０位のスレオニン、１７０位のセリン、３２２位のセリンが挙げられる。Ｍａｒｃｋｓｌ１においては、例えば、２２位のセリン、８５位のスレオニン、１０４位のセリン、１４８位のスレオニン、１５１位のセリン、１８０位のセリン、１８４位のセリンが挙げられる。ＳＲＲＭ２においては、例えば、１１０２位のセリン、１３２０位のセリン、１３４８位のセリン、１３８３位のセリン、１４０３位のセリン、１４０４位のセリン、２３９８位のセリン、２１３２位のセリン、２４４９位のセリン、２５８１位のセリン、１４９２位のスレオニン、２３９７位のスレオニンが挙げられる。ＳＰＴＡ２においては、例えば、１０３１位のセリン、１２１７位のセリンが挙げられる。ＡＤＤＢにおいては、例えば、６０位のセリン、６２位のセリン、５３２位のセリン、５９２位のセリン、６００位のセリン、６１７位のセリン、６９３位のセリン、７０１位のセリンが挙げられる。ＮＥＵＭにおいては、例えば、１５１位のセリン、１８１位のスレオニン、２０３位のセリンが挙げられる。ＢＡＳＰ１においては、例えば、３１位のスレオニン、３６位のスレオニン、１３２位のセリン、１９５位のセリン、２１９位のセリンが挙げられる。ＳＹＴ１においては、例えば、１２６位のスレオニン、１２９位のスレオニンが挙げられる。Ｇ３Ｐにおいては、例えば、１８４位のスレオニン、２１１位のスレオニンが挙げられる。ＨＳ９０Ａにおいては、例えば、２３１位のセリン、２６３位のセリンが挙げられる。ＮＦＨにおいては、例えば、５０３位のセリン、５４０位のセリン、６６０位のセリン、７３０位のセリン、７６９位のセリン、８０１位のセリン、８２８位のセリンが挙げられる。ＮＦＬにおいては、例えば、４７２位のセリンが挙げられる。ＧＰＲＩＮ１においては、例えば、７７６位のセリン、７９９位のセリン、８５０位のセリン、８５３位のセリン、８７７位のスレオニンが挙げられる。
なお、これらのリン酸化部位は、後述の実施例５において同定された、アルツハイマー病モデルマウスにおいてリン酸化レベルが変化していた部位を、対応するヒトの部位に変換したものである（各リン酸化部位におけるヒトとマウスとの対応関係については、ＰｈｏｓｐｈｏＳｉｔｅ Ｐｌｕｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｏｓｐｈｏｓｉｔｅ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅＡｃｔｉｏｎ．ｄｏ）参照のこと）。また、本発明において「リン酸化部位」とは、前記基質タンパク質等のリン酸化されるタンパク質において、リン酸化されているアミノ酸の前後１アミノ酸を含む少なくとも３アミノ酸からなる部位を意味する。
前記診断方法において、基質タンパク質のリン酸化の検出の対象となる被検体が、ヒトを含む動物の身体から単離された試料（体液、組織、細胞等）である場合、すなわち該診断方法がインビトロ法である場合には、工程（ｉ）における検出方法として、例えば、後述の実施例において示すような質量分析法、すなわち、前記試料より抽出し、標識したリン酸化ポリペプチドを２Ｄ ＬＣ ＭＳ／ＭＳにより解析する方法が挙げられる。このような質量分析法による検出は、複数の基質タンパク質の複数のリン酸化を網羅的に検出でき、ひいては診断精度がより高められるという観点から好ましい。
また、インビトロ法に関しては、基質タンパク質のリン酸化部位に特異的に結合する抗体による検出方法、例えば、免疫組織化学染色、免疫電顕法、免疫アッセイ（酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫アッセイ、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫クロマト法及びウエスタンブロット法等）も挙げられる。さらには、基質タンパク質のリン酸化部位に特異的に結合する化合物を固定化した金属薄膜を用いる、表面プラズモン共鳴現象を利用した検出装置（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（ＧＥヘルスケア社製））を利用する方法も挙げられる。前記抗体及び化合物については、後述の＜アルツハイマー病を診断薬＞記載参照のこと。
また、前記診断方法において、基質タンパク質のリン酸化の検出の対象となる被検体が、ヒトを含む動物の体である場合、すなわち該診断方法がインビボ法である場合には、工程（ｉ）における検出方法として、例えば、バイオイメージング技術（コンピューター体軸断層撮影法（ＣＡＴ、ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ））が挙げられる。より具体的には、特表２００４−５１３１２３号公報、特表２００４−５３０４０８号公報、特表２００２−５１４６１０号公報、特開２０１１−９５２７３号公報、特表２００１−５２７５０９号公報、特表平９−５０１４１９号公報、特表平９−５０５７９９号公報、特表平８−５０９２２６号公報に記載の技術を参酌して行うことができるが、本発明の診断方法の態様はこれらに限定されるものではない。
バイオイメージング技術において、基質タンパク質のリン酸化部位に特異的に結合する化合物が、被検体の体内に導入されることとなるが、導入方法としては特に制限はなく、例えば、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気道内投与、直腸投与及び筋肉内投与、輸液による投与、標的部位（脳等）への直接投与が挙げられる。標的部位への直接投与は、例えば、カニューレ（カテーテル）、切開術等を用いて行うことができる。前記化合物については後述の＜アルツハイマー病を診断薬＞記載参照のこと。
また、後述の実施例において示す通り、アルツハイマー病の診断方法において、検出の対象となる基質タンパク質は、リン酸化の経時変化のパターンに応じて３つに分類される。すなわち、アルツハイマー病の発症前段階の初期にてリン酸化が最も亢進する基質タンパク質として、ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１及びＳＲＲＭ２が挙げられ、アルツハイマー病の発症前段階の中期にてリン酸化が最も亢進する基質タンパク質として、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ及びＨＳ９０Ａが挙げられ、アルツハイマー病の発症前段階の後期にてリン酸化が最も亢進する基質タンパク質として、ＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ及びＧＰＲＩＮ１が挙げられる。したがって、工程（iii）において、ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１及びＳＲＲＭ２のうちの少なくとも２つの基質タンパク質のリン酸化（より好ましくは、３つ全ての基質タンパク質のリン酸化）が、正常検体のそれらよりも高ければ、被検体がアルツハイマー病発症前の初期段階にあると判定することができる。また、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ及びＨＳ９０Ａのうちの少なくとも２つの基質タンパク質のリン酸化（より好ましくは、３つの基質タンパク質のリン酸化、４つの基質タンパク質のリン酸化、５つの基質タンパク質のリン酸化、さらに好ましくは、６つの基質タンパク質のリン酸化、特に好ましくは、７つ全ての基質タンパク質のリン酸化）が、正常検体のそれらよりも高ければ、被検体がアルツハイマー病発症前の中期段階にあると判定することができる。また、ＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ及びＧＰＲＩＮ１のうちの少なくとも２つの基質タンパク質のリン酸化（より好ましくは、３つの基質タンパク質のリン酸化、さらに好ましくは、４つ全ての基質タンパク質のリン酸化）が、正常検体のそれらよりも高ければ、被検体がアルツハイマー病発症前の後期段階にあると判定することができる。
＜アルツハイマー病を診断する方法２＞
また、後述の実施例において示す通り、前記ＭＡＲＣＫＳ等の基質タンパク質をリン酸化するキナーゼタンパク質は、アルツハイマー病モデルマウスにおいて、その発症前に活性化していることも明らかになった。したがって、本発明においては、アルツハイマー病の診断方法の第２の態様として、下記工程（ｉ）〜（iii）を含む方法も提供される。
（ｉ）被検体において、キナーゼタンパク質の活性又は発現を検出する工程、
（ii）該活性又は発現と、正常検体におけるキナーゼタンパク質の活性又は発現とを比較する工程、及び、
（iii）該比較の結果、前記被検体におけるキナーゼタンパク質の活性又は発現が、前記正常検体におけるキナーゼタンパク質の活性又は発現よりも高い場合、前記被検体はアルツハイマー病を罹患している、またはアルツハイマー病を発症する危険性を有していると判定する工程
を含み、かつ前記キナーゼタンパク質が、ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＣＳＫ、Ｌｙｎ及びｂ−ＲＡＦからなる群から選択される少なくとも１のキナーゼタンパク質である、方法。
当該診断方法において、ＰＫＣ等のキナーゼタンパク質は、上記典型例として挙げているアミノ酸配列からなるタンパク質に各々限定されず、自然界において生じ得る変異体も対象となる。また、検出の対象となるキナーゼタンパク質の「活性」とは基質タンパク質を直接的又は間接的にリン酸化する活性（キナーゼ活性）を意味する。さらに、キナーゼ活性はキナーゼタンパク質の発現量、特に活性化キナーゼタンパク質の発現量と相関するものであるから、キナーゼ活性の代わりに、キナーゼタンパク質の発現量、好ましくは活性化キナーゼタンパク質の発現量も前記診断方法の検出の対象とすることができる。
本発明において「活性化キナーゼタンパク質」とは、基質タンパク質をリン酸し得る状態となっているキナーゼタンパク質のことを意味し、例えば、リン酸化されているキナーゼタンパク質が挙げられる。活性化キナーゼタンパク質としては、より具体的には、６４２位のスレオニンがリン酸化されているＰＫＣβ、６３８位のスレオニンがリン酸化されているＰＫＣα、４０３位のスレオニンがリン酸化されているＰＫＣλ/ι、６４３位のセリンがリン酸化されているＰＫＣδ、４１０位のスレオニンがリン酸化されているＰＫＣζ、４１７位のチロシンがリン酸化されているＰＫＣζ、１７７位のセリンがリン酸化されているＣａＭＫＩ、２８７位のスレオニンがリン酸化されているＣａＭＫIIβ、２００位のスレオニンがリン酸化されているＣａＭＫIV、２８７位のスレオニンがリン酸化されているＣａＭＫIIσ、２８６位のスレオニンがリン酸化されているＣａＭＫIIα、３６０位のスレオニンがリン酸化されているＣＳＫIIα、３６２位のセリンがリン酸化されているＣＳＫIIα、３９７位のチロシンがリン酸化されているＬｙｎ、３６５位のセリンがリン酸化されているｂ−ＲＡＦ、４４６位のセリンがリン酸化されているｂ−ＲＡＦ、５７９位のセリンがリン酸化されているｂ−ＲＡＦ、５９９位のスレオニンがリン酸化されているｂ−ＲＡＦ、６０２位のセリンがリン酸化されているｂ−ＲＡＦ、７２９位のセリンがリン酸化されているｂ−ＲＡＦ、７３２位のセリンがリン酸化されているｂ−ＲＡＦが挙げられる。
前記診断方法がインビトロ法である場合には、前記活性の検出は、例えば、前記試料又はそのタンパク質抽出液に、基質及び放射標識したリン酸塩を添加し、該リン酸塩の該基質への取り込みを検出することで行うことができる。リン酸塩の基質への取り込みは、シンチレーションカウンター、オートラジオグラフィー等によって検出することができる。また、放射性標識を用いることなく、前記基質を前記試料又はそのタンパク質抽出液によって処理し、その処理後の該基質の分子量の増大を検出することによっても、前記活性を検出することができる。分子量の増大の検出は、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動における基質の移動度の変化を検出することによって行うことができる。さらに、該電気泳動後のポリアクリルアミドゲルをＰＶＤＦ等のメンブレンに転写し、当該基質のリン酸化部位に特異的に結合する抗体を用いたウエスタンブロット法によっても検出することができる。なお、基質としては、対象とするキナーゼタンパク質の公知の基質タンパク質、又はリン酸化される部位（被リン酸化部位）を含むその部分ペプチドが挙げられる。
ＰＫＣの公知の基質タンパク質としては、例えば、ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ、ＨＳＰ９０Ａが挙げられる。より具体的には、ＰＫＣβの基質タンパク質としては、ＳＰＴＡ２、ＭＡＲＣＫＳ、ＮＥＵＭが挙げられ、ＰＫＣαの基質タンパク質としては、ＭＡＲＣＫＳ、ＨＳＰ９０Ａが挙げられ、ＰＫＣζの基質タンパク質としては、Ｍａｒｃｋｓｌ１が挙げられ、ＰＫＣλ/Iの基質タンパク質としては、Ｇ３Ｐ、ＨＳＰ９０Ａが挙げられ、ＰＫＣδの基質タンパク質としては、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＨＳＰ９０Ａが挙げられる。
ＣａＭＫの公知の基質タンパク質としては、例えば、ＳＰＴＡ２、Ｇ３Ｐが挙げられる。より具体的には、ＣａＭＫＩの基質タンパク質としては、Ｇ３Ｐが挙げられ、ＣａＭＫIIβの基質タンパク質としては、Ｇ３Ｐが挙げられ、ＣａＭＫＩＶの基質タンパク質としては、Ｇ３Ｐが挙げられ、ＣａＭＫIIδの基質タンパク質としては、ＳＰＴＡ２が挙げられる。
ＣＳＫの公知の基質タンパク質としては、例えば、ＮＥＵＭ、ＳＹＴ１、ＨＳＰ９０Ａが挙げられる。より具体的には、ＣＳＫIIサブユニットαの基質タンパク質としては、ＨＳＰ９０Ａが挙げられ、ＣＳＫIIαの基質タンパク質としては、ＮＥＵＭ、ＨＳＰ９０Ａが挙げられる。
Ｌｙｎの公知の基質タンパク質としては、例えば、Ｇ３Ｐが挙げられる。また、ｂ−ＲＡＦの基質タンパク質としては、例えば、ＭＥＫ１、ＥＲＫ１、ｔａｕが挙げられる。
また、インビトロ法において、前記発現量の検出法としては、前述の基質タンパク質のリン酸化の検出同様に、例えば、質量分析法、キナーゼタンパク質（好ましくは活性化キナーゼタンパク質）に特異的に結合する抗体による検出方法、キナーゼタンパク質（好ましくは活性化キナーゼタンパク質）に特異的に結合する化合物を固定化した金属薄膜を用いる、表面プラズモン共鳴現象を利用した検出装置を利用する方法が挙げられる。該抗体及び化合物については後述の＜アルツハイマー病を診断薬＞記載参照のこと。
前記診断方法がインビボ法である場合には、前記活性の検出は、該活性による基質タンパク質のリン酸化を検出することによって行うことができる。すなわち、前述の基質タンパク質のリン酸化を検出の対象とするバイオイメージング技術を好適に用いることができる。
また、前記診断方法がインビボ法である場合には、前記発現量の検出は、前述の基質タンパク質のリン酸化の検出同様に、例えば、キナーゼタンパク質（好ましくは活性化キナーゼタンパク質）に特異的に結合する化合物を用いるバイオイメージング技術を利用することによって行うことができる。該化合物については後述の＜アルツハイマー病を診断薬＞記載参照のこと。
以上、本発明の診断方法の好適な態様について説明したが、このような診断は、通常、医師（医師の指示を受けた者も含む）によって行われる。本発明の診断方法によって得られる、被検体における前記基質タンパク質のリン酸化、若しくはキナーゼタンパク質の活性又は発現に関するデータは、医師による診断に役立つものである。よって、本発明の方法は、医師による診断に役立つデータを収集し、提示する方法とも表現しうる。
また、本発明によれば、アルツハイマー病を罹患している、またはアルツハイマー病を発症する危険性を有していると判定することができる。このように、アルツハイマー病の罹患等を早期に判断できれば、アルツハイマー病の病変を抑えるための治療方法（免疫療法、アルツハイマー病の病変を抑えるための薬剤を投与する方法）の奏効が期待できる。
したがって、本発明は、本発明のアルツハイマー病の診断方法によりアルツハイマー病を罹患している、またはアルツハイマー病を発症する危険性を有していると判定された被検体に、アルツハイマー病の病変を抑えるための薬剤を投与する工程及び／又は免疫療法を施す工程を含む、
アルツハイマー病の治療方法を提供することもできる。
免疫療法としては、例えば、アミロイドβの凝集の抑制を対象とする、アミロイドβの部分ペプチドを用いる能動免疫療法（ワクチン療法）、アミロイドβに対する抗体を投与する受動免疫療法が挙げられる。
また、アルツハイマー病の病変を抑えるために投与される薬剤としては、例えば、アミロイドβの産生を抑制するための薬剤（γセクレターゼモジュレーター（ＧＳＭ）、γセクレターゼモジュレーター阻害剤（ＧＳＩ）、非ステロイド性抗炎症薬等）、アミロイドβの凝集を抑制するための薬剤（クルクミン、ポリ硫酸化合物、クリオキノール等）、ｔａｕの凝集を抑制するための薬剤（アミノチエノピリダジン、シアニン色素、メチレンブルー等）、神経保護薬（ジメボン等）、コリンエステラーゼ阻害薬（ドネぺジル等）、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬（ガランタミン等）、グルタミン酸ＮＭＤＡ受容体阻害薬（メマンチン等）が挙げられる。
さらに、後述の通り、ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、ＳＲＲＭ２、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ、ＨＳ９０Ａ、ＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＧＰＲＩＮ１、ＡＣＯＮ、ＡＴＰＡ及びＡＴＰＢからなる群から選択される少なくとも１の基質タンパク質のリン酸化を抑制する化合物、ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＣＳＫ、Ｌｙｎ及びｂ−ＲＡＦからなる群から選択される少なくとも１のキナーゼタンパク質の活性又は発現を抑制する化合物、Ｌｙｎを活性化する化合物、若しくはＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、ＳＰＲＭ２、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ、ＨＳ９０Ａ、ＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＧＰＲＩＮ１、ＡＣＯＮ、ＡＴＰＡ及びＡＴＰＢからなる群から選択される少なくとも１の基質タンパク質と、ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＣＳＫ、Ｌｙｎ及びｂ−ＲＡＦからなる群から選択される少なくとも１のキナーゼタンパク質との結合を抑制する化合物を含有する、アルツハイマー病を治療するための薬剤も、アルツハイマー病の病変を抑えるための薬剤として好適に用いることができる。
＜アルツハイマー病の診断薬＞
前述の通り、複数のアルツハイマー病モデルマウスにおいて、それらの発症前に、ＭＡＲＣＫＳ等のリン酸化が共通して亢進していることが明らかになった。したがって、本発明においては、ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、ＳＰＲＭ２、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ、ＨＳ９０Ａ、ＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＧＰＲＩＮ１、ＡＣＯＮ、ＡＴＰＡ及びＡＴＰＢからなる群から選択される少なくとも１の基質タンパク質のリン酸化部位に対して結合活性を有する化合物を含有する、アルツハイマー病を診断するための薬剤が提供される（アルツハイマー病を診断するための薬剤のことを以下「アルツハイマー病診断薬」とも称する）。
前述の通り、前記ＭＡＲＣＫＳ等の基質タンパク質をリン酸化するキナーゼタンパク質も、アルツハイマー病モデルマウスにおいて、その発症前に活性化していることが明らかになった。したがって、本発明においては、ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＣＳＫ、Ｌｙｎ及びｂ−ＲＡＦからなる群から選択される少なくとも１のキナーゼタンパク質に対して結合活性を有する化合物を含有する、アルツハイマー病を診断するための薬剤が提供される。さらに、該薬剤の好適な態様としては、ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＣＳＫ、Ｌｙｎ及びｂ−ＲＡＦからなる群から選択される少なくとも１の活性化キナーゼタンパク質に対して結合活性を有する化合物を含有する、アルツハイマー病を診断するための薬剤が挙げられる。
本発明の診断薬の標的となる前記基質タンパク質及びキナーゼタンパク質は、前述の診断方法と同じく、上記典型例として挙げているアミノ酸配列からなるタンパク質に各々限定されず、自然界において生じ得る変異体も標的となる。
「前記基質タンパク質のリン酸化部位に対して結合活性を有する化合物」及び「前記キナーゼタンパク質に対して結合活性を有する化合物」としては特に制限はなく、公知の化合物であってもよく、後述のスクリーニングにより同定されるものであってもよい。このような化合物としては、例えば、前記基質タンパク質のリン酸化部位又は前記キナーゼタンパク質に結合する抗体、前記基質タンパク質のリン酸化部位又は前記キナーゼタンパク質に結合する低分子化合物が挙げられる。
本発明における「抗体」は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、抗体の機能的断片であってもよい。抗体には、免疫グロブリンの全てのクラス及びサブクラスが含まれる。抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、その抗原を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体等が挙げられる。また、抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及びこれら抗体の機能的断片が含まれる。さらに、これら抗体は、必要に応じ、アミノ酸配列の改変、修飾等が施されているものであってもよい。このような抗体は、当業者であれば公知の抗体作製方法により適宜調製することができる。また、これらの抗体のうち、本発明のアルツハイマー病を診断するための薬剤又は後述の治療するための薬剤が導入される対象がヒトである場合には、導入された抗体に対して免疫反応が生じにくいという観点から、ヒト化抗体、ヒト抗体、及びこれら抗体の機能的断片が好ましい。
また、「前記基質タンパク質のリン酸化部位に対して結合活性を有する化合物」及び「前記キナーゼタンパク質に対して結合活性を有する化合物」は、前述の抗体による検出方法やバイオイメージング技術等において検出するために、標識物質が結合されていることが好ましい。標識物質は、用いる検出方法等の種類に合せて適宜選択されるが、例えば、放射性標識物質、蛍光性標識物質、常磁性標識物質、超常磁性標識物質、酵素標識物質が挙げられる。また、このような標識物質と前記分子との結合は直接的なものであってもよく、間接的なものであってもよい。間接的な結合としては、標識物質を結合させた二次抗体、標識物質を結合させたポリマー（プロテインＡ、プロテインＢ等）を介した結合が挙げられる。
本発明の薬剤は、前記化合物の他、薬理学上許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩が挙げられる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ−マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
本発明の診断薬をインビボにて使用する際の、被検体の体内への投与方法は、上述の＜アルツハイマー病を診断する方法＞に記載の通りである。また、本発明の診断薬の投与量及び投与回数は、当業者であれば、前記化合物の種類、被検体の体重等に応じて適宜調節することができ、投与回数は投与量、投与経路等に応じて適宜調節することができる。
本発明の診断薬の製品又はその説明書は、対象とする疾患を診断するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品又は説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装等に表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物等に表示を付したことを意味する。
＜アルツハイマー病診断薬候補化合物のスクリーニング方法＞
前述の通り、複数のアルツハイマー病モデルマウスにおいて、それらの発症前に、ＭＡＲＣＫＳ等の基質タンパク質のリン酸化が共通して亢進していることが明らかになった。さらに、これら基質タンパク質をリン酸化するキナーゼタンパク質は、アルツハイマー病モデルマウスにおいて、その発症前に活性化していることも明らかになった。したがって、かかる知見に基づき、本発明は、以下に示す２態様の、アルツハイマー病を診断するための候補化合物のスクリーニング方法を提供することができる。
（１） ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、ＳＰＲＭ２、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ、ＨＳ９０Ａ、ＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＧＰＲＩＮ１、ＡＣＯＮ、ＡＴＰＡ及びＡＴＰＢからなる群から選択される少なくとも１の基質タンパク質のリン酸化部位と、被験化合物とを接触させ、前記リン酸化部位と結合する化合物を選択する工程を含む方法。
（２） ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＣＳＫ、Ｌｙｎ及びｂ−ＲＡＦからなる群から選択される少なくとも１のキナーゼタンパク質と、被験化合物とを接触させ、前記キナーゼタンパク質と結合する化合物を選択する工程を含む方法。
本発明のスクリーニング方法において使用する被験化合物としては特に制限はなく、例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製又は部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物又は動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。
これらのスクリーニング方法において用いられる、ＭＡＲＣＫＳ等の基質タンパク質及びＰＫＣ等のキナーゼタンパク質は、上述の＜アルツハイマー病の診断薬＞に記載の通りであるが、キナーゼタンパク質に関しては、活性化キナーゼタンパク質であることが好ましい。また、結合の検出のし易さという観点から、これらタンパク質には、レポータータンパク質（例えば、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ）、精製用タグタンパク質（例えば、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグ）等が付加されていてもよい。さらに、これらタンパク質は部分ペプチドであってもよいが、前記基質タンパク質及び活性化キナーゼタンパク質に関しては、少なくともリン酸化部位を含んでいる必要がある。
また、これらタンパク質との結合の検出は、特に制限されることはなく、公知の手法を適宜選択して行うことができる。公知の手法としては、例えば、免疫共沈降法、ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴現象を利用した検出装置を用いた方法、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した方法が挙げられる。
＜アルツハイマー病治療薬１＞
後述の実施例において示す通り、複数のアルツハイマー病モデルマウスにおいて、それらの発症前に、ＭＡＲＣＫＳ等の基質タンパク質のリン酸化が共通して亢進していることが明らかになった。さらに、かかる基質タンパク質の発現をｓｈＲＮＡにより抑制することによって、アルツハイマー病モデルマウスにおける病変（スパイン形成の異常）を抑制できることも見出した。
したがって、本発明においては、ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、ＳＰＲＭ２、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ、ＨＳ９０Ａ、ＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＧＰＲＩＮ１、ＡＣＯＮ、ＡＴＰＡ及びＡＴＰＢからなる群から選択される少なくとも１の基質タンパク質のリン酸化を抑制する化合物を含有する、アルツハイマー病を治療するための薬剤が提供される（アルツハイマー病を治療するための薬剤のことを以下単に「治療薬」とも称する）。
本発明の治療薬の標的となるＭＡＲＣＫＳ等の基質タンパク質は、上述の＜アルツハイマー病の診断薬＞に記載の通りである。また、基質タンパク質のリン酸化の「抑制」とは、該リン酸化の完全な抑制（阻害）のみならず、部分的な抑制も含む意味である。
また、前記基質タンパク質のリン酸化の抑制は、当該基質タンパク質自体の発現を抑制することによっても達成し得る。したがって、「前記基質タンパク質のリン酸化を抑制する化合物」には「前記基質タンパク質の発現を抑制する化合物」も含まれる。
「前記基質タンパク質のリン酸化を抑制する化合物」としては特に制限はなく、公知の化合物であってもよく、後述のスクリーニングにより同定されるものであってもよい。このような化合物としては、例えば、前記基質タンパク質の被リン酸化部位に結合する抗体、前記基質タンパク質の被リン酸化部位に結合する低分子化合物、前記基質タンパク質をコードする遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ、前記基質タンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチドが挙げられる。抗体については＜アルツハイマー病の診断薬＞参照のこと。「タンパク質をコードする遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ」、「タンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチド」については後述を参照のこと。
なお、本発明において「被リン酸化部位」とは、前記基質タンパク質等のリン酸化され得るタンパク質において、リン酸化されるアミノ酸の前後１アミノ酸を含む少なくとも３アミノ酸からなる部位を意味する。
＜アルツハイマー病治療薬２＞
後述の実施例において示す通り、前記基質タンパク質をリン酸化するキナーゼタンパク質は、アルツハイマー病モデルマウスにおいて、その発症前に活性化していることも明らかになった。さらに、かかるキナーゼタンパク質に対する阻害剤を用い、該タンパク質の活性化を抑制することによって、アルツハイマー病モデルマウスにおける病変を抑制できることも見出した。
したがって、本発明においては、アルツハイマー病の治療薬の第２の態様として、ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＣＳＫ、Ｌｙｎ及びｂ−ＲＡＦからなる群から選択される少なくとも１のキナーゼタンパク質の活性又は発現を抑制する化合物を含有する薬剤も提供される。
本発明の治療薬の標的となるＰＫＣ等のキナーゼタンパク質は、上述の＜アルツハイマー病の診断薬＞に記載の通りである。また、キナーゼタンパク質の活性又は発現の「抑制」とは、該活性又は発現の完全な抑制（阻害）のみならず、部分的な抑制も含む意味である。
「前記キナーゼタンパク質の発現又は活性を抑制する化合物」としては特に制限はなく、公知の化合物であってもよく、後述のスクリーニングにより同定されるものであってもよい。このような化合物としては、例えば、前記キナーゼタンパク質に結合する低分子化合物、前記キナーゼタンパク質をコードする遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ、前記キナーゼタンパク質に対する抗体、前記キナーゼタンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチドが挙げられる。
前記低分子化合物として、ＰＫＣに関しては、例えば、Ｇｏ６９７６、ＵＣＮ−０１、ＢＡＹ４３−９００６、ＲＯ３１８２２０、ＲＯ３２０４３２、Ｉｓｉｓ３５２１、ＬＹ３３３５３１、ＬＹ３７９１９６、ビスインドリルマレイミド、スフィンゴシン、スタウロスポリン、ミドスタウリン、チルホスチン５１、ヒペリシン、エンザスタウリン、ロットレリン、サフィンゴール、ブリオスタチン１、ペリフォシン、ルルモフォシン等のＰＫＣ阻害剤が挙げられる。ＣａＭＫに関しては、例えば、ＫＮ−９３、ＫＮ−６２、ＡＩＰ、ＣａＭキナーゼIIインヒビター２８１−３０１、ラベンダスティンＣ、Ｋ２５２ａ、ロッテレリン、ＭＬ−７、ＭＬ−９、ＳＴＯ−６０９、Ｗ−７、Ｗ−５等のＣａＭＫ阻害剤が挙げられる。ＣＳＫに関しては、例えば、ＴＢＣＡ、ＩＱＡ、ＴＭＣＢ、キナリザリン、ケルセチン、アピゲニン等のＣＳＫ阻害剤が挙げられる。また、Ｌｙｎに関しては、例えば、ＩＮＮＯ−４０６（ＮＳ−１８７）が挙げられ、ｂ−ＲＡＦに関しては、例えば、ＰＬＸ−４７２０（Ｎ−［３−［（５−クロロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）カルボニル］−２，４−ジフルオロフェニル］−１−プロパンスルホンアミド）、ソラフェニブ（４−［４−［３−［４−クロロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル］ウレイド］フェノキシ］−Ｎ−メチルピリジン−２−カルボアミド）、ＧＤＣ−０８７９（２−｛４−［（１Ｅ）−１−（ヒドロキシイミノ）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−イル］−３−（ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル｝エタン−１−オル）、ベムラフェニブ（ＰＬＸ４０３２、ＲＧ７２０４、Ｎ−｛３−［５−（４−クロロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボニル］−２，４−ジフルオロフェニル｝プロパン−１−スルホンアミド）、ダブラフェニブ（Ｎ−［３−［５−（２−アミノピリジン−４−イル）−２−ｔｅｒｔ−ブチル−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル］−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミド）、ソラフェニブトシレート（４−（４−｛３−［４−クロロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル］ウレイド｝フェノキシ）−Ｎ２−メチルピリジン−２−カルボキサミドモノ（４−メチルベンゼンスルホネート）、ＬＧＸ８１８（メチル［（２Ｓ）−１−｛［４−（３−｛５−クロロ−２−フルオロ−３−［（メチルスルホニル）アミノ］フェニル｝−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−２−ピリミジニル］アミノ｝−２−プロパニル］カルバメート）等のｂ−ＲＡＦ阻害剤が挙げられる。
本発明における「タンパク質をコードする遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ」としては、前記基質タンパク質又は前記キナーゼタンパク質をコードする遺伝子の転写産物と相補的な、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｐｉｎ ＲＮＡ）等のｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡの鎖長としては、標的遺伝子の発現を抑制することができ、かつ、毒性を示さなければ特に制限はなく、例えば、１５〜４９塩基対であり、好適には１５〜３５塩基対であり、さらに好適には２１〜３０塩基対である。ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の塩基配列と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は、ＢＬＡＳＴプログラムにより決定することができる。
「タンパク質をコードする遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ」の他の態様としては、前記基質タンパク質又は前記キナーゼタンパク質をコードする遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡや該転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡ（リボザイム）も挙げられる。
以上のＲＮＡにおいては、その一部又は全部において、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＥＮＡ等の人工核酸によって、ＲＮＡが置換されているものであってもよい。また、これらＲＮＡに関しては、本発明の薬剤の投与対象内において発現させるべく、当該ＲＮＡをコードするＤＮＡを保持する発現ベクターの態様であってもよい。また、このようなＲＮＡは、当業者であれば、市販の合成機等を用い化学合成して調製することができる。
「タンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチド」としては、前記基質タンパク質であれば、キナーゼタンパク質による結合に関して、基質タンパク質上の結合部位と競合するようなポリペプチド（例えば、前記基質タンパク質の被リン酸化部位を含む部分ペプチド、デコイペプチド）等が挙げられる。また、前記キナーゼタンパク質であれば、該キナーゼタンパク質の活性化を競合的に阻害するポリペプチド（例えば、前記キナーゼタンパク質の被リン酸化部位を含む部分ペプチド）等が挙げられる。
＜アルツハイマー病治療薬３＞
前述の通り、ＭＡＲＣＫＳ等の基質タンパク質のリン酸化を抑制することによって、アルツハイマー病モデルマウスにおける病変を抑制できることが明らかになった。したがって、該リン酸化に必要なＭＡＲＣＫＳ等の基質タンパク質とＰＫＣ等のキナーゼタンパク質との結合を抑制しても、該病変を抑制できる。
かかる知見に基づき、本発明においては、アルツハイマー病の治療薬の第３の態様として、ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、ＳＰＲＭ２、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ、ＨＳ９０Ａ、ＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＧＰＲＩＮ１、ＡＣＯＮ、ＡＴＰＡ及びＡＴＰＢからなる群から選択される少なくとも１の基質タンパク質と、ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＣＳＫ、Ｌｙｎ及びｂ−ＲＡＦからなる群から選択される少なくとも１のキナーゼタンパク質との結合を抑制する化合物を含有する、薬剤も提供される。
本発明の治療薬の標的となるＭＡＲＣＫＳ等の基質タンパク質とＰＫＣ等のキナーゼタンパク質は、上述の＜アルツハイマー病の診断薬＞に記載の通りであるが、基質タンパク質はリン酸化されていないことが好ましく、キナーゼタンパク質は活性化キナーゼタンパク質であることが好ましい。また、これらタンパク質の結合の「抑制」とは、該結合の完全な抑制（阻害）のみならず、部分的な抑制も含む意味である。
「前記結合を抑制する化合物」としては特に制限はなく、公知の化合物であってもよく、後述のスクリーニングにより同定されるものであってもよい。このような化合物としては、例えば、前記基質タンパク質と前記キナーゼタンパク質との結合に関して、該基質タンパク質又は該キナーゼタンパク質における結合部位と競合するようなポリペプチド、抗体、低分子化合物が挙げられる。なお、本発明の低分子化合物には、低分子化合物の生理学的に許容される塩又は溶媒和物の態様も含まれる。
＜アルツハイマー病治療薬４＞
後述の実施例において示す通り、Ｌｙｎに関しては活性化することによっても、アルツハイマー病モデルマウスにおける病変を抑制できることが明らかになった。したがって、本発明においては、アルツハイマー病の治療薬として、Ｌｙｎを活性化する化合物を含有する薬剤も提供される。本発明の治療薬の標的となるＬｙｎは、上述の＜アルツハイマー病の診断薬＞に記載の通りである。
「Ｌｙｎを活性化する化合物」としては特に制限はなく、公知の化合物であってもよい。このような化合物としては、例えば、Ｌｙｎに結合する低分子化合物が挙げられ、より具体的には、国際公開第２００８／１０３６９２号に記載のＬｙｎキナーゼ活性化剤（ＭＬＲ−１０２３等）が挙げられる。
また、Ｌｙｎの発現量を増やすことによって、Ｌｙｎの活性を増大させることもできる。したがって、「Ｌｙｎを活性化する化合物」には、Ｌｙｎをコードする核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、該核酸がコードするＬｙｎを対象の細胞内にて発現させることが可能なＤＮＡ構築物（例えば、プラスミドＤＮＡ、ウィルスベクター）、Ｌｙｎタンパク質も含まれる。
以上、本発明の治療薬の好適な態様について説明したが、本発明の治療薬は、前記化合物の他、前記薬理学上許容される他の成分を、上述の診断薬同様含有してもよい。さらに、核酸又はタンパク質等を細胞に導入するための担体も、本発明の治療薬に含有されていてもよい。担体としては、カチオン性リポソーム等の正電荷を有する物質や、新油性物質（コレステロール及びその誘導体、脂質（例えば、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質等）、ビタミンＥ（トコフェロール）等のビタミン類）が挙げられる。また、本発明の治療薬は、アルツハイマー病の治療に用いられる公知の医薬品と併用してもよい。
本発明の治療薬の投与形態としては特に制限はなく、例えば、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気道内投与、直腸投与及び筋肉内投与、輸液による投与、標的部位（脳等）への直接投与が挙げられるが、治療効果が高く、また投与する薬剤の量が抑えられるという観点から、標的部位に直接投与することが好ましい。標的部位への投与は、例えば、カニューレ（カテーテル）、切開術、ドラッグデリバリーシステム、注射等を用いて行うことができ、より具体的には、定位脳手術方法によってカニューレ等を挿入し、当該カニューレを通じて薬剤を脳内に投与する方法、開頭し、薬剤を入れた徐放系ドラッグデリバリーシステム（例えば、ＡＬＺＥＴ社製の浸透圧ポンプ）を脳内に埋め込む方法、薬剤を電気穿孔法により脳内の細胞に導入する方法が挙げられる。また、本発明の薬剤を脳内に直接投与しない場合には、前記化合物に脳関門透過物質を結合させて投与する方法を利用してもよい。なお、脳関門透過物質としては、例えば、狂犬病ウィルス由来の２９アミノ酸からなる糖タンパク質（Ｎａｔｕｒｅ、２００７年７月５日、４４８巻、３９〜４３ページ 参照）が挙げられるが、これに制限されない。
本発明の治療薬の投与量及び投与回数は、前記化合物の種類、被検体の体重、症状等に応じて適宜調節することができ、投与回数は投与量、投与経路等に応じて適宜調節することができる。
本発明の治療薬の製品又はその説明書は、アルツハイマー病を治療するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。「製品又は説明書に表示を付した」とは、上述の＜アルツハイマー病の診断薬＞に記載の通りであるが、当該表示においては、本発明の薬剤を投与することによって、ＭＡＲＣＫＳ等の基質タンパク質のリン酸化の抑制を介し、スパイン形成の異常等が抑制され、アルツハイマー病の病変が改善される等の、本発明の薬剤の作用機序についての情報を含むことができる。
また、本発明は、前述の通り、前記化合物を対象に投与することにより、アルツハイマー病を治療することもできる。したがって、本発明は、ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、ＳＰＲＭ２、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ、ＨＳ９０Ａ、ＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＧＰＲＩＮ１、ＡＣＯＮ、ＡＴＰＡ及びＡＴＰＢからなる群から選択される少なくとも１の基質タンパク質のリン酸化を抑制する化合物、ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＣＳＫ、Ｌｙｎ及びｂ−ＲＡＦからなる群から選択される少なくとも１のキナーゼタンパク質の活性又は発現を抑制する化合物、ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、ＳＰＲＭ２、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ、ＨＳ９０Ａ、ＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＧＰＲＩＮ１、ＡＣＯＮ、ＡＴＰＡ及びＡＴＰＢからなる群から選択される少なくとも１の基質タンパク質と、ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＣＳＫ、Ｌｙｎ及びｂ−ＲＡＦからなる群から選択される少なくとも１のキナーゼタンパク質との結合を抑制する化合物、又は、Ｌｙｎを活性化する化合物を対象に投与することを特徴とする、アルツハイマー病を治療する方法をも提供するものである。
＜アルツハイマー病治療薬候補化合物のスクリーニング方法１＞
前述の通り、アルツハイマー病モデルマウスにおいて、ＭＡＲＣＫＳ等の基質タンパク質の発現抑制を介して、該タンパク質のリン酸化を抑制することにより、該マウスにおける病変を抑制できることを見出した。したがって、かかる知見に基づき、本発明においては、下記アルツハイマー病を治療するための候補化合物のスクリーニング方法も提供される。
（ｉ）ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、ＳＰＲＭ２、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ、ＨＳ９０Ａ、ＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＧＰＲＩＮ１、ＡＣＯＮ、ＡＴＰＡ及びＡＴＰＢからなる群から選択される少なくとも１の基質タンパク質のリン酸化を検出しうる系に、被験化合物を適用させる工程、並びに、
（ii）該基質タンパク質のリン酸化を抑制する化合物を選択する工程
を含む、方法。
このスクリーニング方法において用いられる「ＭＡＲＣＫＳ等の基質タンパク質」については、上述の＜アルツハイマー病診断薬候補化合物のスクリーニング方法＞に記載の通りであり、これらタンパク質は部分ペプチドであってもよいが、少なくとも被リン酸化部位を含んでいる必要がある。また、これらタンパク質は精製用タグタンパク質等の他のタンパク質が付加されていてもよい。
また、このスクリーニング方法において用いられる「被験化合物」としては特に制限はなく、例えば、上述の＜アルツハイマー病診断薬候補化合物のスクリーニング方法＞に記載の化合物が挙げられる。
「基質タンパク質のリン酸化を検出しうる系」としては特に制限はなく、例えば、ＭＡＲＣＫＳ等の基質タンパク質と、該基質タンパク質をリン酸化するキナーゼタンパク質（ＰＫＣ等）との混合溶液が挙げられる。そして、この混合溶液に、放射標識したリン酸塩を被験化合物と共に添加し、インキュベーションした後、該リン酸塩の該基質タンパク質への取り込みをシンチレーションカウンター、オートラジオグラフィー等によって検出する。そして、被験化合物の非存在下で検出した場合と比較して、被験化合物の存在下で検出される基質タンパク質へのリン酸塩の取り込み量が少なければ、該被験化合物は、基質タンパク質のリン酸化を抑制する化合物と評価され、アルツハイマー病を治療するための候補化合物として選択されることとなる。
また「基質タンパク質のリン酸化を検出しうる系」の他の態様としては、ＭＡＲＣＫＳ等の基質タンパク質のリン酸化を直接的に検出する系も挙げられる。当該系に関しては、基質タンパク質を発現する細胞又は該タンパク質を強制的に発現させた細胞に被験化合物を適用させ、前記細胞における基質タンパク質のリン酸化を検出する。そして、被験化合物の非存在下で検出した場合と比較して、検出されるリン酸化された基質タンパク質の量が低ければ、被験化合物は、基質タンパク質のリン酸化を抑制する化合物と評価される。基質タンパク質のリン酸化を直接的に検出する場合には、上述の＜アルツハイマー病を診断する方法１＞同様に、基質タンパク質のリン酸化部位に特異的に結合する抗体による検出方法、基質タンパク質のリン酸化部位に特異的に結合する化合物を固定化した金属薄膜を用いる、表面プラズモン共鳴現象を利用した検出装置を利用する方法等が好適に用いられる。
＜アルツハイマー病治療薬候補化合物のスクリーニング方法２＞
前述の通り、アルツハイマー病モデルマウスにおいて、ＰＫＣ等のキナーゼタンパク質の活性化を抑制しても、該マウスにおける病変を抑制できることを見出した。したがって、かかる知見に基づき、本発明においては、アルツハイマー病を治療するための候補化合物のスクリーニング方法の第２の態様として、下記方法も提供される。
（ｉ）ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＣＳＫ、Ｌｙｎ及びｂ−ＲＡＦからなる群から選択される少なくとも１のキナーゼタンパク質の活性又は発現を検出しうる系に、被験化合物を適用させる工程、並びに、
（ii）該タンパク質の活性又は発現を抑制する化合物を選択する工程
を含む、方法。
このスクリーニング方法において用いられる「ＰＫＣ等のキナーゼタンパク質」については、上述の＜アルツハイマー病の診断方法＞と同じく、上記典型例として挙げているアミノ酸配列からなるタンパク質に各々限定されず、自然界において生じ得る変異体も標的となる。
「ＰＫＣ等のキナーゼタンパク質の活性を検出しうる系」としては、該キナーゼタンパク質の活性、すなわち基質タンパク質のリン酸化を検出できる系であればよく、前述の＜アルツハイマー病治療薬候補化合物のスクリーニング方法１＞に記載の系が好適に用いられる。また、基質タンパク質のリン酸化にはキナーゼタンパク質自体の活性化（リン酸化等）が必要であるため、「ＰＫＣ等のキナーゼタンパク質のリン酸化を検出しうる系」を用いてもよい。なお、当該系は、前述の「基質タンパク質のリン酸化を検出しうる系」において、ＭＡＲＣＫＳ等の基質タンパク質の代わりに、ＰＫＣ等のキナーゼタンパク質を用いることで構築される。
「ＰＫＣ等のキナーゼタンパク質の発現を検出しうる系」としては、例えば、各キナーゼタンパク質をコードする遺伝子のプロモータ―領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞又はその細胞からの抽出液が挙げられる。ここで「機能的に結合した」とは、各遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、各遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。そして、当該系に被験化合物を適用させ、レポーター遺伝子がコードするタンパク質の活性を測定し、被験化合物の非存在下で検出した場合と比較して、検出される当該活性が低ければ、被験化合物は、各キナーゼタンパク質の発現を抑制する活性を有すると評価されることになる。
「ＰＫＣ等のキナーゼタンパク質の発現を検出しうる系」の他の態様としては、前記レポーター系以外に、ＰＫＣ等のキナーゼタンパク質の発現を直接的に検出する系も挙げられる。当該系に関しては、各タンパク質を発現する細胞に被験化合物を適用させ、前記細胞における各タンパク質の発現を検出する。そして、被験化合物の非存在下で検出した場合と比較して、検出される各タンパク質の発現量が低ければ、被験化合物は、タンパク質の発現を抑制する活性を有すると評価されることになる。タンパク質の発現の検出に関し、タンパク質自体の発現を検出する場合には、上述の＜アルツハイマー病を診断する方法２＞同様に、キナーゼタンパク質（好ましくは、活性化キナーゼタンパク質）に特異的に結合する抗体による検出方法、キナーゼタンパク質（好ましくは、活性化キナーゼタンパク質）に特異的に結合する化合物を固定化した金属薄膜を用いる、表面プラズモン共鳴現象を利用した検出装置を利用する方法等が好適に用いられる。また、キナーゼタンパク質の発現を転写レベルの遺伝子発現を通して検出する場合には、ノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ドットブロッティング法等を用いることができる。
＜アルツハイマー病治療薬候補化合物のスクリーニング方法３＞
前述の通り、ＭＡＲＣＫＳ等の基質タンパク質のリン酸化を抑制することによって、アルツハイマー病モデルマウスにおける病変を抑制できることが明らかになった。したがって、該リン酸化に必要なＭＡＲＣＫＳ等の基質タンパク質とＰＫＣ等のキナーゼタンパク質との結合を抑制しても、該病変を抑制できる。
かかる知見に基づき、本発明においては、アルツハイマー病を治療するための候補化合物のスクリーニング方法の第３の態様として、下記方法も提供される。
下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、アルツハイマー病を治療するための候補化合物のスクリーニング方法
（ａ）被験化合物の存在下で、ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＣＳＫ、Ｌｙｎ及びｂ−ＲＡＦからなる群から選択される少なくとも１のキナーゼタンパク質と、ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、ＳＰＲＭ２、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ、ＨＳ９０Ａ、ＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＧＰＲＩＮ１、ＡＣＯＮ、ＡＴＰＡ及びＡＴＰＢからなる群から選択される少なくとも１の基質タンパク質とを接触させる工程、
（ｂ）前記キナーゼタンパク質と前記基質タンパク質との結合を検出する工程、
（ｃ）前記結合を抑制する化合物を選択する工程。
このスクリーニング方法において用いられる、「ＰＫＣ等のキナーゼタンパク質」、「ＭＡＲＣＫＳ等の基質タンパク質」及び「被験化合物」は、上述の＜アルツハイマー病診断薬候補化合物のスクリーニング方法＞に関する記載の通りであるが、基質タンパク質はリン酸化されていないことが好ましく、キナーゼタンパク質は活性化キナーゼタンパク質であることが好ましい。
（ａ）の工程において、キナーゼタンパク質と基質タンパク質とを被験化合物存在下で接触させるが、接触は、被験化合物の非存在下において当該結合が抑制されない条件下で行われればよい。
（ｂ）の工程において、キナーゼタンパク質と基質タンパク質との結合を検出するが、この結合の検出は特に制限されることはなく、公知の手法を適宜採用することができる。例えば、免疫共沈降法、ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴現象を利用した検出装置を用いた方法、ＦＲＥＴを利用した方法を採用することができる。
（ｃ）の工程において、前記結合を抑制する化合物を選択するが、例えば、免疫共沈降法を用いた場合においては、被験化合物の存在下で、キナーゼタンパク質をその特異的な抗体によって沈降させた際に共沈してくる基質タンパク質の量と、被験化合物の非存在下における基質タンパク質の量（対照値）とを比較することにより評価することができる。すなわち、被験化合物の存在下における基質タンパク質の量が被験化合物の非存在下における量と比較して低い場合には、該被験化合物を、アルツハイマー病を治療するための候補化合物と評価することができる。前記結合の検出において免疫沈降法以外の方法を用いる場合も同様に、被験化合物非存在下における前記結合の程度を対照値として用いて評価することができる。
以上、本発明のアルツハイマー病を治療するための候補化合物のスクリーニング方法について好適な態様を説明したが、本発明のスクリーニング方法においては、上述の方法によって選択された化合物をアルツハイマー病モデル動物に投与し、そのモデル動物の症状の回復を指標として、候補化合物をさらに絞り込むこともできる。
「アルツハイマー病モデル動物」としては、後述の実施例に示すように、例えば、アルツハイマー病の原因遺伝子（ＰＳ１のエクソン９欠損体、ＰＳ２変異体（Ｎ１４１Ｉ）、ヒト二重変異体ＡＰＰ６９５（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ、スウェーデンタイプ）、五重変異体（スウェーデンタイプ（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ）、フロリダタイプ（Ｉ７１６Ｖ）及びロンドンタイプ（Ｖ７１７Ｉ）のヒトＡＰＰ６９５三重変異体、並びにヒトＰＳ１二重変異体（Ｍ１４６Ｌ及びＬ２８５Ｖ））、ヒトｔａｕ変異体、又はこれら変異体の組み合わせ等）を導入した動物（マウス、ラット、マーモセット等）が挙げられる。
「モデル動物の症状の回復」は、後述の実施例に示すように、例えば、アルツハイマー病において生じるスパイン形成の異常の回復の程度を、２光子顕微鏡を介したインビボイメージングにて検出することによって行うことができる。また、後述の実施例に示す行動試験に供し、モデル動物の行動異常の回復の程度を評価することによってもできる。
以上、本発明における、アルツハイマー病の診断方法、診断薬及び治療薬、並びにこれら薬剤の候補化合物をスクリーニングする方法等の好適な実施形態について説明したが、以下にて、前頭側頭葉変性症の診断薬及び治療薬等に関し、説明する。
＜前頭側頭葉変性症を診断する方法＞
後述の実施例において示す通り、ｔａｕタンパク質等の基質タンパク質をリン酸化するキナーゼタンパク質 ｂ−ＲＡＦタンパク質は、前頭側頭葉変性症モデルマウスにおいて、その発症前に活性化していることが明らかになった。したがって、本発明においては、前頭側頭葉変性症の診断方法として、下記工程（ｉ）〜（iii）を含む方法も提供される。
（ｉ）被検体において、ｂ−ＲＡＦタンパク質の活性又は発現を検出する工程、
（ii）該活性又は発現と、正常検体におけるｂ−ＲＡＦタンパク質の活性又は発現とを比較する工程、及び、
（iii）該比較の結果、前記被検体におけるｂ−ＲＡＦタンパク質の活性又は発現が、前記正常検体におけるｂ−ＲＡＦタンパク質の活性又は発現よりも高い場合、前記被検体は前頭側頭葉変性症を罹患している、または前頭側頭葉変性症を発症する危険性を有していると判定する工程
を含む、方法。
当該診断方法は、上述の＜アルツハイマー病の診断方法＞と同様の方法であり、検出の対象となる「活性化キナーゼタンパク質」としても上記同様に、３６５位のセリンがリン酸化されているｂ−ＲＡＦ、４４６位のセリンがリン酸化されているｂ−ＲＡＦ、５７９位のセリンがリン酸化されているｂ−ＲＡＦ、５９９位のスレオニンがリン酸化されているｂ−ＲＡＦ、６０２位のセリンがリン酸化されているｂ−ＲＡＦ、７２９位のセリンがリン酸化されているｂ−ＲＡＦ、７３２位のセリンがリン酸化されているｂ−ＲＡＦが挙げられるが、前頭側頭葉変性症を罹患している又は発症する危険性を有している検体と正常検体との差がより大きいという観点から、本発明の前頭側頭葉変性症の診断方法においては、３６５位のセリンがリン酸化されているｂ−ＲＡＦ、７２９位のセリンがリン酸化されているｂ−ＲＡＦ、７３２位のセリンがリン酸化されているｂ−ＲＡＦが検出の対象として好ましく、７２９位のセリンがリン酸化されているｂ−ＲＡＦが検出の対象としてより好ましい。
また、本発明によれば、前頭側頭葉変性症を罹患している、または前頭側頭葉変性症を発症する危険性を有していると判定することができる。このように、前頭側頭葉変性症の罹患等を早期に判断できれば、前頭側頭葉変性症の病変を抑えるための治療方法（前頭側頭葉変性症の病変を抑えるための薬剤を投与する方法等）の奏効が期待できる。
したがって、本発明は、上述の＜アルツハイマー病の診断方法＞同様に、本発明の診断方法により前頭側頭葉変性症を罹患している、または前頭側頭葉変性症を発症する危険性を有していると判定された被検体に、前頭側頭葉変性症の病変を抑えるための薬剤を投与する工程を含む、前頭側頭葉変性症の治療方法を提供することもできる。
また、前頭側頭葉変性症の病変を抑えるために投与される薬剤としては、例えば、セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、コリンエステラーゼ阻害剤（ＣｈＥＩ）、ｔａｕの凝集を抑制するための薬剤（アミノチエノピリダジン、シアニン色素、メチレンブルー等）、神経保護薬（ジメボン等）が挙げられる。
さらに、後述の通り、ｂ−ＲＡＦタンパク質の活性又は発現を抑制する化合物を含有する、前頭側頭葉変性症を治療するための薬剤も、前頭側頭葉変性症の病変を抑えるための薬剤として好適に用いることができる。
＜前頭側頭葉変性症の診断薬＞
前述の通り、ｔａｕタンパク質等の基質タンパク質をリン酸化するキナーゼタンパク質ｂ−ＲＡＦは、その発症前に活性化していることが明らかになった。したがって、本発明においては、ｂ−ＲＡＦに対して結合活性を有する化合物を含有する、前頭側頭葉変性症を診断するための薬剤が提供される。
本発明の前頭側頭葉変性症の診断薬の標的となるｂ−ＲＡＦタンパク質は、前述の＜アルツハイマー病の診断方法＞と同じく、上記典型例として挙げているアミノ酸配列からなるタンパク質に各々限定されず、自然界において生じ得る変異体も標的となる。また、「ｂ−ＲＡＦに対して結合活性を有する化合物」としては特に制限はなく、上述の＜アルツハイマー病の診断薬＞に記載の化合物を同様に用いることができる。
＜前頭側頭葉変性症の治療薬＞
後述の実施例において示す通り、ｔａｕタンパク質等の基質タンパク質ををリン酸化するｂ−ＲＡＦタンパク質は、前頭側頭葉変性症モデルマウスにおいて、その発症前に活性化していることも明らかになった。さらに、ｂ−ＲＡＦタンパク質に対する阻害剤を用い、該タンパク質の活性化を抑制することによって、前頭側頭葉変性症モデルマウスにおける病変を抑制できることも見出した。
したがって、本発明においては、前頭側頭葉変性症の治療薬として、ｂ−ＲＡＦの活性又は発現を抑制する化合物を含有する薬剤も提供される。
本発明の前頭側頭葉変性症治療薬は、上述の＜アルツハイマー病治療薬＞と同様であり、また、標的となるｂ−ＲＡＦタンパク質は、上述の＜前頭側頭葉変性症の診断薬＞に記載の通りである。
本発明の前頭側頭葉変性症治療薬の製品又はその説明書は、上述の＜アルツハイマー病治療薬＞と同様に、前頭側頭葉変性症治療薬を治療するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。「製品又は説明書に表示を付した」とは、上述の＜アルツハイマー病の診断薬＞に記載の通りであるが、当該表示においては、本発明の薬剤を投与することによって、ｂ−ＲＡＦの活性の抑制を介し、スパイン数の低減等が抑制され、前頭側頭葉変性症の病変が改善される等の、本発明の薬剤の作用機序についての情報を含むことができる。
また、本発明は、前述の通り、前記化合物を対象に投与することにより、前頭側頭葉変性症を治療することもできる。したがって、本発明は、ｂ−ＲＡＦの活性又は発現を抑制する化合物を対象に投与することを特徴とする、前頭側頭葉変性症を治療する方法をも提供するものである。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
―アルツハイマー病―
本実施例においては、先ず、アルツハイマー病の発症の前段階において中心的な役割を担っているリン酸化タンパク質、キナーゼタンパク質、及びそれらタンパク質から構成されるネットワークを同定し、ひいてはアルツハイマー病の診断及び治療に有用な標的分子を提供するために、以下に示す実験方法等を行った。
＜モデルマウスを用いた実験＞
本実施例において用いたアルツハイマー病モデルマウスは、以下の５種類である。
（１）ＰＳ１トランスジェニックマウス（マウスＰｒＰプロモーター制御下にてエクソン９欠損体（ＰＳＥＮ１ｄＥ９）を発現しているマウス、Ｊａｎｋｏｗｓｋｙ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、２００４年、１３巻、１５９〜１７０ページ 参照）
（２）ＰＳ２トランスジェニックマウス（ユビキタスＣＭＶ初期エンハンサー及びニワトリβアクチンプロモーター制御下にてヒトＰＳ２変異体（Ｎ１４１Ｉ）を発現しているマウス、Ｏｙａｍａ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、１９９８年、７１巻、３１３〜３２２ページ 参照）
（３）ヒト二重変異体ＡＰＰ６９５（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ、スウェーデンタイプ）トランスジェニックマウス（このマウスは、ハムスターＰｒＰコスミドベクター中のＰｒＰ遺伝子をその変異体に置き換えて調製した（Ｈｓｉａｏ，Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９６年、２７４巻、９９〜１０２ページ 参照））
（４）５×ＦＡＤマウス（スウェーデンタイプ（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ）、フロリダタイプ（Ｉ７１６Ｖ）及びロンドンタイプ（Ｖ７１７Ｉ）の三重変異を有するヒトＡＰＰ６９５と、二重変異（Ｍ１４６Ｌ及びＬ２８５Ｖ）を有するヒトＰＳ１とが、マウスＴｈｙ１制御下にて発現しているトランスジェニックマウス）（Ｏａｋｌｅｙ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２００６年、２６巻、１０１２９〜１０１４０ページ 参照）
（５）マウスＰｒＰプロモーター制御下にて、ヒトｔａｕ変異タンパク質が発現しているトランスジェニックマウス（Ｙｏｓｈｉｙａｍａ，Ｙ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ、２００７年、５３巻、３３７〜３５１ページ 参照）。
なお、各々のトランスジェニックマウスの遺伝的背景は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７／Ｂ６ＸＳＪＬ、Ｃ５７／Ｂ６ＸＳＪＬ及びＢ６Ｃ３Ｈ／Ｆ１である。
後述の質量分析においては、各図及びその説明に示した月齢にて、上記トランスジェニックマウス等の雄から脳組織を単離し、分析に供した。
免疫組織化学解析においては、脳サンプルを４％パラホルムアルデヒドにて固定し、ミクロトーム（大和光気工業株式会社製）を用いてパラフィン切片（各切片の厚さ：５μｍ）を調製した。また、一次抗体としては、以下に記載の抗体を１０００分の１に各々希釈して用いた。
抗Ａβ抗体（８２Ｅ１）、ＩＢＬ社製、コード番号：１０３２３
抗Ａβ抗体（６Ｅ１０）、Ｃｏｖａｎｃｅ社製、商品コード：ＳＩＧ−３９３００
抗ヒトＰＨＦ−ｔａｕ抗体（ＡＴ−８）、Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ社製、カタログ番号：ＢＲ−０３。
そして、各抗体と反応させた組織サンプルを、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット及びＤＡＢペルオキシダーゼ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ，社製）にて処理し、各抗体が認識するタンパク質の発現を視覚化した。
また、図には示さないが、上記トランスジェニックマウス等の雄を、以下の６種の行動試験に供し、検出される行動異常を指標に、これらマウスにおけるアルツハイマー病の発症の有無等を評価した。
（１）モリス水迷路試験
この試験においては、５日間、マウスに６０秒の試行を１日当たり４回受けさせ、プラットフォームに達するまでの時間を測定した。
（２）ロータロッド試験
この試験においては、３日間、速度を徐々にあげながら回転するロッド（回転速度：３．５〜３５ｒｐｍ）にマウスをつかまらせる試行を１日当たり４回実施し、回転するロッドから落ちるまでの平均時間を記録した。
（３）恐怖条件付け試験
この試験においては、先ず、音刺激（６５ｄＢホワイトノイズ、３０秒）と共に足に電気刺激（０．４ｍＡ、２秒）をマウスに与えた。そして、その２４時間後に、同チャンバーにて電気刺激を与えることなく音刺激を与えた際の、当該マウスのフリージング反応の頻度を測定した。
（４）オープンフィールド試験
この試験においては、オープンフィールドの中央領域にマウスが留まる時間を測定した。
（５）明暗ボックス試験
この試験においては、明るいボックス側に留まる時間を測定した。
（６）高架式十字迷路試験
この試験においては、床から６０ｃｍのところに設置した高架式十字迷路において、マウスが壁のない走行路に留まる時間を測定した。
＜ヒトの脳＞
後述のプロテオーム解析のため、ＡＤ（アルツハイマー病）患者、ＤＬＢ（レビー小体型認知症）患者及び健常対照者から、脳サンプルを単離し、死後１時間以内に−８０℃にて冷凍した。また、各グループ５つの脳から、側頭極及び後頭極の組織を解離した。
なお、各脳サンプルについては、免疫組織化学に基づき、神経病理学者が病理学的診断を行った。その結果、ＡＤ患者の脳において、レビー小体、ＴＤＰ４３の細胞質における凝集、嗜銀性グレインといった他の病変は確認されなかった。また、ＤＬＢ患者の脳においては、その疾患特異的な病理学所見が確認された。
＜リン酸化タンパク質及びリン酸化ペプチドの調製＞
上記トランスジェニックマウス等から、リン酸化タンパク質及びリン酸化ペプチドを調製するにあたり、先ず、エチルエーテルを用いてマウスを安楽死させ、その５分以内に大脳皮質を回収した。得られた大脳皮質を液体窒素にて直ちに凍結し、リン酸化タンパク質を抽出するまで保存した。タンパク質の抽出においては、先ず、２％ＳＤＳ、１ｍＭＤＴＴ及び１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含有する***解バッファーにて皮質組織を溶解し、氷上にて、ガラス製ダウンス型ホモジェナイザーを用い、２０回ストーロークし、細胞を破砕した。組織に対する溶解バッファーの比率は、１ｍｇに対して１０μＬである。細胞を破砕した後、溶解物を１００℃にて１５分間インキュベーションした。そして、４℃、１６０００×ｇにて１０分間遠心をかけることにより、粗抽出物を得た。回収した上清を水にて１０分の１の濃度になるよう希釈し、孔径０．２２μｍのフィルターに通し、濾過した。得られた素通り画分を、アミコンウルトラ３Ｋフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて、１０倍の濃度になるよう濃縮した。また、このように調製したタンパク質の濃度は、ＢＣＡタンパク質定量用試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．製）を用いて測定した。
そして、１５ｍｇのタンパク質を含むサンプルアリコート（２００μＬ）に、１００μＬ １Ｍ 重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）（ｐＨ８．５）、３μＬ １０％ＳＤＳ及び３０μＬ ５０ｍＭ トリス−２−カルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）からなる溶液を添加し、６０℃にて１時間インキュベーションした。また、システイン残基を保護するため、１０ｍＭ メチルメタンチオスルホネート（ＭＭＴＳ）を添加し、２５℃にて１０分間処理した。次いで、得られたサンプルを、３７℃、２４時間、８０ｍＭ ＣａＣｌ２、トリプシン（質量分析グレード）（１０：１ タンパク質／酵素、ｗ／ｗ）にて処理した。そして、リン酸化ペプチドを、チタンスフィア（登録商標）フォス−チオキット（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．製）を用い、使用説明書に従って濃縮し、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｌｉｇｈｔ Ｃ１８カートリッジカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用い、使用説明書に従って脱塩した。サンプルアリコートは、乾燥させた後、２５μＬ １００ｍＭ ＴＥＡＢ（ｐＨ８．５）に溶解した。また、個々のサンプルにおけるリン酸化ペプチドは、ｉＴＲＡＱ（登録商標）マルチプレックス解析キット（ＡＢ ＳＣＩＥＸ Ｉｎｓ．製）を用い、２５℃にて２時間かけ、使用説明書に従って別々に標識した。そして、標識したリン酸化ペプチドのプールを混合した。得られたアリコートは、乾燥させた後、１ｍＬ ０．１％ギ酸に再溶解した。
＜２Ｄ ＬＣ ＭＳ／ＭＳ解析＞
前述の通りに標識したリン酸化ペプチドサンプルは、ＴＳＫゲルＳＰ−５ＰＷカラム（ＴＯＳＯＨ社製）及びプロミネンスＵＦＬＣシステム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）を用いた、強カチオン交換（ＳＣＸ）クロマトグラフィーに供した。なお、Ａ溶液（１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ３．０）、２５％アセトニトリル）の流速は１０ｍＬ／分とした。そして、Ｂ溶液（１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ３．０）、２５％アセトニトリル、１Ｍ ＫＣｌ）を用い、０〜５０％の勾配範囲にて溶出を行った。回収した溶出画分は、乾燥させた後、１００μＬ ０．１％ギ酸に再溶解した。
そして、このようにして調製した各画分は、ＤｉＮａナノ−フローＬＣシステム（ＫＹＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）及びトリプルＴＯＦ ５６００システム（ＡＢ ＳＣＩＥＸ Ｉｎｓ．製）を用いて解析した。液体クロマトグラフィーにおいては、サンプルを、Ｃ溶液（２％アセトニトリル及び０．１％ギ酸）と共に０．１ｍｍｘ１００ｍｍ Ｃ１８カラムにロードし、Ｄ溶液（８０％アセトニトリル及び０．１％ギ酸）を用い、０〜５０％の勾配範囲にて溶出を行った。なお、流速は３００ｎＬ／分とし、イオンスプレー圧は２．３ｋＶとした。情報依存収集（ＩＤＡ）は、４００〜１２５０ｍ／ｚ、荷電数２〜５の範囲にて行った。また、各ペプチドを同定するため、アナリストＴＦ１．５ソフトウェア（ＡＢ ＳＣＩＥＸ Ｉｎｓ．製）を用いた。さらに、各ペプチドは、ＬＣ−分離ペプチドピークにおいて検出されたＴＯＦ−ＭＳ電流に基づき、荷電／ペプチドの比率に合わせ、定量した。また、得られたシグナルは、アナリストＴＦ（バージョン１．５）（ＡＢ ＳＣＩＥＸ Ｉｎｓ．製）を用いて解析した。そして、プロテインパイロットソフトウェア（バージョン４）にて処理した。
＜データ解析＞
前述の通り、２Ｄ ＬＣ ＭＳ／ＭＳ解析において、ペプチドの質量スペクトルの収集及び解析は、アナリストＴＦ（バージョン１．５）（ＡＢ ＳＣＩＥＸ Ｉｎｓ．製）を用いて行った。そして、得られた結果に基づき、ヒト及びマウスのタンパク質配列データベース（ユニプロットＫＢ／スイス−プロット、２０１０年６月２２日にユニプロット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）よりダウンロードしたデータから、前述の通り、パラゴンアルゴリズムを備えたプロテインパイロットソフトウェア（バージョン４）（ＡＢ ＳＣＩＥＸ Ｉｎｓ．製、Ｓｈｉｌｏｖ， Ｉ． Ｖ．ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００７年、６巻、１６３８〜１６５５ページ 参照）を用い、対応するタンパク質を探索した。なお、プロテインパイロットによるペプチド探索における許容度は、ＭＳ解析においては０．０５Ｄａ、ＭＳ／ＭＳ解析においては０．１０Ｄａとした。また、プロテインパイロットにおいて、「リン酸化重視（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｅｍｐｈａｓｉｓ）」を、サンプルの詳細に設定し、「生物学的修飾（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）」を、処理仕様に設定した。また、ペプチド同定における質を評価するため、信頼スコアを利用した。さらに、同定したタンパク質は、冗長性を排除するため、ＰｒｏＧｒｏｕｐアルゴリズム（ＡＢ ＳＣＩＥＸ Ｉｎｓ．製）にてグループ分けした。また、プロテインパイロットにおいて、タンパク質検出の閾値は９５％の信頼度に設定した。そして、信頼度が９５％以上である場合にタンパク質が同定できたと判断した。
また、質量分析計におけるフラグメンテーションに応じ、ＭＳ／ＭＳスペクトルを作製した。さらに、該ＭＳ／ＭＳスペクトルにおけるｉＴＲＡＱレポーターグループ解析を介して、タンパク質の定量化を行った。ペプチド及びタンパク質の定量においては、異なるｉＴＲＡＱレポーターのシグナルを標準化するため、バイアス補正オプションを用いた。また、ペプチドの比率、ＡＤ患者におけるレポーターシグナルと対照サンプルのそれとの比率を、バイアス補正後に算出した。タンパク質の比率（平均比率）は、タンパク質に対応するペプチドの比率の加重平均値から推定した。また、その推定においては、バイアス補正後、エラー因子に基づき、異なる重み付けがされたペプチド比率を用いた。なお、これら値を算出するための詳細な式は、ＡＢＳＣＩＥＸのマニュアルに記載したものを使用した。また、ペプチドの比率を用い、ＡＤ患者におけるタンパク質量と対照サンプルのそれとを比較した。スチューデントｔ値は、ｌｏｇペプチドの比率の加重平均値、それの標準誤差及びｌｏｇバイアスから算出した。また、多重仮設検定の問題を排除するため、プロテインパイロットにおけるポストホック検定と共にＰ値を算出した。この検定により得られた３サンプルのＰ値を、逆正規法により統合した。そして、統合Ｐ値が０．０５より小さい場合に、タンパク質のリン酸化は変化していると判断した。
プロテインパイロットにおけるペプチドサマリー及びタンパク質サマリーは、更なるデータ解析のため、エクセルに組み込んだ。また、リン酸化部位を含む多重ＭＳ／ＭＳフラグメントに由来するシグナル強度の幾何平均値を、リン酸化ペプチド断片の量として算出した。また、ＡＤ患者グループと対照グループとの差は、スチューデントｔ検定にて評価した（ｎ＝３）。そして、異なるＡＤモデル間において、変化したリン酸化タンパク質を比較し、仮説のないアプローチ又はＡβ凝集と関連付けるアプローチにおいて共通して変化しているタンパク質を選択した。
＜システム生物学＞
ヒトの脳の後頭葉及び側頭葉において発現しているタンパク質を同定するため、プロテインパイロットソフトウェアを使用した（Ｓｈｉｌｏｖ，Ｉ．Ｖ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００７年、６巻、１６３８〜１６５５ページ 参照）。すなわち、プロテインパイロットにより、実測された各タンパク質にユニプロットＩＤを自動的に付与した。そして、実測された各タンパク質において、共通するホモロジーングループＩＤに属するタンパク質を探索し、収集したタンパク質のタクソノミーＩＤ及びジーンＩＤを得た。なお、タクソノミーＩＤは、ヒトに関しては９６０６個、マウスに関しては１００９０個、ラットに関しては１０１１６個に限られていた。また、新たに追加したタンパク質のユニプロットＩＤも、添付した。次いで、収集したタンパク質のリストから、ＧＮＰデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅｎｅｔｗｏｒｋ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ＿ｅ．ｈｔｍｌ）にないユニプロットＩＤを有するタンパク質を除外した。そして、東京大学のヒトゲノム解析センターのスーパーコンピューターシステムを利用し、ＧＮＰから収集した情報をデータベース化した。その結果、残存タンパク質を解析したタンパク質であると判断した。またＧＮＰデータベースにおいて、解析したタンパク質に結合するタンパク質を探索し、エッジファイルを作製した（冗長なエッジは除外した）。作製したエッジファイルに基づき、タンパク質ネットワークを得、それをセルイラストレーターにて視覚化した（Ｎａｇａｓａｋｉ，Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２００３年、２巻、１８１〜１８４ページ 参照）。
＜２光子顕微鏡を介したインビボイメージング＞
樹状突起スパインの２光子イメージングは、正立顕微鏡（ＢＸ６１ＷＩ、Ｏｌｙｍｐｕｓ社製、水浸対物レンズ（ＸＬＰｌａｎＮ２５ｘＷ；開口数，１．０５）及びパルスレーザー（ＭａｉＴａｉ ＨＰ ＤｅｅｐＳｅｅ、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃｓ社製）を備えた走査型レーザー顕微鏡システムＦＶ１０００ＭＰＥ２（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）を用いて行った。イメージングにおいて、ＥＧＦＰは８９０ｎｍの波長の光にて励起し、５００〜５５０ｎｍの範囲にてスキャンした。また、三次元イメージングのためにスキャンした領域は、１００×１００μｍ（１μｍ Ｚ軸ステップ、１０２４×１０２４ピクセル）である。
また、イメージングの２週間前に、シナプシン１プロモーターを有するアデノ随伴ウィルス１（ＡＡＶ１）−ＥＧＦＰ（力価：１×１０１０ベクターゲノム／ｍＬ、１μＬ）を、２．５％イソフルランにて麻酔したマウスの膨大後部皮質（ブレグマより前後方向に−２．０ｍｍ及び中外側に０．６ｍｍ、深さ１ｍｍ）に注入した。そして、その２週間後に、大脳皮質第１層（レイヤー１）の樹状突起スパインは、「Ｙａｎｇ，Ｇ．ら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．、２０１０年、５巻、２０１〜２０８ページ」に記載の方法に沿って、薄削頭蓋骨観察窓を通して観察した。
また、キナーゼ阻害による樹状突起スパインへの影響をイメージングした際には、１μＭ Ｇｏ６９７６（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）、０．４ｍＭ ＫＮ−９３（Ｃａｙｍａｎ社製）又は１μＭ ＭＬＲ１０２３（Ｇｌｉｘｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）含有ＰＢＳ／１％ＤＭＳＯにて充填したＡｌｚｅｔマイクロ浸透圧ポンプ（モデル：１００３Ｄ、Ｄｕｒｅｃｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）、Ｏ２／イソフルランにて麻酔したマウスに埋め込んだ。そして、浸透圧ポンプを埋め込んでから３０時間又は６０時間経過後に、樹状突起スパインを観察した。なお、ＰＫＣの阻害剤であるＧｏ６９７６については、Ｙａｎ，Ｚ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９９年、９６巻、１１６０７〜１１６１２ページ 参照のこと。ＣａＭＫの阻害剤であるＫＮ−９３については、Ｇａｌａｎ，Ａ．ら、Ｐａｉｎ．、２００４年、１１２巻、３１５〜３２３ページ 参照のこと。Ｌｙｎの活性化剤であるＭＬＲ１０２３については、Ｓａｐｏｒｉｔｏ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、２０１２年、３４２巻、１５〜２２ページ 参照のこと。
また、ｓｈＲＮＡレンチウィルスベクター導入による樹状突起スパインへの影響をイメージングした際には、ＭＡＲＣＫＳに対するｓｈＲＮＡをコードするレンチウィルスベクター（ｓｃ−３５８５８−Ｖ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製、１ｘ１０６ＴＵ）又はスクランブルｓｈＲＮＡ（ＲＨＳ４３４８、１ｘ１０６ＴＵ）３μＬを、前記ＡＡＶ１−ＥＧＦＰと同じ領域に注入した。
また、スパインの密度、スパインの長さ、スパインの最大径及びスパインネックの最小径は、得られた画像より、画像解析ソフトウェアＩＭＡＲＩＳ７．２．２（Ｂｉｔｐｌａｎｅ社製）を用いて測定した。
＜統計解析＞
疾患モデルマウス又はヒト患者の質量分析データは、逆正規法により、各々バックグランドマウス又はヒトの対照サンプルのデータと比較して評価した。質量分析において各ペプチドの量は多数のピークに基づくものであり、各タンパク質の量は多数のペプチド値に基づくものであることを考慮し、これらの量に関してＰ値を求めた。また、Ｐ値と共に、各ペプチド又はタンパク質について遺伝子発現差異解析を反復させることなく行った。さらに、結果の質を保証するため、同定したタンパク質の数を増やすことのできる生物学的反復データも得た。その結果、ヒト及びマウスの脳のサンプルサイズは、各々Ｎ＝５及びＮ＝３が適当であると判断した。
なお、全てのサンプルが正規分布を形成するかどうかは確認していない。しかしながら、Ｐ値をコンピューターにて算出する過程にて、本解析においては市販のプログラム（プロテインパイロット）を用い、異常値が生じる質の低い測定結果は除外している。
また、動物行動試験及び２光子顕微鏡観察によって得られた結果については、各図及びその説明に記載のサンプルサイズにて、スチューデント独立ｔ検定（両側検定）により、大概解析した。
また、脳組織のサンプリング、質量分析におけるデータ収集及びシステム生物学的解析については、事情を知っているグループに割り当てることなく、独立した研究者によって行われたものである。
（実施例１）
＜アルツハイマー病についてのフォスフォプロテオーム解析＞
アルツハイマー病の病変においては、ｔａｕリン酸化を始め様々なリン酸化シグナル伝達の関与が示唆されている。そのため、アルツハイマー病におけるリン酸化シグナル伝達、特にアルツハイマー病の発症の前段階において中心的な役割を担っているリン酸化シグナル伝達が同定されれば、この疾患の早期診断及び治療における、極めて有効な標的分子を提供することが可能となる。そこで、本発明者はアルツハイマー病におけるリン酸化シグナル伝達を網羅的に解析（フォスフォプロテオーム解析）し、その病変において中心的な役割を担うリン酸化シグナル伝達の同定を試みた。
しかしながら、ヒトの死後の脳サンプルを対象とするフォスフォプロテオーム解析において、大概死後のタンパク質リン酸化の変化はかなりの妨げとなる。実際、従前に本発明者らは、死後のヒトの脳を解析するにあたり、その脳が生前の状態を反映している期間を決定するため、室温又は４℃にて異なる時間保管したマウスの脳におけるリン酸化タンパク質の変化をプロテオームワイドに解析した。そして、その結果、保管を開始してから１２時間後の時点で、既に様々なリン酸化タンパク質の変化が生じていることを本発明者らは明らかにしている（Ｏｋａ，Ｔ．，Ｔａｇａｗａ，Ｋ．，Ｉｔｏ，Ｈ．＆Ｏｋａｚａｗａ，Ｈ．「死後のマウスの脳における、フォスフォプロテオームのダイナミックな変化（Ｄｙｎａｍｉｃ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｅ ｉｎ ｐｏｓｔｍｏｒｔｅｍ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎｓ）」、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２０１１年、６，ｅ２１４０５）。
そのため、この結果を鑑み、ヒトサンプルということを唯一の拠り所にしてフォスフォプロテオーム解析を行うことにはリスクがあると判断し、先ずは、アルツハイマー病モデルマウスを解析してからアルツハイマー病患者の脳サンプルを解析するという段階的なアプローチにより、アルツハイマー病において発現量が変化するリン酸化タンパク質を同定することを試みた。
すなわち先ず、以下の５種類のトランスジェニックマウス（ＡＤモデルマウス４種及びＴａｕモデルマウス１種）を、１、３及び６月齢（４、１２及び２４週齢）に解剖した。そして、顕微鏡下、大脳皮質、海馬及び線条体を迅速に分け、速やかに凍結した。なお、これらの全工程は５分以内に完了したことを、ストップウオッチにてかかった時間を測定することにより確認している。
（１）ＰＳ１トランスジェニックマウス
（２）ＰＳ２トランスジェニックマウス
（３）ヒト二重変異体ＡＰＰ６９５トランスジェニックマウス
（４）５ｘＦＡＤマウス
（５）Ｔａｕトランスジェニックマウス。
また、ＡＰＰ−Ｔｇ２５７６マウス及び５ｘＦＡＤマウスのバックグランドはＢ６／ＳＪＬであり、ＰＳ１トランスジェニックマウス及びＰＳ２トランスジェニックマウスのバックグランドはＣ５７ＢＬ６であり、ＴａｕトランスジェニックマウスのバックグランドはＣ５７ＢＬ６／Ｃ３Ｈである。そこで、これらバックグランドマウスを、以下の実験ではコントロールマウスとして利用している。
なお、フォスフォプロテオーム解析に際しては、リン酸化タンパク質を最も多く検出できる最適な条件を決定するため、ＡＢ ＳＣＩＥＸトリプルＴＯＦ５６００質量分析による予備試験を繰り返した。また、陽イオン交換カラム及び逆相カラムを用い、サンプルを多段階に分画し、同サンプルを複合解析して得られたデータと重ね合わせた。その結果、信頼度９５％という極めて高い検出スコアを得ることのできる質量分析の条件（適当な量、ランタイム）を得ることができた。
次に、この条件を用い、アルツハイマー病モデルマウスについてフォスフォプロテオーム解析を行った。すなわち、リン酸化タンパク質を、前記５種類のトランスジェニックマウスと、それらに対応する３種類のバックグランドマウスとから、チタンスフィア（登録商標）フォス−チオキットを用いて精製した。そして、ｉＴＲＡＱ試薬を用いて、８種の異なるプローブにて標識し、質量分析の１回のランにて解析した。そして、３回の質量分析の実験結果に基づき、システム生物学的解析を行った結果、９５％の信頼度にて、７４４〜１１２８個のリン酸化タンパク質が同定され、１３０１７〜２９９９５個のリン酸化ペプチドが同定された。
次いで、スーパーコンピューターにより、９回の質量分析において同定されたタンパク質をタンパク質間相互作用（ＰＰＩ）統合データベースにマップした。利用した統合データベースは、国立遺伝学研究所が提供するゲノムネットワークプラットフォーム（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅｎｅｔｗｏｒｋ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ＿ｅ．ｈｔｍｌ）であり、この統合データベースには、ヒトゲノムプロジェクト（ＧＮＰ）の実験的にサポートされているＰＰＩデータベース、ＢＩＮＤ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｎｄ．ｃａ／）、ＢｉｏＧｒｉｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｂｉｏｇｒｉｄ．ｏｒｇ／）、ＨＰＲＤ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｐｒｄ．ｏｒｇ／）、ＩｎｔＡｃｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔａｃｔ／ｓｉｔｅ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｆ）及びＭＩＮＴ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｎｔ．ｂｉｏ．ｕｎｉｒｏｍａ２．ｉｔ／ｍｉｎｔ／Ｗｅｌｃｏｍｅ．ｄｏ）が含まれている。
そして、マップしたリン酸化タンパク質をノードに指定し、さらに有意に変化していたリン酸化タンパク質に結合するタンパク質を、アクセサリーノードとして付随させた。また各タンパク質間の結合を線（エッジ）にて結合し、マウスデフォルトネットワークを作製した。なお、該ネットワークにおいて、同定されたタンパク質に２以上のエッジを介して間接的に結合しているタンパク質は、ネットワークから除外した。
次に、１のタンパク質は、それに由来する多数のペプチドの多数のＰ値を有しているが、逆正規法によりこれらＰ値を統合し、統合したＰ値を、モデルマウスグループと、コントロールマウスグループとで比較した（ｎ＝３）。次いで、１〜６月齢において、ＡＤモデルマウス又はＴａｕモデルマウスと、それらのコントロールマウスとを比較し、変化していたリン酸化タンパク質をノードとして選抜した（ｐ＜０．０５）。そして、図には示さないが、各モデルマウスの各時期において変化していたリン酸化タンパク質のネットワークを構築した。
次に、このように構築して得られた各モデルマウスのネットワークに基づき、これらモデルマウスにおいて共通して変化しているリン酸化シグナル伝達の同定を、以下に記載の異なる２つのアプローチを用いて行った。
（１）第１のアプローチ
同一時点における多種のモデルマウスのフォスフォプロテオームデータを単純に比較した結果に基づいて選択するアプローチ（仮説を設定しないアプローチ（Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ ｆｒｅｅ ａｐｐｒｏａｃｈ））
（２）第２のアプローチ
アミロイド凝集又は凝集前の一定の過程において、異常なリン酸化シグナルが生じているという仮定に基づき、選択するアプローチ（Ａβ凝集と関連付けるアプローチ（Ａβ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ−ｌｉｎｋｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ））。
なお、第１のアプローチにおいて、異なるモデル間にて共通してているノードの数は、比較したＡＤモデル数の増加とともに減少した。すなわち、４種のＡＤモデルにおいて共通しているノードは、たった１つ（１ヶ月齢のＭＡＰ１Ｂのみ）であり、３及び６ヶ月齢においてはいずれのノードも含まれていなかった。したがって、更なる解析のため、図には示さないが、ＡＤモデルマウス２タイプ間において１回以上共通している６５個のノードを選択した。６５個のタンパク質のうち、５１タンパク質は、ある１時点において、ＡＤモデルマウス２タイプの１の組み合わせにおいて共通してリン酸化が変化していたタンパク質であり、１４タンパク質は、複数の時点において共通して変化していたリン酸化タンパク質と、ＡＤモデルマウス２タイプの複数の組み合わせにおいて共通して変化していたリン酸化タンパク質とである（１４タンパク質については図１参照）。
また、第２のアプローチに際して、４種類のＡＤモデルマウスについて、免疫組織学的解析を行った。そして、これらモデルマウス間における病態の差異について確認した。すなわち、図には示さないが、５×ＦＡＤマウス及びＡＰＰマウスにおいて、アミロイドの沈着は、各々３及び６ヶ月齢において生じ始めた。一方、ＰＳ１マウス及びＰＳ２マウスにおいては、６ヶ月齢に至ってもアミロイド沈着が確認されなかった。
したがって、このような結果に基づき、５×ＡＤＤマウスとＡＰＰマウスとは、Ａβ沈着が生じ始める時期において、病理学的シグナル伝達が共通しているはずであると想定し、１ヶ月齢の５×ＦＡＤマウス及び３カ月齢のＡＰＰマウス間、又は、３ヶ月齢の５×ＦＡＤマウス及び６カ月齢のＡＰＰマウス間とで、有意に変化しているリン酸化タンパク質を比較した。
そして、この比較の結果から、脳におけるＡβ凝集に関連していることが推定されるリン酸化タンパク質として、５×ＦＡＤマウス及びＡＰＰマウスにおいて共通している１１のノードが選択された（１１のノード（タンパク質）については図１参照）。
驚くべきことに、図１に示した結果から明らかな通り、異なるアプローチによって得られた結果と照合したところ、Ａβ凝集と関連付けるアプローチによって選抜された１１のタンパク質の内８個は、仮説を設定しないアプローチにおいても選択されたタンパク質であった。一方、ＡＤモデルマウス２タイプ間の複数の時点において共通してリン酸化状態が変化していることが認められた１４のタンパク質のうち、それらの半数以上がＡβ凝集と関連付けるアプローチによっても選抜された。
また、これら全てのリン酸化タンパク質の変化は発症前に生じていた。すなわち、図には示さないが、４種類のＡＤモデルマウス（ＰＳ１、ＰＳ２、ＡＰＰ及び５ｘＦＡＤ）について、行動試験（モリス水迷路試験、ロータロッド試験、オープンフィールド試験、高架式十字迷路試験、明暗ボックス試験及び恐怖条件付け試験）を行ったが、６ヶ月齢において、いずれの行動異常を検出することはできなかった。
以上の通り、このフォスフォプロテオミクス解析において、独立した２つのアプローチによって同様の結論に至り、アルツハイマー病の発症の前段階に関与し、その病変において中心的な役割を担うネットワーク（ＡＤコアネットワーク）を構成する因子として、１７のリン酸化タンパク質を同定することができた。
（実施例２）
＜Ｔａｕモデル動物におけるＡＤコアネットワークについての解析＞
アルツハイマーの病因及び発症機構については、未だ結論は出されていないものの、アミロイドβの凝集（アミロイド病変）が生じ、該凝集によってｔａｕのリン酸化及び重合（ｔａｕ病変）が促進され、ひいては神経細胞死等に至るという機構（アミロイドカスケード仮説）が有力視されている。そこで、この仮説において想定される、アミロイド病変からｔａｕ病変への移行の観点から、アミロイド病変が誘導されているＡＤモデルマウスにおいて選抜された１７タンパク質について、ｔａｕ病変が誘導されているＡＤモデルマウスを対象として再解析を行った。
すなわち、ＡＤモデルマウスにおいて、仮説を設定しないアプローチにおいても選択された前記１４タンパク質と、Ｔａｕモデルマウスにおいて変化しているリン酸化タンパク質とを比較した。その結果、表１に示す通り、ＡＤモデルマウスとＴａｕモデルマウスとの間で、１０のリン酸化タンパク質（ＡＤＤＢ、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＳＰＴＡ２、ＢＡＳＰ１、ＣＬＨ、ＭＡＲＣＳ、ＮＥＵＭ、ＳＲＲＭ２及びＭａｒｃｋｓｌ１）が共通して変化していることが明らかになった。
また、図には示さないが、前記１７タンパク質には含まれていないものの、仮説を設定しないアプローチにおいて検出された６５のタンパク質にはｔａｕが含まれていた。すなわち、１ヶ月齢におけるリン酸化ｔａｕタンパク質の量は、重度のＡＤモデルマウス（５ｘＦＡＤ及びＡＰＰ）とｔａｕモデルマウスとにおいて、共通して亢進しており、ｔａｕタンパク質のリン酸化は、アミロイド病変とｔａｕ病変とを結びつけていることが裏付けられた。
（実施例３）
＜ヒトＡＤ患者におけるＡＤコアネットワークについての解析＞
次に、ヒトＡＤ患者の脳のフォスフォプロテオームデータに基づき、上記ＡＤモデルマウスの結果から選択された１７のタンパク質について評価した。
すなわち、先ず、ヒトＡＤ患者の脳のフォスフォプロテオームデータを得るべく、ヒトＡＤ患者の５つの脳を用い、前記マウス同様に質量分析を行った。なお、この分析に供した脳サンプルは死後１時間以内に単離して冷凍保存したものであり、その内、側頭葉（側頭極）及び後頭葉（後頭極）のサンプルを該分析の対象とした。通常、これらの脳の領域は、ＡＤ患者において顕著に冒されている領域である。また、これら脳サンプルに、ＡＤの病変を示していない組織、レビー小体及び嗜銀性グレイン等が混入されていないことを、病理学検査にて確認した上で分析に供した。さらに、ＡＤ患者と年齢を適合させた５つの健常人由来の脳と、レビー小体型認知症患者由来の５つの脳とも、コントロールとして分析に供した。
その分析の結果、図には示さないが、全てのヒトの脳において検出されたリン酸化タンパク質に基づき、ヒトのデフォルトネットワークを作製した。なお、次の解析段階の、ヒトとマウスとのネットワークにおける比較において、キナーゼやフォスファターゼといった重要な分子を落とさないように、今回のケースにおいては、ヒトのＰＰＩデータベースのみならず、マウス及びラットのＰＰＩデータベースに基づき、エッジ及びアクセサリーノードをノードに付加させた。
そして、側頭葉及び後頭葉のそれぞれにおいて、ＡＤ患者の脳と、正常な脳又はＤＬＢ患者の脳とを比較し、変化しているリン酸化タンパク質を、「ヒト（ＡＤ）−（正常）ノード」又は「ヒト（ＡＤ）−（ＤＬＢ）ノード」として選択した。なお、注目すべきことに、「ヒト（ＡＤ）−（ＤＬＢ）ノード」における疾患特異的なノードの全ては、「ヒト（ＡＤ）−（正常）ノード」ネットワークにおいても検出された。
次いで、側頭葉及び後頭葉における「ヒト（ＡＤ）−（正常）ノード」に基づくネットワークを作製し、マウスフォスフォプロテオームに基づく前述の１７タンパク質との比較に供した。その結果、表１に示す通り、前記ＡＤコアネットワークを構成する１７のタンパク質において、ＡＤＤＢ、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＳＰＴＡ２、ＢＡＳＰ１、Ｇ３Ｐ、ＭＡＲＣＫＳ及びＮＥＵＭが、ヒトＡＤ患者においても共通して変化していることが明らかになった。
また、ヒトＡＤ患者においても共通して変化していたこれら９つのリン酸化タンパク質は、Ｇ３Ｐを除き、Ｔａｕモデルマウスにおいて変化していたリン酸化タンパク質として同定されていたものであった。
したがって、以上のＴａｕモデル動物及びヒトＡＤ患者の解析結果から、１７タンパク質又は少なくともそれらの大部分は、アルツハイマー病の発症の前段階に関与し、その病変において中心的な役割を担うネットワークの構成要素であることが確認された。
（実施例４）
＜ＡＤコアネットワークについての機能解析＞
前述の統合されたヒト−マウスＰＰＩデータベースに基づき、前記１７タンパク質を伴うＡＤコアネットワークを作製した。得られた結果を図２に示す。
図２に示した結果から明らかなように、驚くべきことに、１７タンパク質中１２のタンパク質は直接結合しており、３タンパク質（ＳＲＲＭ２、ＢＡＳＰ１及びＡＤＤＢ）は、独立した１のタンパク質を介して結合していた。なお、ＰＰＩデータベースにおいて、Ｍａｒｃｋｓｌ１は、他の１６タンパク質とは直接結合していないが、ＭＡＲＣＫＳに対して高い相同性を示すタンパク質であり、このように、少なくとも１５タンパク質は、単一の機能的なネットワークを形成していることが明らかになった。
さらに驚くべきことに、それらの機能は、スパイン形成、小胞体の再利用及びエネルギー産生といった、シナプスの機能に直接関連するものに集積していた。
ＳＰＴＡ２（脳αスペクトリン）は、アクチンにクロスリンクしているタンパク質であり、脳において高発現している（Ｌｅｔｏ，Ｔ．Ｌ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９８８年、８巻、１〜９ページ 参照）。ＳＰＴＡ２は後シナプス肥厚においてＳＨＡＮＫと相互作用しており（Ｂｏｃｋｅｒｓ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、２７６巻、４０１０４〜４０１１２ページ 参照）、また今回同定された１７タンパク質の一つであるＡＤＤＢ／ａｄｄｕｃｉｎ−ｂとも相互作用し、スペクトリン／アデューシン／アクチン複合体を形成することが知られている（Ｌｉ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９６年、２７１巻、１５６９５〜１５７０２ページ 参照）。また、これらタンパク質はプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の基質であり、これらタンパク質のリン酸化後、前記複合体は不安定となり、膜の安定性も低下することも明らかになっている。
ＡＤＤＢは、ＭＡＲＣＫＳ関連ドメインを含んでおり、ＰＫＣによるリン酸化によって、後シナプスにおける局在が制御され、前述の通り、アクチン／スペクトリン複合体形成が阻害されることが知られている（Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９９８年、１４２巻、４８５〜４９７ページ 参照）。また、ショウジョウバエの神経筋接合部（ＮＭＪ）における結果ではあるが、このシステムは、シナプス生産及び除去を制御していることが示されている（Ｐｉｅｌａｇｅ，Ｊ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ、２０１１年、６９巻、１１１４〜１１３１ページ 参照）。
ＭＡＲＣＫＳ、ＢＡＳＰ１及びＮＥＵＭは、脂質ラフトに起因するシグナルに大きく関わっていることが知られている。また、ＭＡＲＣＫＳはＰＫＣ特異的な基質であり、通常細胞膜に局在している。しかしながら、リン酸化後又はカルモジュリンに結合した後、ＭＡＲＣＫＳは細胞膜から放出され、細胞質に移行し、Ｆ−アクチンのクロスリンクを阻害することが知られている（Ｈａｒｔｗｉｇ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９２年、３５６巻、６１８〜６２２ページ 参照）。さらに、変異ＭＡＲＣＫＳを有するマウスの脳において、様々な形態上及び機能上の異常が観察されている（Ｓｔｕｍｐｏ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９５年、９２巻、９４４〜９４８ページ 参照）。
ＭＲＰ／Ｍａｒｃｋｓｌ１は、ＭＡＲＣＫＳファミリーの１メンバーであり、ＰＫＣのシグナル伝達に関与する。また、Ｍａｒｃｋｓｌ１はＪＮＫによりリン酸化され、アクチンの安定性及びニューロンのフィロポディア形成を制御することが知られている（Ｂｊｏｒｋｂｌｏｍ，Ｂ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２０１２年、３２巻、３５１３〜３５２６ページ 参照）。
ＮＥＵＭ／ニューロモジュリン／ＧＡＰ４３は、成長錐／軸索 シナプス前終末の重要な構成要素であり、ＰＫＣの主な基質として知られている（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ，Ｌ．Ｉ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９９７年、２０巻、８４〜９１ページ 参照）。また、ＮＥＵＭは様々な分子と相互作用することが知られている。例えば、ＰＩＰ２及びパルミチン酸塩、又はアクチン、スペクトリン、シナプトフィシン及びｔａｕ等の細胞骨格タンパク質と、ＮＥＵＭは相互作用することが報告されており、ＭＡＲＣＫＳ及びＳＰＴＡ２同様に、ＮＥＵＭもまたカルモジュリンによって制御され、膜と細胞質との間を行き来することが示されている（Ｇａｍｂｙ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９６年、２７１巻、２６６９８〜２６７０５ページ 参照）。このように、ＮＥＵＭは、細胞骨格の調節を介し、シナプス前終末の機能を制御するアダプタータンパク質であり、記憶及びＬＴＰの形成に関与していることが示唆されている（Ｒｏｕｔｔｅｎｂｅｒｇ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０００年、９７巻、７６５７〜７６６２ページ 参照）。
ＢＡＳＰ１／ＮＡＰ−２２／ＣＡＰ２３は、ＰＥＳＴモチーフを有するミリストイル化タンパク質であり、軸索終末に豊富に存在している（Ｍｏｓｅｖｉｔｓｋｙ，Ｍ．Ｉ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９９７年、７９巻、３７３〜３８４ページ 参照）。その機能は十分に解明されていないが、細胞膜の脂質ラフトの内表面に存在している。また、ＢＡＳＰ、ＭＡＲＣＫＳ及びＮＥＵＭは、共通したメカニズムを介して、ＰＩ（４，５）Ｐ２を調節しているように見受けられる。さらに、ＢＡＳＰ、ＭＡＲＣＫＳ又はＮＥＵＭと、カルモジュリンとの、リン酸化依存的相互作用は、アクチンネットワークの形成を促進することが示唆されている（Ｌａｕｘ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２０００年、１４９巻、１４５５〜１４７２ページ 参照）。
このように、ＡＤコアネットワークを構成するタンパク質は、シナプス前及びシナプス後の形態を制御するネットワークを形成していることが示唆される。
また、ＳＹＴ１／シナプトタグミン１及びＧＰＲＩＮ１／軸索成長Ｇタンパク質制御誘導因子１のフォスフォプロテオミック上の変化は、Ｔａｕモデルマウス及びヒトＡＤ患者の脳の双方において検出されなかったが、これらタンパク質もまた、ＡＤの発症前段階に関与しているのかもしれない。特に、シナプス終末において小胞体再利用を制御するため、ＳＹＴ１／シナプトタグミン１は重要である。なお、仮説を設定しないアプローチ及びＡβ凝集と関連付けるアプローチの両方において選択された小胞体カーゴ分子 ＣＬＨ／クラスリン重鎖と、ＳＹＴ１とは、シナプス終末において複合体を形成することが知られている（Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｔ．Ｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００４年、１０１巻、１６４０１〜１６４０２ページ 参照）。また、ＧＰＲＩＮ１は、軸索成長を誘導する成長錐膜画分に多いＧαｏのエフェクターであるが（Ｃｈｅｎ，Ｌ．Ｔ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年、２７４巻、２６９３１〜２６９３８ページ 参照）、その機能の詳細はいまだ解明されていない。
さらに、興味深いことに、エネルギー産生に関与する分子も選択された。すなわち、ＡＴＰＡ及びＡＴＰＢは、各々ミトコンドリアＡＴＰ合成のサブユニットＡ及びＢであり、ＡＣＯＮは、ＴＣＡサイクルのクエン酸異性化を触媒するミトコンドリアアコニターゼ２である。また、Ｇ３Ｐ／ＧＡＰＤＨ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒロゲナーゼは、解糖において重要な酵素である一方で、ニトロシレート活性を介して核機能を担い、同様のメカニズムにて微小管集合にも影響を及ぼすため、細胞骨格に関連するものでもある。
ＳＲＲＭ２は、ＳＲｍ１６０と共にスプライシングに関与し（Ｂｌｅｎｃｏｗｅ，Ｂ．Ｊ．、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１９９８年、１２巻、９９６〜１００９ページ 参照）、他のコアネットワークタンパク質とは機能的に異なっている。
ＨＳ９０Ａ／ＨＳＰ９０は様々なタンパク質の品質管理とフォールディングに関与するシャペロン分子であり、その一般的な役割故、コアネットワークにおける様々なタンパク質と結合する。
以上の通り、アルツハイマー病の発症の前段階におけるフォスフォプロテオミックの変化は、シナプス機能及びエネルギー代謝を制御する２〜３のネットワークに選択的に集中していることが明らかになった。
＜ＡＤモデル動物における、加齢に伴うリン酸化タンパク質の変化＞
さらに、ＡＤモデルマウスにおけるリン酸化タンパク質の経時的変化（病的加齢におけるリン酸化タンパク質の変化）と、通常の加齢（生理学的加齢）におけるそれら（バックグランドマウスにおけるリン酸化タンパク質の経時的変化）とがどのように関連しているのかを解析した。なお、５×ＦＡＤマウスのいずれかの時点で信頼度の高いデータを得られなかったタンパク質については、この解析から除外した。
この解析に際し、１〜１２カ月齢の様々な時点における５×ＦＡＤマウス及びバックグランドマウスを含む新たなサンプル、３セットを質量分析にて解析した。そして、前記１７のリン酸化タンパク質に関し、得られた１ヶ月齢におけるバックグランドマウスの値に基づき、各月齢における５×ＦＡＤマウス及びバックグランドマウスの値を補正した上で、グラフにプロットすることで、これらリン酸化タンパク質の経時的変化を解析した。
その結果、図には示さないが、生理学的加齢と病的加齢にある老化とにおいて、ＡＤコアネットワークを構成する殆どのリン酸化タンパク質の変化のパターンは質的には同様であった。しかしながら、そのパターンは量的には異なり、各リン酸化タンパク質において、５×ＦＡＤマウスとバックグランドマウスとの間で、発現量の差が顕著に大きくなる時点が各々存在することが明らかになった。
例えば、ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１及びＳＲＲＭ２に関し、１ヶ月齢の５×ＦＡＤマウスにおいて、これらリン酸化タンパ質の量は、バックグランドマウスのそれらと比較して顕著に多かった。なお、その差は経時変化に伴い減少していった。また、ＳＰＴＡ２、Ｇ３Ｐ、ＡＤＤＢ、ＳＹＴ１、ＢＡＳＰ１及、ＨＳＰ９０Ａ及びＮＥＵＭに関しては、３ヶ月齢の５×ＦＡＤマウスにおいて、これらリン酸化タンパ質の量はバックグランドマウスと比較して顕著に多かった。さらに、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＣＬＨ及びＧＰＲＩＮ１に関しては、１２ヶ月齢の５×ＦＡＤマウスにおいて、これらリン酸化タンパ質の量はバックグランドマウスと比較して顕著な差が生じていた。
そして、以上のリン酸化タンパク質の経時変化の解析結果に基づき、コアタンパク質のネットワークを再構築した。得られた結果を図３に示す。
前述の通り、ＭＡＲＣＫＳ及びそのホモログであるＭａｒｃｋｓｌ１のリン酸化は初期に変化していた。また、図３に示す通り、これらと同じ機能ドメイン又は関連する機能ドメインに属する他のコアリン酸化タンパク質もそれらに続いて変化していることが明らかになった。
（実施例５）
＜ＡＤコアネットワークの変化に関与するキナーゼ／フォスファターゼの探索＞
図３に示す通り、ＡＤコアネットワークを構成するタンパク質のリン酸化の経時的変化は、アルツハイマー病の発症前段階において、初期にピークがあるもの、中期にピークがあるもの、後期にピークがあるもの、これら３パターンにカテゴリー化することができる。そして、これらカテゴリーを鑑みるに、ＡＤコアネットワークを構成するタンパク質のリン酸化は特定のキナーゼ等によって時期特異的に制御されていることが想定される。
そこで、このＡＤコアネットワークの制御に関与するキナーゼ等を探索すべく、先ず、ＡＤコアネットワークを構成するタンパク質に直接結合するタンパク質の中から、キナーゼ及びフォスファターゼを選択した。そして、これらのキナーゼ及びフォスファターゼにおいて、最も多くのコアタンパク質をリン酸化できるという観点から、ＰＫＣをＡＤコアネットワークの変化に関与する最も重要な酵素として位置づけた。なお、ＡＤ病変における様々な過去の報告から既に明らかにされている通り、ＰＫＣに次いで、ＭＡＰＫ及びＭＡＰＫＫＫが同定された。
また、これら３つのキナーゼに続く第２のグループとして、カゼインキナーゼ（ＣＳＫII）、受容体共役タンパク質セリン／スレオニンキナーゼ１／３（ＲＩＰ１／３）、サイクリン依存性キナーゼ５／６（ＣＤＫ５／６）及びプロテインキナーゼＣ様タンパク質１（ＰＫＮ１）が同定された。さらに、第３のグループとして、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性キナーゼ（ＣａＭＫI／II）及びプロテインキナーゼＤ（ＰＫＤ）等が同定された。また、たった一つのコアタンパク質としか結合していないのにも関わらず、Ｌｃｋ／Ｙｅｓ関連新規タンパク質チロシンキナーゼ（Ｌｙｎ）及びその他２０のキナーゼが、コアネットワークを制御している候補として同定された。
以上のコアリン酸化タンパク質に結合するキナーゼについての解析結果と、前述の５×ＦＡＤマウスにおけるコアリン酸化タンパク質の経時変化の結果とを比較して得られた、酵素−基質の相関を図３に示す。
図３に示した結果から明らかな通り、コアリン酸化タンパク質の初期（1ヶ月齢）、中期（３ヶ月齢）及び後期パターン（６ヶ月齢）と、ＰＫＣ、Ｌｙｎ、ＣａｍＫ及びＣＡＳＫとの間に相関関係が認められた。
これらのうち、ＰＫＣファミリーは最も早く様々なキナーゼを活性化させ、そして、その活性化は後期まで持続されているように見受けられる。すなわち、ＰＫＣファミリーによって、先ずＭＡＲＣＫＳ及びＭａｒｃｋｓｌ１がリン酸化され、そして、それらに次いでＧ３Ｐ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１及びＳＰＴＡ２のリン酸化が当該キナーゼファミリーによって生じていることが明らかになった。
また、ＡＤコアネットワークを構成する１８タンパク質を制御するキナーゼの標的配列を同定するため、質量分析から得られたペプチドリン酸化のデータを再検討し、各タンパク質における１の部位におけるリン酸化レベルを個別に解析した。すなわち、前記５種類のトランスジェニックマウス（ＡＤモデルマウス４種及びＴａｕモデルマウス１種）のうち、少なくとも１モデルの１時点以上において、野生型と比較して、量の変化がＰ＜０．０５となる１のリン酸化部位を含むポリペプチドを同定した。
その結果、図には示さないが、ＡＤＤＢに関しては、６０位のセリン、６２位のセリン、５３２位のセリン、５９４位のセリン、６０２位のセリン、６１８位のセリン、６９２位のセリン及び７００位のセリンにおいてリン酸化レベルの有意な変化が認められた。ＮＦＨに関しては、５００位のセリン、５３５位のセリン、５８３位のセリン、６７３位のセリン、７２１位のセリン、７６３位のセリン、７９５位のセリン、８３４位のセリン、８３９位のスレオニン、８６７位のセリン及び８８８位のセリンにおいてリン酸化レベルの有意な変化が認められた。ＮＦＬに関しては、４７３位のセリン、５２３位のセリン及び５３２位のセリンにおいてリン酸化レベルの有意な変化が認められた。ＳＰＴＡ２に関しては、１０３１位のセリン及び１２１７位のセリンにおいてリン酸化レベルの有意な変化が認められた。ＡＴＰＢに関しては、２６２位のスレオニン及び４５３位のスレオニンにおいてリン酸化レベルの有意な変化が認められた。ＢＡＳＰ１に関しては、３１位のスレオニン、３６位のスレオニン、９２位のセリン、１３１位のセリン、１９２位のセリン及び２１８位のセリンにおいてリン酸化レベルの有意な変化が認められた。Ｇ３Ｐに関しては、１８２位のスレオニン及び２０９位のスレオニンにおいてリン酸化レベルの有意な変化が認められた。ＧＰＲＩＮ１に関しては、１８２位のセリン、２１９位のセリン、４９５位のセリン、５７６位のセリン、６９１位のセリン、６９３位のセリン、７１４位のセリン、７６４位のセリン、７７１位のセリン、８１６位のセリン及び７９５位のスレオニンにおいてリン酸化レベルの有意な変化が認められた。ＭＡＲＣＫＳに関しては、２６位のセリン、２７位のセリン、２９位のセリン、１１３位のセリン、１２２位のセリン、１２４位のセリン、１２５位のセリン、１２７位のセリン、１２８位のセリン、１３８位のセリン、１４０位のセリン、１４１位のセリン、１４３位のスレオニン、１６３位のセリン、１７１位のセリン及び２９９位のセリンにおいてリン酸化レベルの有意な変化が認められた。ＮＥＵＭに関しては、８６位のセリン、８９位のスレオニン、９６位のセリン、１４２位のセリン、１７２位のスレオニン及び１９３位のセリンにおいてリン酸化レベルの有意な変化が認められた。ＳＲＲＭ２に関しては、１０６７位のセリン、１２７８位のセリン、１３０５位のセリン、１３３９位のセリン、１３５９位のセリン、１３６０位のセリン、２３５１位のセリン、２０８４位のセリン、２４０４位のセリン、２５３５位のセリン、１４４８位のスレオニン及び２３５０位のスレオニンにおいてリン酸化レベルの有意な変化が認められた。Ｍａｒｃｋｓｌ１に関しては、２２位のセリン、８５位のスレオニン、１０４位のセリン、１４８位のスレオニン、１８９位のセリン、１５１位のセリン及び１８５位のセリンにおいてリン酸化レベルの有意な変化が認められた。ＨＳ９０Ａに関しては、２３１位のセリン及び２６３位のセリンにおいてリン酸化レベルの有意な変化が認められた。ＳＹＴ１に関しては、１２５位のスレオニン及び１２８位のスレオニンにおいてリン酸化レベルの有意な変化が認められた。
＜アルツハイマー病の病変におけるキナーゼの関与＞
上述の解析結果によって構築されたＡＤコアネットワークに関し、アルツハイマー病の病変におけるその意義を、インビボ及びインビトロの実験系を用いて実証した。
フォスフォプロテオーム解析によって明らかとなったコア因子の機能から、アルツハイマー病が発症する前の最も早い段階にて、シナプス前の細胞骨格とシナプス後の細胞骨格とを関係づける特異的なリン酸化シグナルは乱されていることが示唆される。特に、アクチン及びスペクトリン等のアクチン結合タンパク質からなる細胞骨格ネットワークは、樹状突起スパイン形成を主に制御していることが示唆されている（Ｍａｔｕｓ，Ａ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年、２９０巻、７５４〜７５８ページ、Ｔａｄａ，Ｔ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、２００６年、１６巻、９５〜１０１ページ 参照）。そのため、ＭＡＲＣＫＳからアクチン重合への結合、及び、ＳＰＴＡ２からアクチンとスペクトリンとの架橋への結合が、アルツハイマー病の初期段階において異常をきたし始め、これら細胞骨格ネットワークが活性化されることにより、樹状突起スパインの動態に影響を与え、ひいてはアルツハイマー病の病変に関与していることが想定される。
そこで、アルツハイマー病発症前の５×ＦＡＤマウス（１２週齢）を対象とし、２光子顕微鏡により樹状突起スパインの動態を解析した。得られた結果を図４〜９に示す。
１２週齢の５×ＦＡＤマウスのレイヤー１の皮質ニューロンを生かしたまま、２光子顕微鏡により観察した結果、図４及び５に示す通り、皮質ニューロンにおいて樹状突起スパイン密度が顕著に減少していることが明らかになった。また、樹状突起軸の長さあたりのスパインの数は、スパインの全てのタイプ（シン（Ｔｈｉｎ）、マッシュルーム（ｍｕｓｈｒｏｏｍ）及びスタビー（ｓｔｕｂｂｙ））において減少が認められた（図６ 参照）。さらに、１００μｍあたりの樹状突起スパインの絶対数に関し、形成されたスパイン、除去されたスパイン及び安定して残っていたスパインは全て減少してた（図７〜９ 参照）。また、５×ＦＡＤマウスにおけるスパイン動態３タイプの比率に関し、形成されたスパインは減少していた。一方、除去されたスパイン及び安定して残っていたスパインにおいて、顕著な変化は認められなかった（図９ 参照）。総じて、５×ＦＡＤマウスの病変において、スパイン形成過程が冒されていることが明らかになった。なお、これらの結果は、ＡＤモデルマウスにおける過去の知見とも基本的には一致している（Ｐａｌｏｐ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０１０年、１３巻、８１２〜８１８ページ、Ｗｅｉ， Ｗ．ら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０１０年、１３巻、１９０〜１９６ページ、Ｗｕ，Ｈ．Ｙ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０１０年、３０巻、２６３６〜２６４９ページ 参照）。
そこで、次に、アルツハイマー病の発症前段階の初期〜中期にかけて、ＡＤコアネットワークに影響を与えていることが示唆されたキナーゼに関し、これらキナーゼに対する阻害剤等を５×ＦＡＤマウスのくも膜下に投与することにより、該マウスにおけるシナプス病変への影響を解析した。得られた結果を図４〜９に示す。
ＰＫＣ阻害剤（Ｇｏ６９７）を投与することによって、５×ＦＡＤマウスにおけるスパインの異常は緩和され、スパインの総密度は増加した（図４及び５参照）。また、シン、マッシュルーム及びスタビータイプのスパインの数も増加していた（図６ 参照）。さらに、スパインの動態に関し、Ｇｏ６９７処理によって、スパイン形成及び安定性は亢進していた（図７〜９ 参照）。
また、ＣａｍＫII阻害剤（ＫＮ−９３）処理によっても、スパイン形成及び安定性に対する治療的効果が奏されることが明らかになった。さらに、５ｘＦＡＤマウスにおいて減少していた全てのタイプの樹状突起スパインの数も、該処理によって回復することも明らかになった（図７〜９ 参照）。
さらに、Ｌｙｎキナーゼ活性化剤（ＭＬＲ１０２３）処理によっても、前記ＰＫＣ阻害剤又はＣａｍＫII阻害剤処理同様に、スパイン形成及び安定性に対する治療的効果が奏されることが明らかになった（図７〜９ 参照）。なお、今回有効性が見出されたＭＬＲ１０２３はインスリン受容体増強剤としても知られている。そのため、今回の治療効果は、アルツハイマー病患者の脳において確認されているインスリン抵抗性の改善を介した効果であることも想定される（Ｃｒａｆｔ，Ｓ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２０１２年、８巻、３６０〜３６２ページ 参照）。
また、キナーゼ阻害剤による効果をインビボの系にて確認するため、２光子顕微鏡観察後の脳サンプルを対象とし、各キナーゼ活性型に対する抗体を用い、免疫組織学的解析を行った。得られた結果を図１０及び１１に示す。
その結果、図１０及び１１に示す通り、５×ＦＡＤマウスの皮質領域（脳梁膨大後部皮質）において、ＰＫＣβ、ＰＫＣδ及びＣａｍＫII（ＣａｍＫIIα）は活性化していることが確認された。また、免疫染色部位から発せられるシグナルを定量化した結果、前述のキナーゼ阻害剤による効果が確認された。
＜アルツハイマー病のスパイン病変におけるＭＡＲＣＫＳの関与＞
上述の通り、加齢パターン解析において、また、前述の凝集と関連付けるアプローチによっても、ＭＡＲＣＫＳはアルツハイマー病の初期段階にリン酸化が変化しているタンパク質として検出されている（表１及び図３ 参照）。このことから、ＭＡＲＣＫＳは、アルツハイマー病の病変の発症前段階において、最も信頼できるリン酸化シグナル伝達分子であることが示唆される。
この点を確認すべく、ＰＫＣ及びＣａｍＫIIの基質であるＭＡＲＣＫＳをＡＤモデルマウスにおいてノックダウンした。すなわち、ＭＡＲＣＫＳに対するｓｈＲＮＡを発現させるレンチウィルスベクターを、発症前の５×ＦＡＤマウス（１２週齢）の皮質に注入した。得られた結果を図１２〜１８に示す。
図１２〜１８に示した結果から明らかなように、５×ＦＡＤマウスにおけるスパインの病変は、ｓｈＲＮＡによりＭＡＲＣＫＳの発現を抑制することにより、緩和された。また、ＭＡＲＣＫＳに対するｓｈＲＮＡによって、５×ＦＡＤマウスにおいて、スパイン数の減少も回復し、未成熟及び成熟したスパインの数が増加し、さらにスパイン形成も改善された。
（実施例６）
＜アミロイド病変からｔａｕ病変への移行に関与するキナーゼの探索＞
上述のアルツハイマー病の発症前段階における特異的なネットワークの同定に加え、ｔａｕのリン酸化を促進できるキナーゼの同定を試みた。
上述の仮説を設定しないアプローチに基づいて選抜されたタンパク質の中には、キナーゼ／フォスファターゼは直接含まれていなかったものの、３カ月齢の２つのＡＤモデルマウス（ｐ＜０．０５）においては、ｂ−ｒａｆのタンパク質量の亢進が認められた。また１ヶ月齢の３つのＡＤモデルマウス及び６ヶ月齢の２つのＡＤモデルマウスにおいても、その亢進は確認された。
そこで、ｂ−ｒａｆを阻害することによって、ｔａｕ病変を実際に調節できるかどうかを試験した。すなわち、アミロイドβタンパク質（Ａβ１−４２）及び３種類のｂ−ｒａｆ阻害剤を皮質神経細胞の初代培養に添加し、該皮質神経細胞におけるｔａｕのリン酸化を解析した。なお、皮質神経細胞をＡβによって処理することによって、ｔａｕのリン酸化が亢進することは明らかになっている。得られた結果を図１９及び２０に示す。
図１９及び２０に示した結果から明らかな通り、Ａβ処理した皮質神経細胞におけるｔａｕのリン酸化は抑制されていた。また、図には示さないが、ｔａｕのリン酸化の亢進は、重度のＡＤモデルマウス（５×ＦＡＤ、ＡＰＰ）及びｔａｕモデルマウスの１ヶ月齢において、共通して観察された。すなわち、驚くべきことに、免疫組織学上及び症候上の変化が生じるよりも前に、若いＡＤモデルマウス（１ヶ月齢）の脳においてはｔａｕのリン酸化が生じ始めていることになる。
したがって、以上の結果から、ｂ−ｒａｆがアミロイド病変からｔａｕ病変への移行の促進に関与しているということが示唆された。
―前頭側頭葉変性症―
本実施例においては、次に、前頭側頭葉変性症の発症の前段階において中心的な役割を担っているシグナル伝達経路を同定し、ひいては前頭側頭葉変性症の診断及び治療に有用な標的分子を提供するために、以下に示す実験方法等を用いて解析を行った。また、以下に具体的に示した以外の実験については、特に断りの無い限り、上記アルツハイマー病―の解析同様に行った、
＜前頭側頭葉変性症モデルマウス＞
本実施例において、前記標的分子探索のため、前頭側頭葉変性症モデルマウスの作製した。
ＰＧＲＮ（プログラニュリン）タンパク質の５０４位のアルギニンは種間を通して保存されており、また、この部位における点変異は主に認知症を引き起こすことが知られている（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ａ．Ｍ．らＡｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．４，４（２０１２）、Ｌｅ Ｂｅｒ，Ｉ．ら、Ｈｕｍ． Ｍｕｔａｔ．、２００７年、２８巻、８４６〜８５５ページ 参照）。
そこで、この部位にストップ変異を導入すべく、ヘテロ接合型ＰＧＲＮ Ｒ５０４Ｘ変異ノックインマウスの作製を、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスへのＮｅｏカセット挿入により作製した。
すなわち先ず、該ノックインマウス作製のためのターゲティングベクターは、下記２種類のコンストラクトを用いて構築した。
（コンストラクト１）
Ｒ５０４Ｘ変異を伴う６．５ｋｂｐ ＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ断片を、Ｂａｃクローン（ＩＤ：ＲＰ２３−３１１Ｐ１又はＲＰ２３−１３７Ｊ１７）からＰＣＲにて増幅し、ｐＢＳ−ＤＴＡベクター（Ｕｎｉｔｅｃｈ社製）にサブクローニングした。
（コンストラクト２）
２９９９ｂｐ ＣｌａＩ−ＸｈｏＩ断片をＰＣＲにて増幅し、Ｎｅｏカセットを伴うｐＢＳ−ＬＮＬ（−）ベクター（Ｕｎｉｔｅｃｈ社製）にサブクローニングした。
そして、前記コンストラクト２由来のＢａｍＨＩ（Ｂｌｕｎｔ）−ＸｈｏＩ断片を、コンストラクト１のＸｈｏＩ（Ｂｌｕｎｔ）−ＳａｌＩ部位の間に挿入し、サブクローニングし、このようにして得られたベクターを、ターゲティングベクターとして用いた。
次に、ＳｗａＩ処理によってターゲティングベクターを線状化した後、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスのＥＳクローンに、エレクトロポレーションにより導入した。ＥＳクローンの遺伝子型解析は、ＰＣＲによって行った。該解析において陽性であったクローンについては、ネオマイシン（Ｎｅｏ）に対するプローブを用いたサザンブロッティングにより解析した。そして、ターゲティングベクターとＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスのゲノムとの間で相同組み換えが生じたことが確認されたＥＳクローンをマウス初期胚に注入することによりキメラマウスを作製した。次いで、ＣＡＣ−Ｃｒｅマウスと交配することにより、Ｆ１マウスゲノム中のＮｅｏカセットを除去した。さらに、このようにして得られたＦ１マウスの尻尾から調製したゲノムＤＮＡを用い、これらマウスにおいて、ノックインによりＰＧＲＮ変異が導入された個体を選抜することにより、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスを樹立した。なお、特に断りのない限り、以下に記載のＰＧＲＮ−ＫＩマウスは、ヘテロ接合体について言及するものとする。
また、このようにして作製したＰＧＲＮ−ＫＩマウスについて、抗ＰＧＲＮに抗体を用いたウェスタンブロット解析を行い、当該マウスの大脳皮質においてＰＧＲＮタンパク質全長の発現量が低減していることは確認している。さらに、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構から予測されるように、定量的ＰＣＲにより、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいて、変異型ｍＲＮＡの発現量が低減していることも確認している。また、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいて、ＰＧＲＮに対する免疫染色を行い、神経細胞のマーカータンパク質であるＮｅｕＮに対するそれとを重ね合わせた結果から、大脳皮質及び小脳において共に、前記ＰＧＲＮの減少は、神経細胞における減少に主に由来していることが考えられる。
また、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスの誕生時の体重は、興味深いことに、コントロールとして用いた遺伝的背景が同じマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、以下「バックグラウンドマウス」とも称する）のそれよりも小さかった。しかしながら、生後２０週齢において、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスの殆どの体重は、野生型のそれと変わらなくなっていた。さらに、脳の重さにおいては、コントロールと比べてわずかに小さかったもの、構造的な異常は認められなかった。
＜べムラフェニブ及びｓｈＲＮＡによる回復実験＞
前記ＰＧＲＮ−ＫＩマウスを対象とした薬理学上の回復実験を以下の通りにして行った。すなわち、１２週齢のマウスのくも膜下腔に、浸透圧ポンプ（１μｌ／時間、１００３Ｄ、Ｄｕｒｅｃｔ社製）を導入し、べムラフェニブ（Ｓ１２６７、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社製）１．７μＭ又はＰＢＳを３日間供給した。そして、導入術後３日目、０．８、２４時間後にイメージングを行った。
また、ｓｈＲＮＡ−Ｔａｕレンチウィルスベクター（ｓｃ−４３０４０２−Ｖ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製、１ｘ１０６ＴＵ）３μｌ又はスクランブルｓｈＲＮＡ（ＳＣ−１０８０８０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製、１ｘ１０６ＴＵ）を、ＡＡＶ１−ＥＧＦＰと同じ領域に注入した（ＡＡＶ１−ＥＧＦＰについては、上記アルツハイマー病の＜２光子顕微鏡を介したインビボイメージング＞を参照のこと）。そして、ｓｈＲＮＡ注入後５日目、０．８、２４時間後にイメージングを行った。
＜ｔａｕタンパク質のスパインにおける誤った局在についての解析＞
抗ＰＳＤ−９５抗体及び抗リン酸化ｔａｕ抗体（Ｓｅｒ２０３又はＴｈｒ２２０）を用いた免疫共染色解析を行った。すなわち、ＰＧＲＮ−ＫＩマウス等の脳梁膨大後部異顆粒皮質（ＲＳＤ）組織からパラフィン切片（５μｍ）を調製し、前記抗体にて共染色を行った後、ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社製、対物倍率×６３、ズーム１、Ｚスタックイメージは０．８μｍ間隔に設定）。
共局在解析においては、取得画像（１４３μｍｘ１４３μｍ）において、リン酸化ｔａｕ及びＰＳＤ−９５のシグナルが重なり合っている箇所の数を数えた。
また、リン酸化ｔａｕ又はＰＳＤ−９５に由来する蛍光シグナル強度を、ＺＥＮ ｌｉｔｅ ２０１２（Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて定量化し、ＲＯＩ（２０μｍｘ２０μｍ）あたりの平均ピクセル強度を算出した。
そして、無作為に設定した１０の画像からデータを取得し、統計分析（一元配置分散分析及びＴｕｋｅｙの多重比較検定）によるマウスグループ間の比較に供した。
（参考例）
＜ＰＧＲＮ−ＫＩマウスの表現型についての解析＞
前述の通りにＰＧＲＮ（プログラニュリン）遺伝子にストップ変異を導入したＰＧＲＮ−ＫＩマウスが、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）の表現型を示しているかどうかを先ず解析した。
ＰＧＲＮが関連するＦＴＬＤは、核及び細胞質内におけるＴＤＰ４３凝集によって特徴付けられるＦＴＬＤ−ＴＤＰに分類される。なお、ＴＤＰ４３はＲＮＡプロセシングに関与する核タンパク質であるが、細胞質内移行により前記凝集が生じることとなる。
そこで、抗ＴＤＰ４３抗体によって、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスの脳組織を染色した。その結果、図には示さないが、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスの前頭皮質において、１ヶ月齢から、ＴＤＰ４３染色のシグナル強度は不均一であった。また、抗ＴＤＰ４３抗体によって染色されない又は弱く染色される神経細胞の数は、バックグラウンドマウスのそれと比較して、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいて明らかに増加しており、さらにその差は経時的に顕著になっていた。
また、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいて、細胞質内封入体、レンズ核内封入体（ｌｅｎｔｉｆｏｒｍ ｉｎｔｒａｎｕｃｌｅａｒ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）及びＴＤＰ４３の細胞質内染色が確認された。さらに、当該マウスにおいては、ユビキチン陽性の凝集も確認された。
これらの特徴はヒトにおけるＰＧＲＮが関連するＦＴＬＤにおいて認められる病理学的所見である。したがって、病理学上においては、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスは当該疾患の患者と同様であることが明らかになった。
一方、ヒト病理学上めったにないｐ６２及びＦＵＳ封入体が、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいて非典型的な所見として確認された。これら抗ｐ６２抗体又は抗ＦＵＳ抗体が認識する封入体は、４月齢の前頭皮質（Ｍ２）に検出され、６月齢においては頭頂皮質にまで及んでいた。また、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいて、１２月齢までにＴｕｎｅｌ染色によって検出されるアポトーシスの明らかな増加は認められなかった。
また、前記タンパク質凝集についての解析に加え、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいて炎症の活性化が生じているかどうかについて解析した。なお、炎症の活性化は、多種の神経変性疾患を通して共通して見られる特徴である。ＰＧＲＮ−ＫＩマウスに対し、抗ＩＢＡ１抗体及び抗ＧＦＡＰ抗体による免疫染色を行った結果、ミクログリア及びアストロサイトにおいて各々活性化していることが明らかになった。また、かかる炎症の活性化は、ＩＬ−１ｂ及びＣｏｘ−２を対象とする定量的ＰＣＲによっても確認することができた。しかしながら、ＣＤ４又はＣＤ８陽性細胞の浸潤は認められなかった。
さらに、神経変性疾患の共通したもう一つの特徴としてＤＮＡ損傷があるが、６月齢の皮質神経細胞において明らかなγＨ２ＡＸのフォーカス形成の増加が認められたため、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいてもＤＮＡ損傷が生じていることが明らかになった。
また、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスについても、上述のアルツハイマー病モデルマウス同様に６種の行動試験を行ったところ、オープンフィールド試験、明暗ボックス試験及び高架式十字迷路試験において、不安記憶（ａｎｘｉｅｔｙ ｍｅｍｏｒｙ）及び不安関連記憶（ａｎｘｉｅｔｙ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍｅｍｏｒｙ）における異常は認められなかった。しかしながら、恐怖条件付け試験においては、明らかな記憶形成の低減が認められた。なお、ロータロッド試験においては異常なスコアが認められなかったため、この記憶形成の低減は、感覚機能又は運動機能の障害に依るものではないといえる。また、モリス水迷路試験において、３月齢から、目標とする領域において留まる時間又は当該目標を横切る回数に関し、統計学上有意な低減が認められ、この結果からＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいて記憶形成の喪失が生じていることが裏付けられた。なお、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスを用いたモリス水迷路試験においては、５日間、マウスに６０秒の試行を１日当たり４回受けさせ、プラットフォームの位置（目標とする領域）について学習させた。そして、該プラットフォームを除去した条件下において同試験を行い、マウスが、プラットフォームが元あった目標とする領域において留まる時間及び当該目標を横切る回数を測定した。また、行動試験上認められたこれら特性は、主に認知症を発症させるＲ５０４ストップ変異を有するＦＴＬＤ患者の臨床症状と大概一致するものである。
以上の通り、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスは、病理学上所見においても、また臨床症状においても、ＦＴＬＤ患者のそれらを反映しており、当該マウスはＦＴＬＤのモデル動物として極めて有用であることが明らかになった。
（実施例７）
＜ＦＴＬＤについてのフォスフォプロテオーム解析＞
ＦＴＬＤモデル動物としての有用性が実証された前記ＰＧＲＮ−ＫＩマウスを用いて、上記アルツハイマー病についての解析同様に、ＦＴＬＤについても該疾患におけるリン酸化シグナル伝達を網羅的に解析（フォスフォプロテオーム解析）し、その病変において中心的な役割を担うリン酸化シグナル伝達の同定を試みた。
特に、ＰＧＲＮはＴＮＦに対して拮抗的作用を示すことが報告されている一方で、相反する結果も報告されている（非特許文献１７〜２１ 参照）。この不可解さを解明すべく、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスの大脳皮質組織について包括的なプロテオーム解析を行い、ＰＧＲＮ変異関連ＦＴＬＤのモデルマウスの脳内においては、ＴＮＦシグナル伝達経路が活性化しているのか、それとも異なるタイプのシグナル伝達経路が活性化しているのかを調べた。
すなわち、３匹のＰＧＲＮ−ＫＩマウス由来の大脳皮質組織と、３匹のバックグランドマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）由来のそれらとを対象として、ＡＢＳＣＩＥＸ５６００を用い、上記アルツハイマー病同様に、包括的なプロテオーム解析を行った。
そして、このようにして構築した包括的なプロテオームデータに基づき、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスの大脳皮質組織において、ＴＮＦシグナル伝達経路が活性化しているかどうかを調べた。具体的には、ＫＥＧＧ（京都遺伝子ゲノム百科事典）のシグナル伝達経路に関するデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／ｐａｔｈｗａｙ．ｈｔｍｌ）を用い、ＴＮＦシグナル伝達経路に属するタンパク質に関し、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスとにおいて、リン酸化状態が変化しているタンパク質を探索した。その結果、驚くべきことに、ＴＮＦシグナル伝達経路自体においては、生後１〜６月の間、発症した後において、リン酸化が変化しているタンパク質を見出すことはできなかった。
そこで次に、アディポサイトカインシグナル伝達経路、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達経路及びアポトーシスシグナル伝達経路を含む、１６のＴＮＦ関連シグナル伝達経路を対象として解析を行った。その結果、ＭＡＰＫシグナル伝達経路、ｍＴＯＲシグナル伝達経路、並びに抗原プロセシング及び提示に関するシグナル伝達経路において、これらシグナル伝達経路に属するタンパク質のリン酸化が、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比較して、顕著に変化していることが明らかになった。
さらに、これらシグナル伝達経路において、リン酸化の顕著な最も変化は、ｔａｕタンパク質のリン酸化に至るＭＡＰＫシグナル伝達経路に集中していることも明らかになった。
なお、ｍＴＯＲシグナル伝達経路と、ＭＡＰＫシグナル伝達経路とは、ＰＫＣが活性化しているという点において共通していた。一方で、抗原プロセシング及び提示に関するシグナル伝達経路に関しては、タンパク質のリン酸化は生後１〜６月の間で変動していた。
ＭＡＰＫシグナル伝達経路は、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいて、その発症前段階から明らかに活性化しており、病状が進行している期間においても、該シグナル伝達経路に属する複数のタンパク質は常に高リン酸化状態にあった。
特に、ＭＡＰＫシグナル伝達経路に属する７つのタンパク質、ｂ−ｒａｆ、ＰＫＣα、ＰＫＣβ、ＰＫＣγ、ｔａｕ、ＭＡＰ２Ｋ１（マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ１、ＭＡＰキナーゼキナーゼ１、ＭＥＫ−１）及びスタスミンにおいて、それら各タンパク質の１又は２のアミノ酸部位におけるリン酸化（質量分析において検出されたリン酸化ペプチド量）は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比較して、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいて顕著に変化していた。
重要なことに、ｔａｕタンパク質のリン酸化は多数の部位において有意に変化していた。特に、ｔａｕタンパク質の２０３位のセリン、２２０位のスレオニン及び３９３位のセリン（ヒトにおけるｔａｕタンパク質の２１４位のセリン、２３１位のスレオニン及び４０４位のセリンに各々相当）は、上記期間において常に高リン酸化状態にあるか、または経時的にリン酸化が亢進していた。
また、ｂ−ｒａｆ及びＰＫＣγに関しても、１又は複数の部位において、常に高リン酸化状態にあるか、経時的にリン酸化が亢進していた。
より具体的には、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいて、ｂ−ｒａｆの３４８位のセリンにおけるリン酸化は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのそれの１．１４８７倍、１．１７９５倍及び１．３６６４倍（各々、１月齢、３月齢及び６月齢における相対値を示す）であった。また、ｂ−ｒａｆの７６６位のセリンに関しては、１．７５０８倍及び３．０４７６倍（各々、３月齢及び６月齢における相対値を示す）であった。また、ｂ−ｒａｆの７６９位のセリンに関しては、１．９７５２倍（６月齢における相対値を示す）であった。なお、前記ｂ−ｒａｆの３４８位のセリン、７６６位のセリン及び７６９位のセリンは、ヒトにおいては、３６５位のセリン、７２９位のセリン及び７３２位のセリンに各々相当する。
また、ＰＫＣγに関しては、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいて、その６５５位のスレオニンにおけるリン酸化は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのそれの１．２０５２倍、１．１３０８倍及び１．５７０２倍（各々、１月齢、３月齢及び６月齢における相対値を示す）であった。また、ＰＫＣγの６９０位のセリンに関しては、２．５９１８倍（１月齢における相対値を示す）であった。なお、前記ＰＫＣγの６５５位のスレオニン及び６９０位のセリンは、ヒトにおいては、６５５位のスレオニン及び６９０位のセリンに各々相当する。
また、図には示さないが、上記質量分析の結果同様に、ｂ−ｒａｆにおける７６６位のセリン及びＰＫＣγにおける６５５位のスレオニンに関し、ウェスタンブロッティングにより、それら部位のリン酸化が、ＰＧＲＮ−ＫＩマウス３ヶ月齢の大脳皮質において、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス３ヶ月齢のそれらと比較して、各々亢進していることも確認している。
さらに、ｂ−ｒａｆ及びＰＫＣγの下流に位置するＭＥＫ−１（Ｍａｐ２ｋ１）のリン酸化についてもウェスタンブロッティングにより解析し、ＰＧＲＮ−ＫＩマウス３ヶ月齢の大脳皮質において、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス３ヶ月齢のそれと比較して、亢進していることも確認している。
また、抗リン酸化ｔａｕ抗体ＡＴ８を用いた免疫組織学的解析にて、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスの前頭葉神経細胞の細胞質において、リン酸化されたｔａｕタンパク質の検出を試みたところ、１２月齢においてリン酸化ｔａｕタンパク質のシグナルが検出された。
一方、ＴＮＦによって誘導されるシグナル伝達を、該シグナル伝達において形成される複合体（ＴＮＦＲ−ＴＲＡＤＤ複合体、ＴＮＦＲ−ＲＩＰ複合体及びＴＮＦＲ−ＴＲＡＦ２複合体）の量を指標として、免疫共沈法により解析した結果、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスとの間にて有意な差を見出すことはできなかった。
以上の結果から、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいては、ＭＡＰＫシグナル伝達経路は活性化している一方で、ＴＮＦシグナル伝達経路は活性化していないことが明らかになった。
（実施例８）
＜ｂ−ｒａｆ阻害剤による、ＦＴＬＤモデルマウスの行動的表現型に対する治療効果についての解析＞
ＭＡＰＫシグナル伝達経路における異常な活性化を、ｂ−ｒａｆ特異的な阻害剤を用いて抑制することにより、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスの行動的表現型が回復されるかどうかを解析した。
すなわち、図２１に示したプロトコールの通り、生後６週齢から６週間かけて、毎日ｂ−ｒａｆ特異的阻害剤 べムラフェニブ又はＰＢＳを、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスに与えた。そして、モリス水迷路試験及び恐怖条件付け試験にて、これらマウスの行動を評価した。得られた結果を図２２及び２３に示す。
図２３及び２３に示した結果から明らかなように、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスにべムラフェニブを投与することによって、前記２試験におけるスコアは顕著に回復した。
また、サリドマイドによる治療効果についても試験した。なお、サリドマイドは、ＴＮＦシグナル伝達経路を抑制することが知られている。具体的には、図２４に示したプロトコールの通り、ｂ−ｒａｆ阻害剤を用いた際のプロトコール同様の期間において、腹膜腔注射によって、サリドマイドをＰＧＲＮ−ＫＩマウスに毎日投与し、前記２試験にて、これらマウスの行動を評価した。得られた結果を図２５及び２６に示す。
図２５及び２６に示した結果から明らかなように、最終的には、モリス水迷路試験及び恐怖条件付け試験のスコアに関し、サリドマイドの投与例においても有益な効果が確認された。
なお、このような症状の回復は、ＰＢＳを投与したＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいては認められなかった。
また、薬剤処理したＰＧＲＮ−ＫＩマウスの大脳皮質をウェスタンブロットにて解析した結果、図２７に示す通り、べムラフェニブはｂ−ｒａｆのリン酸化を抑制していることが確認された。さらには、べムラフェニブによってＰＫＣのリン酸化も抑制されていることが明らかになった。
一方、サリドマイドの投与例においては、図２８に示した結果から明らかなように、ｂ−ｒａｆのリン酸化は抑制されたものの、ＰＫＣのリン酸化は抑制されなかった。
これらの結果から、総じて、ＦＴＬＤが関与する表現型における２つの薬剤による治療効果は、ｂ−ｒａｆ経路の阻害を介して奏されるということが明らかになった。
（実施例９）
＜ｂ−ｒａｆ阻害剤及びｔａｕノックダウンによる、ＦＴＬＤモデルマウスのスパイン表現型に対する回復効果についての解析＞
アルツハイマー病及びＦＴＬＤ−Ｔａｕにおいて、ｔａｕのリン酸化は、対らせん状繊維（ＰＨＦ）の形成及び該タンパク質の細胞質内凝集に関与していることが知られている。また、ｔａｕとアミロイドβ（Ａβ）との関連性についても、アルツハイマー病の病理学上報告されており、かかる知見から、ｔａｕは通常Ａβの下流に位置するエフェクター分子として考えられている。
また、シナプス機能に対してＡβが毒性を示す初期の病理学上段階にて、ｔａｕはシナプススパインにおいて異なる重要な役割を担っていることが、最近明らかになった。
さらに、ＮＭＤＡＲをリン酸化するＦｙｎキナーゼによる、ｔａｕのスパインへの移行は、カルシウム濃度の亢進、並びにスパインの細胞骨格の破壊の引き金となるということも報告されている。
そこで、以上の知見に基づき、２つの仮説をたて検討した。すなわち、第１の仮説として、ｂ−ｒａｆのリン酸化抑制による前記治療効果は、べムラフェニブ又はサリドマイドによって、神経におけるタンパク質凝集が解消されるということに基づいているということを想定し、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスの大脳皮質におけるタンパク質凝集に対する、べムラフェニブ又はサリドマイドによる回復効果について解析した。
しかしながら、図には示さないが、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスの脳に関する免疫組織的解析によって、ＦＵＳ及びｐ６２封入体（ＩＢ）において、べムラフェニブ又はサリドマイドによる有意な効果は認められなかった。また、ＴＤＰ４３の細胞質内への移行についても、べムラフェニブ又はサリドマイドを投与したＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいて、大きな変化は認められなかった。
そこで、次に、ｔａｕにおける異常なリン酸化によってシナプススパインが損なわれているということを第２の仮説としてたてた。すなわち、べムラフェニブ又はサリドマイドによる前記治療効果は、ｂ−ｒａｆのリン酸化抑制を介したシナプススパインの回復によって奏されるということを想定し、２光子顕微鏡によるシナプススパインのインビボイメージングを行った。
具体的には、ＰＧＲＮ−ＫＩマウス及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脳梁膨大後部異顆粒皮質（ＲＳＤ）にＥＧＦＰ発現ＡＡＶを注入した。そして、その２週間後に２光子顕微鏡によるシナプススパインのインビボイメージングを行った。得られた結果を図２９及び３０に示す。
図２９に示す通り、レイヤー１のＥＧＦＰ陽性神経細胞をインビボイメージングした結果、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいて、スパイン密度が顕著に減少していることが明らかになった。なお、長さ、径及び体積といったスパインの他のパラメーターは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのそれらと大した違いはなかった。以上のことから、スパイン密度の減少は、比較的長い時間を要する表現型であることが示唆される。
さらに図３０に示す通り、一貫して、３つの時点においてスパイン動態を観察した結果、いずれの時点においても、生産されたスパイン、除去されたスパイン、安定して残ったスパインの数は２４時間以内に有意に変化することはなかった。
また、べムラフェニブ及び／又はｔａｕノックダウンは、スパインに関する表現型を回復できるかどうかについても解析した。得られた結果を、図３１及び３２に示す。
図３１に示す通り、２光子顕微鏡による観察した結果、浸透圧ポンプによってべムラフェニブを投与することにより、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスのスパイン数は回復することが明らかになった。
また、図３２に示す通り、ｔａｕに対するｓｈＲＮＡ（ｓｈ−ｔａｕ）を発現するレンチウィルスベクターによってＴａｕをノックダウンした結果、インビボにおけるスパイン数の回復効果が認められた。
図３１及び３２に示す通り、シナプススパインにおける変化は、前記両処置において同様であったが、静止したスパインの形態上においては、わずかな相違が検出された。すなわち、ｂ−ｒａｆ阻害によりスパインの体積は減少する傾向が認められた一方で、ｔａｕノックダウンにおいては、それは増加する傾向にあった。この傾向の差異は、べムラフェニブ及びｓｈ−ｔａｕによって、増加しているスパインが、前者においては薄い（ｔｈｉｎ）スパインであるのに対し、後者においては厚い（ｔｈｉｃｋ）スパインであるということに基づくものと考えられる。しかしながら、図３１及び３２に示す通り、その差は安定することなく、統計学上の有意差として確認することはできなかった。
また、スパインの動態についても観察したが、図３３に示す通り、スパインの産生又は除去において、いずれの変化も検出することはできなかった。
以上の結果から、べムラフェニブ投与又はｔａｕノックダウンによって、スパイン数の回復効果が奏されることが明らかになった。また、これらの結果を通しても、ｔａｕを含むＭＡＰＫ経路の活性化が、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおける行動異常の主要なメカニズムであることが確認された。
以上説明したように、アルツハイマー病の発症前段階において、ＭＡＲＣＫＳ、Ｍａｒｃｋｓｌ１、ＳＲＲＭ２、ＳＰＴＡ２、ＡＤＤＢ、ＮＥＵＭ、ＢＡＳＰ１、ＳＹＴ１、Ｇ３Ｐ、ＨＳ９０Ａ、ＣＬＨ、ＮＦＨ、ＮＦＬ、ＧＰＲＩＮ１、ＡＣＯＮ、ＡＴＰＡ及びＡＴＰＢから構成されるＡＤコアネットワークのリン酸化が、段階的に亢進していくことによって、樹状突起スパインの動態等に影響が生じ、ひいてはアルツハイマー病の発症に至ることが明らかになった。また、ＡＤコアネットワークのリン酸化は、ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＣＳＫ及びＬｙｎによって奏され、さらに、アルツハイマー病の進行において重要なアミロイド病変からｔａｕ病変への移行の促進（ｔａｕタンパク質のリン酸化の亢進）にｂ−ｒａｆが関与していることも明らかになった。
したがって、本発明は、ＡＤコアネットワークを構成する前記タンパク質及びそれらタンパク質をリン酸化するキナーゼを対象とするものであり、アルツハイマー病の早期診断方法及び治療方法、並びにこれら方法に利用できる薬剤の提供において有用である。
また、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）に関しても、その発症前段階から、ＴＮＦ関連シグナル伝達経路、特にＭＡＰＫシグナル伝達経路が活性化しており、当該活性化によりＦＴＬＤ患者におけるシナプススパインの数が減少し、ひいては行動異常等の発症に至るということが明らかになった。
したがって、本発明は、ＭＡＰＫシグナル伝達経路に属するｂ−ＲＡＦを対象とするものであり、ＦＴＬＤの診断方法及び治療方法、並びにこれら方法に利用できる薬剤の提供において有用である。

Claims (7)

  1. アルツハイマー病の発症前段階又はアルツハイマー病を発症する危険性を診断するための方法であって、
    （ｉ）被検体において、基質タンパク質のリン酸化を検出する工程、
    （ii）該リン酸化と、正常検体における基質タンパク質のリン酸化とを比較する工程、及び、
    （iii）前記被検体における基質タンパク質のリン酸化が、前記正常検体における基質タンパク質のリン酸化よりも高いことは、前記被検体はアルツハイマー病の発症前段階にあること、またはアルツハイマー病を発症する危険性を有していることを示す工程
    を含み、かつ
    前記基質タンパク質がＭＡＲＣＫＳである、方法。
  2. ＭＡＲＣＫＳのリン酸化部位に対して結合活性を有する化合物を含有する、アルツハイマー病の発症前段階又はアルツハイマー病を発症する危険性を診断するための薬剤。
  3. アルツハイマー病の発症前段階又はアルツハイマー病を発症する危険性を診断するための候補化合物のスクリーニング方法であって、
    ＭＡＲＣＫＳのリン酸化部位と、被験化合物とを接触させ、前記リン酸化部位と結合する化合物を選択する工程を含む方法。
  4. ＭＡＲＣＫＳのリン酸化を抑制する化合物を含有する、アルツハイマー病の病変を抑制するための薬剤。
  5. ＭＡＲＣＫＳと、ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＣＳＫ、Ｌｙｎ及びｂ−ＲＡＦからなる群から選択される少なくとも１のキナーゼタンパク質との結合を抑制する化合物を含有する、アルツハイマー病の病変を抑制するための薬剤。
  6. アルツハイマー病の病変を抑制するための候補化合物のスクリーニング方法であって、
    （ｉ）基質タンパク質のリン酸化を検出しうる系に、被験化合物を適用させる工程、並びに、
    （ii）該基質タンパク質のリン酸化を抑制する化合物を選択する工程
    を含み、かつ
    前記基質タンパク質がＭＡＲＣＫＳである、方法。
  7. アルツハイマー病の病変を抑制するための候補化合物のスクリーニング方法であって、
    （ａ）被験化合物の存在下で、ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＣＳＫ、Ｌｙｎ及びｂ−ＲＡＦからなる群から選択される少なくとも１のキナーゼタンパク質と、基質タンパク質とを接触させる工程、
    （ｂ）前記キナーゼタンパク質と前記基質タンパク質との結合を検出する工程、
    （ｃ）前記結合を抑制する化合物を選択する工程を含み、かつ
    前記基質タンパク質がＭＡＲＣＫＳである、方法。
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