JP6584322B2 - アルツハイマー病及び前頭側頭葉変性症の診断方法、診断薬、治療薬、及びこれら薬剤のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
<1> アルツハイマー病を診断する方法であって、
(i)被検体において、MARCKS、Marcksl1、SRRM2、SPTA2、ADDB、NEUM、BASP1、SYT1、G3P、HS90A、CLH、NFH、NFL、GPRIN1、ACON、ATPA及びATPBからなる群から選択される少なくとも1の基質タンパク質のリン酸化を検出する工程、
(ii)該リン酸化と、正常検体における基質タンパク質のリン酸化とを比較する工程、及び、
(iii)該比較の結果、前記被検体における基質タンパク質のリン酸化が、前記正常検体における基質タンパク質のリン酸化よりも高い場合、前記被検体はアルツハイマー病を罹患している、またはアルツハイマー病を発症する危険性を有していると判定する工程
を含む、方法。
<2> アルツハイマー病を診断する方法であって、
(i)被検体において、キナーゼタンパク質の活性又は発現を検出する工程、
(ii)該活性又は発現と、正常検体におけるキナーゼタンパク質の活性又は発現とを比較する工程、及び、
(iii)該比較の結果、前記被検体におけるキナーゼタンパク質の活性又は発現が、前記正常検体におけるキナーゼタンパク質の活性又は発現よりも高い場合、前記被検体はアルツハイマー病を罹患している、またはアルツハイマー病を発症する危険性を有していると判定する工程
を含み、かつ前記キナーゼタンパク質が、PKC、CaMK、CSK、Lyn及びb−RAFからなる群から選択される少なくとも1のキナーゼタンパク質である、方法。
<3> MARCKS、Marcksl1、SRRM2、SPTA2、ADDB、NEUM、BASP1、SYT1、G3P、HS90A、CLH、NFH、NFL、GPRIN1、ACON、ATPA及びATPBからなる群から選択される少なくとも1の基質タンパク質のリン酸化部位に対して結合活性を有する化合物を含有する、アルツハイマー病を診断するための薬剤。
<4> PKC、CaMK、CSK、Lyn及びb−RAFからなる群から選択される少なくとも1のキナーゼタンパク質に対して結合活性を有する化合物を含有する、アルツハイマー病を診断するための薬剤。
<5> アルツハイマー病を診断するための候補化合物のスクリーニング方法であって、
MARCKS、Marcksl1、SRRM2、SPTA2、ADDB、NEUM、BASP1、SYT1、G3P、HS90A、CLH、NFH、NFL、GPRIN1、ACON、ATPA及びATPBからなる群から選択される少なくとも1の基質タンパク質のリン酸化部位と、被験化合物とを接触させ、前記リン酸化部位と結合する化合物を選択する工程を含む方法。
<6> アルツハイマー病を診断するための候補化合物のスクリーニング方法であって、
PKC、CaMK、CSK、Lyn及びb−RAFからなる群から選択される少なくとも1のキナーゼタンパク質と、被験化合物とを接触させ、前記キナーゼタンパク質と結合する化合物を選択する工程を含む方法。
<7> MARCKS、Marcksl1、SRRM2、SPTA2、ADDB、NEUM、BASP1、SYT1、G3P、HS90A、CLH、NFH、NFL、GPRIN1、ACON、ATPA及びATPBからなる群から選択される少なくとも1の基質タンパク質のリン酸化を抑制する化合物を含有する、アルツハイマー病を治療するための薬剤。
<8> PKC、CaMK、CSK、Lyn及びb−RAFからなる群から選択される少なくとも1のキナーゼタンパク質の活性又は発現を抑制する化合物を含有する、アルツハイマー病を治療するための薬剤。
<9> 前記化合物が、PLX−4720、ソラフェニブ、GDC−0879、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ソラフェニブトシレート及びLGX818からなる群から選択される少なくとも1の、b−RAFの活性又は発現を抑制する化合物である、<8>に記載の薬剤。
<10> 前記化合物がベムラフェニブである、<9>に記載の薬剤。
<11> MARCKS、Marcksl1、SRRM2、SPTA2、ADDB、NEUM、BASP1、SYT1、G3P、HS90A、CLH、NFH、NFL、GPRIN1、ACON、ATPA及びATPBからなる群から選択される少なくとも1の基質タンパク質と、PKC、CaMK、CSK、Lyn及びb−RAFからなる群から選択される少なくとも1のキナーゼタンパク質との結合を抑制する化合物を含有する、アルツハイマー病を治療するための薬剤。
<12> アルツハイマー病を治療するための候補化合物のスクリーニング方法であって、
(i)MARCKS、Marcksl1、SRRM2、SPTA2、ADDB、NEUM、BASP1、SYT1、G3P、HS90A、CLH、NFH、NFL、GPRIN1、ACON、ATPA及びATPBからなる群から選択される少なくとも1の基質タンパク質のリン酸化を検出しうる系に、被験化合物を適用させる工程、並びに、
(ii)該基質タンパク質のリン酸化を抑制する化合物を選択する工程
を含む、方法。
<13> アルツハイマー病を治療するための候補化合物のスクリーニング方法であって、
(i)PKC、CaMK、CSK、Lyn及びb−RAFからなる群から選択される少なくとも1のキナーゼタンパク質の活性又は発現を検出しうる系に、被験化合物を適用させる工程、並びに、
(ii)該タンパク質の活性又は発現を抑制する化合物を選択する工程
を含む、方法。
<14> 下記(a)〜(c)の工程を含む、アルツハイマー病を治療するための候補化合物のスクリーニング方法
(a)被験化合物の存在下で、PKC、CaMK、CSK、Lyn及びb−RAFからなる群から選択される少なくとも1のキナーゼタンパク質と、MARCKS、Marcksl1、SRRM2、SPTA2、ADDB、NEUM、BASP1、SYT1、G3P、HS90A、CLH、NFH、NFL、GPRIN1、ACON、ATPA及びATPBからなる群から選択される少なくとも1の基質タンパク質とを接触させる工程、
(b)前記キナーゼタンパク質と前記基質タンパク質との結合を検出する工程、
(c)前記結合を抑制する化合物を選択する工程。
<15> b−RAFの活性又は発現を抑制する化合物を含有する、前頭側頭葉変性症を治療するための薬剤。
<16> 前記化合物が、PLX−4720、ソラフェニブ、GDC−0879、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ソラフェニブトシレート及びLGX818からなる群から選択される少なくとも1の化合物である、<15>に記載の薬剤。
<17> 前記化合物がベムラフェニブである、<16>に記載の薬剤。
<18> b−RAFに対して結合活性を有する化合物を含有する、前頭側頭葉変性症を診断するための薬剤。
後述の実施例において示す通り、複数のアルツハイマー病モデルマウスにおいて、それらの発症前に、MARCKS、Marcksl1、SRRM2、SPTA2、ADDB、NEUM、BASP1、SYT1、G3P、HS90A、CLH、NFH、NFL、GPRIN1、ACON、ATPA及びATPBのリン酸化が共通して亢進していることが明らかになった。したがって、本発明においては、これらタンパク質のリン酸化を指標とする、下記工程(i)〜(iii)を含むアルツハイマー病を診断する方法が提供される。
(i)被検体において、MARCKS、Marcksl1、SRRM2、SPTA2、ADDB、NEUM、BASP1、SYT1、G3P、HS90A、CLH、NFH、NFL、GPRIN1、ACON、ATPA及びATPBからなる群から選択される少なくとも1の基質タンパク質のリン酸化を検出する工程、
(ii)該リン酸化と、正常検体における基質タンパク質のリン酸化とを比較する工程、及び、
(iii)該比較の結果、前記被検体における基質タンパク質のリン酸化が、前記正常検体における基質タンパク質のリン酸化よりも高い場合、前記被検体はアルツハイマー病を罹患している、またはアルツハイマー病を発症する危険性を有していると判定する工程
を含む、方法。
また、後述の実施例において示す通り、前記MARCKS等の基質タンパク質をリン酸化するキナーゼタンパク質は、アルツハイマー病モデルマウスにおいて、その発症前に活性化していることも明らかになった。したがって、本発明においては、アルツハイマー病の診断方法の第2の態様として、下記工程(i)〜(iii)を含む方法も提供される。
(i)被検体において、キナーゼタンパク質の活性又は発現を検出する工程、
(ii)該活性又は発現と、正常検体におけるキナーゼタンパク質の活性又は発現とを比較する工程、及び、
(iii)該比較の結果、前記被検体におけるキナーゼタンパク質の活性又は発現が、前記正常検体におけるキナーゼタンパク質の活性又は発現よりも高い場合、前記被検体はアルツハイマー病を罹患している、またはアルツハイマー病を発症する危険性を有していると判定する工程
を含み、かつ前記キナーゼタンパク質が、PKC、CaMK、CSK、Lyn及びb−RAFからなる群から選択される少なくとも1のキナーゼタンパク質である、方法。
アルツハイマー病の治療方法を提供することもできる。
前述の通り、複数のアルツハイマー病モデルマウスにおいて、それらの発症前に、MARCKS等のリン酸化が共通して亢進していることが明らかになった。したがって、本発明においては、MARCKS、Marcksl1、SPRM2、SPTA2、ADDB、NEUM、BASP1、SYT1、G3P、HS90A、CLH、NFH、NFL、GPRIN1、ACON、ATPA及びATPBからなる群から選択される少なくとも1の基質タンパク質のリン酸化部位に対して結合活性を有する化合物を含有する、アルツハイマー病を診断するための薬剤が提供される(アルツハイマー病を診断するための薬剤のことを以下「アルツハイマー病診断薬」とも称する)。
前述の通り、複数のアルツハイマー病モデルマウスにおいて、それらの発症前に、MARCKS等の基質タンパク質のリン酸化が共通して亢進していることが明らかになった。さらに、これら基質タンパク質をリン酸化するキナーゼタンパク質は、アルツハイマー病モデルマウスにおいて、その発症前に活性化していることも明らかになった。したがって、かかる知見に基づき、本発明は、以下に示す2態様の、アルツハイマー病を診断するための候補化合物のスクリーニング方法を提供することができる。
(1) MARCKS、Marcksl1、SPRM2、SPTA2、ADDB、NEUM、BASP1、SYT1、G3P、HS90A、CLH、NFH、NFL、GPRIN1、ACON、ATPA及びATPBからなる群から選択される少なくとも1の基質タンパク質のリン酸化部位と、被験化合物とを接触させ、前記リン酸化部位と結合する化合物を選択する工程を含む方法。
(2) PKC、CaMK、CSK、Lyn及びb−RAFからなる群から選択される少なくとも1のキナーゼタンパク質と、被験化合物とを接触させ、前記キナーゼタンパク質と結合する化合物を選択する工程を含む方法。
後述の実施例において示す通り、複数のアルツハイマー病モデルマウスにおいて、それらの発症前に、MARCKS等の基質タンパク質のリン酸化が共通して亢進していることが明らかになった。さらに、かかる基質タンパク質の発現をshRNAにより抑制することによって、アルツハイマー病モデルマウスにおける病変(スパイン形成の異常)を抑制できることも見出した。
後述の実施例において示す通り、前記基質タンパク質をリン酸化するキナーゼタンパク質は、アルツハイマー病モデルマウスにおいて、その発症前に活性化していることも明らかになった。さらに、かかるキナーゼタンパク質に対する阻害剤を用い、該タンパク質の活性化を抑制することによって、アルツハイマー病モデルマウスにおける病変を抑制できることも見出した。
前述の通り、MARCKS等の基質タンパク質のリン酸化を抑制することによって、アルツハイマー病モデルマウスにおける病変を抑制できることが明らかになった。したがって、該リン酸化に必要なMARCKS等の基質タンパク質とPKC等のキナーゼタンパク質との結合を抑制しても、該病変を抑制できる。
後述の実施例において示す通り、Lynに関しては活性化することによっても、アルツハイマー病モデルマウスにおける病変を抑制できることが明らかになった。したがって、本発明においては、アルツハイマー病の治療薬として、Lynを活性化する化合物を含有する薬剤も提供される。本発明の治療薬の標的となるLynは、上述の<アルツハイマー病の診断薬>に記載の通りである。
前述の通り、アルツハイマー病モデルマウスにおいて、MARCKS等の基質タンパク質の発現抑制を介して、該タンパク質のリン酸化を抑制することにより、該マウスにおける病変を抑制できることを見出した。したがって、かかる知見に基づき、本発明においては、下記アルツハイマー病を治療するための候補化合物のスクリーニング方法も提供される。
(i)MARCKS、Marcksl1、SPRM2、SPTA2、ADDB、NEUM、BASP1、SYT1、G3P、HS90A、CLH、NFH、NFL、GPRIN1、ACON、ATPA及びATPBからなる群から選択される少なくとも1の基質タンパク質のリン酸化を検出しうる系に、被験化合物を適用させる工程、並びに、
(ii)該基質タンパク質のリン酸化を抑制する化合物を選択する工程
を含む、方法。
前述の通り、アルツハイマー病モデルマウスにおいて、PKC等のキナーゼタンパク質の活性化を抑制しても、該マウスにおける病変を抑制できることを見出した。したがって、かかる知見に基づき、本発明においては、アルツハイマー病を治療するための候補化合物のスクリーニング方法の第2の態様として、下記方法も提供される。
(i)PKC、CaMK、CSK、Lyn及びb−RAFからなる群から選択される少なくとも1のキナーゼタンパク質の活性又は発現を検出しうる系に、被験化合物を適用させる工程、並びに、
(ii)該タンパク質の活性又は発現を抑制する化合物を選択する工程
を含む、方法。
前述の通り、MARCKS等の基質タンパク質のリン酸化を抑制することによって、アルツハイマー病モデルマウスにおける病変を抑制できることが明らかになった。したがって、該リン酸化に必要なMARCKS等の基質タンパク質とPKC等のキナーゼタンパク質との結合を抑制しても、該病変を抑制できる。
(a)被験化合物の存在下で、PKC、CaMK、CSK、Lyn及びb−RAFからなる群から選択される少なくとも1のキナーゼタンパク質と、MARCKS、Marcksl1、SPRM2、SPTA2、ADDB、NEUM、BASP1、SYT1、G3P、HS90A、CLH、NFH、NFL、GPRIN1、ACON、ATPA及びATPBからなる群から選択される少なくとも1の基質タンパク質とを接触させる工程、
(b)前記キナーゼタンパク質と前記基質タンパク質との結合を検出する工程、
(c)前記結合を抑制する化合物を選択する工程。
後述の実施例において示す通り、tauタンパク質等の基質タンパク質をリン酸化するキナーゼタンパク質 b−RAFタンパク質は、前頭側頭葉変性症モデルマウスにおいて、その発症前に活性化していることが明らかになった。したがって、本発明においては、前頭側頭葉変性症の診断方法として、下記工程(i)〜(iii)を含む方法も提供される。
(i)被検体において、b−RAFタンパク質の活性又は発現を検出する工程、
(ii)該活性又は発現と、正常検体におけるb−RAFタンパク質の活性又は発現とを比較する工程、及び、
(iii)該比較の結果、前記被検体におけるb−RAFタンパク質の活性又は発現が、前記正常検体におけるb−RAFタンパク質の活性又は発現よりも高い場合、前記被検体は前頭側頭葉変性症を罹患している、または前頭側頭葉変性症を発症する危険性を有していると判定する工程
を含む、方法。
前述の通り、tauタンパク質等の基質タンパク質をリン酸化するキナーゼタンパク質b−RAFは、その発症前に活性化していることが明らかになった。したがって、本発明においては、b−RAFに対して結合活性を有する化合物を含有する、前頭側頭葉変性症を診断するための薬剤が提供される。
後述の実施例において示す通り、tauタンパク質等の基質タンパク質ををリン酸化するb−RAFタンパク質は、前頭側頭葉変性症モデルマウスにおいて、その発症前に活性化していることも明らかになった。さらに、b−RAFタンパク質に対する阻害剤を用い、該タンパク質の活性化を抑制することによって、前頭側頭葉変性症モデルマウスにおける病変を抑制できることも見出した。
本実施例においては、先ず、アルツハイマー病の発症の前段階において中心的な役割を担っているリン酸化タンパク質、キナーゼタンパク質、及びそれらタンパク質から構成されるネットワークを同定し、ひいてはアルツハイマー病の診断及び治療に有用な標的分子を提供するために、以下に示す実験方法等を行った。
本実施例において用いたアルツハイマー病モデルマウスは、以下の5種類である。
(1)PS1トランスジェニックマウス(マウスPrPプロモーター制御下にてエクソン9欠損体(PSEN1dE9)を発現しているマウス、Jankowsky,J.L.ら、Hum.Mol.Genet.、2004年、13巻、159〜170ページ 参照)
(2)PS2トランスジェニックマウス(ユビキタスCMV初期エンハンサー及びニワトリβアクチンプロモーター制御下にてヒトPS2変異体(N141I)を発現しているマウス、Oyama,F.ら、J.Neurochem.、1998年、71巻、313〜322ページ 参照)
(3)ヒト二重変異体APP695(KM670/671NL、スウェーデンタイプ)トランスジェニックマウス(このマウスは、ハムスターPrPコスミドベクター中のPrP遺伝子をその変異体に置き換えて調製した(Hsiao,K.ら、Science、1996年、274巻、99〜102ページ 参照))
(4)5×FADマウス(スウェーデンタイプ(KM670/671NL)、フロリダタイプ(I716V)及びロンドンタイプ(V717I)の三重変異を有するヒトAPP695と、二重変異(M146L及びL285V)を有するヒトPS1とが、マウスThy1制御下にて発現しているトランスジェニックマウス)(Oakley,H.ら、J.Neurosci.、2006年、26巻、10129〜10140ページ 参照)
(5)マウスPrPプロモーター制御下にて、ヒトtau変異タンパク質が発現しているトランスジェニックマウス(Yoshiyama,Y.ら、Neuron、2007年、53巻、337〜351ページ 参照)。
抗Aβ抗体(82E1)、IBL社製、コード番号:10323
抗Aβ抗体(6E10)、Covance社製、商品コード:SIG−39300
抗ヒトPHF−tau抗体(AT−8)、Innogenetics社製、カタログ番号:BR−03。
そして、各抗体と反応させた組織サンプルを、Vectastain Elite ABCキット及びDABペルオキシダーゼ基質キット(Vector,社製)にて処理し、各抗体が認識するタンパク質の発現を視覚化した。
(1)モリス水迷路試験
この試験においては、5日間、マウスに60秒の試行を1日当たり4回受けさせ、プラットフォームに達するまでの時間を測定した。
(2)ロータロッド試験
この試験においては、3日間、速度を徐々にあげながら回転するロッド(回転速度:3.5〜35rpm)にマウスをつかまらせる試行を1日当たり4回実施し、回転するロッドから落ちるまでの平均時間を記録した。
(3)恐怖条件付け試験
この試験においては、先ず、音刺激(65dBホワイトノイズ、30秒)と共に足に電気刺激(0.4mA、2秒)をマウスに与えた。そして、その24時間後に、同チャンバーにて電気刺激を与えることなく音刺激を与えた際の、当該マウスのフリージング反応の頻度を測定した。
(4)オープンフィールド試験
この試験においては、オープンフィールドの中央領域にマウスが留まる時間を測定した。
(5)明暗ボックス試験
この試験においては、明るいボックス側に留まる時間を測定した。
(6)高架式十字迷路試験
この試験においては、床から60cmのところに設置した高架式十字迷路において、マウスが壁のない走行路に留まる時間を測定した。
後述のプロテオーム解析のため、AD(アルツハイマー病)患者、DLB(レビー小体型認知症)患者及び健常対照者から、脳サンプルを単離し、死後1時間以内に−80℃にて冷凍した。また、各グループ5つの脳から、側頭極及び後頭極の組織を解離した。
上記トランスジェニックマウス等から、リン酸化タンパク質及びリン酸化ペプチドを調製するにあたり、先ず、エチルエーテルを用いてマウスを安楽死させ、その5分以内に大脳皮質を回収した。得られた大脳皮質を液体窒素にて直ちに凍結し、リン酸化タンパク質を抽出するまで保存した。タンパク質の抽出においては、先ず、2%SDS、1mMDTT及び100mMTris−HCl(pH7.5)を含有する***解バッファーにて皮質組織を溶解し、氷上にて、ガラス製ダウンス型ホモジェナイザーを用い、20回ストーロークし、細胞を破砕した。組織に対する溶解バッファーの比率は、1mgに対して10μLである。細胞を破砕した後、溶解物を100℃にて15分間インキュベーションした。そして、4℃、16000×gにて10分間遠心をかけることにより、粗抽出物を得た。回収した上清を水にて10分の1の濃度になるよう希釈し、孔径0.22μmのフィルターに通し、濾過した。得られた素通り画分を、アミコンウルトラ3Kフィルター(Millipore社製)を用いて、10倍の濃度になるよう濃縮した。また、このように調製したタンパク質の濃度は、BCAタンパク質定量用試薬(Thermo Fisher Scientific Inc.製)を用いて測定した。
前述の通りに標識したリン酸化ペプチドサンプルは、TSKゲルSP−5PWカラム(TOSOH社製)及びプロミネンスUFLCシステム(Shimadzu社製)を用いた、強カチオン交換(SCX)クロマトグラフィーに供した。なお、A溶液(10mM KH2PO4(pH3.0)、25%アセトニトリル)の流速は10mL/分とした。そして、B溶液(10mM KH2PO4(pH3.0)、25%アセトニトリル、1M KCl)を用い、0〜50%の勾配範囲にて溶出を行った。回収した溶出画分は、乾燥させた後、100μL 0.1%ギ酸に再溶解した。
前述の通り、2D LC MS/MS解析において、ペプチドの質量スペクトルの収集及び解析は、アナリストTF(バージョン1.5)(AB SCIEX Ins.製)を用いて行った。そして、得られた結果に基づき、ヒト及びマウスのタンパク質配列データベース(ユニプロットKB/スイス−プロット、2010年6月22日にユニプロット(http://www.uniprot.org)よりダウンロードしたデータから、前述の通り、パラゴンアルゴリズムを備えたプロテインパイロットソフトウェア(バージョン4)(AB SCIEX Ins.製、Shilov, I. V.ら、Mol. Cell. Proteomics、2007年、6巻、1638〜1655ページ 参照)を用い、対応するタンパク質を探索した。なお、プロテインパイロットによるペプチド探索における許容度は、MS解析においては0.05Da、MS/MS解析においては0.10Daとした。また、プロテインパイロットにおいて、「リン酸化重視(Phosphorylation emphasis)」を、サンプルの詳細に設定し、「生物学的修飾(biological modifications)」を、処理仕様に設定した。また、ペプチド同定における質を評価するため、信頼スコアを利用した。さらに、同定したタンパク質は、冗長性を排除するため、ProGroupアルゴリズム(AB SCIEX Ins.製)にてグループ分けした。また、プロテインパイロットにおいて、タンパク質検出の閾値は95%の信頼度に設定した。そして、信頼度が95%以上である場合にタンパク質が同定できたと判断した。
ヒトの脳の後頭葉及び側頭葉において発現しているタンパク質を同定するため、プロテインパイロットソフトウェアを使用した(Shilov,I.V.ら、Mol.Cell.Proteomics、2007年、6巻、1638〜1655ページ 参照)。すなわち、プロテインパイロットにより、実測された各タンパク質にユニプロットIDを自動的に付与した。そして、実測された各タンパク質において、共通するホモロジーングループIDに属するタンパク質を探索し、収集したタンパク質のタクソノミーID及びジーンIDを得た。なお、タクソノミーIDは、ヒトに関しては9606個、マウスに関しては10090個、ラットに関しては10116個に限られていた。また、新たに追加したタンパク質のユニプロットIDも、添付した。次いで、収集したタンパク質のリストから、GNPデータベース(http://genomenetwork.nig.ac.jp/index_e.html)にないユニプロットIDを有するタンパク質を除外した。そして、東京大学のヒトゲノム解析センターのスーパーコンピューターシステムを利用し、GNPから収集した情報をデータベース化した。その結果、残存タンパク質を解析したタンパク質であると判断した。またGNPデータベースにおいて、解析したタンパク質に結合するタンパク質を探索し、エッジファイルを作製した(冗長なエッジは除外した)。作製したエッジファイルに基づき、タンパク質ネットワークを得、それをセルイラストレーターにて視覚化した(Nagasaki,M.ら、Appl.Bioinformatics、2003年、2巻、181〜184ページ 参照)。
樹状突起スパインの2光子イメージングは、正立顕微鏡(BX61WI、Olympus社製、水浸対物レンズ(XLPlanN25xW;開口数,1.05)及びパルスレーザー(MaiTai HP DeepSee、Spectra Physics社製)を備えた走査型レーザー顕微鏡システムFV1000MPE2(Olympus社製)を用いて行った。イメージングにおいて、EGFPは890nmの波長の光にて励起し、500〜550nmの範囲にてスキャンした。また、三次元イメージングのためにスキャンした領域は、100×100μm(1μm Z軸ステップ、1024×1024ピクセル)である。
疾患モデルマウス又はヒト患者の質量分析データは、逆正規法により、各々バックグランドマウス又はヒトの対照サンプルのデータと比較して評価した。質量分析において各ペプチドの量は多数のピークに基づくものであり、各タンパク質の量は多数のペプチド値に基づくものであることを考慮し、これらの量に関してP値を求めた。また、P値と共に、各ペプチド又はタンパク質について遺伝子発現差異解析を反復させることなく行った。さらに、結果の質を保証するため、同定したタンパク質の数を増やすことのできる生物学的反復データも得た。その結果、ヒト及びマウスの脳のサンプルサイズは、各々N=5及びN=3が適当であると判断した。
<アルツハイマー病についてのフォスフォプロテオーム解析>
アルツハイマー病の病変においては、tauリン酸化を始め様々なリン酸化シグナル伝達の関与が示唆されている。そのため、アルツハイマー病におけるリン酸化シグナル伝達、特にアルツハイマー病の発症の前段階において中心的な役割を担っているリン酸化シグナル伝達が同定されれば、この疾患の早期診断及び治療における、極めて有効な標的分子を提供することが可能となる。そこで、本発明者はアルツハイマー病におけるリン酸化シグナル伝達を網羅的に解析(フォスフォプロテオーム解析)し、その病変において中心的な役割を担うリン酸化シグナル伝達の同定を試みた。
(1)PS1トランスジェニックマウス
(2)PS2トランスジェニックマウス
(3)ヒト二重変異体APP695トランスジェニックマウス
(4)5xFADマウス
(5)Tauトランスジェニックマウス。
同一時点における多種のモデルマウスのフォスフォプロテオームデータを単純に比較した結果に基づいて選択するアプローチ(仮説を設定しないアプローチ(Hypothesis free approach))
(2)第2のアプローチ
アミロイド凝集又は凝集前の一定の過程において、異常なリン酸化シグナルが生じているという仮定に基づき、選択するアプローチ(Aβ凝集と関連付けるアプローチ(Aβ aggregation−linked approach))。
<Tauモデル動物におけるADコアネットワークについての解析>
アルツハイマーの病因及び発症機構については、未だ結論は出されていないものの、アミロイドβの凝集(アミロイド病変)が生じ、該凝集によってtauのリン酸化及び重合(tau病変)が促進され、ひいては神経細胞死等に至るという機構(アミロイドカスケード仮説)が有力視されている。そこで、この仮説において想定される、アミロイド病変からtau病変への移行の観点から、アミロイド病変が誘導されているADモデルマウスにおいて選抜された17タンパク質について、tau病変が誘導されているADモデルマウスを対象として再解析を行った。
<ヒトAD患者におけるADコアネットワークについての解析>
次に、ヒトAD患者の脳のフォスフォプロテオームデータに基づき、上記ADモデルマウスの結果から選択された17のタンパク質について評価した。
<ADコアネットワークについての機能解析>
前述の統合されたヒト−マウスPPIデータベースに基づき、前記17タンパク質を伴うADコアネットワークを作製した。得られた結果を図2に示す。
さらに、ADモデルマウスにおけるリン酸化タンパク質の経時的変化(病的加齢におけるリン酸化タンパク質の変化)と、通常の加齢(生理学的加齢)におけるそれら(バックグランドマウスにおけるリン酸化タンパク質の経時的変化)とがどのように関連しているのかを解析した。なお、5×FADマウスのいずれかの時点で信頼度の高いデータを得られなかったタンパク質については、この解析から除外した。
<ADコアネットワークの変化に関与するキナーゼ/フォスファターゼの探索>
図3に示す通り、ADコアネットワークを構成するタンパク質のリン酸化の経時的変化は、アルツハイマー病の発症前段階において、初期にピークがあるもの、中期にピークがあるもの、後期にピークがあるもの、これら3パターンにカテゴリー化することができる。そして、これらカテゴリーを鑑みるに、ADコアネットワークを構成するタンパク質のリン酸化は特定のキナーゼ等によって時期特異的に制御されていることが想定される。
上述の解析結果によって構築されたADコアネットワークに関し、アルツハイマー病の病変におけるその意義を、インビボ及びインビトロの実験系を用いて実証した。
上述の通り、加齢パターン解析において、また、前述の凝集と関連付けるアプローチによっても、MARCKSはアルツハイマー病の初期段階にリン酸化が変化しているタンパク質として検出されている(表1及び図3 参照)。このことから、MARCKSは、アルツハイマー病の病変の発症前段階において、最も信頼できるリン酸化シグナル伝達分子であることが示唆される。
<アミロイド病変からtau病変への移行に関与するキナーゼの探索>
上述のアルツハイマー病の発症前段階における特異的なネットワークの同定に加え、tauのリン酸化を促進できるキナーゼの同定を試みた。
本実施例においては、次に、前頭側頭葉変性症の発症の前段階において中心的な役割を担っているシグナル伝達経路を同定し、ひいては前頭側頭葉変性症の診断及び治療に有用な標的分子を提供するために、以下に示す実験方法等を用いて解析を行った。また、以下に具体的に示した以外の実験については、特に断りの無い限り、上記アルツハイマー病―の解析同様に行った、
<前頭側頭葉変性症モデルマウス>
本実施例において、前記標的分子探索のため、前頭側頭葉変性症モデルマウスの作製した。
R504X変異を伴う6.5kbp NotI−XhoI断片を、Bacクローン(ID:RP23−311P1又はRP23−137J17)からPCRにて増幅し、pBS−DTAベクター(Unitech社製)にサブクローニングした。
2999bp ClaI−XhoI断片をPCRにて増幅し、Neoカセットを伴うpBS−LNL(−)ベクター(Unitech社製)にサブクローニングした。
前記PGRN−KIマウスを対象とした薬理学上の回復実験を以下の通りにして行った。すなわち、12週齢のマウスのくも膜下腔に、浸透圧ポンプ(1μl/時間、1003D、Durect社製)を導入し、べムラフェニブ(S1267、Selleckchem社製)1.7μM又はPBSを3日間供給した。そして、導入術後3日目、0.8、24時間後にイメージングを行った。
抗PSD−95抗体及び抗リン酸化tau抗体(Ser203又はThr220)を用いた免疫共染色解析を行った。すなわち、PGRN−KIマウス等の脳梁膨大後部異顆粒皮質(RSD)組織からパラフィン切片(5μm)を調製し、前記抗体にて共染色を行った後、LSM510共焦点顕微鏡(Zeiss社製、対物倍率×63、ズーム1、Zスタックイメージは0.8μm間隔に設定)。
<PGRN−KIマウスの表現型についての解析>
前述の通りにPGRN(プログラニュリン)遺伝子にストップ変異を導入したPGRN−KIマウスが、前頭側頭葉変性症(FTLD)の表現型を示しているかどうかを先ず解析した。
<FTLDについてのフォスフォプロテオーム解析>
FTLDモデル動物としての有用性が実証された前記PGRN−KIマウスを用いて、上記アルツハイマー病についての解析同様に、FTLDについても該疾患におけるリン酸化シグナル伝達を網羅的に解析(フォスフォプロテオーム解析)し、その病変において中心的な役割を担うリン酸化シグナル伝達の同定を試みた。
<b−raf阻害剤による、FTLDモデルマウスの行動的表現型に対する治療効果についての解析>
MAPKシグナル伝達経路における異常な活性化を、b−raf特異的な阻害剤を用いて抑制することにより、PGRN−KIマウスの行動的表現型が回復されるかどうかを解析した。
<b−raf阻害剤及びtauノックダウンによる、FTLDモデルマウスのスパイン表現型に対する回復効果についての解析>
アルツハイマー病及びFTLD−Tauにおいて、tauのリン酸化は、対らせん状繊維(PHF)の形成及び該タンパク質の細胞質内凝集に関与していることが知られている。また、tauとアミロイドβ(Aβ)との関連性についても、アルツハイマー病の病理学上報告されており、かかる知見から、tauは通常Aβの下流に位置するエフェクター分子として考えられている。
Claims (7)
- アルツハイマー病の発症前段階又はアルツハイマー病を発症する危険性を診断するための方法であって、
(i)被検体において、基質タンパク質のリン酸化を検出する工程、
(ii)該リン酸化と、正常検体における基質タンパク質のリン酸化とを比較する工程、及び、
(iii)前記被検体における基質タンパク質のリン酸化が、前記正常検体における基質タンパク質のリン酸化よりも高いことは、前記被検体はアルツハイマー病の発症前段階にあること、またはアルツハイマー病を発症する危険性を有していることを示す工程
を含み、かつ
前記基質タンパク質がMARCKSである、方法。 - MARCKSのリン酸化部位に対して結合活性を有する化合物を含有する、アルツハイマー病の発症前段階又はアルツハイマー病を発症する危険性を診断するための薬剤。
- アルツハイマー病の発症前段階又はアルツハイマー病を発症する危険性を診断するための候補化合物のスクリーニング方法であって、
MARCKSのリン酸化部位と、被験化合物とを接触させ、前記リン酸化部位と結合する化合物を選択する工程を含む方法。 - MARCKSのリン酸化を抑制する化合物を含有する、アルツハイマー病の病変を抑制するための薬剤。
- MARCKSと、PKC、CaMK、CSK、Lyn及びb−RAFからなる群から選択される少なくとも1のキナーゼタンパク質との結合を抑制する化合物を含有する、アルツハイマー病の病変を抑制するための薬剤。
- アルツハイマー病の病変を抑制するための候補化合物のスクリーニング方法であって、
(i)基質タンパク質のリン酸化を検出しうる系に、被験化合物を適用させる工程、並びに、
(ii)該基質タンパク質のリン酸化を抑制する化合物を選択する工程
を含み、かつ
前記基質タンパク質がMARCKSである、方法。 - アルツハイマー病の病変を抑制するための候補化合物のスクリーニング方法であって、
(a)被験化合物の存在下で、PKC、CaMK、CSK、Lyn及びb−RAFからなる群から選択される少なくとも1のキナーゼタンパク質と、基質タンパク質とを接触させる工程、
(b)前記キナーゼタンパク質と前記基質タンパク質との結合を検出する工程、
(c)前記結合を抑制する化合物を選択する工程を含み、かつ
前記基質タンパク質がMARCKSである、方法。
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