JP6579152B2 - 改変された耐熱性dnaポリメラーゼ - Google Patents
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Description
(1)パイロコッカス(Pyrococcus)属又はサーモコッカス(Thermococcus)属由来のDNAポリメラーゼであって、ウラシルの結合に関するアミノ酸配列のうち、少なくとも2つのアミノ酸の改変を有し、野生型DNAポリメラーゼよりもウラシルの感受性が低いことを特徴とする、改変型DNAポリメラーゼ。
(2)配列番号1に示されるアミノ酸配列における7、36、37、90〜97、および112〜119番目に相当するアミノ酸からなるウラシルの結合に関するアミノ酸配列のうち、少なくとも2つのアミノ酸の改変を有し、野生型DNAポリメラーゼよりもウラシルの感受性が低いことを特徴とする、(1)に記載の改変型DNAポリメラーゼ。
(3)配列番号1に示されるアミノ酸配列におけるY7、P36、およびV93に相当するアミノ酸のうち、少なくとも2つのアミノ酸を改変し、野生型DNAポリメラーゼよりもウラシルの感受性が低いことを特徴とする、(2)に記載の改変型DNAポリメラーゼ。
(4)Y7に相当するアミノ酸の改変が、Y7A、Y7G、Y7V、Y7L、Y7I、Y7P、Y7F、Y7M、Y7W、及びY7Cからなる群より選ばれるアミノ酸置換である、(3)に記載の改変型DNAポリメラーゼ。
(5)P36に相当するアミノ酸の改変が、P36H、P36K、またはP36Rのアミノ酸置換である、(3)または(4)に記載の改変型DNAポリメラーゼ。
(6)V93に相当するアミノ酸の改変が、V93H、V93K、またはV93Rのアミノ酸置換である、(3)〜(5)のいずれかに記載の改変型DNAポリメラーゼ。
(7)少なくとも2つのアミノ酸の改変が、Y7A及びP36Hのアミノ酸置換である、(3)に記載の改変型DNAポリメラーゼ。
(8)少なくとも2つのアミノ酸の改変が、Y7A及びP36Kのアミノ酸置換である、(3)に記載の改変型DNAポリメラーゼ。
(9)少なくとも2つのアミノ酸の改変が、Y7A及びP36Rのアミノ酸置換である、(3)に記載の改変型DNAポリメラーゼ。
(10)少なくとも2つのアミノ酸の改変が、Y7A及びV93Qのアミノ酸置換である、(3)に記載の改変型DNAポリメラーゼ。
(11)少なくとも2つのアミノ酸の改変が、Y7A及びV93Kのアミノ酸置換である、(3)に記載の改変型DNAポリメラーゼ。
(12)少なくとも2つのアミノ酸の改変が、Y7A及びV93Rのアミノ酸置換である、(3)に記載の改変型DNAポリメラーゼ。
(13)少なくとも2つのアミノ酸の改変が、P36H及びV93Kのアミノ酸置換である、(3)に記載の改変型DNAポリメラーゼ。
(14)さらに3’−5’エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列のいずれかに少なくとも1つのアミノ酸の改変を有する、(1)〜(13)のいずれかに改変型DNAポリメラーゼ。
(15)3’−5’エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列が、配列番号1に示される137〜147、206〜222、および308〜318番目に相当するアミノ酸からなる、(14)に記載の改変型DNAポリメラーゼ。
(16)3’−5’エキソヌクレアーゼ活性領域のD141、I142、E143、N210、及びY311に相当するアミノ酸に少なくとも1つのアミノ酸の改変を有する、(15)に記載の改変型DNAポリメラーゼ。
(17)3’−5’エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列の改変がD141A及びE143Aである、(16)に記載の改変型DNAポリメラーゼ。
(18)3’−5’エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列の改変がI142Rである、(16)に記載の改変型DNAポリメラーゼ。
(19)3’−5’エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列の改変がN210Dである、(16)に記載の改変型DNAポリメラーゼ。
(20)3’−5’エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列の改変がY311Fである、(16)に記載の改変型DNAポリメラーゼ。
(21)前記改変型DNAポリメラーゼがH147E、またはH147Dのアミノ酸置換を更に含む、(1)から(20)のいずれかに記載の改変型DNAポリメラーゼ。
(22)パイロコッカス(Pyrococcus)属又はサーモコッカス(Thermococcus)属由来のDNAポリメラーゼが、パイロコッカス・フリオサス、パイロコッカス・エスピーGB−D、サーモコッカス・コダカラエンシス、サーモコッカス・ゴルゴナリウス、サーモコッカス・リトラリス、サーモコッカス・エスピーJDF−3、サーモコッカス・エスピー9°N−7、サーモコッカス・エスピーKS−1、サーモコッカス・セラー、又はサーモコッカス・シクリ由来のDNAポリメラーゼである、(1)〜(21)のいずれかに記載の改変型DNAポリメラーゼ。
(23)野生型が配列番号1〜10のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるパイロコッカス(Pyrococcus)又はサーモコッカス(Thermococcus)に属するDNAポリメラーゼである、(1)〜(22)のいずれかに記載の改変型DNAポリメラーゼ。
(24)(1)〜(23)のいずれかに記載のポリメラーゼを使用して核酸増幅反応を行う方法。
(25)(1)〜(23)のいずれかに記載のポリメラーゼを使用して、イノシンを含んだプライマーで核酸増幅反応を行う方法。
(26)(1)〜(23)のいずれかに記載のポリメラーゼを使用して、バイサルファイト処理したDNAから核酸増幅反応を行う方法。
(27)(1)〜(23)のいずれかに記載のポリメラーゼを使用して増幅した核酸を、ウラシル−DNAグリコシラーゼを用いて分解する方法。
(25)(1)〜(23)のいずれかに記載のポリメラーゼを含む、核酸増幅反応を行うための試薬。
(26)(1)〜(23)のいずれかに記載のポリメラーゼを含む、核酸増幅反応を行うための試薬を含むキット。
既知のアミノ酸配列からその遺伝子をクローニングする手法として、縮重プライマーを用いたPCR法が用いられる。縮重プライマーを用いたPCR法では、縮重プライマーの組み合わせ数を減らすため、イノシン(dITP)を用いたプライマーが利用されることが多い。イノシンはどの塩基とも相補対とならず、二本鎖形成の阻害もしないため、アミノ酸に対する複数種類のコドンを網羅的に増幅することができる。ところが、パイロコッカス(Pyrococcus)属又はサーモコッカス(Thermococcus)属由来の野生型のDNAポリメラーゼでは、イノシンを含むプライマーを使用すると、反応性が著しく低下するという問題がある。しかしながら、本発明の改変型DNAポリメラーゼは、イノシンを含むプライマーでも高い増幅効率が見られ、正確性もあることから、本発明はイノシンを含むプライマーを用いたPCRに有用である。
DNAメチル化解析の手法として、ゲノムDNAにバイサルファイト(亜硫酸水素)処理を行い、メチル化の有無やポジションを解析できるバイサルファイト・シーケンス法(BSP法)や、メチル化および非メチル化されている塩基を特異的にPCR増幅してメチル化の様子を解析するメチル化特異的PCR法(MSP法)がある。ゲノムDNAにバイサルファイト処理を行うと、メチル化されていないシトシンがウラシルに変換され、メチル化されたシトシンは変換されない。そこでバイサルファイト処理の前後で生じるシトシンとチミン(ウラシル)の差異を元に、メチル化の解析を行うことが出来る。本発明の改変型DNAポリメラーゼはウラシルを含むDNAを効率的に増幅することが出来るため、バイサルファイト処理をしたDNAの増幅反応、およびメチル化解析の手法に有用である。
PCRのキャリーオーバーの防止のため、PCRに際し、ウラシル(dUTP)を取り込ませてPCR反応を行い、次のPCR反応を行う前に,夾雜PCR産物をウラシル−DNA グリコシラーゼ(UNG)により分解させることにより、キャリーオーバーを防ぐdUTP/UNGコンタミネーション除去法が用いられる。UNGは一本鎖あるいは二本鎖DNAのウラシル−グリコシド結合を分解し,ウラシルの削除とDNA内にアルカリ感受性無塩基部位を生成する。本発明の改変型DNAポリメラーゼはウラシルを含むDNAを効率的に増幅することが出来るため、dUTP/UNGコンタミネーション除去法に有用である。
酵素活性が強い場合には、保存緩衝液(50mM Tris−HCl(pH8.0),50mM KCl,1mM ジチオスレイトール,0.1% Tween20,0.1% Nonidet P40,50% グリセリン)でサンプルを希釈して測定を行う。(1)下記のA液25μl、B液5μl、C液5μl、滅菌水10μl、及び酵素溶液5μlをマイクロチューブに加えて75℃にて10分間反応する。(2)その後氷冷し、E液50μl、D液100μlを加えて、攪拌後更に10分間氷冷する。(3)この液をガラスフィルター(ワットマン製GF/Cフィルター)で濾過し、0.1N 塩酸およびエタノールで十分洗浄する。(4)フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター(パッカード製)で計測し、鋳型DNAのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の1単位はこの条件で30分当りの10nmolのヌクレオチドを酸不溶性画分(即ち、D液を添加したときに不溶化する画分)に取り込む酵素量とする。
A:40mM Tris−HCl緩衝液(pH7.5)16mM 塩化マグネシウム15
mM ジチオスレイトール100μg/ml BSA(牛血清アルブミン)
B:1.5μg/μl 活性化仔牛胸腺DNA
C:1.5mM dNTP(250cpm/pmol [3H]dTTP)
D:20% トリクロロ酢酸(2mMピロリン酸ナトリウム)
E:1mg/ml仔牛胸腺DNA
KOD Y7A変異体の作製
サーモコッカス・コダカラエンシス KOD1株由来の改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミド、pKOD Y7A(配列番号11の19〜21番目のTACをGCCに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した。
改変型耐熱性DNAポリメラーゼ(KOD Y7A)の作製
実施例1で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した100μg/mlのアンピシリンを含有するTB培地(Molecular cloning 2nd edition、p.A.2)80mLを500mL坂口フラスコに分注した。この培地に予め100μg/mlのアンピシリンを含有する3mlのLB培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム;ギブコ製)で37℃、16時間培養したエシェリシア・コリJM109(プラスミド形質転換株)(試験管使用)を接種し、37℃にて16時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、50mlの破砕緩衝液(30mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、30mM NaCl、0.1mM EDTA)に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を80℃にて15分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液(50mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、50mM 塩化カリウム、1mM ジチオスレイトール、0.1% Tween20、0.1%ノニデットP40、50%グリセリン)に置換し、改変型耐熱性DNAポリメラーゼ(KOD Y7A)を得た。
A液: 40mM Tris−HCl緩衝液(pH7.5)、16mM 塩化マグネシウム、15mM ジチオスレイトール、100μg/ml BSA
B液: 1.5μg/μl 活性化仔牛胸腺DNA
C液: 1.5mM dNTP(250cpm/pmol [3H]dTTP)
D液: 20% トリクロロ酢酸(2mMピロリン酸ナトリウム)
E液: 1mg/ml仔牛胸腺DNA
A液25μl、B液5μl、C液5μl及び滅菌水10μlをマイクロチューブに加えて攪拌混合後、上記精製酵素希釈液5μlを加えて75℃で10分間反応する。その後冷却し、E液50μl、D液100μlを加えて、攪拌後更に10分間氷冷する。この液をガラスフィルター(ワットマン製GF/Cフィルター)で濾過し、0.1N塩酸及びエタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター(パッカード製)を用いて計測し、鋳型DNAへのヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性の1単位はこの条件下で30分当り10nmolのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。
KOD P36Hの作製
実施例2と同様の方法にて、pKOD P36H(配列番号11の106〜108番目のCCCをCACに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した(pKOD P36H)。鋳型にはpKOD、変異作製用プライマーとしては配列番号15および18に記載のプライマーを使用した。更に実施例2同様の精製方法にて改変型耐熱性DNAポリメラ−ゼ(KOD P36H)を得た。
KOD P36Kの作製
実施例2と同様の方法にて、pKOD P36K(配列番号11の106〜108番目のCCCをAAAに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した(pKOD P36K)。鋳型にはpKOD、変異作製用プライマーとしては配列番号16および18に記載のプライマーを使用した。更に実施例2同様の精製方法にて改変型耐熱性DNAポリメラ−ゼ(KOD P36K)を得た。
KOD P36Rの作製
実施例2と同様の方法にて、pKOD P36R(配列番号11の106〜108番目のCCCをCGTに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した(pKOD P36R)。鋳型にはpKOD、変異作製用プライマーとしては配列番号17および18に記載のプライマーを使用した。更に実施例2同様の精製方法にて改変型耐熱性DNAポリメラ−ゼ(KOD P36R)を得た。
KOD V93Qの作製
実施例2と同様の方法にて、pKOD V93Q(配列番号11の277〜279番目のGTCをCAGに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した(pKOD V93Q)。鋳型にはpKOD、変異作製用プライマーとしては配列番号19および20に記載のプライマーを使用した。更に実施例2同様の精製方法にて改変型耐熱性DNAポリメラ−ゼ(KOD V93Q)を得た。
KOD V93Kの作製
実施例2と同様の方法にて、pKOD V93K(配列番号11の277〜279番目のGTCをAAAに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した(pKOD V93K)。鋳型にはpKOD、変異作製用プライマーとしては配列番号19および21に記載のプライマーを使用した。更に実施例2同様の精製方法にて改変型耐熱性DNAポリメラ−ゼ(KOD V93K)を得た。
KOD V93Rの作製
実施例2と同様の方法にて、pKOD V93R(配列番号11の277〜279番目のGTCをCGTに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した(pKOD V93R)。鋳型にはpKOD、変異作製用プライマーとしては配列番号19および22に記載のプライマーを使用した。更に実施例2同様の精製方法にて改変型耐熱性DNAポリメラ−ゼ(KOD V93R)を得た。
KOD P115Δの作製
実施例2と同様の方法にて、pKOD P115Δ(配列番号11の343〜345番目のCCCを欠損した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した(pKOD P115Δ)。鋳型にはpKOD、変異作製用プライマーとしては配列番号23および25に記載のプライマーを使用した。更に実施例2同様の精製方法にて改変型耐熱性DNAポリメラ−ゼ(KOD P115Δ)を得た。
KOD Y7A/P36Hの作製
実施例2と同様の方法にて、pKOD Y7A/P36H(配列番号11の19〜21番目のTACをGCCに、配列番号11の106〜108番目のCCCをCACに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した(pKOD Y7A/P36H)。鋳型には(pKOD Y7A)、変異作製用プライマーとしては配列番号15および18に記載のプライマーを使用した。更に実施例2同様の精製方法にて改変型耐熱性DNAポリメラ−ゼ(KOD Y7A/P36H)を得た。
KOD Y7A/P36Kの作製
実施例2と同様の方法にて、pKOD Y7A/P36K(配列番号11の19〜21番目のTACをGCCに、配列番号11の106〜108番目のCCCをAAAに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した(pKOD Y7A/P36K)。鋳型にはpKOD Y7A、変異作製用プライマーとしては配列番号16および18に記載のプライマーを使用した。更に実施例2同様の精製方法にて改変型耐熱性DNAポリメラ−ゼ(KOD Y7A/P36K)を得た。
KOD Y7A/P36Rの作製
実施例2と同様の方法にて、pKOD Y7A/P36R(配列番号11の19〜21番目のTACをGCCに、配列番号11の106〜108番目のCCCをCGTに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した(pKOD Y7A/P36R)。鋳型にはpKOD Y7A、変異作製用プライマーとしては配列番号17および18に記載のプライマーを使用した。更に実施例2同様の精製方法にて改変型耐熱性DNAポリメラ−ゼ(KOD Y7A/P36R)を得た。
KOD Y7A/V93Kの作製
実施例2と同様の方法にて、pKOD Y7A/V93K(配列番号11の19〜21番目のTACをGCCに、配列番号11の277〜279番目のGTCをAAAに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した(pKOD Y7A/V93K)。鋳型にはpKOD Y7A、変異作製用プライマーとしては配列番号19および21に記載のプライマーを使用した。更に実施例2同様の精製方法にて改変型耐熱性DNAポリメラ−ゼ(KOD Y7A/V93K)を得た。
KOD Y7A/P115Δの作製
実施例2と同様の方法にて、pKOD Y7A/P115Δ(配列番号11の19〜21番目のTACをGCCに、配列番号11の343〜345番目のCCCを欠損した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した(pKOD Y7A/P115Δ)。鋳型にはpKOD Y7A、変異作製用プライマーとしては配列番号23および24に記載のプライマーを使用した。更に実施例2同様の精製方法にて改変型耐熱性DNAポリメラ−ゼ(KOD Y7A/P115Δ)を得た。
KOD P36H/V93Kの作製
実施例2と同様の方法にて、pKOD P36H/V93K(配列番号11の106〜108番目のCCCをCACに、配列番号11の277〜279番目のGTCをAAAに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した(pKOD P36H/V93K)。鋳型にはpKOD V93K、変異作製用プライマーとしては配列番号15および18に記載のプライマーを使用した。更に実施例2同様の精製方法にて改変型耐熱性DNAポリメラ−ゼ(KOD P36H/V93K)を得た。
KOD P36R/V93Kの作製
実施例2と同様の方法にて、pKOD P36H/V93K(配列番号11の106〜108番目のCCCをCGTに、配列番号11の277〜279番目のGTCをAAAに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した(pKOD P36R/V93K)。鋳型にはpKOD V93K、変異作製用プライマーとしては配列番号17および18に記載のプライマーを使用した。更に実施例2同様の精製方法にて改変型耐熱性DNAポリメラ−ゼ(KOD P36R/V93K)を得た。
KOD Y7A/P36H/V93Kの作製
実施例2と同様の方法にて、pKOD Y7A/P36H/V93K(配列番号11の19〜21番目のTACをGCCに、配列番号11の106〜108番目のCCCをCACに、配列番号11の277〜279番目のGTCをAAAに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した(pKOD Y7A/P36H/V93K)。鋳型にはpKOD Y7A/V93K、変異作製用プライマーとしては配列番号15および18に記載のプライマーを使用した。更に実施例2同様の精製方法にて改変型耐熱性DNAポリメラ−ゼ(KOD Y7A/P36H/V93K)を得た。
KOD Y7A/P36R/V93Kの作製
実施例2と同様の方法にて、pKOD Y7A/P36R/V93K(配列番号11の19〜21番目のTACをGCCに、配列番号11の106〜108番目のCCCをCGT、配列番号11の277〜279番目のGTCをAAAに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した(pKOD Y7A/P36R/V93K)。鋳型にはpKOD Y7A/V93K、変異作製用プライマーとしては配列番号17および18に記載のプライマーを使用した。更に実施例2同様の精製方法にて改変型耐熱性DNAポリメラ−ゼ(KOD Y7A/P36R/V93K)を得た。
KOD N210D変異体の作製
KOD N210Dは野生型KOD DNAポリメラーゼの3‘−5’エキソヌクレアーゼ領域への改変を含み、3‘−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた(エキソ(−))改変型DNAポリメラーゼである。実施例1〜18と同様の方法にて、pKOD N210Dに様々な変異を挿入した。pKOD N210Dは配列番号11の628〜630番目のAACをGACに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミドであり、特許第3487394号に記載の配列である。更に実施例2同様の精製方法にて、それぞれ改変型DNAポリメラ−ゼを精製した。
KOD D141A/E143A変異体の作製
KOD D141A/E143Aは野生型KOD DNAポリメラーゼの3‘−5’エキソヌクレアーゼ領域への改変を含み、3‘−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた(エキソ(−))改変型DNAポリメラーゼである。実施例1〜18と同様の方法にて、pKOD D141A/E143Aに様々な変異を挿入した。pKOD D141A/E143Aは配列番号11の421〜423番目のGACをGCCに、427〜429番目のGAAをGCAに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミドであり、更に実施例2同様の精製方法にてそれぞれ改変型DNAポリメラ−ゼを精製した。
KOD I142R変異体の作製
KOD I142Rは野生型KOD DNAポリメラーゼの3‘−5’エキソヌクレアーゼ領域への改変を含み、3‘−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた(エキソ(−))改変型DNAポリメラーゼである。実施例1〜18と同様の方法にて、pKOD I142Rに様々な変異を挿入した。pKOD I142Rは配列番号11の424〜426番目のATTをCGTに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミドであり、特許第3487394号に記載の配列である。更に実施例2同様の精製方法にてそれぞれ改変型DNAポリメラ−ゼを精製した。
KOD H147E変異体の作製
KOD H147Eは野生型KOD DNAポリメラーゼの3‘−5’エキソヌクレアーゼ領域に改変を含むが、3‘−5’エキソヌクレアーゼ活性を維持した改変型DNAポリメラーゼである。実施例1〜18と同様の方法にて、pKOD H147Eに様々な変異を挿入した。pKOD H147Eは配列番号11の439〜442番目のCATをGAGに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミドであり、特許第3891330号に記載の配列である。さらに実施例2同様の精製方法にてそれぞれ改変型DNAポリメラ−ゼを精製した。
Pfu Y7Aの作製
実施例2と同様の方法にて、pPfu Y7A(配列番号12の19〜21番目のTACをGCCに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した(pPfu Y7A)。鋳型にはpPfu:pBluescriptに配列番号12の耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子をクローニングしたプラスミド、変異作製用プライマーとしては配列番号32および33に記載のプライマーを使用した。更に実施例2同様の精製方法にて改変型耐熱性DNAポリメラ−ゼ(Pfu Y7A)を得た。
Pfu P36Hの作製
実施例2と同様の方法にて、pPfu P36H(配列番号12の106〜108番目のCCAをCACに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した(pPfu P36H)。鋳型にはpPfu、変異作製用プライマーとしては配列番号34および35に記載のプライマーを使用した。更に実施例2同様の精製方法にて改変型耐熱性DNAポリメラ−ゼ(Pfu P36H)を得た。
Pfu V93Rの作製
実施例2と同様の方法にて、pPfu V93R(配列番号12の277〜279番目のGTTをCGTに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した(pPfu V93R)。鋳型にはpPfu、変異作製用プライマーとしては配列番号36および37に記載のプライマーを使用した。更に実施例2同様の精製方法にて改変型耐熱性DNAポリメラ−ゼ(Pfu V93R)を得た。
Pfu Y7A/P36Hの作製
実施例2と同様の方法にて、pPfu Y7A/P36H(配列番号12の19〜21番目のTACをGCCに、配列番号12の106〜108番目のCCAをCACに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した(pPfu Y7A/P36H)。鋳型にはpPfu Y7A、変異作製用プライマーとしては配列番号34および35に記載のプライマーを使用した。更に実施例2同様の精製方法にて改変型耐熱性DNAポリメラ−ゼ(Pfu Y7A/P36H)を得た。
Pfu Y7A/V93Kの作製
実施例2と同様の方法にて、pPfu Y7A/V93K(配列番号12の19〜21番目のTACをGCCに、配列番号12の277〜279番目のGTTをAAAに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した(pPfu Y7A/V93K)。鋳型にはpPfu Y7A、変異作製用プライマーとしては配列番号36および37に記載のプライマーを使用した。更に実施例2同様の精製方法にて改変型耐熱性DNAポリメラ−ゼ(Pfu Y7A/V93K)を得た。
Pfu N210D/Y7A/P36Hの作製
実施例2と同様の方法にて、pPfu N210D/Y7A/P36H(配列番号12の19~21番目のTACをGCCに、配列番号12の106〜108番目のCCAをCACに、配列番号12の628〜630番目のAATをGACに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した(pPfu N210/Y7A/P36H)。鋳型にはpPfu Y7A/P36H、変異作製用プライマーとしては配列番号38および39に記載のプライマーを使用した。更に実施例2同様の精製方法にて改変型耐熱性DNAポリメラ−ゼ(Pfu Y7A/P36H)を得た。
Pfu N210D/Y7A/V93Kの作製
実施例2と同様の方法にて、pPfu N210D/Y7A/V93K(配列番号12の19~21番目のTACをGCCに、配列番号12の277〜279番目のGTTをAAAに、配列番号12の628〜630番目のAATをGACに置換した改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド)を作製した(pPfu N210/Y7A/V93K)。鋳型にはpPfu Y7A/V93K、変異作製用プライマーとしては配列番号38および39に記載のプライマーを使用した。更に実施例2同様の精製方法にて改変型耐熱性DNAポリメラ−ゼ(Pfu Y7A/V93K)を得た。
改変された耐熱性DNAポリメラーゼのウラシルの感受性の評価
ウラシルの感受性は、以下のようにPCRを行い測定した。PCRにはKOD −Plus− Ver.2(Toyobo社製)添付のものを用い、1×PCR Buffer、および1.5mM MgSO4、0.2mM dNTPs(dATP、dTTP,dCTP、dGTP)、約1.3kbを増幅する15pmolの配列番号25及び26に記載のプライマー、10ngのヒトゲノムDNA(Roche社製)、1Uの各酵素を含む50μlの反応液中に、dUTP(Roche社製)を終濃度0.5、5、50、100、200μMになるよう添加した。94℃、30秒の前反応の後、98℃、10秒→65℃、30秒→68℃、1分30秒を30サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社製)を用いて行った。反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約1.3kbの増幅DNA断片を確認した。
改変された耐熱性DNAポリメラーゼを用いたPCR増幅量の評価
PCRにおいてdTTPとdUTPでの増幅の違いを、Human β−グロビンの482bpを増幅することで比較し、dUTPへの感受性を調べた。この際、各酵素は、1Uあたり1μgのKOD抗体と混合したものを用いた。PCRにはKOD −Plus− Ver.2(Toyobo社製)添付のものを用い、1×PCR Buffer、および1.5mM MgSO4、481kbを増幅する15pmolの配列番号27及び28に記載のプライマー、10ngのヒトゲノムDNA(Roche社製)、抗体と混合した1Uの各酵素を含む50μlの反応液中に、通常のdNTPs(dATP、dTTP,dCTP、dGTP)を0.2mM添加したものと、dTTPをdUTPに置換したdNTPs(dATP、dUTP,dCTP、dGTP)を0.2mMになるよう添加したものをそれぞれ用いた。94℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→68℃、1分を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社)を用いてPCRを行った。反応終了後、MulitiNA(島津製作所社製)のDNA−1000キットに供し増幅DNA断片を確認した。
改変された耐熱性DNAポリメラーゼを用いた長鎖DNA増幅の評価
dUTPを含むPCRにおいてHuman β−グロビンの1.3kbpおよび、2.8kbp、3.6kbpの増幅を比較した。この際、各酵素は、1Uあたり1μgのKOD抗体と混合したものを用いた。PCRにはKOD −Plus− Ver.2(Toyobo社製)添付のものを用い、1×PCR Buffer、および1.5mM MgSO4、2mM dTTPをdUTPに置換したdNTPs(dATP、dUTP,dCTP、dGTP)、15pmolのプライマー(1.3kbpの増幅では配列番号25及び26、2.8kbpの増幅では配列番号26および29、3.6kbpの増幅では配列番号30および31)、10ngのヒトゲノムDNA(Roche社製)、抗体と混合した1Uの各酵素を含む50μlの反応液を用いた。94℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→65℃、30秒→68℃、1kbpあたり約1分(1.3kbpの増幅では1分30秒、2.8kbpの増幅では3分、3.6kbpの増幅では4分)を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社)にてPCRを行った。またコントロールとして、Taq DNAポリメラーゼでの増幅も行った。Taq DNAポリメラーゼはToyobo社製のものを用い、Anti−Taq High(Toyobo社製)と混合したものを用いた。反応は1×BlendTaqに添付のBuffer、2mM dTTPをdUTPに置換したdNTPs(dATP、dUTP,dCTP、dGTP)、10pmolのプライマー(上記と同様)、10ngのヒトゲノムDNA(Roche社製)、抗体と混合した2.5Uの酵素を含む50μlの反応液を、94℃、2分の前反応の後、94℃、30秒→65℃、30秒→68℃、1kbpあたり約1分(1.3kbpの増幅では1分30秒、2.8kbpの増幅では3分、3.6kbpの増幅では4分)を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社製)にてPCRを行った。
それぞれ反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約増幅DNA断片の増幅量を確認した。
イノシンが含まれたプライマーを用いた増幅比較
イノシンが含まれたプライマーを用いて、PCRでの増幅の違いを比較した。比較には、1Uあたり1μgのKOD抗体と混合したKOD変異体とKOD(野生型)、抗体を混合したTaq DNAポリメラーゼ(TaqDNAポリメラーゼ(Toyobo社製)とAnti−Taq High(Toyobo社製)を等量混合したもの)を用いた。
KOD変異体とKODのPCRは、KOD −Plus− Ver.2(Toyobo社製)添付のBuffer、MgSO4、dNTPsを用い、1×PCR Buffer、および1.5mM MgSO4、0.2mM dNTPs(dATP、dTTP,dCTP、dGTP)、75pmolおよび150pmolのプライマー(配列番号40および41)、100ngのPsychrobacter DNA、抗体と混合した1Uの各酵素を含む50μlの反応液を、94℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→54℃、10秒→68℃、1分を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社)を用いてPCRを行った。
Taq DNAポリメラーゼのPCRは、1×BlendTaqに添付のBuffer(Toyobo製品)、0.2mM dNTPs(dATP、dUTP,dCTP、dGTP)、75pmolおよび150pmolのプライマー(上記と同様)、100ngのPsychrobacter DNA、抗体と混合した2.5Uの酵素を含む50μlの反応液を、94℃、2分の前反応の後、94℃、30秒→54℃、30秒→68℃、1分を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社)を用いてPCRを行った。
反応終了後、MulitiNA(島津製作所社製)のDNA−1000キットに供し増幅DNA断片を確認した。
バイサルファイト処理したDNAの増幅比較
バイサルファイト処理したDNAを鋳型に、様々なプライマーでPCRの増幅の違いを比較した。比較には、1Uあたり1μgのKOD抗体と混合したKOD変異体(Y7A/V93K)とKOD(野生型)、抗体を混合したTaq DNAポリメラーゼ(TaqDNAポリメラーゼ(Toyobo社製)とAnti−Taq High(Toyobo社製)を等量混合したもの)を用いた。
バイサルファイト処理したDNAは、ヒトゲノムDNA(Roche製)をInvitrogen社のMethylCodeBisulfite Conversion Kitで処理したものを用いた。
KOD変異体(Y7A/V93K)とKODのPCRは、KOD −Plus− Ver.2(Toyobo社製)添付のBuffer、MgSO4、dNTPsを用い、1×PCR Buffer、および1.5mM MgSO4、0.2mM dNTPs(dATP、dTTP,dCTP、dGTP)、15pmolのプライマー(MINT1の増幅では配列番号42及び43、RARの増幅では配列番号44および45、THBS1の増幅では配列番号46および47、MINT31の増幅では配列番号48および49)、バイサルファイト処理したDNA抽出液1μl、抗体と混合した1Uの各酵素を含む50μlの反応液を、94℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→55℃、15秒→68℃、1分を40サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社)を用いてPCRを行った。
Taq DNAポリメラーゼのPCRは、1×BlendTaqに添付のBuffer(Toyobo製品)、0.2mM dNTPs(dATP、dUTP,dCTP、dGTP)、15pmolのプライマー(上記と同様)、バイサルファイト処理したDNA抽出液1μl、抗体と混合した2.5Uの酵素を含む50μlの反応液を、94℃、2分の前反応の後、94℃、30秒→55℃、30秒→68℃、1分を40サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社)を用いてPCRを行った。
反応終了後、MulitiNA(島津製作所社製)のDNA−1000キットに供し増幅DNA断片を確認した。
KOD Y7A/V93K変異体と同様の方法でKOD Y7A/P36H変異体やKOD N210D Y7A/P36H変異体、Pfu Y7A/V93K変異体でも同様の結果が得られている。このことから、ウラシル感受性が低い変異体はテンプレートにウラシルが含まれていても増幅ができることがわかり、バイサルファイト処理したDNAからでも増幅ができることがわかった。
dUTP存在下で増幅したDNAのUNGによる分解確認
ウラシル感受性を弱めたKOD変異体(N210D/Y7A/P36H)を用いてdUTPを含むPCRで増幅したHuman β−グロビンの0.7kbpを、UNGと反応させることで分解できるかを確認した。PCRにはKOD −Plus− Ver.2(Toyobo社製)添付のものを用い、1×PCR Buffer、および1.5mM MgSO4、2mM dTTPをdUTPに置換したdNTPs(dATP、dUTP,dCTP、dGTP)、15pmolのプライマー(配列番号50及び51)、10ngのヒトゲノムDNA(Roche社製)、抗体と混合した1Uの酵素を含む50μlの反応液を用いた。94℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→60℃、30秒→68℃、1分を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社)にてPCRを行った。その増幅産物を、上記1×PCR Bufferで10ng/μlに希釈し、希釈した増幅産物8μlと様々な濃度のUNG(Roche社製)2μlを混合し、37℃、10分反応させた。反応終了後、MulitiNA(島津製作所社製)のDNA−1000キットに供し増幅産物の量を確認した。
他の変異体(KOD Y7A/V93K、Pfu Y7A/V93K、KOD Y7A/P36H)で増幅したDNAにおいても、上記と同様の方法で、UNGにより分解できたという同様の結果が得られている。
Claims (19)
- サーモコッカス・エスピーKS−1(Thermococcus sp.KS−1)由来の野生型DNAポリメラーゼにおけるウラシルの結合に関するアミノ酸配列のうち少なくとも2つのアミノ酸の改変を有するものであり、該改変が配列番号8に示されるアミノ酸配列におけるY7に改変を有し、かつ、P36又はV93に相当するアミノ酸を改変したものであって、該改変が(a)〜(c)に示すものである、野生型DNAポリメラーゼよりもウラシルの感受性が低いことを特徴とする改変型DNAポリメラーゼ。
(a)Y7に相当するアミノ酸の改変が、Y7A、Y7G、Y7V、Y7L及びY7Iからなる群より選ばれるいずれかのアミノ酸置換である
(b)P36に相当するアミノ酸の改変が、P36H、P36K及びP36Rからなる群より選ばれるいずれかのアミノ酸置換である
(c)V93に相当するアミノ酸の改変が、V93H、V93K及びV93Rからなる群より選ばれるいずれかのアミノ酸置換である - サーモコッカス・セラー(Thermococcus celer)由来の野生型DNAポリメラーゼにおけるウラシルの結合に関するアミノ酸配列のうち少なくとも2つのアミノ酸の改変を有するものであり、該改変が配列番号9に示されるアミノ酸配列におけるY7に改変を有し、かつ、P36又はV93に相当するアミノ酸を改変したものであって、該改変が(a)〜(c)に示すものである、野生型DNAポリメラーゼよりもウラシルの感受性が低いことを特徴とする改変型DNAポリメラーゼ。
(a)Y7に相当するアミノ酸の改変が、Y7A、Y7G、Y7V、Y7L及びY7Iからなる群より選ばれるいずれかのアミノ酸置換である
(b)P36に相当するアミノ酸の改変が、P36H、P36K及びP36Rからなる群より選ばれるいずれかのアミノ酸置換である
(c)V93に相当するアミノ酸の改変が、V93H、V93K及びV93Rからなる群より選ばれるいずれかのアミノ酸置換である - サーモコッカス・シクリ(Thermococcus siculi)由来の野生型DNAポリメラーゼにおけるウラシルの結合に関するアミノ酸配列のうち少なくとも2つのアミノ酸の改変を有するものであり、該改変が配列番号10に示されるアミノ酸配列におけるY7に改変を有し、かつ、P36又はV93に相当するアミノ酸を改変したものであって、該改変が(a)〜(c)に示すものである、野生型DNAポリメラーゼよりもウラシルの感受性が低いことを特徴とする改変型DNAポリメラーゼ。
(a)Y7に相当するアミノ酸の改変が、Y7A、Y7G、Y7V、Y7L及びY7Iからなる群より選ばれるいずれかのアミノ酸置換である
(b)P36に相当するアミノ酸の改変が、P36H、P36K及びP36Rからなる群より選ばれるいずれかのアミノ酸置換である
(c)V93に相当するアミノ酸の改変が、V93H、V93K及びV93Rからなる群より選ばれるいずれかのアミノ酸置換である - 少なくとも2つのアミノ酸の改変が、Y7A及びP36Hのアミノ酸置換である請求項1から3のいずれかに記載の改変型DNAポリメラーゼ。
- 少なくとも2つのアミノ酸の改変が、Y7A及びP36Kのアミノ酸置換である請求項1から3のいずれかに記載の改変型DNAポリメラーゼ。
- 少なくとも2つのアミノ酸の改変が、Y7A及びP36Rのアミノ酸置換である請求項1から3のいずれかに記載の改変型DNAポリメラーゼ。
- 少なくとも2つのアミノ酸の改変が、Y7A及びV93Kのアミノ酸置換である請求項1から3のいずれかに記載の改変型DNAポリメラーゼ。
- 少なくとも2つのアミノ酸の改変が、Y7A及びV93Rのアミノ酸置換である請求項1から3のいずれかに記載の改変型DNAポリメラーゼ。
- 3’−5’エキソヌクレアーゼ活性領域に関するアミノ酸配列のうち、配列番号8,9又は10に示されるアミノ酸配列におけるD141、I142、E143、H147、N210及びY311に相当するアミノ酸のうちの少なくとも1つの改変を更に有する請求項1〜8のいずれかに記載の改変型DNAポリメラーゼ。
- 3’−5’エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列の改変がD141A及びE143Aである請求項9に記載の改変型DNAポリメラーゼ。
- 3’−5’エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列の改変がI142Rである請求項9に記載の改変型DNAポリメラーゼ。
- 3’−5’エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列の改変がY311Fである請求項9に記載の改変型DNAポリメラーゼ。
- 前記改変型DNAポリメラーゼがH147E又はH147Dのアミノ酸置換を更に含む請求項1〜12のいずれかに記載の改変型DNAポリメラーゼ。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の改変型DNAポリメラーゼを使用することを特徴とする核酸増幅方法。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の改変型DNAポリメラーゼを使用して、イノシンを含んだプライマーを用いることを特徴とする核酸増幅方法。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の改変型DNAポリメラーゼを使用して、バイサルファイト処理したDNAを増幅することを特徴とする核酸増幅方法。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の改変型DNAポリメラーゼを使用して増幅した核酸を、ウラシル−DNAグリコシラーゼを用いて分解する工程を含むことを特徴とする核酸増幅方法。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の改変型DNAポリメラーゼを含む核酸増幅用試薬。
- 請求項18に記載の核酸増幅用試薬を含むキット。
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