JP6578283B2 - 藻類をベースとした食用ワクチン - Google Patents
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Description
(a)外因性抗原をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む遺伝子組換え微細藻類の有効量を介在生物に経口投与するステップであって、コードされる外因性抗原が微細藻類細胞の細胞内コンパートメント内に局在し、それにより遺伝子組換え微細藻類を摂食した介在生物を得る、ステップと、
(b)遺伝子組換え微細藻類を摂食した介在生物の有効量を動物対象に経口投与するステップと、
を含む。
用語「微細藻類」または「微細藻類(複数)」は、本明細書において、その最も広い範囲において使用され、淡水系および海洋系において通常見出される単細胞微小真核藻類を指す。微細藻類のサイズは、その種類に応じて、数マイクロメートル(μm)から数百マイクロメートルの範囲にわたることがある。ある現在の特定の実施形態によれば、上記用語は海生真核微細藻類または海生真核微細藻類(複数)を指す。
これらの実施例は、本発明の実施形態の少なくとも一部の態様の特定の実施に関する。実施例は例示に過ぎず、決して限定することを意図するものではない。
NNVカプシドタンパク質発現ベクターの調製
NNVカプシドタンパク質(配列番号3)をコードする遺伝子を藻類Phaeodactylum tricornutumのコドン使用頻度に従って合成し、配列番号7に示される核酸配列を得た。
腸炎菌の細菌フラジェリン(配列番号4)をコードする遺伝子を藻類Phaeodactylum tricornutumのコドン使用頻度に従って合成し、配列番号8に示される核酸配列を得る。液胞標的化配列およびHAタグが予めサブクローニングされたpPhaT1ベクターに、細菌フラジェリンに対応する合成配列をクローニングする。BamHIおよびKpnIを用いて細菌フラジェリンをクローニングする。
・目的の遺伝子のクローニングサイトの上流にfcpA(フコキサンチンクロロフィルタンパク質A)プロモーター、
・MCP−マルチクローニングサイト、
・ゼオシン耐性およびフレオマイシン耐性を付与するタンパク質をコードするStreptoalloteichus hindustanus由来sh ble遺伝子の転写を制御するfcpB(フコキサンチンクロロフィルタンパク質B)プロモーター、
・目的の遺伝子の後ろ(下流)およびゼオシン(zeucine)耐性遺伝子の後ろにあるfcpAターミネーター、
・アンピシリン耐性遺伝子、
・Escherichia coli由来複製開始点
を含む。
藻類の培養および回収を、本発明の出願人に属する米国特許出願公開第2011/0081706号に記載されるように行った。簡潔に説明すると、珪藻を増殖させるためのF/2栄養素で強化した濾過海水中で藻類を培養した(「Andersen R et al.2005.Recipes for freshwater and seawater media.:Algal Culturing Techniques(R.A.Andersen,Eds.),pp.429−538.Elsevier,Amsterdam」から改変)。72時間ごとに最終培養体積に対して1:1000の用量でF/2を加えた。温度状況を21℃で一定に維持した。100μmol photons/m2s1の光強度で、明:暗を16時間:8時間に設定した。CO2を空気と混合し、エアレーションシステムによって、制御された比率で培養液に送達した。実験で使用する藻類を、その最大培養密度付近にて回収した。藻類の凝集を促進するために水酸化カルシウムを、0.15g/mlでCa(OH)2を含む水中での粒子の微細懸濁液として培養液に加え、その後、培養液を濾過するか、または遠心分離した。得られた藻類沈殿物を凍結乾燥した。
(Apt et al.1996.Mol.Gen Genet.252:572−579に従って実施した)
上述の通りに、新鮮な藻類培養液を人工海水(ASW)F/2培地において対数期半ば(2〜5×106cells/ml)まで増殖させた。射出の24時間前に細胞を回収し、新鮮なASW+F2で2回洗浄して、元の細胞体積の1/10となるようにASW+F/2に再懸濁した。細胞懸濁液0.5mlを、凝固させたASW+F/2培地を含む55mmのペトリ皿の中央にスポットする。プレートを放置して、通常の増殖条件下で乾燥させる。直径が2ミクロンより大きい細胞についてはM17タングステンパウダー(BioRad Laboratories Inc.)を用いて、および、より小さい細胞については0.6ミクロン未満の粒子からなるタングステンパウダー(FW06,Canada Fujian Jinxin Powder Metallurgy Co.,Markham,ON,Canada)を用いて、PDS 1000/He biolistic transformation system(BioRad Laboratories Inc.,Hercules,CA USA)を製造業者の指示書に従い使用して射出を行った。タングステンを直鎖状DNAで被覆した。1100または1350psiのラプチャーディスクを使用した。使い捨て用品は全てBioRad Laboratories Incから購入した。射出後に、プレートを通常の増殖条件下で24時間インキュベートし、その後、細胞を選択固体培地上にプレーティングして、単一のコロニーが出現するまで通常の増殖条件下でインキュベートした。
上述の通りに、藻類培養液を人工海水(ASW)+F/2培地において対数期半ばまで増殖させた。その後、細胞を回収し、新鮮な培地で2回洗浄した。元の体積の1/50となるように細胞を再懸濁した後、ASW中4%のヘミセルラーゼ(Sigma)および2%のドリセラーゼ(Sigma)を等体積で加えることによりプロトプラストを調製し、37℃で4時間インキュベートした。カルコフロールホワイトで染色されないことをもってプロトプラストの形成を試験した。0.6MのD−マンニトールおよび0.6MのD−ソルビトールを含むASWでプロトプラストを2回洗浄し、同じ培地に再懸濁した。その後、DNAを加えた(プロトプラスト100μlごとに10μgの直鎖状DNA)。冷えたエレクトロポレーションのキュベットにプロトプラストを移して、氷上で7分間インキュベートし、その後、ECM830エレクトロポレーション装置(BTX,Harvard Apparatus,Holliston,MA,USA)においてパルスした。1000〜1500ボルト、1パルスあたり10〜20msecの範囲にわたる様々なパルスが通常使用される。各キュベットを5〜10回パルスした。パルス後直ちにキュベットを氷上に5分間置き、その後、プロトプラストを250μlの新鮮な増殖培地(非選択的)に加えた。25℃にて低光量で24時間プロトプラストをインキュベートした後、細胞を選択固体培地上にプレーティングして、単一のコロニーが出現するまで通常の増殖条件下でインキュベートした。
新鮮な藻類培養液をASW+F/2培地において対数期半ばまで増殖させた。培養液サンプル10mlを回収し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS,Gibco,Invitrogen,Carslbad,CA,USA)で2回洗浄して、250μlのバッファR(マイクロポレーション装置およびキットの製造者であるDigital Bio,NanoEnTek Inc.(Seoul,Korea)により供給)中に再懸濁した。細胞100μlごとに直鎖状DNAを8μg加えた後、細胞をパルスした。細胞の種類に応じて、700〜1700ボルト、パルス長さ10〜40msecの範囲にわたる様々なパルスが一般に必要である。各サンプルを1〜5回パルスした。パルス後直ちに細胞を200μlの新鮮な培地(非選択的)に移した。25℃にて低光量で24時間インキュベートした後、細胞を選択固体培地上にプレーティングして、単一のコロニーが出現するまで通常の培養条件下でインキュベートした。
タンパク質発現の解析は、SDS−PAGEおよびウェスタンブロット分析により以下のように行った。プロテアーゼインヒビターカクテル(Sigma;Cat# P9599)および100μlの酸洗浄ガラスビーズ(Sigma;Cat#G8772)を加えた500μlの溶解バッファ(50mM Tris pH7、1mM EDTA、100mM NaCl、1.4mM CHAPS)中で、20mgの藻類の粉末を溶解した。製造業者の指示書に従いBCA Protein Assay Kit(Pierce;Cat#23225)を使用してタンパク質濃度を決定し、製造業者の指示書に従いSDS−PAGE(4〜20%;Tris−グリシン,Bio−Rad Cat#456−1095)によって各サンプル20μlを分析した。製造業者の指示書に従いTransBlot Turbo RTA Transfer Kit(Bio−Rad;Cat#170−4237)を使用してゲルをPVDFメンブレンに移した。メンブレンを環境温度にて1時間、ブロッキングバッファ(5%スキムミルク)でブロッキングし、環境温度にて2時間、マウスモノクローナル抗HA抗体(Covance;Cat#MMS−101P−1000)とインキュベートしてから、TBS−T(Bio−Rad;Cat#170−6435)+0.02% Tween−20(Sigma;Cat#P1379)で3回洗浄した。次に、メンブレンを1時間、Peroxidase−conjugated AffiniPure Goat Anti−Rabbit IgG(Jackson immunochemicals;Cat#115−035−003)とインキュベートし、環境温度にて5分間、TBS−Tで3回洗浄した。製造業者の指示書に従いEZ−ECL(Biological Industries;Cat#20−500−120)を用いてメンブレンを化学発光させ、フジ医療用X線フィルムに露光させた。
魚用飼料を、乾燥させた藻類(野生型または遺伝子組換え)の粉末と混合する。5%ゼラチン溶液100mlを藻類−魚用飼料混合物に注ぎ、その後、風乾させる。
Maxisorp 96−ウェルプレート(Thermo Scientific;Cat#442404)を、コーティングバッファ(0.03M g Na2CO3、0.07M NaHCO3、pH9.6)中に溶解させた5μg/mlの精製NNVカプシドタンパク質100μlでコーティングする。4℃にて一晩インキュベートした後、プレートをPBS(Biological industries;Cat#0.2−0.23−5A)+0.05% Tween−20(Sigma;Cat#P1379)で3回洗浄し、環境温度にて1時間、ブロッキングバッファ(PBS+1%ウシ血清アルブミン(Sigma;Cat#A7888))でブロッキングする。魚の血清をPBS中で段階希釈して、各サンプル100μlを各ウェルに加え、4℃にて一晩インキュベートする。プレートを室温にて洗浄バッファで3回洗浄する。次に、プレートを4℃にて一晩、マウス抗魚IgM抗体(LifeSpan Bioscience;Cat#LS−C58989)とインキュベートする。プレートを洗浄バッファで3回洗浄し、環境温度にて1時間、Peroxidase−conjugated AffiniPure Goat Anti−Mouse IgG(Jackson immunoresearch;Cat#115−035−003)とインキュベートする。次に、プレートを室温にて洗浄バッファで3回洗浄し、環境温度にてペルオキシダーゼの基質(TMBE;Millipore;Cat#ES001)とインキュベートする。発色後に、停止液(2N H2SO4)で反応を終結させる。450nmにて光学密度解析を行う。アッセイは二連で行う。
定量的リアルタイムPCR(qPCR)を使用してインターフェロン誘導性Mxタンパク質の発現レベルをベータノダウイルス接種後に検定する。魚を屠殺し、脳、頭部および腎臓を無菌的に取り出してRNAおよびcDNAの調製のために凍結する。Poisa−Beiro et al.(Molecular Immunology,2008,45:218−225)において以前に説明された通りにqPCRを行う。
Maxisorp 96−ウェルプレート(Thermo Scientific;Cat#442404)を、コーティングバッファ(0.03M g Na2CO3、0.07M NaHCO3、pH9.6)中に溶解させた5μg/mlの精製NNVフラジェリン100μlでコーティングする。4℃にて一晩インキュベートした後、プレートをPBS(Biological industries;Cat#0.2−0.23−5A)+0.05% Tween−20(Sigma;Cat#P1379)で3回洗浄し、環境温度にて1時間、ブロッキングバッファ(PBS+1%ウシ血清アルブミン(Sigma;Cat#A7888))でブロッキングする。ニワトリの血清をPBS中で段階希釈して、各サンプル100μlを各ウェルに加え、4℃にて一晩インキュベートする。プレートを室温にて洗浄バッファで3回洗浄する。次に、プレートを4℃にて一晩、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたウサギ抗ニワトリIgG抗体(Sigma;Cat#A9046)とインキュベートする。プレートを洗浄バッファで3回洗浄し、環境温度にてペルオキシダーゼの基質(TMBE;Millipore;Cat#ES001)とインキュベートする。発色後に、停止液(2N H2SO4)で反応を終結させる。450nmにて光学密度解析を行う。アッセイは二連で行う。
NNVカプシドタンパク質を液胞標的化配列に融合させ、さらなる分析において特定のタンパク質の検出を容易にするためにHAタグに融合させた。必要に応じて、カプシドタンパク質を、液胞リーダー配列およびHAタグに加えて膜移行配列(MTS)に融合させた。MTSは、魚の腸からその血液循環系へと魚によって摂取された藻類において発現されたタンパク質の吸収を促進することが本発明の発明者によって以前に示された。NNV組換えタンパク質の発現について藻類の形質転換体をスクリーニングした(図1)。陽性の藻類クローンを上述の通りにさらに培養し、ワクチネーション試験に使用するために藻類材料を回収した。
孵化した仔魚の3つの反復試験群をワクチネーション実験に使用し(アッセイ群)、3つの反復試験群を対照として使用する。開放循環で濾過およびUV処理された海水を供給されるタンクにおいて仔魚を飼育した(環境温度および環境塩分濃度)。ワムシを含む生の稚魚スターター飼料(live fry starter feed)を10日間、仔魚に給餌し、その後、さらなる20日間については、以下のように餌をArtemia naupliiに変更した。
(1)液胞標的化カプシドタンパク質を発現する遺伝子組換え藻類を給餌したアルテミアをアッセイ群の仔魚への給餌に使用した。
(2)野生型の藻類を給餌したアルテミアを対照群の仔魚への給餌に使用した。
開放循環で濾過およびUV処理された海水を供給されるタンクにおいて仔魚を飼育する(環境温度および環境塩分濃度)。孵化した仔魚の3つの反復試験群をワクチネーション実験に使用し、3つの反復試験群(いずれもワクチネーション処理なし)を対照として使用する。ワムシを含む生の稚魚スターター飼料を仔魚に給餌した。10日間の後、NNVカプシドタンパク質を発現する遺伝子組換え微細藻類を給餌されたArtemia naupliiを、さらなる20日間、仔魚への給餌に使用した(ワクチネーション実験、アッセイ群)。野生型の藻類を給餌されたArtemia naupliiを給餌された仔魚が対照群となる。
ワクチネーション群(遺伝子組換え微細藻類を給餌)および非ワクチネーション群(野生型の微細藻類を給餌)の10匹の幼魚または稚魚の3つの反復試験群を浸漬または腹腔内(IP)注射のいずれかによって107、105、103または101のTCID50で曝露させる。陰性対照は、5%ウシ胎仔血清(Invitrogen)を加えたL−15培地で偽曝露させる。60%の死亡率を生じさせる用量(LD60)を、その後の曝露に使用する。曝露から0日、15日および30日後に、各反復試験群から3匹の魚のサンプリングを行う。ウイルス曝露後の魚の生存率、血清中のIgM力価のレベルおよびサイトカインMxのRNAの発現レベルによってワクチンの有効性を決定する。
37日齢の健康な20匹のヒヨコを2つの群に割り当てる。一方の群にはフラジェリンを発現する藻類を給餌し、対照群には野生型の藻類を給餌する。3つの独立した反復試験を並行して行う。免疫化から26日後に、ニワトリの群を109CFUのS.Enteritidisに経口的に曝露させる。曝露から3日、7日、および14日後に、盲腸糞を採取し、Okamura et al.(Poultry Science 91:2444−2449,2012)において以前に説明された通りに細菌の***を調べる。曝露から18日後に、ニワトリを剖検に供し、サルモネラについて肝臓、脾臓、および盲腸の内容物を調べる。また、特異的抗腸炎菌フラジェリン抗体力価分析のために、ワクチネーション前およびワクチネーション後に血清も採取する。
Claims (36)
- 遺伝子組換え真核微細藻類を含む食用ワクチンであって、
前記遺伝子組換え微細藻類は、外因性抗原をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドと液胞標的化ペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む発現カセットを含む、
食用ワクチン。 - 前記液胞標的化ペプチドは、配列番号1および配列番号9のうちのいずれか1つに対して少なくとも90%相同であるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の食用ワクチン。
- 前記コードされる外因性抗原は、前記ワクチンを摂取する標的対象において、病原体によって引き起こされる疾患に対する免疫応答を誘導する、請求項1または2に記載の食用ワクチン。
- 前記ワクチンは、前記遺伝子組換え微細藻類を摂食した介在生物を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の食用ワクチン。
- 前記標的対象は魚である、請求項3または4に記載の食用ワクチン。
- 前記病原体は、Streptococcus iniae、Streptococcus agalactiae、ベータノダウイルス、および伝染性サケ貧血ウイルスからなる群から選択される、請求項5に記載の食用ワクチン。
- 前記病原体はベータノダウイルスであり、前記外因性抗原は配列番号3に対して少なくとも90%相同であるアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の食用ワクチン。
- 前記標的対象は家禽対象である、請求項3に記載の食用ワクチン。
- 前記病原体はsalmonella entericaである、請求項8に記載の食用ワクチン。
- 前記外因性抗原は、配列番号4に対して少なくとも90%相同であるアミノ酸配列を含む、請求項9に記載の食用ワクチン。
- 前記微細藻類は海生藻類である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の食用ワクチン。
- 前記微細藻類は、Phaeodactylum tricornutum、Dunaliella spp.、Nannochloropsis app.、Nannochloris spp.、Tetraselmis spp.、Isochrysis galbana、Pavlova spp.、Amphiprora hyaline、Chaetoceros muelleri、およびNeochloris oleoabundansからなる群から選択される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の食用ワクチン。
- 前記微細藻類はPhaeodactylum tricornutumである、請求項12に記載の食用ワクチン。
- 前記外因性抗原は、100kDa以下の分子量を有する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の食用ワクチン。
- 請求項1に記載の食用ワクチンを含む、食用組成物。
- 前記食用組成物は、水生動物に給餌するための食用組成物および陸生家畜に給餌するための食用組成物からなる群から選択される動物用食物組成物である、請求項15に記載の食用組成物。
- 請求項4に記載の食用ワクチンを含む、食用組成物。
- 前記介在生物は、アルテミアおよびワムシからなる群から選択される、請求項17に記載の食用組成物。
- 外因性抗原をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドと液胞標的化ペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む発現カセットを含む遺伝子組換え真核微細藻類を含むワクチンであって、
それを必要とする対象に対する前記コードされる抗原の経口送達に使用するためのワクチン。 - 前記液胞標的化ペプチドは、配列番号1および配列番号9のうちのいずれか1つに対して少なくとも90%相同であるアミノ酸配列を含む、請求項19に記載のワクチン。
- 前記コードされる外因性抗原は、前記対象において、病原体によって引き起こされる疾患に対する免疫応答を誘発する、請求項19または20に記載のワクチン。
- 前記コードされる外因性抗原は、病原体に対する前記対象の抵抗性を向上させる、請求項19または20に記載のワクチン。
- 前記対象は、水生動物、陸生家畜およびヒトからなる群から選択される、請求項19〜22のいずれか1項に記載のワクチン。
- 前記対象は魚である、請求項23に記載のワクチン。
- 前記病原体は、Streptococcus iniae、Streptococcus agalactiae、ベータノダウイルス、および伝染性サケ貧血ウイルスからなる群から選択される、請求項24に記載のワクチン。
- 前記病原体はベータノダウイルスであり、前記外因性抗原は配列番号3に対して少なくとも90%相同であるアミノ酸配列を含む、請求項25に記載のワクチン。
- 前記対象は家禽対象である、請求項23に記載のワクチン。
- 前記病原体はsalmonella entericaである、請求項27に記載のワクチン。
- 前記外因性抗原は、配列番号4に対して少なくとも90%相同であるアミノ酸配列を含む、請求項28に記載のワクチン。
- 前記微細藻類は海生藻類である、請求項19〜29のいずれか1項に記載のワクチン。
- 前記微細藻類は、Phaeodactylum tricornutum、Dunaliella spp.、Nannochloropsis app.、Nannochloris spp.、Tetraselmis spp.、Isochrysis galbana、Pavlova spp.、Amphiprora hyaline、Chaetoceros muelleri、およびNeochloris oleoabundansからなる群から選択される、請求項19〜29のいずれか1項に記載のワクチン。
- 前記微細藻類はPhaeodactylum tricornutumである、請求項31に記載のワクチン。
- 前記コードされる外因性抗原は、100kDa以下の分子量を有する、請求項19〜32のいずれか1項に記載のワクチン。
- 前記ワクチンは、食用の希釈剤、賦形剤または運搬体をさらに含む、請求項19に記載のワクチン。
- 前記ワクチンは、水生動物に給餌するための組成物および陸生家畜に給餌するための組成物からなる群から選択される動物用食物組成物として製剤化されている、請求項34に記載のワクチン。
- 前記ワクチンは、前記遺伝子組換え微細藻類を摂食した介在生物を含む、請求項19〜35のいずれか1項に記載のワクチン。
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