JP6573331B2 - 同起源の抗体可変領域遺伝子セグメントをクローニングおよび発現させるための迅速な方法 - Google Patents
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Description
モノクローナル抗体を分泌する細胞を得るために、Koehler and Milsteinによって開発されたハイブリドーマ技術が広く用いられている。しかし、ハイブリドーマ技術では、融合して増殖させることができるのは、免疫した実験動物から得られたB細胞の1分画のみである。B細胞源は、一般的に脾臓などの免疫した実験動物の臓器である。
- RT-PCRにおける鋳型として抗体分泌B細胞から得られたRNAを用いて一本鎖cDNAを合成する段階、
- PCRにおいて、可変ドメインコード核酸を増幅して、それによって抗体の同起源の可変ドメインをコードする核酸断片を単離する段階、
を含む抗体の同起源の可変ドメインをコードする核酸の単離方法であって、
PCRプライマーがPCR後に除去される方法である。
- 抗体をコードする核酸を含む真核細胞を培養する段階、および
- 細胞または培養培地から抗体を回収する段階、
を含む抗体を産生する方法であって、
抗体をコードする核酸が、
- RT-PCRにおける鋳型として抗体分泌B細胞から得られたRNAを用いて一本鎖cDNAを合成する段階、
- PCRにおいて可変ドメインコード核酸を増幅する段階、および
- 可変ドメインコード核酸を1つまたは複数の真核細胞発現プラスミドに挿入する段階によって得られる、方法である。
- 1つまたは複数の発現プラスミドがプラスミド形質転換大腸菌細胞のプールから調製されている、抗体重鎖および軽鎖をコードする1つまたは複数の発現プラスミドをトランスフェクトした真核細胞を培養する段階、
- 細胞または培養培地から抗体を回収する段階
を含む抗体を産生する方法である。
- 抗体をコードする核酸を含む真核細胞の培養培地から抗体を回収する段階、
を含む抗体を産生する方法であって、
抗体をコードする核酸が、
- PCRにおける鋳型として抗体分泌B細胞のRNAから得られた一本鎖cDNAから同起源の可変ドメインコード核酸を増幅する段階、および
- ライゲーション非依存的クローニングによって可変ドメインコード核酸を真核細胞発現プラスミドに挿入する段階、によって得られ、
抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをそれぞれコードする核酸のプールが挿入のために用いられる、方法である。
- 鋳型として抗体分泌B細胞から得られたRNAを用いて一本鎖cDNAを合成する段階、を含む。
- 真核細胞が、プラスミド形質転換大腸菌細胞のプールから調製されている発現プラスミドのプールをトランスフェクトされている、抗体をコードする発現プラスミドをトランスフェクトした真核細胞を培養する段階、
- 細胞または培養培地から抗体を回収する段階、
を含む、抗体を産生する方法である。
- PCRにおける鋳型として抗体分泌B細胞のRNAから得られた一本鎖cDNAから同起源の可変ドメインコード核酸を増幅する段階、および
- ライゲーション非依存的クローニングによって可変ドメインコード核酸を真核細胞発現プラスミドに挿入する段階、によって得られる。
- 鋳型として抗体分泌B細胞から得られたRNAを用いて一本鎖cDNAを合成する段階、を含む。
[本発明1001]
抗体をコードする核酸を含む真核細胞の培養培地から抗体を回収する段階
を含む、抗体を産生する方法であって、
PCRにおける鋳型として抗体分泌B細胞のRNAから得られた一本鎖cDNAから同起源の可変ドメインコード核酸を増幅する段階、および
ライゲーション非依存的クローニングによって可変ドメインコード核酸を真核細胞発現プラスミドに挿入する段階
によって、抗体をコードする核酸が得られ、
抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをそれぞれコードする核酸のプールが挿入のために用いられる、方法。
[本発明1002]
プラスミド形質転換大腸菌細胞のプールから調製されている発現プラスミドのプールをトランスフェクトされている、抗体をコードする発現プラスミドをトランスフェクトした真核細胞を培養する段階、
該細胞または培養培地から抗体を回収する段階
を含む、抗体を産生する方法。
[本発明1003]
B細胞がウサギB細胞であることを特徴とする、本発明1001の方法。
[本発明1004]
B細胞が1つの沈着させたB細胞であることを特徴とする、本発明1001または1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
B細胞が約7日間培養されることを特徴とする、本発明1001または1003または1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
1つの細胞から開始してフィーダー細胞と共に7日間共培養すると20 ng/mlより多くの抗体をB細胞およびその子孫が産生することを特徴とする、本発明1001および1003から1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
SEQ ID NO: 5および6またはSEQ ID NO: 7または8の核酸配列をPCRプライマーが有することを特徴とする、本発明1001および1003から1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
PCRプライマーがPCR後に除去されることを特徴とする、本発明1001および1003から1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
配列およびライゲーション非依存的クローニングによって核酸断片が発現プラスミドに挿入されることを特徴とする、本発明1001から1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
核酸約300 ngが挿入反応に用いられることを特徴とする、本発明1001および1003から1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
可変ドメインを含まない増幅された発現プラスミドにおける可変ドメインコード核酸の配列およびライゲーション非依存的クローニングによって発現プラスミドが得られることを特徴とする、本発明1001から1011のいずれかの方法。
[本発明1012]
プラスミドが増幅前に直線状にされることを特徴とする、本発明1011の方法。
定義
「親和性」は、分子(たとえば、抗体)の1つの結合部位と、その結合パートナー(たとえば、抗原)とのあいだの非共有結合相互作用の総和の強度を意味する。それ以外であることを明記している場合を除き、本明細書において用いられる「結合親和性」は、結合対(たとえば、抗体と抗原)のメンバー間の1:1の相互作用を反映する内因性の結合親和性を意味する。そのパートナーYに対する分子Xの親和性は、一般的に解離定数(Kd)によって表すことができる。親和性は、本明細書において記述される方法を含む、当技術分野において公知の一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための特異的な実例となる例示的態様を、以下に記述する。
100×分数X/Y、
式中Xは、AとBのそのプログラムのアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムALIGN-2によって同一のマッチとして採点されたアミノ酸残基の数であり、Yは、Bにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、Bに対するAの%アミノ酸配列同一性は、Aに対するBの%アミノ酸配列同一性と等しくないと認識されるであろう。それ以外であると明記している場合を除き、本明細書において用いられる全ての%アミノ酸配列同一性の値は、ALIGN-2コンピュータープログラムを用いて直前の段落に記述されているように得られる。
免疫
抗体に基づく治療を評価するための動物モデルとして、しばしばマウス、ウサギ、ハムスター、およびラットなどの非ヒト動物が用いられる。同様に、特異的疾患から生存した、慢性疾患を有する、または特異的疾患に対して最近ワクチン接種を受けたヒトのB細胞を用いることも可能である。
実験動物またはヒトの血液は、高度に多様な抗体産生B細胞を提供する。そこから得られるB細胞は、CDR内のアミノ酸配列とほとんど同一ではないまたは重なり合わないアミノ酸配列を有し、このように高い多様性を示す抗体を分泌する。
B細胞から、総mRNAを単離してcDNAに転写することができる。特異的プライマーによって、同起源のVHおよびVL領域コード核酸を増幅することができる。本明細書において報告される方法によって、同一の配列はほとんど得られないであろう。このように、本方法は、同じ抗原に結合する高度に多様な抗体を提供する。
a) 染色B細胞集団(1つの態様において、B細胞は、1つから3つ、または2つから3つの蛍光色素によって染色される)から1つの(成熟)B細胞(実験動物またはヒトの血液またはリンパ系臓器から得られる)を、個々の容器(1つの態様において、容器はマルチウェルプレートのウェルである)に沈着させる段階、
b) 沈着させた個々のB細胞を、フィーダー細胞およびフィーダーミックスの存在下で培養する段階(1つの態様において、フィーダー細胞はEL-4 B5細胞であり、1つの態様において、フィーダーミックスは天然のTSN(B細胞が由来する同じ種の実験動物の胸腺の培養上清)であり、1つの態様において、フィーダーミックスは合成フィーダーミックスである)、
c) 逆転写PCR(RT-PCR)によって特異的結合抗体の可変軽鎖および重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定して、それによってモノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインコード核酸を得る段階、
d) 個々のHCおよびLC発現カセットにおいて可変軽鎖および重鎖をコードする核酸を含む細胞を培養して、細胞または細胞培養上清から抗体を回収して、それによって抗体を産生する段階。
a) (成熟)B細胞集団(実験動物またはヒトの血液またはリンパ系臓器から得られる)を提供する段階、
b) 少なくとも1つの蛍光色素(1つの態様において、1つから3つ、または2つから3つの蛍光色素)によってB細胞集団の細胞を染色する段階、
c) 染色したB細胞集団の1つの細胞を、個々の容器(1つの態様において、容器はマルチウェルプレートのウェルである)に沈着させる段階、
d) 沈着させた個々のB細胞を、フィーダー細胞およびフィーダーミックスの存在下で培養する段階(1つの態様において、フィーダー細胞はEL-4 B5細胞であり、1つの態様において、フィーダーミックスは天然のTSN(B細胞が由来する同じ種の実験動物の胸腺の培養上清)であり、1つの態様において、フィーダーミックスは合成フィーダーミックスである)、
e) 個々のB細胞の培養において分泌された抗体の結合特異性を決定する段階、
f) 所望の結合特異性を有する抗体を分泌するB細胞の総RNAを単離する段階、
g) 軽鎖および重鎖可変ドメインに対して特異的なプライマーによって、ポリA+抽出mRNAについてRT-PCRを行う段階、
h) 特異的結合抗体の可変軽鎖および重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定する段階、
i) 抗体を発現させるためのそれぞれの発現カセットにモノクローナル抗体軽鎖および重鎖可変ドメインコード核酸を導入する段階、
j) 核酸を細胞に導入する段階、
k) 細胞を培養して、細胞または細胞培養上清から抗体を回収して、それによって抗体を産生する段階。
本明細書において報告される方法において、抗体可変ドメイン(軽鎖および重鎖)をコードする核酸セグメントの単離および真核細胞発現プラスミド(軽鎖および重鎖の各々に関してそれぞれ1つの発現カセット)への単離核酸セグメントの挿入は、クローン中間プラスミドを中間で単離して分析することなく行われる。このように、本明細書において報告される方法において、たとえば単離された形質転換大腸菌細胞の分析による中間カセット/プラスミドの中間でのクローニング、単離、および分析は必要ではない。1つの態様において、本明細書において報告される方法は、クローン中間プラスミドを中間で単離および分析することなく行われる。
- 免疫した実験動物の抗体産生B細胞からの総RNA抽出
- 抽出したポリA+ mRNAの一本鎖cDNA合成/逆転写
- 種特異的プライマーによるPCR
- PCRプライマーの除去/PCR産物の精製
- 任意でPCR産物のシークエンシング
- PCR産物のT4ポリメラーゼインキュベーション
- プラスミドDNAの直線化および増幅
- 増幅したプラスミドDNAのT4ポリメラーゼインキュベーション
- 増幅したプラスミドにおける可変ドメインコード核酸の配列およびライゲーション非依存的クローニング
- プラスミド形質転換大腸菌細胞プールからのプラスミドの調製
- 先の段階で調製したプラスミドによる真核細胞のトランスフェクション
- 抗体の発現。
SEQ ID NO: 1 リンカーペプチド1
SEQ ID NO: 2 リンカーペプチド2
SEQ ID NO: 3 リンカーペプチド3
SEQ ID NO: 4 リンカーペプチド4
SEQ ID NO: 5 重鎖可変ドメイン単離プライマー1(rb-VH3-23-Slic-s001プライマー)
SEQ ID NO: 6 重鎖可変ドメイン単離プライマー2(rb-CH1rev-2プライマー)
SEQ ID NO: 7 軽鎖可変ドメイン単離プライマー1(rb-V-カッパ-Slic-s001プライマー)
SEQ ID NO: 8 軽鎖可変ドメイン単離プライマー2(rbCk1-rev2プライマー)
SEQ ID NO: 9 軽鎖プラスミド増幅プライマー1(8011-Slic-s001プライマー)
SEQ ID NO: 10 軽鎖プラスミド増幅プライマー2(8000-Slic-as002プライマー)
SEQ ID NO: 11 重鎖プラスミド増幅プライマー1(8001-Slic-s001プライマー)
SEQ ID NO: 12 重鎖プラスミド増幅プライマー2(8001-Slic-as002プライマー)
SEQ ID NO: 13 rb-V-カッパ-HindIIIsプライマー
SEQ ID NO: 14 rb-C-カッパ-NheIasプライマー
SEQ ID NO: 15 rb-CH1rev-1プライマー
SEQ ID NO: 16 rbVH3-23for3プライマー
SEQ ID NO: 17 bcPCR-huCガンマ-revプライマー
SEQ ID NO: 18 bcPCR-FHLC-リーダー-fwプライマー
SEQ ID NO: 19 bcPCR-huCカッパ-revプライマー
SEQ ID NO: 20 bcPCR-hu-HC-10600-SLIC-asプライマー
SEQ ID NO: 21 bcPCR-hu-HC-10600-SLIC-sプライマー
SEQ ID NO: 22 bcPCR-hu-LC-10603-SLIC-sプライマー
SEQ ID NO: 23 bcPCR-hu-LC-10603-SLIC-asプライマー
SEQ ID NO: 24 SLIC-hu-VHユニバーサル-forプライマー
SEQ ID NO: 25 SLIC-hu-VH6-forプライマー
SEQ ID NO: 26 hu-CH1ガンマ-revプライマー
SEQ ID NO: 27 SLIC-huVk2-forプライマー
SEQ ID NO: 28 SLIC-huVk3-forプライマー
SEQ ID NO: 29 SLIC-huVk5-forプライマー
SEQ ID NO: 30 SLIC-huVk7-forプライマー
SEQ ID NO: 31 SLIC-huVk8-forプライマー
SEQ ID NO: 32 SLIC-huVk1ロング-forプライマー
SEQ ID NO: 33 SLIC-huVk2ロングw-forプライマー
SEQ ID NO: 34 huCk-revプライマー
SEQ ID NO: 35 SLIC-huVl1-forプライマー
SEQ ID NO: 36 SLIC-huVl2-forプライマー
SEQ ID NO: 37 SLIC-huVl3-forプライマー
SEQ ID NO: 38 SLIC-huVl4-forプライマー
SEQ ID NO: 39 SLIC-huVl5-forプライマー
SEQ ID NO: 40 SLIC-huVl6-forプライマー
SEQ ID NO: 41 SLIC-huVl7-forプライマー
SEQ ID NO: 42 SLIC-huVl8-forプライマー
SEQ ID NO: 43 SLIC-huVl9-forプライマー
SEQ ID NO: 44 SLIC-huVラムダ10-forプライマー
SEQ ID NO: 45 huCl-1-revプライマー
SEQ ID NO: 46 huIg-PCR-ベクタープライマー-as
SEQ ID NO: 47 huIg-PCR-ベクタープライマー-VH-s
SEQ ID NO: 48 huIg-PCR-ベクタープライマー-asカッパ
SEQ ID NO: 49 huIg-PCR-ベクタープライマー-VK-s
SEQ ID NO: 50 huIg-PCR-ベクタープライマー-asラムダ
SEQ ID NO: 51 huIg-PCR-ベクタープライマー-VL-s
同起源の抗体可変領域遺伝子セグメントのクローニングおよび発現
a)RNA抽出
10μl/mlの2-メルカプトエタノールを含むRLT緩衝液100μlを添加して、繰り返しピペッティングによって混合することによって細胞を溶解した。溶解物をRNA単離のためにそのまま用いるか、またはRNA調製まで-20℃で凍結保存した。Total RNA Isolation Kit NucleoSpin(Machery & Nagel)を用いて、製造元の説明書に従ってRNAを調製した。
Super Script III第一鎖合成SuperMix(Invitrogen)を用いて製造元の説明書に従って、mRNAの逆転写によってcDNAを生成した。第一の段階において単離mRNA 6μlを、アニーリング緩衝液1μlおよびオリゴdT 1μl(50μM)と共に混合して65℃で5分間インキュベートした後直ちに約1分間氷中に入れた。次に、そのまま氷中で2×First-Strand Reaction Mix and SuperScript(商標)III/RNaseOUT(商標)酵素ミックス10μlを添加した。混合後、反応物を50℃で50分間インキュベートした。85℃で5分間インキュベートすることにより反応を終了させた。終了後、反応ミックスを氷中に入れた。
ポリメラーゼ連鎖反応は、AccuPrime Pfx SuperMix(Invitrogen)を用いて製造元の説明書に従って行った。軽鎖および重鎖可変領域を個別の反応において増幅した。標的抗体発現ベクターに対して25 bpのオーバーラップを有するPCR-プライマー(0.2μM/反応)を用いた。PCR後、PCR反応混合物8μlを48ウェルeGels(Invitrogen)での分析のために用いた。
残留PCRプライマーを、NucleoSpin(登録商標)96 Extract IIキット(Machery & Nagel)を用いて製造元の説明書に従って除去した。
抗体重鎖および軽鎖の可変ドメインをコードするDNA配列を、PCR産物のシークエンシングによって得た。
抗体重鎖および軽鎖可変ドメインをコードするPCR産物をクローニングするためのレシピエントとして用いられるプラスミドDNAを、まず制限酵素消化によって直線状にした。次に、直線状のプラスミドDNAを、分取アガロース電気泳動によって精製して、ゲル(QIAquick Gel Extraction Kit / Qiagen)から抽出した。この精製プラスミドDNAを、クローニングされるPCR産物と重なり合う(20〜25 bp)プライマーを用いて、鋳型としてPCRプロトコールに加えた。PCRは、AccuPrime Pfx SuperMix(Invitrogen)を用いて行った。
PCR産物を、Haun, R.S., et al. (BioTechniques 13 (1992) 515-518) and Li, M.Z., et al. (Nature Methods 4 (2007) 251-256)によって記述される「配列およびライゲーション非依存的クローニング」法(SLIC)を用いて発現ベクターにおいてクローニングした。精製ベクターおよびインサートをいずれも、dNTPの非存在下でDNA 1μgあたりT4 DNAポリメラーゼ(Roche Applied Sciences, Mannheim, Germany)0.5 Uによって25℃で45分間処理して、マッチするオーバーハングを生成した。反応容積の1/10の10 mM dCTP溶液(Invitrogen)を添加することによって反応を停止させた。T4処理ベクターおよびインサートDNA断片をプラスミド:インサート比1:2(w/w)(例えば、100 ng:200 ng)で混合して、RecAProtein(New England Biolabs)および10×RecA緩衝液を添加することによって37℃で30分間組み換えを行った。次に、生成した重鎖および軽鎖発現プラスミドの各5μlを用いて、標準的な化学形質転換プロトコールを用いて、MultiShot Strip Well TOP 10化学コンピテント大腸菌細胞(Invitrogen)を形質転換した。再生後(形質転換大腸菌細胞を37℃で45分間振とうする)、形質転換混合物全体を、アンピシリンを添加したLB培地2 mlをウェルあたり含むDWP 96(深型ウェルプレート)に移した。細胞を37℃で20時間シェーカーにおいてインキュベートした。次の段階において、免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードするプラスミドDNAを、NucleoSpin 96 Plasmid Mini Kit(Macherey & Nagel)を用いて精製して、選択された制限酵素によって消化して、48ウェルeGels(Invitrogen)において分析した。平行して、グリセロール保存液を保存のために調製した。
HEK293細胞を、8%CO2を含む大気中でF17培地(Gibco)中で37℃で120 rpmで振とうさせながら生育させた。細胞をトランスフェクションの前日に分割して、密度0.7〜0.8×106個/mlで播種した。トランスフェクション当日、容積2 ml中のHEK293細胞1〜1.5×106個に、HCプラスミド0.5μgにLCプラスミド0.5μgを加えたものをトランスフェクトして、48ウェル深型ウェルプレートにおいて293を含まない培地(Novagen)1μlおよびOptiMEM(登録商標)培地(Gibco)80μlに浮遊させた。培養物を37℃および8%CO2において180 rpmで7日間インキュベートした。7日後、培養上清を採取して濾過し、抗体含有量および特異性に関して分析した。
B細胞生産性対増幅効率
本明細書において報告される方法において用いられるB細胞は、フィーダー細胞、例えばEL4-B5細胞およびZublerミックスの存在下で1つの沈着させたB細胞の培養によって得られた発現収率(抗体力価)に基づいて選択しなければならないことが見いだされている。得られた発現収率は、以下の表から見ることができる特異的閾値より上でなければならない。
プライマー
ウサギ抗体を発現するB細胞のB細胞PCRのためのプライマー
プライマーセット1:
LCプライマー
HC-プライマー
プライマーセット2:
LCプライマー
HCプライマー
重鎖発現プラスミド骨格を増幅するためのプライマー:
カッパ軽鎖発現プラスミド骨格を増幅するためのプライマー:
重鎖可変ドメインを増幅するためのプライマー
HC-Up
軽鎖可変ドメインを増幅するためのプライマー
1つのクローンと比較したプール
抗体可変領域遺伝子セグメントを増幅して、実施例1に記述されるようにそれぞれの発現ベクターにおいてクローニングした。プールクローニング対通常の1つのコロニーからのクローン採取に由来する配列の忠実度を決定するために、形質転換ミックスを2つに分割した:半分を、通常どおり1つのコロニーを生成するように平板培養して、残りの半分をプール培養として直接生育させた。次に、プール形質転換大腸菌細胞ならびに通常のプレートから採取した1つのコロニーの両方からプラスミドを調製して、クローニングした可変領域遺伝子セグメントの配列を決定した。以下の表に示されるように、コロニー由来プラスミドの80%から100%が、正確な可変領域遺伝子セグメントを含んだが、これはプール形質転換から得られた配列と同一であった。
プール培養細胞のシークエンシングから得られたVHおよびVLコード核酸配列は、個々のクローンのシークエンシングから得られた最も量の多い配列と同一であった。
Claims (8)
- 抗体を産生する方法であって、前記方法は、
(i)PCRにおける鋳型として抗体分泌B細胞のRNAから得られた一本鎖cDNAから同起源の可変ドメインコード核酸を増幅する段階、
(ii)ライゲーション非依存的クローニングによって可変ドメインコード核酸を真核細胞発現プラスミドに挿入する段階、
(iii)発現プラスミドをコンピテント細菌に形質転換する段階、
(iv)コンピテント細菌から抽出される発現プラスミドで真核細胞をトランスフェクトする段階、および
(v)抗体をコードする核酸を含む真核細胞の培養培地から抗体を回収する段階
を含み、
前記段階(iii)と(iv)の間に、
コンピテント細菌を固体培地で培養する段階、
コンピテント細菌を採取する段階、および
コンピテント細菌からプラスミドDNAを単離し分析する段階
を含まず、
抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをそれぞれコードする核酸のポリクローナルな集団が挿入のために用いられ、
B細胞は1つの沈着させたB細胞であり、
1つの細胞から開始してフィーダー細胞と共に7日間共培養すると20 ng/mlより多くの抗体をB細胞およびその子孫が産生する、方法。 - B細胞がウサギB細胞であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- SEQ ID NO: 5および6またはSEQ ID NO: 7または8の核酸配列をPCRプライマーが有することを特徴とする、請求項1および2のいずれか1項記載の方法。
- PCRプライマーがPCR後に除去されることを特徴とする、請求項1から3のいずれか1項記載の方法。
- 配列およびライゲーション非依存的クローニングによって核酸断片が発現プラスミドに挿入されることを特徴とする、請求項1から4のいずれか1項記載の方法。
- 核酸300 ngが挿入反応に用いられることを特徴とする、請求項1から5のいずれか1項記載の方法。
- 可変ドメインを含まない増幅された発現プラスミドにおける可変ドメインコード核酸の配列およびライゲーション非依存的クローニングによって発現プラスミドが得られることを特徴とする、請求項1から6のいずれか1項記載の方法。
- プラスミドが増幅前に直線状にされることを特徴とする、請求項7記載の方法。
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