JP6571149B2 - Multiple resonance probe - Google Patents
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Description
本発明は、多重共鳴用プローブに関する。さらに詳しくは、神経伝達物質に関連する代謝反応の解析、神経伝達物質が関与する疾患の診断を行なうための画像情報の取得などに有用な神経伝達物質の前駆体アミノ酸およびそれを有効成分として含有する多重共鳴用プローブに関する。 The present invention relates to a multiple resonance probe. More specifically, it contains precursor amino acids of neurotransmitters that are useful for analysis of metabolic reactions related to neurotransmitters, acquisition of image information for diagnosis of diseases involving neurotransmitters, and the like as active ingredients The present invention relates to a multiple resonance probe.
生体内に存在する化合物は、それぞれ固有の核磁気共鳴（以下、「ＮＭＲ」ともいう）シグナルを有していることから、前記ＮＭＲシグナルを利用するＮＭＲ法によれば、生体内における特定の化合物中の核磁気共鳴活性核のＮＭＲシグナルを検出し、当該ＮＭＲシグナルの強度を測定することにより、高い定量性でかつ低い侵襲性で、生体内における前記化合物の変化、すなわち、生体内における前記化合物の代謝反応の過程を追跡することができる。前記ＮＭＲ法は、分子プローブの1Ｈ核または13Ｃ核を対象とする磁気共鳴スペクトロスコピー（ＭＲＳ）、磁気共鳴スペクトロスコピーイメージング（ＭＲＳＩ）などに応用されている。しかし、生体内には、1Ｈ核または13Ｃ核のノイズシグナルを生じる水、脂質などの内在性の化合物が存在しているため、前記ＭＲＳおよびＭＲＳＩには、分子プローブのＮＭＲシグナルに加えて前記ノイズシグナルまでもが同時に検出されることから、分子プローブのＮＭＲシグナルのみを高い選択性で検出することが困難であるという欠点がある。 Since each compound present in the living body has a unique nuclear magnetic resonance (hereinafter also referred to as “NMR”) signal, according to the NMR method using the NMR signal, a specific compound in the living body. By detecting the NMR signal of the nuclear magnetic resonance active nucleus in the medium and measuring the intensity of the NMR signal, the change of the compound in the living body, that is, the compound in the living body with high quantification and low invasiveness The process of metabolic reactions can be tracked. The NMR method is applied to magnetic resonance spectroscopy (MRS), magnetic resonance spectroscopy imaging (MRSI), and the like targeting 1 H or 13 C nuclei of molecular probes. However, since endogenous compounds such as water and lipids that generate 1 H or 13 C nucleus noise signals exist in the living body, the MRS and MRSI include the NMR signal of the molecular probe in addition to the NMR signal of the molecular probe. Since even the noise signal is detected at the same time, there is a drawback that it is difficult to detect only the NMR signal of the molecular probe with high selectivity.
そこで、分子プローブのＮＭＲシグナルのみを高い選択性で検出する手法として、19Ｆ−ＮＭＲ法が開発されている。前記19Ｆ−ＮＭＲ法は、例えば、分子プローブとして19Ｆラベル化Ｌ−ドーパを用いて脳内における当該19Ｆラベル化Ｌ−ドーパを検出する方法などに利用されている（例えば、非特許文献１などを参照）。しかし、前記19Ｆラベル化Ｌ−ドーパは、Ｌ−ドーパの分子内に９個の19Ｆ核が導入された化合物であることから、Ｌ−ドーパ本来の生理学的活性または薬理学的活性を失っており、生体内において、代謝されないため、分子プローブとして19Ｆラベル化Ｌ−ドーパを用いる方法には、生体内における当該分子プローブの代謝反応の過程を追跡することができないという欠点がある。 Therefore, the 19 F-NMR method has been developed as a method for detecting only the NMR signal of the molecular probe with high selectivity. The 19 F-NMR method is used for, for example, a method of detecting the 19 F-labeled L-dopa in the brain using 19 F-labeled L-dopa as a molecular probe (for example, non-patent literature). 1 etc.). However, since the 19 F-labeled L-dopa is a compound in which nine 19 F nuclei are introduced into the L-dopa molecule, it loses its original physiological or pharmacological activity. In addition, since it is not metabolized in vivo, the method using 19 F-labeled L-DOPA as a molecular probe has a drawback that the process of metabolic reaction of the molecular probe in vivo cannot be traced.
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、生体内において、神経伝達物質の前駆体としての生理学的活性または薬理学的活性を示し、高い選択性で検出することができる神経伝達物質の前駆体アミノ酸を提供することを課題とする。また、本発明は、生体内において、神経伝達物質の前駆体としての生理学的活性または薬理学的活性を示し、生体内における代謝反応の過程を追跡することができ、さらに高い選択性で検出することができる多重共鳴用のプローブを提供することを課題とする。 The present invention has been made in view of the above prior art, and exhibits a physiological activity or a pharmacological activity as a precursor of a neurotransmitter in vivo and can be detected with high selectivity. It is an object to provide a precursor amino acid of a substance. In addition, the present invention exhibits physiological or pharmacological activity as a neurotransmitter precursor in vivo, can follow the process of metabolic reaction in vivo, and can detect with higher selectivity. It is an object of the present invention to provide a probe for multiple resonance that can be used.
本発明は、
〔１〕神経伝達物質の前駆体アミノ酸であって、式（Ｉ）：
The present invention
[1] A precursor amino acid of a neurotransmitter having the formula (I):
（式中、Ｒ1は、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基、置換基を有していてもよい炭素数３〜１０の複素環基またはカルボキシル基を示す）
で表わされる神経伝達物質の前駆体アミノ酸、および
〔２〕多重共鳴用のプローブであって、前記〔１〕に記載の神経伝達物質の前駆体アミノ酸を有効成分として含有することを特徴とするプローブ
に関する。
(In the formula, R 1 represents a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, an optionally substituted aryl group having 6 to 12 carbon atoms, or a substituent. An optionally substituted heterocyclic group or carboxyl group having 3 to 10 carbon atoms)
A neurotransmitter precursor amino acid represented by [2], and a probe for multiple resonance, comprising the neurotransmitter precursor amino acid of [1] as an active ingredient About.
本発明の神経伝達物質の前駆体アミノ酸は、生体内において、神経伝達物質の前駆体としての生理学的活性または薬理学的活性を示し、高い選択性で検出することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の多重共鳴用プローブは、生体内において、神経伝達物質の前駆体としての生理学的活性または薬理学的活性を示し、生体内における代謝反応の過程を追跡することができ、さらに高い選択性で検出することができるという優れた効果を奏する。 The neurotransmitter precursor amino acid of the present invention exhibits physiological or pharmacological activity as a neurotransmitter precursor in vivo, and has an excellent effect that it can be detected with high selectivity. . In addition, the multiple resonance probe of the present invention exhibits physiological or pharmacological activity as a precursor of a neurotransmitter in a living body, can follow the process of metabolic reaction in the living body, and is higher. An excellent effect is that detection can be performed with selectivity.
本発明の神経伝達物質の前駆体アミノ酸は、前述したように、式（Ｉ）： As described above, the precursor amino acid of the neurotransmitter of the present invention has the formula (I):
（式中、Ｒ1は、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基、置換基を有していてもよい炭素数３〜１０の複素環基またはカルボキシル基を示す）
で表わされる神経伝達物質の前駆体アミノ酸である。
(In the formula, R 1 represents a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, an optionally substituted aryl group having 6 to 12 carbon atoms, or a substituent. An optionally substituted heterocyclic group or carboxyl group having 3 to 10 carbon atoms)
Is a precursor amino acid of a neurotransmitter represented by
本発明の神経伝達物質の前駆体アミノ酸は、1Ｈ−13Ｃ−15Ｎ結合を有しているので、生体内において、神経伝達物質の前駆体アミノ酸としての生理学的活性または薬理学的活性を示すものであり、しかも高い選択性で検出することができる。 Since the precursor amino acid of the neurotransmitter of the present invention has 1 H- 13 C- 15 N bond, it has physiological or pharmacological activity as a precursor amino acid of the neurotransmitter in vivo. It can be detected with high selectivity.
式（Ｉ）において、Ｒ1は、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基、置換基を有していてもよい炭素数３〜１０の複素環基またはカルボキシル基である。 In Formula (I), R 1 is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, an optionally substituted aryl group having 6 to 12 carbon atoms, or a substituent. It is a C3-C10 heterocyclic group or carboxyl group which may have a group.
前記炭素数１〜４のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記炭素数１〜４のアルキル基が有していてもよい置換基としては、例えば、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、チオール基、メチルチオ基、グアニジル基などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基のなかでは、神経伝達物質の前駆体として高い生理学的活性または薬理学的活性を示すことから、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、ヒドロキシメチル基が好ましく、カルボキシメチル基およびカルボキシエチル基が好ましい。 Examples of the alkyl group having 1 to 4 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, and a butyl group, but the present invention is not limited only to such examples. Examples of the substituent that the alkyl group having 1 to 4 carbon atoms may have include a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, a cyano group, a nitro group, a thiol group, a methylthio group, and a guanidyl group. The present invention is not limited to such examples. Among the alkyl groups having 1 to 4 carbon atoms that may have a substituent, a carboxymethyl group, a carboxyethyl group, and the like exhibit high physiological activity or pharmacological activity as a precursor of a neurotransmitter. , A hydroxymethyl group is preferable, and a carboxymethyl group and a carboxyethyl group are preferable.
前記炭素数６〜１２のアリール基としては、例えば、フェニル基、ベンジル基、ナフチル基、トリル基、キシリル基、インデニル基、ビフェニル基などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記炭素数６〜１２のアリール基が有していてもよい置換基は、前記炭素数１〜４のアルキル基が有していてもよい置換基と同様である。前記置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基のなかでは、神経伝達物質の前駆体として高い生理学的活性または薬理学的活性を示すことから、ヒドロキシベンジル基、ジヒドロキシベンジル基、ベンジル基が好ましく、ヒドロキシベンジル基およびジヒドロキシベンジル基がより好ましい。 Examples of the aryl group having 6 to 12 carbon atoms include a phenyl group, a benzyl group, a naphthyl group, a tolyl group, a xylyl group, an indenyl group, and a biphenyl group, but the present invention is limited to such examples. It is not something. The substituent which the C6-C12 aryl group may have is the same as the substituent which the C1-C4 alkyl group may have. Among the aryl groups having 6 to 12 carbon atoms which may have a substituent, since it exhibits high physiological activity or pharmacological activity as a precursor of neurotransmitter, hydroxybenzyl group, dihydroxybenzyl group , A benzyl group is preferable, and a hydroxybenzyl group and a dihydroxybenzyl group are more preferable.
前記炭素数３〜１０の複素環としては、例えば、インドリル基、イミダゾイル基、チエニル基、ベンゾチエニル基、フリル基、ベンゾフリル基、ピリジル基、キノリル基、２，２’−ビピリジル基などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記複素環基が有していてもよい置換基は、前記炭素数１〜４のアルキル基が有していてもよい置換基と同様である。前記置換基を有していてもよい炭素数３〜１０の複素環基のなかでは、神経伝達物質の前駆体として高い生理学的活性または薬理学的活性を示すことから、インドリル基、ヒドロキシインドリル基、イミダゾイル基が好ましく、ヒドロキシインドリル基およびイミダゾイル基がより好ましい。 Examples of the heterocyclic ring having 3 to 10 carbon atoms include indolyl group, imidazolyl group, thienyl group, benzothienyl group, furyl group, benzofuryl group, pyridyl group, quinolyl group, and 2,2′-bipyridyl group. However, the present invention is not limited to such examples. The substituent that the heterocyclic group may have is the same as the substituent that the alkyl group having 1 to 4 carbon atoms may have. Among the heterocyclic groups having 3 to 10 carbon atoms which may have the above-described substituent, since it exhibits high physiological activity or pharmacological activity as a precursor of neurotransmitter, indolyl group, hydroxyindolyl group Group, an imidazolyl group is preferable, and a hydroxyindolyl group and an imidazolyl group are more preferable.
Ｒ1のなかでは、神経伝達物質の前駆体として高い生理学的活性または薬理学的活性を示すことから、水素原子、カルボキシル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、ヒドロキシメチル基、ベンジル基、ヒドロキシベンジル基、ジヒドロキシベンジル基、インドリル基、ヒドロキシインドリル基およびイミダゾイル基が好ましく、水素原子、カルボキシル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシベンジル基、ジヒドロキシベンジル基、ヒドロキシインドリル基およびイミダゾイル基がより好ましい。 Among R 1 , since it exhibits high physiological activity or pharmacological activity as a neurotransmitter precursor, it is a hydrogen atom, carboxyl group, carboxymethyl group, carboxyethyl group, hydroxymethyl group, benzyl group, hydroxybenzyl. Group, dihydroxybenzyl group, indolyl group, hydroxyindolyl group and imidazolyl group are preferred, hydrogen atom, carboxyl group, carboxymethyl group, carboxyethyl group, hydroxymethyl group, hydroxybenzyl group, dihydroxybenzyl group, hydroxyindolyl group and An imidazolyl group is more preferred.
前記核磁気共鳴活性核は、放射線を発生しない核磁気共鳴活性な原子核である。前記1Ｈ−13Ｃ−15Ｎ結合は、1Ｈの磁化を13Ｃに移動させ、13Ｃの磁化を15Ｎに移動させ、15Ｎの磁化を13Ｃに戻し、13Ｃの磁化を1Ｈに戻すことによって検出することができる。 The nuclear magnetic resonance active nucleus is a nuclear magnetic resonance active nucleus that does not generate radiation. The 1 H- 13 C-15 N bonds, 1 H magnetization was moved to 13 C, the 13 C magnetization was moved to 15 N, and returns the magnetization of 15 N to 13 C, 1 the magnetization of 13 C It can be detected by returning to H.
式（Ｉ）で表わされる前駆体アミノ酸の具体例としては、例えば、式（ＩＩ）： Specific examples of the precursor amino acid represented by the formula (I) include, for example, the formula (II):
で表わされるＬ−ドーパ、式（ＩＩＩ）： L-dopa represented by formula (III):
で表わされるグルタミン酸、式（ＩＶ）： A glutamic acid represented by formula (IV):
で表わされるグリシン、式（Ｖ）： Glycine represented by formula (V):
で表わされるＬ−セリン、式（ＶＩ）： L-serine represented by formula (VI):
で表わされるチロシン、式（ＶＩＩ）： Tyrosine represented by formula (VII):
で表わされるヒスチジン、式（ＶＩＩＩ）： A histidine represented by formula (VIII):
で表わされる５−ヒドロキシトリプトファンなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。 Although the 5-hydroxytryptophan represented by these etc. are mentioned, this invention is not limited only to this illustration.
式（ＩＩ）で表わされるＬ−ドーパは、脱炭酸酵素などの作用によって生体内で代謝され、神経伝達物質（代謝産物）としての式（ＩＩａ）： L-dopa represented by the formula (II) is metabolized in vivo by the action of decarboxylase and the like, and the formula (IIa) as a neurotransmitter (metabolite):
で表わされるドーパミン、式（ＩＩｂ）： A dopamine represented by formula (IIb):
で表わされるノルエピネフィリンまたは式（ＩＩｃ）： Or norepinephrine represented by the formula (IIc):
で表わされるエピネフィリンに変換されるという生理学的活性または薬理学的活性を有する。式（ＩＩＩ）で表わされるグルタミン酸は、脱炭酸酵素の作用によって生体内で代謝され、神経伝達物質（代謝産物）としての式（ＩＩＩａ）： It has the physiological activity or pharmacological activity of being converted into epinephrine represented by Glutamic acid represented by formula (III) is metabolized in vivo by the action of decarboxylase, and formula (IIIa) as a neurotransmitter (metabolite):
で表わされるγ−アミノ酪酸に変換されるという生理学的活性または薬理学的活性を有する。 It has a physiological activity or a pharmacological activity of being converted to γ-aminobutyric acid represented by
式（ＩＶ）で表わされるグリシンおよび式（Ｖ）で表わされるＬ−セリンは、それぞれ、ヒトの体内で代謝されることにより、神経伝達物質（代謝産物）としての式（Ｖａ）： The glycine represented by the formula (IV) and the L-serine represented by the formula (V) are each metabolized in the human body, whereby the formula (Va) as a neurotransmitter (metabolite):
で表わされるＤ−セリンに変換されるという生理学的活性または薬理学的活性を有する。なお、式（ＩＶ）で表わされるグリシンは、生体内において、神経伝達物質の前駆体として働くとともに、神経伝達物質としても働く化合物である。式（ＶＩ）で表わされるチロシンは、脱炭酸酵素の作用によって生体内で代謝されることにより、神経伝達物質（代謝産物）としての式（ＶＩａ）： It has the physiological activity or pharmacological activity of being converted into D-serine represented by the formula: In addition, glycine represented by the formula (IV) is a compound that functions as a neurotransmitter in vivo as a precursor of a neurotransmitter. The tyrosine represented by the formula (VI) is metabolized in vivo by the action of decarboxylase, whereby the formula (VIa) as a neurotransmitter (metabolite):
で表わされるチラミンに変換されるという生理学的活性または薬理学的活性を有する。式（ＶＩＩ）で表わされるヒスチジンは、脱炭酸酵素の作用によって生体内で代謝されることにより、神経伝達物質（代謝産物）としての式（ＶＩＩａ）： It has a physiological activity or a pharmacological activity of being converted into tyramine represented by The histidine represented by the formula (VII) is metabolized in vivo by the action of decarboxylase, whereby the formula (VIIa) as a neurotransmitter (metabolite):
で表わされるヒスタミンに変換されるという生理学的活性または薬理学的活性を有する。式（ＶＩＩＩ）で表わされる５−ヒドロキシトリプトファンは、脱炭酸酵素の作用によって生体内で代謝されることにより、神経伝達物質（代謝産物）としての式（ＶＩＩＩａ）： It has the physiological activity or pharmacological activity of being converted to histamine represented by The 5-hydroxytryptophan represented by the formula (VIII) is metabolized in vivo by the action of decarboxylase, whereby the formula (VIIIa) as a neurotransmitter (metabolite):
で表わされるセロトニンに変換されるという生理学的活性または薬理学的活性を有する。 It has the physiological activity or pharmacological activity of being converted into serotonin represented by
本発明の神経伝達物質の前駆体アミノ酸は、例えば、13Ｃ核および15Ｎ核でラベルしたグリシンを出発物質として用いて当該グリシンのアミノ基に適切な保護基を導入して誘導体を得、得られた誘導体を不斉アルキル化または不斉水素化させ、保護基を除去することなどによって製造することができる。 The precursor amino acid of the neurotransmitter of the present invention can be obtained by, for example, obtaining a derivative by introducing an appropriate protecting group into the amino group of the glycine using glycine labeled with 13 C nucleus and 15 N nucleus as a starting material. The obtained derivative can be produced by asymmetric alkylation or asymmetric hydrogenation to remove a protecting group.
本発明の神経伝達物質の前駆体アミノ酸は、前述したように、生体内において、神経伝達物質の前駆体アミノ酸としての生理学的活性または薬理学的活性を示すものであり、しかも高い選択性で検出することができることから、多重共鳴用のプローブの有効成分として用いることができる。本発明には、前記神経伝達物質の前駆体アミノ酸を有効成分として含有する多重共鳴用のプローブも包含される。 As described above, the precursor amino acid of the neurotransmitter of the present invention exhibits physiological or pharmacological activity as a precursor amino acid of the neurotransmitter in vivo and is detected with high selectivity. Therefore, it can be used as an active ingredient of a probe for multiple resonance. The present invention also includes a probe for multiple resonance containing the precursor amino acid of the neurotransmitter as an active ingredient.
本発明の多重共鳴用のプローブは、式（Ｉ）で表わされ、1Ｈ、13Ｃおよび15Ｎからなる群より選ばれた少なくとも２種類の核磁気共鳴活性核を有し、かつ異なる共鳴周波数を有する少なくとも３個の核磁気共鳴活性核からなる結合を有している前駆体アミノ酸を有効成分として含有しているため、生体内において、神経伝達物質の前駆体としての生理学的活性または薬理学的活性を示し、しかも高い選択性で検出することができる。また、本発明の多重共鳴用のプローブに含まれる神経伝達物質の前駆体アミノ酸から代謝反応によって生成された神経伝達物質は、前記神経伝達物質の前駆体アミノ酸と区別しながら同時に検出することができる。したがって、本発明の多重共鳴用のプローブによれば、本発明の多重共鳴用のプローブを用いて多重共鳴ＮＭＲ法、多核多重磁気共鳴画像化方法などを行なうことにより、生体内における代謝反応の過程を追跡することができる。 The probe for multiple resonance according to the present invention has at least two kinds of nuclear magnetic resonance active nuclei selected from the group consisting of 1 H, 13 C and 15 N represented by the formula (I), and different resonances. Physiological activity or drug as a precursor of neurotransmitter in vivo because it contains a precursor amino acid having a bond consisting of at least three nuclear magnetic resonance active nuclei having a frequency as an active ingredient It shows physical activity and can be detected with high selectivity. Further, a neurotransmitter produced by a metabolic reaction from a precursor amino acid of a neurotransmitter contained in the probe for multiple resonance of the present invention can be detected simultaneously while being distinguished from the precursor amino acid of the neurotransmitter. . Therefore, according to the multiple resonance probe of the present invention, the multiple resonance NMR method, the multinuclear multiple magnetic resonance imaging method and the like are performed using the multiple resonance probe of the present invention, so that the metabolic reaction process in vivo is performed. Can be tracked.
本発明の多重共鳴用のプローブにおける前記神経伝達物質の前駆体アミノ酸の含有量は、前記神経伝達物質の前駆体アミノ酸の種類、多重共鳴用のプローブの用途などによって異なることから、一概には決定することができないので、前記神経伝達物質の前駆体アミノ酸の種類、多重共鳴用のプローブの用途などに応じて適宜決定することが望ましい。本発明の多重共鳴用のプローブにおける前記神経伝達物質の前駆体アミノ酸の含有量は、通常、生体内において、神経伝達物質の前駆体としての生理学的活性または薬理学的活性を示す範囲であればよく、神経伝達物質の前駆体アミノ酸から代謝反応によって生成された神経伝達物質の生理学的活性を十分に発揮させる観点から、好ましくは１μｍｏｌ以上、より好ましくは１０μｍｏｌ以上である。なお、本発明の多重共鳴用のプローブは、前記神経伝達物質の前駆体アミノ酸のみからなるものであってもよい。 Since the content of the precursor amino acid of the neurotransmitter in the probe for multiple resonance of the present invention varies depending on the type of precursor amino acid of the neurotransmitter, the use of the probe for multiple resonance, etc., it is generally determined. Therefore, it is desirable to determine appropriately according to the type of precursor amino acid of the neurotransmitter, the use of the probe for multiple resonance, and the like. The content of the precursor amino acid of the neurotransmitter in the probe for multiple resonance of the present invention is usually within the range showing physiological activity or pharmacological activity as a neurotransmitter precursor in vivo. Often, the amount is preferably 1 μmol or more, more preferably 10 μmol or more, from the viewpoint of sufficiently exerting the physiological activity of the neurotransmitter generated by the metabolic reaction from the precursor amino acid of the neurotransmitter. The multiple resonance probe of the present invention may be composed of only the precursor amino acid of the neurotransmitter.
本発明の多重共鳴用のプローブは、必要により、当該プローブを用いる部位以外の部位での分解、修飾などによる失活を抑制するための阻害剤、安定化剤、溶解補助剤、薬物運搬体などの助剤を含有していてもよい。 The probe for multiple resonance of the present invention includes an inhibitor, a stabilizer, a solubilizing agent, a drug carrier, etc. for suppressing inactivation due to decomposition, modification, etc. at a site other than the site where the probe is used, if necessary. The auxiliary may be contained.
本発明の多重共鳴用のプローブは、生体内において、神経伝達物質の前駆体としての生理学的活性または薬理学的活性を示し、体内における代謝反応の過程を追跡することができ、さらに高い選択性で検出することができることから、多重共鳴ＮＭＲ法、多核多重磁気共鳴画像化方法などに用いることができる。 The probe for multiple resonance of the present invention exhibits physiological activity or pharmacological activity as a precursor of a neurotransmitter in a living body, can follow a metabolic reaction process in the body, and has higher selectivity. Can be used for multiple resonance NMR method, multinuclear multiple magnetic resonance imaging method and the like.
本発明の多重共鳴用のプローブを多重共鳴ＮＭＲ法に用いる場合、当該多重共鳴ＮＭＲ法は、例えば、本発明の多重共鳴用のプローブを用いて代謝反応を行なうことによって得られた反応生成物または本発明の多重共鳴用のプローブからＮＭＲ測定用試料を調製し、当該ＮＭＲ測定用試料の多重共鳴ＮＭＲスペクトルを測定することによって実施することができる。 When the multiple resonance probe of the present invention is used for the multiple resonance NMR method, the multiple resonance NMR method is, for example, a reaction product obtained by performing a metabolic reaction using the multiple resonance probe of the present invention or An NMR measurement sample can be prepared from the multiple resonance probe of the present invention, and the multiple resonance NMR spectrum of the NMR measurement sample can be measured.
本発明の多重共鳴用のプローブを多重磁気共鳴画像化方法に用いる場合、当該多重磁気共鳴画像化方法は、例えば、本発明の多重共鳴用のプローブを検体に付与した後、前記検体に電磁波を照射して前記プローブの前記結合中の各核の間での磁化移動を行ない、当該磁化移動を利用して前記プローブに起因する多重共鳴シグナルを検出し、画像化することによって実施することができる。 When the multiple resonance probe of the present invention is used in a multiple magnetic resonance imaging method, the multiple magnetic resonance imaging method includes, for example, applying the multiple resonance probe of the present invention to a specimen, and then applying an electromagnetic wave to the specimen. It can be carried out by irradiating, performing a magnetization transfer between each of the nuclei in the binding of the probe, and detecting and imaging multiple resonance signals due to the probe using the magnetization transfer .
検体への前記多重共鳴用のプローブの付与は、例えば、皮下注射、経口投与、経皮投与、静脈投与、腹腔内投与などによって行なうことができるが、本発明は、かかる例示に限定されるものではない。 The application of the probe for multiple resonance to a specimen can be performed by, for example, subcutaneous injection, oral administration, transdermal administration, intravenous administration, intraperitoneal administration, etc., but the present invention is limited to such illustrations. is not.
前記多重共鳴用のプローブを検体に付与する際には、当該多重共鳴用のプローブを分散媒に溶解させて用いることができる。前記分散媒は、プローブを溶解させるための液状の物質であればよく、例えば、生理食塩水、注射用蒸留水、リン酸緩衝水溶液（ＰＢＳ）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、前記多重共鳴用のプローブは、分散媒の他に、必要に応じて薬理上許容できる添加物とともに用いてもよい。 When the multiple resonance probe is applied to the specimen, the multiple resonance probe can be dissolved in a dispersion medium. The dispersion medium may be a liquid substance for dissolving the probe, and examples thereof include physiological saline, distilled water for injection, and phosphate buffered aqueous solution (PBS), but the present invention is only such examples. It is not limited to. In addition to the dispersion medium, the probe for multiple resonance may be used together with a pharmacologically acceptable additive as necessary.
電磁波の照射に際しては、1Ｈ−13Ｃ−15Ｎ結合に基づく1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝三重核磁気共鳴法のパルス系列と磁気共鳴撮像法のパルス系列とを用いることができる。前記磁気共鳴撮像法のパルス系列は、例えば、プローブに含まれる磁気共鳴活性核の縦緩和時間（Ｔ１）、横緩和時間（Ｔ２）などに基づいて適宜設定することができる。前記磁気共鳴撮像法のパルス系列としては、例えば、スピンエコー法、高速スピンエコー法、エコープラナーイメージング法、グラジエントエコー法、スポイルドグラジエントエコー法、コヒーレントグラジエントエコー法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。 Upon irradiation with electromagnetic waves, a pulse sequence of 1 H- { 13 C- 15 N} triple nuclear magnetic resonance method based on 1 H- 13 C- 15 N bond and a pulse sequence of magnetic resonance imaging method can be used. The pulse sequence of the magnetic resonance imaging method can be appropriately set based on, for example, the longitudinal relaxation time (T1) and transverse relaxation time (T2) of the magnetic resonance active nucleus included in the probe. Examples of the pulse sequence of the magnetic resonance imaging method include a spin echo method, a high-speed spin echo method, an echo planar imaging method, a gradient echo method, a spoiled gradient echo method, and a coherent gradient echo method. However, the present invention is not limited to such examples.
電磁波を照射して前記プローブの前記結合中の各核の間での磁化移動を行なうことによって、前記プローブの前記結合中の各核磁気共鳴活性核に由来する多重共鳴シグナルの出現、消失、強度変化などに基づき、プローブの位置、存在量、構造などの情報を得、かかる情報に基づき画像を構築することができる。 Appearance, disappearance, and intensity of multiple resonance signals derived from each nuclear magnetic resonance active nucleus in the binding of the probe by irradiating electromagnetic waves and performing magnetization transfer between the nuclei in the binding of the probe Information such as the position, abundance, and structure of the probe can be obtained based on the change and an image can be constructed based on the information.
以上説明したように、本発明の神経伝達物質の前駆体アミノ酸および当該神経伝達物質の前駆体アミノ酸を有効成分として含有する本発明の多重共鳴用プローブによれば、生体内において、神経伝達物質の前駆体としての生理学的活性または薬理学的活性を示し、しかも高い選択性で検出することができる。また、本発明の多重共鳴用のプローブに含まれる神経伝達物質の前駆体アミノ酸から代謝反応によって生成された神経伝達物質は、当該前駆体アミノ酸の核磁気共鳴活性核に帰属される多重共鳴ＮＭＲスペクトルとは異なる多重共鳴ＮＭＲスペクトルを示すことから、前記神経伝達物質の前駆体アミノ酸と区別しながら同時に検出することができる。そのため、本発明の多重共鳴用のプローブによれば、生体内における代謝反応の過程を追跡することができる。したがって、本発明の神経伝達物質の前駆体アミノ酸および当該神経伝達物質の前駆体アミノ酸を有効成分として含有する本発明の多重共鳴用プローブは、神経伝達物質に関連する代謝反応の解析、神経伝達物質が関与する疾患の診断を行なうための画像情報の取得などに好適に用いることが期待されるものである。 As described above, according to the multiple resonance probe of the present invention containing the precursor amino acid of the neurotransmitter of the present invention and the precursor amino acid of the neurotransmitter as an active ingredient, It exhibits physiological or pharmacological activity as a precursor and can be detected with high selectivity. In addition, the neurotransmitter generated by metabolic reaction from the precursor amino acid of the neurotransmitter contained in the probe for multiple resonance of the present invention is a multiple resonance NMR spectrum belonging to the nuclear magnetic resonance active nucleus of the precursor amino acid. Since a multiple resonance NMR spectrum different from is shown, it can be detected simultaneously while being distinguished from the precursor amino acid of the neurotransmitter. Therefore, according to the probe for multiple resonance of the present invention, the process of metabolic reaction in the living body can be traced. Therefore, the precursor amino acid of the neurotransmitter of the present invention and the probe for multiple resonance of the present invention containing the precursor amino acid of the neurotransmitter as an active ingredient are used for analysis of metabolic reactions related to the neurotransmitter, neurotransmitter Therefore, it is expected to be suitably used for obtaining image information for diagnosing a disease related to the disease.
実施例１
以下に示される化合物１（13Ｃ−15Ｎ−ラベル化グリシン）を出発物質として用い、式：
Example 1
（式中、ＣｂｚＣｌは塩化ベンジルオキシカルボニル、Ｃｂｚはベンジルオキシカルボニル基、ＴＥＢＡＣは塩化ベンジルトリエチルアンモニウム、ｔ−ＢｕＢｒは２−ブロモ−２−メチルプロパン、ＤＭＡはＮ,Ｎ−ジメチルアセトアミド、ｔ−ＢｕＯはｔｅｒｔ−ブチルオキシ基、Ｐｄ／Ｃはパラジウム／炭素、ＥｔＯＨはエタノール、Ｐｈ2Ｃ＝ＮＨはベンゾフェノンイミン、Ｐｈはフェニル基、ＢｎＯはベンジルオキシ基、Ｔｏｌｕｅｎｅはトルエン、ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄはクエン酸、ＴＨＦはテトラヒドロフラン、Ｅｔ3ＳｉＨはトリエチルシランを示す）
で表わされる反応にしたがって、化合物８（13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパ）を調製した。より具体的には、以下の操作を行なうことにより、化合物１（13Ｃ−15Ｎラベル化グリシン）から化合物８（13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパ）を調製した。
(Where CbzCl is benzyloxycarbonyl chloride, Cbz is benzyloxycarbonyl group, TEBAC is benzyltriethylammonium chloride, t-BuBr is 2-bromo-2-methylpropane, DMA is N, N-dimethylacetamide, t-BuO is tert- butyloxy group, Pd / C is palladium / carbon, EtOH is ethanol, Ph 2 C = NH benzophenone imine, Ph is a phenyl group, BnO is benzyloxy, BY tOLUENE toluene, citric acid is citric acid, THF is Tetrahydrofuran, Et 3 SiH represents triethylsilane)
Compound 8 ( 13 C / 15 N-labeled L-dopa) was prepared according to the reaction represented by: More specifically, compound 8 ( 13 C / 15 N-labeled L-dopa) was prepared from compound 1 ( 13 C- 15 N-labeled glycine) by performing the following operations.
（１）前記式における化合物２の調製
２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液６．８ｍＬに２−13Ｃ−15Ｎグリシン（１．０４ｇ，１３．５ｍｍｏｌ）を加えて溶解させた後、得られた溶液を０℃に冷却した。前記で得られた溶液に塩化ベンジルオキシカルボニル２．３ｍＬ（１６．２ｍｍｏｌ）を加えた後、当該溶液に４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（３．４ｍＬ）をゆっくりと滴下し、０℃で２０時間撹拌した。前記で得られた溶液をジエチルエーテルで３回洗浄し、水層を分取した。得られた水層に５Ｍ塩酸を加えて当該水層のｐＨを１に調製した後、得られた懸濁液を０℃に冷却し、白色沈殿物を生成させた。前記白色沈殿物を濾別し、減圧下に乾燥させることにより、化合物２〔収量：２．５１ｇ（１１．８９ｍｍｏｌ）、収率：８８％〕を得た。
(1) the 2-13 C-15 in the preparation 2M aqueous sodium hydroxide 6.8mL of
なお、生成した化合物が前記式における化合物２であることは、以下の1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲ、15Ｎ｛1Ｈ｝−ＮＭＲおよびＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって確認された。
In addition, it was confirmed by the following 1 H-NMR, 13 C { 1 H} -NMR, 15 N { 1 H} -NMR and ESI-TOF-MS that the generated compound was
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ: 7.37-7.32 (5H), 5.28 (d, JCH= 93 Hz, 1H), 5.14 (2H), 4.05 (dd, J = 138 Hz, 5.4 Hz, 2H)
13C{1H}-NMR (CDCl3, 75 MHz) δ: 42.4 (d, 1JCN= 14 Hz)
15N{1H}-NMR (CD3OD, 40 MHz) δ: 71.4 (d, 1JCN= 14 Hz)
ESI-TOF-MS [M + Na]+: 234.0484.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz) δ: 7.37-7.32 (5H), 5.28 (d, J CH = 93 Hz, 1H), 5.14 (2H), 4.05 (dd, J = 138 Hz, 5.4 Hz, 2H)
13 C { 1 H} -NMR (CDCl 3 , 75 MHz) δ: 42.4 (d, 1 J CN = 14 Hz)
15 N { 1 H} -NMR (CD 3 OD, 40 MHz) δ: 71.4 (d, 1 J CN = 14 Hz)
ESI-TOF-MS [M + Na] + : 234.0484.
（２）前記式における化合物３の調製
前記で得られた化合物２（２．２６ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（７５ｍＬ）に加えて溶解させた。得られた溶液に、塩化ベンジルトリエチルアンモニウム２．４４ｇ（１０．７ｍｍｏｌ）と２−ブロモ−２−メチルプロパン６７．１ｇ（４９０ｍｍｏｌ）とを加えた後、あらかじめ乾燥させておいた炭酸カリウム３６ｇ（２６０ｍｍｏｌ）を加え、５５℃で２４時間加熱しながら撹拌した。得られた溶液に超純水（１Ｌ）と酢酸エチル（２５０ｍＬ）とを加えて抽出を行ない、有機層を分取した。得られた有機層を超純水（１００ｍＬ）で２回洗浄し、さらに飽和塩化ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）で洗浄した。洗浄後に得られた溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した後、エバポレーターで溶媒を留去し、減圧下に乾燥させることにより、オイル状の化合物３〔収量：２．７３ｇ（９．９９ｍｍｏｌ）、収率９３％〕を得た。
(2) Preparation of
なお、生成した化合物が前記式における化合物３であることは、以下の1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲ、15Ｎ｛1Ｈ｝−ＮＭＲおよびＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって確認された。
In addition, it was confirmed by the following 1 H-NMR, 13 C { 1 H} -NMR, 15 N { 1 H} -NMR and ESI-TOF-MS that the generated compound was
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.38-7.27 (5H), 5.21 (d, JCH = 88 Hz, 1H, 15NH), 5.12 (s, 2H), 3.87 (dd, J = 140, 3.9 Hz, 2H), 1.47 (s, 9H)
13C{1H}-NMR (CDCl3, 75 MHz) δ: 43.4 (d, JCN = 14 Hz)
15N{1H}-NMR (CDCl3, 40 MHz) δ: 68.8 (d, JCN = 14 Hz)
ESI-TOF MS [M + Na]+: 290.1355.
1 H-NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ: 7.38-7.27 (5H), 5.21 (d, J CH = 88 Hz, 1H, 15 NH), 5.12 (s, 2H), 3.87 (dd, J = 140 , 3.9 Hz, 2H), 1.47 (s, 9H)
13 C { 1 H} -NMR (CDCl 3 , 75 MHz) δ: 43.4 (d, J CN = 14 Hz)
15 N { 1 H} -NMR (CDCl 3 , 40 MHz) δ: 68.8 (d, J CN = 14 Hz)
ESI-TOF MS [M + Na] + : 290.1355.
（３）前記式における化合物４の調製
前記で得られた化合物３（２．６７ｇ、９．９９ｍｍｏｌ）を、アルゴンガス雰囲気下でエタノール２０ｍＬに溶解させた後、得られた溶液に５％（パラジウム基準）パラジウム炭素（Ｐｄ／Ｃ）（３００ｍｇ）を加え、アルゴンガスを０℃で水素に置換し、室温で５．５時間激しく撹拌した。その後、得られた反応液を珪藻土濾過助剤〔アルファ・エイサー（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）社製、商品名：Ｆｉｌｔｅｒ ａｉｄ、Ｃｅｌｉｔｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｕｐｅｒ−ｃｅｌ〕で濾過して当該反応液に含まれるパラジウム炭素を除去し、得られた濾液をエバポレーターで濃縮した。得られた残渣に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と酢酸エチルとを加えて抽出を行ない、有機層を分取した。得られた有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水し、エバポレーターで濃縮した後、減圧下に乾燥させることにより、化合物４〔収量：０．９２ｇ（６．９２ｍｍｏｌ）、収率：６９％〕を得た。
(3) Preparation of
なお、生成した化合物が前記式における化合物４であることは、以下の1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲ、15Ｎ｛1Ｈ｝−ＮＭＲおよびＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって確認された。
In addition, it was confirmed by the following 1 H-NMR, 13 C { 1 H} -NMR, 15 N { 1 H} -NMR and ESI-TOF-MS that the produced compound was the
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ: 3.31 (d, J = 136 Hz, 2H), 1.47 (s, 9H)
13C{1H}-NMR (CDCl3, 75 MHz) δ: 44.7 (d, JCN = 4.5 Hz)
15N{1H}-NMR (CDCl3, 40 MHz) δ = 7.4 (d, JCN = 4.5 Hz)
ESI-TOF MS [M + H]+ 134.1025.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz) δ: 3.31 (d, J = 136 Hz, 2H), 1.47 (s, 9H)
13 C { 1 H} -NMR (CDCl 3 , 75 MHz) δ: 44.7 (d, J CN = 4.5 Hz)
15 N { 1 H} -NMR (CDCl 3 , 40 MHz) δ = 7.4 (d, J CN = 4.5 Hz)
ESI-TOF MS [M + H] + 134.1025.
（４）前記式における化合物５の調製
前記で得られた化合物４（０．９２ｇ、６．９２ｍｍｏｌ）を塩化メチレン溶液（２０．４ｍＬ）に溶解させた後、得られた溶液にベンゾフェノンイミン１．２６ｇ（６．９８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２４時間撹拌し、沈殿物を生成させた。生成した沈殿物を濾過して除去した後、得られた濾液をエバポレーターで濃縮した。得られた残渣にジエチルエーテル３０ｍＬを加えた後、生成した不溶物を濾過して除去した。得られた濾液を超純水３０ｍＬで洗浄した後、得られた溶液からエバポレーターで溶媒を減圧下に除去した。得られた固体をエタノールで再結晶させることにより、化合物５〔収量：１．７３ｇ（５．
８２ｍｍｏｌ）、収率：８４％〕を得た。
(4) Preparation of
82 mmol), yield: 84%].
なお、生成した化合物が前記式における化合物５であることは、以下の1Ｈ−ＮＭＲおよびＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって確認された。
In addition, it was confirmed by the following 1 H-NMR and ESI-TOF-MS that the produced compound was the
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ: 7.68-7.16 (10H), 4.11 (d, J = 136 Hz, 2H), 1.46 (s, 9H)
ESI-TOF MS [M + H]+ 298.1497.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz) δ: 7.68-7.16 (10H), 4.11 (d, J = 136 Hz, 2H), 1.46 (s, 9H)
ESI-TOF MS [M + H] + 298.1497.
（５）前記式における化合物６の調製
前記で得られた化合物５（０．４５０ｇ、１．５３ｍｍｏｌ）をトルエン溶液（９ｍＬ）に溶解させた後、得られた溶液に（Ｒ，Ｒ）−３，４，５−トリフルオロフェニル−ＮＡＳ＝ブロミド１４ｍｇ（１．０ｍｏｌ％）と５０質量％水酸化カリウム水溶液３ｍＬとを加え、溶液を０℃に冷却した。得られた溶液に、４−ブロモメチル−１，２−ビスフェニルメトキシベンゼン（０．７１１ｇ、１．８６ｍｍｏｌ）を加え、０℃で３時間撹拌した。得られた反応液に超純水とジエチルエーテルとを加えて抽出を行ない、有機層を分取した。得られた有機層をエバポレーターで濃縮した後、得られた残渣にテトラヒドロフラン（１５ｍＬ）と１Ｍクエン酸水溶液（１５ｍＬ）とを加え、室温で１６時間撹拌した。
得られた反応液からテトラヒドロフランを減圧下に留去し、炭酸水素ナトリウム水溶液で中和（ｐＨ７）した。得られた溶液に塩化メチレンを加えて抽出を行ない、有機層を得た。得られた有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水した後、エバポレーターで濃縮した。得られた濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー〔酢酸エチル／ヘキサン（体積比）＝６／４〕で精製することにより、オイル状の化合物６〔収量：０．３３９ｇ（０．７７９ｍｍｏｌ）、収率：５１％、光学純度：９５％ｅｅ〕を得た。
(5) Preparation of
Tetrahydrofuran was distilled off from the resulting reaction solution under reduced pressure, and neutralized with an aqueous sodium hydrogen carbonate solution (pH 7). Extraction was performed by adding methylene chloride to the obtained solution to obtain an organic layer. The obtained organic layer was dehydrated with anhydrous magnesium sulfate and then concentrated with an evaporator. The obtained concentrate was purified by silica gel column chromatography [ethyl acetate / hexane (volume ratio) = 6/4] to give oily compound 6 [yield: 0.339 g (0.779 mmol), yield: 51%, optical purity: 95% ee].
なお、生成した化合物が前記式における化合物６であることは、以下の1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲ、15Ｎ｛1Ｈ｝−ＮＭＲ、ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳおよび高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって確認された。ＨＰＬＣは、分析カラム〔（株）ダイセル製、商品名：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＤ〕および展開用溶媒〔ヘキサン／２−プロパノール（体積比）＝４／１〕を用い、流速０．５ｍＬ／分の条件で行なった。
Note that compounds generated is a
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ: 7.46-7.27 (10H), 6.87 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.72 (dd, J = 8.0, 2.0 Hz, 1H), 5.13 (s, 4H) 3.52 (d, J = 140 Hz, 1H), 2.93 (m, 1H), 2.72 (m、1H), 1.47 (br, 2H), 1.42 (s, 9H)
13C{1H}-NMR (CDCl3, 75 MHz) δ: 56.3 (d, JCN = 4.3 Hz)
15N{1H}-NMR (CDCl3, 40 MHz) δ: 21.9 (d, JCN = 4.3 Hz)
ESI-TOF MS [M + H]+ 436.2179.
HPLC retention time: 15.9 min (S), 18.0 min (R).
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz) δ: 7.46-7.27 (10H), 6.87 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.72 (dd, J = 8.0, 2.0 Hz, 1H), 5.13 (s, 4H) 3.52 (d, J = 140 Hz, 1H), 2.93 (m, 1H), 2.72 (m, 1H), 1.47 (br, 2H), 1.42 (s , 9H)
13 C { 1 H} -NMR (CDCl 3 , 75 MHz) δ: 56.3 (d, J CN = 4.3 Hz)
15 N { 1 H} -NMR (CDCl 3 , 40 MHz) δ: 21.9 (d, J CN = 4.3 Hz)
ESI-TOF MS [M + H] + 436.2179.
HPLC retention time: 15.9 min (S), 18.0 min (R).
（６）前記式における化合物７の調製
前記で得られた化合物６（０．３３９ｇ、０．７７９ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン溶液（８ｍＬ）に加えて溶解させた。得られた溶液に、アルゴンガス雰囲気下に０℃で１０（パラジウム基準）パラジウム炭素（４０ｍｇ）を加えた。さらに、アルゴンガスを０℃で水素に置換し、５０℃で４時間加熱しながら撹拌した。得られた反応液を珪藻土濾過助剤〔アルファ・エイサー（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）社製、商品名：Ｆｉｌｔｅｒ ａｉｄ、Ｃｅｌｉｔｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｕｐｅｒ−ｃｅｌ〕で濾過して当該反応液に含まれるパラジウム炭素を除去し、得られた濾液をエバポレーターで濃縮した。得られた濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル）で精製することにより、化合物７〔収量：７５．４ｍｇ（０．２９９ｍｍｏｌ）、収率：３８％〕を得た。
(6) Preparation of Compound 7 in the Formula The compound 6 (0.339 g, 0.779 mmol) obtained above was added to a tetrahydrofuran solution (8 mL) and dissolved. To the resulting solution, 10 (palladium basis) palladium on carbon (40 mg) was added at 0 ° C. under an argon gas atmosphere. Further, the argon gas was replaced with hydrogen at 0 ° C., and the mixture was stirred while heating at 50 ° C. for 4 hours. The obtained reaction solution was filtered through a diatomaceous earth filter aid (manufactured by Alfa Aesar, trade name: Filter aid, Celite Standard Super-cel) to remove palladium carbon contained in the reaction solution. The obtained filtrate was concentrated with an evaporator. The obtained concentrate was purified by silica gel column chromatography (ethyl acetate) to obtain Compound 7 [Yield: 75.4 mg (0.299 mmol), Yield: 38%].
なお、生成した化合物が前記式における化合物７であることは、以下の1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲ、15Ｎ｛1Ｈ｝−ＮＭＲおよびＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって確認された。 In addition, it was confirmed by the following 1 H-NMR, 13 C { 1 H} -NMR, 15 N { 1 H} -NMR and ESI-TOF-MS that the generated compound was the compound 7 in the above formula. .
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ: 6.68 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.60 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.48 (dd, J = 8.1, 1.8 Hz, 1H), 5.21 (br, 4H), 3.52 (d, J = 141 Hz, 1H), 2.93 (m, 1H), 2.67 (m, 1H), 1.44 (s, 9H)
13C{1H}-NMR (CDCl3, 75 MHz) δ: 55.4 (d, JCN = 4.5 Hz)
15N{1H}-NMR (CDCl3, 40 MHz) δ: 26.2 (d, JCN = 4.5 Hz)
ESI-TOF-MS [M + H]+ 256.1319.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz) δ: 6.68 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.60 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.48 (dd, J = 8.1, 1.8 Hz, 1H) , 5.21 (br, 4H), 3.52 (d, J = 141 Hz, 1H), 2.93 (m, 1H), 2.67 (m, 1H), 1.44 (s, 9H)
13 C { 1 H} -NMR (CDCl 3 , 75 MHz) δ: 55.4 (d, J CN = 4.5 Hz)
15 N { 1 H} -NMR (CDCl 3 , 40 MHz) δ: 26.2 (d, J CN = 4.5 Hz)
ESI-TOF-MS [M + H] + 256.1319.
（７）前記式における化合物８の調製
前記で得られた化合物７（７５．４ｍｇ、０．２９９ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（０．８２ｍＬ）に加えて溶解させた。得られた溶液に、アルゴンガス雰囲気下にトリフルオロ酢酸（０．３９ｍＬ、５．３ｍｍｏｌ）とトリエチルシラン（０．１６ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）とを加え、室温で１９時間撹拌した。得られた反応液をエバポレーターで濃縮した。得られた濃縮物をジエチルエーテルで洗浄した後、当該濃縮物をろ過して溶媒を除去した。得られた固体を混合溶媒（水／２−プロパノール（体積比）＝６／４）で再結晶させることにより、化合物８（収量：２５．３ｍｇ（０．１２７ｍｍｏｌ）、収率：４２％、光学純度：９４％ｅｅ）を得た。
(7) Preparation of
なお、生成した化合物が前記式における化合物８（13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパ）であることは、以下の1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲ、15Ｎ｛1Ｈ｝−ＮＭＲ、ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳおよびＨＰＬＣによって確認された。ＨＰＬＣは、分析カラム〔（株）ダイセル製、商品名：ＣＲＯＷＮＰＡＫ ＣＲ（＋）〕および展開用溶媒〔過塩素酸水溶液（ｐＨ２）〕を用い、流速０．５ｍＬ／分の条件で行なった。 Note that compounds generated is a compound 8 (13 C / 15 N- labeled L- dopa) in the above formula, the following 1 H-NMR, 13 C { 1 H} -NMR, 15 N {1 H } -NMR, ESI-TOF-MS and HPLC confirmed. HPLC was performed using an analytical column [manufactured by Daicel Corporation, trade name: CROWNPAK CR (+)] and a developing solvent [perchloric acid aqueous solution (pH 2)] at a flow rate of 0.5 mL / min.
1H-NMR (D2O, 300 MHz) δ: 6.75 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.67 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 6.59 (dd, J = 8.1, 0.9 Hz, 1H), 3.77 (d, 1JCH = 141 Hz 1H), 3.00 (m, 1H), 2.85 (m, 1H)
13C{1H}-NMR (D2O, 75 MHz) δ: 54.9 (d, JCN = 5.9 Hz)
15N{1H}-NMR (D2O, 40 MHz) δ: 33.6 (d, JCN = 5.9 Hz)
ESI-TOF MS [M + H]+ 200.0707.
HPLC retention time: 5.7 min (R, d-dopa) and 6.6 min (S, l-dopa).
1 H-NMR (D 2 O, 300 MHz) δ: 6.75 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.67 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 6.59 (dd, J = 8.1, 0.9 Hz, 1H ), 3.77 (d, 1 J CH = 141 Hz 1H), 3.00 (m, 1H), 2.85 (m, 1H)
13 C { 1 H} -NMR (D 2 O, 75 MHz) δ: 54.9 (d, J CN = 5.9 Hz)
15 N { 1 H} -NMR (D 2 O, 40 MHz) δ: 33.6 (d, J CN = 5.9 Hz)
ESI-TOF MS [M + H] + 200.0707.
HPLC retention time: 5.7 min (R, d-dopa) and 6.6 min (S, l-dopa).
製造例１
以下に示される化合物９（４−ブロモメチル−１，２−ビスフェニルメトキシベンゼン）を出発物質として用い、式：
Production Example 1
Compound 9 (4-bromomethyl-1,2-bisphenylmethoxybenzene) shown below is used as a starting material and has the formula:
（式中、ＢｎＯはベンジルオキシ基、ＮＭＰはＮ−メチル−２−ピロリドン、Ｐｄ（ＯＨ）2／Ｃは水酸化パラジウム／炭素、ＥｔＯＨはエタノールを示す）
で表わされる反応にしたがって、化合物１１（13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミン塩酸塩）を調製した。より具体的には、以下の操作を行なうことにより、化合物９（４−ブロモメチル−１，２−ビスフェニルメトキシベンゼン）から化合物１１（13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミン塩酸塩）を得た。
(In the formula, BnO represents a benzyloxy group, NMP represents N-methyl-2-pyrrolidone, Pd (OH) 2 / C represents palladium hydroxide / carbon, and EtOH represents ethanol)
Compound 11 ( 13 C / 15 N-labeled dopamine hydrochloride) was prepared according to the reaction represented by: More specifically, Compound 11 ( 13 C / 15 N-labeled dopamine hydrochloride) was obtained from Compound 9 (4-bromomethyl-1,2-bisphenylmethoxybenzene) by performing the following operations.
４−ブロモメチル−１，２−ビスフェニルメトキシベンゼン（５１０ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）をＮ−メチルピロリドン（３ｍＬ）に溶解させた。得られた溶液に[13Ｃ，15Ｎ]−シアン化カリウム（１５２ｍｇ、２．２６ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で２０時間加熱しながら攪拌した。得られた反応液に飽和重曹水を加えた後、酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、エバポレーターで濃縮した。得られた濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー〔ヘキサン／酢酸エチル（体積比）＝６／１〕で精製することにより、化合物１０（収量：３２０ｍｇ）を得
た。
4-Bromomethyl-1,2-bisphenylmethoxybenzene (510 mg, 1.33 mmol) was dissolved in N-methylpyrrolidone (3 mL). [ 13 C, 15 N] -potassium cyanide (152 mg, 2.26 mmol) was added to the obtained solution, and the mixture was stirred while heating at 100 ° C. for 20 hours. Saturated aqueous sodium hydrogen carbonate was added to the resulting reaction solution, and the mixture was extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with water and saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and concentrated with an evaporator. The obtained concentrate was purified by silica gel column chromatography [hexane / ethyl acetate (volume ratio) = 6/1] to obtain Compound 10 (yield: 320 mg).
得られた化合物１０（３２０ｍｇ）を、アルゴンガス雰囲気下で、エタノール（４ｍＬ）／クロロホルム（２ｍＬ）混合溶液に、０℃で２０％水酸化パラジウム／炭素（８０ｍｇ）を加えた。さらに、アルゴンガスを０℃で水素に置換し、５０℃で終夜加熱撹拌した後、反応溶液を珪藻土濾過助剤〔アルファ・エイサー（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）社製、商品名：Ｆｉｌｔｅｒ ａｉｄ、Ｃｅｌｉｔｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｕｐｅｒ−ｃｅｌ〕で濾過して、Ｐｄ（ＯＨ）2／Ｃを濾過除去した後、濾液をエバポレーターで濃縮した。残渣を水に溶解し、塩化メチレンで洗浄後、水層を濃縮した。得られた濃縮物を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で精製することにより、化合物１１〔収量：７．７ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）、収率：３．８％〕を得た。 20% palladium hydroxide / carbon (80 mg) was added to a mixed solution of the obtained compound 10 (320 mg) in ethanol (4 mL) / chloroform (2 mL) at 0 ° C. under an argon gas atmosphere. Further, after replacing the argon gas with hydrogen at 0 ° C. and heating and stirring at 50 ° C. overnight, the reaction solution was converted to a diatomaceous earth filter aid (trade name: Filter aid, Celite Standard Super- manufactured by Alfa Aesar). Cel] and Pd (OH) 2 / C was removed by filtration, and then the filtrate was concentrated by an evaporator. The residue was dissolved in water, washed with methylene chloride, and the aqueous layer was concentrated. The obtained concentrate was purified by reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) to obtain Compound 11 [Yield: 7.7 mg (0.05 mmol), Yield: 3.8%].
なお、生成した化合物が前記式における化合物１１であることは、以下の1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲおよびＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって確認された。 In addition, it was confirmed by the following 1 H-NMR, 13 C { 1 H} -NMR and ESI-TOF-MS that the produced compound was the compound 11 in the above formula.
1H-NMR (D2O, 400 MHz) δ: 6.77 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.70 (s, 1H), 6.62 (d, J = 7.8 Hz), 3.09 (dt, J = 144.3, 6.8 Hz, 2H), 2.73 (m, 2H)
13C{1H}-NMR (D2O, 100 MHz) δ: 41.3 (d, J = 4.1 Hz).
ESI-TOF-MS [M]+ 156.0887.
1 H-NMR (D 2 O, 400 MHz) δ: 6.77 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.70 (s, 1H), 6.62 (d, J = 7.8 Hz), 3.09 (dt, J = 144.3 , 6.8 Hz, 2H), 2.73 (m, 2H)
13 C { 1 H} -NMR (D 2 O, 100 MHz) δ: 41.3 (d, J = 4.1 Hz).
ESI-TOF-MS [M] + 156.0887.
実施例２
実施例１で得られた13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパ（２．０ｍＭ）または製造例１で得られた13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンと、５ｍｍ ＴＣＩクライオプローブを装備した核磁気共鳴装置〔ブルカー・バイオスピン（Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ）社製、商品名：Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ６００（６００ＭＨｚ）〕とを用い、重水中における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを測定した（積算回数１６回）。実施例２において、1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝三重核磁気共鳴法に用いられたパルスシーケンスを図１に示す。図中、細いバーが９０°パルス、太いバーが１８０°パルスを示す。ＣＨおよびＣＮのカップリング定数1ＪCHおよび1ＪCNに基づき、順に1Ｈから13Ｃへの磁化移動、当該13Ｃから15Ｎへの磁化移動、さらに当該15Ｎから13Ｃへの磁化移動、最終的に13Ｃから1Ｈへの磁化移動により、シグナルを検出するように設定し、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパと13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンの同時観測を目的として、1ＪCH＝１４９Ｈｚおよび1ＪCN＝６．２Ｈｚをパラメータとして設定した。実施例２で得られた13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを図２（Ａ）、実施例２で得られた13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを図２（Ｂ）に示す。
Example 2
A nucleus equipped with 13 C / 15 N-labeled L-dopa (2.0 mM) obtained in Example 1 or 13 C / 15 N-labeled dopamine obtained in Production Example 1 and a 5 mm TCI cryoprobe 13 C / 15 N-labeled L-dopa and 13 C / 15 N- in heavy water using a magnetic resonance apparatus (manufactured by Bruker BioSpin, trade name: Bruker Avance 600 (600 MHz)) The 1 H- { 13 C- 15 N} -NMR spectrum of each labeled dopamine was measured (16 times of integration). In Example 2, the pulse sequence used for the 1 H- { 13 C- 15 N} triple nuclear magnetic resonance method is shown in FIG. In the figure, a thin bar represents a 90 ° pulse, and a thick bar represents a 180 ° pulse. Based on the coupling constants 1 J CH and 1 J CN of CH and CN , the magnetization transfer from 1 H to 13 C, the magnetization transfer from 13 C to 15 N, and the magnetization transfer from 15 N to 13 C in this order Finally, it is set to detect the signal by magnetization transfer from 13 C to 1 H, and the purpose is to simultaneously observe 13 C / 15 N-labeled L-dopa and 13 C / 15 N-labeled dopamine. 1 J CH = 149 Hz and 1 J CN = 6.2 Hz were set as parameters. The 1 H- { 13 C- 15 N} -NMR spectrum of 13 C / 15 N-labeled L-dopa obtained in Example 2 is shown in FIG. 2 (A) and 13 C / 15 obtained in Example 2. A 1 H- { 13 C- 15 N} -NMR spectrum of N-labeled dopamine is shown in FIG.
図２（Ａ）に示された結果から、化学シフト値３．８４ｐｐｍの位置に、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパのメチンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属される1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝三重共鳴ＮＭＲシグナルが見られることがわかる。また、図２（Ｂ）に示された結果から、化学シフト値３．１３ｐｐｍの位置に、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンのメチレンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属される1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝三重共鳴ＮＭＲシグナルが見られることがわかる。これらの結果から、図１に示されるパルスシーケンスを用いることにより、代謝基質である13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパとその代謝産物である13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンとを同時に、かつ高い選択性で検出することができることがわかる。 From the result shown in FIG. 2 (A), it is attributed to 1 H- 13 C- 15 N 1 H of 13 C / 15 N-labeled L-dopa methine at the position of chemical shift value 3.84 ppm. 1 H- { 13 C- 15 N} triple resonance NMR signal is seen. Further, from the results shown in FIG. 2 (B), the position of the chemical shift values 3.13Ppm, were assigned to 1 H of 13 C / 15 N-labeled of dopamine methylene 1 H- 13 C- 15 N 1 H- { 13 C- 15 N} triple resonance NMR signal is seen. These results, by using the pulse sequence shown in FIG. 1, a metabolic substrate 13 C / 15 N-labeled L- Dopa and 13 and C / 15 N-labeled dopamine its metabolite simultaneously In addition, it can be detected with high selectivity.
実施例３
芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素などの代謝酵素が高発現しているマウス肝臓組織内では、前記芳香族脱炭酸酵素によってＬ−ドーパからドーパミンを生成する代謝反応が行なわれている。そこで、マウス肝臓組織の抽出液と、実施例１で得られた13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパとを用い、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパの代謝反応を調べた。より具体的には、以下の操作を行なうことにより、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパの代謝反応を調べた。
Example 3
In a mouse liver tissue in which metabolic enzymes such as aromatic L-amino acid decarboxylase are highly expressed, a metabolic reaction for producing dopamine from L-dopa is performed by the aromatic decarboxylase. Thus, the metabolic reaction of 13 C / 15 N-labeled L-dopa was examined using the extract of mouse liver tissue and 13 C / 15 N-labeled L-dopa obtained in Example 1. More specifically, the metabolic reaction of 13 C / 15 N-labeled L-dopa was examined by performing the following operations.
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、体重：１５ｇ）の肝臓組織を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中でホモジナイズすることにより、肝臓組織抽出液を得た。得られた肝臓組織抽出液を、その濃度が１０体積％となるように、反応用混合液〔組成：５００μＭ 13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパ、２ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．１ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび１００μＭピリドキサールリン酸〕に加え、得られた混合液を３７℃で４５分間インキュベーションすることによって反応を行なった。 A liver tissue extract was obtained by homogenizing the liver tissue of a mouse (C57BL / 6J mouse, body weight: 15 g) in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). The obtained liver tissue extract was mixed with a reaction mixture [composition: 500 μM 13 C / 15 N-labeled L-dopa, 2 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) so that the concentration was 10% by volume. ), 0.1 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 0.1 mM 2-mercaptoethanol and 100 μM pyridoxal phosphate], and the resulting mixture was incubated at 37 ° C. for 45 minutes.
得られた反応液と、５ｍｍ ＴＣＩクライオプローブを装備した核磁気共鳴装置〔ブルカー・バイオスピン（Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ）社製、商品名：Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ６００（６００ＭＨｚ）〕とを用い、重水中における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル、1Ｈ−｛13Ｃ｝−ＮＭＲスペクトルおよび1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルのそれぞれを測定した。パルスシーケンスとして図１に示されたパルスシーケンスを用いた。実施例３において、肝臓組織抽出液を含む溶液における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル、1Ｈ−｛13Ｃ｝−ＮＭＲスペクトルおよび1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを図３に示す。図中、（ａ）は3Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル、（ｂ）は13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ｝−ＮＭＲスペクトル、（ｃ）は13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを示す。 Using the obtained reaction solution and a nuclear magnetic resonance apparatus (manufactured by Bruker BioSpin, trade name: Bruker Avance 600 (600 MHz)) equipped with a 5 mm TCI cryoprobe, 13 C / 15 N-labeled L- dopa and 13 C / 15 N-labeled dopamine respective 1 H-NMR spectrum, 1 H- {13 C} -NMR spectrum and 1 H- {13 C- 15 N} -NMR spectrum Each was measured. The pulse sequence shown in FIG. 1 was used as the pulse sequence. In Example 3, 1 H-NMR spectra of 13 C / 15 N-labeled L-dopa and 13 C / 15 N-labeled dopamine in a solution containing a liver tissue extract, 1 H- { 13 C}- The NMR spectrum and 1 H- { 13 C- 15 N} -NMR spectrum are shown in FIG. In the figure, (a) is the 1 H-NMR spectrum of each of 3 C / 15 N-labeled L-dopa and 13 C / 15 N-labeled dopamine, and (b) is 13 C / 15 N-labeled L- 1 H- { 13 C} -NMR spectra of dopa and 13 C / 15 N-labeled dopamine, respectively, (c) is 13 C / 15 N-labeled L-dopa and 13 C / 15 N-labeled dopamine, respectively. 1 H- { 13 C- 15 N} -NMR spectrum of is shown.
図３に示された結果から、1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝三重共鳴ＮＭＲによれば、代謝基質である13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパのメチンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（３．８４ｐｐｍ）と、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンのメチレンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（３．１３ｐｐｍ）との双方がみられることがわかる。また、図３に示された結果から、代謝基質である13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパのメチンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（３．８４ｐｐｍ）よりも、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンのメチレンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（３．１３ｐｐｍ）が多くなっていることから、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパの代謝反応の進行が確認された。これに対し、1Ｈ−ＮＭＲ〔図中、（ａ）参照〕では、多数の1Ｈシグナルがみられることから、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパの代謝反応を調べることは困難であることがわかる。また、1Ｈ−｛13Ｃ｝−二重共鳴ＮＭＲ〔図中、（ｂ）参照〕では、1Ｈ−ＮＭＲに比べて1Ｈシグナルの数が少なくなっているが、肝臓抽出液中の夾雑物由来の1Ｈシグナルが見られることがわかる。これらの結果から、夾雑物が多数存在する生体系においても、1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝三重共鳴ＮＭＲを用いることにより、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパと13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンとを同時に、かつ高い選択性で検出することができることがわかる。 From the results shown in FIG. 3, according to 1 H- { 13 C- 15 N} triple resonance NMR, 1 H- 13 C— of methine of 13 C / 15 N-labeled L-dopa, which is a metabolic substrate, is obtained. 15 the signal (3.84ppm) attributed to 1 H of N, the signal to be attributed to 1 H of 13 C / 15 N-labeled 1 H- 13 C-15 N methylene dopamine (3.13ppm) It can be seen that both are seen. Further, from the results shown in FIG. 3, a signal (3.84 ppm) attributed to 1 H of 1 H- 13 C- 15 N of methine of 13 C / 15 N-labeled L-dopa, which is a metabolic substrate. than, since the signal that is attributable to 1 H of 13 C / 15 N-labeled 1 H- 13 C- 15 N methylene dopamine (3.13ppm) are increasingly, 13 C / 15 N- Progress of the metabolic reaction of labeled L-dopa was confirmed. In contrast, in 1 H-NMR (see (a) in the figure), since many 1 H signals are observed, it is difficult to investigate the metabolic reaction of 13 C / 15 N-labeled L-dopa. I know that there is. Further, 1 H- {13 C} - [labeled, (b) refer to Fig double resonance NMR in, the number of the 1 H signals in comparison with the 1 H-NMR is low, contamination of the liver extract It can be seen that a 1 H signal derived from a product can be seen. From these results, 13 C / 15 N-labeled L-dopa and 13 C / 15 can be obtained by using 1 H- { 13 C- 15 N} triple resonance NMR even in a biological system in which many impurities exist. It can be seen that N-labeled dopamine can be detected simultaneously and with high selectivity.
実施例４
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、体重：１５ｇ）の肝臓組織を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中でホモジナイズすることにより、肝臓組織抽出液を得た。
Example 4
A liver tissue extract was obtained by homogenizing the liver tissue of a mouse (C57BL / 6J mouse, body weight: 15 g) in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0).
得られた肝臓組織抽出液を、その濃度が１０体積％となるように、反応用混合液〔組成：５００μＭ 13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパ、２ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．１ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび１００μＭピリドキサールリン酸〕に加え、得られた溶液を３７℃で４５分間インキュベーションした。一方、前記において、肝臓組織抽出液を前記反応用混合液の代わりにブランクとして超純水を加え、得られた溶液を３７℃で４５分間インキュベーションした。 The obtained liver tissue extract was mixed with a reaction mixture [composition: 500 μM 13 C / 15 N-labeled L-dopa, 2 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) so that the concentration was 10% by volume. ), 0.1 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 0.1 mM 2-mercaptoethanol and 100 μM pyridoxal phosphate], and the resulting solution was incubated at 37 ° C. for 45 minutes. On the other hand, in the above, ultrapure water was added using the liver tissue extract as a blank instead of the reaction mixture, and the resulting solution was incubated at 37 ° C. for 45 minutes.
インキュベーション後に得られた各溶液と、５ｍｍ ＴＣＩクライオプローブを装備した核磁気共鳴装置〔ブルカー・バイオスピン（Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ）社製、商品名：Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ６００（６００ＭＨｚ）〕とを用い、重水中における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルのそれぞれを測定した。パルスシーケンスとして図１に示されたパルスシーケンスを用いた。実施例４において、肝臓組織抽出液を含む溶液における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを図４（Ａ）、肝臓組織抽出液を含まない溶液における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを図４（Ｂ）に示す。図中、ピークＡは13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパのメチンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル、ピークＢは13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンのメチレンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナルを示す。 Each solution obtained after incubation, 5 mm TCI cryoprobe nuclear magnetic resonance apparatus equipped with: using the [Bruker BioSpin (Bruker BioSpin) trade name Bruker Avance 600 (600MHz)], 13 in the heavy water Each 1 H- { 13 C- 15 N} -NMR spectrum of each of C / 15 N-labeled L-dopa and 13 C / 15 N-labeled dopamine was measured. The pulse sequence shown in FIG. 1 was used as the pulse sequence. In Example 4, the 1 H- { 13 C- 15 N} -NMR spectrum of each of 13 C / 15 N-labeled L-dopa and 13 C / 15 N-labeled dopamine in a solution containing a liver tissue extract was obtained. FIG. 4 (A), 1 H- { 13 C- 15 N} -NMR of 13 C / 15 N-labeled L-dopa and 13 C / 15 N-labeled dopamine in a solution not containing liver tissue extract, respectively. The spectrum is shown in FIG. In the figure, the peak A is 13 C / 15 N-labeled L- dopa signals attributable to 1 H of 1 H- 13 C- 15 N methine, Peak B of 13 C / 15 N-labeled dopamine The signal attributed to 1 H of 1 H- 13 C- 15 N of methylene is shown.
図４に示された結果から、肝臓組織抽出液を含む溶液においては、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパのメチンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（ピークＡ）および13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンのメチレンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（ピークＢ）の双方がみられるが、肝臓組織抽出液を含まない溶液においては、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンのメチレンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（ピークＢ）がみられないことがわかる。 From the results shown in FIG. 4, in the solution containing the liver tissue extract, signals attributable to 1 H of 13 C / 15 N-labeled L-dopa methine 1 H- 13 C- 15 N ( Both peak A) and a signal attributed to 1 H of 13 C / 15 N-labeled dopamine methylene 1 H- 13 C- 15 N 1 H (peak B) are seen, but no liver tissue extract is included in solution, it can be seen that the signal attributed to 1 H of 13 C / 15 N-labeled methylene dopamine 1 H- 13 C- 15 N (peak B) is not observed.
これらの結果から、1Ｈ−13Ｃ−15Ｎ結合を有する13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパを用いることにより、マウスの肝臓組織抽出液中に含まれる芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素による13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパから13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンへの代謝を調べることができることがわかる。また、1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝三重共鳴ＮＭＲを用いることにより、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパと13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンとを同時に、かつ高い選択性で検出することができることがわかる。なお、式（Ｉ）で表わされ、かつ１Ｈ、１３Ｃおよび15Ｎからなる群より選ばれた少なくとも２種類の核磁気共鳴活性核を有するとともに異なる共鳴周波数を有する少なくとも３個の核磁気共鳴活性核からなる結合を有する他の神経伝達物質の前駆体アミノ酸を多重共鳴用のプローブとして用いたときにも同等の傾向が見られる。 From these results, by using 13 C / 15 N-labeled L-dopa having 1 H- 13 C- 15 N bond, aromatic L-amino acid decarboxylase contained in mouse liver tissue extract it can be seen that can be examined 13 metabolism of C / 15 N-labeled L- dopa to 13 C / 15 N-labeled dopamine by. Further, by using 1 H- { 13 C- 15 N} triple resonance NMR, 13 C / 15 N-labeled L-dopa and 13 C / 15 N-labeled dopamine are simultaneously and highly selective. It can be seen that it can be detected. It should be noted that at least three nuclear magnetisms represented by formula (I) and having at least two types of nuclear magnetic resonance active nuclei selected from the group consisting of 1 H, 13 C and 15 N and having different resonance frequencies The same tendency can be seen when the precursor amino acid of another neurotransmitter having a bond composed of a resonance active nucleus is used as a probe for multiple resonance.
実施例５
臨床で用いられているＬ−ドーパ製剤は、脳内での薬効を高めるため、肝臓、腎臓などの臓器における代謝分解を抑制するための脱炭酸酵素阻害剤と併用されている。そこで、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパの脱炭酸代謝反応に対する脱炭酸酵素阻害剤の効果を、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを測定することによって調べた。より具体的には、以下の操作を行なうことにより、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパの脱炭酸代謝反応に対する脱炭酸酵素阻害剤の効果を調べた。
Example 5
Clinically used L-dopa preparations are used in combination with decarboxylase inhibitors for suppressing metabolic degradation in organs such as the liver and kidneys in order to increase the efficacy in the brain. Therefore, 13 C / 15 N- labeled L- dopa effects decarboxylase inhibitors against decarboxylation metabolic reactions, 13 C / 15 N- labeled L- Dopa and 13 C / 15 N-labeled dopamine, respectively The 1 H- { 13 C- 15 N} -NMR spectrum was measured. More specifically, the effect of the decarboxylase inhibitor on the decarboxylation metabolic reaction of 13 C / 15 N-labeled L-dopa was examined by performing the following operations.
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、体重：１５ｇ）の肝臓組織を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中でホモジナイズすることにより、肝臓組織抽出液を得た。得られた肝臓組織抽出液をその濃度が１０体積％となるように反応用混合液〔組成：５００μＭ 13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパ、２ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．１ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび１００μＭピリドキサールリン酸〕に加えるとともに、カルビドパ（０．１２５当量）またはベンゼラジド（０．１２５当量）を加え、得られた混合液を３７℃で４５分間インキュベーションすることによって反応を行なった。一方、肝臓組織抽出液をその濃度が１０体積％となるように反応用混合液〔組成：５００μＭ 13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパ、２ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．１ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび１００μＭピリドキサールリン酸〕に加え、得られた混合液を３７℃で４５分間インキュベーションすることによって反応を行なった。 A liver tissue extract was obtained by homogenizing the liver tissue of a mouse (C57BL / 6J mouse, body weight: 15 g) in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). The resulting liver tissue extract was mixed for reaction so that its concentration was 10% by volume [composition: 500 μM 13 C / 15 N-labeled L-dopa, 2 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 0.1 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 0.1 mM 2-mercaptoethanol and 100 μM pyridoxal phosphoric acid], carbidopa (0.125 equivalent) or benzlazide (0.125 equivalent), and the resulting mixture at 37 ° C. The reaction was performed by incubation for 45 minutes. On the other hand, the liver tissue extract was mixed for reaction so that its concentration was 10% by volume [composition: 500 μM 13 C / 15 N-labeled L-dopa, 2 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 0 .1 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 0.1 mM 2-mercaptoethanol and 100 μM pyridoxal phosphate] and the resulting mixture was incubated at 37 ° C. for 45 minutes.
得られた反応液と、５ｍｍ ＴＣＩクライオプローブを装備した核磁気共鳴装置〔ブルカー・バイオスピン（Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ）社製、商品名：Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ６００（６００ＭＨｚ）〕とを用い、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを測定した。パルスシーケンスとして図１に示されたパルスシーケンスを用いた。実施例５において、カルビドパを含む反応液およびカルビドパを含まない反応液における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを図５に示す。図５中、（ａ）はカルビドパを含まない反応液における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトル、（ｂ）はカルビドパを含む反応液における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを示す。また、実施例５において、ベンゼラジドを含む反応液およびベンゼラジドを含まない反応液における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを図６に示す。図６中、（ａ）はベンゼラジドを含まない反応液における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトル、（ｂ）はベンゼラジドを含む反応液における13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパおよび13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンそれぞれの1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝−ＮＭＲスペクトルを示す。また、図５および図６中、ピークＡは13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパのメチンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル、ピークＢは13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンのメチレンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナルを示す。 Using the obtained reaction solution and a nuclear magnetic resonance apparatus (manufactured by Bruker BioSpin, trade name: Bruker Avance 600 (600 MHz)) equipped with a 5 mm TCI cryoprobe, 13 C / 15 N- The 1 H- { 13 C- 15 N} -NMR spectrum of each of the labeled L-dopa and 13 C / 15 N-labeled dopamine was measured. The pulse sequence shown in FIG. 1 was used as the pulse sequence. In Example 5, 1 H- { 13 C- 15 N of each of 13 C / 15 N-labeled L-dopa and 13 C / 15 N-labeled dopamine in a reaction solution containing carbidopa and a reaction solution not containing carbidopa. } -NMR spectrum is shown in FIG. In FIG. 5, (a) shows 1 H- { 13 C- 15 N} -NMR of 13 C / 15 N-labeled L-dopa and 13 C / 15 N-labeled dopamine in a reaction solution not containing carbidopa, respectively. Spectrum, (b) shows 1 H- { 13 C- 15 N} -NMR spectrum of each of 13 C / 15 N-labeled L-dopa and 13 C / 15 N-labeled dopamine in a reaction solution containing carbidopa. . In Example 5, 1 H- { 13 C- of each of 13 C / 15 N-labeled L-dopa and 13 C / 15 N-labeled dopamine in the reaction solution containing benzelazide and the reaction solution not containing benzelazide. The 15 N} -NMR spectrum is shown in FIG. In FIG. 6, (a) shows 1 H- { 13 C- 15 N} -NMR of 13 C / 15 N-labeled L-dopa and 13 C / 15 N-labeled dopamine in a reaction solution not containing benzrazide. Spectrum, (b) shows 1 H- { 13 C- 15 N} -NMR spectrum of 13 C / 15 N-labeled L-dopa and 13 C / 15 N-labeled dopamine, respectively, in a reaction solution containing benzrazide. . 5 and 6, peak A is a signal attributed to 1 H of 13 C / 15 N-labeled L-dopa methine 1 H- 13 C- 15 N, and peak B is 13 C / 15 The signal attributed to 1 H of 1 H- 13 C- 15 N of methylene of N-labeled dopamine is shown.
図５に示された結果から、カルビドパを含まない反応液においては、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパのメチンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（ピークＡ）および13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンのメチレンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（ピークＢ）の双方がみられるが、カルビドパを含む溶液においては、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンのメチレンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（ピークＢ）がみられないことがわかる。また、図６に示された結果から、ベンゼラジドを含まない反応液においては、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパのメチンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（ピークＡ）および13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンのメチレンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（ピークＢ）の双方がみられるが、ベンゼラジドを含む溶液においては、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化ドーパミンのメチレンの1Ｈ−13Ｃ−15Ｎの1Ｈに帰属されるシグナル（ピークＢ）がみられないことがわかる。これらの結果から、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパを用いることにより、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパの脱炭酸代謝反応に対する脱炭酸酵素阻害剤の効果を調べることができることがわかる。 From the results shown in FIG. 5, in the reaction solution containing no carbidopa, a signal (peak) attributed to 1 H of 13 C / 15 N-labeled L-dopa methine 1 H- 13 C- 15 N A) and 13 C / 15 N-labeled dopamine methylene 1 H- 13 C- 15 N signal assigned to 1 H (peak B) is observed, but in the solution containing carbidopa, 13 C / 15 N-labeled dopamine signals that are attributable to 1 H of 1 H- 13 C- 15 N methylene (peak B) it can be seen that not observed. Further, from the results shown in FIG. 6, in the reaction solution not containing benzrazide, the signal attributed to 1 H of 13 C / 15 N-labeled L-dopa methine 1 H- 13 C- 15 N 1 H (Peak A) and 13 C / 15 N-labeled dopamine methylene 1 H- 13 C- 15 N signal assigned to 1 H (peak B) are both seen, but in a solution containing benzrazide , 13 C / 15 N-labeled dopamine methylene 1 H- 13 C- 15 N attributed to 1 H (peak B) is not observed. From these results, the use of 13 C / 15 N-labeled L- dopa, that can examine the effect of 13 C / 15 N-labeled L- dopa decarboxylase inhibitor to decarboxylation metabolic reactions I understand.
以上の結果から、13Ｃ／15Ｎ−ラベル化Ｌ−ドーパに代表される式（Ｉ）で表わされる神経伝達物質の前駆体アミノ酸を多重共鳴用のプローブとして用い、1Ｈ−｛13Ｃ−15Ｎ｝三重共鳴ＮＭＲ法を行なうことにより、代謝基質であるＬ−ドーパなどの神経伝達物質の前駆体とその代謝産物であるドーパミンなどの神経伝達物質とを同時に、かつ高い選択性で検出することができ、しかも神経伝達物質の前駆体（代謝基質）から神経伝達物質（代謝産物）への代謝過程を調べることができることが示唆される。
From the above results, the precursor amino acid of the neurotransmitter represented by the formula (I) represented by 13 C / 15 N-labeled L-dopa was used as a probe for multiple resonance, and 1 H- { 13 C- By performing the 15 N} triple resonance NMR method, a precursor of a neurotransmitter such as L-dopa as a metabolic substrate and a neurotransmitter such as dopamine as a metabolite thereof are simultaneously detected with high selectivity. Moreover, it is suggested that the metabolic process from a neurotransmitter precursor (metabolite) to a neurotransmitter (metabolite) can be examined.
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