JP6570833B2 - 人工沿軸中胚葉前駆(iPAM)細胞を調製する方法及びその使用 - Google Patents
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Description
本発明の第1の態様は有効量のWntシグナル伝達経路の活性化剤を含む適切な培養培地中で多能性細胞を培養する工程を含む、人工沿軸中胚葉前駆(iPAM)細胞を調製するex vivo方法に関する。
a)それらは、Tbx6、EphrinA1、EphrinB2、EPHA4、PDGFRアルファ、Sall1、Sall4、Dll1、Dll3、Papc(Pcdh8)、Lfng、Hes7、Ripply1、Ripply2、Brachyury(T)、Cdx2、Cdx4、Evx1、Cxcr4、Ill7rd、Fgf8、Fgf17、Gbx2、Wnt3a、Wnt5b、Rspo3、SP5、SP8、Has2、Dkk1、Dact1、Pax3、Pax7、Mesp1、Mesp2又はMsgn1遺伝子等の沿軸中胚葉前駆細胞に特徴的なバイオマーカーを発現する。例えば、Msgn1プロモーターを含む遺伝子レポーターアッセイで測定されるようにMsgn1遺伝子を優先的に発現する;並びに、
b)それらは多能性細胞であり、少なくとも骨格細胞系統、真皮細胞系統又は筋肉細胞系統への分化が可能である;
c)任意選択で、それらは、例えば、6か月を超えて培養物中に維持され得る、長期の自己複製特性を有してもよい。
1.上記R−spondin因子又はR−spondinの修飾形態をコードする遺伝子の内因性の発現を増強する;
2.制御配列に制御可能に連結されたR−spondin因子のコード配列を含む発現ベクターを多能性細胞に導入して分化させるか、又はR−spondin因子に対するコーディングRNAを細胞に導入することによって上記R−spondin因子の異所性の発現を可能とする;
3.例えば、培養培地中、若しくは順化培地中の組換えR−spodin因子(R−spondin1、2、3及び4のファミリー)として、又は基体コーティングとして、適切な量のR−spondin因子を細胞環境に直接導入する;
4.上記標的細胞においてR−spondin因子シグナル伝達に関与する遺伝子の内因性の発現を活性化若しくは阻害する;又は、
5.上記標的細胞におけるR−spondin因子の発現レベルの制御、突然変異及び全体的な調節に関与するタンパク質を過剰発現させる。
a)Wntシグナル伝達経路の活性化剤、
b)骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路の阻害剤、及び
c)任意選択で、人工沿軸中胚葉前駆(iPAM)細胞を調製するための使用説明書、
を含む。
a)Wntシグナル伝達経路の活性化剤、及び
b)任意選択で、人工沿軸中胚葉前駆(iPAM)細胞を調製するための使用説明書、
を含む。
a)R−spondinファミリーのメンバーを含む組成物、
b)BMPシグナル伝達経路の阻害剤を含む組成物、及び
c)DMSO又は等価物、
を含む。
a)R−spondinファミリーのメンバーを含む組成物、及び
b)DMSO又は等価物、
を含む。
a)GSK−3βの化合物阻害剤を含む組成物、
b)I型BMP受容体の化合物阻害剤を含む組成物、及び
c)DMSO又は等価物、
を含む。
本発明は、さらに、上記方法により得ることができる人工沿軸中胚葉前駆(iPAM)細胞を含む集団に関する。
人工沿軸中胚葉前駆(iPAM)細胞は、骨格筋、骨、軟骨、真皮細胞、並びに脂肪細胞又は内皮細胞を含むがこれらに限定されない沿軸中胚葉の他の誘導体を作製するためのin vitroでの分化条件下で有利に培養され得る。
(a)人工沿軸中胚葉前駆(iPAM)細胞を含む集団を供給する工程と、
(b)骨格筋系統、骨系統、軟骨系統、真皮細胞系統、脂肪細胞系統又は内皮細胞系統を含む沿軸中胚葉誘導体のうちから選択される所望の細胞系統へと人工沿軸中胚葉前駆(iPAM)細胞を分化させるために適切な条件下で、上記人工沿軸中胚葉前駆(iPAM)細胞を含む集団を培養する工程とを含む、方法に関する。
(a)人工沿軸中胚葉前駆(iPAM)細胞を含む集団を供給する工程と、
(b)少なくとも以下の成分:
(i)細胞外マトリクス材料;及び
(ii)レチノイン酸、BMP、TGFβ(トランスフォーミング増殖因子β)、Hedgehog、Notch、FGF、Wnt、ミオスタチン、インスリン、PDGF、VEGF、MAPK、PI3Kを含むが、これらに限定されない上記系統の分化を制御することが知られているシグナル伝達経路を活性化又は阻害する化合物;
を含む分化培地の存在下で上記人工沿軸中胚葉前駆(iPAM)細胞を含む集団を培養する工程と、
(c)任意選択で、Wntシグナル伝達経路、FGFシグナル伝達経路、HGF(肝細胞増殖因子)シグナル伝達経路、アクチビンシグナル伝達経路、EGF(上皮増殖因子)シグナル伝達経路、インスリンシグナル伝達経路、及びIGFシグナル伝達経路を活性化若しくは阻害する少なくとも1又は複数の化合物、又はウマ血清若しくはトランスフェリン等の筋形成分化を促進することが知られている少なくとも1又は複数の化合物を含む、第2分化培地中で工程(b)から得られた上記集団を培養する工程と、
を含み、それによって、Desmin若しくはミオシン重鎖等のマーカーによって同定され得る骨格筋細胞系統を含む集団を得る、方法を提供する。
i.細胞外マトリクス材料、
ii.レチノイン酸経路、BMP(骨形成タンパク質)経路、TGFβ経路、Hedgehog経路、Notch経路、FGF経路、Wnt経路、ミオスタチン経路、インスリン経路、PDGF(血小板由来増殖因子)経路、VEGF(血管内皮増殖因子)経路、MAPK経路、PI3K経路を活性化又は阻害する少なくとも1又は複数の化合物。上記組成物は、Wntシグナル伝達経路、FGFシグナル伝達経路、HGFシグナル伝達経路、アクチビンシグナル伝達経路、EGFシグナル伝達経路、インスリンシグナル伝達経路及びIGFシグナル伝達経路を活性化又は阻害する少なくとも別の化合物、又はウマ血清若しくはトランスフェリン等の筋形成分化を促進することが知られている化合物を更に含む。
本発明の別の態様は、人工沿軸中胚葉前駆(iPAM)細胞を含む上記集団の使用、又は人工沿軸中胚葉前駆(iPAM)細胞の分化に由来する骨格筋細胞系統、骨細胞系統、軟骨細胞系統又は真皮細胞系統を含む上記集団の使用のみならず、脂肪組織及び内皮の沿軸中胚葉誘導体の使用に関し、以下、これらを本発明の集団と呼ぶ。
細胞培養
未分化のマウスES細胞Msgn1RepV(E14由来)は、ゼラチンコーティングしたディッシュ上でウシ胎児血清(FBS;PAAより)15%、ペニシリン、ストレプトマイシン、L−グルタミン2mM、非必須アミノ酸0.1mM、ピルビン酸ナトリウム1mM、β−メルカプトエタノール0.2%、及びLIF1500U/mLを補充されたDMEM中に維持した。ES細胞をマイトマイシン不活性化MEF(フィーダー)と共培養した。未分化ヒトES細胞は、matrigel(BD Biosciences)でコーティングしたプレート上でmTeSR培地(STEMCELL Technologies)中で培養した。培養物を、37℃にて5%CO2のインキュベーター内で維持した。
ES細胞をトリプシン処理し、因子及びDMSO(Sigma)を補充された血清ベース(FBS15%)条件又は血清置換(KSR15%、Invitrogen)条件において、ゼラチンでコーティングしたフィーダーを含まない24ウェルプレートに様々な密度で直接播種した。組換えタンパク質を商業的に(R&D)入手し、ストック溶液を製造業者の推奨に従って調製した。GSK−3β阻害剤CHIR99021及びI型BMP受容体阻害剤DorsomorphinをStemgentから購入し、製造業者の推奨に従って調製した。蛍光レポーター分析及び画像取得をZeiss Axiovert system上にて行った。
細胞培養物をトリプシン処理することによって解離し、YFP発現に従ってFACScalibur(BD Biosciences)上でフローサイトメトリーにより分析した。データをMoFloソフトウェア(Beckman Coulter)及びFlowJoソフトウェアにより更に分析した。
マウスE9.5胚のPSMを顕微解剖し、以前に記載されているように加工し(Krol et al, 2011)、調製した試料をAffymetrix GeneChip arrays上で実行した。分化細胞培養物について、Msgn1−YFP+発現に基づくフローサイトメトリーによりiPAMを選別し、マイクロアレイ用に試料を調製した。実験を生物学的に3通り実施した。Affymetrix Microarray Suite(MAS)5.0を使用してデータセットを加工した。
Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Arrays (GEO platform id GPL1261)に対応する、GEOに寄託された野生型マウス組織の全マイクロアレイを使用して遺伝子発現参照を構築した。各マクロアレイについて平均値を算出することにより正規化を行った。全マイクロアレイに亘るそれらの平均値の分布に対する中央値を決定した。その後、この中央値(median)を各マイクロアレイに対する各値のスケーリング因子として使用した。一旦全てのマイクロアレイを正規化すると、各プローブセットに対する中央発現値(median expression value)は参照値として規定される。1つの実験条件に特異的な遺伝子サインリストを、参照データセットのような対応するマイクロアレイデータを正規化することによって作製した。正規化発現値(normalized expression value)が対応する参照値より10倍高いプローブセットをその条件のサイン遺伝子とした。
Trizol(Invitrogen)を使用するか、又はRnaeasy plus mini−kit (Qiagen)によりES細胞培養物から全RNAを抽出した。QuantiFast SYBR Green RT−PCR Kit(Qiagen)、適切なプライマーを使用し、LightCycler 480II(Roche)を実行して、RT−PCRを全RNA5ngに対して実施した。GAPDHを内部コントロールとして使用した。
4℃にて一晩、PFA4%により細胞培養物を固定した。Tris緩衝生理食塩水(TBS)中にウシ胎児血清1%及びTriton0.1%で構成されるブロッキング溶液を用いて、細胞を20分間インキュベートした。一次抗体インキュベーションを4℃にて一晩実施し、抗体使用希釈は以下の通りであった:抗GFP(Abcam)は1:1000、抗Desmin(DSHB)は1:100、抗CD31(BD Pharmingen)は1:100。TBSで洗浄後、細胞をAlexaFluor488標識二次抗体(Molecular probes)と1:500にて30分間インキュベートし、ヘキストにより対比染色を行った。アルシアンブルー染色を標準的なプロトコルに従って行った。
Msgn1RepV ES細胞培養物を分化の4日後にトリプシン処理し、FACS Aria又はMoflow Astrios(BD)を使用してYFP蛍光発光に基づいてiPAMを選別した。CAG−GFPレンチウイルス(20〜30のMOI)を用いて一晩形質導入を行うことによって不可逆的にiPAMを標識化した。融合していないウイルス粒子を除去するため、細胞を数回洗浄し、移植のための調製前に培地中で1時間再度インキュベートした。移植筋を1か月後に採取し、免疫組織化学用に加工した。解剖された前脛骨筋を、以前に記載されているように(B. Gayraud-Morel B. et al., 2012)凍結切片用(12μm)に調製した。この研究において使用された抗体は、抗ジストロフィン(Sigma)、抗ラミニン(Sigma)、ミオゲニン(Dako)、Pax7(DSHB)及びGFP(Abcam)であった。ミオシンアイソフォームに対する抗体はS.J.Mathew Dev 138, 371 (2011)に記載されている。組織切片を一次抗体と共に一晩インキュベートした。AlexaFluor(Molecular probes)で標識された二次抗体を1:500で使用した。Zeiss Axio observer上で画像化を行い、Adobe photoshopを用いて画像を加工した。
実施例1:Wntシグナル伝達経路の活性化剤の使用
in−vitroでの人工沿軸中胚葉前駆(iPAM)細胞の産生
本発明者らは、当初、ES細胞由来の沿軸中胚葉系統の分化を促進する主要な分子プレーヤーの同定に焦点を絞っていた。最初に、本発明者らは、ウシ胎児血清15%(FBS15%)を補充されたDMEM系培地において、胚様体を形成した後にマウスES細胞が分化する間、沿軸中胚葉誘導の経時的変化を調査した。沿軸中胚葉前駆細胞における分化は、PCRによって検出されるBrachyury/Tマーカー、Tbx6マーカー、及びMsgn1マーカーの活性化を特徴とした。培養1日目から4日目の本発明者らのデータは、幾つかの分化細胞は未分節中胚葉様段階にあることを示唆している。
中胚葉アイデンティティーの獲得後の骨格筋分化の第1段階を表す、沿軸中胚葉分化(即ち、未分節運命(presomitic fate))の第1期へのES細胞の分化を追跡するため、本発明者らは、沿軸中胚葉前駆体において特異的に発現する蛍光性レポーターを保持するトランスジェニックマウスES細胞株を作製した。本発明者らは、Venus(修飾YFP)の発現を制御する未分節中胚葉に特異的な遺伝子であるマウスMsgn1由来のプロモーターを使用した。その後、完全にトランスジェニックES細胞に由来する胚を作製するために4倍体凝集法を使用して、トランスジェニックMsgn1RepV(Mesogenin1 Reporter Venus)マウスES細胞株を検証した。予想通り、トランスジェニックマウス胚は、蛍光標識された沿軸中胚葉組織を呈し、したがって、トランスジェニックES細胞株におけるVenus発現の組織特異性が検証された。
沿軸中胚葉前駆体の分化条件を最適化するため、本発明者らは、ES細胞に対して様々なシグナル伝達経路に干渉する候補増殖因子及び薬物を試験する手作業のスクリーニングアッセイを開発した。ゼラチン(0.1%)でコーティングされた24ウェルプレートにMsgn1RepVレポーター細胞を所定の密度で播種した。2種の基本培養培地を選択した:ウシ胎児血清15%(FBS、高血清)を含有するDMEM系培地、及びKSR15%(Invitrogen/Gibco)を含有する限定無血清培地。分化の0日目において、これらの基本培地を候補因子により補填した。コントロール条件及び実験条件を並行して培養した。2日目又は3日目に培地を交換し、細胞を3日間から4日間に亘って分化させた。分化の3日目及び4日目に細胞培養物を目視で分析し、更にYFP+集団の定量化のためフローサイトメトリーによって分析した。
in vitroにおけるES細胞の分化に際する沿軸中胚葉前駆細胞運命の誘導を確認するため、本発明者らは、R−spondin3の存在下での分化の4日後にYFP+細胞集団を選別し(図3A)、主要な沿軸中胚葉マーカーであるMsgn1及びTbx6についてqRT−PCRによりYFP−細胞に対するYFP+細胞を分析した(図3B)。本発明者らは、YFP+集団はMsgn1内因性遺伝子、並びにTbx6を強く発現していることを確認し、これは本発明者らがin vitroにおいて沿軸中胚葉前駆体(iPAM)を作製し得ることを立証している。
次に、本発明者らは、R−spondinファミリーの他のメンバーが沿軸中胚葉前駆体iPAM細胞(Msgn1−YFP+沿軸中胚葉前駆体)を誘導し得るかどうかを問うた。ES細胞を、FBS15%を補充された組換えR−spondinタンパク質(R−spondin1〜4)を含有する培地中で培養し、4日間に亘って分化させた(図4B)。このファミリーの2つのメンバー、R−spondin2及びR−spondin3が同等の活性を呈し、YFP+細胞数を顕著に増加した。R−spondinファミリータンパク質の活性は、古典的Wnt/ベータカテニンシグナル伝達と関連し(非特許文献14;非特許文献15)、より最近では、Wnt/PCPシグナル伝達と関連している(非特許文献16)。本発明者らは、分泌されたDkk1阻害剤を使用して、R−spondin依存性分化に対する古典的Wntシグナル伝達の阻害効果を分析した(図4A)。細胞外WntアンタゴニストであるDkk1による培地の補填は、YFP+誘導の急激な減少を生じる。さらに、FBS含有培地にDkk1を添加すると、R−spondin3の効果が遮断され、R−spondin3効果は、Wnt古典的経路によって媒介されていることを示唆している。また、本発明者らは、R−spondin3、及びDkk1、又はWntシグナル経路を活性化し得る化合物LiClによって処理された、又は処理されていないES細胞において形質移入された古典的Wntシグナル伝達に反応するプロモーター(BAT−luc)により制御されるプラスミド由来のルシフェラーゼ発現を分析した(図4C)。ルシフェラーゼは、R−spondin3処理によって強く活性化され、このような状況において古典的Wnt経路を活性化することを示唆している。
本発明者らは、次に、iPAM細胞集団の分化可能性を探索した。in vivoにおいて、沿軸中胚葉前駆細胞は、骨格筋、脊椎組織(軟骨、骨)、背側真皮、内皮、及び脂肪組織等の他の組織になるよう運命づけられている。
代替的に、人工沿軸中胚葉前駆(iPAM)細胞を、3日間に亘ってBMP4、アクチビンA及びIGF−1を補完されたSFO3培地を使用する二次元培養の後、LiCl及びShhを補完されたSFO3培地中で3日間に亘り、筋肉細胞へと分化させることができる。
骨格系統については、人工沿軸中胚葉前駆(iPAM)細胞を、ヒト又はマウス組換えBMP4 200ng/ml、又はレチノイン酸1μM及び塩化リチウム10mMの組合せに暴露する。或いは、細胞を、1ウェル(24ウェルプレート)当たり1〜3×103の密度でゼラチンコーティングしたプレートに蒔き、骨特異的マーカーを発現する細胞又はアルシアンブルー陽性細胞外マトリクスを分泌する細胞を観察するため、骨分化培地(DMEM、FBS10%、l−グルタミン2mM、1×ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)、デキサメタゾン0.1μM、アスコルビン酸2リン酸50μM、β−グリセロリン酸10mM、BMP4 10ng/mL)中で28日間培養する。分化した骨格細胞系統を、アルシアンブルー又はアリザリンレッドを含む骨及び軟骨の細胞外マトリクス成分に対する特異的染色を使用して、並びに軟骨細胞特異的抗体及び/又は骨細胞特異的抗体を使用する免疫蛍光法により同定する。
軟骨形成細胞分化について、人工沿軸中胚葉前駆(iPAM)細胞を、1ウェル(24ウェルプレート)当たり8×104の密度で蒔き、軟骨分化培地(αMEM、FBS10%、l−グルタミン2mM、1×P/S、デキサメタゾン0.1μM、アスコルビン酸2リン酸170μM)中で37℃のインキュベーターにおいて30分間培養する。次に、等量のTGFベータ3 10ng/mLを含む軟骨細胞分化培地をウェルに添加する。1週間後、Bmp2 10ng/mLを補充された軟骨分化培地で培地を置換する。21日後、細胞外マトリクスを分泌する軟骨小結節を観察することができる。また、人工沿軸中胚葉前駆(iPAM)細胞を、アルファMEM、FBS10%、L−グルタミン2mM、1×P/S、デキサメタゾン0.1mM、及びアスコルビン酸2リン酸170mMに基づく分化培地、又はデキサメタゾン0.1mM、アスコルビン酸0.17mM、ピルビン酸ナトリウム1.0mM、L−プロリン0.35mM、インスリン−トランスフェリンナトリウム1%、ウシ血清アルブミン1.25mg/ml、リノール酸5.33ug/ml、及びトランスフォーミング増殖因子ベータ0.01ug/ml)並びにTGFベータ3又はBMP2を補充されたDMEMを使用して、軟骨細胞へと分化させることもできる。細胞を、3日毎に培地交換をしながら数週間培養する。また、分化を、FBS10%及び抗生物質を含有し、組換えヒト骨形成タンパク質−2(BMP−2)100ng/ml及びアスコルビン酸50mgを補充されたDMEM系培地中において、アルギン酸ビーズ等の3D足場上に高密度で行うこともできる。ムコ糖タンパク質(Muco-glycoproteins)を青く染色することが当該技術分野においてよく知られている、分化している培養物のアルシアンブルー染色によって、軟骨形成を確認することができる。或いは、サフラニンO染色を行うことができる。
人工沿軸中胚葉前駆(iPAM)細胞を、bFGF(塩基性線維芽細胞増殖因子)又は増殖因子のWntファミリーのメンバー等の線維芽細胞増殖因子を含有する培地中でコラーゲンの足場上でそれらを培養することによって真皮線維芽細胞へと分化させることができる。
Msgn1−YFP+細胞集団の特性評価
R−spondinタンパク質及びDMSOを使用することにより、本発明者らは、1つの工程で70%のMsgn1−YFP+細胞を産生することができる(図2B)。Msgn1−YFP+のトランスクリプトームをそれらのin vivo対応物(即ち、未分節中胚葉、PSM)と直接比較するため、本発明者らは、マイクロアレイを使用して、徐々により成熟した分化段階を表す、連続したマウスフラグメントの全体的なトランスクリプトームプロファイリングを作製した(データは非図示)。PSMフラグメントは、下肢芽レベルから筋形成プログラムが最初に活性化される体節領域にまで及んだ。このマイクロアレイシリーズに基づいて、本発明者らは、下肢芽(エピブラスト)から未分節中胚葉及び体節段階への細胞の進行性の成熟段階を規定するサイン遺伝子セットを特定することができた。並行して、本発明者らは、R−spondin3及びDMSO(RD)の存在下でES細胞を分化し、Msgn1−YFP+細胞集団を選別して、この集団の分化3日目及び4日目のマイクロアレイをそれぞれ作製した。全体的なトランスクリプトーム及びサイン遺伝子セットを、in vivoPSM及びin vitro分化Msgn1−YFP+細胞間で比較した(データは非図示)。
このBMP4活性を相殺するため、本発明者らは、BMP4を阻害することが知られている組換えNoggin(Nog)タンパク質の分化培地への添加の効果を試験した。本発明者らは、分化の0日目又は1日目からのNogginの添加により、Nogginを含まない分化培地中で培養された細胞と比較して、Msgn1−YFP+細胞は効果的にBMP4発現を抑制することを見出した。さらに、本発明者らは、Nogginを添加する最適な濃度及び最適なタイミングの両方を特定した。NogginはMsgn1−YFP+人工沿軸中胚葉前駆(iPAM)細胞の総数(産生効率)を変化せず、培養物中の総細胞数も変化しないが、むしろMsgn1−YFP+の成熟(成熟効率)を変化する。Msgn1−YFP+細胞に対するNogginの影響をより詳しく特性評価するため、本発明者らは、分化の3日目と4日目にMsgn1−YFP+人工沿軸中胚葉前駆体(iPAM)集団に対してマイクロアレイを実施した(図11、条件RDN及び条件RDを比較)。
本発明者らは、マウスPSMマイクロアレイシリーズにおけるBMP阻害剤であるFollistatin(Fst)及びCerberus(Cerl)の強い上方制御を検出した。またChordin、Noggin、及びGremlin1等の他のBMP阻害剤は、発生の間近接する組織によって発現されることが知られている(非特許文献25;非特許文献26及びScott IC et al, 2000)。これは、in vivoにおいてPSMが適切に成熟するためにBMP阻害を必要とし、in vitroにおいてもBMP阻害がiPAM細胞の適切な成熟に必要であることを示唆している。
これらの前駆体の最終分化を更に制御するため、本発明者らは、次に、in vivoアプローチを採用した。R−spondin3及びNogginを含有する培地での分化4日後に得られたPax3陽性細胞を、GFP発現レンチウイルスにより形質導入し、恒久的に標識した。その後、蛇毒心臓毒の筋肉内投与によって損傷された免疫無防備状態のRag2−/−:γc−/−成体マウス(Gayraud-Morel B. et al., 2012)の前脛骨筋にそれらを注入した。1ヶ月後の移植された筋肉の検査より、移植GFP発現細胞は、ラミニン及びジストロフィンを発現する筋線維により満たされた広い面積を再構成したことが示された(n=3;図13A)。分化マーカーであるミオゲニンを高レベルで発現した線維は、直径が小さく、成体の筋肉のようには整列されておらず、胚性一次線維(embryonic primary fibers)に対応している可能性があることを示唆している(図13B)(Gayraud-Morel B. et al., 2009)。これは、上記線維がミオシン重鎖の胚性アイソフォーム及び周産期アイソフォーム発現することを示すことにより確認された(図13C)。注目すべきことは、筋衛星細胞特異的マーカーであるPax7を発現する重要な細胞集団が、生着した再生領域において観察され、これは分化ES細胞が筋細胞の前駆体プール(progenitor pool)を産生することもできることを示唆している(図13B)。このようにして、損傷した筋肉にin vivoで移植された場合、in vitroで得られたPax3陽性細胞は筋形成系統へのそれらの分化を継続することができる。
Claims (9)
- 有効量の古典的Wnt/ベータカテニンシグナル伝達経路の活性化剤を含む培養培地中でヒト多能性幹細胞を培養する工程を含む、人工ヒト沿軸中胚葉前駆細胞を調製するex vivo方法であって、
前記古典的Wnt/ベータカテニンシグナル伝達経路の活性化剤が、R−spondin3、R−spondin2、若しくは前記R−spondin3及びR−spondin2の組合せであるR−spondinファミリーのメンバーであるか、又はCHIR99021若しくはLiClであるGSK−3βの阻害剤であり、 前記培養培地がTGFβシグナル調節剤を含まない、ex vivo方法。 - 有効量の古典的Wnt/ベータカテニンシグナル伝達経路の活性化剤と有効量の骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路の阻害剤とを含む培養培地中でヒト多能性幹細胞を培養する工程を含む、人工ヒト沿軸中胚葉前駆細胞を調製するex vivo方法であって、
前記古典的Wnt/ベータカテニンシグナル伝達経路の活性化剤が、R−spondin3、R−spondin2、若しくは前記R−spondin3及びR−spondin2の組合せであるR−spondinファミリーのメンバーであるか、又はCHIR99021若しくはLiClであるGSK−3βの阻害剤であり、 前記骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路の阻害剤が、Dorsomorphinであるか、又はNoggin及びFollistatinからなる群より選択され、 前記培養培地がTGFβシグナル調節剤を含まない、ex vivo方法。 - 有効量の古典的Wnt/ベータカテニンシグナル伝達経路の活性化剤と有効量の骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路の阻害剤とのみからなる培養培地中でヒト多能性幹細胞を培養する工程を含む、人工ヒト沿軸中胚葉前駆細胞を調製するex vivo方法であって、
前記古典的Wnt/ベータカテニンシグナル伝達経路の活性化剤が、R−spondin3、R−spondin2、若しくは前記R−spondin3及びR−spondin2の組合せであるR−spondinファミリーのメンバーであるか、又はCHIR99021若しくはLiClであるGSK−3βの阻害剤であり、 前記骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路の阻害剤が、Dorsomorphinであるか、又はNoggin及びFollistatinからなる群より選択される、ex vivo方法。 - 前記R−spondin−3が、配列番号1の配列のヒトR−spondin−3又は配列番号5の配列のヒトR−spondin−3アイソフォーム2である請求項1〜3のいずれかに記載のex vivo方法。
- 前記R−spondin−2が、配列番号3の配列のヒトR−spondin−2、配列番号6の配列のヒトR−spondin−2アイソフォーム2、又は配列番号7の配列のヒトR−spondin−2アイソフォーム3である請求項1〜3のいずれかに記載のex vivo方法。
- 前記BMPシグナル伝達経路の阻害剤がDorsomorphinである請求項2または3に記載のex vivo方法。
- 前記培養培地がDMSOを更に含む請求項1〜6のいずれか一項に記載のex vivo方法。
- 前記多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞、又はiPS細胞である請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 骨格筋系統、骨系統、軟骨系統、真皮細胞系統、脂肪細胞系統又は内皮細胞系統を含む集団を調製する方法であって、
(a)請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法により、人工ヒト沿軸中胚葉前駆(iPAM)細胞を含む集団を調製する工程と、
(b)骨格筋系統、骨系統、軟骨系統、真皮細胞系統、脂肪細胞系統又は内皮細胞系統を含む沿軸中胚葉誘導体のうちから選択される所望の細胞系統へと人工沿軸中胚葉前駆細胞を分化させるのに適切な条件下で、前記人工沿軸中胚葉前駆(iPAM)細胞を含む集団を培養する工程とを含む、方法。
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